HU198514B - Process for the renaturation of proteins - Google Patents

Process for the renaturation of proteins Download PDF

Info

Publication number
HU198514B
HU198514B HU871493A HU149387A HU198514B HU 198514 B HU198514 B HU 198514B HU 871493 A HU871493 A HU 871493A HU 149387 A HU149387 A HU 149387A HU 198514 B HU198514 B HU 198514B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
renaturation
solution
denatured
buffer
Prior art date
Application number
HU871493A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44046A (en
Inventor
Rainer Rudolph
Stephan Fischer
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HUT44046A publication Critical patent/HUT44046A/hu
Publication of HU198514B publication Critical patent/HU198514B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

A,találmány tárgya új eljárás proteinek renaturálására.
A jelen találmány keretén belül proteinek renaturálása alatt proteinek normális biológiai működésének helyreállítását vagy újbóli helyreállítását értjük, melynek során feltételeztük, hogy a természetes szekunder, tercier és adott esetben kvaterner struktúra is újból helyreállítódik.
A proteinek renaturálásának a problémája nagy jelentőséggel bír, mivel a biológiailag aktív proteinek az előforduló kezelések során, például a kísérd anyagokból való elválasztásukkor sokféleképp denaturálódnak, és ekkor az illető biológiai aktivitást egészen vagy részben elvesztik. A renaturálás szintetikus vagy a géntechnológia módszerei szerint előállított proteinek esetében is jelentőséghez jut, mivel ilyenkor sok esetben csak a helyes primer struktúrát, tehát az aminosavszekvenciát kapjuk meg, a biológiai aktivitás kívánt felhasználása azonban feltételezi, hogy a természetes szekunder struktúra, tercier struktúra és adott esetben a kvaterner struktúra kiépülése közben megy végbe a renaturálás.
A 4.530.787. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból már ismert, hogy olyan szintetikus proteineket, amelyek redukált ciszteint tartalmaznak, jodozil-benzoáttal biológiai aktivitásuk visszanyerése közben oxidálnak. Mégha ez a módszer általánosan alkalmazható is lenne, a proteinek renaturálásának akkor is csak egy részproblémáját oldaná meg.
G. Zettlsmeissl, R. Rudolph és R. Jaenicke [Biochemistry, 18, 5567-75 (1979)] egy oligomer enzim, nevezetesen a laktát-dehidrogenáz renaturálását tanulmányozták tercier struktúrájának újbóli visszaállítása közben, és megállapították, hogy ilyen renaturálás közben két konkurráló reakció megy végbe, egyrészt a renaturálódás, másrészt pedig inaktív aggregátumok képződése. Jó renaturálódási hozamok elérése céljából arra kell vigyázni, hogy az oldatban né lépjük túl az enzimek egy határkoncentrációját. Proteinek renaturálására szolgáló általános eljárás azonban ebből sem vezethető le.
A találmány feladata ezért olyan eljárás biztosítása, amely általánosan lehetővé teszi proteinek renaturálásának javítását.
A jelen találmány szerint ezt a feladatot denaturált proteineknek egy renaturáló puffer-oldatában történő renaturálására szolgáló olyan eljárással oldjuk meg, amelyre az jellemző, hogy a renaturálandó proteinnek a kiválasztott pufferban egy kritikus koncentrációjú oldatát készítjük el, és hajtogatott intermedier képződése után további renaturálandó proteint adunk hozzá a kritikus koncentrádó eléréséhez szükséges mennyiségben.
Az eljárás azon a felismerésen alapul, hogy a renaturált proteinre számítva lehető legmagasabb kitermelés a renaturálás egyidejű maximális sebessége mellett akkor érhető el, ha az oldatban a denaturált renaturálandó proteinnek egy bizonyos kritikus koncentrádóját nem lépjük túl, ahol ez az érték az illető protein fajtájától és azoktól a körülményektől függ, amelyek között a renaturálást végrehajtjuk. Eközben fontos, hogy a két egymással konkuráló reakdót, mégpedig egyrészt az inaktív proteinek (például aggregátumok) nemkívánatos képződését, másrészt pedig egy olyan hajtogatott intermedier képződését;
amely végeredményben a végleges natív renaturált proteinné alakul át, úgy toljuk el, hogy csak a lehető legkisebb arányban keletkezzen Inaktív protein. Ehhez az szükséges, hogy figyelembe vegyük a renaturálandó protein proteinspedfikus és feltételspedfikus kritikus koncentrádóját, a hajtogatott Intermedier renaturálódási kinetikáját és a képződéshez szükséges időt.. [R. L. Baldwin, lntermediates in Protein Folding Reactions and the Meehanism of Protein Folding, Annual Review os Biochemistry 44 (1975) 453 475 és P. S. Kim and R. L. Baldwin, Spedfic lntermediates in the Folding Reactions of small Proteins and the Meehanism of Protein Folding, Annual Review of Biochemistry 51 (1982)459-4871.
Ez a három, az eljárás szempontjából lényeges paraméter minden további nélkül meghatározható. A kritikus koncentrádó egy olyan mérőgörbe segítségével állapítható meg, amelyet úgy kapunk, hogy a mindenkori kiválasztott renaturáló pufferhoz különböző koncentrádóknak megfelelő denaturált proteint adunk, és egy előre megadott időtartam után mérjük a renaturált protein elért végkitermelését. A kritikus koncentrádó annak az értéknek felel meg, amelynél a natív renaturált proteinre nézve a legmagasabb kitermelést kapjuk. Itt a találmány keretén belül a legmagasabb koncentrádó mintegy 10%-ának megfelelő koncentrádó jön ,.kritikus koncentrádóként’ számításba.
A renaturálódási kinetika ugyancsak ismert módszerek szerint meghatározható. Itt a maximálisan lehetséges koncentrádónál a renaturált proteinné való átalakuláshoz szükséges időt határozzuk meg.
A hajtogatott intermedier képződéséig eltelő idő végül egy egész sor különböző eljárással meghatároz.ható. Az egyik első meghatározási módszer a drkylárdikroizmus (CD) mérése. Ennél célszerűen olyan hullámhosszat választunk, ahol nagy jelet kapunk, és utána kimérjük a megfelelő görbét, ahol rendszerint meredek emelkedés megy végbe viszonylag rövid időn belül, és a görbe utána ellaposodik, amint a hajtogatott intermedier képződött. További lehetőséget jelent az, hogy kövessük a szulfhidrilcsoportok intramolekuláris diszulfidhidak képződése során történő eltűnését. Ennek során azonban vigyázni kell arra, hogy nem szabad intermolekuláris diszulfidhidakat képezni, ami a molekulasúly ellenőrzésével figyelhető, amely utóbbi esetben növekedne.
Egy még további lehetőséget nyújt a fluoreszcendamérés. Ez a triptofán-, illetve tirozin-fluoreszcendán alapul, ami megváltozik, ha az aromás gyökök az összehajtogatódó protein egy hidrofób régiójába kerülnek át. További lehetőségek a korlátozott proteolizisek, mivel a hajtogatott Intermedier fokozódó képződésével a proteolitikus támadás lehetősége is csökken. Az is lehetséges, hogy ezt a meghatározást hidrodinamikus mérésekkel hajtsuk végre. Például a belső viszkozitást mérjük, amely csökken, mivel a hajtogatott intermedier kisebb viszkozitású oldat keletkezéséhez vezet.
A gyakorlatban elegendő a kritikus koncentrádót és az inaktív proteinek felé menő mellékreakdó ellen védett hajtogatott intermedier képződéséig eltelő időt kimérni, és mindenkor a kritikus koncentrádóval kezdeni, és a hajtogatott intermedier képződésének végbemenetele után újból a közbülső időben az oldatból átalakulással felhasználódott denaturált proteint pótolni. Ez szakaszosan is történhet, amenynyiben az időket és kritikus koncentrációkat előre megadjuk, és azután mindig az intermedier képződésének végbemenetele után adjuk hozzá az ennek során átalakult denaturált proteinnek megfelelő ismert mennyiséget. Más módszer szerint az eljárás folytonosan is kivitelezhető, amennyiben mindig pontosan éppen annyi denaturált proteint adagolunk újból, amennyi hajtogatott intermedier újraképződésével fogy. Ezen a módon a renaturálás olyan körfolyamatban hajtható végre, amelynek során például a renaturálandó proteint valamilyen erre alkalmas oldószerben, így például erősen hígított sósavban oldva vagy liofilizált formában mindig olyan mennyiségben adagoljuk folyamatosan a renaturáló reaktorba, hogy az optimális renaturálási koncentrációt kapjuk. A renaturálási puffért egyidejűleg olyan összetételben adagoljuk folyamatosan, hogy a körülmények pH-érték, anyag-koncentrációk és hasonlók tekintetében konstansak maradjanak. A reaktor megfelelő kialakításával, ami lehet például hurokszerűen felépítve, és a protein és puffer hozzáadásának sebességével és mennyiségével meghatározott áramlási sebességgel olyan tartózkodási idő állítható be, ami a hajtogatott intermedier képződéséhez szükséges időnek felel meg. Ezután a reaktivált proteint folyamatosan elvesszük a rendszerből, például ultraszűrés, fordított ozmózis és hasonló műveletek segítségével történő elválasztással, és adott esetben ínatkív aggregátumokra és aktív proteinre választjuk szét. A folyamatos eljárást előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy az elválasztott puffer-oldatot folyamatosan újból visszavisszük a reaktorba.
A találmány szerinti eljárás folyamatos kivitelezése során előnyös, ha kezdetben a nem-folyamatos eljáráshoz hasonlóan a denaturált proteint az előbbiekben leírt módon addig adagoljuk, míg a renaturált natív protein optimális koncentrációja beáll. Amint t,,‘ elérjük, megkezdjük a reaktivált protein vizonylag tcmény oldatának folyamatos elvételét, és csak ezutái. váltunk át valóban teljes folyamatos eljárásra. A beépítési fázis, amelyben a reaktivált protein koncentrációja még emelkedik, ezért a tulajdonképpeni folyamatos kivitelezéshez élőiről kapcsolódik. Renaturáh protein optimális koncentrációján azt a lehető legmagasabb koncentrációt értjük, amelynél a reakcióelegy alkotórészeinek oldhatóságával még semmilyen problémák nincsenek.
A találmány szerinti eljárásnál előnyösen liofilizált denaturált protcnt használunk. Amennyiben viszont olyan proteini ’íl van szó, amely csak lassan és nehezen vihető olda ba, akkor a hozzáadás oldott formában történik, hogy a találmány szerinti eljárás időbeli jellemzőit pontosan betarthassuk.
A találmány szerinti eljárással ugyan a nem kívánt és a renatur ál ássál konkurráló aggregátképződés minimalizálódik, de teljesen nem szorul vissza. A képződött inaktív aggregátumoknak azonban lényegesen magasabb molekulasúlya van, és ezért a renaturált proteinből könnyen eltávolíthatók olyan elválasztási módszerekkel, amelyek ezt a molekulasúly-különbséget használják ki, például molekulaszitás frakdonálással, adott esetben megfelelő kizárási határú ultraszűréssel, gradiens centrifugálással és hasonlókkal. Így elválasztott aggregátumok azután oldatbevitelük után ismét visszavihetők a renaturálási eljárásba.
Renaturáló pufferekként az ilyen célra ismert összeállítások jönnek számításba. A pH-értéknek olyan pH-tartományon belül kell lennie, amelynél az illető protein jó stabilitású, célszerű közel a maximális stabilitás pH-értékénél lenni. A szennyezések, például nehézfémek denaturáló befolyásának kizárása céljából komplexképzök, például EDTA és hasonló vegyületek jelenlétében célszerű dolgoznunk. Így
Íiéldául a laktát-dehidrogenáz esetében 6-8 pH-jú oszfát puffer használatos, amely körülbelül 1 mmól EDTA-t és 1 mmól DTE-t tartalmaz. Lizozim esetében gyengén lúgos TRIS/HCl-puffer válik be, amely EDTA mellett valamilyen szulfhidrilcsoportot tartalmazó anyagot és kismennyiségű megfelelő díszülfidot tartalmaz. A szöveti plazminogén aktivátor (tPA) renaturálására például a 3.537 708. számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben leírt reaktiváló puffer megfelelő. Számos további protein esetében ismertek alkalmas renaturáló pufferek, vagy a proteinek ismert tulajdonságai, különösen a plí-stabilitás, szulfliidrilcsoport-tartalom, nehézfém-érzékenység és hasonlók alapján szakember néhány előkísérlet nyomán találhat ilyeneket.
Ismert volt, hogy a renaturálás esetében bizonyqs koncentráció-határértékeket nem szabad túllépni. Új az. a felismerés, hogy nagyobb mennyiségű denaturált proteinhez esetleg nem szükséges nagyobb oldattérfogat alihoz, hogy nagyobb mennyiségű renaturált proteinhez jussunk, hanem ugyanabban az oldatban denaturált protein állandó újraadagolásával vagy egymást követő szakaszos újraadagolásával tovább dolgozhatunk és ezáltal lényegesen magasabb renaturált proteinkoncentrációhoz juthatunk el, mint amit a technika jelenlegi állása lehetségesnek tart.
A következő példák a találmányt részletesebben szemléltetik.
1. példa
Lizozim adagolásos reaktiválása (Pulsreaktivierung)
a) Az enzimoldatok előkészítése
Koncentráció-meghatározás (A: 1%-os oldat abszorpciója 280 nm-nél):
natív lizozim: A=26,3 redukált lizozim: A= 23,7
A fajlagos aktivitás meghatározása:
— 2 mg lizozimot 1 ml 0,066 mól/1 koncentrációjú, 6,2 pH-jú kálium-foszfát-oldatban oldunk, a koncentrációt ÚV-abszorpdóval határozzuk meg.
— Vizsgálati oldat: 2,5 mg Micrococcus lysodeicticus sejtfalat szuszpendálunk 10 ml 0,066 mól/1 koncentrációjú, 6,2j>H-jú kálium-foszfát-oldatban.
— Vizsgálat 25 υ-οη: 1 ml sejtfalszuszpenaó és 0,03 ml lizozim-oldat (1:40 előhígítás), a zavarosodás csökkentését 450 nm-en követjük nyomon.
Fajlagos aktivitás^ 60.000 lU/mg.
Redukdó/denaturálás:
— 500 mg lizozimot 3 óra hosszat inkubálunk 25 °C-on, 0,1 mól/1 koncentrádójú, 8,6 pH-jú TR1S/HQ+ + 6 mól/1 guanidin.HQ + 150 mmól/1 DTE (ditio-eritritol) elegyben.
— A ρΗ-t 3-ra állítjuk, és a mintát szétosztjuk.
A-rész
- 'Gélszűrés Sephadex G25F-en (oszloptérfogat « * 270 ml), 0,01 mólos sósav-oldatban.
- A csúcsfrakciókat egyesitjük és liofilizáljuk.
B-rész — Dialízis háromszor 1 1 0,01 mólos sósav-oldattal szemben 4 °C-on, — Liofilizálás.
Mindkét sómentesítésí eljárás (A- és B-rész) olyan redukált lizozimot eredményez,.amelyek a reaktiválási tulajdonságok vonatkozásában nem különböznek.
— A liofilizáit redukált enzimet —40 °C-on nitrogéngáz alatt tároljuk.
Reoxidádó/reaktiválás:
- 12 mg redukált lizozimot oldunk 1 ml 0,01 mól os s ósav-ol datban.
— Szűrés Millipore-on.
— Koncentráció-meghatározás UV-abszorpdóval.
— Reoxidádó 25 °C-on 0,1 mól/1 8,2 pH-jú TRIS+Hd + 1 mmól/1 EDTA ♦ 3 mmól/1 GSH (redukált glutation) ♦ 0,3 mmól/1 GSSG (oxidált glutation) eleggyel való hígítással.
b) A renaturálás kritikus koncéntrádójának meghatározása
- A redukdó/reoxidádó a fentebb leírtak szerint történik változó protein-koncentrádóval a reaktiválási elegyben. Az eredményt az 1. ábra mutatja, ahol a redukált lizozim 20 óra 25 °C-on való reoxidálása utáni reaktiválásának koncentrádófüggését ábrázoljuk grafikusan.
c) A hajtogatott intermedier képződéséig eltelő idő
- Az előbb leírtak szerint redukdóval/reoxidádóval 25 °C-on 0,03 mg/ml protein-koncentrádónál meghatározzuk a redukált lizozim reaktiválásának kinetikáját. Az eredményt a 2. ábrán grafikusan ábrázoljuk.
d) Redukált lizozim „adagolásos reaktiválása”
- 1,6, illetve 2,4 ml 0.125 mól/1, 8,2 pH-jú TR1S/ /HQ * 1,25 mmól/1 EDTA ♦ 3,75 mmól/1 GSH * 0,375 mmól/1 GSSG elegyet készítünk elő.
1. Kísérlet
- 10 perces időközönként 20 alkalommal egyenként 20 μΐ redukált lizozimot adunk az elegyhez. Koncentrádó-növekedés adagonként: 0,11—0,13 mg/ml. Végkonoentrádó 20 adag után: 2,15 mg/ml.
- összehasonlító reaktiválás adagolás nélkül:
Egyszeri hozzáadás azonos végkoncentrádóig. A .pufferkörülmények hígítás után az előbb leírt reoxidádós puffemak felelnek meg.
- 25 °C-on való 2 óra reaktiválás után (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva): Adagolás reaktiválás: 2200 lU/mg összehasonlítás adagolás nélkül: 470 lU/mg
2. Kísérlet
- 10 perces időközönként 20 alkalommal egyenként 30 au redukált lizozimot adunk az elegyhez 0,01 mólos sósav-oldatban oldva.
Koncentrádó-növekedés adagonként: 0,034— -0,042 mg/mT.
Végkoncentrádó 20 adag után: 0,68 mg/ml.
- összehasonlitó aktiválás:
Egyszeri hozzáadás azonos végkoncentrádóig.
— 25 eC-on 0,5 óra reaktiválás után (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva):
Adagolás reaktiválás: 7600 lU/mg összehasonlítás adagolás nélkül; . 1400 IU/mg.
3. Kísérlet — 20 perces időközönként 20 alkalommal egyenként 20 μΐ redukált lizozimot adunk az elegyhez 0,01 mólos sósavban oldva.
Koncentrádó-növekedés adagonként: 0,035— —0,044 mg/ml
Végkoncentrádó 20 adag után: 0,71 mg/ml.
— összehasonlító reaktiválás:
Egyszeri hozzáadás azonos végkoncentrádóig, — 25 °C-on 24 óra reaktiválás után (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva);
Adagolás reaktiválás: 10100 lU/mg összehasonlítás adagolás nélkül: 1400 IU/mg
Ezekből az eredményekből az adódik, hogy:
— A reaktiválási kitermelés 0,1 mg/ml-nél nagyobb protein-koncentrádóknál folyamatosan csökken.
— a megadott reoxidálási körülmények között a reaktiválás 25 °C-on 15 perc múlva csaknem tökéletesen befejeződik (2. ábra).
A találmány szerinti .adagolásos reaktiválás”-sal az adagolás nélküli reaktiváláshoz képest 5-7-szer magasabb kitermelés érhető el.
2. példa
LDH M4 „adagolásos reaktiválása”
a) Az enzim-oldat előkészítése:
— Sertésizomból származó LDH-M4 (laktát-dehidrogenáz) ammónium-szulfátos szuszpenziót (gyártó: Boehringer Mannheim GmbH, dkkszám: 107077) centrifugálunk, és az üledéket az eredeti térfogat 1/6-ának megfelelő térfogatú 0,1 mól/1 7,6 pHjú kálium-foszfát + 1 mmól/1 EDTA + 1 mmól/1 DTE eleggyel oldjuk,
- és kétszer 1 1 azonos puffénál szemben 4 °C-on dializáljuk.
— Koncentrádó-meghatározás A= 14 felett. (A= = l?Los oldat abszorpdója 280 nm-nél).
- a 25 °C-on R. Hermann, R. Jaenicke és R. Rudolph [Biochemistry 20, 5195—5201. (1981)] szerint végzett aktivitás-vizsgálat alapján a fajlagos aktivitás= 300 IU/mg.
Denaturálás/reaktiválás.
— Denaturálás: 1:5 hígítás 0,1 mólos foszforsav-oldattal, 6 perc inkubálás 0 °C-on.
_ Reaktiválás: 1:3 hígítás 0,1 mól/1 12,65 pH-jú kálium-foszfát + 1 mmól/1 EDTA + 1 mmól/1 DTE eleggyel 20 °C-on, elegyítés után az oldat pH-ja 7,6.
b) A renaturálás kritikus koncentrádójának meghatározása
- Denaturálás/reaktiválás az előbb leírtak szerint történik a protein-koncentrádónak a denaturáló elegyben való változtatása közben.
A 3. ábra LDH-M4 savas denaturálás utáni reaktiválásának koncentrádó-függését mutatja, ahol a 25 °C-on 20 óra reaktiválás után mért aktivitást a koncentrádó függvényében ábrázoljuk.
c) A hajtogatott intermedier képződéséig eltelő idő rrteghatározása
- A fentiek szerinti denaturálás/renaturálás útján 25 °C-on meghatározzuk a savdenaturált LDH-M4 «aktiválódásának kinetikáját 0,01 mg/ml protein-koncentrácíónál. Az eredményt a 4. ábra mutatja.
d) Savdenaturált LDH-M4 folyamatos «aktiválása
Egy zárt reaktorba folyamatosan savdenaturált
LDH-M4-et és reaktiváló puffért táplálunk be.
Az alkalmazott reaktiváló re.aktort vázlatosan az
5. ábrán mutatjuk be.
Az A és B tárolóedényekből a Pl és P2 szivattyúkkal folyamatosan tápláljuk az enzim oldatát és a denaturáló oldatot, és a VI keverőszakaszban denaturálunk. A denaturált enzim-oldatot folyamatosan a V2 renaturáló reaktorba vezetjük be. Egyidejűleg a C tárolóedényből a P3 szivattyú segítségével folyamatosan renaturáló oldatot táplálunk be ugyancsak a V2 reaktorba. A renaturált oldatot folyamatosan elvezetjük, és frakciószedőben gyűjtjük. Az oldatok összetétele és a reaktorban fennálló körülmények a
A: 7,43 mg/ml LDH-M4 0,1 mól/1 7,6 pH-jú kálium-foszfát + 1 mmól/1 DTE + 1 mmól/1 EDTA elegyben 0 °C-on.
B; Denaturáló puffer: 0,1 mólos foszforsav-oldat 0°C-on.
C: Renaturáló puffer: 0,1 mól/112,6 pH-jú káliumToszfát ♦ 1 mmól/1 DTE ♦ 1 mmól/1 EDTA elegy 25 °C-on (a B-vel való elegyítés után a pH 7,6).
VI: A Vl= 0,25 ml denaturálási térfogat 0 °C-on 3 perces denaturálási időtartamot eredményez.
V2: A V2 renaturálási térfogat* 58 ml, 25 °C.
Szivattyúsebesség: Pl= 1 ml/óra
P2= 4 ml/óra P3= 10 ml/óra
Az adott reaktornagyság/szivattyúsebesség aránynál egy molekulának a reaktorban való átlagos tartózkodási idejére 2,9 óra adódik.
A működtetéskor 2,5 ml-es mintákat gyűjtünk, és a végső «aktiválást 24 óra 25 °C-on való állás után határozzuk meg.
A 6. ábra a reaktor feltöltésekor mért aktivitásnövekedést mutatja.
Mintegy 4 óra elteltével konstans «aktiválási kitermelést érünk el.
A «aktiválás végkoncentrációja: 0,5 mg/ml
Kitermelés folytonos «aktiválás: 10,2 lU/mg összehasonlítás adagolás nélkül: 1,9 IU/mg
A fenti eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerint mintegy 5,4-szer magasabb kitermelést érünk el, mint ugyanilyen végkoncentrációnál végzett direkt reaktiválással.
3. példa rec-tPA adagolást» «aktiválása
a) A „törmelék testek” (refractile bodies, RB) előkészítése
A sejtfeltárással és különböző centrifugálási/mosási műveletekkel végzett ,,RB-preparálás az EP-A1-0114 506. számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés 7. példája szerinti eljáráshoz hasonlóan történik. Az „RB”-kben levő tPA idegen proteinnel szennyezett, inaktív és oldhatatlan.
Szolubilizálás redukdó/denaturálás útján:
— 2,5 g sejtbő, származó ,,RB”-ket 3 óra hosszat Inkubálunk 25 °C-on 10 ml 0,1 mól/1 8,6 pH-jú TR1S/ /HCI + 6 mól/1 guanidin . HQ ♦ 1 mmól/lEDTA + 150 mmól/1 DTE elegyben.
- összprotein az „RB”-kben redukció után: 41,5 mg. A pH-t tömény sósavval 3-ra állítjuk, és Sephadpx G25F-en (oszloptérfogat- 270 ml) gélszűrést végzünk 0,01 mólos sósav-oldatban.
B) A «aktiválás koncentrádó-függésének meghatározása
A redukált protein savas frakdóját maximális reaktiválhatósággal (c= 0,83 mg/ml) reoxidáljuk 1:3-1:500 hígítással.
A különböző hígításoknál történő reoxidálási körülményeket konstansra állítjuk be: 0,1 mól/1 10,4 pH-jú TRIS/HG * 1 mmól/1 EDTA + 0,5 mól/1 L-arginin ♦ 1 mg/ml BSA (benzol-szulfonsav) + 1 mmól/1 GSH ♦ 0,2 mmól/1 GSSG elegy. Az aktivitást 25 °C-on 25-27 órás reoxidálás után határozzuk meg. Az aktiválás mérése előtt reoxidádós pufferral azonos végkoncentrádóra állunk be. Az eredményeket az
1. táblázat és a rajzmelléklet 7. ábrája mutatja.
1. táblázat rec-tPA «aktiválásának koncentrádófűggése
Protein-koncentrádó^ Kitermelés Stimulálhatóság
(pg/ml) 2) (faktor)
277 31,3 16,8
138 52,4 17,0
92,2 64,9 18,5
55,3 74,9 21,5
27,7 91,5 17,5
17,3 95,6 25,3
8,68 100,0 20,5
5,53 97,8 19,8
3,95 94,4 20,6
LS4 85.3 16.7
1) Protein-koncentrádó a «aktiválásnál (összprotein).
2) Maximális «aktiválási értékre vonatkoztatva.
c) A «aktiválás kinetikájának meghatározása — Redukdót/reoxidádót hajtunk végre az előbb leírtak szerint.
Az anyag szennyezettsége miatt a hajtogatott intermedier képződéséig eltelő időt közbetlenül nem lehet mérni, hanem közvetve a «aktiválás kinetikáján és az adagolási sebesség változtatásán keresztül körülbelül 40-60 percnek határozzuk meg.
A 8. ábra mutatja a rec-tPA «aktiválásának kinetikáját 20 °C-on, 15 pg/ml összprotein-koncentrádónál. A «aktiválás a 30 óra utáni végkitermelésre vonatkozik.
d) rec-tPA „adagolásos «aktiválása” perc és 45 perc közötti időintervallumokban 15 alkalommal egyenként 10 pl redukált rec-tPA-t adunk 0,01 mólos sósavban oldva, 300 pl reaktiváló pufféihoz 25 °C-on.
— Reaktiválási puffer az adagolásos «aktiválás előtt:
0,15 mól/1 10,5 pH-jú TRIS/HG ♦ 1,5 mmól/1
EDTA ♦ 0,5 mól/1 L-arginin ♦ 0,3 mmól/1 GSSC ♦ +1,5 himól/1 GSH.
— Reaktiválási puffer a redukált protein hozzáadása után: 0,1 mól/1 10,4 pH-jú TR1S/HQ * 1 mmól/1 EDTA ♦ 0,33 mól/1 L-arginin + 0,2 mmöl/1 GSSG * * 1 mmól/1 GSH.
Adagonként koncentráció-növekedés 18-27 pg/ml Végkoncentrádó 15 adag után: 227 pg/ml
Az aktivitásmérés (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva) 24 ór.ás 20 °C-on végzett reoxidálás után történik. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja:
2.táblázat rec-tPA „adagol ásos-reaktiválása”
Adagolási sebesség (perc) Kitermelés (%) Stimulálhatóság (faktor)
2 31,3 7,1
Ί0 38,6 8.1
20 39,5 9,0
30 44,8 8,2
45_ 45,8 L8
1) A 7. ábrának megfelelő maximális «aktiválásra vonatkoztatva.
Magyarázat:
- Az alkalmazott kiindulási anyag esetében a reaktlválási kitermelés - a bevitt proteinmennyiségre vonatkoztatva - 20 pg/ml-nél nagyobb koncentrádóknál csökken (7. ábra).
A CNBr/FSP-vel való stimulálhatóság a mérés pontosságán belül a reaktiválásl koncentrádótól függetlennek bizonyul (1. táblázat).
- A «aktiválás felezési ideje 20 °C-on az adott kísérleti körülmények között 7±2 óra.
- a reaktiválási kitermelés a reaktiválási adagok közötti várakozási idő hosszabbodásával nő (2. táblázat).
4. példa
Antitestek adagolásos renaturálása
A proteinoldat előkészítése:
A humán kretinkináz váJzomotlzoenzime (CK-MM) elleni monoklonális antitesteket (MÁK 33) az ECACC... hibiidoma sejtvonalból nyerünk [lásd P. Buckel és munkatársai, Gene 51, 13-19 (1987)]. Ebből a preparátumból A. Johnstone és R. Ihorpé [lmmunochemisiij ín Practice, L'ackwell Scientific Publícations (1982), 52-53. old.] szerint Fab-fragmenseket izolálu t
Az aktív immunreaktivitás kimutatása:
Aktív ímmunreaktivitáson itt a natív, illetve «natúréit Fab-f- Jgrv'nsnek a spedfikus antigénné (jelen esetben humán-CK MM-rnel) való reakcióját értjük. Egy Eí V-tesztrendszerben mérjük ezt a reakdót enzim-konjugált poliklonális anti-egér-antitestek segítségével kvantitative az ABTS kromogén szubsztrát átalakítása útján kolorimetrikusan (H. U. Bergmeyer, Methods in Enzymatic Analyisis, 3. kiadás, IX. kötet,
15-37. old).
Redukdó/denaturálás: 5 mg MÁK 33 FAb-ot 3 óra hosszat Ínkubálunk 25 °C-on 1 ml elegyben, melynek összetétele: 0,1 mól/liter . 8,5 pH-jú tris. HCI + 6 mól/liter guanidin . HCI + 0,3 mól/liter ditioeritritol (DTE) + 2 mmól/liter etilén-díamin-tetraecetsav (EDTA). Ütána a pH-t 3-ra állítjuk, és 2 pH-jú 6 mól/liter koncentrádójú guanidin . HCJ oldattal szemben dializáljuk.
Renaturál ás/reoxidádó:
Reoxidádó 20 °C-on a denaturált proteinoldatnak a következő végkoncentrádóra való hígításával:
0,1 mól/1 8/5 pH jú tris.HCl + 0,3 mól/1 guanidin . HCI + 2 mmól/1 EDTA +0,2 mmól/1 oxidált gjutation (GSSG) + 2 mmól/1 redukált glutation (GSH).
Redukált MÁK 33 Fab „adagolásos renaturálása”: t= 24 órás időközönként 5 x 20 pl-t adunk redukált MAK33 FAB 6 mól/1 koncentrádójú 2 pH-jú guanidin . HQ oldattal készített oldatából a renaturáló oldathoz.
Adagonként! koncentrádónövekedés: 0,02-0,021 mg/ml.
adag utáni végkoncentrádó: 0,103 mg/ml. összehasonlító renaturálás adagolás nélkül:
Egyszeri beadagolás azonos végkoncentrátióig. A pufferköiülmények hígítás után az előbb megadott reoxidáló puffemek felelnek meg.
A denaturált protein hozzáadásának befejezése után' 200 óra renaturálás 20 °C-on. Végül a kitermelés meghatározása az aktív immunreaktivitásnak az eredetileg beadagolt natív Fab-hoz viszonyított mérésével:
Adagolásos renaturálás; 8%
Adagolás nélküli összehasonlító mérés: 7%.
A jelen találmány szerinti „adagolásos renaturálással” az adagolás nélküli renaturáláshoz képest 11 ezer magasabb kitermelés érhető el.

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás denaturált proteinek renaturálására oldatban valamilyen renaturáló pufferban, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott 6-10,5 pH-jú pufferben elkészítjük a renaturálandó protein kritikus koncentrációjú oldatát, és a hajtogatott intermedier keletkezése után további renaturálandó proteint adunk hozzá a kritikus koncentrádó eléréséhez szükséges mennyiségben.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást szakaszosan hajtjuk végre, amennyiben minden alkalommal a hajtogatott intermedier képzéséhez szükséges idő lefutása után pótoljuk a kritikus koncentrádó eléréséhez szükséges mennyiségű denaturált proteint.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást folyamatosan hajtjuk végre olymódon, hogy a folyamatos renaturáláshoz egy reaktorba folyamatosan adagoljuk a kritikus kocentrádó eléréséhez szükséges mennyiségű denaturált proteint és a megfelelő mennyiségű renaturáló puffért, és azelegy reaktorban való tartózkodásának idejét a hajtogatott intermedier képződéséhez szükséges időtartamra szabályozzuk be.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a denaturált proteint addig adagoljuk a reaktorba, amíg a renaturált protein optimális koncentrádója beáll, és utána az így kapott oldatot folyamatosan eltávolítjuk, és denaturált protein opti-61
    198.514 malis koncentrációjú oldatával megfelelően pótoljuk.
  5. 5.‘Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keletkező inaktív proteinaggregátumokat magasabb molekulasúlyuk alapján elválasztjuk a renaturált proteintől, és feloldás után ismét vissza visszük az eljárásba.
  6. 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljá5 rás, azzal jellemezve, hogy a denaturált proteint liofilizált vagy előre oldott formában visszük be az eljárásba.
HU871493A 1986-04-08 1987-04-07 Process for the renaturation of proteins HU198514B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863611817 DE3611817A1 (de) 1986-04-08 1986-04-08 Verfahren zur renaturierung von proteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44046A HUT44046A (en) 1988-01-28
HU198514B true HU198514B (en) 1989-10-30

Family

ID=6298240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU871493A HU198514B (en) 1986-04-08 1987-04-07 Process for the renaturation of proteins

Country Status (20)

Country Link
US (1) US4933434A (hu)
EP (1) EP0241022B1 (hu)
JP (1) JPH0742307B2 (hu)
KR (1) KR900005279B1 (hu)
AT (1) ATE84541T1 (hu)
AU (1) AU583723B2 (hu)
CA (1) CA1304191C (hu)
CZ (1) CZ283304B6 (hu)
DD (1) DD260280A5 (hu)
DE (2) DE3611817A1 (hu)
DK (1) DK173650B1 (hu)
ES (1) ES2038969T3 (hu)
FI (1) FI93842C (hu)
GR (1) GR3007605T3 (hu)
HK (1) HK46896A (hu)
HU (1) HU198514B (hu)
IE (1) IE60064B1 (hu)
IL (1) IL82091A (hu)
SK (1) SK249587A3 (hu)
ZA (1) ZA872474B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989001484A1 (en) * 1987-08-14 1989-02-23 Gebro Broschek Kg Pharmazeutische Fabrik Process for intramolecular oxidation of two -sh groups in a peptide compound to a disulphide bridge, and peptide so obtained
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat
EP0545999B1 (en) * 1990-08-20 1997-06-04 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of biologically active IGF-1 using IGF-1 having an amino-terminal extension
ES2119779T3 (es) * 1990-09-05 1998-10-16 Southern Cross Biotech Pty Ltd Solubilizacion de proteinas en formas activas.
US5023323A (en) * 1990-09-12 1991-06-11 Monsanto Company Method of somatotropin naturation
DE4037196A1 (de) * 1990-11-22 1992-05-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur reaktivierung von denaturiertem protein
DE4139000A1 (de) 1991-11-27 1993-06-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf
EP1077263A1 (de) 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
US20050079526A1 (en) * 2002-02-20 2005-04-14 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Methods and apparatuses for characterizing refolding and aggregation of biological molecules
WO2011113601A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Biogenerix Ag Method for obtaining biologically active recombinant human g-csf
WO2012104099A1 (en) 2011-02-04 2012-08-09 Glucometrix Ag Process for the production of recombinant trypsin
CN106699836A (zh) * 2017-03-07 2017-05-24 安徽鑫华坤生物工程有限公司 一种蛋白质复性的透析设备

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4216141A (en) 1978-07-19 1980-08-05 The Salk Institute For Biological Studies Method for cyclization of peptides
DE3231658A1 (hu) 1981-01-21 1983-11-17
EP0112849B1 (en) * 1982-06-07 1987-09-16 Celltech Limited A process for the preparation of chymosin
JPS593711U (ja) * 1982-06-30 1984-01-11 協伸工業株式会社 電線被覆剥取器
AU538170B2 (en) * 1982-09-15 1984-08-02 Owens-Illinois Glass Container Inc. Modified protein to mould an enzyme type molecule
GR79124B (hu) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
GB2138004B (en) * 1983-03-25 1987-05-13 Celltech Ltd A process for the production of a protein
US4530787A (en) * 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
KR860007688A (ko) 1985-03-08 1986-10-15 시끼 모리야 전자석장치(電磁石裝置)
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
EP0208539A3 (en) * 1985-07-11 1988-08-03 Repligen Corporation Folding disulfide-cross-linkable proteins
US4656255A (en) * 1985-09-09 1987-04-07 International Minerals & Chemical Corp. Protein recovery
DE3618817A1 (de) * 1986-06-04 1987-12-10 Behringwerke Ag Verfahren zur gewinnung aktiver proteine aus einer biologisch inaktiven form

Also Published As

Publication number Publication date
ES2038969T3 (es) 1993-08-16
AU583723B2 (en) 1989-05-04
EP0241022A2 (de) 1987-10-14
HUT44046A (en) 1988-01-28
CZ249587A3 (en) 1997-11-12
IE870695L (en) 1987-10-08
DK179787D0 (da) 1987-04-08
DE3611817A1 (de) 1987-10-15
ZA872474B (en) 1988-07-27
FI93842B (fi) 1995-02-28
FI93842C (fi) 1995-06-12
FI871522A0 (fi) 1987-04-07
DK173650B1 (da) 2001-05-21
HK46896A (en) 1996-03-22
JPS62242697A (ja) 1987-10-23
GR3007605T3 (hu) 1993-08-31
CA1304191C (en) 1992-06-23
DD260280A5 (de) 1988-09-21
JPH0742307B2 (ja) 1995-05-10
ATE84541T1 (de) 1993-01-15
IE60064B1 (en) 1994-06-01
IL82091A0 (en) 1987-10-30
CZ283304B6 (cs) 1998-02-18
US4933434A (en) 1990-06-12
FI871522A (fi) 1987-10-09
DK179787A (da) 1987-10-09
IL82091A (en) 1991-12-15
SK279976B6 (sk) 1999-06-11
EP0241022A3 (en) 1989-10-25
EP0241022B1 (de) 1993-01-13
DE3783497D1 (de) 1993-02-25
KR870010185A (ko) 1987-11-30
KR900005279B1 (ko) 1990-07-27
SK249587A3 (en) 1999-06-11
AU7119087A (en) 1987-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU198514B (en) Process for the renaturation of proteins
EP0364926B1 (de) Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in Prokaryonten exprimierten Antikörpern
Wolf et al. Micellar solubilization of enzymes in hydrocarbon solvents, enzymatic activity and spectroscopic properties of ribonuclease in n-octane
Davis et al. Characterization of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells
EP1434789B1 (en) Improved protein disaggregation and refolding using high pressure
Snyder et al. Electrostatic influence of local cysteine environments on disulfide exchange kinetics
JPS62502895A (ja) 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法
US20070238860A1 (en) Method for Refolding a Protein
Cardamone et al. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies
CN1825119A (zh) D－二聚体测定用标准物质
JPS6277332A (ja) 蛋白質の回収
Buswell et al. A new kinetic scheme for lysozyme refolding and aggregation
Moshkov et al. Proteolysis of Human Ceruloplasmin: Some Peptide Bonds Are Particularly Susceptible to Proteolytic Attack
RU2070888C1 (ru) Способ реактивации рекомбинантного белка
JP3930051B2 (ja) 正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質の製造方法
MXPA04007589A (es) Proceso de produccion del factor de crecimiento placentario recombinante.
US7893210B2 (en) Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines
Rizzolo et al. Behavior of fragmented calcium (II) adenosine triphosphatase from sarcoplasmic reticulum in detergent solution
Bergenhem et al. The existence of glutathione and cysteine disulfide-linked to erythrocyte carbonic anhydrase from tiger shark
West et al. A comparison of the denaturants urea and guanidine hydrochloride on protein refolding
Phelps et al. Protein disaggregation and refolding using high hydrostatic pressure
Zwizinski et al. The purification of M13 procoat, a membrane protein precursor.
Rao et al. Purification and properties of milk‐clotting enzyme from Bacillus subtilis K‐26
CN106519024A (zh) 一种用于去除单克隆抗体中异构体的复性液及复性方法
Markussen et al. Kinetics of trypsin catalysis in the industrial conversion of porcine insulin to human insulin

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628