JP2746380B2 - ヒト乳頭腫ウイルス４１型、そのｄｎａおよびそれによってコードされるタンパク質 - Google Patents
ヒト乳頭腫ウイルス４１型、そのｄｎａおよびそれによってコードされるタンパク質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ヒト乳頭腫ウイルス（human papillomavirus）（HP
V）は、約40種の異なる型の一群を形成する［Hausen,H.
およびSchneider,A.:（1987）、The Papilomaviruses、
Howley,P.M.およびSalzmann,N.P.（編集者）、印刷
中］。HPVは、良性（疣贅、生殖器領域の湿疣）および
悪性（皮膚および膣の癌腫）の上皮性新生物に関連して
発見された。乳頭腫ウイルスは、培養によって増殖させ
ることができない。したがって、ヒト乳頭腫ウイルス41
型DNA（HPV41DNA）の診断用薬としての使用、および発
現産物の生産とそれらの抗原としての使用、抗体の単離
および対応する診断用薬および治療用薬の製造には、遺
伝子工学的方法が要求される。
V）は、約40種の異なる型の一群を形成する［Hausen,H.
およびSchneider,A.:（1987）、The Papilomaviruses、
Howley,P.M.およびSalzmann,N.P.（編集者）、印刷
中］。HPVは、良性（疣贅、生殖器領域の湿疣）および
悪性（皮膚および膣の癌腫）の上皮性新生物に関連して
発見された。乳頭腫ウイルスは、培養によって増殖させ
ることができない。したがって、ヒト乳頭腫ウイルス41
型DNA（HPV41DNA）の診断用薬としての使用、および発
現産物の生産とそれらの抗原としての使用、抗体の単離
および対応する診断用薬および治療用薬の製造には、遺
伝子工学的方法が要求される。
本発明は、HPV41の初めての単離、このゲノムの部分
的特徴づけおよびpUC19におけるクローニングに基づく
ものである。これによってHPV41に関連する皮膚腫瘍の
早期発見への道が開かれる。
的特徴づけおよびpUC19におけるクローニングに基づく
ものである。これによってHPV41に関連する皮膚腫瘍の
早期発見への道が開かれる。
本発明は、特許請求の範囲に定義される。本発明のさ
らなる実施態様は、詳細に以下に記述される通りであ
る。
らなる実施態様は、詳細に以下に記述される通りであ
る。
HPV41のクローニングは、他の40の型のHPVとの比較を
可能にした。HPV7、８、10、17、27、29、30および33の
連関は僅かであるが、HPV41とHPV8との共線性（colinea
rity）が明らかにされて（第２図）、制限酵素切断の物
理的ゲノムチャートが作成された（第１図）。
可能にした。HPV7、８、10、17、27、29、30および33の
連関は僅かであるが、HPV41とHPV8との共線性（colinea
rity）が明らかにされて（第２図）、制限酵素切断の物
理的ゲノムチャートが作成された（第１図）。
本発明は、したがって、新生物、特に皮膚の腫瘍、の
HPV41の存在を試験する方法および、妥当であれば、HPV
41タンパク質に対する抗体を用いる治療の試みの手段を
提供するものである。
HPV41の存在を試験する方法および、妥当であれば、HPV
41タンパク質に対する抗体を用いる治療の試みの手段を
提供するものである。
例 例１ エピソームHPV41DNAの単離： 15歳の女子の身体の異なる３領域からの疣贅組織から
の生検用切片を、採取後直ちに−70℃で凍結して保存し
た。これから、高分子DNAを記述された方法［Gissmann
ら：（1982）、lnt.J.Cancer 29、143−146］で単離し
た。Radloffら［（1967）、Proc.Nat.Acad.Sci.57、151
4−1521］の方法によって閉環状の二本鎖DNAを記述され
た細胞性DNAから得て、約10μｇのDNAを600μg/mlのエ
チジウムブロミドを加えたCsCl溶液（密度1.56g/ml）中
で50Tiローター（ベックマン社製）を用いて45,000rpm
で48時間遠心分離して、密度1.59〜1.60の分画を集め
た。これに代えて、同じ生検材料からの全DNAのエピソ
ームHPV41DNAを、エチジウムブロミドで染色したアガロ
ースゲル［１％アガロース（SeakemME）、40mMトリス−
酢酸および2mMEDTA（pH7.8）］中で検出して、これから
分離することもできた。
の生検用切片を、採取後直ちに−70℃で凍結して保存し
た。これから、高分子DNAを記述された方法［Gissmann
ら：（1982）、lnt.J.Cancer 29、143−146］で単離し
た。Radloffら［（1967）、Proc.Nat.Acad.Sci.57、151
4−1521］の方法によって閉環状の二本鎖DNAを記述され
た細胞性DNAから得て、約10μｇのDNAを600μg/mlのエ
チジウムブロミドを加えたCsCl溶液（密度1.56g/ml）中
で50Tiローター（ベックマン社製）を用いて45,000rpm
で48時間遠心分離して、密度1.59〜1.60の分画を集め
た。これに代えて、同じ生検材料からの全DNAのエピソ
ームHPV41DNAを、エチジウムブロミドで染色したアガロ
ースゲル［１％アガロース（SeakemME）、40mMトリス−
酢酸および2mMEDTA（pH7.8）］中で検出して、これから
分離することもできた。
例２ プラスミドpUC19におけるHPV41のクローニング： 既知のプラスミドpUC19（Yanish−Perronら：（198
5）、Gene 33、113−119）をクローニングベクターとし
て選択した。閉環状の二本鎖DNAをBamH Iでの切断の後
にpUC19においてクローニングした［Maniatisら：（198
2）、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold S
pring Harbor Laboratory Press、New York］。組換え
クローンをβ−ガラクトシダーゼ試験［Messingら：（1
977）、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74、3642−3646］で同
定して、連結挿入されたDNAフラグメントを高速DNA抽出
［Birnboim,H.L.およびDoly:（1979）、Nucl.Acids Re
s.７、1513−1523］によって分析した。
5）、Gene 33、113−119）をクローニングベクターとし
て選択した。閉環状の二本鎖DNAをBamH Iでの切断の後
にpUC19においてクローニングした［Maniatisら：（198
2）、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold S
pring Harbor Laboratory Press、New York］。組換え
クローンをβ−ガラクトシダーゼ試験［Messingら：（1
977）、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74、3642−3646］で同
定して、連結挿入されたDNAフラグメントを高速DNA抽出
［Birnboim,H.L.およびDoly:（1979）、Nucl.Acids Re
s.７、1513−1523］によって分析した。
二つの組換え体を得た。その一つのK10は6.6kbの挿入
部を含み、もう一つのK6は0.98kbの挿入部を含んでい
た。クローニングされたこれらの配列の相同性を生検材
料からのエピソームDNAとのハイブリダイゼーション
（対合）によって証明する。
部を含み、もう一つのK6は0.98kbの挿入部を含んでい
た。クローニングされたこれらの配列の相同性を生検材
料からのエピソームDNAとのハイブリダイゼーション
（対合）によって証明する。
例３ HPV41の物理的ゲノムチャート： BamH I切断によってベクターから切り出し分離された
HPV41DNAを制限エンドヌクレアーゼAcc I、Bal II、Xba
I、Sma I、EcoR I、Pst IおよびHinc IIで消化して、
対応する物理的ゲノムチャートを一般に知られた方法に
て作成した。その結果は、第１図に要約された通りであ
る。唯一のKpn I切断部位によってHPV41分子が線状にな
る。
HPV41DNAを制限エンドヌクレアーゼAcc I、Bal II、Xba
I、Sma I、EcoR I、Pst IおよびHinc IIで消化して、
対応する物理的ゲノムチャートを一般に知られた方法に
て作成した。その結果は、第１図に要約された通りであ
る。唯一のKpn I切断部位によってHPV41分子が線状にな
る。
例４ 他のHPVとの比較： HPV41ゲノムのDNAと、HPVの入手可能な40種の型のDNA
とを、種々の緊張（stringency）条件下におけるDNA/DN
Aハイブリダイゼーション法［E.M.Southern:（1975）、
J.Mol.Biol.98、503−517］によって比較した。高緊張
の条件下（融解温度Tm:−20℃）では、HPV41のK10−DNA
はHPV29のDNAと一部だけ対合する。K6クローンのDNA
は、低緊張の条件下（Tm:−40℃）でのみHPV3および13
のDNAと対合する。
とを、種々の緊張（stringency）条件下におけるDNA/DN
Aハイブリダイゼーション法［E.M.Southern:（1975）、
J.Mol.Biol.98、503−517］によって比較した。高緊張
の条件下（融解温度Tm:−20℃）では、HPV41のK10−DNA
はHPV29のDNAと一部だけ対合する。K6クローンのDNA
は、低緊張の条件下（Tm:−40℃）でのみHPV3および13
のDNAと対合する。
ハイブリダイゼーション実験に基づいたHPV8との共線
性を第２図に示す。
性を第２図に示す。
既知のHPV8DNA配列［Fuchsら：（1986）、J.Virol.5
8、626−634］からHPV41の転写解読枠を推知することが
可能であって、したがって、クローンK10およびK6のサ
ブクローニングおよびその後の原核または真核生物にお
ける発現システムでの発現からなる公知の方法によっ
て、HPV41タンパク質を得ることができる。
8、626−634］からHPV41の転写解読枠を推知することが
可能であって、したがって、クローンK10およびK6のサ
ブクローニングおよびその後の原核または真核生物にお
ける発現システムでの発現からなる公知の方法によっ
て、HPV41タンパク質を得ることができる。
プラスミドHPV41のクローンK6およびK10［大腸菌（Es
cherichia coli）を宿主とする］は、DSM4174P（K6につ
いて）およびDSM4175P（K10について）の寄託番号の下
に1987年７月３日（3.7.1987）にドイチェ・ザンムルン
グ・フュール・ミクロンオルガニスメン（Deutsche Sam
mlung fr Mikroorganismen）に寄託された。
cherichia coli）を宿主とする］は、DSM4174P（K6につ
いて）およびDSM4175P（K10について）の寄託番号の下
に1987年７月３日（3.7.1987）にドイチェ・ザンムルン
グ・フュール・ミクロンオルガニスメン（Deutsche Sam
mlung fr Mikroorganismen）に寄託された。
第１図は、HPV41のゲノムチャートを図示する説明図で
ある。 第２図は、HPV41とHPV8の共線性を図示する説明図であ
る。
ある。 第２図は、HPV41とHPV8の共線性を図示する説明図であ
る。
Claims (5)
- 【請求項１】寄託クローンDSM4175PおよびDSM4147Pによ
って特徴付けられる、ヒト乳頭腫ウイルス41DNA。 - 【請求項２】請求項１に記載のDNAを含有してなる診断
剤。 - 【請求項３】請求項１に記載のDNAを、原核または真核
発現系で発現させることを特徴とする、DNAの発現方
法。 - 【請求項４】生検材料または塗沫材料を、請求項２に記
載の診断剤と接触させることを特徴とする、ヒト乳頭腫
ウイルス41感染のインビトロ診断方法。 - 【請求項５】調べようとするRNAまたはDNAを、請求項１
に記載のDNAと緊張ハイブリダイゼーションの条件下で
ハイブリダイゼーションさせることを特徴とする、ヒト
乳頭腫ウイルス41感染のインビトロ診断方法。
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