JP2746291B2 - 血液潅流用の改良された親和性担体 - Google Patents

血液潅流用の改良された親和性担体

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，体液の体外での処理法およびアフィニティ
ークロマトグラフィーの分野に関する。詳細には，本発
明は，血液灌流と，それほど厳密でないクロマトグラフ
ィー法および試料の処理法の分野とに適切な，保護膜型
コーティングを有する微粒子状担体に関する。
（従来の技術） 安定で高容量を有し，非特異的吸着性が低い，便利な
クロマトグラフィー用担体が，永年にわたって捜し求め
られてきた。しかし，この特性の組み合わせを達成する
ことは極めて困難である。木炭または合成ポリマー類の
ような単一物質の担体は非特異性であり，高容量で高安
定性の両方を兼ねそなえたものは製造できないことは明
らかである。多孔性シリカにDEAEデキストランを含浸さ
せることによって得られるようなハイブリッドゲルも上
記の欠陥がある。
この種のハイブリッド担体は多数開示されている。例
えば，米国特許第4,673,734号は，アミノ化多糖類を含
浸させた鉱物質の担体に関し；米国特許第3,577,226号
には，シリカゲルの細孔にinsituで重合させて架橋ポリ
マーを形成させる方法が記載されており;Boardman,N.
K.,J.Chromatog２巻,388〜389頁,1959年，には，セライ
トのような多孔性担体の空洞に，樹脂の薄層を形成させ
ることが記載され；そして，米国特許第3,878,092号に
もポリマーでコートされたシリカが記載されている。
シリカと多孔性ガラスの未コートの形態のものは，高
多孔性で高流量を提供するが，分解しやすく，そして，
表面にシラノール基があるためタンパクが非特異的に吸
着する。これらの欠点を克服するために，シランカップ
リング剤を含有する親水性ポリマーコーティングが開示
されている。例えば，米国特許第3,983,299号および第
4,029,583号には，シリカ担体に結合したグリシドキシ
プロピルトリメトキシシランが開示されている。しか
し，そのコーティングの接着性は不良である。
米国特許第4,332,694号には，反応性エポキシと無機
のシリカ担体との組合せが記載されている。米国特許第
4,352,884号には，無機物質と，親水性アクリレートも
しくはメタクリレートおよび共重合可能なカルボン酸も
しくはアミンとの共重合体と架橋剤とからなるコーティ
ングが記載されている。しかし，この方法は，下にある
基材との結合性が不充分であった。米国特許第3,795,31
3号には，メタクリルオキシシランでコートされた石英
質の担体が記載され，米国特許第3,808,125号には，ポ
リマーのバックボーン上で重合させたカップリング剤で
製造された共重合体に化学的に結合されたシリカの担体
が記載されている。異なる方法としては，米国特許第4,
070,348号には，酵素もしくはタンパクのような特異的
なリガンドで共有結合的に修飾されているグリシジルア
クリレートとアミノ含有アクリレートとの共重合体が記
載されている。
1986年２月26日に公開された欧州特許出願第0172579
号および米国特許第4,724,207号には，合成コポリマー
に共有結合的に結合された修飾シリカ担体が記載されて
いる。上記合成コポリマーは，イオン化可能な基を有す
る物質，すなわち疎水性物質，またはアフィニティーリ
ガンドに結合しうる基を有する物質と共重合したシリカ
に，直接共有結合的に結合することが可能なポリマーを
含有する。関連する米国特許第4,663,163号には，同様
に修飾された多糖類の担体が記載され，特許請求がなさ
れている。したがって，これらの担体は，特異性を付与
する誘導体を含有するマトリックスとして，そして，こ
の物質を微粒子状の有機もしくは無機の担体に結合させ
るためのリンクとして，引き続いて架橋されたポリマー
のコーティングを，用いている。
上記のクロマトグラフィー用担体は，いずれも血液灌
流に使用するのには適切でない。その理由は，その流れ
特性が不適切で担体が著しく不安定なことと，非特異的
結合が余りにも多いからである。前記の方法ではアクリ
ルポリマーと会合したヒドロゲルが得られる。このポリ
マーは，接着性が不良なので，基本粒子の機械的特性を
改質することが非常に重要であるという本質的な欠点が
ある。例えば，ポリアクリルヒドロゲルは，その細孔の
平均半径が４〜10オングストロームにすぎないと推定さ
れている（Refojo,M.F.,J.Ap.Polym.Sci.,9巻,3417頁,1
965年;White,M.L.,J.Phys.Chem.,64巻,1563頁,1960
年）。このような細孔の大きさは，アルブミン（158Å
×38Å）とγ−グロブリン（235Å×44Å）のような小
さな血漿タンパクさえも有効に除外する。
上記の理由のため，さきに引用したクロマトグラフィ
ー用担体は，血液もしくは血漿のような生物学的液体を
生体外で処理するのには不適当である。このような用途
に適合するには，高い寸法安定性，微粒子の放出がない
こと，高い効率と容量および生体適合性，ならびに非特
異的吸着がないということが必要である。現在実施され
ている方法では，活性炭，イオン交換体もしくは樹脂の
ような非特異的吸着剤が，血漿灌流に使用されている。
この血漿灌流を実施するのは，血液灌流を実施すること
よりも容易であるが，細胞を血漿から分離するのに追加
の装置を要し，処理された血漿の濾過も必要である。特
異的な免疫リガンドでコートしたチューブを血液を通過
させるような，血液成分を特異的に除く試みも報告され
ている（Schenkeinら，J Clin Invest,50巻,1964頁,197
1年;Lyleら，J Immunol 113巻,517頁,1974年）。Terman
ら，Clin Exp Immunol,28巻,180頁,1977年，には，ナイ
ロンに結合され，カラムとして用いられる封入吸着剤が
記載され,Termanら，New Eng J Med 305巻,1195-1200
頁,1981年，には，充実性癌の治療にチャコール−コロ
ジオンに結合させたプロテインＡを使用することが記載
され，そして,Besaら，Am J Med,71巻,1035頁,1981年，
には，自己免疫療法において血清IgGを除去するための
プロテインＡが記載されている。米国特許第4,681,870
号には,IgGを生体液から除去するためのプロテインＡシ
リカ免疫吸着体の使用を開示している。この方法は，生
体外での処理中に“微粒子（fines）”を放出するとい
う欠点を有する。Messaikehら，“Biological and Biom
echanical Performance of Biomaterials",1986年,Chri
stelら編,Elsevier,Amsterdam,321〜326頁には,VIII:C
因子を生体外で除くためにポリスチレンの誘導体を使用
することが記載されている。Margelら，Ap Biochem Bio
technol,12巻,37〜66頁,1986年，には，特異的な血液灌
流のための誘導体化架橋アガロースポリアクロレインの
微小球ビーズ（“アガロースアクロビーズ”）の使用が
記載されている。
血漿もしくは血液から物質を選択的に除去するための
マトリックスとして，無機担体に直接結合させた特異的
な親和リガンドを使用することが，次のBensingerらの
一連の論文に記載されている：Transfusion,21巻,335〜
342頁,1981年；New Eng J Med,304巻,160-162頁,1981
年；J Clin Apheresis,1巻 ２〜５頁,1982年およびVox
Sang,48巻,357-361頁,1985年。これらの発表のうちの
最後のものでは，免疫吸着体は,ChangのTrans Am Soc A
rtif Int Organs 26巻,546-549頁,1980年，および関連
する米国特許第3,725,113号に記載されている方法によ
り，コロジオンでうすくコートされたが，そのうすいコ
ロジオンコーティングは微粒子の放出を防げなかった。
非特異的担体の親水性コーティングが発表されている。
その他の報告ではヒト血漿から抗体を除去するのに類似
のカラムを使っており（Osterwalderら，Blut,53巻,379
-390頁,1986年;Busselら，Plasma Ther Transfus Techn
ol,6巻,461-464頁,1985年），また全血からの抗体の除
去にも類似のカラムが使われている（Rajaら，上記文
献,22巻,102-103頁,1986年；およびBannettら，Transpl
antation,43巻,909-910頁,1987年）。吸着剤を被覆する
試みの中には，血液灌流用の活性炭顆粒の表面にヘキサ
メチルジシロキサンを重合させるのにグロー放電を使用
することが含まれているが（HasirciおよびAkovali,J B
iomed Mater Res,20巻,963-970頁,1986年），やはり微
粒子の放出を防止することはできない。
その外の問題点は，担体に対する非特異的吸着であ
る。種々の物質の高分子物質への接着性が研究されてい
る。種々のポリマーの生体適合性の総説が，“Biocompa
tible Polymers,Metals and Composites"（Szycher編
集）1983年,Technomic,PA中のNeumannらの論文になされ
ている。例えばポリスチレンは，細胞に対して接着性が
不良であることが示されている〔“Biological and Bio
mechanical Performance of Biomaterials"（前出）のT
homasらの論文〕。血小板の接着性は表面の平滑度と粗
さには左右されないようであるが（Zinggら，Biomateri
als,2巻,156-158頁,1981年），疎水性表面に対しては，
表面の粗さは，流動条件下で細胞の接着性に影響する
（Strongら，Anal Biomed Engg,10巻,71-82頁,1982
年）。
本発明は，結着性と機械的強度を付与するメンブレン
型の物理的特性を有し，アフィニティー担体を保護する
のに用いる場合に生体適合性であり，微粒子の放出を防
止する，制御された細孔コーティングを提供する方法を
提供するものである。従って，そのコーティングは，メ
ンブレンの適切な機械的特性を兼ね備え，担体に結合し
たアフィニティーリガンドが反応する抗体などの物質の
ような血液タンパクの浸透に適合した適当な多孔性を有
する。
（発明の構成） 新規親和性吸着剤を含む血液灌流装置は，血液から特
定の物質を選択的に除去するために使用される。この装
置は，臨床適用における体外免疫吸着用の先行技術のク
ロマトグラフの担体の限界を克服する。この担体はま
た，アフィニティークロマトグラフィーの手法に基づ
く，生物学的高分子の大規模な分離および精製において
も有用である。
体外血液灌流により，血液循環から不必要な物質を特
異的に除去することは，血漿分離交換法よりもはるかに
望ましく，簡便であるため，大きな医学的重要性を有す
る。適当な親和性リガンドを使用すると，該リガンドへ
の結合についての特異性を有する物質だけが除去され
る。本発明は，全血（あるいは血漿）を安全に循環さ
せ，その後直接人体に返還することができる担体を提供
する。担体は従って「生体適合性」である。すなわち，
これらの担体は特異的な標的以外のいかなる血液成分に
も有害な影響をおよぼさない。さらに，担体は細胞およ
び血小板の付着に対して抵抗性があり，さもなければ有
害な塞栓症を導きうる微粒子の放出を防ぐ。
本発明の吸着剤のマトリックスは，親和性リガンドが
付着したシリカあるいはその他の不活性粒子を含み，得
られる誘導体化担体はメンブレンタイプのコーティング
によって修飾される。吸着剤マトリックスは，体外免疫
吸着によって直接血流あるいは血漿から抗体または他の
不必要な物質を選択的に除去するのに適した特性を有す
る。コーティングは，それ自体でメンブレンの形成にお
いて一般的に用いられる位相逆転法と同様の手法によっ
て得られる。合成メンブレンタイプの超薄多孔性フィル
ムの形成を包含する。
疎水性ポリマーはより容易に一体型メンブレンを生じ
るので，メンブレンタイプのコーティングを得るために
は望ましい。そのような場合には，ポリマーと共に，該
ポリマーの重量の0.5〜５％の量の溶解した適合性の孔
調節成分を含む必要があり得る。次に溶媒を除去し，目
的とする生体適合性のメンブレンタイプコーティングを
形成する。このコーティングは20オングストロームもし
くはそれを越える大きさの孔を有する。より疎水性の高
いポリマーコーティングは，孔調節成分を必要としない
であろう。メンブレンタイプのコーティングで被覆した
ときに，担体は，少なくとも必要に応じてさらに洗浄
し，予備的に微細成分を除去したあとは，微粒子につい
て安定性を示す。本発明はまた，親和性リガンドへと誘
導されない，あるいは誘導される，ポリマーメンブレン
被覆マトリックスをも対象とする。
従って，ひとつの局面において，本発明は特異的親和
性吸着剤を被覆するための方法を対象とする。この方法
は，微粒子状固体不活性担体（親和性リガンドによって
誘導されない，または誘導される）の懸濁液を調製する
ことを包含し，該懸濁液は，マトリックスの重量の0.1
〜１％の量の溶解したポリマーを含む溶媒中で調製され
る。次いで，担体にポリマーのメンブレン型コーティン
グが与えられるという条件下で，該懸濁液から溶媒を除
去される。上記メンブレン型コーティングは，一体化メ
ンブレンの物理的および機械的特性を有するが，そのメ
ンブレンは，親和性リガンドに吸着される物質が十分に
通過しうる大きさの孔を持つ。従って，孔の大きさは少
なくとも20オングストローム以上でなければならない。
もう１つの面では，本発明は，本発明の被覆マトリッ
クスを含むデバイスならびにそれを用いて体液の体外灌
流技法を実施する方法に関する。特に，本発明は，本発
明の被覆担体を使用する血液灌流の方法を対象とする。
本発明の親和性マトリックスは，特定の成分を選択的
に除去する体液の体外灌流またはクロマトグラフィーに
適し；（ａ）特異的な親和性リガンドで誘導体化された
固体微粒子担体と，（ｂ）該誘導体化担体を被覆する生
体適合性ポリマーコーティングとを有し；該ポリマーコ
ーティングが一体型メンブレンタイプのコーティングで
あり，該メンブレンコーティングが少なくとも20Åの孔
径を有し，そして該コーティングが該マトリックスから
微粒子が濾過されることを防止する。
本発明の方法は，一般的には，微粒子状担体を，孔径
が少なくとも20Åの生体適合性メンブレンタイプのコー
ティングで被覆する方法であって，該コーティングはマ
トリックスから微粒子が濾過されることを防止する。
本発明のある方法は，親和性リガンドで誘導体化され
ていないか，官能基化されているか，または誘導体化さ
れた微粒子状担体の懸濁液を，該担体の重量を基準にし
て0.1〜１重量％の量で溶解された生体適合性ポリマー
を含有する溶媒中に調製すること；そして，薄い一体型
メンブレンを生じる条件下で，該懸濁液から溶媒を除去
することを包含する。
本発明の他の方法は，親和性リガンドで誘導体化され
ていないか，官能基化されているか，または誘導体化さ
れた微粒子状担体の懸濁液を，該担体の重量を基準にし
て0.1〜１重量％の量で溶解された生体適合性ポリマー
を含有し，さらに該ポリマーの重量を基準にして0.5〜
５重量％の量で溶解された適合性孔調節成分を含有する
溶媒中に調製すること；該懸濁液から溶媒を除去するこ
と；そして，薄い一体型メンブレンを生じる条件下で，
該コーティングから孔調節成分を除去すること，を包含
する。
体外灌流を行う本発明の方法は，（ａ）被験者から体
液を取り出すこと；（ｂ）該体液を次のような親和性マ
トリックスに通過させること；ここで，該親和性マトリ
ックスは，（ｉ）特異的な親和性リガンドで誘導体化さ
れた固体微粒子状の担体と，（ii）該誘導体化担体を被
覆する生体適合性ポリマーコーティングとを有し，該ポ
リマーコーティングが少なくとも20Åの孔径を有する一
体型メンブレンタイプのコーティングであり，該コーテ
ィングが該マトリックスから微粒子が濾過されることを
防止する；そして（ｃ）該処理された体液を該被験者に
戻すことを包含する。
新規免疫吸着剤物質は，たとえば，血流からの抗体の
ような特異的物質の選択的除去に使用される。血液を患
者から採取し，本発明のメンブレン被覆担体を通して全
血として循環させ，不必要な物質を除去して処理した血
液を直接患者に返還する。あるいは，処置前に全血から
血液細胞を分離することもできる。次に分離した血漿を
メンブレン被覆担体を通過させ，それを患者に返還して
処理する。分離した血液細胞はまた，直接あるいは処理
済の血漿と混合したあと，患者に再注入することもでき
る。
本発明のメンブレン被覆担体は，使用時には，一般
に，親和性リガンドを含む。リガンドは，たとえば，ヒ
ト血液型群のオリゴ糖決定基のような化学的に合成され
た構造から選択される。このリガンドは，シリカ粒子，
多孔性ガラスなどのような支持微粒子に直接またはリン
カーを用いて共有結合的に付着させるか，あるいは望ま
しくは適当な担体分子を用いて，非共有結合的に吸着す
ることができる。このようにして得た免疫吸着剤を，本
発明のメンブレン型被覆方法により，微粒子を防ぐが除
去すべき成分を含む全血は通過させ，その成分が特異的
リガンドに達することを可能にして，全血の血液灌流
（あるいは一般的な使用）により適した特性を与えるよ
うに修飾される。
A.定義 本明細書中で使用される，「生体適合性メンブレン型
コーティング」とは，本発明の方法を用いて不活性担
体，あるいは官能基化または親和性誘導担体に被覆され
た物質をさす。そして，この物質は，組成の点からは，
生理的物質に関しては化学的に不活性であり，血液を含
めて体外液と接触させて使用するときには生体適合性で
ある，合成のあるいは自然界由来のポリマー物質であ
る。生体適合性は，特定条件下で使用する時，二次的な
アルブミン・コーティングの形成により増強されると考
えられる。
「孔調節成分」とは，コーティングの調製に使用され
る溶媒，および後述の溶媒気化ステップに用いるゲル化
／湿潤化／濾過媒体の両方に可溶な物質をさす。孔調節
成分はまた，誘導体化担体へのコーティングの形成に関
しても不活性である。孔調節成分は，非溶媒あるいはポ
リマー膨潤剤であり，これは，孔の大きさおよび／また
は数を制御し，従って被覆されたマトリックスのぬれや
すさおよび安定性を制御する機能を有する。その例とし
ては，たとえば，特に分子量300〜20,000のポリエチレ
ングリコール（PEG），ポリプロピレングリコール，ポ
リビニルアルコール，ポリビニルピロリドン（PVP）の
ような低分子量のポリマー，あるいはその他の低分子量
で比較的親水性のポリマーが含まれる。Tween-20,Trito
n-X,種々のSolulan,電解質などのような非イオン性界面
活性剤もまた使用され得る。
「不活性担体」とは，コーティングポリマーが付与さ
れる微粒子状不活性物質をさしていう。「誘導体化」担
体とは，親和性リガンドを複合化した不活性担体をさし
ていう。リガンドは，担体あるいはリンカーに直接共有
結合的に（あるいは非共有結合的に）結合しており，時
には担体も使用され得る。
「官能基化」担体とは，リンカー成分だけが，あるい
はさらなる複合化のための官能基を与える成分（たとえ
ば，カルボキシル基を生じるスクシニル基）が付着した
不活性担体をさしていう。官能基化担体とは，本発明の
メンブレン型コーティングフィルムによって被覆された
担体，あるいは被覆されていない担体の両方をさしてい
う。
「非誘導体化担体」とは，付加リンカーあるいは親和
性リガンドを持たない担体をさしていう。非誘導体化担
体の定義に適合する上で，本発明のコーティングが付与
されているかどうかは問題とならない。
「リンカー」とは，微粒子状担体から親和性リガンド
を切り離す役割をする成分をさしていう。「リンカー」
と，さらなる複合化のための官能基を与える一般的成分
との間の差異は厳密ではなく，またそのような厳密さは
重要ではない。親和性リガンドが，担体に複合化される
前にリンカーあるいは「リンカーアーム（linking ar
m）」によって与えられることは可能であり，またしば
しばそうである。リンカーは，担体が元来持つ官能基あ
るいは付加的複合化成分によって与えられる官能基に結
合しうる官能基を含む。
B.材料 本発明は，血液灌流，ならびにより需要の低い血漿分
離交換法および通常のアフィニティークロマトグラフィ
ーでの使用のために安全な被覆・保護された親和性吸着
剤を得るための方法を提供する。
担体 親和性マトリックスは，固定支持微粒子に複合化した
あるいは結合した特異的リガンドを持つ，いかなる誘導
体化微粒子であってもよい。
本発明の基質の調製にあたっては，上記従来の技術の
項に示したように，広汎なかかる固体微粒子担体が記述
されている。本発明に有用な固体支持微粒子は，種々の
微粒子形態の不活性物質であり，それには，シリカ粉末
のような種々のシリカ誘導体，多孔性ガラスのような合
成ケイ酸塩，珪藻土のような生物由来のケイ酸塩，カオ
リナイトのようなケイ酸塩含有物質などが含まれる。そ
の他の適切な担体としては，以下に述べるようなコーテ
ィングポリマーあるいはアルミナのような一般的に使用
されるクロマトグラフィー担体として有用なものを含め
て，ポリスチレン，ポリプロピレン，多糖類などのよう
な合成樹脂あるいは微粒子状ポリマーが含まれる。ケイ
酸含有物質が特に望ましい。特に望ましいのは，表面に
水酸基を有するクリストバール石（Cristobolite）タイ
プの焼成珪藻土である。これらはリガンドの共有結合的
な結合において都合がよい。サイズは，約150メッシュ
から12メッシュまで目的用途に応じて変えられ得る。血
液灌流の場合には,60/30メッシュが特に望ましい。
親和性リガンド 固体担体（以下に述べるように被覆されているか，あ
るいは被覆されていない）は，親和性リガンド…すなわ
ち，親和性担体によって処理されるサンプルの成分につ
いての特異性を有する物質…に直接複合化されている
か，あるいは共有結合的または非共有結合的に結合され
ている。そのようなリガンドは，免疫グロブリン;Fab,F
（ab′）2，あるいはFab′フラグメントのような免疫グ
ロブリンのフラグメント；ビオチンおよびアビジンのよ
うな特異的相互作用物質；プロタミンのような生体反応
性タンパクあるいはヘパリナーゼのような酵素；ヌクレ
オチド配列；ヘパリンのようなグリコサミノグリカン；
および様々な生物学的物質の抗原部分あるいは特異的反
応領域を表わす糖成分を含む。あるリガンド，特に糖成
分は，例えば，タンパクとの複合体として与えられう
る。本発明の特異的吸着剤においては，このリガンド
は，固体担体に受動的に複合化されているか，あるいは
ポリマーコーティングが付与される前または後に直接，
もしくはリンカーを介して固体担体に複合化される。リ
ンカーは，代表的には，単に固体担体の表面からリガン
ドを遠ざける役割だけを果たす適当な長さの有機二官能
成分である。適当なリガンドおよびリンカーは，例え
ば，米国特許第4,137,401号,4,238,473号および4,362,7
20号に開示されているものである。
本発明の親和性マトリックスを特徴づけるメンブレン
型コーティングは，単一メンブレンの物理的および機械
的特性を持つが，液体中の処理されるべき物質が担体に
結合する親和性リガンドに容易に接近しうるように20Å
以上の孔を有する一体化されたフィルムである。メンブ
レン自体は，フィルムが微粒子全体にわたって一体化す
るが，表面には必要な孔を残すように，ポリマーから形
成される。以下に述べるように，様々なポリマーが使用
できるが，必要な孔の大きさおよび一体化されたフィル
ムを得るために使用する工程および条件は，選択するポ
リマーの性質に依存する。
メンブレン型コーティング 疎水性の高い物質ほど親水性の物質よりも一体型メン
ブレンが容易に得られるので，疎水性ポリマーが望まし
い。コーティングおよび吸着工程の最終段階は水性媒体
中で実施されるため，メンブレン形成を極めて慎重に制
御して操作しないと，疎水性ポリマーは「脱落する」コ
ーティングを形成する傾向がある。従って，例えば，先
行技術であるChang（前出）のコロジオン・コーティン
グは，完全なメンブレン形成を確保するパラメータに注
意を払わずに実施され，また目的とする疎水性ポリマー
を使用しないので，本発明の範囲には含まれない。
疎水性ポリマーを使用すれば，一体型メンブレンタイ
プのコーティングの形成は比較的容易である（支持のた
めに適切な比率のポリマーを使用し，慎重に溶媒を蒸発
させることを必要とするだけである）。適当な数および
大きさの孔の形成を確保するために，疎水性ポリマーを
使用する時には，「孔調節物質」を含む必要があると考
えられる。この物質は，代表的には低分子量のポリマー
であり，コーティングに使用される溶媒，および，特に
予備的な微粒子の除去を行うためのゲル化／湿潤化／濾
過に用いられる媒体において可溶性でなければならな
い。
本発明の方法において生体適合性メンブレン型コーテ
ィングとして使用しうるポリマーの例には，疎水性物質
が包含され，それには，例えば，ポリスチレン，ポリエ
ーテルウレタン，ポリスルホン，ポリ塩化ビニルのよう
なフッ素化または塩素化ポリマー，ポリエチレンおよび
ポリプロピレン，ポリカーボネート，およびポリエステ
ルがある。疎水性ポリマーはまた，他のポリオレフィン
を包含し，それには，例えば，ポリブタジエン，ポリジ
クロロブタジエン，ポリイソプレン，ポリクロロプレ
ン，ポリハロゲン化ビニリデン，ポリ炭酸ビニリデン，
およびポリフッ化エチレンがある。スチレン−ブタジエ
ン共重合体あるいはα−メチルスチレンとジメチルシロ
キサンとの共重合体のようなコポリマーもコーティング
として有用である。本発明において有用なその他のポリ
マーは，合成または天然ゴムならびに脂肪族または芳香
族成分を含有するポリシロキサン（シリコーンポリマ
ー）である。それには，例えば，ポリジメチルシロキサ
ン，ポリフェニルメチルシロキサン，ポリトリフルオロ
プロピルメチルシロキサンがある。以下に挙げるような
ポリアクリロニトリルあるいはアクリロニトリル含有コ
ポリマーも有用である：ポリα−クロロアクリロニトリ
ルコポリマー；ポリラクタムおよびポリアリレートを含
むポリエステル；ポリアルキルアクリレートおよびポリ
アルキルメタクリレート；アルキドあるいはテルピノイ
ド樹脂；脂肪族含有ポリスルホネート，ポリアルキレ
ン，ポリスルフェートを含むポリスルホン。より疎水性
の高いポリマーには以下のような物質が含まれる：比較
的分子量の高い，ポリエチレングリコールおよびポリプ
ロピレングリコールのようなポリアルキレングリコー
ル；ポリアリレンオキシド；ナイロン；ポリビニルアル
コール；およびポリエチレンメチルホスフェートのよう
なポリホスフェート。上記のすべてについて，ブロック
・インターポリマーおよびグラフトポリマーを含むコポ
リマーおよびそれらのブレンドが使用され得る。適切な
生物学的に誘導されたポリマーは，セルロースポリマー
のようなポリヒドロキシ物質，血清アルブミンおよびコ
ラーゲンのようなタンパク，グリコサミノグリカン等を
含む。
ポリマー，特にポリシロキサン，ポリヒドロキシ物
質，およびタンパクは，コーティングの付与後あるいは
コーティングの形成中に架橋され得る。
親和性リガンドと反応性のあるより大きな成分の吸着
に関するマトリックスの性能およびそのぬれやすさは，
以下に述べるようなある環境下において孔調節成分を包
含することにより増強される。
親水性ポリマーコーティングを使用する場合には，メ
ンブレンの一体性を達成することが既に困難であるの
で，孔制御成分を添加することは推奨されない。疎水性
ポリマーについては，リガンドと吸着される物質の相互
作用が十分小さい成分に関わっている場合には，孔制御
成分の添加は必要ないと考えられる。例えば，ポリスチ
レン・コーティングを使用して,IgMが担体に複合化され
た親和性リガンドに吸着されるのに十分な大きさの孔
が，この成分を添加することなく形成される。
C.コーティング工程 本発明の担体は，メンブレンの表面全体にわたって一
体化され，かつ的確な大きさの孔を持つメンブレン型の
コーティングを有することを特徴とする。このコーティ
ングを得る工程は，メンブレン型のコーティングフィル
ムの孔の数および大きさが制御された所望の特性を与え
る上で重要であり，担体のぬれやすさおよび安定性もメ
ンブレンによって制御される。このメンブレンタイプ・
コーティングを調製するための工程においては，従っ
て，使用するポリマーの性質と濃度を含めたコーティン
グ溶液の組成ならびにゲル化／濾過浴媒体の組成と性質
を含めた蒸発およびゲル化の条件が，これらの結果を得
る上で重要である。一般に一体型メンブレンを得るため
の方法は，メンブレン形成技術において知られており，
これらの方法が本発明の親和性担体に適用される。
誘導体化担体は，選択したポリマーに適した方法に従
って，少なくとも20Åの孔を有する生体適合性ポリマー
のメンブレン型フィルムで被覆される。メンブレン型コ
ーティングの孔の大きさは本発明の方法において制御す
ることができ，従ってその後の担体の誘導体化を可能に
するように調節できるので，コーティング処理は官能基
化の前または後，あるいは特異的リガンドへの担体の誘
導体化の前または後に実施できる。
本発明の方法においては，従って，保護コーティング
メンブレンが，望ましい厚さの一体型メンブレンを得る
ための適量のポリマーを含む媒体においてポリマー・コ
ーティングを与えることにより，誘導体化，官能基化，
あるいは非誘導体化担体に付与される。この量は,12〜1
50メッシュの微粒子の場合には，微粒子担体の重量の0.
1〜１％にあたるポリマーの重量である。十分に混合
し，適当な期間，典型的には15〜30分間インキュベート
した後，ポリマー被覆微粒子が乾くまで真空下で溶媒を
蒸発させる。当該技術において理解されているように，
ポリマーは，コーティング工程中，あるいはその直後，
望ましくは溶媒の蒸発前に，架橋されうる（架橋されな
いこともある）。次に乾燥した微粒子をゲル化／湿潤化
／濾過媒体，代表的には水性媒体において湿潤化させ，
ポリマーのゲル化，非一体化成分の濾過を行ない，存在
している微粒子（fines）を除去する。ポリマー溶液の
組成，温度，インキュベートの時間，溶媒蒸発速度，ゲ
ル化条件等のパラメータを，薄い多孔メンブレンの形成
において代表的に使用されるものに類似するように調製
することにより，生じるフィルムは物理的な一体性を有
する。
酢酸セルロース，ナイロン，血清アルブミン等のよう
に，ポリマーが比較的親水性であれば，適当な大きさの
孔形成は自動的に生じうる。しかしながら，一体化した
コーティングを得ることはより困難である。ポリスチレ
ンやポリスルホンのような疎水性ポリマーを使用する時
には，コーティングが20Å以上の孔を持つように工程を
修正しなければならない。これは，コーティング混合物
への孔調節成分の添加によって達成される。上記の方法
と同様に，有効濃度の孔調節成分が存在する時には，適
当な時間攪拌しながらインキュベートした後，溶媒を蒸
発させ，乾燥固体をゲル化／湿潤化／濾過水性媒体に再
懸濁し，微粒子（fines;被覆されていないポリマーゲ
ル，孔調節の非溶媒成分，および残留溶媒を含む）を除
去する。
典型的には，この工程は，固体担体をポリマーと孔調
節成分の両方を含む溶液中に懸濁することによって実施
される。ポリマーの濃度は，懸濁される固体担体の重量
の0.1〜１％，好ましくは0.5％である；孔調節成分は，
添加される生体適合性ポリマーの重量の0.5〜５％，好
ましくは約１％の量で存在する；従って，この成分は実
質的に低い濃度で存在する。孔調節成分の選択は，もち
ろん，ポリマーの選択，ポリマーに適した溶媒，および
ゲル化／湿潤化／濾過媒体に依存する。孔調節成分は，
ポリマーと相溶性であり，かつ溶媒およびゲル化／湿潤
化／濾過媒体に可溶でなければならない。
典型的なプロトコールにおいては，ポリマー物質を必
要に応じて加温しながら適切な溶媒に約2g/lの濃度で溶
解させ，適量，典型的には約20mg（膜被覆を形成するポ
リマーの重量の約0.5〜５％）の孔調節成分を，攪拌し
ながら添加する。両方の成分を溶解させた後，乾燥固体
担体約400g/lすなわちメンブレンコーティングを形成す
るポリマーの重量の100〜1,000倍を，穏やかに攪拌して
溶液中に懸濁させる。次に懸濁液を適当な時間，約15〜
30分間穏やかに攪拌し，その後ポリマーを架橋させ（あ
るいは架橋させないで），真空下で溶媒蒸発させる。攪
拌と蒸発はともにロータリーエバポレーターを用いて簡
便に実施される。蒸発の最終段階で温度を上昇させても
よく，被覆されたマトリックスは完全に乾燥したことが
確認されるべきである。
次に被覆マトリックスを徐々に室温まで冷却し，ポリ
マーに応じて，好ましくは室温あるいは約４〜40℃の温
度で，適当な時間（典型的には１〜２時間），ゲル化／
湿潤化／濾過媒体（典型的には，ポリマーの性質に応じ
て，アルコール（たとえばエタノール），酸（たとえば
硫酸）などの孔の大きさを制御するのに役立つ他の成分
を含有する水浴）中に懸濁する。マトリックスは，適切
に被覆された場合には，この湿潤化工程中に目に見える
ゲルあるいは沈澱を生じない。
孔調節成分が含まれていたかどうかにかかわらず，孔
調節成分あるいは膨潤剤および残留溶媒を含む，微細な
粒子あるいは被覆混合物の痕跡を取り除くために，懸濁
したマトリックスを水のような濾過媒体で十分に洗浄す
る。
次に洗浄したマトリックスを吸引し，そのあと約60℃
に加熱することにより，恒量に達するまで乾燥する。
マトリックスがまだ特異的リガンドで誘導体化されて
いなければ，懸濁したメンブレン被覆マトリックスに関
して，適切に誘導体化工程を実施する。
D.被覆マトリックスの特性 本発明の被覆マトリックスは，適切な容量，孔隙率，
取扱い特性，安定性，必要に応じて特異性を有し，標準
的なクロマトグラフ法および体液の体外処理において有
用である。従って，この材料は，付随する生物学的成分
を乱すことなく所望の分離あるいは除去を行うことがで
きるという点で生体適合性である。
分子レベルでは，アフィニティー・クロマトグラフィ
ーあるいは灌流において使用する材料は，適当な親和性
リガンドに吸着されるか，もしくは直接またはリンカー
アームを通して共有結合された微粒子状の固体担体とい
える。完全に誘導体化された担体は，結合する材料に適
した大きさの孔を持つポリマー材料の薄い一体型メンブ
レンタイプの膜で被覆されている。体液由来のタンパク
あるいは抗体などの特異的物質の除去に対して，適当な
孔の大きさは，およそ20オングストロームかそれより大
きい。本発明の材料は，ポリマーコーティングにではな
く微粒子状担体に親和性リガンドが結合していること，
および多孔性の，薄い外皮コーティングを特徴とする。
（親和性リガンドで誘導体化されていない被覆担体も同
等に本発明に包含される。これらは，本発明の材料の形
成における中間体であるか，あるいは非特異的処理にお
いて使用され得る。） E.被覆担体の用途 一般に，本発明の親和性マトリックスは，親和性クロ
マトグラフ担体と類似した方法で，標準的なクロマトグ
ラフ法ならびに血漿や血液などの体液の体外灌流に使用
される。後者の目的については，好ましい装置は，第１
図に示すものに代表される，マトリックスを納めるため
のカートリッジを使用するものである。図が示すよう
に，カートリッジ１は円筒状の胴部2,一対の先端キャッ
プ3,各々の末端の一対のメッシュスクリーン4,および保
護キャップ栓５から成る。同様の様々なデザインが使用
できるが，カートリッジ部品の材料自体が，生体適合性
でなければならない。そのような材料はポリエチレン，
テフロンあるいはレキサンポリカーボネートなどであ
る。マトリックスを充填したカートリッジは，胴部２の
一方の端にメッシュスクリーン４を置き，スクリーン４
の上に先端キャップ３を取り付けて組立てられる。次い
で胴部２に本発明の親和性マトリックス６を充填し，も
う一方のメッシュスクリーン４を置いて先端キャップ３
を正しい位置に取り付けると組立てが完了する。一般
に，充填は滅菌下で実施する。もしくは充填後に，たと
えばエチレンオキシド滅菌法によってカートリッジを内
容物と共に滅菌してもよい。次に親和性マトリックス
を，発熱物質を含まない通常生理食塩水に注入し，洗浄
してマトリックスから放出されたか，あるいは調製中に
残留した小さな粒子を確実に除去して，湿潤化する。
次いでカートリッジをヒト血清アルブミンの１％通常
生理食塩水溶液で満たし,4℃で保存する。使用の前に，
有効量のヘパリンを含有するACD-Aのような適当な抗凝
固剤を添加した0.9％塩化ナトリウム溶液でカートリッ
ジを洗浄する。この溶液は，例えば250mlのカートリッ
ジの場合には,6,000ユニットのヘパリンを含有する150m
lのACD-Aを添加した約１の塩化ナトリウム溶液であ
る。
使用時には，患者の腕にシャント（例えばプラスチッ
クの医療用グレードのチューブの輪）を設置し，患者に
直接血液を戻しながらカートリッジを通して血液を循環
させることによって，被験者の血液あるいは血漿を，カ
ートリッジに通過させる。代わりに，細胞成分から分離
した血漿を通過させるために,IBM2997型のような連続流
動式血液分離装置あるいは半透過性膜分離装置により，
チューブを通して血液を循環させることもできる。その
あと血漿をカートリッジに通過させ，直接あるいは細胞
と混合したあと，被験者に戻す。
被覆されたハンプテン化担体は，所望の血液成分ある
いは他の体液由来のリガンドの精製にも使用できる。体
液を,4℃〜室温で適当な特異的被覆吸着剤と共に震盪
し，そして特定のリガンドに適した方法を用いて吸着し
た生物学的物質を溶出させる。例えば，抗体を溶出させ
る場合には,0.15M生理食塩水中の２％アンモニアあるい
はpH2に調整した0.2M酢酸で十分に溶出される。使用し
うるその他の溶出剤は,1％アンモニアの生理食塩水溶
液,0.2M塩酸グリシン，種々のカオトロピックイオン，
および0.1M糖類溶液である。
抗Ａあるいは抗Ｂ抗体の除去については，以下に示す
実施例１のように調製されたマトリックス約25mgで生理
食塩水力価1/64の抗血清1mlから全抗体を十分に除去す
ることができる。
マトリックスは，新しいサンプルに適用する前に最初
の緩衝液で再平衡化させた場合，活性を失うことなく数
回再使用することができる。精製に用いる場合は，血液
灌流とは対照的に，より小さな粒子サイズ（100/120メ
ッシュ）が好ましい。
F.実施例 以下の実施例は本発明を例示するためのものであっ
て，本発明を限定することを意図するものではない。一
般に，実施例および付随する調製方法は，親和性リガン
ドの微粒子担体への結合ならびに本発明のメンブレン型
コーティングによる誘導体化担体，官能基化担体，ある
いは非誘導体化担体の被覆を例示する。上述したよう
に，どのような目的でも，固体担体の処理のこれら２つ
の局面がある。グリコシドハプテンをリンカーアームを
通して微粒子状担体に誘導するのに適した方法は，米国
特許第4,137,401;4,238,473;および4,362,720号に述べ
られている。これらは参考文献としてここに示されてい
る。調製法Ａはこれらの特許において使用されている方
法を例示するものである。
調製法A:三糖類のアミノシル化珪藻土への結合 A.WestalとFilbert,Meth Enzymol（1974）34B:64およ
びWeetall,Nature（1969）223:959-960の方法を用い
て，酸で洗浄した珪藻土をアミノシル化した。この方法
は上に引用した米国特許第4,137,401および4,238,473号
において使用されている引用特許第4,362,720号に述べ
られているように，合成ハプテンであるＡ三糖類の８−
アジドカルボニルオクチル誘導体，図２のIA,（ATS）
（2.31g）を，乾燥した条件下でアセトン／ドライアイ
ス浴に入れたフラスコ中でかき混ぜながら30ml乾燥DMF
に溶解させる。次に浴の温度を−25℃に調整し,1,4−ジ
オキサン中の4.55M HCl 1.35ml,次いで亜硝酸ｔ−ブチ
ル252μｌを添加する。反応混合物を30分間攪拌し，ジ
イソプロピルエチルアミン1.2mlを添加する。そのあと
アジド溶液を，−２℃で乾燥アセトニトリル8.4l中のア
ミノシル化珪藻土（3kg）の懸濁液に30分間急速攪拌し
ながら添加し，続いて2.5時間ゆっくり攪拌する。生じ
たハプテン化珪藻土を鎮静させ，溶媒を減圧下で蒸留す
る。担体のハプテン化は,DuBoisら，Anal Chem（1956）
28:350-356のフェノール−硫酸法によって確認する。典
型的には,0.35μmolハプテン/g吸着剤の最小値が得られ
る。
メタノール（7.2l）を乾燥ハプテン化珪藻土に添加
し，減圧下で10分間攪拌し,1メタノール中酢酸無水物
0.18lを添加する。１時間攪拌を続け，反応混合物を室
温で一晩放置する。溶媒を排液法によって除去し，最後
に減圧下で蒸留する。得られた生成物を，光路長1cm,42
0nmで測定して，上澄みの光学的密度が0.1未満になるま
でくり返し洗浄する。２回目の洗浄サイクルに4lの飽和
重炭酸塩溶液を添加して残留酢酸を中和する。洗浄した
生成物を減圧濾過によって乾燥し,2lのメタノールで再
び洗浄し，ステンレススチール製のトレーに拡げて乾燥
器に入れ,70℃で一晩乾燥する。典型的な収率は約2.85k
gである。
B.A項の方法を,A三糖の８−アジドカルボニルオクチ
ル誘導体の代わりに，第２図の1Bの対応するＢ三糖，あ
るいは第２図でII-VIIの番号を付したオリゴ糖類を用い
て同様に実施する。
実施例１ Ａ三糖誘導体化担体のコーティング A.PEGを孔調節成分として用いる，ポリスチレン被覆誘
導体化担体 約6.4lのトリクロロエチレンを45℃まで加温し,14,25
gのポリスチレン（分子量250,000）を添加し，溶解させ
る。攪拌しながら，孔調節成分であるPEG-300を0.1425g
添加する。
ついで調製物Ａのハプテン化担体を添加し，スラリを
ロータリーエバポレーターで20分間回転させ，次に減圧
下で溶媒を蒸発させる。温度を60℃まで上昇させ，マト
リックスが乾燥したように見えるまで溶媒の蒸発を続け
る。
マトリックスを徐々に室温まで冷却し，周囲条件下で
２時間水に懸濁させる。マトリックスは容易に湿潤化さ
れ，目に見えるゲル化／沈澱はほとんどまたは全く生じ
ない。ついで上澄み液にゲル化ポリマーがなくなるま
で，かつ粒子が見られなくなるまで，マトリックスを水
で完全に洗浄する。洗浄されたマトリックスを，ブーフ
ナー漏斗で吸引乾燥し，乾燥器内で60℃で４時間または
それ以上，恒量に達するまで乾燥する。コーティングさ
れた物質の収率は，典型的には2.8kgである。
B.別のコーティング ポリスチレンの代わりに別のポリマー,PEGの代わりに
別の孔調節成分を用いるか，あるいは用いず，そして適
切な溶媒を用いて，かつATSで誘導体化された30/60また
は100/120メッシュの珪藻土を使用したこと以外，この
実施例のＡ項で示されたのと同じ一般的手順を用いて，
下記のコーティングされたマトリックスを調製した。
実施例２ ヒト血清アルブミン（HSA）で被覆されたATS−誘導体化
珪藻土 200mlの水の入った１蒸発フラスコで，ゆっくりと
タンパクを溶解して,0.40g HSAの溶液（Sigma ♯A 1653
の画分）を調製する。80gのATS−誘導体化珪藻土（調製
物Ａ）をこの溶液に添加し，フラスコを穏やかに１時間
回転させる。上澄み液を傾瀉し，ブーフナー漏斗でマト
リックスを吸引乾燥する。上澄み液から全部で78.2mgの
タンパクが回収される。（代わりに，本質的にすべての
タンパクがマトリックス上に析出するように，マトリッ
クスを減圧下で完全に乾燥してもよい。） 次いで0.033MのKH2PO4中の1.25％グルタルアルデヒド
溶液200mlを添加して，析出あるいは吸着したタンパク
を被覆マトリックス上に架橋させる。混合物を30分間低
速で攪拌し，ついで１晩室温で放置する。沈降したマト
リックスを傾瀉し,1MのNaClを含む水500mlですすぎ洗い
をして，マトリックスにゆるく結合しているだけのタン
パクを除去する。タンパクの架橋は，フラスコの周りに
不溶性の膜が出現することからわかる。しかしながら，
グルタルアルデヒドの架橋後にマトリックスをすすぎ洗
いすることによって回収されたタンパクおよびタンパク
フィルムの量が，無視できるほど（約2mg）のものであ
るのでマトリックス上に固定されたHSAの量はマトリッ
クス1g当り約4mg,あるいは初めに減圧乾燥された場合に
は5mg/gである。
ついでコーティングされたマトリックスを過剰の水
（3l）で洗浄して残留グルタルアルデヒドを除去し，か
つ視覚的に透明な上澄み液が得られるようになるまで微
粒子による曇りを除去する。最後にマトリックスを吸引
乾燥し，恒量に達するまで,1晩室温に放置して風乾す
る。次いでこの生成物を，微粒子および生物学活性につ
いてテストする。
実施例３ ポリスチレンであらかじめ被覆された，アミノシル化珪
藻土への抗原ATS-BSAの結合 調製物Ａのように調製されたアミノシル化珪藻土を，
実施例１に記載されているようにポリスチレンで被覆す
る。得られた，被覆され，かつ官能基化された珪藻土の
試料1gを,2.5％グルタルアルデヒドを含有する,10mlの
0.1Mリン酸塩緩衝液pH7中に懸濁し,1時間10℃におい
て，転倒型（end over end）回転でインキュベートし，
次に水でよく洗浄してグルタルアルデヒドを除去する。
ATS-BSA複合体2.675mgの溶液（0.54μｍのATSを含む）
を，同じ緩衝液中で調製し，グルタルアルデヒドで活性
化された被覆マトリックスへ添加し,1晩室温で振とうす
る。上澄み液を傾瀉し,0.1Mリン酸塩緩衝液pH7中1MのNa
Cl溶液で，マトリックスを十分に洗浄する。
１つの手順によれば，上澄み液および洗浄液のタンパ
ク測定では，グルタルアルデヒド（BX7-20A）を介して1
gのマトリックスと化学的に結合した0.43μmolのATSの
損失が認められた。グルタルアルデヒドの存在下にATS-
BSAが結合された同様の調製法では,0.09μm ATS/g（BX7
-20A1）であった。複合マトリックスを水洗いし，恒量
に達するまで室温で風乾する。
実施例４ 微粒子の評価 洗浄によって本発明のマトリックスから除去されうる
微粒子の量を測定するためにいくつかの手順を用いた。
最初の粗試験では,0.3gのサンプルを計量し,5ml試験管
に入れ，次に3mlの0.1M PBSを添加する。混合物を10分
間放置したままにし，ついで試験管を10回逆さにする。
１分間の静置後，上澄み液を1cmセルに移して,420nmで
光学密度を測定する。
この手順はまた，親和性マトリックスで体外的に使用
される間に遭遇するような条件をシミュレートするため
に修正される。約75gのマトリックスを，第１図に示さ
れたカートリッジに入れ，カートリッジを，微粒子の評
価に先立って,1時間血液ミキサーで転倒型回転を行う。
カートリッジがマトリックスで完全に満たされるように
注意を払わなければならない。ついでマスターフレック
ス（Masterflex）ポンプを使って，流速40ml/分で,0.9
％生理食塩水（滅菌のため0.2μｍで濾過された）で，
カートリッジを灌流する。装置を通して全部で10lの生
理食塩水を系に通過させて灌流し，洗浄水１リットル毎
に20mlのサンプルを採取する。１）直径が５μｍより大
きい微粒子，および２）直径が25μｍより大きい微粒子
について，微粒子を微粒子/mlで計数する。数は,C256チ
ャネライザーを付いたコールターカウンタのModel ZMを
用いて測定する。灌流およびカートリッジの回転に先立
って，生理食塩水に対して対照の計数を実施する。
第３図は，対照サンプルに関して,5μｍより大きい直
径を有する微粒子について得られた結果を示す。対照サ
ンプルの１つは，微粒子担体を取り巻く一体型メンブレ
ンで被覆されており（正の対照），もう１つはChangに
よって記載されている（上記）のような,0.36％コロジ
オンで被覆されたマトリックス（負の対照）である。ど
ちらの対照も非誘導体化珪藻土であり，正の対照につい
ては，コーティング溶液が孔調節成分を含まないことを
除いて，実施例１の手順が用いられる。予期されたよう
に，ポリスチレンで被覆されたマトリックスは，コロジ
オンで被覆された負の対照に比べて，比較的微粒子が含
まれていない。
第４図は，種々の量の孔調節成分であるPEG-300を用
いたこと以外，実施例１と同様にして調製された。非誘
導体化ポリスチレン被覆珪藻土についての結果を示す。
これらの結果の示すところでは，実施例１の条件すなわ
ち１％ PEG-300（このパーセンテージは，用いられた
全ポリマーコートを基準としている）は，第４図に示さ
れる，より多量の孔調節用PEG-300（４％および28％）
の場合よりも優れた結果が得られる。
表１は,25μｍ以上の直径を有する微粒子について，
第４図の３つの試験組成物，および第３図のポリスチレ
ン被覆された正の対照についての結果を示す。すべての
孔調節成分の含有率で，この大きさの範囲では同様の微
粒子数を示した。
前記手順は，液体の体外処理において遭遇するような
その他の条件をシミュレートするために，下記のように
さらに修正された： （ａ）カートリッジに入れた75gのマトリックスを用い
た標準的操作手順では，血液ミキサーで１時間回転乾燥
し40ml/分の速度で10lの生理食塩水を用いて洗浄した。
サンプルを，洗浄の最初と各１リットルの洗浄後に採取
した。
（ｂ）前記手順（ａ）に引続き,15分間一時的に流れを
中断した後にサンプルを採取した。
（ｃ）手順（ｂ）に引続き,1晩の長時間流れを中断した
後にサンプルを採取した。
（ｄ）前記手順（ｃ）に引続き，移送をシミュレートす
るために，カートリッジに物理的な攪拌（physical dis
turbance）を加えた後，サンプルを採取した。
（ｅ）前記手順（ｄ）に引続き，湿潤条件下で１時間回
転することによってさらに物理的に攪拌した後にサンプ
ルを採取した。
（ｆ）前記手順（ｅ）に引続き，マトリックスの入って
いるカートリッジを，シミュレートされた条件下で，突
然の衝撃によって物理的な攪拌の極限条件に付した後で
サンプルを採取した。
（ｇ）CF2-14Aで標準的手順に続いて風乾し，−20℃で7
2時間マトリックスを貯蔵した後にサンプルを採取し
た。
（ｈ）前記手順（ｇ）に引続き，他の処理を行なわず
に,37℃で１晩カートリッジをインキュベートした後に
サンプルを採取した。
表１および表２は，これらの特定された条件におい
て，両方の図でも示されているような，下記２つのマト
リックスについての結果を示している。すなわち４％PE
G-300孔調節成分を用いて改質された0.5％ポリスチレン
被覆30-60メッシュ珪藻土であるCF2-14A,および１％PEG
-300のみが使用されていることを除きCF2-14Aと同じも
のであるCF2-16である。追加した処理は，比較的大きな
粒子については微粒子の数に顕著な影響を与えなかった
ようであるが（表１），比較的小さい微粒子の数は，少
なくとも初めは大きく影響されることがありうる（表
２）。このことは特に，条件（ｇ）でテストされたCF2-
14Aサンプルの場合のように，マトリックスが長時間（1
5日間ほど），湿潤条件下に保持される時に起こる。
実施例５ 生体適合性分析： 必須血液成分の溶血および吸着 ポリマー基質を血液と接触させる場合，血小板は特に
吸着性があると考えられる。ポリスチレン被覆された珪
藻土，およびＡ三糖でハプテン化された同様のマトリッ
クスへの血小板の吸着性の度合いを測定した。マトリッ
クスの0.5g部を,3.75mlの血液または生理食塩水を用い
て,37℃で転倒型回転により30分間インキュベートし
た。上澄み液を，血小板（PLT），白血球（WBC），赤血
球（RBC）およびヘモグロビン（HGB）について計数し
た。バックグラウンドを測定するために生理食塩水を用
いた（×109/l）。対照として新鮮な血液を用いた。
試験条件は，平均的成人からの全血6lの体外処理のた
めに,100gのマトリックスが４時間以上使用されると仮
定する；転倒型回転は，カートリッジを通る流れの物理
的な攪拌に近い。結果を表３に示す。
対照（４）として，第二コーティングを得るために，
生理食塩水中の１％HSAで予備インキュベートした,A三
糖でハプテン化されたポリスチレン被覆マトリックスを
使用した。HSAが，ポリマー表面への血小板の吸着性を
減少させることは証明されている（Neumannら，上
記）。これらの結果が示すところでは，マトリックスへ
の必須血液成分の非特異吸着は，あるとしても極めてわ
ずかである。
これらのマトリックスについて，血液をマトリックス
と接触させた場合，認めうるほどの溶血がおこるかどう
かを測定するための試験が行なわれた。溶血分析の詳細
は以下のとおりである： 1gまたは2gのマトリックスを,5または10mlの0.9％生
理食塩水を含有する試験管に別々に入れた。予め採血さ
れたヒトの血液の0.1mlサンプルを,1gmのマトリックス
および生理食塩水の入っている各試験管に，あるいは70
℃で24時間インキュベートした2gのマトリックスの混合
物から抽出された5mlの生理食塩水に直接添加した。同
様に,0.1mlの血液を，負の対照として作用する生理食塩
水（溶血なし）の試験管へ，および正の対照として作用
する蒸溜水（100％溶血）の試験管へも添加した。すべ
ての試験管の内容物を穏やかに混合し，水溶中で37℃で
１時間インキュベートした。マトリックスのサンプルを
除去した後（直接接触法），血液−生理食塩水混合物
を,2,200rpmで５分間遠心分離し，各上澄み溶液の吸光
度を,545nmで分光分析法で測定した。溶血率は，正の対
照の吸光度で割った，試験用サンプルの吸光度と負の対
照の吸光度との差を100倍して決定された。この抽出方
法によれば，結果は0.13〜0.32％の範囲にあった。直接
法によれば,CF2-14BおよびCF2-20Aについて,0.53〜0.73
％の溶血が見られた。（５％以下は非溶血とみなされ
る）。
実施例６ 特異吸着における被覆マトリックスの効力 ATSへの例示したリガンド抗体の吸着における，被覆
マトリックスの効力を示すために，インビトロでの血球
凝集分析を用いた。Ａ三糖にハプテン化されたマトリッ
クス25mgを,0.5mlのＯ−血漿血清（抗A1を含む）を用い
て，血液ミキサーで回転させて,1時間室温（21℃）でイ
ンキュベートする。上澄み液を除去し,A抗原を有する赤
血球で系列希釈して,IgMおよびIgGによる血球凝集の試
験を行なう。
結果を表４に示す。
ポリスチレン被覆された免疫吸着剤Ａは，明らかにそ
の被覆されていないハプテン化形態と同様な効果があ
る。粒子サイズが小さい（100/120メッシュ）免疫吸着
剤も，効果が増加している；その結果は，抗原の複合体
化（ATS-BSA）法が効力に影響を与えることも示してい
る。
実施例７ シミュレートされた血液灌流における成績 体外灌流手順をシミュレートするために，地方の屠殺
場から入手した。ブタの貯溜血液（6l）を，通常の生理
食塩水中のヘパリンおよびクエン酸ナトリウムの溶液で
さらに血液凝固を阻止し，実施例１で調製されたポリス
チレン被覆Ａ三糖誘導体化珪藻土150gを含有するカート
リッジを通して,40ml/分の速度で室温（21℃）において
4.5時間，連続的に再循環させた。30分間隔でサンプル
を採取し，全タンパク，アルブミン，ビリルビン，コレ
ステロール，アルカリ性ホスファターゼおよび乳酸デヒ
ドロゲナーゼについての分析を行なった。これらの成分
の濃度変化は，ほとんどまたはまったく見られなかっ
た。
実施例６に記載されたヒトA1RBCを用いて灌流された
血液における抗体価を測定した。ブタ血漿における抗A1
（IgM/IgG）についての最初の力価は,64/128であった。
これらの値は,2時間の血液灌流後,16/32まで低下した。
（発明の要約） クロマトグラフィー用の微粒子状担体を被覆して，合
成メンブレンタイプのフィルムからなる生体適合性の外
層を与える方法が記述されている。この合成メンブレン
タイプのフィルムは，微粒子の放出を防止するが，親和
性リガンドへの各種成分の吸着を可能にする。マトリッ
クスには，少なくとも20Åの孔径を有するメンブレンタ
イプのコーティングが設けられており，微粒子が濾過さ
れることを防止する。このコーティングは，一体型のメ
ンブレンコートが形成されるような条件下で，固体微粒
子に適用される。メンブレンの孔径および孔数は，次の
ような溶媒中に固体担体を含む懸濁液を処理することに
よって調節することが必要な場合もある。この溶媒は，
担体の重量を基準にして0.1〜１重量％の生体適合性ポ
リマーと，該ポリマーの重量を基準にして0.5〜５重量
％の溶解された適合性孔調節成分を含有する。次いで，
この懸濁液から溶媒が除去される。メンブレンで被覆さ
れた材料は，体液の体外処理または他のクロマトグラフ
ィー技術に用いられる。このような被覆法は，上記の微
粒子状担体が官能基化および／または誘導体化される前
後のいずれかに実施し得る。
【図面の簡単な説明】
第１図は，本発明の免疫吸着剤を用いた血液灌流におい
て使用するカートリッジ装置を示す。 第２図は，本発明の方法において有用ないくつかの親和
性リガンドを示す。 第３図および第４図は，種々の量の孔調節成分による被
覆プロトコールを用いて調製した免疫吸着剤からの微粒
子の放出を示す。

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】特定の成分を選択的に除去する体液の体外
    灌流またはクロマトグラフィーに適する親和性マトリッ
    クスであって、該マトリックスは、 （ａ）固体微粒子担体、 （ｂ）様々な生物学的物質の抗原部分あるいは特異的反
    応領域を表す、生物学的物質または糖成分に由来する特
    異的な親和性リガンド、および （ｃ）生体適合性ポリマーコーティグを有し、 （ｂ）の特異的な親和性リガンドは、（ａ）の該固体微
    粒子担体と結合し、該親和性リガンドが結合した該固体
    微粒子は、（ｃ）の生体適合性のポリマーでコートされ
    ており、 該ポリマーコーティングが一体型メンブレンタイプのコ
    ーティングであり、該メンブレンコーティングが少なく
    とも20オングストロームの孔径を有し、そして該コーテ
    ィングが該マトリックスから微粒子が濾過されることを
    防止する、 親和性マトリックス。
  2. 【請求項２】前記担体が、合成の、鉱物の、および生物
    由来の珪酸塩からなる群から選択された不活性な無機微
    粒子である、請求項１に記載のマトリックス。
  3. 【請求項３】前記親和性リガンドが、糖質部分である、
    請求項１に記載のマトリックス。
  4. 【請求項４】前記親和性リガンドが、リンカーアームあ
    るいキャリアーを介して、前記担体と結合している、請
    求項１に記載のマトリックス。
  5. 【請求項５】前記ポリマーコーティングが、ポリスチレ
    ン、ポリスルフォン、ポリエーテルウレタン、ポリジメ
    チルシロキサン、PSMAおよびBSAからなる群から選択さ
    れるポリマーコーティングである、請求項１に記載のマ
    トリックス。
  6. 【請求項６】前記糖質部分がＡ三糖（ATS）またはＢ三
    糖（BTS）である、請求項３に記載のマトリックス。
  7. 【請求項７】特定の成分を選択的に除去する体液の体外
    灌流またはクロマトグラフィーに適する親和性マトリッ
    クスを含有するカートリッジであって、該マトリックス
    は、 （ａ）固体微粒子担体、 （ｂ）様々な生物学的物質の抗原部分あるいは特異的反
    応領域を表す、生物学的物質または糖成分に由来する特
    異的な親和性リガンド、および （ｃ）生体適合性ポリマーコーティグを有し、 （ｂ）の特異的な親和性リガンドは、（ａ）の該固体微
    粒子担体と結合し、該親和性リガンドが結合した該固体
    微粒子は、（ｃ）の生体適合性のポリマーでコートされ
    ており、 該ポリマーコーティングが一体型メンブレンタイプのコ
    ーティングであり、該メンブレンコーティングが少なく
    とも20オングストロームの孔径を有し、そして該コーテ
    ィングが該マトリックスから微粒子が濾過されることを
    防止する親和性マトリックスである、カートリッジ。
  8. 【請求項８】体液の体外灌流に適する親和性マトリック
    スを有するカートリッジの調製方法であって、 該親和性マトリックスは、様々な生物学的物質の抗原部
    分あるいは特異的反応領域を表す、生物学的物質または
    糖成分に由来する特異的な親和性リガンドが固体微粒子
    担体と結合し、該親和性リガンドが結合した該固体微粒
    子が生体適合性のポリマーでコートされたものであり、
    該ポリマーコーティングが一体型メンブレンタイプのコ
    ーティングであり、該メンブレンコーティングが少なく
    とも20オングストロームの孔径を有し、そして該コーテ
    ィングが該マトリックスから微粒子が濾過されることを
    防止する、親和性マトリックスであり、そして、該方法
    は、以下の工程： 親和性リガンドを体液の体外処理装置用に大きさ、体積
    を作られた固体微粒子担体に結合させる工程； 該親和性リガンドが結合した固体微粒子担体の懸濁液
    を、該担体の重量を基準にして、0.1〜１重量％の量で
    溶解された生体適合性ポリマーを含有する溶媒中に調製
    する工程； 減圧下でのエバポレーションにより、該懸濁液から溶媒
    を除去して乾燥した被覆された微粒子を得、続いて、該
    孔径を有する薄い一体化メンブレンを生じるように、該
    乾燥した微粒子をゲル化／湿潤化／濾過媒体中で処理す
    る工程；および、 体液の体外処理用に大きさ、体積を作られたカートリッ
    ジに該コーティングされた微粒子を充填する工程； を包含する、カートリッジの調製方法。
  9. 【請求項９】体液の体外灌流に適する親和性マトリック
    スを有するカートリッジの調製方法であって、 該親和性マトリックスは、様々な生物学的物質の抗原部
    分あるいは特異的反応領域を表す、生物学的物質または
    糖成分に由来する特異的な親和性リガンドが固体微粒子
    担体と結合し、該親和性リガンドが結合した該固体微粒
    子が生体適合性のポリマーでコートされたものであり、
    該ポリマーコーティングが一体型メンブレンタイプのコ
    ーティングであり、該メンブレンコーティングが少なく
    とも20オングストロームの孔径を有し、そして該コーテ
    ィングが該マトリックスから微粒子が濾過されることを
    防止する、親和性マトリックスであり、そして、該方法
    は、以下の工程： 親和性リガンドを体液の体外処理装置用に大きさ、体積
    を作られた固体微粒子担体に結合させる工程； 該親和性リガンドが結合した固体微粒子担体の懸濁液
    を、該担体の重量を基準にして、0.1〜１重量％の量で
    溶解された生体適合性ポリマーを含有し、さらに該ポリ
    マーの重量を基準にして、0.5〜５重量％の量で溶解さ
    れた適合性孔調節成分を含有する溶媒中に調製する工
    程； 減圧下でのエバポレーションにより、該懸濁液から溶媒
    を除去して乾燥した被覆された微粒子を得、続いて、該
    乾燥した微粒子をゲル化／湿潤化／濾過媒体中で処理す
    る工程； 該孔径を有する薄い一体化メンブレンを生じるように、
    該被覆物から孔調節成分を除去する工程、および、 体液の体外処理用に大きさ、体積を作られたカートリッ
    ジに該コーティングされた微粒子を充填する工程； を包含する、カートリッジの調製方法。
  10. 【請求項１０】前記マトリックスが、リンカーアームま
    たはキャリアを介して前記担体に必要に応じて結合され
    た親和性リガンドで誘導体化され、該担体が、合成の、
    鉱物の、または生物由来の珪酸塩から選択される、請求
    項８または９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記生体適合性ポリマーが、ポリスチレ
    ン、PDMS、PEU、およびポリスルホンからなる群から選
    択される疎水性ポリマーである、請求項９に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】前記孔調節成分がPEGおよびPVPから選択
    される、請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記溶媒が、ジクロロメタン、クロロホ
    ルム、ジクロロエチレン、TCE、DMF、アセトン／水、蟻
    酸、およびエタノールから選択される、請求項９に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】請求項８あるいは９の方法で調製された
    カートリッジを有する、体液の体外処理装置。
  15. 【請求項１５】請求項７のカートリッジを有する、体液
    の体外処理装置。
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