JP2732881B2 - ２段階発酵による多糖類の製造法 - Google Patents
２段階発酵による多糖類の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はバイオマス生産の第１段階では、事実上培養
培地に多糖類は存在しないような２段階の発酵による多
糖類の製造方法に関する。
培地に多糖類は存在しないような２段階の発酵による多
糖類の製造方法に関する。
［発明が解決しようとする課題］ 多くの多糖類を生産する微生物、細菌、真菌は増殖中
にポリマー体を分泌し、前培養培地は急速に粘稠にな
り、これは撹拌効果および培地の通気を減少し、バイオ
マス生産の収率および到達し得る最高細胞濃度を限定し
てしまう。種々の解決法が提案されてきたが細胞増殖と
多糖類生産とを切り放したものであった。これらの解決
法の一つはキサンタンの連続的製法における、アメリカ
特許第3328262号、またはアメリカ特許第3251749号、ま
たはヨーロッパ特許公開第0112661号に記載のような炭
水化物に偏向した培地を用いるものであり、これは、単
一の炭素含有栄養物として、キサンタンを生産するザン
トモナス・カンペストリス（Xanthomonas Campestris）
に多糖類の生合成を許さない、キシロース、またはグリ
セリンのような化合物を前培養培地に導入するものであ
る。
にポリマー体を分泌し、前培養培地は急速に粘稠にな
り、これは撹拌効果および培地の通気を減少し、バイオ
マス生産の収率および到達し得る最高細胞濃度を限定し
てしまう。種々の解決法が提案されてきたが細胞増殖と
多糖類生産とを切り放したものであった。これらの解決
法の一つはキサンタンの連続的製法における、アメリカ
特許第3328262号、またはアメリカ特許第3251749号、ま
たはヨーロッパ特許公開第0112661号に記載のような炭
水化物に偏向した培地を用いるものであり、これは、単
一の炭素含有栄養物として、キサンタンを生産するザン
トモナス・カンペストリス（Xanthomonas Campestris）
に多糖類の生合成を許さない、キシロース、またはグリ
セリンのような化合物を前培養培地に導入するものであ
る。
しかし、第１の解決法では、炭水化物濃度の制御が困
難なため、満足な増殖を維持するが、多糖類の生合成は
弱いものであった。一方、第２の解決法では、増殖中に
多糖類分泌を妨げる炭素含有栄養物は数種の微生物につ
いてしか公知でないことが判明しており、特にすべて種
類の微生物に効果的であるとは考えられていない。本発
明の目的は前培養段階での多糖類の分泌を妨げることで
はなく、かわりに、その生成につれて、これを酵素的方
法により分解するものである。
難なため、満足な増殖を維持するが、多糖類の生合成は
弱いものであった。一方、第２の解決法では、増殖中に
多糖類分泌を妨げる炭素含有栄養物は数種の微生物につ
いてしか公知でないことが判明しており、特にすべて種
類の微生物に効果的であるとは考えられていない。本発
明の目的は前培養段階での多糖類の分泌を妨げることで
はなく、かわりに、その生成につれて、これを酵素的方
法により分解するものである。
［課題を解決するための手段］ 本発明の第１の目的は、増粘性多糖類を生産する微生
物マスの製造方法であり、これらの微生物を、その増殖
を促進し、生成した多糖類の分解を触媒する酵素を含有
する培地中で培養することからなる。
物マスの製造方法であり、これらの微生物を、その増殖
を促進し、生成した多糖類の分解を触媒する酵素を含有
する培地中で培養することからなる。
上記方法は、キサンタンを生産するザントモナス（Xa
nthomonas）型細菌、特にザントモナス・ベギオニアエ
（Xanthomonas begioniae）、ザントモナス・カンペス
トリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス・ベ
シカトリア（Xanthomonas vesicatoria）およびザント
モナス・ピシ（Xanthomonas pici）種、アルギニン酸を
生産するアゾバクター（Azobacter）型細菌、特にアゾ
バクター・ビネランディイ（Azobacter vinelandii）
種、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Agrobact
erium radiobacter）およびアルカリゲネス・フェカー
リス（Alcaligenes faecalis）種、およびスクシノグル
カンを生産するプソイドモナス・ミゾゲネス（Pseudomo
nas myxogenes）、デキストランを生産する細菌である
リュコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides）種、およびスクレログルカンを生産する
真菌である、アメリカ特許第3301848号記載のようなス
クレロチウム（Sclerotium）型、のような増粘性多糖類
を生産する細菌、または真菌のバイオマスを得るのに用
いることができる。
nthomonas）型細菌、特にザントモナス・ベギオニアエ
（Xanthomonas begioniae）、ザントモナス・カンペス
トリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス・ベ
シカトリア（Xanthomonas vesicatoria）およびザント
モナス・ピシ（Xanthomonas pici）種、アルギニン酸を
生産するアゾバクター（Azobacter）型細菌、特にアゾ
バクター・ビネランディイ（Azobacter vinelandii）
種、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Agrobact
erium radiobacter）およびアルカリゲネス・フェカー
リス（Alcaligenes faecalis）種、およびスクシノグル
カンを生産するプソイドモナス・ミゾゲネス（Pseudomo
nas myxogenes）、デキストランを生産する細菌である
リュコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides）種、およびスクレログルカンを生産する
真菌である、アメリカ特許第3301848号記載のようなス
クレロチウム（Sclerotium）型、のような増粘性多糖類
を生産する細菌、または真菌のバイオマスを得るのに用
いることができる。
使用酵素は生産される多糖類に関連して選択する。
例えば、ザントモナス（Xanthomonas）を得るため
に、バシラス（Bacillus）株により生産される酵素組成
物を用いることができ、デベロップメンタル・インダス
トリー・オブ・ミクロバイオロジィ（Dev.Ind.Microbio
l）第26巻第281−288頁（1984年）に記載のフラボバク
テリウム（Fravobacterium）種の純粋または混合物のい
ずれか、またはジャーナル・オブ・インダストリアル・
ミクロバイオロジィ（J.Ind.Microbiol）第31−37頁（1
986年）に記載の組成物を用いることができる。
に、バシラス（Bacillus）株により生産される酵素組成
物を用いることができ、デベロップメンタル・インダス
トリー・オブ・ミクロバイオロジィ（Dev.Ind.Microbio
l）第26巻第281−288頁（1984年）に記載のフラボバク
テリウム（Fravobacterium）種の純粋または混合物のい
ずれか、またはジャーナル・オブ・インダストリアル・
ミクロバイオロジィ（J.Ind.Microbiol）第31−37頁（1
986年）に記載の組成物を用いることができる。
スクレロチウム（Sclerotium）生産のためには、例え
ば、アメリカ特許第3423288号記載のエフ・イー・ハレ
ックによる担子菌類（Basidiomycetes）のベータ−1,3
−グルカナーゼ、スポロトリクム・ディモルフォスポー
ルム（Sporotrichum dimorphosporum）の培養によって
得られたベータ−1,3−グルカナーゼ、および特に、ATC
C第24562号に登録された株の培養によって得られたも
の、および商標グルカネックスのもとにノボ社（デンマ
ーク）から市販されているベータ−1,3−ベータ−1,6−
グルカナーゼ、または商標ラピダーゼGL150のもとにギ
スト−ブロケイド社から市販されているベータ−1,3−
ベータ−1,6−グルカナーゼがある。
ば、アメリカ特許第3423288号記載のエフ・イー・ハレ
ックによる担子菌類（Basidiomycetes）のベータ−1,3
−グルカナーゼ、スポロトリクム・ディモルフォスポー
ルム（Sporotrichum dimorphosporum）の培養によって
得られたベータ−1,3−グルカナーゼ、および特に、ATC
C第24562号に登録された株の培養によって得られたも
の、および商標グルカネックスのもとにノボ社（デンマ
ーク）から市販されているベータ−1,3−ベータ−1,6−
グルカナーゼ、または商標ラピダーゼGL150のもとにギ
スト−ブロケイド社から市販されているベータ−1,3−
ベータ−1,6−グルカナーゼがある。
リュコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）を得るためには、例えば、「ストレプ
トコッカス・ムタン（Streptcoccus mutans）の分子生
物学および免疫学」ハマダら、エルセビエル スコット
ランド版（1986年）第205−215頁に記載のストレプトコ
ッカス・ムタン（Streptcoccus mutans）デキストラナ
ーゼ、またはノボ社から市販されているペニシリウム・
リラシナム（Penicilium lilacinum）に由来する真菌性
デキストラナーゼおよびベータ−1,3−ベータ−1,6−グ
ルカナーゼがある。
mesenteroides）を得るためには、例えば、「ストレプ
トコッカス・ムタン（Streptcoccus mutans）の分子生
物学および免疫学」ハマダら、エルセビエル スコット
ランド版（1986年）第205−215頁に記載のストレプトコ
ッカス・ムタン（Streptcoccus mutans）デキストラナ
ーゼ、またはノボ社から市販されているペニシリウム・
リラシナム（Penicilium lilacinum）に由来する真菌性
デキストラナーゼおよびベータ−1,3−ベータ−1,6−グ
ルカナーゼがある。
前培養培地に導入する酵素量は、酵素、多糖類の性質
および純度、および増殖段階でのその生産率に関係な
い。当業者は予備試験によって各場合の効果的な濃度を
決定することができる。
および純度、および増殖段階でのその生産率に関係な
い。当業者は予備試験によって各場合の効果的な濃度を
決定することができる。
同様に検討した多糖類を減少させるために利用し得る
酵素から選ばれた酵素は前培養のpHおよび温度条件では
高い酵素活性を示し、生産段階に入る前、または中に不
活性化され得るものである。
酵素から選ばれた酵素は前培養のpHおよび温度条件では
高い酵素活性を示し、生産段階に入る前、または中に不
活性化され得るものである。
本発明のもう１つの目的は、２段階の発酵による多糖
類の製造方法である。すなわち多糖類を加水分解する酵
素の存在下、前培養によって分泌微生物の所定量を産生
し、当該微生物を培養し、生産に適した培地中で多糖類
を製造するものである。本方法は、実質上、明らかに短
時間で従来法と同量の多糖類を得る点において特に優れ
ている。
類の製造方法である。すなわち多糖類を加水分解する酵
素の存在下、前培養によって分泌微生物の所定量を産生
し、当該微生物を培養し、生産に適した培地中で多糖類
を製造するものである。本方法は、実質上、明らかに短
時間で従来法と同量の多糖類を得る点において特に優れ
ている。
前培養および発酵の条件は増殖中に加水分解を誘導、
または反対に生産段階では加水分解を阻害のいずれをも
するように選択する。例えば、前培養および培養培地の
pH、および／または温度の選択は促進、または不活性化
の一手段である。ある種の場合には従来の方法を用いる
ことができる。酵素の阻害剤、またはアロステリック効
果剤も、前培養の終点で培地中に導入することができ
る。
または反対に生産段階では加水分解を阻害のいずれをも
するように選択する。例えば、前培養および培養培地の
pH、および／または温度の選択は促進、または不活性化
の一手段である。ある種の場合には従来の方法を用いる
ことができる。酵素の阻害剤、またはアロステリック効
果剤も、前培養の終点で培地中に導入することができ
る。
場合によっては、酵素活性を中和するために前培養の
終点で、ブロスを選択酵素が変性する温度、またはpHで
処理する。
終点で、ブロスを選択酵素が変性する温度、またはpHで
処理する。
もし、多糖類の加水分解によって培地中に微生物が同
化し得る炭水化物が放出されるならば、前培養段階中
に、微生物のための炭素含有栄養素として用いられる生
産物はかなり少ない量を培養培地に導入する。例えば、
スクレロチウム・ロルフシィ（Sclerotium rolfsii）の
前培養では、外部添加のグルコースの含量は少なくとも
70％だけ減少させる。
化し得る炭水化物が放出されるならば、前培養段階中
に、微生物のための炭素含有栄養素として用いられる生
産物はかなり少ない量を培養培地に導入する。例えば、
スクレロチウム・ロルフシィ（Sclerotium rolfsii）の
前培養では、外部添加のグルコースの含量は少なくとも
70％だけ減少させる。
多糖類の加水分解によって微生物が炭素含有栄養素と
して用いる炭水化物が生成されるならば生産段階中の培
地に少量の酵素活性が残っていてもよい。
して用いる炭水化物が生成されるならば生産段階中の培
地に少量の酵素活性が残っていてもよい。
実施例による下記の記載は、スクレロチウム・ロルフ
シィ（Sclerotium rolfsii）真菌の発酵によるスクレロ
グルカンの製造に本発明の方法を適用したものである。
シィ（Sclerotium rolfsii）真菌の発酵によるスクレロ
グルカンの製造に本発明の方法を適用したものである。
実施例： 前培養:ATCC第15206号株の凍結スクレロチウムからス
クレロチウム・ロルフシィ（Sclerotium rolfsii）の産
生 ａ）真菌の再生： ５凍結菌核を、グルコース4.5g、NaNO30.2g、酵母抽
出物0.1g、KH2PO40.1g、MgSO40.025gおよびチアミン0.0
005gを含有する水性滅菌培地100mlを含む三角フラスコ
中に入れる。
クレロチウム・ロルフシィ（Sclerotium rolfsii）の産
生 ａ）真菌の再生： ５凍結菌核を、グルコース4.5g、NaNO30.2g、酵母抽
出物0.1g、KH2PO40.1g、MgSO40.025gおよびチアミン0.0
005gを含有する水性滅菌培地100mlを含む三角フラスコ
中に入れる。
密閉したフラスコを撹拌下、28℃にて96時間インキュ
ベートさせる。
ベートさせる。
ｂ）撹拌下、６リットル発酵容器中第１接種物の製造： 再生フラスコ４個の内容物を、グルコース176g、NaNO
38g、酵母抽出物40g、 KH2PO44g、MgSO44g、チアミン0.02gおよびプルロニック
（商標）のような消泡剤4gを含有する水性滅菌培地４リ
ットル中に入れ、滅菌グルカネックス（商標）160mgを
添加する。
38g、酵母抽出物40g、 KH2PO44g、MgSO44g、チアミン0.02gおよびプルロニック
（商標）のような消泡剤4gを含有する水性滅菌培地４リ
ットル中に入れ、滅菌グルカネックス（商標）160mgを
添加する。
10％水酸化ナトリウム水溶液を添加してpHを4.5に保
ちながら撹拌下28℃にて44時間維持する。
ちながら撹拌下28℃にて44時間維持する。
ｃ）撹拌下、15リットル発酵容器中にて第２接種物の製
造： 上記で得た接種物１リットルを、グルコース350g、Na
NO328g、アルコールに浸漬トウモロコシ7.2g、KH2PO47
g、MgSO410.5g、チアミン0.05gおよびプルロニック（商
標）5gおよびグルカネックス（商標）400mgを含有する
水性滅菌培地10リットル中に入れる。
造： 上記で得た接種物１リットルを、グルコース350g、Na
NO328g、アルコールに浸漬トウモロコシ7.2g、KH2PO47
g、MgSO410.5g、チアミン0.05gおよびプルロニック（商
標）5gおよびグルカネックス（商標）400mgを含有する
水性滅菌培地10リットル中に入れる。
全混合物を撹拌下28℃にて24時間維持する。
かくして得られた培地は大量のバイオマスを含み、イ
ンキュベーション期間の終点では、従来の発酵では2g/k
gであるのに対し培地1kg当たり10gである。
ンキュベーション期間の終点では、従来の発酵では2g/k
gであるのに対し培地1kg当たり10gである。
ｄ）スクレログルカンの製造： グルコース350g、NaNO314g、アルコール浸漬トウモロ
コシ3.6g、MgSO410.5g、KH2PO47g、プルロニック（商
標）5gおよび接種物１リットルを含有する水性滅菌培地
10lを接種物製造に使用した型と同じ型の15リットル発
酵容器中に入れる。
コシ3.6g、MgSO410.5g、KH2PO47g、プルロニック（商
標）5gおよび接種物１リットルを含有する水性滅菌培地
10lを接種物製造に使用した型と同じ型の15リットル発
酵容器中に入れる。
全混合物をpHを10％NaOH水溶液を添加してpHを３に維
持しつつ、撹拌下28℃にて36.5時間インキュベートす
る。
持しつつ、撹拌下28℃にて36.5時間インキュベートす
る。
その後、発酵培地を利用目的に従って、バイオマスを
濾過して分離し、スクレログルカンをイソプロパノール
のようなアルコール溶媒を添加して沈澱させるか、また
は、アルコール溶媒を発酵培地に添加し、生成した沈澱
物を分離するかのいずれかのような公知の方法により処
理する。
濾過して分離し、スクレログルカンをイソプロパノール
のようなアルコール溶媒を添加して沈澱させるか、また
は、アルコール溶媒を発酵培地に添加し、生成した沈澱
物を分離するかのいずれかのような公知の方法により処
理する。
本発明の方法によると、スクレログルカンは、酵素な
しの公知の発酵において得られるのと同量が得られる。
生成した多糖類の量は、実質的に培地中に存在するグル
コースの量により変化する。他方、酵素なしの従来法の
発酵時間は48時間であり、本方法では36.5時間である。
しの公知の発酵において得られるのと同量が得られる。
生成した多糖類の量は、実質的に培地中に存在するグル
コースの量により変化する。他方、酵素なしの従来法の
発酵時間は48時間であり、本方法では36.5時間である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (11)
- 【請求項１】多糖類を生産する微生物マスを得る方法に
おいて、微生物の増殖を、多糖類を加水分解する酵素を
含有する培地中で行なうことを特徴とする方法。 - 【請求項２】微生物がスクレログルカン（scleroglucan
e）を産生するスクレロチウム（Sclerotium）型真菌で
ある、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】酵素がベータ−1,3−グルカナーゼであ
る、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】酵素がベータ−1,3−ベータ−1,6−グルカ
ナーゼである、請求項２記載の方法。 - 【請求項５】発酵による多糖類の製造方法において、微
生物の増殖段階を、多糖類を加水分解する酵素の存在下
で行なうことを特徴とする方法。 - 【請求項６】酵素が、増殖段階の終点で、pH、または温
度の修正により阻害される、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】酵素がpHを適値に固定することにより製造
段階中に不活性化される、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】微生物がスクレログルカン産生スクレロチ
ウム（Sclerotium）型真菌である、請求項５−７のいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項９】酵素がベータ−1,3−グルカナーゼであ
る、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】酵素がベータ−1,3−ベーター1,6−グル
カナーゼである、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】製造培地のpHが３である、請求項９およ
び10のいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8801933A FR2627509B1 (fr) | 1988-02-18 | 1988-02-18 | Procede de fermentation en deux etapes pour la production de polysaccharides |
| FR881933 | 1988-02-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01247080A JPH01247080A (ja) | 1989-10-02 |
| JP2732881B2 true JP2732881B2 (ja) | 1998-03-30 |
Family
ID=9363375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1039166A Expired - Lifetime JP2732881B2 (ja) | 1988-02-18 | 1989-02-17 | ２段階発酵による多糖類の製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5017479A (ja) |
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