JP2724726B2 - 繊維状固定化酵素又は固定化菌体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、アセト酢酸エステル基を有するポリビニル
アルコール系樹脂を用いる繊維状固定化酵素、又は固定
化菌体の製造法に関するものである。

［従来の技術］ 従来、酵素や菌体による触媒反応を利用して各種の物
質を製造するに当たり、酵素又は菌体を固定して反応生
成物との分離を容易にし、連続運転を可能とする「固定
化技術」が注目されている。固定化技術としては、適当
な担体に酵素を化学的又は物理的に結合させる担体結合
法、酵素同士を共有結合させる架橋法及び高分子母体中
又はマイクロカプセル中に酵素を包蔵させる包括法など
が知られている。しかし、担体結合法、架橋法は固定化
処理の際に酵素を変質させ、活性を低下させるという欠
点があり、その点、包括法は酵素や菌体自身に何らの変
化も与えないので有利であるといえる。包括法での固定
化酵素の代表的形状としては、ゲル状物、繊維状物があ
るが、本発明者らの研究によると同じ樹脂を使用しても
ゲル化物は繊維状物に比較して活性が劣る傾向があり、
また取り扱い易さの点でも繊維状物の方が種々の点で有
利であることがわかった。そこで本発明者らは、繊維状
固定化酵素又は菌体の製造法において高分子母体として
ポリビニルアルコール系樹脂を使用し種々検討をおこな
った。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、高分子母体として単なるポリビニルアルコー
ルを使用する包括法により繊維状固定化酵素又は菌体を
得ても、高分子母体自体が水溶性のため、使用中にポリ
ビニルアルコールが溶出し、その役を果たさないので、
何らかの手段による不溶化が必要である。その方法とし
て、アセタール化法等の架橋剤を併用して加熱する方法
や繊維状に成型後紫外線によって架橋する方法（特開昭
58−60988号公報）が提案されているが、しかし前者の
方法は加熱により酵素や菌体に悪影響を与えるので望ま
しくなく、後者の方法はまず繊維状に成型し、その後不
溶化処理するという２段階の工程を必要とする点で必ず
しも有利とは言い難く、更に簡便な操作で、酵素又は菌
体の機能や性質を低下させることのない繊維状固定化酵
素又は菌体を製造する方法の開発が望まれている。

［課題を解決するための手段］ そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく種々検討
を行った結果、アセト酢酸エステル基含有ポリビニルア
ルコール系樹脂水溶液に、酵素又は菌体を配合してなる
溶液を、架橋剤を含有する紡糸浴中に紡糸することによ
り上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成し
た。

本発明の特徴は、酵素や菌体を包括させるポリビニル
アルコール（以下、PVAと略記する）系樹脂にアセト酢
酸エステル基（以後、AA基と略記する）を導入した点、
及び紡糸浴中に凝固剤と共に架橋剤を含有させた点にあ
る。このPVA系樹脂中に存在するAA基は、比較的低温で
も架橋剤との反応が円滑に進行するので、紡糸浴温度が
従来のPVA繊維製造時の40〜60℃という条件をそのまま
採用することができ、特に室温（30℃）付近でも架橋可
能であるので、酵素や菌体の機能やその他の性質を低下
せしめることなく、一段階の工程で容易に実用的な繊維
状固定化酵素又は菌体を得ることが可能となるのであ
る。

本発明の固定化酵素に用いられる酵素としては、特に
制限はなく目的に応じ各種の酵素を利用することができ
る。その例としては、インベルターゼ、グルコアミラー
ゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、ウレアーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌク
レアーゼ、プロテアーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−
アミノ酸オキシターゼ、ステロイドエステラーゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカ
リ性ホスファターゼ、ラクターゼ、ロイシンアミノペプ
チターゼ、アミノペプチターゼ、トリプシン、パパイ
ン、フイシン、プロナーゼ、アミノアシラーゼ、アスパ
ラギナーゼなどがあるが、勿論これらに限定されるもの
ではない。

又、菌体としては酵母、バクテリア、糸状菌、活性汚
泥（菌）等任意の微生物が用いられる。

酵素又は菌体の配合割合は、その種類によって一概に
は規定できないが、一般的にAA化PVAの100重量部に対し
て５〜500重量部、好ましくは10〜300重量部が適当であ
る。５重量部未満では触媒効果が発現しにくく、活性が
低下し、500重量部を越える場合には、酵素又は菌体の
流出がみられる。

本発明で使用するAA化PVAは、代表的にはPVAにジケケ
テン等を反応させてPVAにAA基を導入して得られるもの
である。

該PVAとは、ポリ酢酸ビニルの部分ケン化物あるい
は、完全ケン化物のみならず、ビニルエステルとそれと
共重合しうる単量体、例えばエチレン、プロピレン、イ
ソブチレン、α−オクテン、α−ドデセン、α−オクタ
デセン等のオレフィン類、アクリル酸、メタクリル酸、
クロトン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸
等の不飽和酸類あるいはその塩あるいはモノ又はジアル
キルエステル等、アクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル等のニトリル類、アクリルアミド、メタクリルアミド
等のアミド類、エチレンスルホン酸、アリルスルホン
酸、メタアリルスルホン酸等のオレフィンスルホン酸あ
るいはその塩、アルキルビニルエーテル類、Ｎ−アクリ
ルアミドメチルトリメチルアンモニウムクロライド、ア
リルトリメチルアンモニウムクロライド、ジメチルジア
リルアンモニウムクロライド等のカチオン基を有する化
合物、ビニルケトン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニ
ル、塩化ビニリデン等との共重合体ケン化物が挙げられ
るが、必ずしもこれに限定されるものではない。

PVAの平均ケン化度は60〜100モル％、好ましくは80〜
100モル％、平均重合度は300〜4,000、好ましくは500〜
2,000の範囲から選ぶのが有利である。

上記PVAにAA基を含有させる方法としては、任意の方
法が実施出来るが、好適には該PVAにジケテンを付加反
応させるか、アセト酢酸エステルでエステル交換反応す
る方法が挙げられる。AA基の含有量は、前記PVAに対
し、0.05モル％以上で水溶性を有する範囲内の最大限ま
で可能であるが、通常0.1〜20モル％、なかんずく0.2〜
10モル％の範囲から選ばれることが多い。AA基の含有量
があまり少ないと本発明の効果は得難く、逆に必要以上
に多くても使用量の割には期待される効果を得ることが
できない。

紡糸浴に含有させる架橋剤としては、以下のものが例
示される。

（ｉ）アルデヒド類 ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンア
ルデヒド、ブチルアルデヒド、などのモノアルデヒド
類、グリオキザール、マロンジアルデヒド、スクシンジ
アルテヒド、グルタルジアルデヒド、マレインジアルデ
ヒド、フタルアルデヒド、などのジアルデヒド類等。

（ii）アミノ系樹脂 メラミン、アセトグアナミン、ベンゾグアナミン、尿
素などのアミノ化合物の１種又は２種以上とホルムアル
デヒド又はその他のアルデヒドとの初期反応生成物又は
これをアルコールやエポキシ化合物その他の化合物で変
性したもの、例えばメチル化メチロールメラミン、ブチ
ル化メチロールメラミン等のメチロールメラミンの部分
又は完全エーテル化物等。

（iii）フェノール系樹脂 フェノール、クレゾール、エチルフェノール、イソプ
ロピルフェノール、ｔ−ブチルフェノール、ｎ−アミル
フェノール、ｔ−アミルフェノール、ｔ−オクチルフェ
ノール、フェニルフェノール、キシレノール、レゾルシ
ン、カテコール、ピロガロール、チモール、カルバクロ
ールなどのフェノール系化合物の１種又は２種以上とホ
ルムアルデヒド又はフルフラールなどその他のアルデヒ
ドとの初期反応生成物又はこれをアルコールやエポキシ
化合物その他の化合物で変性したもの等。

（iv）エポキシ系化合物 エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチ
レグリコールジグリシジルエーテル、グリセリンジ又は
トリグリシジルエーテル、1,6−ヘキサンジオールジグ
リシジルエーテル、トリメチロールプロパントリグリシ
ジルエーテル、ジグリシジルアニリン、ジグリシジルア
ミン等。

（ｖ）イソシアネート系化合物 例えばトリレンジイソシアネート、水素化トリレンジ
イソシアネート、トリメチロールプロパン−トリレンジ
イソシアネートアダクト、トリフェニルメタントリイソ
シアネート、メチレンビス（４−フェニルメタントリイ
ソシアネート）、イソホロンジイソシアネート、及びこ
れらのケトオキシムブロック物又はフェノールブロック
物等。

（vi）アンモニウム塩 塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム等の鉱酸のアンモニウム塩や、酢酸アンモニウム、
プロピオン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩
等。

（vii）ラジカル発生能を有する化合物 過酸化水素、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、
過酸化ベンゾイル、過酸化コハク酸、ｔ−ブチル過酸化
マレイン酸、ｔ−ブチルヒドロパーオキシドベンゾイン
メチルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾイ
ンイソプロピルエーテル等のベンゾインアルキルエーテ
ル、ジブチルスルフィド、ベンジルスルフィド、デシル
フェニルスルフィドなどの有機イオウ化合物、ジアゾニ
ウム塩、テトラゾニウム塩或はこれらと塩化亜鉛との複
合塩又はその縮合物、アゾビスイソブチロニトリル、2,
2′−アゾビス（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリ
ド、メチレンブルーなどの染料又はこれとｐ−トルエン
スルホネートイオンなどとの組合せ、ピリリウム塩又は
チアピリリウム塩、重クロム酸アンモニウム、アセトフ
ェノン、ベンゾフェノン、ベンジル、フェナントレン、
チオキサントン、ジクロルプロピルフェニルケトン、ア
ントラキノン、２−クロロアントラキノン、２−ブロモ
アントラキノン、アントラキノンβ−スルホン酸ソー
ダ、1,5−ジニトロアントラキノン、1,2−ベンザントラ
キノン、フェナントレンキノン、５−ベンゾイルアセナ
フテン、５−ニトロアセナフテン、1,4−ナフトキノ
ン、1,8−フタロイルナフタリン、２−ニトロフルオレ
ン、ｐ−ニトロアニリン、ピクラミド等。

（viii）酸化剤 重クロム酸カリウム、重クロム酸アンモニウム、過塩
素酸カルシウム等。

（ix）金属塩 アルミニウム、鉄、銅、亜鉛、スズ、チタン、ニッケ
ル、アンチモン、マグネシウム、バナジウム、クロム、
ジルコニウム、チタン等の多価金属の塩化物、臭化物、
硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、等の塩で具体的には塩化第二
銅、塩化アルミニウム、塩化第二鉄、塩化第二スズ、塩
化亜鉛、塩化ニッケル、塩化マグネシウム、硫酸アルミ
ニウム、酢酸銅、酢酸クロム等。

（ｘ）その他 多価アルコール、多塩基酸などの多官能性化合物、ベ
ントナイト等、AA化PVA系樹脂に使用される一般的な架
橋剤。

以上、例示した架橋剤の紡糸浴中の含有量は、２〜20
0g/、好ましくは５〜50g/が適当である。

次に、本発明の方法について各工程別に、更に詳細に
説明する。

1.原液調製工程 AA化PVA系樹脂を所定濃度（普通14〜16重量％）にな
るように、溶解機中で10〜15時間、60〜90℃で加温溶解
を行う。得られた樹脂溶液を10〜40℃まで冷却後、酵素
又は菌体を所定量添加し、均一に混合する。また、後の
紡糸にさしつかえない程度の量の架橋剤を更に添加して
もよい。

2.紡糸工程 10〜40℃の原液を10〜40℃の紡糸浴中へ紡糸口金を通
して押し出し、繊維化する。

凝固剤としては、芒硝、硫酸アンモニウム、リン酸ナ
トリウムなどの塩類及び水酸化ナトリウムなどのアルカ
リが使用できるが、工業的には凝固能と経済性により、
芒硝水溶液が主として使用される。

かかる凝固剤を用いた実用的紡糸液の例としては、芒
硝の飽和水溶液、又は硫酸アンモニウムの飽和水溶液等
が挙げられ、本発明ではこの溶液に架橋剤を２〜200g/
、好ましく５〜50g/含有させるのである。又、該工
程における着色を防止するために、紡糸浴に硫酸亜鉛や
硫酸マグネシウム或は少量の硫酸を添加したり、銅やマ
ンガンなどの微量の重金属の塩類を加えても良い。

更に、紡糸液としては水系のみならずメタノール等の
アルコール系溶媒等、有機溶剤を用いる事も出来る。

紡糸口金に関しては、円、角等の任意の形状のノズル
が用いられ、十字線、放射線、星型等の配列が採用され
る。

この紡糸工程において凝固・架橋された繊維状固定化
酵素又は菌体はローラにより凝固浴から引出され、必要
に応じて（低温）乾燥、延伸等が可能である。又必要に
応じて適当な長さに切断して用いられる。

このようにして得られる本発明の繊維状固定化酵素又
は菌体はその特徴として繊維状であるので、取扱い反応
液との分離、再使用が極めて容易であり、勿論固定化
率、活性発現率、溶出率なども優れており、産業上極め
て有用である。

［作用］ 本発明の製造法は、酵素又は菌体の機能や性質を著し
く低下させることなく、簡便に１工程で繊維状固定化酵
素又は菌体を製造できる。

［実施例］ 以下、実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ アセト酢酸エステル基を10モル％、含有する重合度15
00、ケン化度99モル％のポリビニルアルコールの10％水
溶液100部とインベルターゼ粉末（シグマー社製）３部
を30℃で混合した水溶液を、 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） 400g/（水） 硫酸亜鉛 （SnSO₄） 20g/（水） グリオキザール（架橋剤） 10g/（水） の組成の紡糸浴中へ、円形、0.1mmφ、放射線配列100孔
の紡糸口金を用い、吐出量12g/minで押し出し、速度50m
/minで紡糸し、更に、得られた繊維を風乾した（水分８
重量％）。この結果1.5デニールの繊維が得られた。こ
の時の紡糸浴温度は35℃であった。

得られた固定化酵素の性質として、固定化率、発現
率、膨潤率、溶出率を測定して表３に示した。

○固定化率：膨糸浴中に含まれる残存酵素又は菌体の量
を定量することによって算出した。

○発現率 イ）酵素 インベルターゼ：得られた繊維状固定化インベルター
ゼに１％ショ糖水溶液を加えて、40℃で10分間反応後の
グルコースへの転換率から同一重量の原料インベルター
ゼの発現率を100％としたときの酵素活性発現率を求め
た。

アミノアシラーゼ：得られた繊維状固定化アミノアシ
ラーゼに１％アセチルDC−メチオニンを加えて37℃、１
時間に加水分解する転換率から同一重量の原料アミノア
シラーゼの発現率を100％としたときの酵素活性発現率
を求めた。

ロ）菌体 イースト菌：得られた繊維状固定化イースト菌に１％
グルコース水溶液を加えて25℃、24時間反応後のアルコ
ールへの転換率から、同一重量の原料イースト菌の発現
率を100％としたときの菌活性発現率を求めた。

○膨潤度，溶出率：得られた繊維状固定化酵素又は菌体
を30℃の水中に96時間撹拌下に浸漬し膨潤度、溶出率を
測定した。算出式を次に示す。

実施例２〜９ 表１に示す如く実施例１の条件を変更した以外は全く
同様にして繊維状固定化酵素又は菌体を製造し、各種の
評価を行った。結果を表３に示した。

但し、固定化イースト菌の場合は紡糸後の乾燥はさ
け、常に湿潤常態を維持した。

対照例１ 表２に示す如く実施例１と同一紡糸液組成物にゲル化
剤（架橋剤）としてグリオキザールをPVA100重量部に対
し５重量部添加、室温（25℃）で24時間放置し、ゲル状
固定化酵素を得た。これを5mm角に切断し、酵素活性及
び物性を同様に求めた。結果を表３に示した。

対照例２ 表２に示す如く対照例１と同様に実施例７と同一組成
物で反応した。結果を表３に示した。

［効果］ 前記の如く本発明は、酵素又は菌体の機能や性質を低
下させることなく、簡便に１工程で繊維状固定化酵素又
は菌体を製造することを可能にするので、産業上極めて
有用である。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素又は菌体を配合してなるアセト酢酸エ
   ステル基含有ポリビニルアルコール系樹脂水溶液を、架
   橋剤を含有する紡糸浴中に紡糸することを特徴とする繊
   維状固定化酵素又は固定化菌体の製造法。