JP2535782B2 - アンギオテンシン変換酵素阻害物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、アンギオテンシンＩ
をアンギオテンシンIIに変換させるアンギオテンシン変
換酵素の活性を阻害するアンギオテンシン変換酵素阻害
物質に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、アンギオテンシン変換酵素が
アンギオテンシンＩをアンギオテンシンIIに変換させる
作用を有することが知られている。そして、このように
アンギオテンシン変換酵素によってアンギオテンシンＩ
から変換されたアンギオテンシンIIが血圧を上昇させる
作用を有すると言われている。このため、アンギオテン
シンＩをアンギオテンシンIIに変換させるアンギオテン
シン変換酵素の活性を阻害すれば、血圧の上昇を抑制す
ることができるとして、従来より、上記のようなアンギ
オテンシン変換酵素の活性を阻害する物質について様々
な研究が行われ、種々のアンギオテンシン変換酵素阻害
物質が開発されるに至った。

【０００３】そして、上記のようなアンギオテンシン変
換酵素の活性を阻害する物質として、従来においては、
例えば、Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル
−Ｌ−プロリンのような合成物質の他、特開昭６２−２
７０５３３号公報，特開昭６４−５４９７号公報，特開
昭６４−８３０９６号公報においてカゼインを分解させ
て得られる各種のペプチドが開示されている。しかし、
上記の合成物からなるアンギオテンシン変換酵素阻害物
質は、一般にアンギオテンシン変換酵素の阻害活性が高
いが、合成物であるため、多くの場合、副作用等の安全
性の点で若干問題を有していた。

【０００４】一方、カゼイン等を分解して得られるアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質の場合、上記の合成物か
らなるものに比べ、その阻害活性が一般に低いが、その
原料が天然物、特に食品由来のものであるため、一般に
その毒性が低く、安全性の高いものであった。このた
め、上記のように天然物、特に食品由来のアンギオテン
シン変換酵素阻害物質について、さらなる開発が望まれ
ていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、上記のよ
うな事情に鑑みなされたものであり、アンギオテンシン
ＩをアンギオテンシンIIに変換させるアンギオテンシン
変換酵素の活性を有効に阻害して、血圧の上昇を抑制で
きると共に、人体に対する安全性も高く、食品等として
投与され、マイルドな作用で血圧の上昇を抑制すること
ができるアンギオテンシン変換酵素阻害物質を提供する
ことを課題とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この発明においては、ア
ンギオテンシンＩをアンギオテンシンIIに変換させるア
ンギオテンシン変換酵素の活性を阻害するアンギオテン
シン変換酵素阻害物質として、下記に示す構造式〔１〕
のペプチドまたはその塩を用いるようにしたのである。 〔１〕 Tyr-Arg-Ile-Leu-Glu-Phe

【０００７】ここで、上記ペプチドにおける塩の形態と
しては、塩酸塩，臭化水素酸塩，ヨウ化水素塩，硫酸
塩，燐酸塩等の無機酸塩、酢酸塩，トリフルオロ酢酸
塩，クエン酸塩，マレイン酸塩，フマル酸塩，酒石酸
塩，乳酸塩，メタンスルホン酸塩，ｐ−トルエンスルホ
ン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、上記ペプチド
を構成するアミノ酸は、天然に存在するという点で、Ｌ
−体であることが望ましい。

【０００８】上記〔１〕の構造式に示されるペプチド
は、大豆から分離された分離大豆蛋白をペプシンによっ
て分解させて製造することができる。そして、上記構造
式〔１〕に示されるペプチドまたはその塩は、アンギオ
テンシンＩをアンギオテンシンIIに変換させるアンギオ
テンシン変換酵素の活性を阻害する作用を有すると共
に、上記のように食品として使用されている大豆から得
られた分離大豆蛋白を、ペプシンによって分解させて製
造することができる食品由来のものであり、安全性が高
いものとなっている。

【０００９】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ 上記〔１〕に示す構造式のペプチドを製造する場合につ
いて説明する。この実施例においては、大豆から分離さ
せた分離大豆蛋白（不二製油（株）製、商品名：フジプ
ロ−Ｒ）３．０ｇを水に溶解させ、これに酢酸を加えて
ｐＨ３．２に調整し、さらに６規定の塩酸を加えてｐＨ
２．０に調整した溶液６０ｍｌとした。そして、この溶
液にペプシンを上記分離大豆蛋白の１／５００の量、す
なわち６ｍｇ加え、これを３７℃で１０時間反応させ、
上記分離大豆蛋白をペプシンによって酵素分解させた。

【００１０】その後、これを１００℃で１５分間加熱
し、上記ペプシンを失活させた後、これを遠心分離機に
より、１００００ｒｐｍで２分間遠心分離させて、沈澱
画分と溶液画分とに分離させ、沈澱画分を除去し、溶液
画分だけを取り出した。

【００１１】次いで、このようにして取り出された溶液
画分を、分子ふるいクロマトグラフィー（ファルマシア
社製、セファデックスＧ−２５）を用いて分画するよう
にした。ここで、上記の分子ふるいクロマトグラフィー
によって分画を行うにあたっては、カラム容積が２００
ｍｌのものを使用し、また展開液としては0.０５Ｍの酢
酸溶液を使用し、流量が４ｍｌ／ｈｒとなるようにし
て、各フラクションに３ｍｌずつ分取するようにした。

【００１２】次いで、このようにして分取された各フラ
クションのものについて、それぞれ蛋白量及びアンギオ
テンシン変換酵素阻害率を測定するようにした。ここ
で、蛋白量を測定するにあたり、この実施例において
は、公知のＴＮＢＳ法を用いて測定するようにした。即
ち、この実施例においては、0.１０％のＴＮＢＳ（２，
４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）溶液を0.５ｍ
ｌと、0.０１Ｍの亜硫酸ナトリウム溶液を0.５ｍｌと0.
１５Ｍのホウ酸緩衝液を２．０ｍｌ加えたものに、上記
の各フラクションにおけるサンプルを吸光度の測定範囲
に入るように適当に希釈したものを0.５ｍｌ加えて、こ
れらを３７℃で６０分間反応させた後、分光光度計によ
って４２０ｎｍの光の吸収を測定し、その結果を、図１
に実線で示した。なお、上記分光光度計によって測定さ
れた４２０ｎｍの光の吸収が大きいほど、サンプル中に
おけるペプチド数が多くなっている。

【００１３】また、上記のように分取された各フラクシ
ョンにおけるアンギオテンシン変換酵素阻害率を測定す
るにあたり、この実施例においては、公知のアンギオテ
ンシン変換酵素阻害活性測定法（Ｃｕｓｈｍａｎ−Ｃｈ
ｅｕｎｇ法）によってアンギオテンシン変換酵素阻害率
を測定するようにした。ここで、この実施例において
は、ラビットラングアセトンパウダー（シグマ社製）１
０ｇを、１００ｍｌの５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
３）に溶解させ、４００００ｇ、４０分間の遠心処理を
行った後、その上清液を５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝
液で５倍に希釈してアンギオテンシン変換酵素溶液を調
製した。

【００１４】一方、上記の各フラクションのものを凍結
乾燥させた後、これらのものをそれぞれ５０ｍＭのリン
酸カリウム緩衝液0.６ｍｌに溶解させ、この溶液よりサ
ンプルとしてそれぞれ５０μｌ採取した。そして、この
ように採取した５０μｌの各サンプルに対して、それぞ
れ基質Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ペプチド研究所
製）と、リン酸カリウム緩衝液と塩化ナトリウムとの混
合溶液と、上記のように調製したアンギオテンシン変換
酵素溶液５０μｌとを加えて２５０μｌにした。この
時、上記溶液中における基質の最終濃度は２．５ｍＭ、
リン酸カリウム緩衝液の最終濃度は１００ｍＭ、塩化ナ
トリウムの最終濃度は３００ｍＭであった。

【００１５】次いで、このように調製された各混合溶液
を３７℃で３０分間反応させた後、１規定の塩酸を２５
０μｌ添加させて反応を停止させ、その後、１．５ｍｌ
の酢酸エチルを加えて１０秒間攪拌し、さらに３５００
０ｒｐｍで２分間遠心分離させて、酢酸エチル層を１ｍ
ｌ採取した。そして、このように採取されたものを、エ
バポレートによって乾固させた後、これを１ｍｌの蒸留
水に溶解させ、抽出されたヒブリル酸の吸収（２２８ｎ
ｍの吸光度）を測定し、各フラクションにおけるサンプ
ルのアンギオテンシン変換酵素阻害率を、下記の〔１〕
式によって求めるようにした。

【００１６】

【数１】

【００１７】（但し、ＯＤ_s は上記のようにしてサンプ
ルを加えて測定した時の吸光度。ＯＤ_sbは上記の混合溶
液を反応させる前に１規定の塩酸を２５０μｌ添加させ
て測定した時の吸光度。ＯＤ_c は上記の混合溶液にサン
プルを加えずに測定した時の吸光度。ＯＤ_cbは上記の混
合溶液にサンプルを加えずに１規定の塩酸を２５０μｌ
添加させて測定した時の吸光度。）そして、このように
して測定した各フラクションのサンプルにおけるアンギ
オテンシン変換酵素阻害率（ＡＣＥ阻害率）を図１に破
線で示した。この結果、同図に示すように、アンギオテ
ンシン変換酵素阻害率は、そのフラクション番号が４４
〜６０のものにおいて大きくなっていた。このため、こ
の実施例においては、フラクション番号が４４〜６０の
部分、すなわち分子量が約２０００〜２００のものを分
取するようにした。

【００１８】そして、このようにして分取されたものを
凍結乾燥させ、次いで、このように凍結乾燥されたもの
を、分子ふるいクロマトグラフィー（ファルマシア社
製、セファデックスＧ−１０）を使用してさらに分画す
るようにした。ここで、この分子ふるいクロマトグラフ
ィーによって分画を行うにあたっては、カラム容積が１
５０ｍｌになったものを使用し、また展開液としては0.
０５Ｍの酢酸溶液を使用し、流量が３ｍｌ／ｈｒとなる
ようにして、各フラクションに１ｍｌずつ分取するよう
にした。

【００１９】次いで、このようにして分取された各フラ
クションのものについて、上記の場合と同様にして、そ
れぞれ蛋白量及びアンギオテンシン変換酵素阻害率を測
定するようにした。そして、分光光度計によって測定さ
れた各フラクションにおける４２０ｎｍの光の吸収結果
を、図２に実線で示す一方、各フラクションから採取さ
れた各サンプルにおけるアンギオテンシン変換酵素阻害
率（ＡＣＥ阻害率）を図２に破線で示した。この結果、
図２に示すように、フラクション番号が１０５〜１３０
のものにおいては、ペプチド数に対するアンギオテンシ
ン変換酵素阻害率が高くなっていた。このため、この実
施例においては、フラクション番号が１０５〜１３０の
もの、すなわち分子量が約１０００〜４００のものを分
取するようにした。

【００２０】そして、このようにして分取したものを、
今度は陽イオン交換分離によって、分画するようにし
た。ここで、陽イオン交換分離を行うにあたっては、フ
ァルマシア社製のＦＰＬＣユニットを使用すると共に、
カラムとして陽イオン交換樹脂Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／
５（商品名）を使用し、また展開液として、0.０５Ｍの
酢酸−アンモニア緩衝液（ｐＨ７．５）を用いる一方、
グラジエントとして、0.５Ｍの塩化ナトリウム溶液を用
い、この塩化ナトリウム溶液を加える量を当初から５分
間は０にし、５〜２５分の間で０〜１００％に増加させ
るようにし、流量が１ｍｌ／ｍｉｎとなるようにして、
各フラクションに0.５ｍｌずつ分取するようにした。

【００２１】そして、上記のようにして分画された各フ
ラクションのものについて、それぞれ蛋白量及びアンギ
オテンシン変換酵素阻害率を測定するようにした。ここ
で、各フラクションにおけるアンギオテンシン変換酵素
阻害率を測定するにあたっては、各フラクションのもの
を凍結乾燥させた後、これらのものをそれぞれ５０ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液１ｍｌに溶解させるようにし、
それ以外については、上記のアンギオテンシン変換酵素
阻害活性測定法と同様にして、各フラクションにおける
サンプルについてそれぞれのアンギオテンシン変換酵素
阻害率（ＡＣＥ阻害率）を測定し、その結果を図３
（Ａ）に示した。

【００２２】一方、各フラクションにおけるサンプルに
ついての蛋白量の測定は、公知の紫外部吸光法によって
行い、２８０ｎｍの光の吸収を測定し、その結果を、図
３（Ｂ）に示した。なお、この場合においても、２８０
ｎｍの光の吸収が大きいほど、サンプル中における蛋白
量が多くなっている。

【００２３】この結果、上記の図３（Ａ）に示したよう
に、0.５Ｍの塩化ナトリウム溶液を加えていない時点に
おける素通り画分においては、アンギオテンシン変換酵
素阻害率が低くなっていた。そして、この実施例におい
ては、図３（Ａ）において、アンギオテンシン変換酵素
阻害率が高いフラクション番号が３８，３９のものを分
取するようにした。次いで、このようにして分取したフ
ラクション番号が３８，３９のものを凍結乾燥させ、こ
れを４０μｌの蒸留水に溶解させた後、高速液体クロマ
トグラフィー（（株）日立製作所製のＨＰＬＣ Ｌ−４
２００）を用いて、さらに分画を行った。ここで、上記
高速液体クロマトグラフィーによる分画においては、0.
０５％のテトラヒドロフルフリルアクリレート（ＴＦ
Ａ）と５％のアセトアニリドとを加えたＡ溶液と、0.０
５％のＴＦＡと１００％のアセトアニリドとを加えたＢ
溶液とを用い、当初から５分間は上記Ａ溶液だけを加
え、５〜３５分の間で、上記Ａ溶液を１００〜０％に減
少させる一方で、Ｂ溶液を０〜１００％に増加させるよ
うにして分画を行った。

【００２４】このように分画されたものについて、前記
の紫外部吸光法により、その蛋白量を測定するようにし
た。その結果、２８０ｎｍの光に対して、図４に示した
ような光の吸収結果が得られた。そして、図４において
光の吸収が高く、蛋白量が多くなっている（ｂ）の部分
を分取し、これを凍結乾燥させた後、0.４ｍｌの蒸留水
に溶解させ、この溶液を２０μｌ採取したものに、５０
ｍＭのリン酸カリウム緩衝液３０μｌを加えて５０μｌ
になったサンプルを調製し、前記のアンギオテンシン変
換酵素阻害活性測定法と同様にして、アンギオテンシン
変換酵素阻害率を測定したところ、このサンプルにおけ
るアンギオテンシン変換酵素阻害率は３７．４％と高い
値を示した。

【００２５】次いで、上記の図４に示す（ｂ）の部分を
分取し、これを凍結乾燥させて完全に溶剤を除去した
後、再度、上記と同様な方法で高速液体クロマトグラフ
ィーによる精製を行い、その蛋白量を前記の紫外部吸光
法により測定するようにした。この結果、このものは２
８０ｎｍの光に対して、図５に示すように１つの山にな
った光の吸収が得られた。そして、同図に山で示される
（ｂ₁)の部分について、前記のようにしてアンギオテン
シン変換酵素阻害率を測定したところ、アンギオテンシ
ン変換酵素阻害率は２８．４％と高い値を示したため、
この山の部分を分取した。

【００２６】次いで、上記のようにして分取した図５に
示す（ｂ₁)の部分について、アミノ酸シーケンサー（ア
プライズバイオシステム社製の４７７Ａ型）により、こ
れに含まれるペプチドの構造を特定した。この結果、図
５に示す（ｂ₁)の部分のものは、下記の構造式〔１〕に
示されるペプチドであることが判明した。 〔１〕 Tyr-Arg-Ile-Leu-Glu-Phe

【００２７】このようにして得られた上記構造式〔１〕
のペプチドについて、前記のアンギオテンシン変換酵素
阻害活性測定法（Ｃｕｓｈｍａｎ−Ｃｈｅｕｎｇ法）に
よって、アンギオテンシン変換酵素阻害率が５０％にな
るのに必要なペプチドの濃度ＩＤ₅₀を測定したところ、
ＩＤ₅₀は１５６μＭであった。

【００２８】また、上記構造式〔１〕のペプチドが、そ
の原料として使用した分離大豆蛋白に由来するものであ
るかを確認したところ、上記構造式〔１〕に示されるア
ミノ酸配列は、大豆蛋白における蛋白質画分が７ｓα’
サブユニット配列中に存在しており、上記構造式〔１〕
のペプチドが、その原料として使用した分離大豆蛋白に
由来するものであることが確認された。

【００２９】従って、上記構造式〔１〕に示されるペプ
チドは、アンギオテンシンＩをアンギオテンシンIIに変
換させるアンギオテンシン変換酵素に対して、その活性
を有効に阻害することができ、食品等として投与するこ
とによって、血圧の上昇をマイルドな作用で抑制するこ
とが期待でき、このペプチドは食品として利用されてい
る大豆蛋白に由来するものであるため、副作用等の問題
がなく、人体に対する安全性も高いものであった。

【００３０】

【発明の効果】以上、詳述したように、この発明に係る
アンギオテンシン変換酵素阻害物質は、アンギオテンシ
ンＩをアンギオテンシンIIに変換させるアンギオテンシ
ン変換酵素の活性をマイルドな作用で有効に阻害するこ
とができると共に、食品として使用されている大豆から
得られた分離大豆蛋白を、ペプシンによって分解させて
製造できる食品由来のものであり、副作用等がなく、安
全性が高いものである。この結果、この発明に係るアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質は、人体に対する安全性
が高く、食品等として投与して、マイルドな作用で血圧
を下げることができ、また高血圧の予防効果も期待でき
るものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 分子ふるいクロマトグラフィー（ファルマシ
ア社製、セファデックスＧ−２５）によって分画された
各フラクションにおける４２０ｎｍの光に対する吸光度
及びアンギオテンシン変換酵素阻害率を示す図である。

【図２】 分子ふるいクロマトグラフィー（ファルマシ
ア社製、セファデックスＧ−１０）によって分画された
各フラクションにおける４２０ｎｍの光に対する吸光度
及びアンギオテンシン変換酵素阻害率を示す図である。

【図３】 （Ａ），（Ｂ）は陽イオン交換分離によって
分画された各フラクションにおけるアンギオテンシン変
換酵素阻害率及び２８０ｎｍの光に対する吸光度を示す
図である。

【図４】 高速液体クロマトグラフィーを用いて最初に
分画を行った場合における２８０ｎｍの光に対する吸光
度を示す図である。

【図５】 高速液体クロマトグラフィーを用いて再度、
分画を行った場合における２８０ｎｍの光に対する吸光
度を示す図である。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の構造式〔１〕で示されるペプチド
   またはその塩を含有することを特徴とするアンギオテン
   シン変換酵素阻害物質。 〔１〕 Tyr-Arg-Ile-Leu-Glu-Phe