JP2527533B2 - 核酸増幅反応の汚染除去方法 - Google Patents

核酸増幅反応の汚染除去方法

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JP2527533B2 JP6097606A JP9760694A JP2527533B2 JP 2527533 B2 JP2527533 B2 JP 2527533B2 JP 6097606 A JP6097606 A JP 6097606A JP 9760694 A JP9760694 A JP 9760694A JP 2527533 B2 JP2527533 B2 JP 2527533B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸増幅に関し、さらに
詳しくは次の増幅反応を汚染するかもしれない先の増幅
反応からのアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）を不活
化することに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸増幅反応は、特定の核酸配列を増幅
する方法である。これらは核酸分析および調製に力強い
手段となる。幾つかの核酸増幅法が知られている。これ
らには、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、自己支持配列
複製（３ＳＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプ
リカーゼ増幅およびストランド置換増幅（ＳＤＡ）が含
まれる。残念なことに、微量の標的配列を増幅するこれ
ら核酸増幅法の強力な力はまた、試薬、ピペット装置お
よび実験室内表面において先の増幅反応から移るかもし
れない標的配列（アンプリコン）により汚染を受けやす
くもする。これらの先の増幅の汚染生成物は次の増幅反
応においてそれ自身で増幅しうる。汚染標的配列はごく
わずかでさえ直ちに増幅して検出され、その結果誤った
陽性結果を示すことになる。
【０００３】ＰＣＲにおける汚染アンプリコンを不活化
するための最近開発された方法は、チミジントリホスフ
ェート（ＴＴＰ）の代わりに増幅した核酸配列へヌクレ
オチドデオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）
を組み込むことを含む。デオキシウリジン（ｄＵ）は通
常天然産生ＤＮＡでは見られないので、このヌクレオチ
ドはまだ増幅していない新しい標的配列とすでに産生さ
れたアンプリコンとを区別するために働く。先に増幅し
た汚染配列を表すウラシル含有ＤＮＡを、次いで酵素ウ
ラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、ウラシルＮ−グ
リコシラーゼまたはＵＮＧとしても知られている）で処
理する。実際、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮ
Ａポリメラーゼによって誤って組み込まれたかまたはシ
トシンの脱アミノ化のいずれかの結果により生じうるウ
ラシル塩基をＤＮＡから削除する。ＰＣＲ増幅の汚染除
去のために、ＵＤＧは増幅した核酸に故意に組み込まれ
たウラシルを除去する。ウラシルは糖−ホスホジエステ
ル骨格を壊すことなく除かれ、これによりＤＮＡに非塩
基性部位を生ぜしめる。これらの非塩基性部位は熱また
はアルカリによる加水分解を受けやすく、この方法はウ
ラシル含有ＤＮＡを分解し次のＰＣＲにおいてこれを増
幅できなくする。
【０００４】ＰＣＲを汚染除去するために使用する場
合、サンプルをＰＣＲ増幅の前にＵＤＧで処理し、増幅
反応が開始する前に酵素を不活化する。これは新しく生
じるアンプリコンからウラシル残基の除去を妨げる。Ｐ
ＣＲは高められた温度と低くした温度間の循環を含む。
それゆえ、ＵＤＧは高温（７０−８０℃）でのインキュ
ベーションにより汚染除去処理後に不活化され、この方
法はＰＣＲと矛盾しない。ＵＤＧはＰＣＲ増幅反応自体
に使用される高めた温度でほとんど不活化される。しか
しながら、増幅後にＰＣＲサンプルを４−２５℃へ戻す
と、ｄＵ−ＰＣＲ増幅生成物を分解するのに十分なＵＤ
Ｇ活性がいまだに存在することがわかっている。それゆ
え、ＵＤＧ処理後にＰＣＲ反応を高めた温度で維持する
ことが推奨されている（ラシュトシアン，エー．（Ｒａ
ｓｈｔｃｈｉａｎ，Ａ．）、ハートレイ，ジェイ．エ
ル．（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．）およびソルントン，
シー．ジー．（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ｇ．），Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３巻，Ｎｏ．２，ｐ．１８
０）。加熱不活化後の残留ＵＤＧ活性の問題を処理する
ために、国際特許出願第９２／０１８１４号には非耐熱
性ＵＤＧ酵素が記載されている。加熱不活化後にまだ存
在する残留ＵＤＧ活性をコントロールする別の試みで
は、ラシュトシアンらはＵＤＧを加熱不活化後にＰＣＲ
へＵＤＧのたんぱく質阻害剤（Ｕｇｉ−ウラシルＤＮＡ
グリコシラーゼ阻害剤）を加えた。Ｕｇｉはバクテリオ
ファージＰＢＳ２の産生物であり、ファージがそのゲノ
ムの複製の間にＴをｄＵに代えるので、感染の間、宿主
ＵＤＧを阻害してファージゲノムを保護する（モスバ
ウ，ディ．ダブリュ．（Ｍｏｓｂａｕｇｈ，Ｄ．Ｗ．）
およびウァン，ゼット．（Ｗａｎｇ，Ｚ．），Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７０巻，
Ｎｏ．３，ｐ．１０８２）。しかしながら、本発明以前
に核酸増幅反応の汚染除去の関係でＵｇｉ単独をＵＤＧ
不活化のために使用することを示唆する報告はなかっ
た。
【０００５】ＰＣＲと対照的に、幾つかの核酸増幅法は
等温である。すなわち、これらはＰＣＲの高／低温循環
を含まない。等温増幅プロトコールの例は自己支持配列
複製（３ＳＲ；ジェイ．シィ．ギテリィ（Ｊ．Ｃ．Ｇｕ
ａｔｅｌｌｉ）ら、ＰＮＡＳ８７：１８７４−１８７８
（１９９０）），Ｑβレプリカーゼ（ピィ．エム．リザ
ルディ（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７−１２０２（１９８
８）），およびストランド置換増幅（ＳＤＡ；ジィ．テ
ィ．ウォーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、ＰＮＡＳ
８９：３９２−３９６（１９９２）；ジィ．ティ．ウ
ォーカーら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６
９１−１６９６（１９９２））である。このような等温
増幅プロトコールは、ＵＤＧの不活化のための高温工程
が低めた温度および反応の等温性と矛盾するかもしれな
いという汚染除去に対し特別の問題を提供する。ＳＤＡ
増幅プロトコールはこれがＤＮＡ増幅のために制限酵素
およびポリメラーゼの両方を使用する点であまり一般的
ではない。ＤＮＡはこの方法を用いて１０8 倍まで増幅
されうる。ＳＤＡ系の力は、予め増幅した物質（アンプ
リコン）が新しい反応物を不注意に汚染しないようにす
る技術の発展を必要とする。このような汚染は誤って陽
性サンプルを作りだすこともある。ＳＤＡで使用される
制限酵素、ＨｉｎｃIIは特定の６個の塩基対識別配列を
識別する。ＳＤＡは天然産生ｄＡの代わりにポリメラー
ゼによりＨｉｎｃIIの識別部位へデオキシアデニンのα
−チオ誘導体（ｄＡｓ）の組み込みを必要とする。ＳＤ
ＡのメカニズムはＳＤＡプライマーが制限部位の一本の
ストランドを形成し、ポリメラーゼがプライマーを延長
してｄＡｓＴＰを用いて部位の他のストランドを完成す
るというものである。切断部位に対するｄＡｓ部分３’
は修飾されたストランドの制限を阻害する。しかしなが
ら、プライマーにより与えられた未修飾ストランドの制
限を阻害しない。
【０００６】等温増幅反応はＰＣＲのように高めた温度
を含まず、したがって本発明以前にはＵＤＧの阻害剤の
含有だけ（加熱不活化と組み合わせるよりも）で所望の
増幅生成物からウラシルを除くことを防止するのに十分
であるかどうかということは知られていなかった。ま
た、ＰＣＲにおけるＵＤＧに関連する文献がアンプリコ
ン不活化（通常加熱による）における非塩基性核酸の断
片化の役割を強調するので、ウラシルの除去だけでこれ
以上の増幅のための鋳型として汚染アンプリコンを不活
化するのに十分であるかどうかはこれまで知られていな
かった。
【０００７】その等温性に加えて、ＳＤＡは幾つかの他
の重要な点でＰＣＲと異なり、これらの全ては汚染アン
プリコンの不活化のためにＵＤＧを使用することにおい
て重要な効果を有する。第一に、ＳＤＡは制限酵素によ
るＤＮＡのニック化を必要とし、制限酵素識別部位へウ
ラシルを組み込むと制限が妨害されることがあるという
ことがわかっている。ＳＤＡはまたポリメラーゼにより
鋳型ストランドから延長された増幅生成物を酵素的に置
換することも必要である。それゆえ、ＨｉｎｃII制限部
位および増幅生成物におけるウラシルの含有が１）Ｈｉ
ｎｃIIによるニック化を妨げ（特に、ウラシルがｄＡｓ
と塩基対合される場合）、および／または２）ウラシル
またはα−チオ−Ａと塩基対を形成したウラシルの存在
のため正常なストランド置換を妨げるかもしれないとい
うことはこれまで知られていなかった。ポリメラーゼが
普通でないヌクレオチド、すなわちｄＵＴＰおよびｄＡ
ｓＴＰの両方を増幅生成物へ巧く同時に組み込むことが
できるかどうかは知られていなかった。ＳＤＡ ＫＰＯ
4 緩衝剤系は増幅反応においてユニークである（ＰＣＲ
はトリス緩衝剤を使用する）。ＵＤＧおよびＵｇｉがＫ
ＰＯ4 緩衝剤系において活性であるかどうかは知られて
いなかった。予期せぬことに、出願人はＨｉｎｃII制限
部位へのｄＵの組み込みがＨｉｎｃIIによるニック化を
著しく阻害しない、すなわち、ｄＡｓを持たないストラ
ンドがいまだに有効にニック化されていることを見出し
た。さらに、出願人はｄＵの組み込みがＳＤＡにおいて
生ずる他の酵素的反応を著しく妨害するようなことはな
く、ＫＰＯ4 緩衝剤はＵＤＧおよびＵｇｉ活性と矛盾せ
ず、そして所望によりＭｇＣｌ2 が反応から除去されう
ることを見出した。
【０００８】ｄＵはしたがって増幅反応を阻害すること
なく等温増幅したＤＮＡへ組み込まれる。ウラシル−修
飾核酸もまたＵＤＧで処理することにより特異的に識別
されそして不活化されうる。したがって、ｄＵが等温増
幅したＤＮＡへ組み込まれる場合、次の反応のいずれか
を最初にＵＤＧで処理し、そして先に増幅した反応から
のｄＵ含有ＤＮＡのいずれかをも増幅不可能にすること
ができる。増幅すべき標的ＤＮＡはｄＵを含まず、そし
てＵＤＧ処理により影響されないであろう。さらに、出
願人は、予期せぬことに、ＵＤＧが先行技術で示される
加熱処理を行うことなく標的物の増幅前にＵｇｉ単独に
より十分阻害されることを見出した。したがって、Ｕｇ
ｉは新規増幅生成物におけるＵＤＧの攻撃を防止するた
めの手段として等温増幅反応に有用である。Ｕｇｉは増
幅酵素と一緒に単に添加するだけでＵＤＧでの汚染除去
後に増幅を開始する。これら二つの発見により等温核酸
増幅反応に対する本発明のＵＤＧ／Ｕｇｉ汚染除去法の
発展が可能になった。
【０００９】
【発明の概略】本発明は等温核酸増幅反応たとえばＳＤ
Ａおよび３ＳＲにおける汚染アンプリコンを不活化する
ための方法を提供するものである。ｄＵは、チミン
（Ｔ）の代わりに増幅により産生したアンプリコンへ組
み込まれる。これらのアンプリコンが次の増幅反応を汚
染する場合、これらはＵＤＧで処理することにより鋳型
として不活化される（すなわち、増幅不可能になる）。
等温増幅が高めた温度を含まないので、ＵＤＧはＵＤＧ
阻害剤たんぱく質Ｕｇｉを含むことにより特定の標的配
列の次の増幅の間に不活化されうる。
【００１０】ｄＵ残基の組み込みは予期せぬことに通常
のＳＤＡ反応と比べてＳＤＡの増幅能力を強めることが
見出された。この強化はｄＵ含有核酸がＳＤＡにより増
幅された場合（ＵＤＧの添加により汚染除去されること
なく）観察される。本発明がどのようにして作用するか
といういかなる特定の理論に縛られることを望むもので
はないが、この強化ＤＮＡがｄＵを含む場合、融解温度
がより低くなるという結果になる。これらのより低いＤ
ＮＡの融解温度はより大きなプライマーハイブリッド形
成特異性をもたらし、そしてまたポリメラーゼによるス
トランド置換を強化する。
【００１１】
【発明の詳細な記載】本発明は、次の等温増幅反応にお
いて鋳型として働くことから先行核酸増幅反応で生じる
アンプリコンを妨げる方法を提供するものである。該方
法は増幅した標的配列へ普通でないヌクレオチドを導入
しそして等温増幅のための次のサンプルを処理してサン
プルにおける核酸の増幅前に普通でないヌクレオチドを
特異的に除去することを含む。普通でないヌクレオチド
を含む予め生じた核酸から、その普通でないヌクレオチ
ドを除去することにより、予め生じた核酸が次の増幅反
応においてさらに増幅されることに関して不適当なもの
になる。
【００１２】“ 普通でない "ヌクレオチドとは、特定
核酸において天然産生でないヌクレオチドのことであ
る。普通でないヌクレオチドは天然産生ヌクレオチド
（たとえば、ヒポキサンチン）でもよくまたはこれらは
普通のヌクレオチド（たとえば、Ｎ−７−メチルグアニ
ン、デオキシウリジンおよびデオキシ−３’−メチルア
デニン）の化学的に修飾した誘導体または類似物でもよ
い。たとえば、ウラシルは天然産生であり、ＲＮＡにお
いて普通のヌクレオチドであるが、しかしこれはＤＮＡ
では普通でない。選択された普通でないヌクレオチドは
増幅反応を阻害したりまたは増幅した標的配列のつぎの
操作を阻害すべきでなく、すなわちポリメラーゼ、ハイ
ブリッド形成、等を妨害すべきでない。ウラシルは本発
明方法によるＤＮＡへの組み込みのための好ましい、普
通でないヌクレオチドである。ウラシルは好ましくは
２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート（ｄＵ
ＴＰ）として組み込まれ、そして標的配列が増幅する間
および／またはプライマーを合成する間ＤＮＡ合成反応
に含まれる。好ましくは、ｄＵＴＰは増幅（ＤＮＡ合
成）の間に用いられ部分的または完全にＴＴＰと代わ
る。最も好ましくは、ｄＵＴＰは増幅反応において完全
にＴＴＰと代わりそして最大置換のために反応を行うた
めに他のヌクレオチドよりやや高濃度で含まれる（たと
えば、ｄＵＴＰが０．５ｍＭ、そして他のｄＮＴＰｓが
各々０．２ｍＭ）。より長い標的はｄＵＴＰのいずれか
の与えられた濃度に対し短い標的よりさらに十分にｄＵ
置換されるであろうし、したがってｄＵＴＰの濃度は標
的の長さによって調節されうる。一般的に、各ｄＮＴＰ
は増幅反応において０．１ｍＭ−１ｍＭで存在するであ
ろう。ＭｇＣｌ2 はＵＤＧ処理の間任意であり、含まれ
る場合は約０．５−１０ｍＭで存在する。
【００１３】ｄＵＴＰは、これが増幅に悪影響を及ぼさ
ない限りはいずれの等温増幅反応においてもＴＴＰと完
全にまたは一部代えることができる。増幅生成物の完全
ｄＵ−置換を生ずるための各増幅系に含まれるｄＵＴＰ
の適当な量は実験的に測定される。その後、増幅は公知
プロトコールにしたがって実施される。本発明で使用さ
れるための好ましい等温増幅プロトコールはＳＤＡであ
る。
【００１４】一般的には、実験室における全ての増幅反
応はｄＵＴＰの組み込みで行われ、これによりすべての
次の増幅が増幅前に汚染除去される。増幅前にサンプル
を汚染除去するために、０．１−１０単位のＵＤＧ、好
ましくは１−２単位のＵＤＧをサンプルおよび非酵素増
幅試薬（ｄＵＴＰを含む）へ５−３０分間、２５−４５
℃、好ましくは約４１℃で加える。ＵＤＧとのインキュ
ベーションに続いて、増幅の残りの酵素成分にＵｇｉ約
０．１−５０単位、好ましくはＵｇｉ約１−４単位を加
え、増幅反応を開始する。ＵＤＧ：Ｕｇｉの比は少なく
とも１：１以上、好ましくは約４：１である。Ｕｇｉの
好適な量は経験的に簡単に測定されうる。Ｕｇｉ単独の
添加は反応においてＵＤＧを不活化するのに十分であ
り、新しく合成したアンプリコンからウラシル残基を除
去するのを妨げる。
【００１５】増幅された標的配列（アンプリコン）を次
いで当該技術で公知の方法を用いて検出する。これら
は、特徴的サイズによりたとえばゲル電気泳動により同
定されるか、またはハイブリッド形成により可視化して
検出可能なラベルで標識化されたオリゴヌクレオチドプ
ローブとしてもよい。アンプリコンを検出するための好
ましい方法は、ウォーカーら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，前出）により記載されているプライマー延長法
であり、これは32Ｐ標識化プライマーを特異的にハイブ
リッド化してアンプリコンとし、ポリメラーゼで延長す
る。次いで予測した大きさの延長プライマーを延長生成
物のゲル電気泳動後にオートラジオグラフィーで可視化
した。
【００１６】ＵＤＧは多くの細胞において見出され、核
酸実験室的プロトコールに用いられる試薬（たとえば、
制限酵素、ポリメラーゼ、リガーゼ、等）を汚染しう
る。本発明はまたＵＤＧ活性についてのサンプルおよび
試薬を検定する方法を提供するものである。このような
検定は、ウラシル含有ＤＮＡを攻撃するＵＤＧ汚染の発
生源を同定するために有用である。本発明によるサンプ
ルまたは試薬におけるＵＤＧ活性を検定するために、公
知ウラシル含有標的核酸を試験すべきサンプルまたは試
薬へ加える。サンプルまたは試薬は、いずれの汚染ＵＤ
Ｇも標的核酸からウラシルを除去するのに十分な期間イ
ンキュベーションする。Ｕｇｉを加え、標的核酸を上述
のように増幅する。次いでもしあるならば増幅生成物を
検出する。サンプルまたは試薬にＵＤＧが存在する場
合、増幅生成物がないか、または増幅生成物の減少した
量が検出されるであろう。ＵＤＧが無い場合、標的核酸
の増幅は普通に進行するであろう。
【００１７】
【実施例】
実施例１ この実験は、さまざまな量（２００−５０ゲノム）の結
核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ）ＤＮＡおよびｄＵ含有アンプリコンを含むサ
ンプルの増幅におけるＵＤＧ処理の効果を試験した。ｄ
Ｕ含有アンプリコンを以下のようにほぼ１×１０4 結核
菌ゲノムを含むサンプルのＳＤＡにより産生した。この
方法は大体ウォーカーら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．（前出）により記載されているとおりであり、０．
５ｍＭｄＵＴＰでＴＴＰを代えた。残りのｄＮＴＰは
０．２ｍＭで含まれた。ＳＤＡ反応を４１℃で実施し
た。増幅後、反応がほぼ５．１×１０11ｄＵ含有アンプ
リコン／μl を含むことが推定された。この調製物を新
規サンプルへ突入させるためのアンプリコン汚染の貯蔵
源として使用し、各サンプルに対し必要な数の分子を産
生するのに必要なように希釈した。
【００１８】結核菌（Ｍｔｂ）ＤＮＡおよび／または１
０5 ｄＵアンプリコンは表１に記載したように反応緩衝
剤４２μl 中に含まれた。反応を四つに分け、さまざま
な量のゲノムＭｔｂＤＮＡの存在または不存在下にアン
プリコンにおけるＵＤＧ処理の効果を試験した。ＵＤＧ
処理がアンプリコン除去において不成功であるかまたは
部分的に成功するだけの場合、増幅生成物は各群の最初
のサンプル（サンプル１，５，９および１３）で検出さ
れるであろう。反応緩衝剤はすでに記載されている（ウ
ォーカーら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，前出）よ
うにＫi ＰＯ4、ウシ血清アルブミン、四つのプライマ
ー（配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および
配列番号：４）、グリセロール、ｄＡｓＴＰ、ｄＣＴＰ
およびｄＧＴＰを含むがしかしｄＵＴＰは上述のように
ＴＴＰと代わる。サンプルを９８℃で３分間変性し、４
２℃まで冷却し、そして０．５単位／μl ＵＤＧ２μl
を加えた。対照サンプルにおいて、２５％グリセロール
２μl を加えた。すべてのサンプルを４２℃で３０分間
インキュベーションし、次いで温度を４１℃まで調節し
た。ＳＤＡ増幅は、ＭｇＣｌ2、エキソヌクレアーゼフ
リークレノウ、ＨｉｎｃIIおよびＵＤＧ阻害剤（Ｕｇ
ｉ）２または４単位を含む酵素混合物６μl を加えるこ
とにより開始した。増幅反応は４１℃で２時間インキュ
ベーションし７２℃で２分間加熱することにより終了し
た。
【００１９】酵素混合物添加後、反応成分の最終濃度は
以下のようであった：５０ｍＭＫiＰＯ4 ｐＨ７．５；
０．２ｍＭ各ｄＡｓＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ；０．５
ｍＭｄＵＴＰ；０．５μＭプライマー１および２（配列
番号：１および配列番号：２）；０．０５μＭプライマ
ー３および４（配列番号：３および配列番号：４）；
０．１μg ／μl ウシ血清アルブミン；１４％グリセロ
ール；１単位ＵＤＧ；２または４単位阻害剤；１単位エ
キソヌクレアーゼフリークレノウ；１５０単位Ｈｉｎｃ
II；５０ｎｇヒトＤＮＡ（Ｍｔｂ、アンプリコンＤＮＡ
に対し希釈）。
【００２０】ＵＤＧ／ＳＤＡ反応の生成物は、先に記載
されている（ウォーカーら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，前出）ように32Ｐ−標識化プローブ（配列番号：
５）の延長およびゲル電気泳動分析により検出した。増
幅生成物はオートラジオグラフィーにおいて二本のバン
ドとして検出され、それぞれは、３５塩基および５６塩
基に対応する。
【００２１】
【表１】 表 １ ＃ ＋／− Ｍｔｂ １ Ｕ Ｕｇｉ アンプリコン ゲノム ＵＤＧ １ ＋１０5 ０ あ り ２ Ｕ ２ ＋１０5 ２００ゲノム あ り ２ Ｕ ３ ０ ２００ゲノム あ り ２ Ｕ ４ ０ ０ あ り ２ Ｕ ５ ＋１０5 ０ あ り ２ Ｕ ６ ＋１０5 １００ゲノム あ り ２ Ｕ ７ ０ １００ゲノム あ り ２ Ｕ ８ ０ ０ あ り ２ Ｕ ９ ＋１０5 ０ あ り ２ Ｕ １０ ＋１０5 ５０ゲノム あ り ２ Ｕ １１ ０ ５０ゲノム あ り ２ Ｕ １２ ０ ０ あ り ２ Ｕ １３ ＋１０5 ０ あ り ４ Ｕ １４ ＋１０5 ５０ゲノム あ り ４ Ｕ １５ ０ ５０ゲノム あ り ４ Ｕ １６ ０ ０ あ り ４ Ｕ １７ ＋１０5 ０ な し ２ Ｕ １８ ０ ２００ゲノム な し ２ Ｕ １９ ０ １００ゲノム な し ２ Ｕ ２０ ０ ５０ゲノム な し ２ Ｕ ２１ ０ ０ な し ２ Ｕ この実験の結果を図１に示す。サンプル１，５，９およ
び１３では増幅生成物は検出されず、これはサンプルの
汚染除去が成功したことを示す。サンプル１７はＵＤＧ
のない対照物であり、検出されたは増幅生成物１０5 汚
染アンプリコンがＵＤＧ汚染除去の不存在下にＳＤＡに
より検出可能に増幅されうることを示した。サンプル１
７とサンプル１，５，９および１３とを比較するとＵＤ
Ｇ処理により除去されうるアンプリコンの数の程度を提
供する。四つの各群における第二のサンプル（サンプル
２，６，１０および１４）は、ゲノムＤＮＡの増幅にお
けるＵＤＧ処理の効果の程度を提供し、すなわち、ゲノ
ムＤＮＡはシグナルにわずかな損失があるだけで増幅が
成功した（ＵＤＧ処理なしで増幅したゲノムＤＮＡの好
適な対照物−サンプル１８，１９および２０とサンプル
２，６，１０および１４とを比較する）の測定を提供す
る。各群における第三のサンプルは、ゲノムＤＮＡの増
幅においてアンプリコンの不存在下におけるＵＤＧ処理
の効果を測定する対照物であった。すなわち、サンプル
２，６，１０および１４におけるアンプリコンの全てが
ＵＤＧ処理により除かれる場合、サンプル２および３；
６および７；１０および１１；１４および１５（各組に
おいて第二および第三のサンプル）についてのＳＤＡ増
幅生成物の量は同じであるべきである。これら一対のサ
ンプルにおいて作られる増幅生成物の量は同じであり、
汚染アンプリコンの除去の成功を示した。各組における
第四のサンプルもまた対照物であり、これはＳＤＡ試薬
とともにＳＤＡ反応へ添加されうるバックグラウンド
（不注意の）アンプリコン汚染をモニターするものであ
る。これらのサンプルはＳＤＡプライマーにより特異的
には増幅されないヒトＤＮＡ（希釈剤として使用）を僅
か５０ｎｇ含むだけであった。サンプル４，８，１２お
よび１６は増幅生成物を全く含まなかった。しかしなが
ら、ＵＤＧ処理を行わないサンプル２１は弱い増幅生成
物シグナルを示した。サンプル２１における増幅生成物
の存在は、緩衝剤混合物が偶然に低いレベルのアンプリ
コン（５０ゲノム等量以下）により汚染されたことを示
した。この系とＵＤＧ処理した組における第四番目の系
（サンプル４，８，１２および１６）を比較すると、バ
ックグラウンドアンプリコンもまたＵＤＧによりサンプ
ルから除かれたことを示した。これらの実験により、１
０5 ｄＵ含有汚染アンプリコン程の多くを除くことがで
きしかも５０Ｍｔｂゲノム程の少ない増幅が成功するこ
とが示された。
【００２２】実施例２ 本実験では、１０5 汚染アンプリコンのＵＤＧ処理にお
けるＭｇＣｌ2 の効果および処理における時間の効果を
調べた。ｄＵ含有アンプリコンは実施例１におけるＳＤ
Ａ増幅により生じたものであった。増幅後、反応は５．
１×１０11アンプリコン／μl を含むと概算された。ア
ンプリコンはＵＤＧ汚染除去を評価するために使用され
る１×１０5 ｄＵアンプリコンを提供するのに必要なよ
うに希釈された。
【００２３】反応混合物（４２μl ）は、Ｋi ＰＯ4 ｐ
Ｈ７．５、ウシ血清アルブミン、ｄＵＴＰ、ｄＡｓＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、プライマー１−４（配列
番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番
号：４）およびグリセロールを含む。さらに、この混合
物は表２に示すように＋／−ＭｇＣｌ2 、＋／−ｄＵお
よびＭｔｂゲノムＤＮＡを含む。サンプルを９８℃で３
分間加熱しＤＮＡを変性しそして４２℃まで冷却した。
０．５単位／μl ＵＤＧ２μl を表２に示すように加
え、５分、１５分または３０分間インキュベーションさ
せた。酵素混合物を、＋／−ＭｇＣｌ2 、ＨｉｎｃII、
エキソヌクレアーゼフリークレノウおよびＵｇｉを含む
ように調製した。ＵＤＧ処理後、酵素混合物６μl をサ
ンプルへ加えＳＤＡ増幅反応を開始した。サンプルを４
１℃で２時間インキュベーションし、増幅を７２℃で２
分間加熱することにより終了した。酵素混合物の添加後
全ての反応成分の最終濃度は以下のようであった：５０
ｍＭＫi ＰＯ4 ｐＨ７．５；０．２ｍＭ各ｄＡｓＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ；０．５ｍＭｄＵＴＰ；０．５μＭ
プライマー１および２（配列番号：１および配列番号：
２）；０．０５μＭプライマー３および４（配列番号：
３および配列番号：４）；０．１μg ／μl ウシ血清ア
ルブミン；７ｍＭＭｇＣｌ2 ；１４％グリセロール；１
単位ＵＤＧ；２単位阻害剤；１単位エキソヌクレアーゼ
フリークレノウ；１５０単位ＨｉｎｃII；５０ｎｇヒト
ＤＮＡ（アンプリコンおよびＭｔｂＤＮＡに対し希
釈）。
【００２４】ＵＤＧ／ＳＤＡ反応の生成物は、実施例１
におけるように32Ｐ−標識化プローブ（配列番号：５）
の延長およびゲル電気泳動分析により検出された。ＳＤ
Ａ増幅生成物はオートラジオグラフィーにおいて二本の
バンドとして検出され、これは３５塩基および５６塩基
に対応する。
【００２５】
【表２】 表 ２ ＃ ＋／− ＋／− ＵＤＧ ＋／−ＭｇＣｌ2 アンプリコン ５０ゲノム 時 間 ＵＤＧ処理の間 １ ＋１０5 ０ ５ 分 ＋ＭｇＣｌ2 ２ ＋１０5 ＋５０ゲノム ５ 分 ＋ＭｇＣｌ2 ３ ０ ＋５０ゲノム ５ 分 ＋ＭｇＣｌ2 ４ ＋１０5 ０ ５ 分 −ＭｇＣｌ2 ５ ＋１０5 ＋５０ゲノム ５ 分 −ＭｇＣｌ2 ６ ０ ＋５０ゲノム ５ 分 −ＭｇＣｌ2 ７ ＋１０5 ０ １５分 ＋ＭｇＣｌ2 ８ ＋１０5 ＋５０ゲノム １５分 ＋ＭｇＣｌ2 ９ ０ ＋５０ゲノム １５分 ＋ＭｇＣｌ2 １０ ＋１０5 ０ １５分 −ＭｇＣｌ2 １１ ＋１０5 ＋５０ゲノム １５分 −ＭｇＣｌ2 １２ ０ ＋５０ゲノム １５分 −ＭｇＣｌ2 １３ ＋１０5 ０ ３０分 ＋ＭｇＣｌ2 １４ ＋１０5 ＋５０ゲノム ３０分 ＋ＭｇＣｌ2 １５ ０ ＋５０ゲノム ３０分 ＋ＭｇＣｌ2 １６ ＋１０5 ０ ３０分 −ＭｇＣｌ2 １７ ＋１０5 ＋５０ゲノム ３０分 −ＭｇＣｌ2 １８ ０ ＋５０ゲノム ３０分 −ＭｇＣｌ2 １９ ０ ＋５０ゲノム ＵＤＧ無し ＋ＭｇＣｌ2 ２０ ０ ＋５０ゲノム ＵＤＧ無し −ＭｇＣｌ2 結果を図２に示す。１０5 ｄＵアンプリコンを有効に除
去するためのＵＤＧ酵素の力におけるＭｇＣｌ2 および
時間の効果を評価するために反応を三つの組に分けた。
ＵＤＧ処理が不成功であるかまたはわずかに部分的に成
功した場合、各組における最初のサンプル（サンプル
１，４，７，１０，１３および１６）は、増幅生成物を
含む。サンプル１，４，７，１０，１３および１６にお
いて増幅生成物がないと、ＵＤＧ酵素が試験された条件
のすべてのもとで１０5 の汚染ｄＵアンプリコンを除去
することができるということを示した。実施例１でも示
したように、各組の第二のサンプル（サンプル２，５，
８，１１，１４および１７）において増幅生成物の存在
は、ＵＤＧ処理とＳＤＡ反応の間に加熱工程がなくとも
ＵＤＧ処理されたアンプリコンの存在下にゲノムＤＮＡ
を増幅するＳＤＡの能力を示した。ＰＣＲに関連する先
行技術はＵＤＧ酵素を不活化するためばかりでなく非塩
基性ＵＤＧ処理ＤＮＡをより小さい非増幅性断片へ断片
化させるためにも必要であることを示していた。出願人
はこの加熱工程が必要ではないことを確認し、そしてＵ
ｇｉ単独でＵＤＧを不活化するのに十分であることを発
見した。このことは非塩基性ではあるがしかしながら完
全なｄＡｓが試験された条件下では増幅しないことを示
す。各組における第三のサンプル（サンプル３，６，
９，１２，１５および１８）は汚染ｄＵアンプリコンの
不存在下にゲノムＤＮＡの増幅におけるＵＤＧ処理の効
果を測定するための対照物であった。各組における第二
および第三のサンプルの増幅生成物の比較は同等のシグ
ナルを示した。それゆえ、ＵＤＧ処理アンプリコンの存
在または不存在におけるゲノムＤＮＡの増幅の間に差は
ない。最後の二つのサンプルは対照（サンプル１９およ
び２０）であり、ＵＤＧ処理なしの結核菌の５０ゲノム
の増幅を測定するためのものである。未処理サンプルか
らのシグナルはＵＤＧ処理サンプルのものよりやや暗い
かった。この違いはＳＤＡ増幅がＵＤＧ処理の不存在下
にやや効果があることを示唆する。この実施例は、ＵＤ
Ｇ処理の間のＭｇＣｌ2 の存在または不存在が１０5 汚
染ｄＵアンプリコンの除去において何らの重要な効果を
持たないことを示した。さらに、５分間のインキュベー
ションはＭｇＣｌ2 の存在とは関係なく１０5 ｄＵアン
プリコンを除去するのに十分であった。
【００２６】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACGGCGTA CTCGACC 37 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACACTGAG ATCCCCT 37 配列番号：３ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TGGACCCGCC AAC 13 配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGCTGAACCG GAT 13 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGTTATCCAC CATAC 15
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１の結果を示すオートラジオグ
ラフィである。
【図２】図２は、実施例２の結果を示すオートラジオグ
ラフィである。
フロントページの続き (72)発明者 ジョージ・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・ボ ラス・ロード 209 (72)発明者 ジェームズ・エル・シュラム アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27545，ナイトデール，ドゥエリング・ プレイス 102

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 先の等温増幅反応で生じた汚染アンプリ
    コンがサンプルの次の等温増幅の間に増幅することを防
    止する方法であって、以下の工程： ａ） 先の等温増幅反応の間にウラシルをアンプリコン
    へ組み込み； ｂ） 次の等温増幅の前に、サンプルをウラシルＤＮＡ
    グリコシラーゼ（ＵＤＧ）の有効量で処理して汚染アン
    プリコンを増幅不可能にし；そして ｃ） ＵＤＧを不活化するのに十分な量のウラシル−Ｄ
    ＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）の存在下に、処理
    したサンプルを増幅することからなる方法。
  2. 【請求項２】 先のおよび次の増幅がストランド置換増
    幅による請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 約０．１−１ｍＭｄＵＴＰが先の増幅反
    応に含まれる請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 約０．５ｍＭｄＵＴＰが先の増幅反応に
    含まれる請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 約０．１−１ｍＭｄＵＴＰが次の増幅反
    応に含まれる請求項３の方法。
  6. 【請求項６】 約０．５ｍＭｄＵＴＰが次の増幅反応に
    含まれる請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 サンプルをＵＤＧ約０．１−１０単位で
    処理して、処理したサンプルをＵｇｉ約０．１−５０単
    位の存在下に増幅する請求項２の方法。
  8. 【請求項８】 サンプルをＵＤＧ約１−２単位で処理し
    て、処理したサンプルをＵｇｉ約１−４単位の存在下に
    増幅する請求項７の方法。
  9. 【請求項９】ａ） ウラシル含有核酸をサンプルへ加
    え； ｂ） ウラシル含有核酸を等温増幅し；そして ｃ） 増幅した核酸をＵＤＧ活性の指標として検出する ことからなるサンプルにおけるウラシルＤＮＡグリコシ
    ラーゼ（ＵＤＧ）活性を検出する方法。
  10. 【請求項１０】 核酸をストランド置換増幅により増幅
    する請求項９の方法。
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