JP2517094B2 - リン脂質組成物 - Google Patents

リン脂質組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 関連のある係属出願 本出願は、1986年12月5日付けで出願された先の共係
属出願第938,563号の一部継続出願であり、該第938,563
号出願は1986年11月26日に出願され、現在は、出願放棄
された第935,919号の一部継続出願であり、これら両出
願は、本明細書中に参考に導入されている。
発明の分野 この発明は、リン脂質類の混合物に関する。特にこの
発明はホスファチジルコリンおよひスフィンゴミエリン
の区別された範囲の混合物で実質的にリソホスファチジ
ルコリンを含まないものに関し、このものは安定なリポ
ソーム類を調製するために直接有用な薬剤生産性を有す
るものである。
発明の背景 リポソーム類は取り込まれた水性容量を含有する、完
全に閉鎖された脂質二分子膜(lipid bilayer membrane
s)である。リポソーム類はユニラメラ小胞体(単一の
二分子膜を有する)又はマルチラメラ小胞体(水性層に
よってその隣のものから各々分離された多層二分子膜に
よって特徴づけられるタマネギ一様構造)であることが
できる。その二分子膜は疎水性“尾部”部位と親水性
“頭部”部位とを有する2つの脂質モノレイヤーから構
成されている。その二分子膜の構造は、その脂質モノレ
イヤーの疎水性(非極性)“尾部”が二分子膜の中心に
配向し、一方親水性(極性)“頭部”は水性相に配向し
ているものである。リポソーム類は薬のような生物活性
剤を人間を含めた哺乳類に投与(deliver)するために
有用である。
一般的に、この脂質二分子膜の主要な成分はホスファ
チジルコリンのようなリン脂質である。得られたリポソ
ーム類は、しばしば不安定であり時間の経過と共に崩壊
する。この不安定さが、その製品の減少した棚に置ける
期間もしくは該製品を貯蔵するために特別の注意をする
必要があるという理由で、リポソームによる薬剤投与シ
ステムの商業的発展および薬剤としての使用をあまり魅
力のないものにしている。
この脂質組成の分析は種々の方法で行うことができ
る。これらの方法の中では、205nmでの紫外線検知(205
nmにおけるUV)を用いた高速液体クロマトグラフィー;
ジンザツェ試薬(例えばホスプレイTM,スペルコ社)に
基く特定分析を用いるリン脂質類の薄層クロマトグラフ
ィー(TLC);炎イオン化を用いる高圧液相クロマトグ
ラフィー;および炎イオン化を用いる薄層クロマトグラ
フィー〔例えばイートロスキャン(TH−10)TM,イート
ロン ラボラトリーズ インコーポレーション、日本)
がある。どの方法も、そのテスト方法特有の効果を得る
であろう。この発明の脂質組成物は、205nmにおけるUV
およびTLCの両者によって分析された。ここで利用され
た205nmにおけるUVテスト方法はシリカゲルカラム上の
高速液体クロマトグラフィーによって行われる。ここで
利用されたTLCテスト方法はシリカゲル板(HPTLC−HL
プリアドソーバント プレート、アナルテック社製のよ
うなもの)の上に卵ホスファチジルコリン(EPC)試料
約200μgを置くことによって行われる。同一の物質をT
LCテストと205nmにおけるUVとで比べると、205nmにおけ
るUVの方がほんの少しであるが明らかに純度が高いとい
う結果を示した。
ここで記載されている純度は特に断らない限りTLC分
析により表現されている。
発明の要約 我々は、より安定なリポソーム類を形成する脂質組成
物を見出した。
また、ヘキサン−エタノール−水勾配(gradient)で
溶出する液体クロマトグラフィーカラムを用いて該脂質
組成物を単離する工程を含有する本発明の脂質組成物の
製造法も記載されている。更にまた、この新規な脂質組
成物を用いて製造されたリポソーム類および該リポソー
ム類が更に少なくとも1つの生物活性剤を含有するもの
が記載されている。
発明の詳細な記載 目的の組成物を得るための便利な方法は卵黄を用いる
ことによって始まる。出発原料たる卵黄としては、好ま
しくは凍結卵黄であるが、新鮮なもの、噴霧乾燥等のも
の、凍結乾燥のもの、蒸発もしくは乾燥剤で乾燥した卵
黄も用いることができる。この出発原料の他の具体例と
しては、部分精製されたホスファチジルコリン製剤(80
%ホスファチジルコリン)があり、これは市販されてい
る。
該出発原料の1例としては、部分解凍された凍結卵黄
がある。凍結卵黄を部分的に解凍するために、それらは
約16−34時間約4℃に保持され、そうすることによっ
て、この卵黄の20−50パーセントは解凍する。一部解凍
卵黄固体はエタノールで2回抽出される。この抽出物
は、まず第一に該卵黄固体の脱水をしているもので、同
時に該卵黄からのリン脂質および中性脂質油の抽出をわ
ずかに行っている。この脱水操作は、ヘキサンが該リン
脂質の後続の抽出に使用されるときに二層混合物が形成
されることを防ぐために好ましく行われるものであり、
後から行われるろ過を容易にさせるものである。該卵黄
を乾燥させるために噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥もし
くは他の方法が、用いられるならば、これらのエタノー
ル抽出工程は減らすかもしくはやめることができる。エ
タノール対卵黄固体の容量対重量比率は一般的には各抽
出に対して約20:1と1:1の間であり、好ましくは約2:1と
1:1の間である。この抽出が行われる温度は一般的には
約60℃と0℃の間であり、好ましくは約40℃と30℃の間
である。
得られた脱水された卵黄固体はエタノール抽出に続い
てエタノールおよびヘキサンの混合物で1ないしより多
回数、好ましくは3回抽出する。各抽出は(a)卵黄固
体とエタノール−ヘキサン混合物を混合し、続いて
(b)ろ過を行って卵黄固体を採取することからなる。
ヘキサンは続いて該抽出物から除去される。各抽出から
の抽出物(ろ液)を真空蒸留してヘキサンを留去するの
が簡便である。エタノール−ヘキサン抽出混合物におけ
るエタノール対ヘキサンの比は約99.9:1および1:99.9容
量比の間であり、好ましくは約1:2および2:1の間であ
る。卵黄固体対エタノール−ヘキサン混合物の重量対容
量比は約1:200と1:0.5の間であり、好ましくは約4:1お
よび1:1の間であり、更に好ましくは約2:1である。この
工程が行われる温度は約60℃と−20℃の間であり、好ま
しくは40℃と20℃の間であり、より好ましくは約40℃と
35℃の間である。ろ過は、真空ろ過によって行われる。
当業界で知られている固体および液体の分離のための他
の方法、例えば加圧ろ過(pressure filtration)、遠
心分離、フィルター プレス、ふるい等の他の類似の方
法も採用できる。
本発明の組成物の製造中に、ヒドロパーオキサイド
類、パーオキサイド類の生成、およびホスファチジルコ
リン(PC)の崩壊および着色を避けるために、工程中の
酸化を避けるための予防手段を採ることができる。例え
ば、ブチル化ヒドロキシトルエ(BHT)もしくはアルフ
ァートコェロールのような抗酸化剤を卵黄固体のエタノ
ール−ヘキサン抽出の間に加えることができる。すなわ
ち、溶媒1リットルにつき約2mgの濃度でのBHTが採用で
きる。そうでなければ、窒素のような不活性雰囲気の使
用のような酸素を排除する他の手段を採用することがで
きる。
最初のエタノール抽出物および実質的にヘキサンが混
じっていないエタノール−ヘキサン抽出物は続いて貯蔵
される。このエタノール抽出物は、またいくつか水分を
含んでおり、このことが、リン脂質が溶解性であるのに
対し、この中性脂質を不溶性とする。約20−20℃で一般
的には約4−18時間置いておくと、水性のエタノール層
の下に濃い油層が形成される。このエタノール分画に残
っているリン脂質を次の工程のための供給化合物として
使用する。その油層は分離して捨てる。この油層は主に
中性脂質とコレステロールを含有しており、その結果エ
タノール抽出物の実質的な精製を行っているのである。
それから、このエタノール分は、エタノール分画への
水の添加後、少なくとも1回、そして好ましくは3回ヘ
キサンで抽出される。水対エタノールの容量対容量比
は、約10:1と1:10の間、好ましくは1:2と1:3の間であ
る。エタノール対ヘキサンの容量対容量比は約1:10と1
0:1の間であり、好ましくは約4:1および1:1の間であ
る。各抽出工程は(a)エタノール水分画へのヘキサン
の添加、続いて(b)水分の添加;(c)これら溶液の
混合;(d)相分離(一般的には約2日までが必要とさ
れる)からなる。この分離は遠心分離もしくは相分離を
強めるために知られている他の方法によって促進される
ことができる。そして(e)のヘキサン相の採取であ
る。3つのヘキサン相を一緒に集め、ヘキサンを好まし
くは真空蒸留で除去し、ヘキサン中約20%(w/v)のリ
ン脂質溶液を得る。この抽出工程を行う温度は約−20℃
および60℃の間、好ましくは15℃および35℃の間、より
好ましくは約15−25℃の間である。
その毒性およびリポソームの安定性に対する逆効果の
故に、リソホスファチジルコリンはホスファチジルコリ
ン組成物の望ましくない成分である。本発明の組成物は
約0.5重量%(205nmにおけるUVで0.2%−−検出限界)
のリソホスファチジルコリン(検出限界)と同等もしく
はそれより小であり、ここで記載されている方法は、リ
ソホスファチジルコリン分画がエタノール水相に大部分
が残るようにその分画の分離をする。ここで使用されて
いる「実質的にリソホスファチジルコリンがない」とい
うのは、リソホスファチジルコリン約0.5重量%より小
ということを意味している。
この20%(w/v)のリン脂質溶液は、液体クロマトグ
ラフィー、好ましくはHPLCによる、リン脂質混合物から
本発明の脂質成分の分離のための出発物である。この物
質は、約5および500ミクロンの粒子サイズのシリカカ
ラムを有するシリカゲルクロマトグラフィー媒体に負荷
する。この発明に対し、一般的にはクロマトグラフィー
に好適などのようなシリカも採用することができる;例
えば、多孔性シリカもしくは融解シリカ、球状シリカも
しくは大小穴のある不規則な形状のシリカがある。この
流動相はヘキサン−エタノール−水の段階勾配である。
5cm直径、50cm長さのカラムを用い、リン脂質0.7リット
ルに対して、一般的には約20リットルの流動相が必要と
される。第1溶媒のヘキサン−エタノール−水の容量比
には単一の相が存在するように選ばれ、例えば約10:90:
1から100:100:3へ、好ましくは約60:130:1から60:130:8
へ、そして、より好ましくは約60:130:6に変化すること
ができる。中性脂質、コレステロールおよびホスファチ
ジルエタノールアミンはこの溶媒中に溶出される。この
コレステロールとホスファチジルエタノールアミンの溶
出に続いて、その流動相はより多い水を含有する溶媒に
変えられる。第2の溶媒のヘキサン−エタノール−水容
量比は単一の相が存在するように選ばれ、そして例えば
約100:100:4から約20:100:100へ、好ましくは約60:130:
1から約60:130:14へ、そしてより好ましくは約60:130:1
2に変えらえる。ホスファチジルコリンとスフィンゴミ
エリンがこの溶媒中に溶出する。目的とする脂質組成物
生産物約160グラムが4kgの卵黄の抽出から得ることがで
きる。この生産物の組成は薄層クロマトグラフィーおよ
び分析HPLCにより決定される。
第2の溶離液ヘキサン−エタノール−水での溶出の
間、目的とするホスファチジルコリン−スフィンゴミエ
リン生成物のきれいな分離を妨げる“テイリング”(ta
iling)が生じることがある。テイリングを減少させる
ために、トリフルオロ酢酸(TFA)、酢酸もしくは他の
有機酸、またはアンモニウムスルフェートもしくはアン
モニウムクロライドのような単純なアンモニウム塩をこ
の溶出溶媒に添加することができる。TFAの濃度は溶出
溶媒1リットルにつき約10-6ないし10-1ミリリットル、
好ましくは1リットルにつき約10-3mlである。アンモニ
ウム塩については、その濃度は溶出溶媒1リットルにつ
き、10-6ないし10-1ミリグラム、好ましくは1リットル
につき10-3mgである。
この脂質組成物生成物はHPLCの溶出溶媒から水の添加
およびヘキサン層の蒸発によって採取される。この脂質
組成物生成物は、例えばエタノールもしくはエタノール
−ヘキサン溶液中に例えばヘキサン中5容量%のエタノ
ールを最終濃度10%(w/v)にまで再溶解され、そして
こはく色のびんに4℃で貯蔵される。もちろん、脂質の
溶解のために一般的に使用されるどのような溶媒も、こ
の脂質組成物生成物の溶解のために用いることができ
る。
本発明の該抽出およびクロマトグラフィー操作手段は
大豆およびホスファチジルコリンの他の原料に適用する
ことができる。一般に約25重量%のホスファチジルコリ
ンを有する市販のレシチン細粒(アメリカンレシチンも
しくはセントラルソーヤから入手し得るようなもの)が
都合のよい出発物質である。このレシチン細粒は少なく
とも1回、好ましくは約5回エタノールで抽出する。各
抽出工程は、レシチン細粒に対し、4容量(重量)のエ
タノールの添加、混合、およびろ過による該抽出物の採
取からなっている。このエタノール分画は貯められ、そ
してろ過される。貯められたエタノール分画は上述のよ
うに水およびヘキサンで抽出する。1kgのレシチン細粒
が抽出されるとき、約200グラムのリン脂質が得られ
る。
5回分のヘキサン抽出物を好ましくは真空蒸留により
濃縮して20%(w/v)のリン脂質溶液を得る。
ヘキサン溶液中の20%(w/v)のリン脂質をホスファ
チジルコリンの分離のためにHPLCシリカカラム上に直接
負荷させる。約160グラムのホスファチジルコリン(80
%回収)が得られる。このホスファチジルコリン分画は
約98%の純度で残りはスフィンゴミエリンであり、生成
物は実質的にリソホスファチジルコリンを含まない。こ
のホスファチジルコリン−スフィンゴミエリン分画は真
空蒸留により濃縮される。得られたホスファチジルコリ
ン−スフィンゴミエリンはエタノール中20%(w/v)溶
液として貯蔵されることができる。
他の方法では出発物質として、約80%のホスファチジ
ルコリンで市販されているリン脂質製剤(例えば、リポ
イドKG,ルードブィッヒ シャーフェン,西独)を使用
する。この80%のホスファチジルコリンはその精製にあ
たってヘキサン中の20%(w/v)リン脂質として用いら
れ、このものはHPLCシリカカラム上に直接負荷される。
すなわち、この方法においては20%(w/v)の80%のホ
スファチジルコリンがHPLCカラムにかけられるものであ
る。4インチ直径のHPLCカラムが使用されるのが好まし
い。
最終生成物が、高い安定性および低い毒性に対して理
想的であると決定される脂質組成物であることが本発明
の重要な限界である。この組成物は重量で少なくとも約
97%のホスファチジルコリンおよび少なくとも約0.5%
から約3%までのスフィンゴミエリンであり、更にこの
組成物はリソホスファチジルコリンを実質的に含まな
い。より好ましくはこの組成物は少なくとも約1.5%の
スフィンゴミエリンであり、更に好ましくは少なくとも
約2%のスフィンゴミエリンである。
最終生成物において使用されるための混合物そのもの
の物質の製造は特に精製の効率的な方法である。今まで
は、目的とする最終生成物(薬剤生成物品質)の特定の
組成を得るために目的とする処方のものを得るために純
粋なホスファチジルコリンを他の成分と混合していたの
である。全ての成分は必ず過度に精製し、それから一緒
にされるであろう。これが試薬、時間およびエネルギー
を費し、更に不必要に経費を上げた。本発明方法では、
目的とする薬剤生成物品質物質がこの方法の生産物であ
る。
リポソーム調製については、バンガム(Bangham)等
〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.
Mol.Biol.,)13,238−252(1965)〕による最初のリポ
ソームの調製は、リン脂質を有機溶媒中に懸濁し、次い
で蒸発乾燥させて、その反応容器上にリン脂質膜を残留
させることを包含する。ついで、水性溶液の適等量が加
えられ、混合物は“膨潤”され、そして、その結果得ら
れたマルチラメラ小胞体類(MLVS)からなるリポソーム
類は機械的手段で分散される。この技術は、パパハジオ
パウルス(Papahadjopoullos)等〔バイオヒミカ・エト
・バイオフィジカ・ウント・アクタ(Biochim.Biophys.
Acta.)135,624−638(1967)〕によって記載された超
音波処理された小さいユニラメラ小胞体類及び大きいユ
ニラメラ小胞体類の展開のための基礎を提供する。
大きいユニラメラ小胞体は、キュリス(Cullis)等の
米国特許第5,008,050号(1985年10月16日出願、米国特
許出願第788,017号)発明の名称“ユニラメラ小胞体類
の製造のための押出し技術”中に記載された方法による
押出し装置を用いて製造することができ、この技術につ
いてはこのものを参照されたい。この技術によって作ら
れた小胞体類LUVETは、ポリカーボネート膜フィルター
を通して、49.2kg/cm2(700psi)までの圧力下で押出さ
れる。これらの小胞体類は、その押出し技術を行なう前
に少なくとも1回の凍結と融解のサイクルにさらされる
ことができる;この操作は、バリィ(Bally)等の米国
特許第4,975,282号(1985年11月21日出願、米国特許出
願第800,545号)、発明の名称“改良された取り込み効
果を有するマルチラメラリポソーム類”中に記載されて
おり、このものを参照されたい。
小胞体を製造するために使用される他の技術は、逆相
蒸発小胞体(REV)を形成するようなもの、パパハジオ
パウルス等 米国特許第4,235,871号、安定なプルリラ
メラ小胞体類(SPLV)、レンク等米国特許第4,522,803
号のようなものを包含し、また単一相小細体(MPV)フ
ァウンティン等米国特許第4,588,578号;凍結および融
解マルチラメラ小細体(FATMLV)、バリィ等米国特許第
4,975,282号(1985年7月5日出願の米国特許出願第75
2,423号および1985年11月21日出願の米国特許出願第80
0,545号);また溶質の均一な分布を有する小細体、レ
ンク等米国特許第5,030,453号(1984年10月12日出願の
米国特許出願第660,573号)を包含する。これらの技術
については各々の公報類を参照されたい。
種々のステロール類およびそれらの水溶性誘導体がリ
ポソーム類を製造するためにこれまで使用されてきた;
特にジャノフ等、「ステロイド性リポソーム」なる名称
のつけられた米国特許第4,891,208号(1985年9月10日
出願の米国特許出願第773,429号)を参照されたい。198
5年3月14日に発行されたメイヒュー等WO 85/00968は、
アルファートコフェロールおよびその或る種の誘導体を
含有するリポソーム中に薬剤を取り込むことによって薬
剤の毒性を減少させる方法を記載している。また、種々
のトコフェロール類およびそれらの水溶性誘導体がリポ
ソームを形成するために使用されているが、「アルファ
ートコフェロールを基とする小胞体」という名称をつけ
られた米国特許第5,041,278号(1986年10月15日出願の
米国特許出願第786,740号)を参照されたい。
このステロール小胞体を製造する方法は、水性の区画
を取り込む完全に閉鎖された二分子膜を形成する十分な
量で、閉鎖二分子膜を形成し得るステロールの有機酸誘
導体の塩形態を水性緩衝液に添加することを包含する。
マルチラメラ小胞体の懸濁液は、この混合物を振とうす
ることによって形成される。小胞体の形成は、水性緩衝
液が溶液中にこの塩の対向イオンをも含有する場合には
促進される。
この懸濁液にエネルギーを与えると、例えば超音波、
またはフレンチ圧縮セル(フレンチ プレス)もしくは
適当な孔経の多孔性フィルターを通してこの小胞体の押
出しをすると、マルチラメラステロール小胞体をユニラ
メラ小胞体に変換することになるであろう。
本発明の脂質を用いて製造したリポソーム類はマルチ
ラメラもしくはユニラメラであることができる。マルチ
ラメラリポソーム類は、当業界で知られているどのよう
な方法によってもつくることができ、SPLV,凍結および
融解MLV,REVおよびMPVを包含することができる。ユニラ
メラリポソーム類は、凍結および融解技術それに続くポ
リカーボネートフィルターを通しての押出しによってつ
くることができる。
リポソーム類は、脂質二分子膜で閉鎖されている水性
媒体を取り込んでいる。この水性媒体は、例えば水もし
くは溶解された塩もしくは緩衝液を含有する水であるこ
とができる。このような塩もしくは緩衝液の例としては
塩化ナトリウムおよびリン酸塩緩衝食塩水(PBS)であ
ることができる。他の緩衝液としてホウ酸塩、クエン酸
塩、トリス−HCl〔トリス−(ヒドロキシメチル)−ア
ミノメタン塩酸〕およびHEPES(N−2−ヒドロキシエ
チル ピペラジン−N1−2−エタンスルホン酸)を包含
するが、これらに限定されることはない。緩衝液は約2.
0および約14.0のpH範囲であることができる。好ましい
具体例においては、この製剤はHEPES緩衝液(150mM Na
Cl,20mM HEPES),pH7.0,ホウ酸塩緩衝液(100mM NaHC
O3,50mM H3BO3,pH8.5,もしくはクエン酸緩衝液(150MM
クエン酸ナトリウム)、pH8.5で水和される。
リポソーム薬剤搬送システムにおいて、薬物は該リポ
ソーム中に取り込まれ、続いて治療される患者に投与さ
れる。例えばラーマン等、米国特許第3,993,754号;シ
アーズ、米国特許第4,145,410号;パパハジョポロス
等、米国特許第4,235,871号;シュナイダー、米国特許
第4,224,179号;レンク等、米国特許第4,522,803号およ
びファウンティン等、米国特許第4,588,578号を参照さ
れたい。
本発明により使用されるリポソーム中には実質的にい
ずれの生物活性剤も取り込ませることができる。該剤
は、ゲンタマイシンのような抗菌性化合物、リファンパ
シン(rifampacin)のような抗ウィルス性化合物、アン
ホテリシンBのような抗かび性化合物、アンチモン誘導
体のような駆虫化合物、ヴィンブラスチン、ヴィンクリ
スチン、マイトマイシンC、ドキソルビシン、ダウノマ
イシン、メソトレクステートおよびシスプラチンのよう
な抗新生生物性化合物、中でもアルブミンのような蛋白
質、ジフテリア毒素のような毒素、カタラーゼのような
酸素、エストロゲン類のようなホルモン類、アセチルコ
リンのような神経伝達物質、アルファーリポプロティン
のような脂肪蛋白質、ヒアルロン酸のような糖蛋白質、
IgGのようなイムノグロブリン類、インターフェロン類
もしくはインターロイキン類のような免疫関与物質、ア
ルセナゾIIIのような染料、14Cのような放射性標識剤、
99Teのような放射能しゃ蔽化合物、カルボキシフルオロ
シインのような蛍光化合物、グルコーゲンのような多糖
類、エストロゲン受容蛋白質のような細胞受容体結合分
子、インドメタシン、サリチル酸アセテート、イブプロ
フェン、スリンダック、ピロキシカムおよびナプロキセ
ンのような非ステロイド性抗炎症剤、デキサメタゾンの
ような抗炎症剤、チモロールもしくはピロカルピンのよ
うな抗緑内障剤、ジブカインのような麻酔剤、チミンの
ような核酸、RNAポリマーのようなポリヌクレオチド類
を包含するが、これらに限定されることはない。
このリポソーム類は脱水されることができ、それによ
って使用までの長い期間の貯蔵を可能にする。このリポ
ソームを脱水するために標準的な凍結−乾燥装置もしく
は同様の機器が使用され得る。リポソームは又、それら
を減圧下におくことによって簡単に脱水することができ
る。そうでなければリポソームおよびそれらを包囲して
いる媒体を脱水の前に液体窒素中で凍結させることがで
きる。まず、凍結をしてからの脱水は米国特許第4,880,
635号(1985年7月26日出願、米国特許出願第759,419
号)の方法に従って、その製剤中に1もしくはそれ以上
の保護糖の存在下で行うことができる。該出願の関連分
は参考にこの中に引用されている。用いることのできる
保護糖の例はトレハロース、マルトース、シュークロー
ス、グルコース、ラクトースおよびデキストランを包含
するが、これらに限られることはない。あるいは、マル
チラメラ小胞体は保護糖はなしに、凍結の前に脱水を行
うことができる。この脱水されたリポソーム類が使用さ
れるときには、該リポソームに水溶液、例えば蒸留水を
単に添加することによって再水和が完了し、それらを再
水和せしめる。
薬剤は、投与の意図された経路および標準的な薬学的
慣習に関して選択された薬剤的に許容し得る担体と混合
して、リポソーム中に入れた形で投与される。リポソー
ム中に取り込まれたときのこれらの薬剤の投薬量は、一
般にはその薬剤の単独の場合のそれとなるであろう;投
与量は患者の年令、体重および状態に関して、処方医師
によって設定されるであろう。担体に対する活性成分の
比例割合は熟慮された投与量の他にその活性成分の化学
的性質、溶解性および安定性に依るのは当然であろう。
投与が経口の場合には、本発明のリポソーム組成物は錠
剤の形態で使用でき、使用し得る担体はラクトース、ク
エン酸ナトリウムおよびリン酸塩を包含する。でん粉の
ような種々の崩解剤、ステアリン酸マグネシウム、ラウ
リル硫酸ナトリウムおよびタルクのような潤滑剤が錠剤
には普通に用いられる。カプセル形態での経口投与で
は、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量のポリエ
チレングリコールである。経口用途のために、水性懸濁
液が必要とされるときには、ある種の甘味料および/ま
たは香味剤を添加することができる。非経口投与、すな
わち静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは乳腺内の経
路での注射にはリポソーム組成物の無菌溶液が製造され
る。静脈用には、溶質の総濃度はこの製剤を等張性にす
るよう調整されるべきである。
それらの使用の他の例においては、小胞体に取り込ま
れた化合物はゲル、油、エマルジョン等があるがそれら
に限定されることはない普通の投与形態の広い範囲に取
り込まれることができる。例えば、取り込まれた化合物
を含有する懸濁液をリポソーム製剤における成分とし
て、その水性相に添加することができる。このような製
剤は、普通のクリーム、ペースト、軟こう、ゲル、ロー
ション等直接の適用のためのものとして投与されること
ができる。
実施例1 卵黄からの製造 部分的に融解した卵黄(7.3キログラム)を各回9
の無水エタノールで2回抽出した。このろ液は貯められ
(総容量16.7リットル)そしてろ別固形物はヘキサン−
エタノール溶液で38℃において更に3回抽出されたが、
ヘキサン−エタノール溶液は第1回のものは3リットル
のエタノールと4リットルのヘキサンから、第2回のも
のは2リットルのエタノールおよび4リットルのヘキサ
ンから、そして最後のものは1.5リットルのエタノール
および3.5リットルのヘキサンからなっている。このヘ
キサン−エタノール卵抽出物は貯められ(16.7リット
ル)そしてこのヘキサンは水銀100ミリメーターの真空
で40℃で回転蒸発器中で蒸発させられた。残りのエタノ
ール性卵抽出物は最初の2つの貯められた抽出物(総量
18リットル)水性エタノールと共に貯められ、そして得
られた混合物は2日間放置して落ち着かせた。中性脂
肪、トリグリセライド、コレステロールおよびいくつか
のオレンジ色染料が溶液から溶かし出され、分離され
た。上清のエタノール−水(16.3リットル)は、その比
率を約2.5:1エタノール:水とするために、2リットル
のヘキサンおよび3リットルの水で抽出した。この抽出
された溶媒混合物は振とうし、次いでこのエタノール水
相が澄むまで分離するために放置された。このヘキサン
相は除去されて取っておかれ、水性エタノール相は更に
2回、各回2リットルのヘキサンと1リットルの水で再
抽出した。この3つのヘキサン抽出物は貯めておくが、
次いで溶液容量に対し20重量%のリン脂質が得られるま
でヘキサンを蒸発させた。この20%溶液は70%のリン脂
質および30%の中性脂肪から成っていた。4の20%溶
液(即ち、800gのリン脂質)が得られた。
リン脂質の20%ヘキサン溶液650mlを、60オングスト
ロームの複数の孔をもち25−40ミクロンの大きさのシリ
カ490gを入れたシリカゲルカラム(YMC−GEL,SIL60,350
/500メッシュ、山村ケミカルラボラトリー,日本)(5c
m×50cm)上に負荷した。中性の脂肪およびホスファチ
ジルエタノールアミンが、容量でヘキサン:エタノー
ル:水60:130:6からなる溶媒5リットルを毎分60mlで押
出して流出された。このものが最初の分画として採取さ
れる。目的とする生成物は毎分80mlで押出されるヘキサ
ン:エタノール:水60:130:12v/v/vからなる溶媒B18
で溶出された。AおよびB溶媒の間の流出物が5×400m
lの分画中に取られる。この残っているものが目的とす
る生成物として採取される。全ての分画がTLCによって
分析され、それらはホスファチジルエタノールアミンと
明確に判断され、この場合、400mlの分画の最後の3つ
および大容量の最後の分画が貯められ、そして、エタノ
ール対水の比を2.5:1とするために3リットルの水が添
加された。ヘキサン相はエタノール−水相から除去さ
れ、保存された。このエタノール−水相は、2リットル
のヘキサン2および3リットルの水の各々の組合わせ
で、更に2回抽出された。一緒にされたヘキサン抽出物
は貯められ、そして10%溶液となるまで蒸発された。収
量:65gの約97%(205nmでのUVでは98%)と同等もしく
はそれより大の純粋なホスファチジルコリン、3%(20
5nmでのUVでは1.9%)と同等もしくはそれより小で、少
なくとも約0.5%のスフィンゴミエリン、約0.5%(205n
mでのUVでは0.2%)と同等、もしくはそれより小のリソ
ホスファチジルコリンを有し、ホスファチジルエタノー
ルアミンやコレステロールもしくは他の中性脂肪を含ま
ないものが得られた。
実施例2 80%ホスファチジルコリンからの製剤 少なくとも80%のホスファチジルコリン(リポイドK
G)を有する市販のリン脂質を使用する製造は、3つの
ヘキサン抽出物を貯め、そして20%重量対容量溶液が得
られるまでヘキサンを蒸発させる点に関して実施例1の
方法を使用した。70%のリン脂質と30%の中性脂肪から
なる20%の溶液の代りに80%のホスファチジルコリン化
合物(このバッチでは81.2%)が用いられた。
ヘキサン中の80%ホスファチジルコリンの20%溶液5,
000mlが、60オングストロームの複数の孔を有し、大き
さ20ミクロンのシリカ(セパレーションズ テクノロジ
ー インコーポレーテッド,ウェイクフィールドR.I.)
を充填したシルカゲルカラム(4インチ×48インチ)に
負荷された。中性脂肪およぴホスファチジルエタノール
アミンが、毎分350mlで押出される容量比でヘキサン:
エタノール:水60:130:6からなる溶媒30で溶出され
た。このものが第一の分画として採取される。目的とす
る生成物は、毎分350mlで押し出される容量比でヘキサ
ン:エタノール:水60:130:12からなる溶媒B120で溶
出された。続いて4の分画が分析のために集められ
た。全ての分画がTLCによって分析され、これらは、ホ
スファチジルエタノールアミンであることが明確に判断
されたが、この場合最後の96が明確なものであった。
その一部の16が22の分離ロートに入れられ、エタノ
ール対水の比を2.5:1(v/v)とするために4の水が加
えられた。このヘキサ相は、エタノール−水相から除去
して保存した。このエタノール−水相は4リットルのヘ
キサンで、もう1回抽出した。一緒にされたヘキサン抽
出物は貯められて、そして乾燥するまで蒸発させた。収
量:195gの約97%(205nmでのUVでは98%)と同等よりも
しくはそれより大の純粋なホスファチジルコリン、約3
%(205nmでのUVでは1.9%)と同等もしくはそれより小
で少なくとも約0.5%のスフィンゴミエリンおよび約0.5
%(205nmでのUVでは0.2%)と同等もしくはそれより少
のリソホスファチジルコリンを有し、ホスファチジルエ
タノールアミン、コレステロールもしくは他の中性脂肪
は有さないものが得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 前置審査 (72)発明者 サッディス,ロバート,エル アメリカ合衆国 ニュージャージィ州 08961 ロビンスヴィレ,ダーヴェル ドライブ 8 (72)発明者 キールンス,ジョーン,ジェー アメリカ合衆国 ニュージャージィ州 08540 プリンストン,ジョクルス ド ライブ 2

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】97重量%以上のホスファチジルコリンおよ
    び3重量%から1.5重量%(205nmUV吸収)のスフィンゴ
    ミエリンを含有し、実質的にリソホスファチジルコリン
    の存在しない、製薬生成物品質を有する脂質組成物。
  2. 【請求項2】97重量%以上のホスファチジルコリンおよ
    び3重量%から1.5重量%(205nmUV吸収)のスフィンゴ
    ミエリンを含有し、実質的にリソホスファチジルコリン
    の存在しない製薬生成物品質の脂質組成物を含有するリ
    ポソーム。
  3. 【請求項3】97重量%以上のホスファチジルコリンおよ
    び3重量%から1.5重量%(205nmUV吸収)のスフィンゴ
    ミエリンを含有し、実質的にリソホスファチジルコリン
    の存在しない製薬生成物品質の脂質組成物、 および 少なくとも1つの生物活性剤を含有するリポソーム。
  4. 【請求項4】97重量%以上のホスファチジルコリンおよ
    び3重量%から1.5重量%(205nmUV吸収により測定され
    た)のスフィンゴミエリンを含有し、実質的にリソホス
    ファチジルコリンの存在しない製薬生成物品質の脂質組
    成物、 および ステロールを含有するリポソーム。
  5. 【請求項5】97重量%以上のホスファチジルコリンおよ
    び3重量%から1.5重量%(205nmUV吸収)のスフィンゴ
    ミエリンを含有し、実質的にリソホスファチジルコリン
    の存在しない製薬生成物品質の脂質組成物、少なくとも
    1つの生物活性剤、および ステロールを含有するリポソーム。
  6. 【請求項6】97重量%以上のホスファチジルコリンおよ
    び3重量%から1.5重量%(205nmUV吸収)のスフィンゴ
    ミエリンを含有し、実質的にリソホスファチジルコリン
    の存在しない組成物を、液体クロマトグラフシリカカラ
    ムを用い、ヘキサン−エタノール−水混合物勾配で溶
    出、単離する工程を包含する、上記製薬生成物品質の脂
    質組成物の製造法。
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