JP2513635B2

JP2513635B2 - 鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリンギエンシス毒素遺伝子のクロ−ン化及び発現

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Publication number: JP2513635B2
Application number: JP61190672A
Authority: JP
Inventors: ヘルンシュタットコリンナ; ウィルコックスエドワード
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1985-08-16
Filing date: 1986-08-15
Publication date: 1996-07-03
Anticipated expiration: 2011-07-03
Also published as: JPH08103281A; US4771131A; JPH08103282A; JPS6251981A; EP0213818A1; EP0213818B1; JP2860319B2; JP2846608B2; JP2846607B2; DE3677431D1; JPH08104699A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は鞘翅目の甲虫に有毒なバシラス・スリンギエ
ンシス毒素遺伝子のクローン化及び発現に関する。

［先行技術及び問題点］胞子形成微生物のバシラス・スリンギエンシス（Baci
llus thuringiensis,Bt）は、最もよく知られた昆虫毒
素をつくる。この毒素は、δ−エンドトキシンと指定さ
れた蛋白質である。これはBtの胞子形成細胞によって合
成される。感受性のある昆虫の幼虫が毒素の結晶型を摂
取すると、毒素は昆虫の腸液プロテアーゼにより生物学
的活性のある部分に転化される。主要標的は昆虫の腸上
皮細胞であって、これが急激に破壊される。Bt毒素の活
性は非常に高く、感受性のある幼虫を殺すのにナノグラ
ム単位の量しか必要でないことが経験からわかってい
る。

Btの報告された活性範囲は、農林業で大きな問題とな
っている昆虫である鱗翅類（Lepidoputera）の範囲内の
昆虫種を包含する。活性範囲はまた双し類（Diptera）
の昆虫を包含する。これには蚊とブヨ（blackfly）の幾
つかの種が含まれる。コーチ・ティー・エル（Couch,T.
L.）（1980年）「バシラス・スリンギエンシス・バラエ
ティ・イスラエレンシスの蚊病源性」Developments in
lndustrial Microbiology 22巻61-67頁；ビーグル・シ
ー・シー（Beegle,C.C.）（1978年）「農業生態系にお
ける昆虫性細菌の利用」Developments in lndustrial M
icrobiology 20巻97-104頁を参照のこと。

クリーグ（Kreig）ら（Z.ang.Ent.（1983年）96巻500
−508頁）はバシラス・スリンギエンシス・バラエティ
・テネブリオニス（B.thringiensisvar.tenebrionis）
と名付けられたBt分離体について記述しているが、これ
は鞘翅目の２種類の甲虫に対して活性があると言われて
いる。これらはコロラド・ポテト・ビートルのレプチノ
タルサ・デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineat
a）とアゲラスチカ・アルニ（Agelastica alni）であ
る。このような活性をもつと報告された既知のBt分離体
はこれだけである。すでに確認されたBt菌株はすべて、
いも虫（鱗翅類）やハエの幼虫（双翅類）に対して活性
をもつものであった。

クリーグらのBt分離体は、本発明の新規なBt遺伝子源
として使用されるBt分離体との並行比較のため入手でき
ない。従って、クリーグらのBt分離体が公衆の手に入ら
ない以上、クリーグらの公告は合衆国法の下で法的に有
効な特許法の参照ではない。

［問題点を解決する手段］鞘翅目の甲虫に有毒な毒素遺伝子のクローン化及び発
現が明らかにされ、特許請求されている。クローン化さ
れた遺伝子でつくられる毒素は、鞘翅目の甲虫に対して
活性があるが、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia n
i）、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigu
a）、又はネッタイシマ蚊（Aedes aegypti）に対しては
活性がない。鞘翅目に含まれるものとして、農業上大き
な損害をもたらす種々のディアブロティカ（Diabrotic
a）種（ハムシ科 Chrysomelidae）がある。例えば、デ
ィー・ウンデシムプンクタータ（D.undecimpunctata）
（西部班点ウリハムシ）、ディー・ロンギコーニス（D.
longicornis）（ノーザン・コーン・ルートワーム）、
ディー・バージテラ（D.virgitera）（ウエスタン・コ
ーン・ルートワーム）、及びディー・ウンデシムプンク
タータ・ハワーディ（D.undecimpunctata howardi）
（サザン・コーン・ルートワーム）がある。

「M-7」で指定される本発明の毒素遺伝子給源として
使用されるバシラス・スリンギエンシス分離体は、独特
のパラ胞子体（結晶）をもつ点で異例である。これは位
相差顕微鏡下に外観が暗色で、平らな角型の外形を呈す
る。

現在バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ
（B.t.sd）として知られるバシラス・スリンギエンシス
Ｍ−７の二次培養基は、1985年２月27日、合衆国イリノ
イ州ピオリア、合衆国農務省、北部研究所の永久保存施
設に寄託された。培養基は、保存施設からNRRL B-15939
の寄託番号を指定された。この寄託物は、これを開示し
た特許の授与により一般に入手できる。寄託物はまた、
本出願又はその後代の対応出願がなされている国の外国
特許法での要求に応じて入手できる。しかし、寄託物が
入手できるからといって、政府決定によって授与される
特許権を侵害してまで、本発明の実施権を構成するもの
ではないことを了解されたい。

バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL
B-15939はこの技術の標準的な培地及び醗酵手法を使用
して培養できる。醗酵周期の完了後、この技術に周知の
手段により、まずBt胞子と結晶を醗酵液から分離するこ
とによって、細菌を収穫できる。細胞からのDNA（染色
体とプラスミド）を標準手順によって単離し、この技術
で周知の手順によって精製できる。例えば、このような
標準手順はマニアティス（Maniatis）ら、分子クローン
化（1982年）、コールドスプリングハーバー研究所、に
明らかにされている。

精製DNAを次に適当な制限エンドヌクレアーゼで消化
させることができる。

次にB.t.sd DNAのジーンバンクを構築することができ
る。本発明では、上記のように得られる精製B.t.sd DNA
を制限エンドヌクレアーゼBamHlで消化させ、周知の入
手できるプラスミドpBR322のBamHl位置へクローン化し
た。

B.t.sdのDNAのジーンバンクが構築されたら、次にこ
のジーンバンクを選別するためにDNAプローブを構築す
る必要がある。この臨床的DNAプローブの構築は、B.t.s
d培養基からM-7毒素結晶を単離することによって開始さ
れた。

回収されたM-7毒素結晶を標準手順によって精製し、
次にトリプシンで消化させるとペプチド断片がつくられ
る。これらのトリプシン性の断片の幾つかのもののアミ
ノ酸配列は標準手順によって決定された。続いて、ある
配列の選択後、プローブを既知手段により化学的に合成
した。生ずるプローブに標識を付け、この技術で知られ
た手順によって交雑（ハイブリダイゼーション）させ
た。その結果、陽性クローン、すなわち構築されたプロ
ーブへ交雑したものが検出された。

陽性クローンの代表を、標準手順によって開発された
うさぎの抗Ｍ−７結晶抗血清を使用してウエスタン・ブ
ロットにかけた。M-7毒素のクローン化と発現は、陽性
クローン及びM-7毒素結晶に対する抗体で陽性反応が見
られた時に、成功の確認が得られた。

代表的な陽性クローンから単離された組替えプラスミ
ドは、BamHl位置へ挿入された5.8kb DNA断片をもつこと
がわかった。この5.8kb DNA断片は、BamHlによって代表
的陽性クローン（pCH-B3）から切断、精製され、次に既
知の入手できるプラスミドpRO1614のBamHl位置へ二次ク
ローン化された（J.Bact.［1982年］150巻60頁；合衆国
特許第4,374,200号）。プラスミドpRO1614は、下記の住
所の北部研究所から入手でき、この寄託番号はNRRL B-1
2127である。プラスミドはpBR322から誘導され、特異な
HindIII、BamHl、SalI、及びPvuII制限位置をもつ。Pst
I挿入物はカルベニシリン抵抗遺伝子と緑膿菌（P.aerug
inosa）複製係を包含している。シュードモナス・フル
オレッセンスはこの構築されたシャトルベクターによっ
て形質転換され、M-7毒素の発現はウエスタン・ブロッ
トでの確認により証明された。

プラスミドpCH-B3、又は5.8kbの断片挿入物をもつプ
ラスミドpRO1614は、周知の手順、例えば透明溶菌液−
密度勾配平衡手順を使用して、細菌宿主から回収でき
る。所望によりBam-Hlでの消化により、5.8kb断片をpRO
1614から切り取り、別の宿主への形質転換のため異なる
ベクターヘクローン化できる。これらの手順はいずれも
当業者に周知である。

大腸菌宿主中のプラスミドpCH-B3は、61604イリノイ
州ピオリア、北部研究センター、培養基保存研究／醗酵
研究所、ARS特許保存実施例に寄託された。寄託物は、
同施設の手で少なくとも30年間、永久保存施設内に保存
される。寄託は1985年７月18日に行なわれ、NRRL B-159
81の寄託番号を付された。二次培養基は、寄託物を明ら
かにした特許の授与により、一般に入手できる。寄託物
はまた、本出願又はその後代の対応出願がなされている
国の外国特許法での要求に応じて入手できる。しかし、
寄託物が入手できるからといって、政府決定によって授
与される特許権を侵害してまで、本発明の実施権を構成
するものではないことを了解されたい。

本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物宿主中に導入
できる。毒素遺伝子（M-7）の発現の結果、直接又は間
接的に殺虫剤が細胞内に生産され、維持される。適当な
宿主、例えばシュードモナスの場合、鞘翅目の甲虫が生
息する場所に微生物を施用すると、これは増殖し、感受
性のある甲虫に摂取される。その結果、望んでいない甲
虫が防除される。その代りに、毒素M-7遺伝子の宿主と
なった微生物を、細胞内につくられる毒素の活性を持続
させるような条件下に処理できる。次に処理細胞を目標
害虫の環境に施用できる。生ずる生成物は、M-7毒素の
毒性を保持している。

M-7毒素遺伝子を適当なベクター経由で微生物宿主に
導入し、宿主を生きた状態で環境に施用する場合、ある
宿主微生物を使用することが必須である。選択されるの
は、対象となる一つ以上の作物の「植物領域」（＝フィ
トスフェア）（葉面＝フィロプレイン、葉周辺＝フィロ
スフェア、根周辺＝リゾスフェア、及び／又は根表面＝
リゾプレイン）を占めることがわかっている微生物宿主
である。これらの微生物は、特定環境（作物と他の昆虫
の生息環境）で野性型微生物と順調に競合でき、ポリペ
プチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定な維持と発現をも
たらし、また望ましくは環境上の劣化や不活性化からの
殺虫剤の改良された保護を提供するようなものが選択さ
れる。

広範囲の重要作物の葉面や根周辺に生息する微生物
は、多数知られている。これらの微生物は細菌、藻類、
及びカビを包含する。特に興味ある微生物は次のような
ものである。細菌では、属名でシュードモナス（Pseudo
monas）、エルウィニア（Erwinia）、セラティア（Serr
atia）、キサントモナス（Xanthomonas）、ストレプト
ミセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、
ロードシュードモナス（Rhodopseudomonas）、アグロバ
クテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Aceto
bacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アース
ロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotob
acter）リューコノストック（Leuconostoc）、及びアル
カリゲネス（Alcaligenes）。カビ、特に酵母では、属
名でサッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッ
カス（Cryptococcus）、クルイベロミセス（Kluyveromy
ces）、スポロボロミセス（Sporoboromyces）、ロード
トルラ（Rhodotorula）、及びアウレオバシジウム（Aur
eobasidium）。特に興味あるのは、次のような植物領域
細菌種である。シュードモナス・シリンガエ（Pseudomo
nas syringae）、シュードモナス・フルオレッセンス
（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセン
ス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリ
ヌム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロ
ードシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomon
as spheroides）、キサントモナス・カンベストリス（X
anthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhi
zobium melioti）、アルカリゲネス・エントロフス（Al
caligenes entrophus）、及びアゾトバクター・ヴィン
ランジイ（Azotobacter vinlandii）。また、興味ある
植物領域の酵母種は次のものである。ロードトルラ・ル
ブラ（Rhodotorula rubra）、R.グルチニス（R.glutini
s）、R.マリナ（R.marina）、R.アウランチアカ（R.aur
antiaca）、クリプトコッカス・アルビヅス（Cryptococ
cus albidus）、C.ジフルエンス（C.diffluens）、C.ラ
ウレンチイ（C.laurenii）、サッカロミセス・ロゼイ
（Saccharomyces rosei）、S.プレトリエンシス（S.pre
toriensis）、S.セレヴィシアエ（S.cerevisiae）、ス
ポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseu
s）、S.オドルス（S.odorus）、クルイヴェロミセス・
ヴェロナエ（Kluyveromyces veronae）、及びアウレオ
バシジウム・ボルランス（Aureobasidium pollulan
s）。有色素微生物が特に興味がある。

遺伝子の安定な維持と表現を可能にするような条件下
に、毒素を表現するM-7遺伝子を微生物宿主中に導入す
るには、多様な方法が広く利用できる。例えば、毒素遺
伝子の表現のため転写及び翻訳の調節信号を包含するDN
A構築物を提供できる。また、組み込みが起こるよう
に、調節制御下の毒素遺伝子と、宿主生物中の配列と相
同なDNA配列とを提供できる。及び／又は、組み込み又
は安定な維持が起こるように、宿主中で機能的な複製系
を提供できる。

転写開始信号はプロモーターと転写開始スタート位置
を包含する。ある場合には、毒素の調節的な発現を提供
するのが望ましい。その場合、毒素の発現は環境への放
出後にのみ生ずることになる。これはオペレーターで、
又は微生物の物理的ないし化学的環境の変化により誘導
可能なアクチベーターやエンハンサーへの領域結合で達
成できる。例えば、感温性調節領域を使用すると、生物
は毒素の発現なしに実験室で生育できるが、環境への放
出により発現が始まる。他の手法は毒素の発現を抑制す
るような特定的な栄養倍地を実験室で使用し、環境中の
栄養倍地で毒素の発現が可能になる。翻訳開始には、リ
ボゾームの結合位置と翻訳開始コドンが存在する。

伝令の表現を強化するには活性オプロモーターを使用
するか、又は伝令RNAの安定性を強化するような配列を
使用するなど、種々の操作を利用できる。イニシエーシ
ョン領域と翻訳終了領域は、停止コードン、ターミネー
ター領域、及び任意付加的にポリアデニル化信号を包含
する。

転写方向、すなわちコーディングないしセンス配列の
５′から３′への方向で、構築物は転写調節域があれば
これと、調節域がプロモーターの５′又は３′のいずれ
かでありうる場合はプロモーター、リボゾーム結合位
置、イニシエーションコドン、イニシエーションコドン
と同フェイズのオープンリーディングフレームをもつ構
造遺伝子、停止コドン、もしあればポリアデニル化信号
配列、及びターミネーション領域を包含する。２本鎖と
してのこの配列は、それ自体、微生物宿主の形質転換の
ために使用できるが、通常は、マーカーに関係するDNA
配列に含まれており、その場合第二のDNA配列は毒素発
現構築物に加わるか、又はDNAの宿主への導入中に、別
個のDNA断片として毒素発現構築物と一緒にできる。

マーカーとは、変更又は形質転換された宿主の選択に
用いる構造遺伝子のことである。マーカーは、通常、選
択的な利点を提供するもので、例えば、抗生物質や重金
属抵抗性などの殺生物抵抗性、栄養要求宿主に原栄養性
を与えるような相補正などを提供する。変更宿主が選択
できるだけでなく、畑で競合できるように、相補性を使
用するのが好ましい。構築物の開発ならびに宿主変更の
ため、一つ以上のマーカーを使用できる。畑での他の野
性型微生物に対する競合的な利点を提供することによっ
て、生物を更に変更できる。例えば、金属キレート化
剤、例えば担鉄細胞を発現する遺伝子を、毒素発現用の
構造遺伝子と共に宿共に導入できる。こうして、担鉄細
胞の強化された発現により、毒素生産宿主に競合的な利
点が得られ、宿主が野性型微生物と効果的に競合し、保
護しようとする植物の環境に生態的地位を安定に占める
ことができる。

機能的な複製系が存在しない場合、構築物は宿主中の
配列と相同な、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも
約10bp、及び通常約1000bpまでの配列をも包含する。こ
うすると、正当な組替えの確率が強化されるため、遺伝
子が宿主中に組み込まれ、宿主によって安定に維持され
る。毒素遺伝子が、相補性を提供する遺伝子や競合的利
点を提供する遺伝子と近接していることが望ましい。従
って、毒素遺伝子が失われるような場合は、生ずる生物
は相補正の遺伝子や競合的利点を提供する遺伝子も失う
可能性があり、このため無傷の構築物を保持している遺
伝子と環境中で競合できなくなる。

細菌、バクテリオファージ、シアノ細菌、藻類、カビ
等のような広範囲の微生物宿主から、多数の転写調節域
が入手できる。種々の転写調節域はtrp遺伝子、lac遺伝
子、gal遺伝子、ラムダ左右プロモーター、Tacプロモー
ター、宿主中で機能的な場合、毒素遺伝子と関連した天
然に生ずるプロモーターを包含する。例として、合衆国
特許第4,332,898号、第4,342,832号、及び第4,356,270
号を参照のこと。終了域は、転写開始域と通常関連した
終了域か、又は二つの領域が宿主中で両立し機能的であ
る限り、異なる転写開始域と関連する終了域でもよい。

安定なエピゾームの維持又は組み込みを望んでいる場
合は、宿主中で機能的な複製系をもつプラスミドが使用
されよう。複製系は、染色体、宿主又は別の宿主中に通
常存在するエピソーム要素、又は宿主中で安定なウィル
スからの複製系から誘導される。プラスミドは、pBR32
2、pACYC184、RSF1010、pRO1614等多数が利用できる。
例として、オルソン（Olson）ら（1982年）J.Bacterio
l.150巻6069頁、及びバグダサリアン（Bagdasarian）
ら、（1981年）Gene 16巻237号、及び合衆国特許第4,35
6,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を参照の
こと。

M-7遺伝子は、開始域の調節制御下に置かれるよう
に、転写・翻訳開始域と転写・翻訳終了域との間に導入
できる。この構築物はプラスミド中に含まれるものであ
って、プラスミドは少なくとも一つの複製系を包含する
が、プラスミド開発中のクローン化に一つの複製系を使
用し、最終宿主中での機能化に第二の複製系が必要な場
合は、一つ以上の複製系を包含できる。更に、すでに述
べた一つ以上のマーカーが存在しうる。組み込みを望ん
でいる場合は、プラスミドが宿主ゲノムと相同の配列を
包含するのが望ましい。

形質転換体は、慣用方法に従って単離できる。通常、
選択的手法を使用し、望んでいる生物を未変更生物から
選び出し、存在していれば、これを移し替える。次に形
質転換体の殺虫活性を試験できる。

好ましい宿主、特に植物領域（フィトスフェア）中の
ものは、宿主中で毒素の環境的安定性を強めるようなあ
る特性をもっていよう。保護的性質は、低水準の蛋白分
解的劣化、厚い細胞壁、色素保有等を包含する。宿主向
けに興味ある他の性質は、葉親和性、対哺乳類毒性の欠
如、摂取害虫への誘引力、取扱いと保存の容易さ、畑で
の増殖速度、競合性等を包含する。

畑施用においては、形質転換体菌株は、害虫から保護
しようとする植物の根周辺や葉面のような、害虫の自然
な生息環境に施用されよう。形質転換体菌株は、M-7毒
素を生産しつつ、その自然な生息環境中で生育し、M-7
毒素は幼虫又は成虫に吸収及び／又は摂取されるか、卵
に有毒な効果をもつであろう。微生物の持続性が植生の
長期保護をもたらすが、時どき投与を繰り返す必要がか
もしれない。生物は、噴霧、浸漬、地中への注入、種子
被覆、苗木被覆又は噴霧等によって施用できる。畑への
投与の場合、生物濃度は、一般にml当り細胞数で10⁶な
いし10¹⁰個、ヘクタール当り施用容量は一般に約0.1オ
ンスないし2lb以上であろう。植物部分に投与される場
合、生物濃度は通常、cm²当り細胞数で10³ないし16⁶個
であろう。

目標害虫の環境に死菌を施用する時に細胞中の毒素の
活性を持続させるために殺虫剤含有細胞を処理する場合
は、適当な宿主細胞は原核細胞又は真核細胞のいずれか
を包含するが、通常、哺乳類のような高等生物に有毒な
物質を生産しないものに限定される。しかし、毒素が不
安定であったり、施用水準が哺乳類宿主への毒性の可能
性を避けられるほど十分に低い場合は、高等生物に有毒
な物質をつくる生物も使用できる。宿主として、特に興
味あるものは、原核生物と、カビのような低級真核生物
である。グラム陰性及びグラム陽性双方の原核生物の例
はエシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwin
ia）、シゲラ（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）
及びプロテウス（Proteus）のような腸内細菌科（Enter
obacteriaceae）；バシラス科（Bacillaceae）；リゾビ
ウム（Rhizobium）のようなリゾビウム科（Rhizobiacea
e）；発光細菌（photobacterium）、ザイモモナス（Zym
omonas）、セラチア（Serratia）、アエロモナス（Aero
monas）、ビブリオ（Vibrio）、デスルホビブリオ（Des
ulfovibrio）、スピリルム（Spirillum）のようならせ
ん菌科（Spirillaceae）；乳酸から菌科（Lactobacilla
ceae）；シュードモナス（Pseudomonas）やアセトバク
ター（Acetovacter）ようなシュードモナス科（Pseudom
onadaceae）；アゾトバクター科（Azotobacteracea
e）、及びニトロバクター科（Nitrobacteraceae）であ
る。真核生物ではサッカロミセス（Saccharomyces）と
シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）のような
酵母を含めた、藻菌類（Phycomycetes）と子嚢菌類（As
comycetes）のようなカビ類（fungi）；及びロードトル
ラ（Rhodotorula）、アウレオバシジウム（Aureobasidi
um）、スポロボロミセス（Sporobolomyces）等のような
担子菌類（Basidiomycetes）酵母がある。

生産を目的として宿主細胞を選択する際に特に興味あ
る性質は、宿主へのM-7遺伝子導入の容易さ、表現系の
入手性、表現効率、宿主中における殺虫剤の安定性、及
び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプ
セル用に興味ある性質は厚い細胞壁、色素保有、及び細
胞内包装又は封入体の形成のような殺虫剤保護性；葉親
和性；対哺乳類毒性の欠如；摂取害虫への誘引力；毒素
へ損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。他の
考慮としては、処方と取り扱いの容易さ、経済性、保存
安定性等がある。

特に興味ある宿主生物は、ロードトルラ種、アウレオ
バシジウム種、サッカロミセス種、及びスポロボロミセ
ス種のような酵母；シュードモナス種、エルウィニア種
及びフラボバクテリウム種のような葉面性の生物；又は
エシエリキア種、ラクトバシラス種、バシラス種等の他
の生物を包含する。特定的な生物は緑膿菌、シュードモ
ナス・フルオレッセンス、サッカロミセス・セレビシア
エ、バシラス・スリンギエンンシス、大腸菌、枯草菌等
を包含する。

細胞は通常、無傷であり、殺菌時に胞子型よりは実質
的に増殖型にあるが、場合によっては胞子も使用でき
る。

細胞増殖を種々の方法で抑制できるが、但しその手法
が殺虫剤の性状に悪影響したり、殺虫剤を保護する際に
細胞能力を消したりしてはならない。方法としては、物
理的処理や化学的処理、細胞の物理的性状を変える、又
は細胞の物理的性質を無傷で残すなどがある。

宿主細胞を不活性化する種々の方法は、通常50℃ない
し70℃の過熱；凍結;UV照射；凍結乾燥；毒素、例えば
抗生物質；フェノール類；アニリド類、例えばカルバニ
リドとサリチルアニリド；ヒドロキシユリア；第４級
類；アルコール類；抗菌染料;EDTA及びアミジン類；ハ
ロゲン化剤、例えば塩素化剤、臭素化剤又はヨウ素化剤
のような非特異的有機及び無気化学物質；アルデヒド
類、例えばグルタルアルデヒド又はホルムアルデヒド；
オゾンやエチレンオキシドのような有毒ガス；過酸化
物；プソラレン類；乾燥剤等。これらを個々に、又は組
合わせて使用できる。薬剤の選択は特定殺虫剤、宿主細
胞の性質、架橋剤による細胞壁の固定及び保存のような
細胞構造の変更の性質などによって変わる。

細胞には、概して強化された構造的安定性があり、こ
れが畑での環境劣化抵抗性を強化している。殺虫剤がプ
ロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型か
ら成熟型への加工を抑制するように不活性化方法を選択
すべきである。例えばホルムアルデヒドは蛋白質を架橋
するから、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制でき
る。不活性化又は殺菌方法は毒素の生体利用効率又は生
物活性の少なくとも実質部分を保持する。

M-7殺虫剤遺伝子を含有する細胞宿主は、DNA構築物が
選択的利点もつ場合、任意好都合な栄養培地で生育でき
選択培地を与えるので、細胞の全部又は実質的に全部が
M-7遺伝子を保持する。次にこれらの細胞を慣用方法に
従って取り入れることができる。その代りに、取り入れ
る前の細胞を固定することもできる。

毒素を含有する宿主生物の処理方法は、幾つかの役割
を果たすものとなっている。第一に、処理は構造的一体
化を強めている。第二に、蛋白分解性の劣化に対する感
受性を減らすように毒素を変更し、かつ又は細胞中に天
然に存在するプロテアーゼの蛋白分解活性を低下させる
ことによって、処理は毒素の強化された蛋白分解安定性
を提供できる。細胞を無傷の段階で変更するのが好まし
く、また毒素蛋白質の実質的な蓄積があった時も変更す
るのが好ましい。これらの変更は、広範囲の化学的反応
性をもつ化学試薬を使用するなど、種々の方法で達成で
きる。約−10ないし60℃の範囲の温度で、かきまぜを加
えて、又は加えずに、化学試薬を含有する液体試薬媒体
と無傷の細胞を一緒にする。反応時間は経験的に決定で
き、試薬及び反応条件により大幅に変わる。細胞濃度は
約10²から10¹⁰の範囲にある。

化学試薬として特に興味あるものは、ハロゲン化剤、
特に原子番号17−80のハロゲン類である。更に詳しく
は、温和な条件下で、望んでいる結果を達成するのに十
分な時間に、ヨウ素を使用できる。他の適当な手法とし
ては、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのような
アルデヒド類での処理；塩化ゼフィランと塩化セチルピ
リジニウムのような抗感染剤；イソプロパノールとエタ
ノールのようなアルコール類；ブアン固定剤やヘリー固
定剤のような種々の組織学的固定剤［フマソン（Humaso
n）、グレッチェン・エル（Gretchen,L.）、Animal Tis
sue Techniques（動物組織技法）、ダブリュー・エッチ
・フリーマン社、1967年を、参照のこと］；又は目標害
虫環境へ細胞を施用する時に細胞中に生産される毒素の
活性を接続させる物理的処理（加熱）と化学的薬剤との
組合わせがある。

ヨウ素でのハロゲン化には、温度は一般に約０ないし
50℃の範囲にあるが、反応は室温で都合よく実施でき
る。酸性の水性媒体、特に約0.5〜5Mの範囲のカルボン
酸水溶液中における0.5ないし５％の三ヨウ素化物又は
ヨウ素を使用してヨウ素化を行なうのが好都合である。
酢酸を都合よく使用できるが、概して約1-4個の炭素原
子の他のカルボン酸も使用できる。反応時間は、一般に
１分未満から約24時間、通常約１−６時間の範囲であろ
う。ジチオナイト、チオ硫酸ナトリウムのような還元剤
や、畑での最終使用に適合した他の還元剤との反応によ
り、任意の残留ヨウ素を除去できる。更に、変更した細
胞を、当業者に周知のように、全反応媒体を除去するた
めの洗浄や、乾燥型での単離、典型的な粘着剤、展着
剤、及び農業用に一般に利用される助剤での処方といっ
た処理に、なおもかけることができる。

特に興味あるものは、細胞壁を架橋できる試薬であ
る。この目的には、幾つかの試薬が知られている。その
処理によって、殺虫剤の安定性が強化される。すなわ
ち、畑条件下に殺虫剤の持続性ないし残留活性が強化さ
れなければならい。こうして、未処理細胞の殺虫活性が
消滅するような条件下に、処理細胞の活性は１〜３倍長
い期間にわたって持続する。

細胞を種々の方法で処方できる。無機材料（フィロ珪
酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）や植物材料（とうも
ろこし芯粉末、もみ殻、くるみ殻等）のような種々の不
活性材料と混合することによって、これらを水和剤、粒
剤又は粉剤として使用できる。処方剤は、展着／粘着助
剤、安定化剤、その他の殺虫添加剤、又は表面活性剤を
包含しうる。液体処方剤は、水性基盤でも非水性でもよ
く、フォーム、ゲル、懸濁液、乳化出来る濃縮物等とし
て使用できる。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分
散剤、又は重合体を包含しうる。

殺虫剤濃度は、特定処方剤の性質、特に処方剤が濃厚
液か直接使用のものかによって大幅に変わる。殺虫剤は
少なくとも１重量％、及び100重量％でも存在しうる。
乾燥処方剤は約１−95重量％の殺虫剤をもつが、液体処
方剤は液相中に概して1-60重量％の固形分をもってい
る。概して処方剤は、mg当り約10²ないし約10⁴個の細胞
をもつ。これらの処方剤は、ヘクタール当り約50mg（液
体又は固体）ないし1kg以上の率で投与される。

処方剤を害虫環境へ、例えば植物、土壌又は水へ、噴
霧、散布、散水等によって施用できる。

以下は、最良の態様を含めた本発明の実施手順を示す
実施例である。これらの実施例は、限定的に考えられて
はならない。他に注意がなければ、百分率はすべて重
量、溶媒混合物の割合はすべて容量による。

実施例１バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL B
-15939、の培養バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴNRRL B-1
5939の二次培養基又は出発培養基を使用して、LBブロス
として知られる次の倍地に摂取できる。

トリプトン 10 g 酵母エキス 5 g NaCl 5 g 5N NaOH 0.6ml 水 1000 ml 標準的な微生物学的手法などによって、上の培地を接
種前に減菌し、無菌手順を用いて接種を行なう。M-7細
胞を30℃で3-4日生育させる。

詳細な手順は以下のとおりである。

無菌のPWYE培地（水１リットル中ペプトン5.0％、酵
母エキス0.1％、NaCl 0.5％、pH 7.5に調整）を含有す
る一連の150ml三角フラスコに、バシラス・スリンギエ
ンシス菌株サンディエゴ、NRRL B-15939をペトリ皿培養
基から接種する。フラスコを回転振とう機（200rpm）
上、30℃で一夜培養する。この出発培養基から、その7.
5mlを用いて２リットルフラスコ中のLBブロス300mlに接
種する。LBブロスのフラスコを出発培養基と同じ条件下
に培養するが、４日後に取り入れる。

上の手順は、この技術で周知の手順により、大醗酵容
器まで容易に規模拡大できる。

上の醗酵で得られるBt胞子及び結晶を、この技術で周
知の手順により単離できる。しばしば使用される手順
は、取り入れた醗酵液を分離手法、例えば遠心分離にか
けることである。

実施例２ M-7毒素遺伝子のクローン化及び発現全体のDNA（染色体DNAとプラスミド）を実施例１のM-
7細胞から単離し、標準手順によって精製した。生ずる
精製DNAを、供給者の指示を用いて制限エンドヌクレア
ーゼBamHlで消化された。消化されたDNAを周知のプラス
ミドpBR322のBamHl位置にクローン化すると、M-7 DNAの
ジーンバンクが得られた。このクローン化手順を、周知
の標準的な手順に従って行なった。

ジーンバンクを選別するためのDNAプローブは、次の
ように得られた。NYSM培地（トリプトン10g、NaCl 5g、
酵母エキス5g、MgSO₄.7H₂O 2g、水1000ml、pH7.5）中30
℃で一夜生育させた培養基から、M-7結晶を単離した。
精製した結晶を8M尿素、0.1Mグリシン、pH8.2に溶解
し、室温で一夜、トリプシンで消化させた。生ずるペプ
チド断片をC₄逆相多孔カラム上で、アセトニトリル中0.
1％トリフルオロ酢酸中の91％溶液Ａ（0.1％トリフルオ
ロ酢酸水溶液）から40％溶液Ａまでの180分勾配によっ
て分離した。幾つかのトリプシン断片のアミノ酸配列が
得られ、32の重剰性もつ長さ17塩基の混合プローブの合
成に６アミノ酸の配列を選んだ。

ポリヌクレオチドキナーゼと［γ^-32Ｐ］ATPでプロー
ブに末端標識を付け、M-7ジーンバンク用に構築された
組替えプラスミドを含有する細菌集落に交雑させた。集
落のフィルターは、ハナハン（Hanahan）及びメルセル
ソン（Meselson）（1980年）Gene 10巻63-67頁に従って
つくられた。陽性集落は、オートラジオグラフィによっ
て確認された。七つの陽性クローン（代表としてpCH-B
3）から単離された組替えプラスミドは、BamHl位置に挿
入された5.8kb（キロ塩基対）のDNA断片をもつことがわ
かった。

pCH-B3のウェスタン・ブロット［バーネット・ダブリ
ュー・エヌ（Burnatte,W.N.（［1981年［Anal.Biochem.
112巻195頁］は、うさぎ抗M-7結晶抗血清を用いて、一
夜培養基のSDS-PAGEで行なった。約86キロダルトンの蛋
白質が確認された。従って、クローンpCH-B3は、M-7か
らの結晶蛋白質による血清学的身元証明のある蛋白質に
対するコードをもつM-7DNA断片を含有している。組替え
蛋白質は、所定のプラスミド構築で転写及び／又は翻訳
の停止信号が入手できないため、溶解化されたM-7結晶
からの毒素より大きいこともありうる。

B.t.sd毒素遺伝子を暗号化したヌクレオチド配列を表
Ａに示す。演えき的に導かれたアミノ酸配列を表Ｂに示
す。

この技術で周知のように、蛋白質のアミノ酸配列はDN
Aのヌクレオチド配列によって決まる。遺伝暗号の重剰
性のため、すなわち蛋白質をつくるために用いられるア
ミノ酸のほとんどに対して、一つ以上の暗号化ヌクレオ
チドトリプレット（コードン）を使用できるため、ある
特定のアミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列が暗号
化できる。このため、遺伝暗号を次のように表わすこと
ができる。

フェニルアラニン（Phe） TTK ロイシン（Leu） XTY イソロイシン（lle） ATM メチオニン（Met） ATG バリン（Val） GTL セリン（Ser） QRS プロリン（Pro） CCL スレオニン（Thr） ACL アラニン（Ala） GCL チロシン（Tyr） TAK ヒスチジン（His） CAK グルタミン（Gln） CAJ アスパラギン（Asn） AAK リジン（Lys） AAJ アスパラギン酸（Asp） GAK グルタミン酸（Glu） GAJ システイン（Cys） TGK トリプトファン（Trp） TGG アルギニン（Arg） WGZ グリシン（Gly） GGL 終了信号 TAJ カギ：各３文字のデオキシヌクレオチドトリプレット
は、左に５′‐末端、右に３′‐末端をもつmRNAのトリ
ヌクレオチドに対応している。本明細書に記載のDNA配
列は、いずれもmRNAの配列に対応する配列のDNA鎖のも
のであって、但しウラシルにはチミンが置き変わる。文
字はデオキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピ
リミジン塩基を表わしている。

Ａ＝アデニンＣ＝シトシンＧ＝グアニンＴ＝チミンＹがＡ又はＧの場合、Ｘ＝Ｔ又はＣＹがＣ又はＴの場合、Ｘ＝ＣＸがＣの場合、Ｙ＝A,G,C又はＴＸがＴの場合、Ｙ＝Ａ又はＧＺがＡ又はＧの場合、Ｗ＝Ｃ又はＡＺがＣ又はＴの場合、Ｗ＝ＣＷがＣの場合、Ｚ＝A,G,C又はＴＷがＡの場合、Ｚ＝Ａ又はＧＳがA,G,C又はＴの場合、QR＝TC 但しＳがＴ又はＣの場合、QR＝AG Ｊ＝Ａ又はＧＫ＝Ｔ又はＣＬ＝A,T,C又はＧＭ＝A,C又はＴ以上は、M-7毒素又は他の有用な蛋白質の新規なアミ
ノ酸配列が、蛋白質の同じアミノ酸配列を暗号化した同
等なヌクレオチド配列によってつくられることを示す。
従って本発明は、このような同等なヌクレオチド配列を
包含している。更に、アミノ酸配列を変更しても蛋白質
の二次構造が変化しないならば、確認された構造と機能
の蛋白質をこのような変更によって構築できることがわ
かった［カイザー・イー・ティー（Kaiser,E.T.）及び
ケズディ・エフ・ジェイ（Kezdy,F.J.）［1984年］Scie
nce 223巻249-255頁］。このように本発明は、蛋白質の
二次構造を変更しないか、又は構造が変更される場合で
も生物活性が同程度に保持されるような、本明細書に記
載のアミノ酸配列の突然変異物を包含している。

実施例３クローンpCH-B3によりM-7毒素蛋白質の生産 pCH-B3培養基20リットル（アンピシリン70μg/mlを含
有するL-ブロス）を醗酵容器中で生育させ、OD600＝3.3
5で取り入れた。細胞ペレットを水洗し、リゾチーム2
g、1mM PMSF（弗化フェニルメチルスルホニル）、1mM T
PCK（1-トシルアミド‐2-フェニルエチルクロロメチル
ケトン）及びDNase 1500μｇを含有するグリシン緩衝液
（0.1Mグリシン、トリス塩基によりpH8.0）500mlに再懸
濁し、室温で30分培養した。次にpHをNaOHで10に上げ、
ビードビーター（バイオスペック・プロダクツ社、オク
ラホマ州バートルスビル）により、氷上で30秒の打撃を
５分間隔で４回与えて細胞を破裂させた。次に抽出液を
10,000×Ｇで30分遠心分離した。

実施例４クローンpCH-B3でつくられるM-7毒素蛋白質の単離及び
精製アフィニティークロマトグラフィ［クァトレカサ・ピ
ー（Cuatrecasa,P.）及びアンフィンセン・シー・ビー
（Anfinsen,C.B.）［1971年］Meth.Enzymology,22巻
［ダブリュー・ビー・ジャコビー編、アカデミックプレ
ス社、ニューヨーク］を用いて、pCH-B3からの蛋白質を
次のように精製した。クァトレカサ及びアンフィンセン
の記述のとおりに、臭化シアンでセファロースを活性化
した。活性化したセファロースにうさぎ抗M-7結晶血清
を添加し、たえずかきまぜながら室温で一夜培養した。
アフィニティー樹脂を１％エタノールアミン、3M NaC
l、pH9.2で洗い、次に0.02％ナトリウムアジドを含有す
るTBS（0.02Mトリス‐HCl、0.07M NaCl、pH7.5）で洗っ
た。1 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、1 mM PMS
F、1 mM TPCK、及び0.02％ナトリウムアジドを含有する
pH 10（トリス塩基で）の0.1Mグリシン中でカラムを平
衡化した。上のように調製した大腸菌抽出液をカラムに
装填し、４℃で64時間再循環させた。抽出液を1MNaCl及
び0.1Mグリシン‐トリス（pH 10）でカラムから洗い、
結合M-7毒素を3M過塩素酸ナトリウム、0.1Mグリシン‐
トリス（pH 10）でカラムから除去した。次にM-7毒素を
水に対して透析し濃縮した（マイクロプロD:コン、ピア
ース・ケミカル社、イリノイ州ロックフォード）。

植生を保護するため、精製されたM-7毒素を、出没す
る鞘翅目の甲虫に感受性のある植生に投与（施用）でき
る。この技術で周知の適当な被覆剤を用いて、M-7毒素
を環境的に安定化させるのが有利である。

実施例５シュードモナス・フルオレッセンスへのM-7毒素遺伝子
の二次クローン化及び発現 M-7毒素遺伝子をもつ5.8kb DNA断片をプラスミドpCH
−B3からBamHlで切り取り、精製し、プラスミドpRO1614
のBamHl位置へ二次クローン化した。シュードモナス・
フルオレッセンスをこのプラスミドで形質転換した。組
み替えシュードモナス細胞によるM-7毒素の発現は、ウ
ェスタン・ブロットでの確認によって証明された。

実施例６バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL B
-15939、の胞子及び結晶の試験上に記述されたとおりに得られるバシラス・スリンギ
エンシス菌株サンディエゴNRRL B-15939、の胞子と結晶
を種々の昆虫に対して試験した。試験された昆虫種と結
果の要約は、第１表に一覧されている。

D.ウンデシムプンタクタータ（西部班点ウリハムシ、
Western spotted cucumber beetle,WSCB）の活性につい
ての試験に使用される方法は、噴霧搭装置内でレタス葉
のディスクへ胞子／結晶懸濁液を噴霧することからな
る。（この昆虫種の幼虫はレタス葉で生育する。）層流
フード内で噴霧液を乾燥し、容器内の湿ったろ紙上に置
いた。WSCBの幼虫10匹を加え、容器を25℃、14時間の光
周期で培養した。新しく処理したディスクを必要に応じ
て加えた。食物接種の抑制が認められ、５日と７日に死
亡率を記録した。２回の生物検定の結果を第２表に示
す。

ピラルタ・ルテオラ（Pyrrhalta luteola、ニレハム
シ）に対するM-7毒素の活性を試験するために、M-7結晶
から溶解化された蛋白質をニレの葉に施用した。次に乾
燥した葉を容器内の湿った砂の上に置いた。P.ルテオラ
幼虫５〜10匹を加え、容器を室温で培養した。３日と５
日に死亡率を記録した。葉表面のcm²当り毒素120ngのLC
₅₀をこれらの検定から計算した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:39）Ｃ１２Ｒ 1:39）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次のアミノ酸配列：を有するポリペプチド毒素をコードするDNA。
【請求項２】次のアミノ酸配列：を有するポリペプチド毒素をコードするDNAを含んで成
るベクター。
【請求項３】前記DNAのための形質転換ベクターであ
る、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】NRRL B−15981として入手可能なプラスミ
ドpCH−B3である、請求項２又は３に記載のベクター。
【請求項５】前記ポリペプチド毒素のための発現ベクタ
ーである、請求項２に記載のベクター。
【請求項６】NRRL B−12127として入手可能なプラスミ
ドpRO 1614である、請求項２又は５に記載のベクター。
【請求項７】次のアミノ酸配列：を有するポリペプチド毒素をコードするDNA断片を含ん
で成るベクターが挿入された原核性微生物。
【請求項８】細菌である、請求項７に記載の原核性微生
物。
【請求項９】前記細菌が大腸菌（Escherichia coli）
である、請求項８に記載の原核性微生物。
【請求項１０】前記大腸菌がE.coli（pCH−B3）（NRRL
−Ｂ−15981）である、請求項９に記載の原核性微生
物。
【請求項１１】前記細菌がシュードモナス（Pseudomona
s）である、請求項８に記載の原核性微生物。
【請求項１２】前記シュードモナスがシュードモナス・
フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（pRO 16
14）（NRRL B−12127）である、請求項11に記載の原核
性微生物。