JP2024510044A - 長時間作用型インターロイキン－１５融合タンパク質、その調製方法およびその用途 - Google Patents

長時間作用型インターロイキン－１５融合タンパク質、その調製方法およびその用途 Download PDF

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Abstract

提供されるのは、モノマー断片Fc、IL-15受容体αスシドメイン、およびIL-15機能性断片を含む、長時間作用型のIL-15融合タンパク質である。このIL-15融合タンパク質は、Fc融合タンパク質よりも高い収率を有し、腫瘍組織中のTreg細胞の数を減少させ、腫瘍細胞を死滅させるために免疫系を効果的に活性化し、IL-15のin vivo腫瘍抑制効果を改善することができる。

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、特に、長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質、その調製方法、長時間作用型タンパク質の構築に必要な核酸、プラスミドおよび宿主細胞、対応する医薬組成物、ならびにそれらの使用に関する。
関連アプリケーションとの相互参照
本出願は、2020年12月30日に中国国家知識産権局に出願された中国特許出願第2020116429173号（発明の名称「長時間作用型インターロイキン15融合タンパク質、その調製方法およびその応用」）の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本出願に組み込まれる。
IL-15は、1994年にGrabsteinらによって発見された約12-14kDのサイトカインであり、生体の正常な免疫応答、例えばT細胞、B細胞およびNK細胞の増殖を促進するなどの機能を果たすことができる。IL-15もIL-2もIL-2ファミリーに属し、IL-2ファミリーの受容体メンバーには、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21など、すべてγc鎖が含まれている。このうち、IL-15とIL-2は共通のIL-2/IL-15Rβ（CD122）とγc受容体（CD132）を持ち、IL-15の特異的受容体はIL-15Rα（CD125）である。
IL-15のシグナル伝達は、IL-15Rα、IL-15Rβ、γcのヘテロ三量体複合体を介して起こりうる。近年、IL-15の作用機序として、IL-15とIL-15RαがAPC（単球や樹状細胞）で共発現し、IL-15Rαに結合したIL-15が隣接するNK細胞やIL-15Rβγc受容体のみを発現するCD8 T細胞にトランスプレゼンテーションされる機序が注目されている。現在、IL-15のトランスプレゼンテーションは、IL-15がin vivoでその役割を果たすための主要な作用機序であり、特に腫瘍免疫の監視において大きな役割を果たしている。IL-15Rαはスシドメインを持ち、このスシドメインはIL-15と結合することができ、結合したIL-15が生物学的機能を発揮するのに必要である。しかし、IL-15とIL-15Rαは主に樹状細胞や単球の表面に発現しており、遊離状態ではあまり発現していない。したがって、IL-15のシグナル伝達経路の活性化は、細胞間接触後に下流のシグナル伝達経路を活性化する可能性が高い。IL-15とIL-2はT細胞を活性化する機能は似ているが、Treg細胞を活性化しない。従って、IL-15は将来臨床で使用される際に副作用が少なく、IL-2の代用となる可能性がある。腫瘍免疫療法の分野におけるIL-15の有望性に鑑み、NIHは初めて腫瘍治療におけるIL-15の研究を行い、臨床研究に押し上げようとした。
しかし、天然型IL-15は分子量が小さく、in vivoでの半減期が短いため、反復投与量のコントロールが難しく、コンプライアンスが悪く、全身性の免疫副作用などの問題を引き起こしやすい。従って、IL-15のin vivo半減期を改善し、in vivoでの生物学的活性を促進または増強するアプローチが当技術分野において緊急に必要とされている。
現在、タンパク質医薬には3つの長時間作用型技術がある：PEG（ポリエチレングリコール）修飾技術、HSA（ヒト血清アルブミン）融合技術、Fc（ヒト抗体Fc領域）融合技術である。これら3つの技術にはそれぞれ弱点がある。一般に、共通の重要な欠点は、融合または修飾されたタンパク質医薬の分子量が大幅に増加することであり、融合タンパク質医薬の収率と臨床効果はしばしば著しく低下する傾向がある。長時間作用型タンパク質の分野において、本発明者らは、合成生物学を利用して、抗体IgG Fcをベースとする新規単量体Fcを革新的に開発した（CN 109705211 B; 202011161007.3）。
CN 109705211 B
本出願の主な目的は、単量体Fc（sFc）、IL-15およびIL-15受容体αスシ（ｓｕｓｈｉ）ドメインを組み込んだ長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質を構築することである。IL-15のトランスプレゼンテーションの作用機序を利用するこの融合タンパク質は、潜在的により優れた開発可能性、より長いin vivo半減期、およびより優れたin vivo抗腫瘍活性を有する。
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決手段を提供する：
第1の局面において、提供されるのは、Fcモノマー、IL-15受容体αスシドメイン、およびIL-15機能性フラグメントを含む、長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質であり、ここで、IL-15受容体αスシドメインの一方の末端は、Fcモノマーに連結され、そしてIL-15受容体αスシドメインの他方の末端は、IL-15機能性フラグメントに連結される。
上記長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の好ましい実施形態において、IL-15レセプターαスシドメインのC末端は、Fcモノマーに連結され、そしてIL-15レセプターαスシドメインは、共有結合を介してIL-15機能性フラグメントに連結される；好ましくは、Fcモノマーは、リンカーペプチドを介してIL-15レセプターαスシドメインに連結され、そしてより好ましくは、リンカーペプチドは、GGGGSまたは（GGGGS）3 である。
本発明でいう共有結合とは、化学結合の一種であり、2つ以上の原子が外側の電子を共有し、理想的な状態では電子飽和状態に達して比較的安定な化学構造を形成する。このように、隣接する複数の原子が共有する電子間に形成される強い相互作用を共有結合という。
リンカーペプチドは、可撓性アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖を指し、可撓性アミノ酸残基はGly、Ser、Ala、またはThrである。ポリペプチド鎖は、所望の活性を維持するように、2つの分子が互いに対して正しい配置を有するように連結するのに適した距離を有するべきである。この目的に適した長さとしては、少なくとも1アミノ酸残基、及び30アミノ酸残基以下が挙げられる。好ましくは、リンカーの長さは約1～30アミノ酸であり、リンカーの好ましい長さは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20アミノ酸である。さらに、リンカーペプチドに含めるために選択されたアミノ酸残基は、連結された2分子の活性に有意に影響する性質を示すべきではない。したがって、リンカーペプチドは、一般に、連結された2つの分子と矛盾する電荷を示さないか、内部フォールディングに影響を与えないか、あるいは、受容体モノマードメインの結合を著しく妨げる1つ以上のモノマー中のアミノ酸残基と結合または他の相互作用を形成しない。柔軟なアミノ酸残基を含むリンカーペプチドには、グリシン-セリンポリマー（(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、および(GGGS)nなど、ここでnは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、およびShakerカリウムチャネルの連結配列のような、当技術分野で公知の他の柔軟なリンカーペプチドが含まれる。
本発明におけるFcモノマーとは、このようなFcポリペプチドのうち、分子量が野生型Fc領域の半分程度であり、抗体Fc領域のFcRn結合性やプロテインA/G結合性を保持し、原核細胞での効率的な発現を実現できるものをいう。
上記の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の好ましい実施態様において、Fcモノマーの配列はSEQ ID NO: 1に記載のアミノ酸配列を含む。
X0は、LおよびSから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X1は、C、G、S、L、N、D、F、I、V、Y、Q、K、E、MおよびTから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X2は、L、Q、N、D、Y、R、C、G、S、F、T、I、V、A、KおよびMから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X3は、P、N、T、I、S、M、Q、R、L、G、V、A、E、D、Y、FおよびHから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X4は、K、N、S、I、M、E、Q、L、V、A、H、D、YおよびFから選択されるいずれかのアミノ酸であり；かつX5は、MおよびYから選択されるいずれかのアミノ酸である；
好ましくは、Fcモノマーの配列は、SEQ ID NO: 2に記載のアミノ酸配列をさらに含む。
本発明におけるIL-15受容体αのスシドメインとは、IL-15受容体αの細胞外ドメインが、第1のエクソン2によりコードされるシステイン残基（C1）から始まり、第4のエクソン2によりコードされるシステイン残基（C4）で終わり、C1残基とC4残基の両方がスシドメインに含まれることを意味する。1つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または付加により形成され、対応する活性を有するIL-15受容体αスシドメインのアミノ酸配列も本発明に含まれる。
上記長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の好ましい実施形態において、IL-15レセプターαスシドメインの配列は、SEQ ID NO: 3に記載されるアミノ酸配列を含み；好ましくは、IL-15機能的フラグメントの配列は、SEQ ID NO: 4に記載されるアミノ酸配列を含む。
SEQ ID NO: 1 (単量体Fcのアミノ酸配列)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTX0PPSRDELTKNQVSLX1CX2VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTX3PVLDSDGSFFLYSX4LTVDKSRWQGNVFSCSVX5HEALHNHYTQKSLSLSPGK。
SEQ ID NO: 2 (単量体Fcのアミノ酸配列)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTSPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVSCSVYHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
SEQ ID NO: 3 (IL-15RαSuのアミノ酸配列)
ITCPPPMSVEHADIWKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR。
SEQ ID NO:4（IL-15変異体のアミノ酸配列）
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
本発明におけるIL-15機能性フラグメントとは、1994年にGrabsteinらによって発見された約12～14kDのサイトカイン（J G Giri et al., EMBO J. 1994 Jun 15; 13(12)：2822-2830.)であり、T細胞、B細胞およびNK細胞の増殖を促進するなど、生体の正常な免疫応答において機能することができる。1つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、対応する活性を有するIL-15機能性フラグメントのアミノ酸配列もまた、本発明に含まれる。
本発明の第2の局面において、提供されるのは、上記の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質を構築するための方法であり、これには以下が含まれる：
(a）リンカーペプチドセグメントを介してFcモノマーをIL-15受容体αスシドメインに連結すること；
(b）IL-15機能性フラグメントを得ること；および
(c) (a)と(b)を共導入発現させるか、あるいは別々に発現させた後、in vitroでタンパク質を組み立てること。
共導入発現とは、リンカーペプチドセグメントを介して連結されたFcモノマーおよびIL-15受容体αスシドメインのインサートを有するベクターと、IL-15機能性フラグメントのベクターとを適切な比率で混合し、細胞（Expi293細胞など）をトランスフェクトし、培養、発現、精製（プロテインGによる一段階精製など）を行い、IL-15融合タンパク質を得ることをいう。
In vitroでタンパク質を組立てる方法とは、リンカーペプチドセグメントを介して連結されたFcモノマーとIL-15受容体αスシドメインのベクターとIL-15機能性フラグメントのベクターを適当な比率で別々に細胞（Expi293細胞など）にトランスフェクトし、この細胞を培養・誘導し、誘導された細胞の上清を適当な比率で混合し、精製（プロテインGによる一段階精製など）を行い、高純度の目的タンパク質を得る方法をいう。
本発明の第3の局面において、上記の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。
本発明の第4の態様では、上記の核酸分子を含むプラスミドが提供される。プロモーターおよびエンハンサーのような調節配列が作動可能に連結されている。
本発明の第5の局面において、上記プラスミドを含む宿主細胞が提供される。本発明の宿主細胞は、細菌細胞（大腸菌(Escherichia coli)およびバチルス・スブチルス(Bacillus subtilis)のような）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用することによる）、および酵母細胞または哺乳動物細胞（CHO細胞株またはBHK細胞株のような）を含むがこれらに限定されない、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。他の適切な宿主細胞は当業者に知られている。
本発明の第6の局面において、上記長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質、上記核酸分子、または上記プラスミドの有効な予防用量または治療用量、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。組成物としては、凍結乾燥剤形、水溶液剤形、リポソーム剤形、カプセル剤形などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の融合タンパク質またはその核酸分子もしくはプラスミドの濃度は、約0.1％～100％（重量％）の範囲で変動し得る。
本発明の第7の態様では、上記長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質、上記核酸分子、または上記プラスミドを含む検出キットが提供される；好ましくは、検出キットは病原体および腫瘍細胞の検出に使用される。病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫感染等が挙げられる。腫瘍細胞としては、各種良性腫瘍細胞、悪性腫瘍細胞（すなわち、癌細胞）、固形腫瘍細胞、血行性癌細胞などが挙げられる。
本発明の有益な効果は、本発明のIL-15融合タンパク質、核酸分子、プラスミドおよび医薬組成物を被験体に投与することからなる、疾患を診断、予防または治療する方法を提供することにある。
本発明に記載される疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、癌、または病原体感染症である。
好ましくは、本発明のIL-15融合タンパク質は、癌を処置するために使用され得る。本発明における癌としては、リンパ腫、胚腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺腫、黒色腫、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。上記の癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば、扁平上皮細胞がん）、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がんおよび肺扁平上皮細胞がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、胃腸がん、膵臓がん、悪性神経膠腫子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮体がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん肝臓がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆管腫瘍、頭部がん、頸部がん、骨髄間質腫瘍、破骨細胞腫瘍、多発性骨髄腫、溶骨性骨がん、中枢神経系腫瘍、脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、髄芽腫、上衣腫、網膜神経芽腫）、上咽頭がん、基底細胞がん、胆管がん、カポジ肉腫、原発性肝がんまたは子宮内膜がん、血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮腫）。
好ましくは、本発明のIL-15融合タンパク質は、病原体感染の治療に用いることができる。本発明における病原体としては、細菌、真菌、ウイルスおよび寄生虫が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のIL-15融合タンパク質によって治療され得る状態としては、具体的には以下の状態であるを挙げられるが、これらに限定されない。うっ血性心不全（CHF）、血管炎、酒さ、にきび、湿疹、心筋炎およびその他の心筋疾患、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞増殖症、骨量減少、パジェット病、廃用性骨減少症、栄養不良、歯周病、家族性脾臓貧血、ランゲルハンス細胞組織球症、 脊髄損傷、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、高コルチゾール血症、単骨性線維性異形成、多発性骨線維性異形成、歯周再建および骨折、サルコイドーシス、骨転移/骨軟化症治療および体液の悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎およびその他の脊椎関節症、移植拒絶反応、ウイルス感染、血液腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫/慢性リンパ性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性巨大B細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、リンパ形質細胞性白血病）、 リンパ球前駆細胞腫瘍、B細胞性急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、T細胞性急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、胸腺腫、成熟T細胞およびNK細胞腫瘍、末梢T細胞性白血病、成熟T細胞性白血病/T細胞リンパ腫、大顆粒リンパ球性白血病、ランゲルハンス細胞組織球症、急性骨髄性白血病の骨髄腫、成熟急性骨髄性白血病（AML）、分化型急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、 急性骨髄単球性白血病、脊髄異形成症候群、慢性骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、骨粗鬆症、肝炎、HIV、AIDS、脊椎関節炎、 関節リウマチ、炎症性腸疾患（IBD）、敗血症および敗血症性ショック、瘢痕性腸炎、乾癬、強皮症、移植片対宿主病（GVHD）、同種膵島移植片拒絶反応、多発性骨髄腫（MM）、骨髄異形成症候群（MDS）、急性骨髄性白血病（AML）などの血液悪性腫瘍、腫瘍関連炎症、末梢神経損傷、または脱髄疾患。
本発明のIL-15融合タンパク質、核酸分子、プラスミドおよび医薬組成物は、通常、治療されるべき疾患の特徴に依存して、種々の投与経路を介してヒトまたは動物被験体に投与され得る。一般に、経口投与、直腸投与、局所投与、眼内投与、胸腔内投与、脳室内投与、気管内投与、点鼻投与、経皮投与、皮下投与、髄腔内投与、筋肉内投与、腹腔投与、腹腔内投与、頭蓋内注入投与または静脈内注入投与を含む任意の医学的に許容される投与様式を使用して、本発明の方法を実施することができる。
図1は、新規な長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の構造モデル図である； 図2は、新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の還元SDS-PAGE解析とクマシーブリリアントブルーによる染色の図である； 図3は、新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析であり、分析対象物はFL115-2a（C）およびFL115-2b（D）であり、対照タンパク質はsFc（A）およびFc（b）である； 図4は、新規な長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の生物学的活性を、CTLL-2の増殖アッセイによって評価したものであり、ポジティブコントロールはIL-15とIL-15レセプターαの融合タンパク質（ポジティブコントロール）である； 図5は、新規の長時間作用型インターロイキン15融合タンパク質FL115-2aのin vivo抗腫瘍効果をマウスで示したものである； 図6は、B16F10黒色腫腫瘍を背部に皮下接種したマウスの体重に対する、本発明の新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の効果を示す； 図7は、B16F10黒色腫腫瘍を背部に皮下接種したマウスの生存率に対する、本発明の新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の効果を示す； 図8は、新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質のマウスにおける抗腫瘍効果、およびB16F10メラノーマ腫瘍を背部に皮下接種したマウスの体重に対するその効果を示す図であり、ポジティブコントロールはIL-15のFc融合タンパク質（PCと略記）、IL15 KIH（IL-15＆IL15αのFc融合タンパク質）およびWT-IL15であり、ネガティブコントロールはPBSである； 図9は、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の抗腫瘍効果を、各群5匹のマウスを用いたin vivoで示したものである； 図10に、新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の各群マウスに対する抗腫瘍効果を示す。各マウスの腫瘍重量を測定し、群間に統計学的な差があるかどうかを一元配置分散分析および統計学により分析した； 図11は、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質を投与した後、B16F10メラノーマ腫瘍を接種したマウスにおいて、フローサイトメトリーで分析した結果、in vivoのTreg細胞数が減少していることを示しており、これは特にFoxp3+CD25+の減少によって証明されている； 図12は、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質を投与した後、B16F10黒色腫腫瘍を接種したマウスにおいて、in vivoでのNK細胞数の増加、およびIFN-γとパーフォリンの分泌の増加をフローサイトメトリーで解析した結果である； 図13は、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質を投与した後、B16F10メラノーマ腫瘍を接種したマウスにおいて、in vivoでIL6が増加したことをフローサイトメトリーで解析したものである。
当業者に本願発明の解決策をよりよく理解させるために、本願発明の実施形態における技術的解決策を、実施例と合わせて明確かつ完全に以下に説明する。明らかに、説明された実施形態は、本願の実施形態の全てではなく、一部に過ぎない。本出願の実施形態に基づき、当業者によって発明努力を伴わずに得られる他のすべての実施形態は、本出願の保護範囲に含まれるものとする。
本発明をより深く理解するために、以下にいくつかの定義を示す。上記の定義は、文法的に等価なものを含むことを意図している。
融合タンパク質という言葉には2つの異なる意味がある。一つはDNA組換え技術によって得られた二つの遺伝子の組換え発現産物であり、もう一つは二つの細胞形質膜の融合を仲介するタンパク質群である。例えば、センダイウイルスの脂質二重層の外葉に含まれる二つの糖タンパク質のうちの一つであり、ウイルスのエンベロープと宿主細胞の形質膜との融合の作用を仲介する。もう一つの糖タンパク質はヘマグルチニン・セラミダーゼである。2つの異なるタンパク質は、化学的方法または遺伝子融合によって高分子を形成するために連結することができる。
IL-15は可溶性サイトカインであり、様々な免疫細胞のケモカインとして作用し、体内の炎症反応や免疫反応に関与し、調節する。その生物学的機能は、様々な細胞によって産生されるIL-2と類似している。
本明細書において、用語「モノマー」とは、ポリマーの基本構造の構造単位を提供するために重合を受けることができる分子を意味する。多数のモノマーが結合してポリマーを形成するプロセスは重合と呼ばれる。
本明細書で使用する場合、「Fc」および「Fcモノマー」という用語は、免疫グロブリンドメインの最初の定常領域以外の抗体定常領域を含むポリペプチドを包含する。したがって、Fcは、IgA、IgDおよびIgG免疫グロブリンドメインの最後の2つの定常領域、IgEおよびIgM免疫グロブリンドメインの最後の3つの定常領域、ならびにこれらのドメインのN末端を連結する柔軟なヒンジを指す。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖から構成され得る。IgGの場合、Fcは免疫グロブリンドメインCγ2とCγ3、およびCγ1とCγ2の間のヒンジから構成される。Fc領域の境界は様々であるが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むものとして定義され、その番号付け方法は、KabatのEU指数に従う。Fcは、単離された領域、または抗体、抗体フラグメント、Fc融合体のコンテクストにおける領域を指すことがある。Fcは、抗体、Fc融合体、またはFcを含むタンパク質もしくはタンパク質ドメインであってもよい。特に好ましいのはFcバリアントであり、合成生物学によって得られる非天然由来のFcバリアントである。
機能性フラグメントとは、アミノ酸とタンパク質の中間に位置する分子構造を持ち、それ自体が強い生物活性を持つ化合物の一種である。
本明細書中で使用される場合、用語「N末端」は、アミノ末端、NH2末端、N末端またはアミン末端としても知られ、タンパク質またはポリペプチドの開始末端であり、ポリペプチドの末端に位置する遊離アミン基（-NH2）を指す。C末端」という用語は、カルボキシル末端、カルボキシル基末端、C末端テール、C末端またはCOOH末端としても知られ、タンパク質またはポリペプチドの末端であり、遊離カルボキシル（-COOH）末端によって終結している。
本明細書において、「アミノ酸」という用語は、天然に存在する20種類のアミノ酸のうちの1つ、または任意の非天然類似体であって、特定の位置に位置し得るものを意味する。本明細書において「タンパク質」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を意味する。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸とペプチド結合、または「類似体」と呼ばれる合成ペプチド模倣体の構造から構成することができる。したがって、本明細書で用いる「アミノ酸」または「ペプチド残基」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸を意味する。例えば、本発明の目的のためには、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンがアミノ酸とみなされる。アミノ酸」という用語には、プロリンやヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、（R）または（S）配置であり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は（S）またはL-配置で存在する。天然に存在しない側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換は、例えば、in vivo分解を防止または遅延させるために使用され得る。
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、ホスホジエステル結合を介してヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、関連する天然に存在する構造変異体およびそれらの合成非天然に存在する類似体）から構成されるポリマーを意味する。したがって、この用語には、ヌクレオチドおよびその間の結合が、チオホスフェート、アミノホスフェート、メチルホスフェート、キラルメチルホスフェート、2'-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）などの天然に存在しない合成類似体を含むヌクレオチドポリマーが含まれるが、これらに限定されない。例えば、これらのポリヌクレオチドは、自動DNA合成機を用いて合成することができる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般に短いポリヌクレオチドを指し、通常は約50ヌクレオチド以下である。ヌクレオチド配列がDNA配列（すなわち、A、T、G、C）で表される場合、「T」が「U」に置き換えられたRNA配列（すなわち、A、U、G、C）も含まれることが理解されるべきである。
ここで、ヌクレオチド配列の説明には従来の記号が使われている。一本鎖のヌクレオチド配列の左端を5'末端、二本鎖のヌクレオチド配列の左端方向を5'方向と呼ぶ。新生RNA転写産物に5'から3'のヌクレオチドが付加される方向を転写方向と呼ぶ。mRNAと同じ塩基配列を持つDNA鎖をコード鎖と呼ぶ。
本明細書において、「コードする」という用語は、遺伝子、cDNAまたはmRNAのようなポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、規定されたヌクレオチド配列または規定されたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程による他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する固有の特性、およびそこから生じる生物学的特性を意味する。したがって、この遺伝子から産生されたmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質をもたらす場合、遺伝子はタンパク質をコードする。遺伝子またはcDNAについて、ヌクレオチド配列がmRNAと同一であり、通常配列表に記載されているコード鎖、および転写鋳型として使用される非コード鎖は、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると呼ぶことができる。特に断らない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いに縮退し、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含むこともある。
本明細書において、「プラスミド」という用語は、実験室での操作に適合するように、天然のプラスミドを基に人工的に構築されたプラスミドを意味する。核酸分子を宿主細胞に導入することにより、形質転換宿主細胞を産生することができる。ベクターは、複製起点のような宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含むことができ、また、1つ以上の選択可能マーカー遺伝子および当該技術分野で公知の他の遺伝要素を含むことができる。
本明細書において、「宿主細胞」という用語は、レシピエント細胞とも呼ばれ、形質転換および形質導入（感染）の際に外来遺伝子を受け取る宿主細胞を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、従来の薬学的に許容される担体を意味する。Remington's Pharmaceutical Sciences、EW Martin、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、第15版（1975年）には、1つ以上の治療用化合物または分子（1つ以上の抗体など）、および追加の薬剤の薬物送達に適した組成物および調製物が記載されている。
本明細書において、疾患の「診断」とは、検査後の患者の状態およびその発症の診断をいう。疾患の「予防」とは、疾患の完全な発症を抑制することをいう。治療」とは、疾患または病的状態が発症し始めた後に、その徴候または症状を改善するための治療的介入をいう。
本明細書において「投与」という用語は、被験体に物質を導入する適切な経路を選択することを意味する。例えば、選択された経路が静脈内である場合、組成物は、被験体の静脈に物質を導入することにより投与される。
本明細書において、用語「有効予防／治療量」とは、薬剤で処置された対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の薬剤の量を意味する。正確な投与量は、治療の目的によって異なり、当業者であれば周知の技術を用いて決定することができる。投与量の範囲は、0.01～100mg/kg体重またはそれ以上、例えば0.1、1、10または50mg/kg体重、好ましくは1～10mg/kgであり得る。当業者によく知られているように、抗体またはFc融合体の分解、全身的または局所的な薬物送達および新規プロテアーゼ合成速度、ならびに年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および疾患の重篤度の観点から、調節が必要な場合があり、当業者であれば通常の実験方法によって決定することができる。このような薬剤には、本明細書に記載の単量体Fcドメイン分子が含まれる。１つの非限定的な例において、これは、HIV感染を予防、治療または改善するためのHIV特異的単量体Fcドメイン（またはHIV特異的CH3ドメイン分子）の量であり得る。理想的には、治療上有効な量の抗体は、被験体において有意な細胞毒性作用を引き起こすことなく、被験体においてHIV感染に起因するような感染または疾患を予防、治療または改善するのに十分な量である。被験体を予防、改善および／または治療するための治療有効量の薬剤は、治療される被験体、病気(indisposition)のタイプおよび重症度、ならびに治療組成物の投与様式によって異なる。
本明細書において「自己免疫疾患」とは、免疫系が正常宿主のある抗原（すなわち、自己抗原）に対する免疫応答（例えば、B細胞応答またはT細胞応答）を生じ、その後組織に障害を引き起こす疾患をいう。自己抗原は宿主細胞由来であってもよいし、共生生物、例えば通常粘膜表面にコロニー形成する微生物（共生生物と呼ばれる）由来であってもよい。哺乳動物に影響を及ぼす自己免疫疾患としては、関節リウマチ、若年性小関節炎、コラーゲン誘発性関節炎、アジュバント誘発性関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病や潰瘍性大腸炎など）、自己免疫性胃萎縮症、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、1型糖尿病、非肥満性糖尿病、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血など。
本明細書において、用語「ウイルス」は、以下のウイルス科のものであるが、これらに限定されない：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）およびヒトT細胞白血病ウイルス（HTLV））；ピコルナウイルス科（例えば、ピコルナウイルス科（ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、口蹄疫ウイルスなど）；カルミクソウイルス科（胃腸炎を引き起こすウイルス株など）；トガウイルス科（馬脳炎ウイルス、風疹ウイルスなど）；フラビウイルス科（デングウイルス、黄熱ウイルスなど）、デングウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、その他の脳炎ウイルスなど）；コロナウイルス科（コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群（SARS）ウイルスなど）；ラブドウイルス科（例．ラブドウイルス科（例：小水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；パラミクソウイルス科（例：パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV））；オルソミクソウイルス科（例：インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例：ハンタウイルス、シンノンビルウイルス、ハンタウイルス、シンノンビルウイルス）、ハンタウイルス、シン・ノンブルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルスなど）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス、マチュポウイルス、ジュニンウイルスなど）；レオウイルス科（レオウイルス、オービウイルス、ロタウイルスなど）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（B型肝炎ウイルスなどヘパドナウイルス科（例えば、B型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（例えば、パルボウイルス）；パポウイルス科（例えば、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、およびBKウイルス）；アデノウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルスなどのほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（例えば、以下同様、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV-1およびHSV-2）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、およびHSV-6を含む他のヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルス）；イリドウイルス科（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）；ウイルス科（例えば、エボラウイルスおよびマールブルグウイルス）、エボラウイルス、マールブルグウイルスなど）、カリシウイルス科（ノーウォークウイルスなど）、未分類のウイルス（海綿状脳症の病原体、δ型肝炎の病原体（B型肝炎ウイルスの欠陥衛星と考えられている）、アストロウイルスなど）。
本明細書において、「細菌」という用語は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borelia burgdorferi)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、マイコバクテリア(mycobacteria)（M. tuberculosis、M. avium、M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonaeなど）、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)（A群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)（B群レンサ球菌）、連鎖球菌(Streptococcus)（Viridans群連鎖球菌）、フェカリス菌(Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス(Streptococcus)（嫌気性菌）、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性カンピロバクター(Campylobacter)、腸球菌(Enterococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、古典豚熱ウイルス、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、 エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)、バクテロイデス(Bacteroides)、クロストリジウム(Clostridium)、ストレプトマイセス・マルトフィリア(Streptomyces maltophilia)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、トレポネーマ(Treponema)、レプトスピラ(Leptospira)、アクチノミセス・イスラエリ(Actinomyces israelli)からであるが、これらに限定されない。
本明細書において「真菌」という用語は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラタム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマチディス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）、またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）からであるが、これらに限定されない。
本明細書において「寄生虫」とは、マラリア原虫またはトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）のことであるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において「癌」とは、固形腫瘍または血原性癌をいう。本発明に記載の固形腫瘍は、肉腫または癌であり、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、または他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、放射線腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、腎芽細胞腫、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱がん、または中枢神経系腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体、血管芽細胞腫、音響神経腫、乏突起膠腫、血管腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫など）である。本発明に記載の血行性癌は、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤芽球性白血病など；）および慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性顆粒球性白血病、慢性リンパ性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度型および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、骨髄異形成症である。
特に指定しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。文脈上特に明示しない限り、単数形の用語「a」、「an」、および「the」は、複数の指標を含む。核酸またはポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子量値は、近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。用語「含む（comprise）」は「含む（include）」を意味する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合は、本明細書（用語の説明を含む）が優先するものとする。さらに、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、制限的なものではない。
実施例において使用される標準的な組換えDNA技術および分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり（Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience発行）、微生物の増殖に適した材料および方法は、当該技術分野において周知である。主な化学・生化学試薬は、KAPA Biosystems、New England Biolabs、TransGen Biotech、Thermo Fisher Scientific、OMEGA bio-tekなどから購入した。
以下、本発明を具体例とともに詳細に説明する。
実施例1.新規な長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の設計と調製
設計された新規な長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質のモデル図を図1に示す。IL15Rα-GGGGS-sFc（SEQ ID NO: 5）、IL15Rα-(GGGGS)3-sFc（SEQ ID NO: 6）、IL15Rα-Fc（SEQ ID NO: 7）、およびIL15(N72D)（配列はSEQ ID NO: 4）をコードする遺伝子は、Genescript, Nanjingによって合成された。遺伝子を真核発現ベクターPTT（Thermo Fisherから購入）にクローニングした。成功裏に構築されたプラスミドを、マキシ調製に供し、そして発現のためにExpi293細胞（Thermo Fisherから購入）に一過性に共形質転換した（ここで、IL15Rα-（GGGGS）3-sFcは、FL115-2aを得るためにIL15（N72D）と共形質転換された）、IL15Rα-GGGGS-sFcをIL15（N72D）と共形質転換してFL115-2bを得、そしてIL15Rα-FcをIL15（N72D）と共形質転換してIL-15のFc融合タンパク質を得た）、そしてプロテインG樹脂（GE Healthcareから購入）を用いて精製を行った（具体的な形質転換、発現および精製方法については、以下を参照のこと：YING, Tianleiら, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2012, 287(23)：19399-19408).精製タンパク質の純度をSDS-PAGEゲルで検証した結果、タンパク質の純度は良好で、不要なバンドがなく、目的のバンドが正しいことが示された（図2参照）。
実施例2.新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の物理化学的性質
実施例1の方法に従い、新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質（FL115-2aおよびFL115-2b）を発現、精製した。また、IL-15のFc融合タンパク質も同様に設計、構築し、同様の発現系、同様の方法で発現、精製を行い、関連タンパク質を得た。精製はプロテインG樹脂を用いて行った（具体的な形質転換、発現、精製方法については、以下を参照：YING, Tianlei et al., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2012, 287(23)：19399-19408を参照）、新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の収量は最大10mg/Lであり、IL-15のFc融合タンパク質の収量1mg/Lと比較して明らかに有利であり、理論的には工業生産コストの面で大きな利点があった。さらに、上記タンパク質の均質性を確認するため、等量100ulを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に採取した。図3に示すように、新規な長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質は、自然界において均質であり、単量体の形態で存在していた。FL115-2aおよびFL115-2bは、それぞれGGGGSおよび(GGGGS)3ペプチドセグメントを介したsFcとIL15Rαとの連結を表していた。以上の結果から、新規の長時間作用型インターロイキン15融合タンパク質は、より優れた開発可能性を有することが示された。
実施例3.CTLL-2細胞株における新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の生物学的活性の評価
新規な長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の生物学的活性を評価するために、CTLL-2細胞株の増殖アッセイを用いた(Santos-Savio A. et al., Biotecn Aplic. 2000, 17:221-4)。以下に述べる手順に従い、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)(Sigmaから購入)によるミトコンドリア染色を用いた(具体的な方法については、Mossman T.J. Immunol.Methods.1983, 65(1-2):55-63を参照）を用い、これらの細胞の増殖を刺激することにより生物学的活性を測定した。96ウェル培養プレート（Costar、USAから購入）において、FL115-2a、FL115-2b、ポジティブコントロール（IL15＆IL15Rα）およびsFcの連続希釈を、10％ウシ胎児血清（FBS）（Gibcoから購入）および50μg／mLのゲンタマイシン（Sigmaから購入）を補充したRPMI培地（Gibcoから購入）の容量50μL中で、4μg／mLの濃度から開始した。CTLL-2細胞（ATCCから購入）をあらかじめRPMI培地で5回洗浄し、5×103細胞/ウェルで50μLの容量でプレートに加えた。インキュベーションは37℃、5％CO2、相対湿度98％で72時間行った。細胞生存率はMTT染色で測定した。sFcはCTLL-2細胞の増殖を誘導しなかったため、生物学的活性はなく、これは用量依存的に増殖を刺激したFL115-2a、FL115-2bおよびポジティブコントロール（IL15&IL15Rα）とは異なっていた（図4参照）。
実施例4.新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質のin vivoにおける薬力学的検証
新規の長時間作用型インターロイキン15融合タンパク質の薬力学を評価するために、6～8週齢の雌性C57BL/6マウス（江蘇GemPharmatech有限公司から購入）に5×105個のB16F10マウスメラノーマ細胞を右背部に注射した。接種後1日目と8日目に、様々な用量のFL115-2a-1、ポジティブコントロール（IL15&IL15Rα）、野生型IL15（WT-IL15）、またはネガティブコントロール（PBS）を投与した。対応するFL115-2a-2は腫瘍接種後1日おきに投与した。マウスの腫瘍サイズを指定日に測定した。実験結果は、各群5匹のマウスの平均値プラスマイナス標準偏差であった。実験データの統計的有意性は一元配置分散分析で解析し、**はp<0.01を表す。ポジティブコントロールはIL-15とIL-15受容体αの融合蛋白（ポジティブコントロール）であり、WT-IL15群とPBS群は対照であり、FL115-2a-1は1日目と8日目の投与を表し、FL115-2a-2は1日おきの投与を表す。
実験の結果、FL115-2a-1とFL115-2a-2の投与様式は、in vivoにおける新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質の抗腫瘍効果に影響を与えず、2群はネガティブコントロール群と統計学的に有意差をもって、非常に明らかな抗腫瘍効果を示した。図5に示すように、in vivoにおけるIL-15の半減期の延長が関係しているのではないかと考えられた。さらに、各群のマウスの体重を測定したところ、Fig.6に示すように、融合タンパク質の安全性は良好であり、FL115-2a-1群とFL115-2a-2群は、図7に示すように、良好な生存率を示したことを確認した。
実施例5.新規な長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質はin vivoで効率的な抗腫瘍活性を示した
新規長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質のin vivoにおける抗腫瘍効果を評価するため、上記薬力学的検証の実験デザインに従い、B16F10マウスメラノーマ細胞を6～8週齢の雌性C57BL/6マウス（江蘇省GemPharmatech社より購入）に背部皮下移植し、マウス移植腫瘍モデルを樹立した。モデル確立後、FL115-2a、PC（IL-15のFc融合タンパク質）、IL15KIH（IL-15&IL15RαのFc融合タンパク質）、WT-IL15およびネガティブコントロールPBSを1日目と8日目に尾静脈に注射し、1日おきにマウスの腫瘍サイズを測定した。図8に示すように、FL115-2aはPCと同等のin vivo腫瘍増殖抑制効果を示し、ネガティブコントロール群とは統計学的に有意な差を示した。各群のマウスの体重に影響はなく、図8に示すように、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質のマウスにおけるin vivoでの安全性が示された。さらに、各群5匹のマウスの腫瘍抑制効果をそれぞれ解析したところ、FL115-2a群のマウスの腫瘍抑制効果は一貫しており、図9に示すように、最大62％の抑制率で、抗腫瘍抑制効果は明らかであった。マウスを解剖し、各マウスの腫瘍を取り出し、腫瘍の重量を測定した。FL115-2aはin vivoで効率的な抗腫瘍活性を示すため、マウスに明らかな腫瘍抑制効果を示し、図10に示すように、大きさ、重量のいずれにおいてもネガティブコントロール群と有意差を示した。
実施例6.フローサイトメトリーによる細胞表現型の解析
麻酔後、マウスの眼窩静脈より末梢静脈血を採取し、直ちに抗凝固処理および赤血球溶解処理を行った。マウスを慈悲深く処刑した後、直ちに脾臓を取り出し、脾臓細胞を採取し、70uMナイロン篩（FALCON社より購入）で濾過し、赤血球溶解処理後、脾臓単細胞懸濁液を得た。さらに、腫瘍組織を取り出し、ピンセットで腫瘍組織の構造を静かに破壊した後、0.2mg/mlのコラゲナーゼIV（Sigma-Aldrichから購入）と0.1mg/mlのDNAse I（Sigma-Aldrichから購入）で37℃、15分間消化した。単細胞懸濁液を回収し、残りの腫瘍組織を上記の酵素溶液で25分間消化した。合わせた単細胞懸濁液を70ミクロンのナイロンメッシュで濾過した。末梢血単細胞、脾臓細胞、腫瘍細胞をフロー抗体（BD社製）で染色し、4％パラホルムアルデヒド溶液（Sigma-Aldrich社製）で固定し、暗所で保存するか、直ちにフローサイトメーター（BD社製）にロードして細胞の表現型を検出した。抗体で染色した後、フローサイトメトリー解析により、FL115-2aで処置したマウスの腫瘍組織ではTreg細胞の数が減少していることがわかり、これは図11に示すように、Foxp3+CD25+の減少によって特に証明された。さらに、NK細胞の数、IFN-γとパーフォリンの分泌が増加した。この実験結果から、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質は、Treg細胞の数とその抑制効果を減少させるだけでなく、NK細胞の腫瘍組織への浸潤能力をより大きく促進し、IFN-γとパーフォリンの分泌を有意に増加させることができることが示唆された。このことはさらに、図12に示すように、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質が、腫瘍細胞を死滅させる免疫系を効果的に活性化し、in vivoにおけるIL-15の腫瘍抑制効果を改善できることを示唆した。さらに、フローサイトメトリーでも、図13に示すように、新規の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質がIL-6の発現を増加させることが示された。
開示された実施形態に関する上記の説明により、当業者は本発明を実施または使用することができる。上記の説明は、本発明の好ましい実施形態についてのみであり、当業者は、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良および補足を行うことも可能であり、これらの改良および補足もまた、本発明の保護範囲内にあるとみなされるべきであることを指摘しておく。これらの実施形態に対する多くの修正は、当業者には明らかであり、本明細書で定義される一般原理は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態で実施することができる。したがって、本発明は、本明細書に示される実施形態によって限定されるものではなく、本明細書に開示される原理および新規な特徴と一致する最も広い範囲に適合する。

Claims (13)

  1. Fcモノマー、IL-15受容体αスシドメイン、およびIL-15機能性フラグメントを含み、IL-15受容体αスシドメインの一方の末端がFcモノマーに連結され、IL-15受容体αスシドメインの他方の末端がIL-15機能性フラグメントに連結されている、長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質。
  2. IL-15受容体αスシドメインのC末端がFcモノマーに連結され、かつIL-15受容体αスシドメインが共有結合を介してIL-15機能性フラグメントに連結されている、請求項1に記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質。
  3. Fcモノマーがリンカーペプチドを介してIL-15受容体αスシドメインに連結されており、ここでリンカーペプチドがGGGGSまたは（GGGGS）3 である、請求項2に記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質。
  4. Fcモノマーの配列がSEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1～3のいずれかに記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質であって、ここで
    X0は、LおよびSから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X1は、C、G、S、L、N、D、F、I、V、Y、Q、K、E、MおよびTから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X2は、L、Q、N、D、Y、R、C、G、S、F、T、I、V、A、KおよびMから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X3は、P、N、T、I、S、M、Q、R、L、G、V、A、E、D、Y、FおよびHから選択されるいずれかのアミノ酸であり；X4は、K、N、S、I、M、E、Q、L、V、A、H、D、YおよびFから選択されるいずれかのアミノ酸であり；かつX5は、MおよびYから選択されるいずれかのアミノ酸である。
  5. Fcモノマーの配列がSEQ ID NO: 2に記載のアミノ酸配列をさらに含む、請求項4に記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質。
  6. IL-15レセプターαスシドメインの配列がSEQ ID NO: 3に記載のアミノ酸配列を含み；かつIL-15機能性フラグメントの配列がSEQ ID NO: 4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1～5のいずれかに記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質。
  7. 請求項1～6のいずれかに記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質を構築する方法であって、以下を含む方法：
    (a）リンカーペプチドセグメントを介してFcモノマーをIL-15受容体αスシドメインに連結すること；
    (b）IL-15機能性フラグメントを得ること；および
    (c) (a)と(b)を共導入発現させるか、あるいは別々に発現させた後、in vitroでタンパク質を組み立てること。
  8. 請求項1～7のいずれかに記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質のいずれかをコードする核酸分子。
  9. 請求項8に記載の核酸分子を含むプラスミド。
  10. 請求項9に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
  11. 請求項1～6に記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質、請求項8に記載の核酸分子または請求項9に記載のプラスミドのいずれかの予防的または治療的有効量、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  12. 請求項1～6のいずれかに記載の長時間作用型インターロイキン-15融合タンパク質、請求項8に記載の核酸分子または請求項9に記載のプラスミドを含む検出キット。
  13. 請求項12に記載の検出キットであって、病原体および腫瘍細胞の検出に使用される、検出キット。
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