KR20230136607A - 지속형 인터루킨-15 융합 단백질, 이의 제조방법 및이의 응용 - Google Patents

지속형 인터루킨-15 융합 단백질, 이의 제조방법 및이의 응용 Download PDF

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KR20230136607A
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수조 포롱 바이오테크놀로지 씨오., 엘티디.
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Abstract

단량체 단편 Fc, IL-15 수용체 α "스시" 도메인 및 IL-15 기능성 단편을 포함하는 지효성 IL-15 융합 단백질이 제공된다. IL-15 융합 단백질은 Fc 융합 단백질보다 더 높은 수율을 보이고, 종양 세포내 Treg 세포의 수를 감소시킴으로써, 면역계를 효과적으로 활성화하여 종양 세포를 사멸시키킬 수 있으며, IL-15의 시험관내 종양 억제 효과를 개선할 수 있다.

Description

지효성 인터루킨-15 융합 단백질, 이의 제조 방법 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 전체 내용이 본 출원에 참고문헌으로서 첨부된 중국특허출원 제2020116429173호(2020년 12월 30일 중국국가지식재산권국에 출원; 발명의 명칭 "Long-acting interleukin-15 fusion protein, preparation method therefor and application thereof")의 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 생물공학 분야에 관한 것으로서, 구체적으로 지효성 인터루킨-15 융합 단백질, 이의 제조 방법, 이 지효성 단백질을 구성하는데 필요한 핵산, 플라스미드 및 숙주 세포, 대응 약학 조성물, 그리고 이의 용도에 관한 것이다.
IL-15는 1994년 Grabstein외 다수에 의해 발견된 것으로서, 체내 정상 면역 반응에서, 예를 들어 T 세포, B 세포 및 NK 세포의 증식을 촉진하는 것과 같은 기능을 발휘할 수 있는, 약 12 kD ~ 약 14 kD의 사이토카인이다. IL-15 및 IL-2는 둘 다 IL-2과에 속하는 것으로서, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21을 포함하여 IL-2과의 수용체 일원들은 모두 γc 사슬을 함유한다. 이것들 가운데, IL-15 및 IL-2는 공통된 IL-2/IL-15Rβ(CD122) 및 γc 수용체(CD132)를 공유하고, IL-15의 특이적인 수용체는 IL-15Rα(CD125)이다.
IL-15 신호전달은 IL-15Rα, IL-15Rβ 및 γc의 이종이량체성 복합체를 통하여 일어날 수 있다. 최근 IL-15의 작용 기작은, IL-15 및 IL-15Rα가 APC(단핵구 및 수지 세포)에 의해 공동발현되고, IL-15Rα에 결합된 IL-15가, IL-15Rβγc 수용체만을 발현하는 이웃 NK 세포 또는 CD8 T 세포에 트랜스 방식으로 제시되는 트랜스형 제시(trans-presentation)의 기작인 것으로 공지되었다. 현재 IL-15의 트랜스형 제시는, 생체내에서의 역할을 담당하는(특히 종양 면역성 감시에 있어 주된 역할을 담당하는) IL-15의 주요 작용 기작인 것으로 공지되어 있다. IL-15Rα는 IL-15에 결합할 수 있고, 이와 결합한 IL-15는 자체의 생물학적 기능을 발휘하는데 필요한 스시 도메인(Sushi domain)을 함유한다. 그러나 IL-15 및 IL-15Rα는 주로 수지 세포와 단핵구의 표면상에 발현되며, 좀처럼 유리된 상태로는 존재하지 않는다. 그러므로 IL-15 신호전달 경로의 활성화는 세포 대 세포의 접촉 이후 하류 신호전달 경로를 활성화할 가능성이 더 클 수 있다. IL-15 및 IL-2는 T 세포를 활성화하는 기능이 유사하되, Treg 세포를 활성화하지는 않는다. 그러므로 IL-15는 장래 임상용으로 사용될 때 부작용이 덜 할 것이고, IL-2의 대리물이 될 수 있다. 종양 면역요법 분야에 있어 IL-15의 전망이 좋다는 관점에서, NIH는 처음으로 종양 치료시 IL-15를 대상으로 연구를 수행하였으며, 이를 임상 연구에 돌입시키고자 노력하였다. 그러나 자연 IL-15의 분자량이 작고, 생체내 반감기가 짧음으로 말미암아, 반복된 투여와 좋지 않은 순응성을 제어함에 어려움이 있으며, 전신 면역 부작용과 같은 문제가 일어나기 쉽다. 그러므로 당 분야에서는 IL-15의 생체내 반감기를 개선하고, 이의 생체내 생물학적 활성을 촉진 또는 향상시키기 위한 연구가 시급한 실정이다.
현재 PEG(폴리에틸렌글리콜) 변형 기술, HSA(인간혈청알부민) 융합 기술 및 Fc(인간 항체의 Fc 영역) 융합 기술과 같이 단백질 약물의 효력을 장기간 지속시키기 위한 기술이 3가지 존재한다. 이와 같은 3가지 기술 모두는 자체의 약점을 가진다. 일반적으로 공통된 중요 단점은, 융합되거나 변형된 단백질 약물의 분자량은 일반적으로 증가할 것이고, 융합된 단백질 약물의 수율과 임상 효능은 종종 유의미하게 감소하는 경향이 있다는 점이다. 지효성 단백질 분야에서, 본 발명자들은 단백질 약물의 장기간 작용에 대한 월등한 대안을 제공하는 합성 생물학(CN 109705211 B; 202011161007.3)을 이용함으로써 항체 IgG Fc를 기반으로 한 신규 단량체 Fc를 혁신적으로 개발하였다.
본 발명의 주된 목적은 단량체 Fc(sFc), IL-15 및 IL-15 수용체 α 스시 도메인을 통합한 지효성 인터루킨-15 융합 단백질을 구성하는 것이다. IL-15 트랜스형 제시의 작용 기작을 이용하는 융합 단백질은 잠재적으로 더 우수한 개발가능성, 더 긴 생체내 반감기, 그리고 더 우수한 생체내 항종양 활성을 가진다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 이하의 기술적 해결책을 제공한다:
제1 측면에서, Fc 단량체, IL-15 수용체 α 스시 도메인, 그리고 IL-15 기능성 단편을 포함하는 지효성 인터루킨-15 융합 단백질이 제공되는데, 단 여기서 IL-15 수용체 α 스시 도메인의 한 쪽 말단은 Fc 단량체와 결합되어 있고, IL-15 수용체 α 스시 도메인의 나머지 한 쪽 말단은 IL-15 기능성 단편과 결합되어 있다.
상기 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 바람직한 구현예에서, IL-15 수용체 α 스시 도메인의 C 말단은 Fc 단량체와 결합되어 있고, IL-15 수용체 α 스시 도메인은 공유 결합을 통하여 IL-15 기능성 단편과 결합되어 있고; 바람직하게 Fc 단량체는 링커 펩티드를 통해 IL-15 수용체 α 스시 도메인과 결합되어 있으며, 더욱 바람직하게 링커 펩티드는 GGGGS 또는 (GGGGS)3이다.
본 발명에 있어 공유 결합이란, 2개 이상의 원자가 자체의 외각 전자를 공유하고, 이상적인 환경에서는 전자 포화 상태에 도달하여, 비교적 안정적인 화학 구조를 형성하는 화학 결합의 한 유형을 지칭한다. 즉 몇몇 인접 원자들이 공유하는 전자들 사이에 형성된 강력한 상호작용은 공유 결합이라 지칭된다.
링커 펩티드란, 가요성 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드 사슬을 지칭하고, 가요성 아미노산 잔기는 Gly, Ser, Ala 또는 Thr이다. 폴리펩티드 사슬은 2개의 분자를 결합시켜, 이 분자들이 서로에 대해서 올바른 입체배열을 가지도록 만듦으로써 원하는 활성을 유지하는데 적합한, 적합한 거리를 가져야 한다. 이러한 목적에 적합한 거리는 적어도 1개 및 30개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게 링커의 길이는 약 1개 ~ 약 30개 아미노산이고, 링커의 바람직한 길이는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 및 20개 아미노산이다. 뿐 아니라, 링커 펩티드에 포함되도록 선택된 아미노산 잔기는, 결합된 분자 2개의 활성에 유의미한 영향을 미치는 특성을 보여서는 안된다. 그러므로 링커 펩티드는, 일반적으로 결합된 분자 2개의 전하와 부합하지 않는 전하를 보이지 않거나, 또는 내부 폴딩(internal folding)에 영향을 미치지 않거나, 또는 1개 이상의 단량체(단 이 단량체들은 수용체 단량체 도메인의 결합을 심각하게 방해하지 않을 것임)내 아미노산 잔기들과 결합을 형성하지 않거나 기타 상호작용을 보이지 않는다. 가요성 아미노산 잔기들을 함유하는 링커 펩티드는 글리신-세린 중합체(예컨대 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n [식 중, n은 적어도 1인 정수임]), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 그리고 당 분야에 공지된 기타 가요성 링커 펩티드, 예컨대 셰이커 칼륨 채널(Shaker potassium channel)의 서열들을 결합시키는 링커 펩티드를 포함한다.
본 발명에 있어 Fc 단량체란, 분자량이 야생형 Fc 영역의 분자량의 절반에 불과하고, 항체 Fc 영역의 FcRn-결합 특성 및 단백질 A/G 결합 특성을 보유하고, 원핵생물 세포에서 효율적인 발현을 실현할 수 있는 Fc 폴리펩티드를 지칭한다.
상기 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 바람직한 구현예에서, Fc 단량체 서열은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
X0은 L 및 S로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X1은 C, G, S, L, N, D, F, I, V, Y, Q, K, E, M 및 T로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X2는 L, Q, N, D, Y, R, C, G, S, F, T, I, V, A, K 및 M으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X3는 P, N, T, I, S, M, Q, R, L, G, V, A, E, D, Y, F 및 H로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X4는 K, N, S, I, M, E, Q, L, V, A, H, D, Y 및 F로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X5는 M 및 Y로부터 선택되는 임의의 아미노산이고;
바람직하게 Fc 단량체의 서열은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명에 있어 IL-15 수용체 α 스시 도메인은, IL-15 수용체 α의 세포외 도메인이 제1 엑손 2에 의해 암호화된 시스테인 잔기(C1)로부터 시작되어, 제4 엑손 2에 의해 암호화된 시스테인 잔기(C4)에서 끝나고, C1 잔기 및 C4 잔기 둘 다는 스시 도메인에 함유되어 있음을 의미한다. 아미노산 잔기 1개 이상의 치환, 결실 또는 부가에 의해 형성되고, 대응 활성을 가지는 IL-15 수용체 α 스시 도메인의 아미노산 서열도 또한 본 발명에 포함된다.
상기 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 바람직한 구현예에서, IL-15 수용체 α 스시 도메인의 서열은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게 IL-15 기능성 단편의 서열은 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:
서열 번호 1(단량체 Fc의 아미노산 서열)
서열 번호 2(단량체 Fc의 아미노산 서열)
서열 번호 3(IL-15RαSu의 아미노산 서열)
서열 번호4(IL-15 돌연변이체의 아미노산 서열)
본 발명에 있어 IL-15 기능성 단편이란, 1994년 Grabstein외 다수에 의해 발견된 것으로서(J G Giri et al., EMBO J. 1994 Jun 15; 13(12): 2822-2830), 체내 정상 면역 반응에서, 예를 들어 T 세포, B 세포 및 NK 세포의 증식을 촉진하는 것과 같은 기능을 발휘할 수 있는, 약 12 kD ~ 약 14 kD의 사이토카인을 지칭한다. 아미노산 잔기 1개 이상의 치환, 결실 또는 부가에 의해 형성되고, 대응 활성을 가지는 IL-15 기능성 단편의 아미노산 서열도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 제2 측면에서,
(a) 링커 펩티드 분절을 통해 Fc 단량체를 IL-15 수용체 α 스시 도메인에 결합시키는 단계;
(b) IL-15 기능성 단편을 수득하는 단계; 및
(c) 단계 (a) 및 단계 (b)를, 공동 혈질감염 발현 또는 별도의 발현에 돌입시킨 후, 시험관내에서 단백질을 조립하는 단계
포함하는, 상기 지효성 인터루킨-15 융합 단백질을 구성하기 위한 방법이 제공된다.
공동 형질감염 발현이란, 링커 펩티드 분절을 통해 결합된 Fc 단량체 및 IL-15 수용체 α 스시 도메인에 대한 삽입부를 가지는 벡터를, IL-15 기능성 단편에 대한 벡터와 적당한 비로 혼합하여 세포(예컨대 Expi293 세포)를 형질감염시켜, 배양, 발현 및 정제(예컨대 단백질 G에 의한 1단계 정제)를 수행함으로써 IL-15 융합 단백질을 수득하는 것을 지칭한다.
시험관내 단백질 조립 방법이란, 세포들(예컨대 Expi293 세포)을, 적당한 비의 벡터들, 즉 링커 펩티드 분절을 통해 결합된 Fc 단량체 및 IL-15 수용체 α 스시 도메인에 대한 벡터 및 IL-15 기능성 단편에 대한 벡터로 별도 형질감염시킨 다음, 이 세포를 배양 및 유도하고 나서, 유도된 세포의 상청액을 적당한 비로 혼합한 후, 정제(예컨대 단백질 G에 의한 1단계 정제)를 수행하여, 고순도 표적 단백질을 수득하는 것을 지칭한다.
본 발명의 제3 측면에서, 상기 지효성 인터루킨-15 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.
본 발명의 제4 측면에서, 상기 핵산 분자를 함유하는 플라스미드가 제공된다. 조절 서열, 예컨대 프로모터와 인핸서는 작동 가능하도록 결합되어 있다.
본 발명의 제5 측면에서, 상기 플라스미드를 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 숙주 세포는 임의의 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포, 예컨대 세균 세포(예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 곤충 세포(예컨대 바큘로바이러스 발현계 사용) 및 효모 또는 포유동물 세포(예컨대 CHO 세포주 또는 BHK 세포주)(이에 한정되는 것은 아님)일 수 있다. 기타 적합한 숙주 세포는 당 업자들에게 공지되어 있다.
본 발명의 제6 측면에서, 상기 지효성 인터루킨-15 융합 단백질, 상기 핵산 분자 또는 상기 플라스미드의 예방적 유효 용량 또는 치료적 유효 용량만큼과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학 조성물이 제공된다. 조성물은 동결 건조 투여형, 수용액 투여형, 리포좀, 캡슐 투여형 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 핵산 분자 또는 플라스미드의 농도는 (중량 기준) 약 0.1% ~ 약 100%로 다양할 수 있다.
본 발명의 제7 측면에서, 상기 지효성 인터루킨-15 융합 단백질, 상기 핵산 분자 또는 상기 플라스미드를 함유하는 검출 키트가 제공되고; 바람직하게 검출 키트는 병원체 및 종양 세포를 검출하기 위해 사용된다. 병원체는 바이러스, 세균, 진균, 기생 감염체 등을 포함한다. 종양 세포는 다양한 양성 종양 세포, 악성 종양 세포(즉 암세포), 고형 종양 세포 및 혈행성 암종 세포를 포함한다.
본 발명의 유리한 효과는, 본 발명이 질환을 진단, 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질, 핵산 분자, 플라스미드 및 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명에 기재된 질환은 자가면역질환, 염증질환, 신경퇴행성질환, 암 또는 병원체감염이다.
바람직하게 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 암은 림프종, 모세포종, 육종(지방육종 포함), 신경내분비종양, 중피종, 슈반종, 뇌수막종, 선종, 흑색종 및 무백혈성백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 암의 더욱 구체적인 예는 편평세포암종(예컨대 편평상피세포암종), 폐암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐선암종 및 폐편평세포암종, 복막암, 간세포암종, 위암, 위장관암, 췌장암, 악성신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암종, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신암, 전립선암, 외음부암, 감상선암, 간암, 항문암, 음경암, 고환암, 식도암, 담관종양, 두부암, 경부암, 골수기질종양, 파골세포종양, 다발성골수종, 골용해성골암, 중추신경계종양, 뇌종양(신경교종, 신경모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 상의세포종 및 망막신경모세포종), 비인두암종, 기저세포암종, 담관암종, 카포시(Kaposi)육종, 원발성 간암 또는 자궁내막암, 그리고 혈관계의 종양(혈관육종 및 혈관주위세포종)을 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 병원체감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 병원체들로서는 세균, 진균, 바이러스 및 기생체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 IL-15 융합 단백질로 치료될 수 있는 병태로서는, 구체적으로 울혈성심부전(CHF), 혈관염, 주사, 여드름, 습진, 심근염 및 기타 심근성 병태, 전신홍반성낭창, 당뇨병, 척추병증, 활액막섬유아세포증식, 골소실, 파젯(Paget)병, 불용성골감소증, 영양실조, 치주질환, 가족성비장빈혈, 랑게르한스(Langerhans) 세포 조직구증, 척추손상, 급성패혈성관절염, 골연화증, 고코르티솔증, 단골성섬유이형성증, 다발성골섬유성이형성증, 치주재건후골절(periodontal reconstruction 및 fracture), 사르코이드증, 골전이/골통증 치료 및 체액의 악성고칼슘혈증, 강직성척수염 및 기타 척추관절증, 이식거부, 바이러스 감염, 혈액암, 호지킨(Hodgkin)림프종, 비호지킨림프종(버킷(Burkitt)림프종, 소림프구성림프종/만성림프구성백혈병, 균상식육종, 맨틀세포림프종, 소포성림프종, 확산성거대B세포림프종, 변연대림프종, 모양세포백혈병 및 림프형질세포성백혈병), 림프구전구체세포종양, B세포급성림프아구성무백혈성백혈병/림프종, 흉선종, 성숙 T 세포 및 NK 세포 종양, 말초T세포무백혈성백혈병, 성숙 T 세포 무백혈성백혈병/T 세포림프종, 거대과립림프구성백혈병, 랑게르한스세포조직구증, 급성골수성백혈병의 골수종, 성숙급성골수성백혈병(AML), 분화급성골수성백혈병, 급성전골수구성백혈병, 급성골수단핵구성백혈병, 급성단핵구성백혈병, 척추이형성증후군, 만성골수증식성질환, 만성골수성백혈병, 골다공증, 간염, HIV, AIDS, 척추관절염, 류머티즘성관절염, 염증성장질환(IBD), 패혈증 및 패혈성쇼크, 흉터성장염, 건선, 경피증, 이식편대숙주병(GVHD), 동종섬이식편거부(allogenic islet graft rejection), 혈액암, 예컨대 다발성골수종(MM), 골수이형성증후군(MDS) 및 급성골수성백혈병(AML), 종양 관련 염증, 말초신경손상 또는 탈수초성질환을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 IL-15 융합 단백질, 핵산 분자, 플라스미드 및 약학 조성물은, 보통 치료될 질환의 특징에 따라서 다양한 투여 경로를 통해 인간 또는 동물 대상체에 투여될 수 있다. 일반적으로 의료상 허용 가능한 임의의 투여 방식, 예컨대 경구, 직장, 국소, 안구내, 수조내, 뇌실내, 기관내, 비내 점적, 경피, 피하, 척추강내, 근육내, 복강, 복막내, 두개내 주입 또는 정맥내 주입 투여가 본 발명의 방법을 수행하는데 사용될 수 있다.
도 1은 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 구조에 관한 표준적 도해를 보여주는 것이고;
도 2는 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 환원 SDS-PAGE 분석 및 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색 결과에 대한 도해를 보여주는 것이며;
도 3은 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석결과[단 이 경우 피분석물은 FL115-2a(C) 및 FL115-2b(D)이고, 대조군 단백질은 sFc(A) 및 Fc(B)임]를 보여주는 것이고;
도 4는 CTLL-2를 대상으로 한 증식 검정에 의해 평가된 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생물학적 활성[단 이 경우 양성 대조군은 IL-15 및 IL-15 수용체 α임(양성 대조군)]을 보여주는 것이며;
도 5는 마우스에 있어 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질 FL115-2a의 생체내 항종양 효과를 보여주는 것이고;
도 6은 B16F10 흑색종 종양이 등에 피하 접종된 마우스의 체중에 대한, 본 발명의 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 효과를 보여주는 것이며;
도 7은 B16F10 흑색종 종양이 등에 피하 접종된 마우스의 생존률에 대한, 본 발명의 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 효과를 보여주는 것이고;
도 8은 B16F10 흑색종 종양이 등에 피하 접종된 마우스에 있어 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 항종양 효과와, 이 마우스의 체중에 대한 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 효과[단 이 경우 양성 대조군(PC로 약칭)은 IL-15의 Fc 융합 단백질, IL15 KIH(IL-15&IL15α의 Fc 융합 단백질) 및 WT-IL15이고, 음성 대조군은 PBS임]를 보여주는 것이며;
도 9는 각각의 군에 속하는 마우스 5마리에 대한, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생체내 항종양 효과를 보여주는 것이고;
도 10은 각각의 군에 속하는 마우스 각각의 치료에 대한, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 항종양 효과를 보여주는 것이며[단 여기서 각각의 마우스의 종양 중량이 계량되고, 군들간 통계학적 차이가 존재하였는지 여부는 1원 ANOVA 분석 및 통계학에 의해 분석되었음];
도 11은 유세포분석에 의해 분석되는 바에 따르면, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질을 투여받은 후 B16F10 흑색종 종양이 접종된 마우스에 있어 생체내 Treg 세포의 수가 감소하였음[이는 특히 Foxp3+CD25+의 감소에 의해 입증됨]을 보여주는 것이고;
도 12는 유세포분석에 의해 분석되는 바에 따르면, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질을 투여받은 후 B16F10 흑색종 종양이 접종된 마우스에 있어 생체내 NK 세포 수가 증가하였음과, IFN-γ 및 퍼포린 분지가 증가하였음을 보여주는 것이며;
도 13은 유세포분석에 의해 분석되는 바에 따르면, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질을 투여받은 후 B16F10 흑색종 종양이 접종된 마우스에 있어 생체내 IL6이 증가하였음을 보여주는 것이다.
당 업자들에게 본 출원의 해결책을 더 잘 이해시키기 위해, 본 출원의 구현예들에 있어 해결책들은 예들과 함께 이하 명확하고 완전하게 기재될 것이다. 명확하게, 기재된 구현예는 본 출원의 구현예의 단지 일부일 뿐 전부는 아니다. 본 출원의 구현예들을 기반으로 하였을 때, 당 업자들에 의해 수득된 기타 구현예 모두는 본 발명의 임의의 노력이 들어가지 않고서도 본 출원의 보호 범위안에 포함될 것이다.
본 발명을 더욱 철저히 이해시키기 위해, 몇몇 정의가 이하에 나열되어 있다. 상기 정의는 문법적 등가물이 포함되도록 의도된다.
융합 단백질이란 용어는 2가지의 상이한 의미를 가진다. 1가지는, DNA 재조합 기술에 의해 수득된 재조합 유전자 2개의 발현 생성물이고, 나머지 1가지는 세포의 원형질막 융합을 매개하는 단백질의 한 군, 예컨대 바이러스 외피와 숙주 세포의 원형질막 사이 융합의 작용을 매개하는 센다이 바이러스(Sendai virus) 지질 이중층의 외곽 소엽에 함유된 당단백질 2개중 1개이다. 또다른 당단백질은 헤마글루티닌 세라미다아제이다. 상이한 단백질 2개는 결합되어, 화학적 방법 또는 유전자 융합에 의해 거대분자를 형성할 수 있다.
IL-15는 체내 염증 반응 및 면역 반응에 참여하여 이를 조절하는, 다양한 면역 세포의 케모카인으로서 작용하는 가용성 사이토카인이다. 이의 생물학적 기능은 다양한 세포에 의해 생산되는 IL-2의 생물학적 기능과 유사하다.
본원에 사용된 바와 같은 "단량체"란 용어는, 중합체 기본 구조에 대한 구조 유닛을 제공하기 위해 중합을 수행할 수 있는 분자를 의미한다. 다수의 단량체가 합하여져, 중합체를 형성하는 과정은 중합이라 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은 "Fc" 및 "Fc 단량체"란 용어는, 면역글로불린 도메인의 제1 불변 영역 이외의 항체 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로 "Fc"란, IgA, IgD 및 IgG 면역글로불린 도메인의 마지막 불변 영역 2개, IgE 및 IgM 면역글로불린 도메인의 마지막 불변 영역 3개, 그리고 이들 도메인의 N 말단들을 연결하는 가요성 경첩부를 지칭한다. IgA 및 IgM에 있어서, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG에 있어서, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3과, Cγ1 및 Cγ2 사이의 경첩부를 포함한다. 비록 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄의 Fc 영역은, 일반적으로 자체의 카복시 말단에 잔기 C226 또는 P230을 함유하는 것으로서 정의되되, 여기서 번호매김 방법은 Kabat.의 EU 지수에 따른다. Fc란, 단리된 영역 또는 항체 배경내 영역, 항체 단편 또는 Fc 융합체를 지칭할 수 있다. Fc는 항체, Fc 융합체, 또는 Fc를 함유하는 단백질 또는 단백질 도메인일 수 있다. 합성 생물학에 의해 수득된 비자연발생 Fc 변이체인 Fc 변이체가 특히 바람직하다.
기능성 단편은 화합물, 즉 아미노산과 단백질 사이에 있으며, 그 자체가 강력한 생물학적 활성을 가지는 분자 구조의 한 군이다.
아미노 말단, NH2-말단, N-말단 또는 아민 말단이라고도 공지된, 본원에 사용된 바와 같은 "N-말단"이란 용어는, 단백질 또는 폴리펩티드의 개시점으로서, 폴리펩티드의 말단에 위치하는 유리 아민기(-NH2)를 지칭한다. 카복실 말단, 카복실기 말단, C-말단 미부, C-말단 또는 COOH-말단이라고도 공지된, "C-말단"이란 용어는, 단백질 또는 폴리펩티드의 말단으로서, 유리 카복실(-COOH) 말단에 의해 종결된다.
본원에 사용된 바와 같은 "아미노산"이란 용어는, 명시된 위치에 위치할 수 있는 자연 발생 아미노산 20개 또는 임의의 비자연 유사체중 1개를 의미한다. 본원에 있어서 "단백질"이란 용어는, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함하여 공유 결합된 아미노산 적어도 2개를 의미한다. 단백질은 자연 발생 아미노산 및 펩티드 결합, 또는 "유사체"라 지칭되는 합성 펩티드 모의체의 구조로 이루어질 수 있다. 그러므로 본원에 사용된 바와 같은 "아미노산" 또는 "펩티드 잔기"란 용어는, 자연 발생 아미노산 및 합성 아미노산을 의미한다. 예를 들어 본 발명을 위하여, 호모페닐알라닌, 시트룰린 및 노르루신은 본 발명을 위한 아미노산으로 간주된다. "아미노산"이란 용어는 또한 이미노산 잔기, 예컨대 프롤린 및 하이드록시프롤린을 포함한다. 측쇄는 (R) 또는 (S) 입체배열을 취할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 아미노산은 (S) 또는 (L) 입체배열로 존재한다. 만일 비자연발생 측쇄가 사용되면, 비아미노산 치환이, 예컨대 생체내 분해를 예방 또는 지연시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "핵산"이란 용어는, 포스포디에스테르 결합을 통해 뉴클레오티드 유닛(리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 관련 자연 발생 구조 변이체 및 이의 합성 비자연 발생 유사체)으로 이루어진 중합체를 의미한다. 그러므로 이 용어는 뉴클레오티드들 및 이것들 사이의 결합이 비자연 발생 합성 유사체, 예컨대 티오포스페이트, 아미노포스페이트, 메틸포스페이트, 키랄 메틸포스페이트, 2'-O-메틸리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA) 등(이에 한정되는 것은 아님)을 포함하는 뉴클레오티드 중합체를 포함한다. 예를 들어 이러한 폴리뉴클레오티드는 자동 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. "올리고뉴클레오티드"란 용어는, 일반적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 보통은 약 50개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉 A, T, G, 및 C)로 표시될 때, 이는 또한 "T"가 "U"로 치환된 RNA 서열(즉 A, U, G, 및 C)을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본원에서 종래의 상징은 뉴클레오티드 서열을 설명하는데 사용되는데; 단일 가닥 뉴클레오티드 서열중 좌측 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5' 방향이라 지칭된다. 5'→ 3' 뉴클레오티드들이 신생 RNA 전사체에 부가되는 방향은 전사 방향이라 지칭된다. 서열이, mRNA 서열과 동일한 DNA 가닥은 암호화 가닥이라 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은 "~를 암호화하는"이란 용어는, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA중 특정 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성이, 규정된 뉴클레오티드 서열 또는 규정된 아미노산 서열중 어느 하나와 함께 생물학적 과정에 의해 기타 중합체 및 거대분자 합성을 위한 주형으로서 사용되고, 이로부터 생물학적 특성이 나타나게 되는 경우를 지칭한다. 그러므로 만일 이 유전자의 전사 및 이 유전자로부터 생산된 mRNA의 번역이 세포 또는 기타 생물계에서 단백질을 생산하게 되면, 해당 유전자는 단백질을 암호화하는 것이다. 암호화 가닥, 즉 mRNA 서열과 동일하고, 보통 서열 목록에 제공되는 뉴클레오티드 서열과, 유전자 또는 cDNA에 대한 전사 주형으로서 사용되는 비암호화 가닥은 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 암호화하는 것이라 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않은 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"이란 용어는, 서로 축퇴성이고, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 또한 인트론을 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "플라스미드"란 용어는, 실험실에서의 작업에 적응되도록 자연 플라스미드를 기반으로 인위적으로 구성된 플라스미드를 의미한다. 핵산 분자는 숙주 세포에 도입될 수 있으며, 이로써 형질전환된 숙주 세포가 생산될 수 있다. 벡터는, 숙주 세포내에서의 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기원을 포함할 수 있으며, 당 분야에 공지된 1개 이상의 선택 마커 유전자 및 기타 유전자 요소를 또한 포함할 수도 있다.
수용 세포(recipient cell)라고도 지칭되는, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"란 용어는, 형질전환 및 형질도입(감염) 도중 외래 유전자를 수용하는 숙주 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는, 종래의 약학적으로 허용 가능한 담체를 의미한다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, EW Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th edition(1975)]에는, 치료 화합물 또는 분자 1개 이상(예컨대 항체 1개 이상) 및 추가 제제의 약물 전달에 적합한 조성물 및 제조가 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 어떤 질환의 "진단"이란, 관찰후 환자의 병태 및 이 병태의 발달을 진단하는 것을 지칭한다. 어떤 질환의 "예방"이란, 해당 질환의 완전한 발달을 억제하는 것을 지칭한다. "치료"란 용어는, 어떤 질환 또는 병리학적 병태가 발달하기 시작한 이래로 해당 질환 또는 병리학적 병태의 징후 또는 증상을 개선하기 위한 치료적 개입을 지칭한다.
본원에 있어서 "투여"란 용어는, 어떤 물질을 대상체에 도입하기에 적당한 경로를 선택하는 것을 의미한다. 예를 들어 만일 선택된 경로가 정맥내 경로이면, 조성물은 해당 물질을 대상체의 정맥에 도입함으로써 투여된다.
본원에서 "예방적/치료적 유효량"이란 용어는, 제제로 치료된 대상체에서 원하는 효과를 달성하기에 충분한, 특정 제제의 양을 의미한다. 정확한 투여량은 치료의 목적에 의존적일 것이며, 널리 공지된 기술을 사용함으로써 당 업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량 범위는 체중 1 kg당 0.01 mg ~ 100 mg 이상, 예컨대 체중 1 kg당 0.1 mg, 1 mg, 10 mg 또는 50 mg, 바람직하게 체중 1 kg당 1 mg ~ 10 mg일 수 있다. 당 분야에 널리 공지된 바와 같이, 항체 또는 Fc 융합체의 분해, 전신 또는 국소 약물 전달과 신규 프로테아제 합성 속도, 그리고 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식습관, 투여 시간, 약물 상호작용 및 질환의 중증도라는 관점에서, 조정은 필요할 수 있고, 종래의 실험 방법에 의해 당 업자들에 의해 결정될 수 있다. 이러한 제제는 본원에 기재된 단량체 Fc 도메인 분자를 포함한다. 하나의 비제한적 예에서, 이는 HIV 감염을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 HIV 특이적 단량체 Fc 도메인(또는 HIV 특이적 CH3 도메인 분자)의 양일 수 있다. 이상적으로, 항체의 치료적 유효량은 대상체에서 유의미한 세포독성 영향을 일으키지 않고 해당 대상체에서 감염 또는 질환, 예컨대 HIV 감염으로 기인할 수 있는 감염 또는 질환을 예방, 치료 또는 완화하기 충분한 양이다. 대상체를 예방, 완화 및/또는 치료하기 위한 제제의 치료적 유효량은, 치료중인 대상체, 몸이 불편한 유형과 중증도, 치료적 조성물의 투여 방식에 의존할 것이다.
본원에 있어 "자가면역질환"이란 용어는, 면역계가 정상 숙주의 몇몇 항원(즉 자기항원)에 대해 면역 반응(예컨대 B 세포 또는 T 세포 반응)을 일으킨 후, 조직에 손상을 유발하는 질환을 지칭한다. 자기항원은 숙주 세포로부터 유래할 수 있거나, 또는 공생 유기체, 예컨대 정상적으로 점막 표면에 서식하는 (공생 유기체라 칭하여지는) 미생물로부터 유래할 수 있다. 포유동물에 발병하는 자가면역질환으로서는 류머티즘성관절염, 소아소수관절염, 콜라겐유도관절염, 애주반트 유도 관절염, 쇼그렌(Sjogren)증후군, 다발성경화증, 실험적자가면역뇌척수염, 염증성장질환(예컨대 크론병 및 궤양성결장염), 자가면역성위점막위축, 심상성천포창, 건선, 백반증, 1형 당뇨병, 비비만형당뇨병, 중증근무력증, 그레이브스(Graves)병, 하시모토(Hashimoto)갑상선염, 경화성담관염, 경화성타액선염, 전신 전신홍반성낭창, 자가면역혈소판감소자반병, 굿파스쳐(Goodpasture)증후군, 애디슨(Addison)병, 전신경화증, 다발성근염, 피부근육염, 자가면역용혈성빈혈, 악성빈혈 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 "바이러스"란 용어는, 이하 바이러스 과들의 바이러스이되, 이에 한정되는 것은 아니다: 레트로비리대(Retroviridae) 과(예컨대 인간면역결핍증바이러스(HIV) 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV)); 피코나비리대(Picornaviridae) 과(예컨대 폴리오바이러스, A형간염바이러스, C형간염바이러스, 장내바이러스, 인간 콕사키바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스 및 수족구병바이러스); 칼믹소비리대(Calmyxoviridae) 과(예컨대 위장염을 일으키는 바이러스 균종); 토가비리대(Togaviridae) 과(예컨대 말뇌염바이러스 및 루벨라바이러스); 플라비비리대(Flaviviridae) 과(예컨대 뎅기바이러스, 황열바이러스, 웨스트나일바이러스, 세인트루이스뇌염바이러스, 일본뇌염바이러스 및 기타 뇌염바이러스); 코로나비리대(Coronaviridae) 과(예컨대 코로나바이러스 및 중증급성호흡기증후군(SARS)바이러스); 래비도비리대(Rhabdoviridae) 과(예컨대 수포성구내염바이러스 및 광견병바이러스); 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 과(예컨대 파라인플루엔자 바이러스, 수두바이러스, 홍역바이러스 및 호흡기세포융합바이러스(RSV)); 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae) 과(예컨대 인플루엔자 바이러스); 부니아비리대(Bunyaviridae) 과(예컨대 한타바이러스, 신놈브레바이러스, 리프트밸리열바이러스, 분야바이러스, 플레보바이러스 및 바이로바이러스); 아레나비리대(Arenaviridae) 과(예컨대 출혈열바이러스, 마추포바이러스 및 후닌바이러스); 레오비리대(Reoviridae) 과(예컨대 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 버나비리대(Birnaviridae) 과; 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 과(예컨대 B형간염바이러스); 파르보비리대(Parvoviridae) 과(예컨대 파보바이러스); 파포바비리대(Papovaviridae) 과(예컨대 파필로마바이러스, 폴리오마바이러스 및 BK바이러스); 아데노비리대(Adenoviridae) 과(예컨대 대부분의 아데노바이러스, 예컨대 아데노연관바이러스); 헤르페스비리대(Herpesviridae) 과(예컨대 헤르페스심플렉스바이러스(HSV-1 및 HSV-2), 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 바리셀라조스터바이러스(VZV) 및 기타 헤르페스바이러스, 예컨대 HSV-6); 폭스비리대(Poxviridae) 과(예컨대 두창바이러스, 백시니아바이러스 및 수두바이러스); 이리도비리대(Iridoviridae) 과(예컨대 아프리타돼지열병바이러스); 비라세아에(Viraceae) 과(예컨대 에볼라바이러스 및 말버그바이러스); 칼리시비리대(Caliciviridae) 과(예컨대 노르워크바이러스); 및 미분류된 바이러스(예컨대 해면모양뇌병증 병원체, 델타간염 병원체(B형간염바이러스의 결함 위성으로 간주됨) 및 아스트로바이러스).
본원에서 "세균"이란 용어는, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 버그도르페리(Borelia burgdorferi,), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 마이코박테리아(예컨대 엠.튜버큘로시스(M. tuberculosis), 엠.아비움(M. avium), 엠.인트라셀룰라레(M. intracellulare), 엠.칸사이(M. kansaii) 및 엠.고도나에(M. gordonae)), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)(A군 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae)(B군 스트렙토코커스), 스트렙토코커스(Streptococcus)(비리단스(Viridans) 군 스트렙토코사이), 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스크렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스(Streptococcus)(혐기성 세균), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 병원체 캄필로박터(Campylobacter), 엔테로코커스(Enterococcus), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코린박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코린박테리움(Corynebacterium), 전통적 돼지열병바이러스, 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 파스퇴렐라 뮬토사이다(Pasteurella multocida), 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리듐(Clostridium), 스트렙토마이세스 말토필리아(Streptomyces maltophilia), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 트레포네마(Treponema), 렙토스피라(Leptospira) 또는 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli)의 세균이되, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 "진균"이란 용어는, 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스미 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum), 코시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 진균이되, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 "기생체"란 용어는, 플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum) 또는 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii)의 기생체이되, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 "암"이란 용어는 고형 종양 또는 혈행성 암종이다. 본 발명에 기재된 고형 종양은 육종 또는 암, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 또는 다른 육종, 활액막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 림프악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포암종, 편평세포암종, 기질세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유도모양암종, 유두모양선암종, 수질암종, 기관지암종, 신세포암종, 간세포암종, 담관암종, 융모막암종, 신모세포종, 자궁경부암종, 고환종양, 방광암 또는 중추신경계종양(예컨대 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과선, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 혈관종, 흑색종, 신경모세포종 또는 망막모세포종)이다. 본 발명에 기재된 혈행성 암종은 백혈병, 예컨대 급성백혈병(예컨대 급성림프구성백혈병, 급성골수성백혈병, 급성골수양백혈병, 그리고 골수아구성백혈병, 전골수구성백혈병, 골수단핵구성백혈병, 단핵구성백혈병 및 적백혈병); 그리고 만성백혈병(예컨대 만성골수구성(과립구성)백혈병, 만성과립구성백혈병 및 만성림프구성백혈병), 진성다혈구증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨림프종(저위험군류 및 고위험군류), 다발성골수종, 발덴스트롬(Waldenstrom)매트로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성증후군, 모양세포백혈병 또는 골수이형성증이다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 보통 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 문맥에 달리 명시되지 않는 한, 단수 용어 "한(a)", "하나의(an)" 및 "본(the)"은 복수를 나타내는 용어를 포함한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 뿐만 아니라, 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공됨이 이해되어야 할 것이다. 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 이하에 기재되어 있다. "~을 포함하다(comprise)"라는 용어는 "~을 포함한다(include)"를 의미한다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체로서 참고문헌으로 포함되어 있다. 상충하는 경우에는 본 명셍서의 설명(용어 설명 포함)이 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한적이지 않는다.
실시예에 사용된 표준 재조합 DNA 기술 및 분자 클로닝 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있으며(Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience 발행), 미생물 성장에 적합한 재료 및 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 주요 화학 및 생화학 시약은 KAPA Biosystems, New England Biolabs, TransGen Biotech, Thermo Fisher Scientific, OMEGA bio-tek 등에서 구입되었다.
본 발명은 구체적인 실시예와 결부되어 이하에 상세히 예시될 것이다.
실시예 1. 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 디자인 및 제조
디자인한 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 표준적 도해를 도 1에 보였다. IL15Rα-GGGGS-sFc를 암호화하는 유전자(서열 번호 5), IL15Rα-(GGGGS)3-sFc를 암호화하는 유전자(서열 번호 6), IL15Rα-Fc를 암호화하는 유전자(서열 번호 7), 및 IL15(N72D)를 암호화하는 유전자(서열은 서열 번호 4임)를 Genescript(Nanjing)에 의해 합성하였다. 유전자를 진핵생물 발현 벡터 PTT(Thermo Fisher로부터 구입)에 클로닝하였다. 성공적으로 구성한 플라스미드를 대상으로 맥시-제조(maxi-preparetion)를 수행하였으며, 이후에는 Expi293 세포(Thermo Fisher로부터 구입)에 도입하여, 이 세포를 일시적으로 공동형질전환시켜 발현을 도모하였고[단 이 경우, IL15Rα-(GGGGS)3-sFc는 IL15(N72D)와 공동형질전환되어, FL115-2a가 수득되었고, IL15Rα-GGGGS-sFc는 IL15(N72D)와 공동형질전환되어, FL115-2b가 수득되었으며, IL15Rα-Fc는 IL15(N72D)와 공동형질전환되어, IL-15의 Fc 융합 단백질이 수득됨], 단백질 G 수지(GE Healthcare로부터 구입)에 의해 정제를 수행하였다[특이적 형질전환, 발현 및 정제 방법에 관하여는 문헌(YING, Tianlei et al., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2012, 287(23): 19399-19408)을 참조한다]. 정제된 단백질의 순도를 SDS-PAGE 겔에 의해 인증하였고, 그 결과는, 단백질 순도는 우수하였고, 관심 밴드는 올발랐으며, 원치않는 밴드들은 존재하지 않았음을 보였다(도 2 참조).
실시예 2. 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 물리화학적 특성
실시예 1의 방법에 따라 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질들(FL115-2a 및 FL115-2b)을 발현시킨 다음, 정제하였다. 뿐 아니라, IL-15의 Fc 융합 단백질을 동일한 방식으로 디자인하여 구성하였고, 동일한 발현계 및 동일한 방식으로 Fc 융합 단백질의 발현 및 정제를 수행하여, 관련 단백질을 수득하였다. 정제를 단백질 G 수지에 의해 수행하였으며[특이적 형질전환, 발현 및 정제 방법에 관하여는 문헌(YING, Tianlei et al., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2012, 287(23): 19399-19408)을 참조한다], 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 수율은 10 mg/L 이하였는데, 이는 IL-15의 Fc 융합 단백질 수율이 1 mg/L인 것에 비해 명백히 유리하였으며, 이론상으로는 산업적 생산 비용의 관점에서 유의미하게 유리하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 단백질을 동 부피(100 ul)만큼 취하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행함으로써, 단백질의 균질성을 인증하였다. 도 3에 보인 바와 같이, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질은 자연에서 동질성이었으며, 단량체 형태로 존재하였다. FL115-2a 및 FL115-2b는 각각 GGGGS 및 (GGGGS)3 펩티드 분절을 통한 sFc 및 IL15Rα 사이의 결합을 나타내었다. 상기 결과는, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질이 잠재적으로 더 우수한 개발가능성을 가졌음을 나타내었다.
실시예 3. CTLL-2 세포주에서 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생물학적 활성 평가
신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생물학적 활성을 평가하기 위해, CTLL-2 세포주를 대상으로 한 증식 검정을 이용하였다(Santos-Savio A. et al., Biotecn Aplic. 2000, 17:221-4). 이하 기재된 절차에 따라, 미토콘드리아의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브롬화물(MTT)(Sigma로부터 구입) 염색을 이용하였고[구체적 방법에 관하여는 문헌(Mossman T.J. Immunol. Methods. 1983, 65(1-2): 55-63)을 참조한다], 생물학적 활성은, 이 세포의 증식을 자극함으로써 측정하였다. 96웰 배양 평판(Costar(USA)로부터 구입)에서 FL115-2a, FL115-2b, 양성 대조군(IL15&IL15Rα) 및 sFc의 일련의 희석(출발 농도 4 μg/mL)을, 10% 소태아혈청(FBS)(Gibco로부터 구입) 및 겐타마이신(Sigma로부터 구입) 50 μg/mL가 보충된 부피 50 μL의 RPMI 배지(Gibco로부터 구입) 중에서 수행하였다. 우선 CTLL-2 세포(ATCC로부터 구입)를 RPMI 배지로 5회 세척하였으며, 이후 평판에 부피 50 μL(5 x 103개 세포/웰)만큼을 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 및 상대 습도 98%에서 72시간 동안 항온처리를 수행하였다. MTT 염색에 의해 세포 생존능을 확정하였다. sFc가 CTLL-2 세포의 증식을 유도하지 않았던 것으로 보아, 이는 용량 의존적 방식으로 증식을 자극하였던 FL115-2a, FL115-2b 및 양성 대조군(IL15&IL15Rα)과 상이하게 생물학적으로 활성이지 않았다(도 4 참조).
실시예 4. 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생체내 약동학적 인증
신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 약동학적성질을 평가하기 위해, 본 발명자들은 5×105개 B16F10 마우스 흑색종 세포를 6주령 ~ 8주령 암컷 C57BL/6 마우스(Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.로부터 구입)의 등 우측에 주입하였다. 접종후 1일차 및 8일차에 다양한 용량의 FL115-2a-1, 양성 대조군(IL15&IL15Rα), 야생형 IL15(WT-IL15) 또는 음성 대조군(PBS)을 투여하였다. 종양 접종후 대응하는 FL115-2a-2를 2일에 1회 투여하였다. 마우스내 종양 크기는 특정일에 측정하였다. 실험 결과는 평균±표준 편차였는데, 이 경우 각각의 군에는 마우스가 5마리씩 포함되었다. 실험 데이터의 통계학적 유의미성은 1원 ANOVA로 분석하였는데, 이 때 **는 p < 0.01를 나타낸다. 양성 대조군은 IL-15 및 IL-15 수용체 α의 융합 단백질(양성 대조군)이었고, WT-IL15 및 PBS 군은 대조군이었으며; FL115-2a-1은 1일차 및 8일차에서의 투여를 나타냈고, FL115-2a-2는 2일에 1회 투여를 나타냈다.
실험 결과는, FL115-2a-1 및 FL115-2a-2의 투여 방식이 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생체내 항종양 효능에 영향을 미치지 않았고, 2개의 군은 매우 명료한 항종양 효능을 보였으되, 음성 대조군의 항종양 효능과는 통계학적으로 유의미한 차이가 있었음을 보였다. 본 발명자들은, 이 결과가 IL-15의 연장된 생체내 반감기와 관련이 있었던 것으로 추측하였다(도 5 참조). 뿐 아니라, 본 발명자들은 각각의 군에 있는 마우스의 체중을 시험하였으며, 융합 단백질의 안전성이 우수하였음을 확인하였고(도 6 참조), FL115-2a-1군 및 FL115-2a-2군은 우수한 생존률을 보였음을 확인하였다(도 7 참조).
실시예 5. 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질은 효율적인 생체내 항종양 활성을 보였다
신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생체내 항종양 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 상기 약동학적 인증 실험 디자인에 따라 B16F10 마우스 흑색종 세포를 6주령 ~ 8주령 암컷 C57BL/6 마우스(Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.로부터 구입)의 등에 피하 이식함으로써 종양이 이식된 마우스 모델을 확립하였다. 모델이 확립된 후, 1일차 및 8일차에 FL115-2a, PC(IL-15의 Fc 융합 단백질), IL15KIH(IL-15&IL15Rα의 Fc 융합 단백질), WT-IL15 및 음성 대조군 PBS를 꼬리 정맥에 주입하였으며, 2일에 1회 마우스내 종양 크기를 측정하였다. FL115-2a는 PC의 생체내 종양 생장 억제 효과와 거의 동일한 생체내 종양 생장 억제 효과를 보였으며, 음성 대조군과는 통계학적으로 유의미한 차이를 보였다(도 8 참조). 각각의 군에 포함된 마우스의 체중은 영향을 받지 않았는데, 이는 마우스내 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질의 생체내 안전성을 나타낸다(도 8 참조). 뿐 아니라, 본 발명자들은 또한 각각의 군에 속한 마우스 5마리에서의 종양 억제 효과를 각각 분석하였으며, FL115-2a군 마우스에서의 종양 억제 효과는 일관되었고, 항종양 억제 효과는 명백하였으되, 단 억제율은 62% 이하였음을 발견하였다(도 9 참조). 본 발명자들은 마우스를 해부하여, 각각의 마우스로부터 종양을 꺼낸 다음, 종양을 계량하였다. FL115-2a는 자체의 생체내 효율적인 항종양 활성으로 말미암아 마우스에서 명백한 종양 억제 효과를 보였고, 종양 크기 또는 무게의 관점에서 음성 대조군과 유의미한 차이를 제시하였다(도 10 참조).
실시예 6. 유세포분석에 의한 세포 표현형 분석
마우스를 마취시킨 후, 마우스 안와정맥으로부터 말초정맥혈을 채혈한 직후에 항응고처리와 적혈구 용해 처리를 수행하였다. 마우스를 인도주의적으로 처형한 후 비장을 꺼내었으며, 그 즉시 비장 세포를 수집하였고, 70 uM 나일론 체(FALCON으로부터 구입)를 통한 여과와 적혈구 용해 처리후 비장 단일 세포 현탁엑을 수득하였다. 뿐 아니라, 종양 조직을 꺼낸 다음, 종양 조직의 구조를 트위저(tweezer)로 가만히 파쇄하였으며, 이후 종양 조직을, 37℃에서 15분 동안 0.2 mg/ml 콜라게나아제 IV(Sigma-Aldrich로부터 구입) 및 0.1 mg/ml DNAse I(Sigma-Aldrich로부터 구입)으로 분해하였다. 단일 세포 현탁액을 수집하고 나서, 나머지 종양 조직을 상기 효소 용액으로 25분 동안 분해하였다. 합한 단일 세포 현탁액을 70 마이크론 나일론 메시를 통과시켜 여과하였다. 말초혈 단일 세포, 비장 세포 및 종양 세포를 유동 항체(BD사 제품)로 염색한 후, 4% 파라포름알데히드 용액(Sigma-Aldrich사 제품)으로 고정하고 나서, 암실에 저장하거나, 또는 고정 즉시 유세포분석기(BD사 제품)에 로딩하여, 세포 표현형 검출을 도모하였다. 항체로 염색을 마친 후, 유세포분석에 의하면 FL115-2a로 처리한 마우스의 종양 조직중 Treg 세포 수는 감소하였고, 이러한 감소는 특히 Foxp3+CD25+의 감소를 통해 입증되었음을 확인할 수 있었다(도 11 참조). 뿐 아니라, NK 세포 수와 IFN-γ 및 퍼포린 분비는 증가하였다. 실험 결과는, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질이 Treg 세포 수와 이의 억제 효과를 감소시킬 수 있었을뿐 아니라, NK 세포의 역량을 촉진하여 종양 조직이 더 많은 정도로 침습하고, IFN-γ 및 퍼포린 분비는 유의미하게 증가하였음을 암시하였을 뿐더러, 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질은 면역계를 효과적으로 활성화하여 종양 세포를 시멀시키고, IL-15의 종양 억제 효과를 개선할 수 있었음을 추가로 암시하였다(도 12 참조). 뿐 아니라, 유세포분석은 또한 신규 지효성 인터루킨-15 융합 단백질이 IL-6의 발현을 증가시킬 수 있었음을 보였다(도 13 참조).
개시된 구현예에 관한 상기 설명은 당업자가 본 발명을 구현하거나 사용할 수 있게 만들어준다. 상기 설명은 단지 본 발명의 바람직한 구현예에 대한 것이며, 당업자는 또한 본 발명의 원리를 벗어나지 않고 여러 가지 개선 및 보완을 진행할 수 있음을 주목해야 하며, 이러한 개선 및 보완은 또한 본 발명의 보호 범위에 있는 것으로 간주된다. 이들 구현예에 대한 다수의 수정은 당업자에게 명백할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 다른 구현예에서 구현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 보인 구현예에 의해 제한되지 않을 것이며, 본원에 개시된 원리 및 신규한 특징과 일치하는 가장 넓은 범위를 준수할 것이다.
<110> SUZHOU FORLONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
<120> LONG-ACTING INTERLEUKIN-15 FUSION PROTEIN, PREPARATION METHOD THEREFOR AND APPLICATION THEREOF
<130> ZPI202101ZT
<140> PCT/CN2021/076670
<141> 2021-02-18
<150> 2020116429173
<151> 2020-12-30
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Xaa Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Xaa Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Xaa Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Xaa His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 2
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Ser Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
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180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Tyr His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 3
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser

Claims (13)

  1. Fc 단량체, IL-15 수용체 α 스시 도메인, 그리고 IL-15 기능성 단편을 포함하고, IL-15 수용체 α 스시 도메인의 한 쪽 말단은 Fc 단량체와 결합되어 있고, IL-15 수용체 α 스시 도메인의 나머지 한 쪽 말단은 IL-15 기능성 단편과 결합되어 있는, 지효성 인터루킨-15 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-15 수용체 α 스시 도메인의 C 말단은 상기 Fc 단량체와 결합되어 있고, 상기 IL-15 수용체 α 스시 도메인은 공유 결합을 통하여 상기 IL-15 기능성 단편과 결합되어 있는, 지효성 인터루킨-15 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 링커 펩티드를 통해 상기 IL-15 수용체 α 스시 도메인과 결합되어 있되, 상기 링커 펩티드는 GGGGS 또는 (GGGGS)3인, 지효성 인터루킨-15 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체 서열은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되,
    X0은 L 및 S로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X1은 C, G, S, L, N, D, F, I, V, Y, Q, K, E, M 및 T로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X2는 L, Q, N, D, Y, R, C, G, S, F, T, I, V, A, K 및 M으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X3는 P, N, T, I, S, M, Q, R, L, G, V, A, E, D, Y, F 및 H로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X4는 K, N, S, I, M, E, Q, L, V, A, H, D, Y 및 F로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; X5는 M 및 Y로부터 선택되는 임의의 아미노산인, 지효성 인터루킨-15 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 Fc 단량체 서열은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 지효성 인터루킨-15 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-15 수용체 α 스시 도메인의 서열은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 IL-15 기능성 단편의 서열은 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 지효성 인터루킨-15 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 지효성 인터루킨-15 융합 단백질을 구성하기 위한 방법으로서,
    (a) 링커 펩티드 분절을 통해 Fc 단량체를 IL-15 수용체 α 스시 도메인에 결합시키는 단계;
    (b) IL-15 기능성 단편을 수득하는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 및 단계 (b)를, 공동 혈질감염 발현 또는 별도의 발현에 돌입시킨 후, 시험관내에서 단백질을 조립하는 단계
    를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 의한 지효성 인터루킨-15 융합 단백질 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 의한 핵산 분자를 함유하는 플라스미드.
  10. 제9항에 의한 플라스미드를 함유하는 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 지효성 인터루킨-15 융합 단백질 임의의 것, 제8항에 의한 핵산 분자 또는 제9항에 의한 플라스미드 예방적 유효 용량 또는 치료적 유효 용량만큼과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 지효성 인터루킨-15 융합 단백질, 제8항에 의한 핵산 분자 또는 제9항에 의한 플라스미드를 함유하는 검출 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 검출 키트는 병원체와 종양세포를 검출하는데 사용되는 검출 키트.
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