JP2024500604A - 細胞培養システム - Google Patents
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Abstract
細胞培養システム（１０）は、リアクタ（１２）と、リアクタ（１２）に対して培地を流入及び流出する流通経路（１６）と、培地に含まれる細胞を光学測定する光学測定部（５４）と、光学測定部（５４）の測定結果を処理する制御部（３２）と、を備える。光学測定部（５４）は、第１測定光（Ｌ１）の出射に基づき光学測定を行う第１測定ユニット（５６）と、第２測定光（Ｌ２）の出射に基づき光学測定を行う第２測定ユニット（５８）と、を培地の流通方向の異なる位置に有する。そして、第１測定光（Ｌ１）の第１光路長（ＯＰ１）は、第２測定光（Ｌ２）の第２光路長（ＯＰ２）よりも長く設定される。【選択図】図２
Description
本発明は、リアクタから流出する液体の細胞数を測定する細胞培養システムに関する。
再生医療では、生体の細胞を採取して培養し、培養した細胞を患者に投与する処置がなされる。細胞を培養する培養処理では、例えば、特開２０１７－１４３７７５号公報に開示されているように、ケース内に中空糸を有する細胞培養容器（リアクタ）を用いた細胞培養システムが使用される。この細胞培養システムは、リアクタの中空糸に細胞を播種し、その後にリアクタに接続される流通経路を介して、リアクタ内に培地を送り込むことで細胞を培養する。
この種の細胞培養システムは、培養中に、細胞培養の状態を把握すると共に細胞の回収タイミングを決めるために、増殖した細胞数を正確に監視することが重要となる。無菌フィルタを介して細胞培養システム内部の培地を無菌的に採取するのが一般的だが、細胞は無菌フィルタを通過できない。このため、従来は、培地を無菌的に採取して、乳酸やグルコース、酸素といった細胞の代謝物質の培地内濃度を測定して間接的に増殖した細胞数を算出している。また、無菌的に細胞を直接採取する方法として、細胞培養システムの回路チューブを一定の長さでシールして細胞含有培地を含むチューブ片を採取している。その後、切断した細胞培養システムの回路を無菌接合装置で再接続している。
しかしながら、上記のような間接的に細胞数を算出する場合には、培養環境の変化により、細胞代謝が変化して、正確な細胞数計測ができない。また、上記のような細胞含有培地を含むチューブを採取する場合、作業が煩雑になると共に、培養動作の一時中断、さらにはサンプリング時に細胞をロスするという問題もある。
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、無菌性を確保した状態でリアクタの細胞数を連続的に測定可能とし、また充分な測定精度が得られる細胞培養システムを提供することを目的とする。
前記の目的を達成するために、本発明に係る細胞培養システムは、培地の流通に基づき細胞を培養するリアクタと、前記リアクタに対して前記培地を流入及び流出する流通経路と、前記流通経路において前記リアクタよりも前記培地の流通方向下流側に設けられ、前記培地に測定光を照射して前記培地の状態を光学測定する光学測定部と、前記光学測定部の測定結果を処理する処理部と、を備え、前記光学測定部は、前記培地の流通方向において互いに異なる位置に配置された第１測定ユニット及び第２測定ユニットを有し、前記第１測定ユニットは、前記培地が流通すると共に第１測定光が透過する第１光路部を有し、前記第２測定ユニットは、前記培地が流通すると共に第２測定光が透過する第２光路部を有し、前記第１光路部の第１光路長は、前記第２光路部の第２光路長よりも長い。
上記の細胞培養システムは、無菌性を確保した状態でリアクタの細胞数を連続的に測定することを可能とし、また充分な測定精度が得られる。
以下、本発明について好適な実施形態を挙げ、添付の図面を参照して詳細に説明する。
本発明の一実施形態に係る細胞培養システム１０は、図１に示すように、無菌室等に設置される定置型の装置に構成され、再生医療において生体の細胞を培養する培養処理を行う。このため、細胞培養システム１０は、細胞の培養容器であるリアクタ１２を備える。細胞培養システム１０は、培地や酸素をリアクタ１２に供給しつつ、細胞培養中に生じた乳酸や二酸化炭素等（未使用の培地、酸素を含む）をリアクタ１２から排出することで、長期間にわたって細胞培養を継続する。
生体の細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、血液に含まれる細胞（Ｔ細胞等）、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等）があげられる。培地も、生体の細胞に応じて適切なものが選択されればよく、例えば、緩衝塩類溶液(Balanced Salt Solution：ＢＳＳ)を基本溶液として、種々のアミノ酸、ビタミン類及び血清等を加えて調製されたものがあげられる。
また、細胞培養システム１０は、培地を貯留した培地貯留部１４、リアクタ１２と培地貯留部１４の間に設けられる流通経路１６、流通経路１６に接続される複数の医療用バッグ１８、及び流通経路１６から排出される液体を貯留する廃液部２０を有する。なお図１中では、リアクタ１２を１つ備えた細胞培養システム１０を図示しているが、細胞培養システム１０は、リアクタ１２を複数備えた構成でもよい。
培地貯留部１４は、リアクタ１２に培地を供給するために、培地を多量に貯留することができる硬質なタンクが適用される。例えば、タンクは、５Ｌ～３０Ｌ程度の容積を有することが好ましく、これにより培養処理中に培地貯留部１４を頻繁に交換する作業負担が軽減される。なお、培地貯留部１４は、可撓性を有する医療用バッグ等を適用してもよい。
流通経路１６は、複数のチューブ２２によって構成される（図１中では、培地貯留部１４に接続されるチューブ２２のみを図示している）。複数のチューブ２２は、培地貯留部１４や複数の医療用バッグ１８に接続されると共に、複数のリアクタ１２に接続される。細胞培養システム１０は、複数のチューブ２２を介して、培地貯留部１４の培地及び医療用バッグ１８の液体をリアクタ１２に供給及び排出する。
複数の医療用バッグ１８としては、例えば、細胞を含む液体（細胞液）を貯留した細胞液バッグ１８Ａ、洗浄液を貯留した洗浄液バッグ１８Ｂ、剥離液を貯留した剥離液バッグ１８Ｃ、培養した細胞を回収する図示しない回収バッグがあげられる。洗浄液は、リアクタ１２及び流通経路１６のプライミング時に使用する液体である。この洗浄液としては、例えば、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Salts）、ＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）等の緩衝液、又は生理食塩水があげられる。また剥離液は、培養処理により培養された細胞を剥離する液体である。剥離液としては、例えば、トリプシン、ＥＤＴＡ液を適用することができる。
細胞培養システム１０の構築時に、流通経路１６は、流路制御機構部２４を通るようにセットされる。流路制御機構部２４は、流通経路１６の一部を収容する筐体２６を備える。また流路制御機構部２４は、所定のチューブ２２を開閉するクランプ２８と、チューブ２２内の液体を流通させるポンプ３０と、クランプ２８及びポンプ３０の動作を制御する制御部３２（処理部）と、を筐体２６内に備える（図２参照）。すなわち筐体２６内で、流路制御機構部２４は、クランプ２８の開閉により液体が流通するチューブ２２を選択的に切り替えつつ、ポンプ３０の動作下に流通経路１６の液体を流通させる。
流通経路１６は、複数のチューブ２２の他に、液体の流路を複数有すると共に幾つかのチューブ２２が接続されるカセット（不図示）を備えていてもよい。この場合、カセットは、筐体２６内にセットされることに伴い流路制御機構部２４のクランプ２８に配置され、クランプ２８によりカセット内の流路の開閉や切替等がなされる。
流通経路１６に接続されるリアクタ１２は、培養面積を広くとるために、例えば、中空糸３４を有する構造を適用することが好ましい。具体的には、リアクタ１２は、複数（例えば、１万本以上）の中空糸３４と、複数の中空糸３４を軸方向に沿って収容するケース３６と、を備える。
各中空糸３４は、延在方向に沿って貫通する図示しない内腔を有し、内腔を構成する内周面に細胞が播種される。また各中空糸３４は、外側と内腔との間を連通する図示しない細孔を複数有し、各細孔は、細胞やタンパク質を透過せず、溶液や低分子の物質を透過する。このため、中空糸３４の内周面の細胞には、細孔を介して培地、所定のガス成分等が供給される。以下、主に中空糸３４の内腔に液体を流通する構成をＩＣ（intra capillary）ともいい、主に中空糸３４の外側に液体を流通する構成をＥＣ（extra capillary）ともいう。
中空糸３４を構成する材料は、特に限定されず、ポリプロピレン、ポリエチレン等のポリオレフィン樹脂、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、再生セルロース等の高分子材料があげられる。
ケース３６は、円筒状に形成され、また硬質性を有している。ケース３６は、複数のチューブ２２に接続される第１ＩＣ端子３６ａ、第２ＩＣ端子３６ｂ、第１ＥＣ端子３６ｃ、第２ＥＣ端子３６ｄを備える。第１ＩＣ端子３６ａは、ケース３６の軸方向一端に設けられ、中空糸３４の内腔に連通している。第２ＩＣ端子３６ｂは、ケース３６の軸方向他端に設けられ、中空糸３４の内腔に連通している。第１ＥＣ端子３６ｃは、ケース３６の側面の他端寄りに設けられ、ケース３６内において中空糸３４の外側の空間に連通している。第２ＥＣ端子３６ｄは、ケース３６の側面の一端寄りに設けられ、ケース３６内において中空糸３４の外側の空間に連通している。
以下、図２を参照して、リアクタ１２と培地貯留部１４との間の流通経路１６、及び流路制御機構部２４の構成について具体的に説明していく。
流通経路１６は、培地貯留部１４に接続される培地送出ルート４０と、培地送出ルート４０から分岐したＩＣ用ルート４２（内部用ルート）及びＥＣ用ルート４４（外部用ルート）とを有する。ＩＣ用ルート４２は、中空糸３４の内腔に液体を供給する経路である。ＥＣ用ルート４４は、中空糸３４の外側のケース３６内に液体を供給する経路である。
培地送出ルート４０には、培地貯留部１４からの培地の供給を開放又は遮断する第１クランプ４０ａが設けられている。
ＩＣ用ルート４２は、リアクタ１２との間で液体を循環可能なＩＣ循環回路４２ａと、培地送出ルート４０からＩＣ循環回路４２ａまで液体を流通可能なＩＣ供給回路４２ｂと、を有する。ＩＣ循環回路４２ａには、液体を循環させるためのＩＣ循環用ポンプ３０ａが設けられている。ＩＣ供給回路４２ｂには、培地送出ルート４０からＩＣ循環回路４２ａに液体を流通させるＩＣ供給用ポンプ３０ｂが設けられている。また図示は省略するが、ＩＣ供給回路４２ｂには、培地貯留部１４の他に、複数のチューブ２２を介して複数の医療用バッグ１８（細胞液バッグ１８Ａ、洗浄液バッグ１８Ｂ、剥離液バッグ１８Ｃ）が接続されている。また、医療用バッグ１８は、用途に応じてバッグを無菌的に接合する無菌接合装置を用いて回収バッグ等と交換してもよい。
ＩＣ循環回路４２ａは、リアクタ１２の第１ＩＣ端子３６ａ及び第２ＩＣ端子３６ｂに接続される。従って、ＩＣ循環回路４２ａを循環する液体が、ＩＣ循環用ポンプ３０ａの動作下に中空糸３４の内腔を流通する。ＩＣ循環回路４２ａにおいてリアクタ１２よりも下流側には、ＩＣ廃液回路４６が接続されている。ＩＣ廃液回路４６には、ＩＣ循環回路４２ａからの液体の排出を開放又は遮断する第２クランプ４６ａが設けられている。ＩＣ廃液回路４６は合流ルート５０に接続され、ＩＣ廃液回路４６を流通した培地が、合流ルート５０のチューブ２２を介して廃液部２０に排出される。
そして、ＩＣ循環回路４２ａは、リアクタ１２よりも液体の流通方向下流側（リアクタ１２とＩＣ廃液回路４６の間）に光学測定部５４を有している。光学測定部５４は、中空糸３４の内腔から流出する培地に対して光学測定を行い、測定結果を制御部３２に送信する。制御部３２は、測定結果に基づき培地に含まれる細胞数を算出することで、培養中の細胞数を管理する。光学測定部５４の具体的な構成については後に詳述する。
一方、ＥＣ用ルート４４は、リアクタ１２との間で液体を循環可能なＥＣ循環回路４４ａと、培地送出ルート４０からＥＣ循環回路４４ａまで液体を流通可能なＥＣ供給回路４４ｂとを有する。ＥＣ循環回路４４ａには、液体を循環させるＥＣ循環用ポンプ３０ｃが設けられている。ＥＣ供給回路４４ｂには、培地送出ルート４０からＥＣ循環回路４４ａに液体を流通させるＥＣ供給用ポンプ３０ｄが設けられている。また図示は省略するが、ＥＣ供給回路４４ｂには、培地貯留部１４の他に、複数のチューブ２２を介して複数の医療用バッグ１８（洗浄液バッグ１８Ｂ、剥離液バッグ１８Ｃ）が接続されている。
ＥＣ循環回路４４ａは、リアクタ１２の第１ＥＣ端子３６ｃ及び第２ＥＣ端子３６ｄに接続される。従って、ＥＣ循環回路４４ａを循環する液体が、ＥＣ循環用ポンプ３０ｃの動作下にケース３６内を流通する。ＥＣ循環回路４４ａにおいてリアクタ１２よりも上流側には、ガス交換器５２が設けられている。ガス交換器５２は、培地に混入している二酸化炭素を排出する一方で、所定のガス成分（窒素Ｎ2：７５％、酸素Ｏ2：２０％、二酸化炭素ＣＯ2：５％）を培地に混合する。ガス交換器５２の構造は、特に限定されず、例えば、リアクタ１２と同様に、複数の中空糸をケース内に備えたものを適用することができる。
ＥＣ循環回路４４ａにおいてリアクタ１２よりも下流側には、ＥＣ廃液回路４８が接続されている。ＥＣ廃液回路４８には、ＥＣ循環回路４４ａからの液体の排出を開放又は遮断する第３クランプ４８ａが設けられている。ＥＣ廃液回路４８は合流ルート５０に接続され、ＥＣ廃液回路４８を流通した培地が、合流ルート５０のチューブ２２を介して廃液部２０に排出される。
また上記したように、リアクタ１２が複数（５つ）設けられる場合に、細胞培養システム１０は、各リアクタ１２に対応してＩＣ循環回路４２ａ、ＥＣ循環回路４４ａを複数備えた構成とすればよい。つまり、ＩＣ供給用ポンプ３０ｂとＩＣ循環回路４２ａとの間の分岐点Ｘ、及びＥＣ供給用ポンプ３０ｄとＥＣ循環回路４４ａとの間の分岐点Ｙに、別のリアクタ１２に液体を循環させる図示しない別のＩＣ循環回路、ＥＣ循環回路が並列接続される。
次に、ＩＣ循環回路４２ａに設けられる光学測定部５４について説明する。光学測定部５４は、リアクタ１２の下流側で培地に含まれる細胞数を、濁度法により測定する。また光学測定部５４は、第１測定光Ｌ１の出射に基づき光学測定を行う第１測定ユニット５６と、第２測定光Ｌ２の出射に基づき光学測定を行う第２測定ユニット５８と、を培地の流通方向の異なる位置に有する。
そして、流通経路１６は、光学測定部５４の構成として、第１測定ユニット５６及び第２測定ユニット５８に配置される測定用容器６０を有する。一方、流路制御機構部２４は、光学測定部５４の構成として、第１測定ユニット５６に設けられる第１測定構造７０と、第２測定ユニット５８に設けられる第２測定構造７１とを備える。
図３Ａ～図３Ｃに示すように、測定用容器６０は、ＩＣ循環回路４２ａを構成するチューブ２２（上流側チューブ２２ａ、下流側チューブ２２ｂ）に接続される。測定用容器６０は、直線状に延在し、且つチューブ２２よりも太い角筒状に形成されている。測定用容器６０の内部には、培地が流通する通路６２が設けられている。通路６２は、測定用容器６０の軸方向（図３Ａの矢印Ａ方向）に沿って延在し、上流側チューブ２２ａ内の流路及び下流側チューブ２２ｂ内の流路に連通している。
測定用容器６０は、第１測定光Ｌ１及び第２測定光Ｌ２が透過するために無色透明又は半透明に形成されている。測定用容器６０は、可撓性を有するチューブ２２よりも硬質（高い弾性率）に形成され、光学測定部５４へ配置した際に弾性変形しないように構成されている。なお、測定用容器６０は、第１測定構造７０や第２測定構造７１に対して密着するように弾性変形可能な軟質性を有してもよい。この場合、測定用容器６０の形状は、角筒状に限定されず、例えば円筒状や円盤状等でもよい。
測定用容器６０は、軸方向に沿って複数の測定用セル（第１セル６４、第２セル６６）を有する。第１セル６４は、測定用容器６０の軸方向略中間位置から一端側（矢印Ａ１側）までの範囲に形成されており、第２セル６６は、測定用容器６０の軸方向略中間位置から他端側（矢印Ａ２側）までの範囲に形成されている。第１セル６４の軸方向長さと第２セル６６の軸方向長さとは、互いに同程度に設定されている。
第１セル６４は、比較的大きな流路断面積及び容積を持つように形成される。第１セル６４は、測定用容器６０の軸方向に直交する断面視で略正方形状を呈し、図３Ｂの矢印Ｂ方向（厚さ方向）に沿った厚みＴ１と、図３Ｂの矢印Ｃ方向（高さ方向）に沿った高さＨ１とが略等しい。
第１セル６４の容器形状に応じて、第１セル６４内には、厚さ方向及び高さ方向に広い第１空間６４ａが形成されている。第１空間６４ａは、測定用容器６０の通路６２の一部を構成する。
第１セル６４の一端側は、上流側チューブ２２ａが接続される円筒状の第１セル側接続部６５ａと、立方形状の本体部分から第１セル側接続部６５ａ（上流側チューブ２２ａ）に向かって徐々に細くなる第１セル側テーパ部６５ｂ（端部側テーパ部）と、を有する。第１セル６４の第１空間６４ａも、第１セル側テーパ部６５ｂの内側においてテーパ状を呈している。
第２セル６６は、第１セル６４よりも小さな流路断面積及び容積を持つように形成される。例えば、第２セル６６の流路断面積は、第１セル６４の流路断面積の１／３～２／３程度の範囲に設定される。第２セル６６は、測定用容器６０の軸方向に直交する断面視で、略長方形状を呈し、図３Ｃの矢印Ｂ方向に沿った厚みＴ２は、第１セル６４の厚みＴ１よりも短い一方で、図３Ｃの矢印Ｃ方向に沿った高さＨ２は、第１セル６４の高さＨ１に一致している。換言すれば、第２セル６６の断面形状は、第１セル６４の断面形状に対して厚さ方向だけが小さくなっている。
第２セル６６の容器形状に応じて、第２セル６６内には、厚さ方向に短い一方で高さ方向に広い第２空間６６ａが設けられている。第２空間６６ａは、測定用容器６０の通路６２の一部を構成する。
第２セル６６の他端側は、下流側チューブ２２ｂが接続される円筒状の第２セル側接続部６７ａと、直方形状の本体部分から第２セル側接続部６７ａ（下流側チューブ２２ｂ）に向かって徐々に細くなる第２セル側テーパ部６７ｂ（端部側テーパ部）と、を有する。第２セル６６の第２空間６６ａも、第２セル側テーパ部６７ｂの内側においてテーパ状を呈している。
第１セル６４と第２セル６６とは、測定用容器６０の軸方向中間位置の流路移行部６８を介して相互に連続している。流路移行部６８を構成する測定用容器６０の厚さ方向の一対の傾斜壁部６９は、第１セル６４から第２セル６６に向かって相互に近づくように傾斜している。つまり流路移行部６８の厚み（不図示）は、一対の第１セル６４の厚みＴ１と第２セル６６の厚みＴ２との間で徐々に変化している。なお、流路移行部６８の高さ（不図示）は、第１セル６４の高さＨ１及び第２セル６６の高さＨ２に一致している。
流路移行部６８の形状に応じて、流路移行部６８の内部には、第１セル６４側から第２セル６６側に向かって幅狭となる移行空間６８ａが設けられている。移行空間６８ａは、測定用容器６０の通路６２の一部を構成する。
上記の測定用容器６０に対応して第１測定構造７０及び第２測定構造７１は、図４に示すように、測定用容器６０を厚さ方向に挟み込む一連のホルダ７２を備える。ホルダ７２は、矢印Ａ方向に沿って延在する配置空間７２ａを有する。配置空間７２ａは、測定用容器６０（又は測定用容器６０に接続されたチューブ２２）を露出するために、ホルダ７２の矢印Ａ方向の両端において開放されている。
ホルダ７２は、第１測定構造７０を構成し第１セル６４を保持する一対の第１保持壁７４と、第２測定構造７１を構成し第２セル６６を保持する一対の第２保持壁７６とを有する。
一対の第１保持壁７４は、第１測定構造７０において配置空間７２ａの厚さ方向に直立する壁部である。一対の第１保持壁７４間の間隔は、第１セル６４の厚みＴ１に一致している。このため、一対の第１保持壁７４は、第１セル６４の配置状態で、適度な摩擦力で第１セル６４を挟持する。第１測定ユニット５６は、一対の第１保持壁７４と、当該一対の第１保持壁７４間に配置された第１セル６４とにより、培地が流通すると共に第１測定光Ｌ１が透過する第１光路部７５を形成している。
一対の第２保持壁７６は、第２測定構造７１において配置空間７２ａの厚さ方向に直立する壁部である。一対の第２保持壁７６間の間隔は、第２セル６６の厚みＴ２に一致している。このため、一対の第２保持壁７６は、第２セル６６の配置状態で、適度な摩擦力で第２セル６６を挟持する。第２測定ユニット５８は、一対の第２保持壁７６と、当該一対の第２保持壁７６に配置された第２セル６６とにより、培地が流通すると共に第２測定光Ｌ２が透過する第２光路部７７を形成している。
そして、第１測定構造７０は、第１セル６４に向けて第１測定光Ｌ１を出射する第１発光部７８と、第１セル６４からの光を受光する第１受光部８０とを有する。
第１発光部７８は、一対の第１保持壁７４のうち一方に設けられ、図示しないレンズを介して配置空間７２ａを臨んでいる。第１発光部７８は、例えば、６６０ｎｍ以上、好ましくは８６０ｎｍ以上の波長からなる第１測定光Ｌ１を出射する。第１発光部７８は、ＬＥＤ、有機ＥＬ、無機ＥＬ、ＬＤ等の１以上の発光素子により構成される。
第１受光部８０は、透過光を受光する１以上の透過光用素子８０ａと、散乱光を受光する１以上の散乱光用素子８０ｂとを含んで構成される。透過光用素子８０ａは、配置空間７２ａを挟んでちょうど第１発光部７８に対向する第１保持壁７４に設けられる。散乱光用素子８０ｂは、例えば、第１発光部７８と同側の第１保持壁７４に設けられる。透過光用素子８０ａ及び散乱光用素子８０ｂは、ＰＤ、ＣＭＯＳ等により構成される。
同様に、第２測定構造７１は、第２セル６６に向けて第２測定光Ｌ２を出射する第２発光部８２と、第２セル６６からの光を受光する第２受光部８４とを有する。
第２発光部８２も、第１発光部７８と同様の発光素子により構成されて、一対の第２保持壁７６のうち一方に設けられ、図示しないレンズを介して配置空間７２ａを臨んでいる。第２発光部８２も、例えば、６６０ｎｍ以上、好ましくは８６０ｎｍ以上の波長からなる第２測定光Ｌ２を出射する。第２測定光Ｌ２の波長は、第１測定光Ｌ１の波長と同じでもよく、異なってもよい。
第２受光部８４も、第１受光部８０と同様に、透過光を受光する１以上の透過光用素子８４ａと、散乱光を受光する１以上の散乱光用素子８４ｂとを含んで構成される。透過光用素子８４ａは、配置空間７２ａを挟んでちょうど第２発光部８２に対向する第２保持壁７６に設けられる。散乱光用素子８４ｂは、例えば、第２発光部８２と同側の第２保持壁７６に設けられる。
すなわち、光学測定部５４は、第１セル６４及び第２セル６６の各透過光（培地に含まれる細胞により吸光された光）と、第１セル６４及び第２セル６６の各散乱光（培地に含まれる細胞が反射した光）とを受光して測定を行う透過光散乱光方式を採用している。なお、光学測定部５４は、透過光散乱光方式に限らず、第１セル６４及び第２セル６６の各透過光のみを受光して測定を行う透過光方式を採用してもよい。又は、第１セル６４及び第２セル６６の各散乱光のみを受光して測定を行う散乱光方式を採用してもよい。
以上の構成からなる第１測定構造７０は、配置状態の第１セル６４に対して第１測定光Ｌ１を出射し、第１セル６４の透過光及び散乱光を受光する。従って、第１光路部７５は、一対の第１保持壁７４の間隔により第１測定光Ｌ１の進行方向に沿った第１光路長ＯＰ１が規定される。この第１光路長ＯＰ１は、一対の第１保持壁７４に挟持された第１セル６４の厚みＴ１に一致している。
また第２測定構造７１は、配置状態の第２セル６６に対して第２測定光Ｌ２を出射し、第２セル６６の透過光及び散乱光を受光する。従って、第２光路部７７は、一対の第２保持壁７６の間隔により第２測定光Ｌ２の進行方向に沿った第２光路長ＯＰ２が規定される。この第２光路長ＯＰ２は、一対の第２保持壁７６に挟持された第２セル６６の厚みＴ２に一致している。
そして、光学測定部５４は、第２光路部７７の第２光路長ＯＰ２よりも第１光路部７５の第１光路長ＯＰ１のほうが長く設定されている（ＯＰ１＞ＯＰ２）。第１光路長ＯＰ１の長さは、例えば、６ｍｍ～２０ｍｍの範囲に設定されるとよい。第２光路長ＯＰ２の長さは、例えば、０．５ｍｍ～３ｍｍの範囲に設定されるとよい。換言すれば、第１光路長ＯＰ１の長さは、２倍～４０倍の範囲であることが好ましい。
そして、第１測定ユニット５６と第２測定ユニット５８は、第１測定光Ｌ１の透過光又は散乱光を受光する第１受光部８０の測定範囲と、第２測定光Ｌ２の透過光又は散乱光を受光する第２受光部８４の測定範囲とが相互に異なるように設定される。すなわち、長い第１光路長ＯＰ１に設けられる第１受光部８０は、培地に含まれる細胞が少ない状態（細胞数が少ない：低濃度の状態：低濁度の状態）に対応している。例えば第１受光部８０の細胞数の測定範囲は１０5～１０7ｃｅｌｌｓ/ｍＬ程度に設定される。一方、短い第２光路長ＯＰ２に設けられる第２受光部８４は、培地に含まれる細胞が多い状態（細胞数が多い：高濃度の状態：高濁度の状態）に対応している。例えば第２受光部８４の細胞数の測定範囲は、１０6～１０8ｃｅｌｌｓ/ｍＬ程度に設定される。そして、細胞培養システム１０は、第１受光部８０の第１測定結果を、細胞数が少ない低濃度時に使用し、第２受光部８４の第２測定結果を、細胞数が多い高濃度時に使用する。これにより、光学測定部５４全体としては細胞数の測定範囲が充分に広くなる。なお、光学測定部５４の測定ユニットは、３以上設けられてもよく、この場合、測定範囲が段階的に異なるように設定されればよい。
また光学測定部５４において、第１発光部７８の第１測定光Ｌ１と、第２発光部８２の第２測定光Ｌ２とは、相互に異なる出射状態（強度、波長等）で出射されてもよい。具体的には、第１発光部７８は、低濃度を測定するために、第１測定光Ｌ１を弱い強度で出射する。これにより第１測定ユニット５６は、適切な強度の第１測定光Ｌ１を培地及び細胞に照射することができる。一方、第２発光部８２は、高濃度を測定するために、第１測定光Ｌ１よりも強い強度で第２測定光Ｌ２を出射する。これにより第２測定ユニット５８は、適切な強度の第２測定光Ｌ２を培地及び細胞に照射することができる。
流路制御機構部２４の制御部３２は、１以上のプロセッサ、メモリ、入出力インタフェースを有するコンピュータにより構成される。制御部３２は、流路制御機構部２４に設けられた操作部９０及び表示部９２に接続されており、ユーザによる操作部９０の操作に基づき流路制御機構部２４の動作内容を設定し、また動作内容やエラー等を表示部９２に表示する。
そして、制御部３２は、光学測定部５４を定期的に制御して光学測定部５４の測定結果を受信することで、リアクタ１２内で培養している細胞数を算出する。例えば、透過光散乱光方式による光学測定において、制御部３２は、透過光用素子８０ａ、８４ａの検出値と、散乱光用素子８０ｂ、８４ｂの検出値との比率に基づき培地の濁度を算出する。さらに制御部３２は、培地の濁度とリアクタ１２の細胞数の関係を示す図示しないマップ情報又は関数を予め保有しており、算出された培地の濁度からリアクタ１２の細胞数を算出する。制御部３２は、算出した細胞数を表示部９２に表示する。
細胞数の算出時に、制御部３２は、第１測定ユニット５６の第１測定結果、第２測定ユニット５８の第２測定結果を選択的に使用する。例えば細胞培養の開始時には、培地に含まれる細胞数が少なく、培地が低濃度（低濁度）となっている。このため、制御部３２は、低濃度の測定範囲を有する第１測定ユニット５６の第１測定結果に基づき細胞数を算出する。この際、制御部３２は、第２測定ユニット５８による測定を実施してもよく、実施しなくてもよい。第２測定ユニット５８により測定した場合に、制御部３２は、その第２測定結果を用いて第１測定結果を補正してもよい。
細胞培養中に細胞数が増えてくると、第１測定ユニット５６の測定範囲では細胞数の測定誤差が大きくなる。そのため制御部３２は、予め設定された図示しない切替閾値以上に細胞数（濁度）が達したことを判定すると、第１測定ユニット５６の第１測定結果の使用から、第２測定ユニット５８の第２測定結果の使用に切り替える。なお、第１測定結果と第２測定結果の切り替えは、算出した細胞数を用いることに限定されず、例えば、培養期間が所定期間経過したことに基づき実施してもよい。この所定期間は、培地の供給量や供給速度等に応じて変動する構成でもよい。
切替後、制御部３２は、高濃度（高濁度）の測定範囲を有する第２測定ユニット５８の第２測定結果に基づき細胞数を算出する。この際、制御部３２は、第１測定ユニット５６による測定を実施してもよく、実施しなくてもよい。第１測定ユニット５６により測定した場合に、制御部３２は、その第１測定結果を用いて第２測定結果を補正してもよい。
本実施形態に係る細胞培養システム１０は、基本的には以上のように構成されるものであり、以下その動作について説明する。
細胞培養システム１０の作業者は、図１に示すように、培養処理の実施前に、培地貯留部１４、複数の医療用バッグ１８、廃液部２０を流路制御機構部２４の筐体２６の外側近傍位置に配置する。また作業者は、リアクタ１２及び流通経路１６を構成する複数のチューブ２２の一部を筐体２６内に適宜セットする。これにより、培地貯留部１４とリアクタ１２の間には図２に示す流通経路１６が構築される。また細胞培養システム１０は、図３Ａ及び図４に示すように、セット時に、流路制御機構部２４のホルダ７２に測定用容器６０が保持される。
上記のセット後、細胞培養システム１０は、培養処理においてプライミング工程、培地置き換え工程、播種工程、培養工程、剥離工程及び回収工程を順次実施する。プライミング工程では、洗浄液バッグ１８Ｂに貯留された洗浄液を、流通経路１６を通してリアクタ１２に供給し、リアクタ１２及び流通経路１６から空気を抜く。培地置き換え工程では、プライミングされた流通経路１６を通して培地貯留部１４からリアクタ１２に培地を供給し、中空糸３４の内外を培地で満たす。播種工程では、細胞液バッグ１８Ａに貯留された細胞液を、ＩＣ用ルート４２を通してリアクタ１２の中空糸３４内に供給し、中空糸３４の内周面に細胞を播種する。
そして図２に示すように、細胞培養システム１０は、培養工程において、ＩＣ用ルート４２及びＥＣ用ルート４４の両方を通して、培地貯留部１４から中空糸３４内に培地を供給し、中空糸３４内で細胞を培養する。この際、ガス交換器５２により、培地には酸素が供給されると共に、培地から二酸化炭素が排出される。培養工程は、他の工程に比べて長期間（例えば数日間）実施されることで、中空糸３４の内周面上に細胞が徐々に増殖していく。なお、細胞培養システム１０は、ＩＣ供給回路４２ｂを経由せずに、ＥＣ用ルート４４を介してリアクタ１２に培地を供給する構成でもよい。ＥＣ用ルート４４を流通してリアクタ１２に流入した培地は、中空糸３４の外側から内側に染み出ることで細胞に供給される。
培養工程において、測定用容器６０の通路６２には、上流側チューブ２２ａから培地が流入する。この培地は、徐々に流路断面積が大きくなる第１セル側テーパ部６５ｂを通って、第１セル６４の本体部分に移動する。第１測定ユニット５６は、この第１セル６４の本体部分において光学測定を実施する。
さらに培地は、第１セル６４から流路移行部６８の移行空間６８ａに向かい、移行空間６８ａにおいて緩やかに集まっていき、移行空間６８ａから第２セル６６の本体部分に移動する。第２測定ユニット５８は、この第２セル６６の本体部分において光学測定を実施する。そして、培地は、第２セル６６から、徐々に流路断面積が小さくなる第２セル側テーパ部６７ｂを通って下流側チューブ２２ｂに流出する。
すなわち、測定用容器６０は、流路断面積が段階的に小さくなる第１セル６４及び第２セル６６を有するが、端部側テーパ部（第１セル側テーパ部６５ｂ、第２セル側テーパ部６７ｂ）や流路移行部６８によって、乱流を抑えて培地を流通させる。光学測定部５４は、第１セル６４の第１空間６４ａ及び第２セル６６の第２空間６６ａにおいて層流となっている培地に光学測定を行なうことで、測定精度が高められる。
流路制御機構部２４の制御部３２は、培養工程及び剥離工程において、図５に示す処理フローに沿って光学測定部５４の測定に基づき培養状態の監視及び制御を行う。詳細には、制御部３２は、培養工程の開始時に、低濃度の培地を測定するために、まず第１測定ユニット５６の第１発光部７８から第１測定光Ｌ１を出射する（ステップＳ１）。これにより第１測定光Ｌ１は、第１光路部７５の第１光路長ＯＰ１を進行し、この際に第１セル６４内の細胞に当たり、吸収又は散乱する。
そのため、第１測定ユニット５６の第１受光部８０は、第１セル６４の透過光及び散乱光を受光して、その検出値である第１測定結果を送信する。制御部３２は、この第１測定ユニット５６の第１測定結果を受信する（ステップＳ２）。そして受信した第１測定結果に基づき、制御部３２は、リアクタ１２内の細胞数を算出し、算出した細胞数を表示部９２に表示する（ステップＳ３）。作業者は、表示部９２に表示された細胞数を確認することで、細胞培養の状態を認識することが可能となる。
また、制御部３２は、算出した細胞数と、保有している切替閾値を比較して、第１測定ユニット５６の測定から第２測定ユニット５８の測定に切り替えるか否かを判定する（ステップＳ４）。細胞数が切替閾値を下回っている場合にはステップＳ１に戻り、同様の処理フローを継続する。一方、細胞数が切替閾値以上となった場合にはステップＳ５に進む。
ステップＳ５において、制御部３２は、高濃度の培地を測定するために、まず第２測定ユニット５８の第２発光部８２から第２測定光Ｌ２を出射する。これにより第２測定光Ｌ２は、第２光路部７７の第２光路長ＯＰ２を進行し、この際に第２セル６６内の細胞に当たり、吸収又は散乱する。
そのため、第２測定ユニット５８の第２受光部８４は、第２セル６６の透過光及び散乱光を受光して、その検出値である第２測定結果を送信し、制御部３２はこの第２測定結果を受信する（ステップＳ６）。制御部３２は、この第２測定結果に基づきリアクタ１２内の細胞数を算出し、算出した細胞数を表示部９２に表示する（ステップＳ７）。
さらに、制御部３２は、算出した細胞数と、保有している回収値とを比較して、培養工程を終了するか否かを判定する（ステップＳ８）。細胞数が回収値を下回っている場合にはステップＳ５に戻り、同様の処理フローを継続する。一方、細胞数が回収値以上となった場合には培養工程を終了し（ステップＳ９）、剥離工程に自動的に移行する。なお、制御部３２は、細胞数が回収値以上となった際に剥離工程の実施をユーザに報知し、ユーザの操作下に剥離工程を実施してもよい。
制御部３２は、剥離工程において、リアクタ１２への培地の流通を一時的に停止して、剥離液バッグ１８Ｃに貯留された剥離液を、ＩＣ用ルート４２を介してリアクタ１２の中空糸３４内に導き、増殖した細胞を剥離する（ステップＳ１０）。さらに制御部３２は、剥離工程後の回収工程においてＩＣ用ルート４２に培地を供給することで、剥離工程において剥離した細胞をリアクタ１２から流出させて図示しない回収バッグに移動させる。
以上の処理フローによって、細胞培養システム１０は、リアクタ１２において培養する細胞の数を、リアルタイム且つ精度よく監視することができる。従って、細胞培養システム１０は、リアクタ１２から細胞を回収すべきタイミングを適切に捉えることができ、目的の細胞数を回収バッグに良好に収容することが可能となる。
本発明は、上記の実施形態に限定されず、発明の要旨に沿って種々の改変が可能である。例えば、上記の実施形態では、測定用容器６０が第１セル６４、第２セル６６の順に培地を流通する構成であったが、培地の流通方向は、第２セル６６、第１セル６４の順であってもよい。また例えば、上記の実施形態では、第１測定ユニット５６と第２測定ユニット５８が互いに隣接する位置に設けられていたが、第１測定ユニット５６と第２測定ユニット５８は相互に離れた位置にあってもよい。従って、測定用容器６０の第１セル６４と第２セル６６も、一連に連続した構成でなく、例えばチューブ２２を介して相互に離れた位置にあってもよい。
さらに、図６に示す変形例のように、光学測定部５４Ａの第１測定ユニット５６及び第２測定ユニット５８は、第１測定光Ｌ１及び第２測定光Ｌ２を出射する発光部１００を共有した構成でもよい。なおこの構成でも、第１測定ユニット５６の第１受光部８０、第２測定ユニット５８の第２受光部８４は別々に設けられる。そのため、発光部１００から出射した測定光は、第１測定ユニット５６の第１測定光Ｌ１として第１受光部８０に受光されると共に、第２測定ユニット５８の第２測定光Ｌ２として第２受光部８４に受光される。
光学測定部５４Ａは、発光部１００から配置空間７２ａに至る第１光路１０２、第２光路１０４を適宜調整することで、第１測定ユニット５６の第１測定光Ｌ１の光強度と、第２測定ユニット５８の第２測定光Ｌ２の光強度とを変えてもよい。例えば図６中に点線で示すように、第１光路１０２に光強度を低減するレンズ１０２ａを設けることで、第２測定光Ｌ２の光強度よりも第１測定光Ｌ１の光強度を小さくしてもよい。
上記の実施形態から把握し得る技術的思想及び効果について以下に記載する。
本発明の一態様は、培地の流通に基づき細胞を培養するリアクタ１２と、リアクタ１２に対して培地を流入及び流出する流通経路１６と、流通経路１６においてリアクタ１２よりも培地の流通方向下流側に設けられ、培地に測定光を照射して培地の状態を光学測定する光学測定部５４と、光学測定部５４、５４Ａの測定結果を処理する処理部（制御部３２）と、を備え、光学測定部５４、５４Ａは、培地の流通方向において互いに異なる位置に配置された第１測定ユニット５６及び第２測定ユニット５８を有し、第１測定ユニット５６は、培地が流通すると共に第１測定光Ｌ１が透過する第１光路部７５を有し、第２測定ユニット５８は、培地が流通すると共に第２測定光Ｌ２が透過する第２光路部７７を有し、第１光路部７５の第１光路長ＯＰ１は、第２光路部７７の第２光路長ＯＰ２よりも長い。
上記によれば、細胞培養システム１０は、流通経路１６においてリアクタ１２よりも培地の流通方向下流側に設けられた光学測定部５４、５４Ａにより、無菌性を確保した状態でリアクタ１２の細胞数を連続的に測定することが可能となる。また、光学測定部５４、５４Ａは、第１光路部７５の第１光路長ＯＰ１が、第２光路部７７の第２光路長ＯＰ２よりも長いことで、第１測定ユニット５６の細胞数の測定範囲と第２測定ユニット５８の細胞数の測定範囲を異ならせることができる。従って、第１測定ユニット５６及び第２測定ユニット５８の各々は、狭い測定範囲の中で精度の高い測定を行うことが可能となり、光学測定部５４、５４Ａは、全体として充分な測定精度を得ることができる。
また、第１光路部７５に配置され培地が流通する第１セル６４と、第２光路部７７に配置され培地が流通する第２セル６６と、を備え、流通経路１６は、第１セル６４及び第２セル６６に接続されるチューブ２２を有し、第１セル６４及び第２セル６６は、チューブ２２よりも硬質に構成される。これら硬質な第１セル６４及び第２セル６６によって、細胞培養システム１０は、第１光路長ＯＰ１及び第２光路長ＯＰ２の培地の流路を安定的に形成することができる。
また、第１セル６４と第２セル６６とは培地の流通方向に沿って相互に連続した１つの容器（測定用容器６０）を構成している。これにより、細胞培養システム１０の作業者は、第１セル６４及び第２セル６６を装置に簡単にセットすることができる。
また、容器（測定用容器６０）は、第１セル６４と第２セル６６の間に、第１セル６４から第２セル６６に向かって培地の流路断面積を徐々に狭める流路移行部６８を有する。これにより、細胞培養システム１０は、第１セル６４と第２セル６６が連続した構成でも、第１セル６４と第２セル６６間の培地の流通状態を安定化させることができる。
また、チューブ２２が接続される第１セル６４の端部及び第２セル６６の端部は、チューブ２２に向かって流路断面積が徐々に小さくなる端部側テーパ部（第１セル側テーパ部６５ｂ、第２セル側テーパ部６７ｂ）を有する。これにより、第１セル６４及び第２セル６６は、培地が流入／流出する際に、培地の乱流を抑制することが可能となる。よって、細胞培養システム１０は、第１セル６４及び第２セル６６に対する光学測定の精度を一層高めることができる。
また、処理部（制御部３２）は、細胞の培養を開始した際に、第１測定ユニット５６の第１測定結果を使用してリアクタ１２の細胞数を算出し、算出した細胞数が所定の切替閾値以上になった場合に、第２測定ユニット５８の第２測定結果を使用してリアクタ１２の細胞数を算出する。これにより、細胞培養システム１０は、リアクタ１２の細胞数の変化を良好に追うことができる。
また、処理部（制御部３２）は、第２測定結果に基づき細胞数が所定の回収値に達した場合に、リアクタ１２への培地の流通を一時的に停止してリアクタ１２の細胞を剥離するための剥離液をリアクタ１２に供給する。これにより、細胞培養システム１０は、リアクタ１２で培養している細胞が目的の細胞数に達した際に、リアクタ１２の細胞をスムーズに回収することができる。
また、第１測定ユニット５６は、第１測定光Ｌ１の透過光を受光すると共に、培地にて第１測定光Ｌ１が散乱した散乱光を受光する第１受光部８０を備え、第２測定ユニット５８は、第２測定光Ｌ２の透過光を受光すると共に、培地にて第２測定光Ｌ２が散乱した散乱光を受光する第２受光部８４を備える。これにより、細胞培養システム１０は、透過光散乱光方式による光学測定を行うことができ、一層精度が高い第１測定結果及び第２測定結果を得るとこができる。
また、第１測定ユニット５６及び第２測定ユニット５８は、第１測定光Ｌ１及び第２測定光Ｌ２を出射する発光部１００を共有している。このように発光部１００を共有することで、光学測定部５４Ａは、構造の簡単化及び低コスト化を図ることができる。
また、第１測定ユニット５６は、第２測定ユニット５８が出射する第２測定光Ｌ２の光強度よりも弱い光強度で第１測定光Ｌ１を出射する。これにより、細胞培養システム１０は、第１測定ユニット５６において低濃度の培地を一層精度よく測定し、また第２測定ユニット５８において高濃度の培地を一層精度よく測定することができる。
Claims (10)
- 培地の流通に基づき細胞を培養するリアクタと、
前記リアクタに対して前記培地を流入及び流出する流通経路と、
前記流通経路において前記リアクタよりも前記培地の流通方向下流側に設けられ、前記培地に測定光を照射して前記培地の状態を光学測定する光学測定部と、
前記光学測定部の測定結果を処理する処理部と、を備え、
前記光学測定部は、前記培地の流通方向において互いに異なる位置に配置された第１測定ユニット及び第２測定ユニットを有し、
前記第１測定ユニットは、前記培地が流通すると共に第１測定光が透過する第１光路部を有し、
前記第２測定ユニットは、前記培地が流通すると共に第２測定光が透過する第２光路部を有し、
前記第１光路部の第１光路長は、前記第２光路部の第２光路長よりも長い
細胞培養システム。 - 請求項１記載の細胞培養システムにおいて、
前記第１光路部に配置され前記培地が流通する第１セルと、前記第２光路部に配置され前記培地が流通する第２セルと、を備え、
前記流通経路は、前記第１セル及び前記第２セルに接続されるチューブを有し、
前記第１セル及び前記第２セルは、前記チューブよりも硬質に構成される
細胞培養システム。 - 請求項２記載の細胞培養システムにおいて、
前記第１セルと前記第２セルとは、前記培地の流通方向に沿って相互に連続した１つの容器を構成している
細胞培養システム。 - 請求項３記載の細胞培養システムにおいて、
前記容器は、前記第１セルと前記第２セルの間に、前記第１セルから前記第２セルに向かって前記培地の流路断面積を徐々に狭める流路移行部を有する
細胞培養システム。 - 請求項２～４のいずれか１項に記載の細胞培養システムにおいて、
前記チューブが接続される前記第１セルの端部及び前記第２セルの端部は、前記チューブに向かって流路断面積が徐々に小さくなる端部側テーパ部を有する
細胞培養システム。 - 請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養システムにおいて、
前記処理部は、
前記細胞の培養を開始した際に、前記第１測定ユニットの第１測定結果を使用して前記リアクタの細胞数を算出し、
算出した細胞数が所定の切替閾値以上になった場合に、前記第２測定ユニットの第２測定結果を使用して前記リアクタの細胞数を算出する
細胞培養システム。 - 請求項６記載の細胞培養システムにおいて、
前記処理部は、
前記第２測定結果に基づき細胞数が所定の回収値に達した場合に、前記リアクタへの前記培地の流通を一時的に停止して前記リアクタの前記細胞を剥離するための剥離液を前記リアクタに供給する
細胞培養システム。 - 請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養システムにおいて、
前記第１測定ユニットは、前記第１測定光の透過光を受光すると共に、前記培地にて前記第１測定光が散乱した散乱光を受光する第１受光部を備え、
前記第２測定ユニットは、前記第２測定光の透過光を受光すると共に、前記培地にて前記第２測定光が散乱した散乱光を受光する第２受光部を備える
細胞培養システム。 - 請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞培養システムにおいて、
前記第１測定ユニット及び前記第２測定ユニットは、前記第１測定光及び前記第２測定光を出射する発光部を共有している
細胞培養システム。 - 請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞培養システムにおいて、
前記第１測定ユニットは、前記第２測定ユニットが出射する前記第２測定光の光強度よりも弱い光強度で前記第１測定光を出射する
細胞培養システム。
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