JP2020171235A

JP2020171235A - 細胞培養装置及びバイオリアクタ

Info

Publication number: JP2020171235A
Application number: JP2019075320A
Authority: JP
Inventors: 圭一杉浦; Keiichi Sugiura
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2020-10-22

Abstract

【課題】流路の回路構成を簡略化できる細胞培養装置及びバイオリアクタを提供する。【解決手段】中空糸２１を有するバイオリアクタ１２と、中空糸２１の内側を通る経路で培養液１９を循環させる循環流路１８と、循環流路１８の一端に接続され循環流路に培養液１９を供給する培地供給部１４と、循環流路１８の他端に接続され循環流路１８から排出される培養液１９を回収する回収部１６と、を備えた細胞培養装置１０において、バイオリアクタ１２は、中空糸２１をガス通過性を有する均質膜とし、中空糸２１の外側の領域にガスを流通させるガス流路２２を設けた。【選択図】図１

Description

本発明は、中空糸内で細胞の培養を行う細胞培養装置及びバイオリアクタに関する。

近年、生体組織から採取した細胞を生体外で培養し、必要な細胞数まで増幅した後、治療に使用する細胞療法に注目が集まっている。このような細胞の培養には、従来よりフラスコを用いる培養方法が知られているが、複雑な操作が必要であり、多くの人手を要するという問題がある。

そこで、より省力的に細胞を培養すべく、中空糸膜を用いたバイオリアクタ（中空糸型バイオリアクタ）内で細胞の培養を行う細胞培養装置が提案されている。例えば、特許文献１には、中空糸内を経る流路（ＩＣループとも呼ぶ）を循環する培養液（細胞培養培地）に細胞を播種し、中空糸の外側を経る流路（ＥＣループとも呼ぶ）内の培養液を介して、ＩＣループ内の培養液に細胞の増殖に必要な酸素等のガス成分を供給する細胞培養装置が記載されている。

特表２０１６−５３７００１号公報

上記の細胞培養装置では、バイオリアクタの中空糸膜に、微細な孔が設けられた多孔質の親水性樹脂膜が用いられている。このような多孔質の親水性樹脂膜は、液相−液相間の物質輸送特性に優れており、液相−液相間の物質交換によって、細胞に必要とされる養分や酸素等のガス成分の供給を行うようになっている。

一方で、多孔質の親水性樹脂膜よりなる中空糸膜が気体と接触すると、液体成分が流出してしまうため、バイオリアクタに直接ガス成分を供給することができない。そのため、ＥＣループを流れる溶液に酸素等のガス成分を供給するためのガス交換ユニットが別途設けられている。このようなガス交換ユニットには、疎水性の多孔質樹脂等よりなる中空糸膜が用いられている。

このように、従来の細胞培養装置では、バイオリアクタを構成する中空糸膜の他にＥＣループ内の液体にガス成分を供給するガス交換ユニットが必要であり装置構成が複雑となっている。

そこで、本発明は、流路の回路構成を簡略化できる細胞培養装置及びバイオリアクタを提供することを目的とする。

本発明の一観点は、中空糸を有するバイオリアクタと、前記中空糸の内腔が形成する流路を通る経路で培養液を循環させる循環流路と、前記循環流路の一端に接続され前記循環流路に前記培養液を供給する培地供給部と、前記循環流路の他端に接続され前記循環流路から排出される前記培養液を回収する回収部と、を備え、前記バイオリアクタにおいて、前記中空糸はガス通過性を有する均質膜よりなり、前記中空糸の外側の領域にガスを流通させるガス流路が設けられている、細胞培養装置にある。

本発明の別の一観点は、上記観点の細胞培養装置に使用されるバイオリアクタであって、前記中空糸はガス通過性を有する均質膜よりなり、前記中空糸の外側の領域にガスを流通させるガス流路が設けられている、バイオリアクタにある。

上記観点の細胞培養装置及びバイオリアクタによれば、バイオリアクタの中空糸膜を介して、循環流路（ＩＣループ）の培養液にガス成分が直接供給される。これにより、バイオリアクタの中空糸膜の外側を流れる液体の流路であるＥＣループが不要となり、細胞培養装置の流路の回路構成が簡略化される。

本発明の実施形態に係る細胞培養装置の概略構成図である。図１のバイオリアクタの断面図である。図２の中空糸膜の断面模式図である。

以下、本発明の好適な実施形態を挙げ、添付の図面を参照して詳細に説明する。

（第１の実施形態）
本実施形態の細胞培養装置１０は、図１に示すように、循環流路１８（ＩＣループともいう）を有する。循環流路１８は、細胞の成長に必要な栄養素、成長因子及びホルモン等を含んだ培養液１９（細胞培養培地）が循環する流路であり、その循環流路１８には、培養対象とする細胞が注射器等を介して播種される。

循環流路１８には、細胞の代謝に必要とされるガス成分（例えば、酸素）の供給及び細胞の代謝に伴って生じたガス成分（例えば、二酸化炭素）の排出を行うために、その経路上にバイオリアクタ１２が設けられている。バイオリアクタ１２は、入口ポート２４及び出口ポート２６を有している。循環流路１８を流れる培養液１９は、入口ポート２４からバイオリアクタ１２の内部に導入され、その内部に配置された中空糸２１（図２参照）の内部の中空部２０（図３参照）を通る。そして、培養液１９はバイオリアクタ１２の出口ポート２６を通じてバイオリアクタ１２の外に流出する。また、循環流路１８には、循環流路１８内を流れる液体の流量を調整するべく、第１流量コントローラ３４が設けられている。

循環流路１８の一端には、培地供給路４０を介して培地供給部１４が接続されている。培地供給部１４は、例えば培養液１９を収容したバッグとして構成されており、細胞の培養に必要な量の培養液１９を収容する。培地供給路４０には、循環流路１８へ流れ込む培養液１９の流量を調整するべく、第２流量コントローラ３２が設けられている。培養液１９は、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩及びグルコース等の炭素源に血清を加え、所定のｐｈ値及び浸透圧に調整された基本培地である。また、培養液１９は、基本培地の血清の一部又は全部を、他の栄養素、動物由来の因子及びホルモン等で置き換えた低血清培地又は無血清培地であってもよい。

循環流路１８の他端には、排出流路４２を介して回収部１６が接続されている。排出流路４２は、バイオリアクタ１２を挟んで培地供給路４０の下流側に配置される。回収部１６は、例えば樹脂バッグ等の容器として構成されており、循環流路１８から排出された培養液１９を収容するように構成されている。排出流路４２には、循環流路１８から排出される培養液１９の流量を調整するべく、第３流量コントローラ４４が設けられている。このように、循環流路１８には、培地供給部１４を介して培養液１９が供給され、排出流路４２を介して培養液１９が排出される。また、バイオリアクタ１２で培養された細胞は、培養液１９とともに、回収部１６に取り付けられた収穫用バッグに回収される。

第１流量コントローラ３４、第２流量コントローラ３２及び第３流量コントローラ４４としては、ポンプ、バルブ、クランプ又はそれらの組み合わせで構成される。ポンプは、例えば、可撓性の管の圧縮部分を流路方向に移動させることで流体を送り出す蠕動ポンプ等を用いることもできる。

バイオリアクタ１２には、ガス導入ポート２８とガス排出ポート３０とが設けられている。ガス導入ポート２８及びガス排出ポート３０は、バイオリアクタ１２の内部の中空糸２１の外側の空間に連通している。ガス導入ポート２８には、ガス供給部３６が接続されており、ガス供給部３６から供給される酸素及び二酸化炭素を含むガスが供給される。ガス排出ポート３０は、排気口３８に連通しており、バイオリアクタ１２を通ったガスが排気される。

図２に示すように、バイオリアクタ１２は、中空糸２１を収容するリアクターハウジング５０と、リアクターハウジング５０の入口側に設けられた入口側ハウジング５２とリアクターハウジング５０の出口側に設けられた出口側ハウジング５４とを備える。リアクターハウジング５０は、筒状に形成されており、その内部に複数の中空糸２１を束ねた状態で収容する。リアクターハウジング５０は入口側及び出口側に開口しており、その入口側の開口は入口側ハウジング５２で覆われ、出口側の開口は出口側ハウジング５４で覆われている。入口側ハウジング５２には、入口ポート２４が形成され、出口側ハウジング５４には出口ポート２６が形成されている。また、リアクターハウジング５０の入口側の側部にはガス導入ポート２８が形成され、リアクターハウジング５０の出口側の側部にはガス排出ポート３０が形成されている。

中空糸２１は、接続部材５６を介してリアクターハウジング５０の側部に接合されている。接続部材５６は、リアクターハウジング５０の入口側と出口側とにそれぞれ設けられている。接続部材５６は、複数の中空糸２１を結束する結束材又は複数の中空糸２１を束ねて接合する接着剤よりなる。これらの接続部材５６によって、中空糸２１の外側の空間が、入口側ハウジング５２と出口側ハウジング５４から気密（及び液密）に隔離される。中空糸２１の外側の空間は、ガス導入ポート２８及びガス排出ポート３０と連通しており、ガス流路２２を構成する。入口ポート２４から導入された培養液１９は、接続部材５６によって、中空糸２１の中空部２０に導かれる。

中空糸２１は、接続部材５６を貫通し、中空糸２１の中空部２０は入口側ハウジング５２と出口側ハウジング５４とに開口している。中空糸２１は、図３に示すように、円筒状の断面形状に形成された中空糸膜によって構成されてなる。中空糸２１は、入口ポート２４から出口ポート２６に向けて液体が流通可能な内径に形成された空洞部を有している。その中空糸２１を構成する中空糸膜の壁厚は、酸素や二酸化炭素等のガス成分が拡散するのに十分な膜厚に形成されている。中空糸２１は、例えば、外径が１００μｍ〜１００００μｍであり、壁厚は１０μｍ〜１００μｍ程度とすることができる。バイオリアクタ１２内には、このような糸状の中空糸２１が数百本〜数万本束ねられて収容されている。

中空糸２１を構成する中空糸膜は、ガス透過性を有する疎水性樹脂の均質膜よりなる。具体的には、例えば、シリコーンゴム（ポリジメチルシロキサン）製の均質膜よりなる中空糸を用いることができる。ここで、均質膜とは、膜に微細な孔が形成されておらず、中空糸膜を構成する分子レベルの隙間（例えば、１０ｎｍ以下）を通じて物質交換を行う膜である。中空糸膜は、従来のバイオリアクタ用の中空糸膜と異なり、孔が形成されておらず、水分、糖類、有機酸、イオン成分、タンパク質等は通過せずに、中空糸膜の内部に保持される。その一方で、酸素（Ｏ₂）や二酸化炭素（ＣＯ₂）等のガス成分は、中空糸膜に溶解し、高分子鎖の熱運動によって生じる隙間を縫って通過することができる。その結果、ガス流路２２を流れるガスと、中空糸２１内を流れる培養液１９のガス成分濃度との間でガス成分の交換が行われる。

図１に示すように、バイオリアクタ１２及び循環流路１８は、細胞の培養に最適な環境とするべく、ＣＯ₂インキュベータ４６内に配置される。ＣＯ₂インキュベータ４６は、循環流路１８及びバイオリアクタ１２を所定の温度に維持するとともに、体内のＣＯ₂濃度に近づけるべく高濃度のＣＯ₂を含む雰囲気ガスを供給する。ガス供給部３６は、ＣＯ₂インキュベータ４６内の雰囲気ガスを取り込むポンプと雰囲気ガス中の異物を除去するフィルタとを備えて構成される。なお、ガス供給部３６は、培養環境に応じたガスを封入したガスボンベで構成してもよい。

上記の細胞培養装置１０は、バイオリアクタ１２の中空糸膜の内面に付着して成長する付着性細胞の培養に用いることができる。また、中空糸膜に付着せずに、培養液１９中に浮遊したまま成長する浮遊性細胞の培養にも用いることができる。細胞培養装置１０は、例えば、幹細胞（間葉細胞、造血細胞等）、繊維芽細胞、角化細胞、前駆細胞、内皮細胞、及び完全分化細胞等の増殖にも使用することができる。

以下、本実施形態の細胞培養装置１０の作用について説明する。

細胞培養装置１０で細胞培養を行う際には、循環流路１８に培地供給路４０を介して、培地供給部１４から培養液１９が供給され、バイオリアクタ１２を含む循環流路１８が培養液１９で満たされる。

その後、バイオリアクタ１２に細胞が播種される。接着性細胞の培養を行う場合には、バイオリアクタ１２の中空糸２１に細胞を付着させる操作を行ってもよい。

次に、循環流路１８内の培養液１９を所定の流量で循環させつつ、細胞の培養を行う。培養液１９の流量は、第１流量コントローラ３４によって制御される。また、バイオリアクタ１２において、ガス導入ポート２８を通じて、中空糸２１の外側のガス流路２２に酸素及び二酸化炭素を含むガスが供給される。これにより、中空糸２１において、外側のガス（気相）と内側の培養液１９（液相）との間でガス成分の交換が行われ、培養液１９中のガス成分の濃度が外側のガスと平衡となり、酸素の供給及び二酸化炭素の排出が行われる。

本実施形態の中空糸２１を構成する中空糸膜には、シリコーン樹脂よりなるため、均質膜であってもガス交換性に優れ、中空糸膜を介して直接ガス成分を培養液１９に供給することができる。また、中空糸膜が均質膜よりなるため、培養液１９から水分、糖類、有機酸、イオン成分、タンパク質等が流出することはなく、循環流路１８内に保持される。

その後、バイオリアクタ１２及び循環流路１８内の培養液１９が、排出流路４２を介して回収部１６に流し込まれ、培養液１９とともに培養された細胞が回収部１６に回収される。なお、接着性細胞を回収する場合には、培養液１９にトリプシン等を添加して中空糸２１の表面から細胞を剥離させる処理を行った後、培養液１９とともに回収部１６に細胞を回収してもよい。

本実施形態の細胞培養装置１０は以下の効果を奏する。

上記の細胞培養装置１０は、中空糸２１を収容したバイオリアクタ１２を備えており、中空糸２１はガス通過性を有する均質膜よりなる中空糸膜からなり、中空糸２１の外側の領域にはガスを流通させるガス流路２２を有している。これにより、バイオリアクタ１２の中空糸２１を介して直接ガス成分を培養液１９に供給することができる。その結果、細胞培養装置１０にガス交換ユニットを設ける必要がなくなるため、流路構成が簡略化され、細胞培養装置１０を小型化及び省スペース化できる。また、流路構成の簡略化に伴って、細胞培養装置１０の導入コストを抑制できるとともに、ガス交換ユニット周りの消耗品のコストも不要となるため、ランニングコストも削減できる。さらに、中空糸２１の外側を循環するＥＣループの制御が不要となるため、ユーザの負担が軽減され、さらなる省力化を図ることができる。

細胞培養装置１０において、中空糸２１はシリコーン樹脂の均質膜よりなり、中空糸２１内を流れる液体の培養液１９と、中空糸２１の外側を流れるガスとの間でガス成分の物質交換を行うものであってもよい。中空糸膜にシリコーン樹脂の均質膜を用いることにより、酸素や二酸化炭素といった細胞の代謝に関わるガス成分を効率よく交換することができる。そのため、バイオリアクタ１２を小型化できる。また、この中空糸膜によれば、ガス成分の交換の際に培養液１９の水分や基質の漏えいが発生しないため、循環流路１８内の環境を一定に保つことが容易となる。

細胞培養装置１０において、バイオリアクタ１２で交換されるガス成分は、酸素及び二酸化炭素を含んでいてもよい。これにより、中空糸２１を介して、細胞の代謝に必要とされる酸素の供給及び細胞の代謝で排出される二酸化炭素の排出を行うことができる。

細胞培養装置１０において、循環流路１８には、中空糸２１の表面に付着して培養される接着性細胞、又は、中空糸２１の表面に付着せずに培養液１９とともに流動しつつ培養される非接着性細胞、が播種されてもよい。本実施形態の細胞培養装置１０は、接着性細胞及び非接着性細胞の培養に用いることができる。

上記において、本発明について好適な実施形態を挙げて説明したが、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の改変が可能なことは言うまでもない。

１０…細胞培養装置１２…バイオリアクタ
１４…培地供給部１６…回収部
１８…循環流路１９…培養液
２１…中空糸２２…ガス流路
４６…ＣＯ₂インキュベータ

Claims

中空糸を有するバイオリアクタと、
前記中空糸の内腔が形成する流路を通る経路で培養液を循環させる循環流路と、
前記循環流路の一端に接続され前記循環流路に前記培養液を供給する培地供給部と、
前記循環流路の他端に接続され前記循環流路から排出される前記培養液を回収する回収部と、を備え、
前記バイオリアクタにおいて、前記中空糸はガス通過性を有する均質膜よりなり、前記中空糸の外側の領域にガスを流通させるガス流路が設けられている、細胞培養装置。
請求項１記載の細胞培養装置であって、前記中空糸はシリコーン樹脂の均質膜よりなり、前記中空糸内を流れる前記培養液と、前記中空糸の外側を流れるガスとの間でガス成分の物質交換を行う、細胞培養装置。
請求項１又は２記載の細胞培養装置であって、前記ガスは、酸素及び二酸化炭素を含む、細胞培養装置。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養装置であって、前記循環流路には、前記中空糸の表面に付着して培養される接着性細胞、又は、前記中空糸の表面に付着せずに前記培養液とともに流動しつつ培養される非接着性細胞、が播種される、細胞培養装置。
中空糸を有するバイオリアクタと、前記中空糸の内腔が形成する流路を通る経路で培養液を循環させる循環流路と、前記循環流路の一端に接続され前記循環流路に前記培養液を供給する培地供給部と、前記循環流路の他端に接続され前記循環流路から排出される前記培養液を回収する回収部と、を備えた細胞培養装置に使用されるバイオリアクタであって、
前記中空糸はガス通過性を有する均質膜よりなり、前記中空糸の外側の領域にガスを流通させるガス流路が設けられている、バイオリアクタ。