JP2024075665A - 認知症の予防、緩和および/または治療のためのシステムならびに方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】認知症またはアルツハイマー病を治療するためのデバイス、システムおよび方法を提供する。【解決手段】一つの例において、約20Hz~約60Hz、より具体的には約40Hzの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが当該対象に非侵襲的に送達され、当該対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導する。特に様々な治療プロトコールおよび暴露プロトコールに従い、聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせは、(聴覚刺激単独または視覚刺激単独とは対照的に)内側前頭前皮質(mPFC)中のミクログリア反応を促進する。概して、聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせは、聴覚皮質、視覚皮質およびmPFC中で拡張されたミクログリアクラスター形成反応を誘導する。【選択図】図7-7
Description
関連出願の相互参照
本出願は、以下の米国仮特許出願明細書のそれぞれに対する優先権を主張する。2017年10月10日に出願され、「NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF COMBINED SENSORY STIMULATION」(代理人整理番号 MITX-9699/00US)という表題の米国仮特許出願第62/570,250号明細書;および2017年10月11日に出願され、「GAMMA ENTRAINMENT BINDS HIGHER ORDER BRAIN REGIONS AND OFFERS NEUROPROTECTION」(代理人整理番号 MITX-0070/00US)という表題の米国仮特許出願第62/570,929号明細書。これらの各仮特許出願明細書は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
本出願は、以下の米国仮特許出願明細書のそれぞれに対する優先権を主張する。2017年10月10日に出願され、「NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF COMBINED SENSORY STIMULATION」(代理人整理番号 MITX-9699/00US)という表題の米国仮特許出願第62/570,250号明細書;および2017年10月11日に出願され、「GAMMA ENTRAINMENT BINDS HIGHER ORDER BRAIN REGIONS AND OFFERS NEUROPROTECTION」(代理人整理番号 MITX-0070/00US)という表題の米国仮特許出願第62/570,929号明細書。これらの各仮特許出願明細書は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
政府の支援に関する表明
本発明は、国立衛生研究所により与えられたグラント番号RF1 AG047661に基づく米国政府の支援により行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により与えられたグラント番号RF1 AG047661に基づく米国政府の支援により行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
アルツハイマー病(AD)は、記憶、見当識および論理的思考の低下を特徴とする進行性の神経変性疾患である。アルツハイマー病は、世界で最も普遍的な認知症であり、米国においては65歳を超える人々のおよそ8人に1人が罹患し、第6位の死亡原因となっている。この進行性の神経変性障害の罹患率は、今後10年間で40%増加すると推定されている。
病理組織学的には、ADはアミロイドプラークの蓄積が特徴であり、アミロイドプラークにはアミロイド-β(Aβ)ペプチドと、タウタンパク質から生成される神経原線維変化(NFT:neurofibrillary tangles)が含まれる。Aβペプチドは36~43アミノ酸のタンパク質であり、その正常な生理学的機能はまだ特定されていない。Aβペプチドは、β-セクレターゼ1(BACE1:β-secretase
1)とγ-セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質(APP:amyloid
precursor protein)の連続的なタンパク質切断によって形成される。C末端断片β(β-CTF:C-terminal fragment β)は、BACE1によるAPPのアミロイド生成切断の間に生成されるAPP誘導体であり、Aβペプチド産生のもう一つの指標である。正常な状態では、可溶性のAβペプチドが産生され、ニューロンによって分泌される。その後は脳脊髄液(CSF:cerebral spinal fluid)経路を介して脳から除去される。しかしながらADを有する対象では、Aβペプチドは高次型へと凝集し、濃度依存性に可溶性のオリゴマーと不溶性のプラークを形成すると考えられる。この凝集は多くの神経毒性現象をもたらす可能性があり、当該現象としては脳代謝の混乱、神経炎症、機能的結合性の低下、シナプスとニューロンの喪失、および/またはNFTの形成が挙げられる。
1)とγ-セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質(APP:amyloid
precursor protein)の連続的なタンパク質切断によって形成される。C末端断片β(β-CTF:C-terminal fragment β)は、BACE1によるAPPのアミロイド生成切断の間に生成されるAPP誘導体であり、Aβペプチド産生のもう一つの指標である。正常な状態では、可溶性のAβペプチドが産生され、ニューロンによって分泌される。その後は脳脊髄液(CSF:cerebral spinal fluid)経路を介して脳から除去される。しかしながらADを有する対象では、Aβペプチドは高次型へと凝集し、濃度依存性に可溶性のオリゴマーと不溶性のプラークを形成すると考えられる。この凝集は多くの神経毒性現象をもたらす可能性があり、当該現象としては脳代謝の混乱、神経炎症、機能的結合性の低下、シナプスとニューロンの喪失、および/またはNFTの形成が挙げられる。
Aβ濃度とニューロン活動の間の根本的な関連性が報告されている。第一に、APPを過剰発現するトランスジェニック(Tg:transgenic)マウスから調製された器官型の海馬切片に、テトロドトキシンを用いた処置を行うと、ニューロン活動が低下し、その後にAβレベルが低下した。次いでピクロトキシンで処置することで反対の作用-ニューロン活動の上昇-が観察された。ニューロン活動を使用したAβペプチド濃度の動的調節と、インビボでの最終的なプラーク沈着も実証されている。ヒトAD患者の神経画
像撮影により、最も重度のプラーク沈着は「デフォルト-モードネットワーク」として知られる最も一貫して活動的な脳の領域に沿っている可能性が示されている。
像撮影により、最も重度のプラーク沈着は「デフォルト-モードネットワーク」として知られる最も一貫して活動的な脳の領域に沿っている可能性が示されている。
現在ADには治療法がなく、治療選択肢はADの病態進行を阻害するものではなく、主には一時的な緩和であり、および/または複数の厄介な副作用がある場合がある。例えば、Aβペプチドおよび/またはその前駆体を標的とする予防的、および/または治療的な戦略(例えば、Aβの免疫療法ならびにβ-およびγ-セクレターゼの阻害)は臨床試験で毒性があり、および/またはAD病変の減少に効果がなかった。アミロイドベータワクチン(例えば、バピニューズマブ(bapineuzumab))を含む臨床試験は、認知機能の利益が無く、失敗に終わった。ガンマ-セクレターゼ阻害剤(例えば、セマガセスタット(semagacestat))は臨床試験に失敗し、被験者の認知障害を悪化させた。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤(例えば、ドネペジル(donepezil)およびリバスチグミン(rivastigmine))およびN-メチル-D-アスパラギン酸塩(NMDA)-受容体アンタゴニスト(例えば、メマンチン(memantine))といった既存の薬剤でさえ、軽度の認知機能の利益を実証したのみである。
2016年11月23日に出願された「SYSTEMS AND METHODS FOR PREVENTING,MITIGATING,AND/OR TREATING
DEMENTIA」という表題の米国特許出願第15/360,637号(その全体の参照により本明細書に組み込まれる)に開示されるように、視覚刺激または聴覚刺激を通して脳に同期化ガンマ振動を誘導することにより、一部の脳領域においてアミロイド負荷量の低下と形態変化が生じた。しかし発明者らは、学習と記憶、そして他の高次脳機能の大部分を担う複数の脳中枢に影響を与える多種回路性(circuit-wide)の疾患に対処する、認知症およびアルツハイマー病の治療のためのシステムならびに方法が未だ必要とされていることを認識し、理解している。
DEMENTIA」という表題の米国特許出願第15/360,637号(その全体の参照により本明細書に組み込まれる)に開示されるように、視覚刺激または聴覚刺激を通して脳に同期化ガンマ振動を誘導することにより、一部の脳領域においてアミロイド負荷量の低下と形態変化が生じた。しかし発明者らは、学習と記憶、そして他の高次脳機能の大部分を担う複数の脳中枢に影響を与える多種回路性(circuit-wide)の疾患に対処する、認知症およびアルツハイマー病の治療のためのシステムならびに方法が未だ必要とされていることを認識し、理解している。
前述の観点において、本開示は少なくとも部分的には、本明細書において概して「感覚刺激を使用したガンマエントレインメント」(GENUS:Gamma ENtrainment Using Sensory stimuli)と呼称される様々な技術に従い、対象の脳にガンマ振動を誘導する聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせに関するものである。本明細書に開示されるように、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせ(例えば視覚GENUSおよび聴覚GENUSの組み合わせ)は予想外なことに、視覚GENUS単独または聴覚GENUS単独では観察されなかったポジティブな生理学的変化および行動学的変化を生じさせた。聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせから生じる脳へのポジティブな効果は、聴覚皮質(AC:auditory cortex)および海馬(HPC:hippocampus)に限定されておらず、特に内側前頭前皮質(mPFC:medial prefrontal cortex)におけるミクログリアのクラスター形成反応の誘導と、新皮質全体のアミロイド負荷量の減少へと拡張されていた。聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせの効果はさらに治療/暴露の短期間のフレームを超えて観察されている(週単位)。
一つの態様において、本開示は、その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するためのデバイス、方法およびシステムを提供するものであり、当該方法は、当該対象に、約20Hz~約60Hzの周波数を有する聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせを非侵襲的に送達し、当該対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。一部の実施形態では、認知症は、AD、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、および/または加齢に伴う認知低下に関連する。対象は、ヒトまたは動物であってもよい。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせ約35Hz~約45Hzの周波数、または約40Hzの周波数を有する。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達は、聴覚皮質(AC)、視覚皮質(VC)、海馬(HPC)および内側前頭前皮質(mPFC)から選択される少なくとも一つの皮質領域の5%以上の記録部位に、周期的なスパイク反応を誘導する。一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、mPFCにおいて約40Hzの局所電場電位(LFP:local field potential)を誘導する。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、少なくとも一つの皮質領域においてミクログリア反応を増加させる。皮質領域は、新皮質、AC、VC、HPCおよびmPFCを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、mPFCにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、アミロイドプラークの25マイクロメートル以内のミクログリア数の増加、ミクログリアの細胞体の直径の増加、ミクログリアの突起長の減少、およびミクログリアの細胞数の増加、から選択される少なくとも一つの効果を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞体の直径における、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の増加を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの突起長における、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の減少を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞数における、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の増加を含む。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイドプラークの減少を含む。皮質領域は、新皮質、AC、VC、HPCおよびmPFCを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、mPFCにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの大きさの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60%の減少を含む。ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの数の少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60%の減少を含む。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイド-β(Aβ)ペプチド量の減少を含む。皮質領域は、新皮質、AC、VC、HPCおよびmPFCを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、mPFC
において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
ある実施形態では、Aβペプチド量の減少は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60%の量の減少を含む。一部の実施形態では、Aβペプチドは、Aβ1 40ペプチドアイソフォームと、Aβ1-42ペプチドアイソフォームのうちの少なくとも一つを含む。一部の実施形態では、Aβペプチドは、可溶性Aβペプチドと、不溶性Aβペプチドのうちの少なくとも一つを含む。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
第二の態様において、本開示は、その必要のある対象における認知症またはアルツハイマー病の治療方法を提供し、当該方法は、約35Hz~約45Hzの周波数の視覚刺激を発する少なくとも一つの視覚刺激装置を制御する工程、電気音声シグナルを、約35Hz~約45Hzの周波数の対応する聴覚刺激へと転換する少なくとも一つの電気音響変換器を制御する工程、および当該対象に組み合わせ刺激を非侵襲的に送達する工程を含み、当該組み合わせ刺激は、同期して並んだ視覚刺激と音刺激を含み、当該組み合わせ刺激は、当該対象の少なくとも一つの脳領域に同期化ガンマ振動を誘導する。同期化ガンマ振動は、当該対象において認知機能の改善を生じさせる。
一部の実施形態では、視覚刺激は、12.5ミリ秒の点灯と、次いで12.5ミリ秒の消灯の反復を含む。一部の実施形態では、光生成(optogenetic)刺激装置は、40~80Wの電力の発光ダイオードである。一部の実施形態では、聴覚刺激は、約4%~約80%の負荷サイクルで40Hzで再生される10kHzの音調(tone)を含む。一部の実施形態では、視覚刺激は、約10%~約80%の負荷サイクルで10秒間、40Hzで明滅される光を含む。
一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は同期化される。一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は、-180~0度または0~180度位相がずれている。
当然のことながら、前述の概念および以下でより詳細に考察する追加的概念のすべての組み合わせは(このような概念は相互に矛盾していないという前提で)、本明細書に開示する本発明の主題の一部であると考えられる。特に、本開示の最後に現れる、特許請求の範囲に記載する主題のすべての組み合わせは、本明細書に開示する発明主題の一部であると考えられる。また当然のことながら、参照により組み込まれるあらゆる開示において明示的に用いられる用語には、本明細書に開示する特定の概念と最も一致する意味を与える必要がある。
以下の図表および詳細な記載を検討すると、他のシステム、プロセス、および特徴が当業者に明らかとなるであろう。このようなさらなるシステム、プロセス、および特徴すべてが、本記載内に含まれ、本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
特許または出願ファイルには、色付きで作成された少なくとも一つの図面が包含されている。
当業者であれば、図面が主として例示的な目的であること、そして本明細書に記載する
本発明の主題の範囲を制限することを意図していないことを理解するだろう。図面は必ずしも一定の比率ではなく、一部の例では、本明細書に開示する本発明の主題の様々な態様は、異なる特徴の理解を容易にするために、図面内で誇張または拡大されて示されうる。図面では、同様の参照文字は概して、例えば同様の特徴(例えば、機能的に類似した、および/または構造的に類似した要素)を意味する。
本発明の主題の範囲を制限することを意図していないことを理解するだろう。図面は必ずしも一定の比率ではなく、一部の例では、本明細書に開示する本発明の主題の様々な態様は、異なる特徴の理解を容易にするために、図面内で誇張または拡大されて示されうる。図面では、同様の参照文字は概して、例えば同様の特徴(例えば、機能的に類似した、および/または構造的に類似した要素)を意味する。
聴覚および視覚の感覚刺激を使用したガンマエントレインメント(GENUS)の組み合わせは、予想外なことに、視覚GENUSまたは聴覚GENUSの単独では観察されなかったポジティブな生理学的および行動学的な変化を生じさせる。脳に対するポジティブな効果は、聴覚皮質(AC)および海馬(HPC)に限定されておらず、むしろ内側前頭前皮質(mPFC)におけるミクログリアのクラスター形成反応の誘導と、新皮質全体のアミロイド負荷量の減少へと拡張されていた。聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせの効果はさらに短期間のフレームを超えて観察されている(週単位)。約1週間の聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせにより、大規模回路ネットワークに及ぶ脳領域においてアルツハイマー病(AD)の病変が改善される。特に聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせは、AC、視覚皮質(VC)、海馬小領域(hippocampal subregion)CA1、およびmPFCにおいて、大規模なアミロイド負荷量の減少を生じさせる。聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせは、ミクログリアのクラスター形成反応と、内側前頭前皮質におけるアミロイドの減少を生じさせる。聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせは、新皮質全体でアミロイドプラークの広範な減少を生じさせる。
一つの態様において、本開示は、その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するためのデバイス、方法およびシステムを提供するものであり、当該方法は、当該対象に、約20Hz~約60Hzの周波数を有する聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせを非侵襲的に送達し、当該対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。一部の実施形態では、認知症は、AD、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、および/または加齢に伴う認知低下に関連する。対象は、ヒトまたは動物であってもよい。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせが約35Hz~約45Hzの周波数、または約40Hzの周波数を有する。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達は、聴覚皮質(AC)、視覚皮質(VC)、海馬(HPC)および内側前頭前皮質(mPFC)から選択される少なくとも一つの皮質領域の5%以上の記録部位に、周期的なスパイク反応を誘導する。一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、mPFCにおいて約40Hzの局所電場電位(LFP:local field potential)を誘導する。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、少なくとも一つの皮質領域においてミクログリア反応を増加させる。皮質領域は、新皮質、AC、VC、HPCおよびmPFCを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、mPFCにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、アミロイドプラークの25マイクロメートル以内のミクログリア数の増加、ミクログリアの細胞体の直径の増加、ミクログリアの突起長の減少、およびミクログリアの細胞数の増加、から選択される少なくとも一つの効果を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞体の直径における、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の増加を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの突起長における、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の減少を含む。ある実施形態では、ミクログリア反応の増加は、ミクログリアの細胞数における、少なくとも10%、20%、
30%、40%または50%の増加を含む。
30%、40%または50%の増加を含む。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10週間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10カ月間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10年間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイドプラークの減少を含む。皮質領域は、新皮質、AC、VC、HPCおよびmPFCを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、mPFCにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの大きさの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60%の減少を含む。ある実施形態では、アミロイドプラークの減少は、プラークの数の少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60%の減少を含む。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10週間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10カ月間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10年間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
一部の実施形態では、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達は、新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域におけるアミロイド-β(Aβ)ペプチド量の減少を含む。皮質領域は、新皮質、AC、VC、HPCおよびmPFCを含んでもよい。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、mPFCにおいて誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、複数の皮質領域において誘導される。一部の実施形態では、ミクログリア反応は、新皮質全体にわたり誘導される。
ある実施形態では、Aβペプチド量の減少は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60%の量の減少を含む。一部の実施形態では、Aβペプチドは、Aβ1 40ペプチドアイソフォームと、Aβ1-42ペプチドアイソフォームのうちの少なくとも一つを含む。一部の実施形態では、Aβペプチドは、可溶性Aβペプチドと、不溶性Aβペプチドのうちの少なくとも一つを含む。
一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
または10週間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10カ月間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10年間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
または10週間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10カ月間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。一部の実施形態では、ミクログリア反応の増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10年間の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせの非侵襲的送達の後に生じる。
第二の態様において、本開示は、その必要のある対象における認知症またはアルツハイマー病の治療方法を提供し、当該方法は、約35Hz~約45Hzの周波数の視覚刺激を発する少なくとも一つの視覚刺激装置を制御する工程、電気音声シグナルを、約35Hz~約45Hzの周波数の対応する聴覚刺激へと転換する少なくとも一つの電気音響変換器を制御する工程、および当該対象に組み合わせ刺激を非侵襲的に送達する工程を含み、当該組み合わせ刺激は、同期して並んだ視覚刺激と音刺激を含み、当該組み合わせ刺激は、当該対象の少なくとも一つの脳領域に同期化ガンマ振動を誘導する。同期化ガンマ振動は、当該対象において認知機能の改善を生じさせる。
一部の実施形態では、視覚刺激は、12.5ミリ秒の点灯と、次いで12.5ミリ秒の消灯の反復を含む。一部の実施形態では、光生成(optogenetic)刺激装置は、40~80Wの電力の発光ダイオードである。一部の実施形態では、聴覚刺激は、約4%~約80%の負荷サイクルで40Hzで再生される10kHzの音調を含む。一部の実施形態では、視覚刺激は、約10%~約80%の負荷サイクルで10秒間、40Hzで明滅される光を含む。
一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は同期化される。一部の実施形態では、視覚刺激と聴覚刺激は、-180~0度または0~180度位相がずれている。本明細書において使用される場合、「位相」とは、聴覚刺激と視覚刺激の間の時間差を指し、度で表され、0度は、聴覚と視覚の同時刺激を意味し、-180度または+180度とは、視覚刺激と聴覚刺激が交互であることを指す。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。一部の実施形態では、治療を必要とする対象には、既に疾患または状態を有する対象、ならびに疾患または状態を発現させる可能性がある対象、および目的が疾患もしくは状態の予防、遅延または軽減である対象が挙げられる。例えば一部の実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、方法およびシステムは、対象が遺伝的に発症しやすい疾患または状態、例えばADを予防、遅延または軽減させるために採用されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、方法およびシステムは、対象がすでに診断されている疾患または状態、例えばADの症状を治療、緩和、減少させるために、および/または進行を遅延させるために採用されてもよい。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、例えば齧歯類、ネコ科、イヌ科または霊長類などの哺乳動物を意味する。本発明の対象は、ヒトであることが好ましい。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、「約」が改変する客体の±10パーセントを指す。
認知症とは、知的能力の減少および/または記憶障害を特徴とする障害である。認知症には例えばAD、血管性認知症、レビー小体型認知症、ピック病、前頭側頭型認知症(FTD)、AIDS認知症、加齢に伴う認知障害、および加齢に伴う記憶障害が含まれる。認知症は、神経学的および/または精神医学的な状態、例えば脳腫瘍、脳病変、てんかん
、多発性硬化症、ダウン症、レット症候群、進行性核上性麻痺、前頭葉症候群、統合失調症および外傷性脳損傷などと関連していてもよい。
、多発性硬化症、ダウン症、レット症候群、進行性核上性麻痺、前頭葉症候群、統合失調症および外傷性脳損傷などと関連していてもよい。
ADは、先進国において最も頻度の高い神経変性疾患である。ADは、アミロイドプラークの蓄積が組織病理学的な特徴であり、アミロイドプラークはAβペプチドと、タウタンパク質から生成されるNFTから構成される。臨床的には、ADは、記憶力、機能、言語能力、判断および実行機能の減少を特徴とする進行性の認知障害と関連している。ADは、その後期の段階で重度の行動症状が生じることが多い。
血管性認知症は、脳血管性認知症と呼称されることもあり、脳血管性疾患を指すこともある(例えば大脳半球の梗塞)。これらは通常、改善と段階的な悪化期間を伴う流動的な経過を有する。血管性認知症は、見当識障害、記憶力の衰え、および/もしくは判断力の衰えのうちの一つまたは複数を含み得る。血管性認知症は、別個の複合的な梗塞を原因とする場合があり、または他の血管性の原因、例えば全身性エリテマトーデスで見出される自己免疫性血管炎、例えばライム病などの感染性血管炎、再発性の脳出血、および/または脳卒中を原因とする場合もある。
前頭側頭型認知症(FTD)は、進行性の神経変性障害である。FTDの対象は概して顕著な行動および性格の変化を呈し、多くの場合、言語障害が付随する。
レビー小体型認知症は、ADと重複する特性を伴う認知症の発現、パーキンソン病の特徴の発現、および/または幻覚症状の早期発現のうちの一つまたは複数の症状を特徴とする。レビー小体型認知症は一般的に、日々の症状の重症度の変動を特徴とする。
一部の態様において、本開示は、対象において認知症を予防、緩和、および/または治療するための方法を提供するものであり、当該方法は、対象の脳において同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。一部の実施形態では、神経学的な疾患もしくは障害、または加齢に伴う衰退に苦しむ対象におけるガンマ振動の誘導は、当該疾患もしくは障害、または加齢に伴う衰退の結果としての、またはそれらに関連している、対象において混乱したガンマ振動リズムを回復させるよう作用する。
一部の実施形態では、ガンマ振動の誘導は、Aβ1-40およびAβ1-42のアイソフォームの生成を減少させる。一部の実施形態では、ガンマ振動の誘導は、対象の脳からのAβ(例えばAβ1-40アイソフォームおよびAβ1-42アイソフォーム)のクリアランスを強化する。一部の実施形態では、ガンマ振動の誘導は、対象の脳においてAβの蓄積を予防する。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、治療前の対象の脳内のAβレベルと比較して、対象の脳内のAβレベルを約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%以上減少させる。一部の実施形態では、対象の脳内のAβレベルは、治療前の対象の脳内のAβレベルと比較して少なくとも約50%に減少する。
一部の実施形態では、対象の脳内のAβレベルは、対象の脳内のAPP切断の低下を介して減少する。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、治療前の対象の脳内のAPP切断レベルと比較して、対象の脳内のAPP切断レベルを約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%以上減少させる。一部の実施形態では、対象の脳内のAPP切断レベルは、治療前の対象の脳内のAPP切断レベルと比較して少なくとも約50%に減少する。一部の実施形態では、APP切断レベルは、対象の脳内のC末端断片β(β-CTF)のレベルにより測定される。一部の実施形態では、脳内のAPP切断レベルは、例えばβおよび/またはγ-セクレターゼ活性の阻害レベルの上昇などによる、βおよび/またはγ-セクレターゼの阻害を介して減少する。一部の実施
形態では、本明細書に提示される方法は、対象の脳内のAβプラークの凝集を減少させる。
形態では、本明細書に提示される方法は、対象の脳内のAβプラークの凝集を減少させる。
一部の実施形態では、本発明方法は、対象の認知能力および/または記憶力を改善する。
別の態様では、本開示は、対象の脳内に、神経保護的プロファイルまたは神経保護的環境を誘導する工程を含み、当該工程は、当該対象の脳内に同期化ガンマ振動を誘導する工程を含む。例えば一部の実施形態では、神経保護的プロファイルは、神経保護的ミクログリア細胞プロファイルと関連している。さらなる実施形態では、神経保護的プロファイルは、M-CSF経路の活性の増加により誘導され、またはこれと関連している。一部の実施形態では、神経保護的環境は、抗炎症性シグナル伝達経路と関連している。例えば一部の実施形態では、抗炎症性シグナル伝達経路は、抗炎症性ミクログリアシグナル伝達経路である。
一部の実施形態では、神経保護的プロファイルは、炎症促進性グリア細胞の活性の低下、または欠落と関連している。炎症促進性グリア細胞の活性は、ミクログリアのM1表現型と関連しており、反応性酸素種(ROS:reactive species of oxygen)、神経分泌性タンパク質のクロモグラニンA、分泌性補因子シスタチンC、NAPDHオキシダーゼ、例えばiNOSなどの酸化窒素シンターゼ酵素、NF-kB依存性炎症性反応タンパク質、ならびに炎症促進性のサイトカインおよびケモカイン(例えばTNF、IL-1β、IL-6およびIFNγ)の産生を含む。
対照的にミクログリアのM2表現型は、炎症の下方制御と、炎症誘導性損傷の回復と関連している。抗炎症性サイトカインおよびケモカイン(IL-4、IL-13、IL-10、および/またはTGFβ)、ならびに貪食活性増加は、M2表現型と関連している。したがって一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、ミクログリアにおいて神経保護的なM2表現型を惹起させる。一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、対象の脳内の貪食活性を上昇させる。例えば一部の実施形態では、本明細書に提示される方法は、ミクログリアの貪食活性を上昇させ、Aβのクリアランスを増加させる。
ガンマ振動は、約20Hz~約100Hzを含んでもよい。したがって一部の実施形態では、本開示は、対象において認知症を予防、緩和または治療するための方法を提供するものであり、当該方法は、対象の脳内に、約20Hz~約100Hz、または約20Hz~約80Hz、または約20Hz~約50Hz、または約30Hz~約60Hz、または約35Hz~約45Hz、または約40Hzのガンマ振動を誘導する工程を含む。ガンマ振動は、約40Hzであることが好ましい。
刺激は、対象の内部環境または外部環境における任意の検出可能な変化を含み得、少なくとも一つの脳領域内に直接または最終的にガンマ振動を誘導する。例えば刺激は、電磁放射線受容体(例えば光受容器、赤外線受容器、および/または紫外線受容器)、機械受容器(例えば機械的なストレスおよび/またはひずみ)、侵害受容器(すなわち疼痛)、音声受容器、電気受容器(例えば電界)、磁気受容器(例えば磁界)、水力受容器(hydroreceptor)、化学受容器、温度受容器、浸透圧受容器、および/または自己受容体(すなわち位置感覚)を刺激するよう設計されてもよい。受容器からの反応を惹起させるために必要とされる感覚の絶対閾値または最小量は、刺激および対象の種類に応じて変化し得る。一部の実施形態では、刺激は、個々の感受性に応じて適合される。
一部の実施形態では、ガンマ振動は、脳領域特異的な様式で誘導される。例えば一部の実施形態では、ガンマ振動は、海馬、視覚皮質、バレル皮質、聴覚皮質、またはそれらの
組み合わせにおいて誘導される。一例として、一部の実施形態では、ガンマ振動は、点滅光を使用して視覚皮質に誘導され、他の実施形態では、ガンマ振動は、特定の周波数の聴覚刺激を使用して聴覚皮質に誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、視覚、聴覚、および/または他の刺激の組み合わせを使用して同時に複数の脳領域内に誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、バーチャルリアリティーシステムにおいて誘導される。
組み合わせにおいて誘導される。一例として、一部の実施形態では、ガンマ振動は、点滅光を使用して視覚皮質に誘導され、他の実施形態では、ガンマ振動は、特定の周波数の聴覚刺激を使用して聴覚皮質に誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、視覚、聴覚、および/または他の刺激の組み合わせを使用して同時に複数の脳領域内に誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、バーチャルリアリティーシステムにおいて誘導される。
一部の実施形態では、対象は、無関係の刺激を受動的または能動的に妨害するチャンバーなど(例えば遮光またはノイズキャンセリング)の、ガンマ振動を誘導するよう構成された環境を介して刺激を受け取る。あるいは、またはさらに、対象は、例えば遮光またはノイズキャンセリングの側面を含むシステムを介して刺激を受け取ってもよい。一部の実施形態では、対象は、例えば刺激を送達するよう設計された眼鏡類といった刺激放出デバイスを介して視覚刺激を受け取る。デバイスは、他の光を遮断してもよい。一部の実施形態では、対象は、例えば刺激を送達するよう設計されたヘッドホンといった刺激放出デバイスを介して聴覚刺激を受け取る。デバイスは、他のノイズを相殺してもよい。
少なくとも一つの刺激放出用インタフェースに加えて、一部の実施形態は、少なくとも一つのプロセッサー(例えば刺激を生成する、刺激放出を制御する、刺激放出/結果を監視する、および/または刺激/結果に関するフィードバックを処理する)、少なくとも一つのメモリ(例えばプロセッサー実行可能な指令、少なくとも一つの刺激、刺激生成方針、フィードバック、および/または結果などを保存する)、少なくとも一つのコミュニケーションインタフェース(例えば対象、ヘルスケア提供者、介護者、臨床研究責任医師、データベース、監視アプリケーションなどと情報交換する)、および/または検出デバイス(例えばガンマ振動が誘導されたか、対象の感受性、認知機能、物理的または化学的変化、ストレス、安全性などを含む、刺激および/または対象に関するフィードバックを検出し、提供する)を含んでもよい。
一部の実施形態では、ガンマ振動は、例えば約20Hz~約100Hzの点滅光などの視覚刺激により誘導される。特定の実施形態では、ガンマ振動は、例えば約20Hz~約50Hzの点滅光により誘導される。さらなる実施形態では、ガンマ振動は、例えば約35Hz~約45Hzの点滅光により誘導される。さらなる実施形態では、ガンマ振動は、例えば約40Hzの点滅光により誘導される。一部の実施形態では、対象は、約20Hz~約100Hzの点滅光、または約20Hz~約50Hzの点滅光、または約35Hz~約45Hzの点滅光、または約40Hzの点滅光を受け取る(またはそうした点滅光を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした点滅光を発する遮光デバイスを着用する)。
一部の実施形態では、ガンマ振動は、約20Hz~約100Hz、または約20Hz~約80Hz、または約20Hz~約50Hz、または約35Hz~約45Hz、または約40Hzの周波数の音といった聴覚刺激により誘導される。一部の実施形態では、対象は、約20Hz~約100Hz、約20Hz~約80Hz、約20Hz~約50Hz、約35Hz~約45Hz、または約40Hzの聴覚刺激を受け取る(またはそうした聴覚刺激を発するノイズキャンセリングデバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした聴覚刺激を発するノイズキャンセリングデバイスを着用する)。
一部の実施形態では、対象は、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間以上、視覚刺激および/または聴覚刺激を受け取る(例えば、そうした刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する)。一部の実施形態では、対象は、約6時間以内、約5時間以内、約4時間以内、約3時間以内、約2時間以内、または約1時間以内の間、刺激を受け取る(例えば、そう
した刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する)。一部の実施形態では、対象は、1時間未満の間、刺激を受け取る(例えば、そうした刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する)。
した刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する)。一部の実施形態では、対象は、1時間未満の間、刺激を受け取る(例えば、そうした刺激を発する遮光デバイスを備えたチャンバー内に置かれる、またはそうした刺激を発する遮光デバイスを着用する)。
一部の実施形態では、対象は、本明細書に提供される方法を受ける。他の実施形態では、対象は、複数の別個のときに、本明細書に提供される方法を用いた治療を受ける。対象は、定期的なスケジュールで治療を受けてもよく、または症状が発生したとき、もしくは症状が悪化したときに治療を受けてもよい。一部の実施形態では、慢性的な治療が、可溶性Aβペプチドおよび/または不溶性Aβペプチド(すなわちプラーク)の減少に有効である場合がある。
一部の実施形態では、ガンマ振動は、細胞型特異的な様式で誘導される。一部の実施形態では、ガンマ振動は、FS-PV介在ニューロンで誘導される。ある種のニューロンを記載するために使用されるとき、「高速スパイク」(FS:fast-spiking)という用語は、長期間、スパイク周波数の適合またはスパイク高の減弱をほとんど伴わずに高頻度で放電するニューロンの能力を指す。したがってこれらのニューロンは、大幅な適応は伴わずに、持続的で高い周波数(例えば約100Hzまたは約150Hz以上)の放電を行うことができる。このFSニューロンの能力は、大部分が自身の高速遅延整流チャンネルの発現に起因し、別の言葉で言い換えれば、非常に素早く活性化と不活化を行うチャンネルの発現に起因する。
一つの態様において、刺激は、非侵襲性であってもよい。本明細書において使用される場合、「非侵襲性」という用語は、例えば組成物もしくはデバイスの注入または移殖といった、外科的介入または身体の操作を必要としないデバイス、方法およびシステムを指す。例えば刺激は、視覚(例えば明滅する光)、聴覚(例えば音の振動)、および/または触覚(力、振動または動きを伴う機械的刺激)であってもよい。
別の態様では、刺激は、侵襲性であってもよく、または少なくとも部分的に侵襲性であってもよい。例えば、視覚、聴覚および/または触覚の刺激は、組成物(例えば、光-感受性タンパク質)もしくはデバイス(例えば、統合光ファイバー光源または固体光源)の注入または移殖と組み合わされてもよい。
実験データ
本明細書に記載される本発明の主旨に関連する実験データは、様々な図面と併せて以下に記載される。最初に概要が、次いで詳細な説明がなされる。
図1A ACにおける40Hzの聴覚刺激(各ペアの左のパネル)と、無作為刺激(各ペアの右のパネル)の間の二つの推定単一ユニットの発火頻度調節を示す。目盛りは、聴覚パルスを示す。光の棒は無作為分布型パルスを示す。ラスタープロットは、10秒間、40Hzの聴覚刺激または無作為刺激に対する、推定単一ユニットの二つの例のスパイク反応を示す。
図1B ACにおける、刺激無し(刺激無しのラベル)、無作為刺激(無作為のラベル)および40Hzの聴覚刺激(40Hz刺激のラベル)の条件に対する、すべての単一ユニット(5匹のマウスにおける9回の記録セッションで、n=292ユニット。刺激間の間隔を中心とした間隔割合:P=0 40Hz対刺激無し、P=0 40Hz対無作為;二つの割合に対するz検定)の発火頻度ピーク間の間隔分布を示す。
図1C 40Hzの聴覚刺激中の刺激発生と比較した発火頻度調節の例示的な極座標プロットを示す(左、0で刺激発生)、40Hzの聴覚刺激、無作為刺激および刺激無しの間の単一ユニット発火頻度調節のベクトル強度分布(中心、****P<0.0001、P=4x10-54 40Hz対刺激無し、P=2x10-13 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定)、および単一ユニット発火頻度調節のレイリー統計値分布(右、****P<0.0001、P=5x10-68 40Hz対刺激無し、P=6x10-72 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定;26ユニットが、30を超える40Hz刺激RS値を有していた;1ユニットが30を超える無作為刺激RS値を有していた)。
図1D ACでの刺激条件間の平均発火頻度値の分布を示す。
図1E CA1に関して、図1Aと同じ内容を示す。
図1F CA1に関して、図1Bと同じ内容を示す(5匹のマウスにおける10回の記録セッションで、n=338ユニット。P=0 40Hz対刺激無し、P=0 40Hz対無作為刺激;二つの割合に対するz検定)。
図1G CA1に関して、図1Cと同じ内容を示す。(中心、****P<0.0001、P=4x10-40 40Hz対刺激無し、P=9x10-11 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定;右、****P<0.0001、P=1x10-74 40Hz対刺激無し、P=2x10-73 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図1H CA1に関して、図1Dと同じ内容を示す。
図1I mPFCに関して、図1Aと同じ内容を示す。
図1J mPFCに関して、図1Bと同じ内容を示す(4匹のマウスにおける7回の記録セッションで、n=115ユニット。P=0 40Hz対刺激無し、P=0 40Hz対無作為刺激;二つの割合に対するz検定)。
図1K mPFCに関して、図1Cと同じ内容を示す。(中心、****P<0.0001、P=2x10-2740Hz対刺激無し、P=4x10-5 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定;右、****P<0.0001、P=1x10-28 40Hz対刺激無し、P=5x10-30 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図1L mPFCに関して、図1Dと同じ内容を示す。
図2A 5XFAD聴覚GENUSマウスに対する行動実験のタイムラインを示す。
図2B 5XFAD聴覚GENUSマウスの新規の物体認識(NOR)検査の認知インデックスを示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、円は「n」を示す、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図2C 新規の物体認知検査の間の平均速度(cm/秒)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群において
n=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
n=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図2D 新規の物体認知検査の間に移動した総距離(cm)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図2E 5XFAD聴覚GENUSマウスの新規の物体位置(NOL)検査の認知インデックスを示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図2F 新規の物体位置検査の間の平均速度(cm/秒)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図2G 新規の物体位置検査の間に移動した総距離(cm)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図2H 非刺激、無作為周波数刺激、および40Hzの聴覚刺激が行われた5XFADマウスのモリス水迷路における逃避潜時を示す(非刺激群でn=25匹のマウス、40Hz群でn=28匹のマウス、無作為周波数群でn=9匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、n.s.=有意差無し、テューキーの多重比較検定を伴う二元ANOVA)。
図2I プローブトライアルの間に目標四分円で泳いで過ごした時間を示す(非刺激群でn=25匹のマウス、40Hz群でn=28匹のマウス、無作為周波数群でn=9匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図2J プローブトライアルの間に交差したプラットフォーム数を示す(非刺激群でn=25匹のマウス、40Hz群でn=28匹のマウス、無作為周波数群でn=9匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、**P<0.01、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図3A 1日当たり1時間で7日間、40Hz、8Hz、80Hzまたは無作為周波数の聴覚刺激を受けた後の6カ月齢の5XFADマウスにおける聴覚皮質(AC)および海馬(HPC)中の相対的可溶性Aβ1-42レベルを示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=19匹のマウス、40Hz群でn=19匹のマウス、8Hz群でn=4匹のマウス、80Hz群でn=7匹のマウス、無作為周波数群でn=6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図3B 不溶性Aβ1-42に関して、図3Aと同じ内容を示す。
図3C 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのACにおける、抗Aβ(D54D2、緑)抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す(1群当たりn=7匹のマウス、スケールバー、50μm)。
図3D CA1に関して、図3Cと同じ内容を示す。
図3E ACおよびCA1におけるAβ陽性プラークの平均数を示す(1群当たりn=7匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図3F ACおよびCA1におけるAβ陽性プラークの平均面積を示す(1群当たりn=7匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、**P<0.01、***P<0.001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図3G 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのACにおける、抗Aβ(12F4、赤)抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す(差し込み図、20x、スケールバー、50μm)。
図3H CA1に関して、図3Gと同じ内容を示す。
図3I 非刺激対照に対して正規化されたAβ(12F4)の平均強度値(12F4抗体)を示す(1群当たりn=7匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図4A 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの5XFADマウスのACにおける、抗Iba1(019-19741、緑)および抗Aβ(12F4、赤)抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す(1群当たりn=8匹のマウス、スケールバー、50μm)。
図4B CA1に関して、図4Aと同じ内容を示す。
図4C ACおよびCA1におけるIba1陽性のミクログリア数を示す(1群当たりn=8匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図4D 非刺激対照群に対して正規化された、ACおよびCA1におけるIba1陽性のミクログリア細胞体の直径を示す(1群当たりn=8匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図4E 非刺激対照群に対して正規化された、ACおよびCA1におけるIba1陽性のミクログリアの主要突起の平均の長さを示す(1群当たりn=8匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図4F 非刺激対照群に対して正規化された、ACおよびCA1におけるIba1陽性のミクログリアの平均突起分枝を示す(1群当たりn=8匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、P<0.05、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図4G ACおよびCA1におけるIba1陽性でAβ陽性でもあるミクログリア細胞体の割合を示す(1群当たりn=8匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、**P<0.01、***P<0.001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図4H 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの5XFADマウスのACにおける、抗S100B(ab868、紫)および抗GFAP(ab4674、灰色)抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示す(1群当たりn=8匹のマウス、スケールバー、50μm)。
図4I CA1に関して、図4Hと同じ内容を示す。
図4J ACおよびCA1におけるS100B陽性の星状細胞数を示す(1群当たりn=8匹のマウス、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図4K GFAP陽性星状細胞に関して、図4Jと同じ内容を示す。
図5A 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのACにおける、レクチン染色(DL-1174、緑)を用いた免疫組織化学染色結果を示す(スケールバー、50μm)。
図5B CA1に関して、図5Aと同じ内容を示す。
図5C 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのACおよびCA1の血管の直径における倍数変化割合を示す。非刺激対照に対して正規化されている(1群当たりn=7匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図5D 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのACにおける、抗LRP1(28320、赤)、抗Aβ(AB9234、緑)およびレクチン染色(DL-1174、灰色)を用いた免疫組織化学染色結果を示す(1群当たりn=8匹のマウス、スケールバー、50μm)。
図5E CA1に関して、図5Dと同じ内容を示す。
図5F 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUS刺激を受けた後、または刺激無しの5XFADマウスのACおよびCA1における、Aβ-LRP1の共局在の割合を示す(1群当たりn=8匹のマウス、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図6A 40Hzの聴覚-視覚刺激の間の単一ユニットの発火頻度調節を示す(左、下)。ラスタープロットは、10秒間、40Hzの聴覚刺激または無作為刺激に対する、推定単一ユニットの二つの例のスパイク反応を示す(左、上)。40Hzの聴覚-視覚刺激、無作為な聴覚-視覚刺激、および刺激無しの期間のベクトル強度分布(右、****P<0.0001、P=9x10-59 40Hz対刺激無し、P=1x10-13 40Hz対無作為;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図6B CA1に関して、図6Aと同じ内容を示す。(右、****P<0.0001、P=6x10-41 40Hz対刺激無し、P=2x10-11 40Hz対無作為、コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図6C mPFCに関して、図6Aと同じ内容を示す。(右、****P<0.0001、P=2x10-23 40Hz対刺激無し、P=9x10-5 40Hz対無作為、コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図6D 1日当たり1時間で7日間、刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのAC、VC、CA1およびmPFCにおける抗Iba1抗体(019-19741)および抗Aβ抗体(12F4)のIMARIS(方法)を使用した免疫組織化学染色および3D再構成の結果を示す(1群当たりn=6匹のマウス、上差し込み図:アミロイドプラークを中心とした25μm半径周囲のミクログリア数を定量するIMARISの使用例。プラークは、赤いドットとして示され、ミクログリアは緑のドット、そして白矢印はクラスターを指し示している。下差し込み図:ACの拡大統合画像。スケールバー、20μm)。
図6E 組み合わせGENUSに関して、図6Dのように示す。
図6F 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、組み合わせGENUS(A+V刺激)を受けた後の、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのAC、VC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア細胞体直径を示す(無刺激対照群においてn=6匹のマウス、組み合わせGENUS群においてn=7匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図6G 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、組み合わせGENUSを受けた後の、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのAC、VC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア突起長を示す(無刺激対照群においてn=6匹のマウス、組み合わせGENUS群においてn=7匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、**P<0.01、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図6H 1日当たり1時間で7日間、組み合わせGENUSを受けた後の、または刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのAC、VC、CA1およびmPFC中の対象領域当たりのミクログリア数を示す(無刺激対照群においてn=6匹のマウス、組み合わせGENUS群においてn=7匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、*P<0.05、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図6I 組み合わせGENUSを受けた後の、または刺激無しのAC、VC、CA1およびmPFC中のプラークの25μm半径周囲の平均ミクログリア数を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図7A 1日当たり1時間で7日間、刺激無しの6カ月齢の5XFADマウスのAC、VC、CA1およびmPFC中の抗Aβプラーク抗体(D54D2、緑)の免疫組織化学染色結果を示す(40x対物レンズを用いて撮影された画像、スケールバー、50μm)。
図7B 組み合わせGENUSに関して、図7Aのように示す。
図7C 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、刺激無し、40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)80Hz、および組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激を受けた後の、6カ月齢の5XFADマウ
スのAC、CA1、mPFCおよびVC中の平均プラークコア面積を示す(1群当たりn=12匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
スのAC、CA1、mPFCおよびVC中の平均プラークコア面積を示す(1群当たりn=12匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図7D 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、刺激無し、40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)80Hz、および組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激を受けた後の、6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1、mPFCおよびVC中の平均プラーク数を示す(1群当たりn=12匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図7E 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)8Hz、または組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激を受けた後の、6カ月齢の5XFADマウスのmPFC中の相対的可溶性Aβ1-42レベルを示す(1群当たりn=4~5匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図7F 可溶性Aβ1-42に関して、図7Eのように示す(n.s.=有意でない、*P<0.05)。
図7G 1日当たり1時間で7日間、刺激無しの後の6ヵ月齢の5XFADマウスのSHIELD処置された全脳(脳の25μm切片の矢状面)の抗Aβプラーク(D54D2、白色)抗体の免疫組織化学染色の結果を示す(ライトシート顕微鏡、スケールバー、700μm)。
図7H 組み合わせ(A+V)GENUSに関して、図7Gのように示す。
図7I 刺激無し、または組み合わせ(A+V)GENUSの後の平均皮質プラーク数を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図7J 組み合わせ(A+V)GENUSの後の平均皮質プラーク体積(μm3)を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図8A 聴覚皮質を検出するために使用された聴覚マッピング音調に対する平均LFP反応を示す(左)。青色領域は、50ミリ秒のマッピング音調が再生されたときを示す。クラスター化推定単一ユニットの例(右)。
図8B 40Hzの聴覚明滅刺激期間および無刺激期間に対するパワースペクトル密度(PSD)反応を示す。記録日全体の平均および標準偏差(左)、全記録日の聴覚明滅に対するAC中のパワースペクトルLFP反応(記録深度当たりの40Hz聴覚明滅中の最も高い40Hzピークを伴う記録部位を示す。方法を参照のこと)(右)。
図8C 40Hzの聴覚刺激期間と無刺激期間のACにおける単一ユニットの平均発火頻度(FR:firing rate)を示す(左)、ACにおける単一ユニットの多重刺激条件間の平均発火頻度の差異は、0Hzを中心として集中している(右、****P<0.0001 40Hz-刺激無し、その他すべてn.s.;ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定)。
図8D 20Hzの聴覚明滅刺激に対する反応における推定単一ユニットの発火頻度調節を示す(左、下)、ラスタープロットは、10秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す(左、上)。20Hzの聴覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布(右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合:P=0 20Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図8E 80Hzの聴覚明滅刺激に対する反応における、Dに示されるユニットと同一のユニットの発火頻度調節を示す(左、下)、ラスタープロットは、10秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す(左、上)。80Hzの聴覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布(右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合:P=0 80Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図8F 20Hzおよび80Hzの聴覚刺激と、刺激無し条件のベクトル強度分布を示す(左、****P<0.0001、P=3x10-61 20Hz対刺激無し、P=3x10-61 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定)、20Hzおよび80Hzの聴覚刺激と、刺激無し条件のレイリー統計分布(右、****P<0.0001、P=3x10-73 20Hz対刺激無し、P=1x10-68 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定;54ユニットが、30を超える20Hz刺激RS値を有していた;28ユニットが、30を超える80Hz刺激RS値を有していた。
図8G CA1を検出するために使用された、海馬の特徴であるシータリズムの例を示す。
図8H CA1に関して、Bと同じ内容を示す。
図8I CA1に関して、Cと同じ内容を示す(右、n.s.;ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定)。
図8J CA1に関して、Dと同じ内容を示す(右、P=0 20Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図8K CA1に関して、Eと同じ内容を示す(右、P=0 80Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図8L CA1に関して、Fと同じ内容を示す。(左、****P<0.0001、P=1x10-40 20Hz対刺激無し、P=9x10-45 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定;右、****P<0.0001、P=1x10-71 20Hz対刺激無し、P=8x10-73 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図8M プローブ跡を示す組織検査画像と、mPFC中の記録位置を示す。赤色の矢印は記録位置を示す。
図8N mPFCに関して、Bと同じ内容を示す。
図8O mPFCに関して、Cと同じ内容を示す(右、n.s.;ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定)。
図8P mPFCに関して、Dと同じ内容を示す(右、P=0 20Hz対刺激無し;
二つの割合に対するz-検定)。
二つの割合に対するz-検定)。
図8Q mPFCに関して、Eと同じ内容を示す(右、P=0 80Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図8R mPFCに関して、Fと同じ内容を示す。(左、****P<0.0001、P=1x10-23 20Hz対刺激無し、P=6x10-24 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定;右、****P<0.0001、P=2x10-17 20Hz対刺激無し、P=4x10-26 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図9A 刺激無し、40Hz周波数、および無作為周波数で刺激された5XFADマウスがNOR検査中、慣れた物体および新規の物体を探索するのに費やした時間(秒)を示す(非刺激群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、**P<0.01、****p<0.0001、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9B NOR検査中、20秒の総物体探索要件に達するまでにマウスが必要とした時間(分)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9C 刺激無し、40Hz周波数、および無作為周波数で刺激された5XFADマウスがNOL検査中、慣れた位置および新規の位置にある物体を探索するのに費やした時間(秒)を示す(非刺激群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、***P<0.001、****p<0.0001、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9D NOL検査中、20秒の総物体探索要件に達するまでにマウスが必要とした時間(分)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9E 馴化中の平均速度(cm/秒)を示す((刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9F 馴化中に移動した総距離(cm)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9G 馴化中に行動チャンバーの中心で費やした時間(秒)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9H 馴化中に行動チャンバーの周辺で費やした時間(秒)を示す(刺激無し群においてn=20匹のマウス、40Hz群においてn=20匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9I モリス水迷路での平均遊泳速度(cm/秒)を示す(刺激無し群においてn=25匹のマウス、40Hz群においてn=28匹のマウス、無作為周波数群においてn=9、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9J 1-時間の刺激無し、聴覚GENUSまたは無作為周波数刺激の間の平均速度(cm/秒)を示す(刺激無し群においてn=6匹のマウス、40Hz群においてn=6匹のマウス、無作為周波数群においてn=6、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9K 1時間の刺激無し、聴覚GENUSまたは無作為周波数刺激の間に移動した総距離(cm)を示す(刺激無し群においてn=6匹のマウス、40Hz群においてn=6匹のマウス、無作為周波数群においてn=6、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図9L 1時間の刺激無し、聴覚GENUSまたは無作為周波数刺激の間、2cm/秒で費やされた時間(秒)を示す(刺激無し群においてn=6匹のマウス、40Hz群においてn=6匹のマウス、無作為周波数群においてn=6、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図10A 1日当たり1時間で7日間、40Hz、8Hz、80Hzまたは無作為周波数の聴覚刺激を受けた後の6カ月齢の5XFADマウスにおける聴覚皮質(AC)および海馬(HPC)中の相対的可溶性Aβ1-40レベルを示す。非刺激対照に対して正規化された(注意:80Hzおよび無作為周波数のHPCサンプルのELISAは上手くいかず、報告できなかった。非刺激群でn=19匹のマウス、40Hz群でn=19匹のマウス、8Hz群でn=4匹のマウス、80Hz群でn=7匹のマウス、無作為周波数群でn=6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、**P<0.01、n.s.=有意差無し、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図10B 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後の6カ月齢のAPP/PS1マウスにおける聴覚皮質(AC)および海馬(HPC)中の相対的可溶性Aβ1-42レベルを示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=4匹のマウス、40Hz群でn=4匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図10C 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後の9カ月齢のAPP/PS1マウスにおけるACおよびCA1(「対象領域」、ROI:region of
interest)中の平均プラーク数を示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=5匹のマウス、40Hz群でn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
interest)中の平均プラーク数を示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=5匹のマウス、40Hz群でn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図10D 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後の9カ月齢のAPP/PS1マウスにおけるACおよびCA1中の平均プラークコア面積を示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=5匹のマウス、40Hz群でn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)
。
。
図10E 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後の9カ月齢のAPP/PS1マウスにおけるACおよびCA1中のAβ(12F4)平均強度値(12F4抗体)を示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=5匹のマウス、40Hz群でn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図10F 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後、刺激無しでの7日間の後の6カ月齢の5XFADマウスにおけるACおよびCA1中の平均プラーク数を示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=6匹のマウス、40Hz群でn=6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図10G 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後、刺激無しでの7日間の後の6カ月齢の5XFADマウスにおけるACおよびCA1中の平均プラークコア面積を示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=6匹のマウス、40Hz群でn=6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図10H 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後、刺激無しでの7日間の後の6カ月齢の5XFADマウスにおけるACおよびCA1中のAβ(12F4)平均強度値(12F4抗体)を示す。非刺激対照に対して正規化された(非刺激群でn=6匹のマウス、40Hz群でn=6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図11A 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後の9カ月齢のAPP/PS1マウスにおけるACおよびCA1中のIba1陽性のミクログリア細胞体の直径を示す。非刺激対照に対して正規化された(1群当たりn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図11B 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後の9カ月齢のAPP/PS1マウスにおけるACおよびCA1中のIba1陽性の主要突起の平均長を示す。非刺激対照に対して正規化された(1群当たりn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図11C 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後の9カ月齢のAPP/PS1マウスにおけるACおよびCA1中のIba1陽性のミクログリア数を示す。非刺激対照に対して正規化された(1群当たりn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図11D 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後、刺激無しでの7日間の後の6カ月齢の5XFADマウスにおけるACおよびCA1中のIba1陽性のミクログリア細胞体の直径を示す。非刺激対照に対して正規化された(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図11E 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後、刺激無しでの7日間の後の6カ月齢の5XFADマウスにおけるACおよびCA1中のIba1陽性のミクログリアの主要突起の平均長を示す。非刺激対照に対して正規化された(1群当たりn=
6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図11F 1日当たり1時間で7日間、聴覚GENUSを受けた後、刺激無しでの7日間の後の6カ月齢の5XFADマウスにおけるACおよびCA1中のIba1陽性のミクログリア数を示す。非刺激対照に対して正規化された(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、*P<0.05、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図11G 6カ月齢の野生型マウスおよび5XFADマウスのCA1における、抗GFAP抗体(ab4674、赤色)およびレクチン染色(DL-1174、緑色)抗体を用いた、CLARITY処置脳切片の免疫組織化学染色の結果を示す(1群当たりn=5匹のマウス、スケールバー、50μm)。
図11H 6ヶ月齢の野生型マウスおよび5XFADマウスのCA1における、GFAP陽性細胞数(対象画像当たりの数、IMARISを使用)を示す(1群当たりn=5匹のマウス、棒グラフ中に平均s.e.m.、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図12A 1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後の6カ月齢のP301SマウスのACにおける抗pタウ抗体(T181、赤色)を用いた免疫組織化学染色結果を示す(40x対物レンズを用いて撮影された画像、スケールバー、50μm)。
図12B CA1に関して、図12Aと同じ内容を示す。
図12C 非刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後のP301SマウスのACおよびCA1におけるpタウ(T181)の相対強度レベルを示す(1群当たりn=10匹のマウス、***P<0.001、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図12D 1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後の6カ月齢のP301SマウスのACにおける抗pタウ抗体(S396、緑)を用いた免疫組織化学染色結果を示す(スケールバー、50μm)。
図12E CA1に関して、図12Dと同じ内容を示す。
図12F 非刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後のP301SマウスのACおよびCA1におけるpタウ(S396)の相対強度レベルを示す(1群当たりn=10匹のマウス、****P<0.0001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図12G 1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後の6カ月齢のP301SマウスのACにおけるpタウ(S396)および総タウのレベルを示す代表的なウェスタンブロッティング結果を示す。
図12H 海馬に関して、図12Gと同じ内容を示す。
図12I 1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後の6カ月齢のP301Sマウスの海馬におけるpタウ(T181)および総タウのレベルを示す代
表的なウェスタンブロッティング結果を示す。
表的なウェスタンブロッティング結果を示す。
図12J 1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後のP301SマウスのACにおける総タウ(Gのウェスタンブロッティングより)に対して正規化された、pタウ(S396)の相対的免疫反応性を示す(1群当たりn=3匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図12K 1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後のP301SマウスのHPCにおける総タウ(Hのウェスタンブロッティングより)に対して正規化された、pタウ(S396)の相対的免疫反応性を示す(40Hz群においてn=2匹のマウス、非刺激群においてn=3匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、***P<0.001、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図12L 1日当たり1時間で7日間、刺激無しまたは聴覚GENUS刺激後のP301Sマウスの海馬における総タウ(Iのウェスタンブロッティングより)に対して正規化された、pタウ(T181)の相対的免疫反応性を示す(40Hz群においてn=2匹のマウス、非刺激群においてn=3匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図13A 40Hzの聴覚-視覚明滅刺激期間および無刺激期間に対するパワースペクトル密度(PSD)反応を示す。記録日全体の平均および標準偏差(左)、全記録日の聴覚-視覚明滅刺激に対するAC中のパワースペクトルLFP反応(記録深度当たりの40Hz聴覚-視覚明滅間の最も高い40Hzピークを伴う記録部位を示す。方法を参照のこと)(右)。
図13B 聴覚-視覚無作為刺激に対する、図13Aに示される推定単一ユニットの以下の発火頻度調節を示す。上のラスタープロットは、10秒の無作為刺激に対する単一ユニットのスパイクを示す(左)。ACにおける聴覚-視覚刺激に対する発火頻度反応におけるピーク間の間隔分布(真ん中、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合:P=0 40Hz対刺激無し、P=0 40Hz対無作為刺激;二つの割合に対するz-検定)、40Hzの聴覚-視覚刺激に対する単一ユニット反応のレイリー統計分布(右、****P<0.0001、P=2x10-79 40Hz対刺激無し、P=1x10-72 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定;20ユニットは30を超える40Hz刺激RS値を有していた。2ユニットは30を超える無作為刺激RS値を有していた)。
図13C すべての聴覚-視覚刺激条件中の単一ユニット平均発火頻度を示す。
図13D 20Hzの聴覚-視覚明滅刺激に対する反応における推定単一ユニットの発火頻度調節を示す(左、下)、ラスタープロットは、10秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す(左、上)。20Hzの聴覚-視覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布(右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合:P=0 20Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図13E 80Hzの聴覚-視覚明滅刺激に対する反応における、Dに示されるユニットと同一のユニットの発火頻度調節を示す(左、下)、ラスタープロットは、10秒の刺激に対する反応におけるスパイクを示す(左、上)。80Hzの聴覚-視覚刺激に対する発火頻度反応のピーク間の間隔の分布(右、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合:P=0 80Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図13F 20Hzおよび80Hzの聴覚刺激のベクトル強度分布は、刺激無し条件よりも高い(左、****P<0.0001、2x10-63 20Hz対刺激無し、P=1x10-56 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定)、20Hzおよび80Hzの聴覚刺激のレイリー統計分布は、刺激無しよりも高い(右、****P<0.0001、P=P = 1x10-88 20Hz対刺激無し、P=5x10-72 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定;50ユニットが、30を超える20Hz刺激RS値を有していた;19ユニットが、30を超える80Hz刺激RS値を有していた。
図13G 複数の刺激条件間のACにおける単一ユニットの平均発火頻度の差異は、0Hzを中心として集中していることを示す(*P<0.05 20Hz-80Hz、*P<0.05 20Hz-40Hz、その他すべてn.s.;ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定)。
図13H CA1に関して、Aと同じ内容を示す。
図13I CA1に関して、Bと同じ内容を示す(右、****P<0.0001、P=1×10-71 40Hz対刺激無し、P=1x10-71 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定。真ん中、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合:P=0
40Hz対刺激無し、P=0 40Hz対無作為刺激;二つの割合に対するz-検定)。
40Hz対刺激無し、P=0 40Hz対無作為刺激;二つの割合に対するz-検定)。
図13J CA1に関して、Cと同じ内容を示す。
図13K CA1に関して、Dと同じ内容を示す(右、P=0 20Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図13L CA1に関して、Eと同じ内容を示す(右、P=0 80Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図13M CA1に関して、Fと同じ内容を示す。(左、****P<0.0001、P=8x10-43 20Hz対刺激無し、P=8x10-40 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定;右、****P<0.0001、P=2x10-70 20Hz対刺激無し、P=1x10-57 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図13N CA1に関して、Gと同じ内容を示す(すべてn.s.;ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定)。
図13O mPFCに関して、Aと同じ内容を示す。
図13P mPFCに関して、Bと同じ内容を示す(右、****P<0.0001、P=5x10-23 40Hz対刺激無し、P=3x10-21 40Hz対無作為刺激;コルモゴロフ-スミルノフ検定。真ん中、刺激間の間隔を中心とした間隔の割合:P=0 40Hz対刺激無し、P=0 40Hz対無作為刺激;二つの割合に対するz-検定)。
図13Q mPFCに関して、Cと同じ内容を示す。
図13R mPFCに関して、Dと同じ内容を示す(右、P=0 20Hz対刺激無し
;二つの割合に対するz-検定)。
;二つの割合に対するz-検定)。
図13S mPFCに関して、Eと同じ内容を示す(右、P=0 80Hz対刺激無し;二つの割合に対するz-検定)。
図13T mPFCに関して、Fと同じ内容を示す。(左、****P<0.0001、P=1x10-23 20Hz対刺激無し、P=2x10-25 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定;右、****P<0.0001、P=1x10-23
20Hz対刺激無し、P=8x10-25 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
20Hz対刺激無し、P=8x10-25 80Hz対刺激無し;コルモゴロフ-スミルノフ検定)。
図13U mPFCに関して、Gと同じ内容を示す(*P<0.05 40Hz-刺激無し、その他すべてn.s.;ゼロメジアンに対するウィルコクソンの符号付き検定)。
図14A 1日当たり1時間で7日間の聴覚GENUS刺激後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFCにおける、抗Iba1(019-19741、緑)および抗Aβ(12F4、赤)抗体の免疫組織化学染色結果を示す(差し込み図倍率、100x;スケールバー、50μm)。
図14B 1日当たり1時間で7日間の視覚GENUS刺激後の6カ月齢の5XFADマウスのVC、CA1およびmPFCにおける、抗Iba1(019-19741、緑)および抗Aβ(12F4、赤)抗体の免疫組織化学染色結果を示す(差し込み図倍率、100x;スケールバー、50μm)。
図14C 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間の聴覚GENUS後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア細胞体直径を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14D 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間の聴覚GENUS後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア突起長を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14E 1日当たり1時間で7日間の聴覚GENUS後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFC中の対象領域当たりのミクログリア数を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14F 聴覚GENUSを受けた後の、または刺激無しのAC、CA1およびmPFC中のプラークの25μm半径周囲の平均ミクログリア数を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14G 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間の視覚GENUS後の6カ月齢の5XFADマウスのVC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア細胞体直径を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14H 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間の視覚GEN
US後の6カ月齢の5XFADマウスのVC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア突起長を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
US後の6カ月齢の5XFADマウスのVC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア突起長を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14I 1日当たり1時間で7日間の視覚GENUS後の6カ月齢の5XFADマウスのVC、CA1およびmPFC中の対象領域当たりのミクログリア数を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14J 視覚GENUSを受けた後の、または刺激無しのVC、CA1およびmPFC中のプラークの25μm半径周囲の平均ミクログリア数を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14K 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間の40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)80Hz、または組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア細胞体直径を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、**P<0.01、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14L 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間の40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)80Hz、または組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFC中の平均ミクログリア突起長を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14M 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間の40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)80Hz、または組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFC中の対象領域当たりのミクログリア数を示す(1群当たりn=6匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14N 1日当たり1時間で7日間の聴覚GENUS後の6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1およびmPFC中の抗Aβプラーク(D54D2、緑)抗体の免疫組織化学染色結果を示す(1群当たりn=6匹のマウス、スケールバー、50μm)。
図14O 1日当たり1時間で7日間の視覚GENUS後の6カ月齢の5XFADマウスのVC、CA1およびmPFC中の抗Aβプラーク(D54D2、緑)抗体の免疫組織化学染色結果を示す(1群当たりn=6匹のマウス、スケールバー、50μm)。
図14P 無刺激対照に対して正規化された、対象領域当たりの平均プラークコア面積を示す(1群当たりn=6匹、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14Q 無刺激対照に対して正規化された、聴覚GENUS後のAC、CA1およびmPFC中の平均プラーク数を示す(1群当たりn=6匹、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、***P<0.001、独立2群のマン-
ホイットニー検定)。
ホイットニー検定)。
図14R 無刺激対照に対して正規化された、対象領域当たりの平均プラークコア面積を示す(1群当たりn=6匹、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14S 無刺激対照に対して正規化された、視覚GENUS後のVC、CA1およびmPFC中の平均プラーク数を示す(1群当たりn=6匹、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意差無し、*P<0.05、独立2群のマン-ホイットニー検定)。
図14T 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、無刺激、40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)8Hz、および組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激を受けた後の6カ月齢の5XFADマウスのACおよびHPC中の相対的可溶性Aβ1-42レベルを示す(1群当たりn=4~5匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図14U 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、無刺激、40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)8Hz、および組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激を受けた後の6カ月齢の5XFADマウスのACおよびHPC中の相対的不溶性Aβ1-42レベルを示す(1群当たりn=4~5匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
図14V 無刺激対照に対して正規化された、1日当たり1時間で7日間、刺激無し、40Hzの聴覚刺激、組み合わせ(A+V)GENUS、組み合わせ(A+V)80Hz、および組み合わせ(A+V)無作為周波数刺激を受けた後の、6カ月齢の5XFADマウスのAC、CA1、およびmPFC中のAβ(12F4)平均強度値(12F4抗体)を示す(1群当たりn=4~5匹のマウス、棒グラフ中、平均s.e.m.、n.s.=有意ではない、*P<0.05、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル-ワリス検定)。
40Hzの聴覚刺激が、AC、CA1およびmPFCにおいて、スパイク活動を調節する
本発明者らは最初に、聴覚音調刺激が、聴覚皮質(AC)、海馬小領域CA1、および内側前頭前皮質(mPFC)において、GENUSを生じさせ得るかを決定した。本発明者らは、20Hz、40Hz、80Hzの音調列、または無作為に分散された音列(1ミリ秒の長さ、10kHzの音調が、12.5ミリ秒、25ミリ秒、50ミリ秒ごとに再生されるか、または平均25ミリ秒の無作為な音調間の間隔で再生される。以下、「聴覚明滅刺激」と呼称される)を動物に提示した。音調提示の間、本発明者らは、球形のトレッドミルで走ったり休んだりしている3~8カ月齢のオスの野生型(C57BL6J)マウスのAC、CA1およびmPFCにおいて32チャンネルのシリコンプローブを使用して電気生理学的記録を行った。ACの位置を見つけるために、一連の50ミリ秒の聴覚マッピング音調(以下、「マッピング刺激」と呼称される)が、音調開始から20ミリ秒あたりで過渡LFP反応が検出されるまで、様々な深度で再生された(図8A)。CA1は、電気生理学的特徴に基づき位置決めされ、mPFC記録位置は、各動物で最後の記録が行われた後に組織構造から確認された(図8Gおよび8M)。
標的領域に達した後、動物は、神経活動が記録される間、静寂時間と、聴覚明滅刺激時間を交互に提示された。20Hz、40Hz、80Hz、および無作為聴覚明滅刺激の間
を刺激ブロックが循環した。推定単一ユニットの発火頻度は、各音調のたびに周期的に増加および減少し、40Hzの聴覚明滅刺激へと同調していった(図1A、1E、および1I、青色)。ユニットは無作為刺激によっても調節された。すべての無作為パルスが整列したとき、刺激後の発火頻度調節に変化が生じた。このことから、単一ユニットは、無作為刺激パルスに反応したことが示唆される。しかし無作為な聴覚音列は、周期的な発火調節を誘導しなかった(図1A、1E、および1I、オレンジ)。位相の分布と振幅の両方で、同調は単一ユニット間で変化した。明滅刺激の間、刺激に応じてニューロンは発火したが、すべてのサイクルでは発火せず、しばしば幅広い位相で発火した(図1A、1E、および1I)。聴覚明滅刺激の間の発火頻度のピーク間の間隔は、単一ユニットの大部分においておよそ25ミリ秒であった(40Hzと同等);ACでは75%、CA1では79%、そしてmPFCでは74%。(図1B、1F、および1J)。
を刺激ブロックが循環した。推定単一ユニットの発火頻度は、各音調のたびに周期的に増加および減少し、40Hzの聴覚明滅刺激へと同調していった(図1A、1E、および1I、青色)。ユニットは無作為刺激によっても調節された。すべての無作為パルスが整列したとき、刺激後の発火頻度調節に変化が生じた。このことから、単一ユニットは、無作為刺激パルスに反応したことが示唆される。しかし無作為な聴覚音列は、周期的な発火調節を誘導しなかった(図1A、1E、および1I、オレンジ)。位相の分布と振幅の両方で、同調は単一ユニット間で変化した。明滅刺激の間、刺激に応じてニューロンは発火したが、すべてのサイクルでは発火せず、しばしば幅広い位相で発火した(図1A、1E、および1I)。聴覚明滅刺激の間の発火頻度のピーク間の間隔は、単一ユニットの大部分においておよそ25ミリ秒であった(40Hzと同等);ACでは75%、CA1では79%、そしてmPFCでは74%。(図1B、1F、および1J)。
対照的に、音調がない基準期間中、および無作為音調の期間中、ピークの間の間隔は、広範な分布を有し、AC中の11%未満の細胞、CA1中の12%未満の細胞、およびmPFC中の16%未満の細胞がおよそ25ミリ秒のピーク間隔を有していた(すなわち発火頻度は40Hzで調節されなかった。図1B、1F、および1J)。強度調節は、刺激位相に応じて単一ユニット発火頻度を検討し、そのベクトル強度(VS)を算出することで定量された(図1C、1G、および1K、左)。ベクトル強度値は、0~1の範囲であり、0は均一な発火分布を表しており、刺激により調節されない(VS=0)。1は特定の刺激位相に対してのみニューロンが発火する分布を表す(VS=1)。40Hzの聴覚刺激に対する単一ユニット反応のベクトル強度分布は、ACで0.002~1、HPCで0.0005~1、そしてPFCで0.1~0.6の範囲であり、刺激無し、ならびに無作為刺激よりも有意に高かった(図1C、1G、および1K、真ん中)。ベクトル強度は刺激による調節を測定するものであるため、無作為刺激ベクトル強度も、無刺激条件より有意に高かった。しかしベクトル強度は調節の周期性は定量化しない。無作為刺激が単一ユニット反応を惹起させいても、周期的な発火調節は誘導しなかった。
同様に、40Hzの聴覚刺激中の単一ユニットに対するレイリー統計分布は、刺激無し、および無作為刺激対照よりも有意に高かった(図1C、1G、および1K、右)。単一ニューロンの平均発火頻度は、40Hzの聴覚明滅刺激と、刺激無し対照、無作為刺激、20Hzおよび80Hzの聴覚明滅刺激の間で類似していた(図1D、1H、および1L;図8C、1I、および1O、右)。ACの局所電場電位は、聴覚明滅刺激中、40Hzで高いパワーを示したが、その効果は記録位置、記録セッションおよびマッピング音調に対する反応潜伏時間の間で変化していた(図8B、1H、および1N)。これらの研究結果から、40Hzの聴覚明滅刺激は、AC、CA1およびmPFCにおいてGENUSを確実に誘導したことが示唆される。
聴覚GENUSは、5XFADマウスにおいて記憶力を改善する
聴覚GENUSは海馬ニューロン活動に影響を与えることができると仮定し、次に6カ月齢の5XFADマウスにおける、海馬依存性の学習および記憶に対するその効果を評価した(図2A)。本発明者らは、行動障害が最初に明白になるときである6カ月齢の5XFADマウスを使用した。本発明者らは以下のすべての実験に対し、1週間の聴覚GENUSを実施した:具体的にはマウスを静かなチャンバー内に置き、1時間/日で7日間、1ミリ秒の長さの10kHzの聴覚音列に、40Hzの周波数(すなわち40(10kHz)音調/秒)で暴露させた。本発明者らは行動チャンバーにマウスを馴らすことから始め、その24時間後に新規の物体認知(NOR)検査および新規の物体位置(NOL)記憶力検査を行った。それらは特定の状況下で物体のアイデンティティと配置を記憶する能力を評価するものであり、ヒトAD対象において影響を受けることが知られている行動である。これらの検査は、認知インデックスを使用して行動力を測定する。このインデック
スは、それぞれ新規の物体、または新たな位置にある物体の探索に費やした時間の、探索の全期間に対する割合である。
スは、それぞれ新規の物体、または新たな位置にある物体の探索に費やした時間の、探索の全期間に対する割合である。
馴化中、聴覚GENUS群、無作為周波数群、そして非刺激群のいずれも平均速度、総距離、中心で過ごした時間、または周辺で過ごした時間において有意な変化は示さず、この3群は一般的な活動、または不安様行動において差異を示さなかったことが示唆される(図9E~9H)。聴覚GENUS後、5XFADマウスは、物体タスクで65.50±1.40%、位置記憶タスクで61.41±2.0%の有意に高い認知インデックスを示した。一方で非刺激対照群および無作為周波数対照群は二つの検査においてそれぞれ新規物体にも新たに動かされた物体にも選好を呈さなかった(図2Bおよび図2E)。この3群の間でタスク期間中の移動距離および平均速度に有意差はなかった。このことから、これら効果は活動における一般的な差異が原因ではなかったことが示唆される(図2C、2D、2F、および2G)。
NOR中に新しい物体と慣れた物体の探索に費やされた時間量が検証された。聴覚GENUS後のマウスは、新規物体で有意に高い時間量を費やし、一方で非刺激対照群および無作為周波数対照群は探索選好を呈さなかったことが観察された(図9A)。同様に、聴覚GENUS後のマウスは、新たな位置にある物体(NOL)で有意に高い時間量を費やし、一方で非刺激対照群および無作為周波数対照群は探索選好を呈さなかったことが観察された(図9C)。探索活動の差異を検証するための追加の対照測定値として、本発明者らは、物体タスク中、物体探索要件である20秒に達するまでにマウスが費やした時間量(分)を測定した。本発明者らは、この3群間で物体探索要件に達するまでにかかった時間において有意差はなかったことを観察した(図9Bおよび9D)。
海馬依存性行動に対する聴覚GENUSの効果をさらに解析するために、本発明者らはモリス水迷路検査を実施した。この検査は、周辺状況の合図と関連付けて隠されたプラットフォームの位置を記憶する能力を測定する。マウスは連続するトライアルを通じて隠されたプラットフォームの位置を次第に学習し、プラットフォーム位置に関する空間記憶は、逃避潜時により測定される。逃避潜時は個々のマウスが隠されたプラットフォームを発見するのにかかった時間の量である。トレーニングフェーズの間、3群すべてが隠されたプラットフォームの位置の学習に成功できた。しかし聴覚GENUSを受けた群の逃避潜時は一貫して、そして有意に、非刺激対照群および無作為周波数対照群の両方よりも短かった(図2H)。3群の間に、遊泳速度における有意差はなかった(図9I)。プローブトライアル中、または隠されたプラットフォームがタンクから取り除かれたとき、聴覚GENUSを受けたマウスは、消えたプラットフォームがあった四分円の探索に有意に長い時間を費やし、以前のプラットフォーム位置の上で、非刺激対照群と無作為周波数対照群の両方と比較して多くの交差数を呈した(図2Iおよび2J)。
最終的な行動測定として、本発明者らは、1時間の聴覚GENUS中、非刺激、または無作為周波数刺激中の5XFADマウスの活動を検証し、平均速度(cm/秒)と移動距離(cm)に有意差はなかったことを観察した(図9Jおよび9K)。「睡眠」状態または休止期間に差異があるかを調べるために、本発明者らは、1時間刺激群の間で、2cm/秒未満でマウスが費やした時間の量を測定した。本発明者らは、この3群の間に有意差はなかったことを観察した(図9L)。まとめると、これらの結果は、聴覚GENUSが、6カ月齢の5XFADマウスの認知記憶および空間記憶を改善し得ることを示す。
聴覚GENUSが、5XFADマウスのACおよび海馬において、アミロイド負荷量を減少させる
認知機能に対し、聴覚GENUSは有益な効果を有していたことから、本発明者らは、
5XFADマウスにおいて基盤であるアミロイド病変が改変され得るかを調べることとした。過去に本発明者らは、もっと若い3カ月齢のマウスにおける、アミロイド負荷量に対する視覚GENUSの改善効果を示している。本明細書では、6カ月齢のマウスに対する聴覚GENUSの効果を詳細に研究することを目的としている。このマウスはさらに進行したADの状態にあり、より多くのアミロイドプラーク負荷量を呈する。マウスを静かなチャンバー内に置き、40Hz、8Hz、80Hz、無作為周波数刺激を含む一連の異なる聴覚音調-列の周波数に暴露させるか、または刺激を与えなかった。7日間の刺激が完了して24時間後、本発明者らは、ACおよび全海馬(HPC)中のアミロイド負荷量を酵素結合免疫吸着法(ELISA)により分析した。40Hzの聴覚刺激後、本発明者らは、音調無し対照または追加の周波数対照と比較して、可溶性Aβ1-42レベルが、ACにおいて51.48±4.98%に減少し、HPCにおいて46.89±3.89%に減少した一方で、ACおよびHPC中の可溶性Aβ1-40レベルはそれぞれ20.65
±3.21%および34.15± 4.83%に減少したことを確認した(図3Aおよび図10A)。同様に不溶性Aβ1-42レベルは、ACにおいて36.68±3.21%、HPCにおいて43.84±2.42%に減少した(図3B)。不溶性Aβ1-40は聴覚GENUSまたは無刺激対照の両方ともELISAでは検出できなかった。
5XFADマウスにおいて基盤であるアミロイド病変が改変され得るかを調べることとした。過去に本発明者らは、もっと若い3カ月齢のマウスにおける、アミロイド負荷量に対する視覚GENUSの改善効果を示している。本明細書では、6カ月齢のマウスに対する聴覚GENUSの効果を詳細に研究することを目的としている。このマウスはさらに進行したADの状態にあり、より多くのアミロイドプラーク負荷量を呈する。マウスを静かなチャンバー内に置き、40Hz、8Hz、80Hz、無作為周波数刺激を含む一連の異なる聴覚音調-列の周波数に暴露させるか、または刺激を与えなかった。7日間の刺激が完了して24時間後、本発明者らは、ACおよび全海馬(HPC)中のアミロイド負荷量を酵素結合免疫吸着法(ELISA)により分析した。40Hzの聴覚刺激後、本発明者らは、音調無し対照または追加の周波数対照と比較して、可溶性Aβ1-42レベルが、ACにおいて51.48±4.98%に減少し、HPCにおいて46.89±3.89%に減少した一方で、ACおよびHPC中の可溶性Aβ1-40レベルはそれぞれ20.65
±3.21%および34.15± 4.83%に減少したことを確認した(図3Aおよび図10A)。同様に不溶性Aβ1-42レベルは、ACにおいて36.68±3.21%、HPCにおいて43.84±2.42%に減少した(図3B)。不溶性Aβ1-40は聴覚GENUSまたは無刺激対照の両方ともELISAでは検出できなかった。
本発明者らの結果は、観察されたアミロイドの減少は40Hzの刺激に特異的であり、8Hz、80Hz、そして無作為周波数刺激のいずれも無刺激対照と比較してAβレベルは有意に変化しないことを示す。これらの効果が他のADマウスモデルにも適用できるかを決定するために、そして本発明者らの結果が、5XFADモデルに特異的なものであるかを決定するために、本発明者らは、6カ月齢のAPP/PS1トランスジェニックマウスの7日間の聴覚GENUS後のAβレベルを検証した。このマウスは実証済みのADモデルである。本発明者らは、可溶性Aβ1-42が無刺激対照と比較してACにおいて48.39±3.50%、そしてHPCにおいて35.54±4.27%に有意に減少していたことを見出した(図10B)。
次に本発明者らは、β-アミロイド特異的抗体(Cell Signaling Technology社;D54D2)を使用した免疫組織化学分析で5XFADマウスモデル中のプラーク負荷量を検証した(図3Cおよび図3D)。プラーク数は、無刺激対照と比較して、7日間の聴覚GENUS後、ACおよびCA1のそれぞれで45.73±2.818%および59.30±2.083%に有意に減少した(図3E)。プラークの大きさもACおよびCA1のそれぞれで54.37±5.603%および40.70±5.321%に有意に減少した(図3F)。Aβ1-42特異的な免疫染色分析から、ACおよびCA1のそれぞれで45.35±0.011%および43.21±0.0285%のAβ1-42沈着の有意なな減少が示唆された(図3G~3I)。40Hz刺激後のプラーク負荷量の動態を検証するために、本発明者らは、β-アミロイド特異的抗体(Cell
Signaling Technology社;D54D2)を使用した免疫組織化学染色法を5XFADマウスで実施した。当該マウスは最初に1週間の聴覚GENUSを与え、次の7日間は無刺激とした。平均プラーク数、プラーク面積およびアミロイド強度に若干の減少が観察されたが、有意な差ではなかった(図10F~10Hを参照のこと)。別のADモデルにおける聴覚GENUS後のプラーク負荷量を検証するために、本発明者らは、9カ月齢のAPP/PS1マウスを使用した。6カ月齢のマウスでは顕著なプラーク発現を呈さないため9カ月齢を使用した。
Signaling Technology社;D54D2)を使用した免疫組織化学染色法を5XFADマウスで実施した。当該マウスは最初に1週間の聴覚GENUSを与え、次の7日間は無刺激とした。平均プラーク数、プラーク面積およびアミロイド強度に若干の減少が観察されたが、有意な差ではなかった(図10F~10Hを参照のこと)。別のADモデルにおける聴覚GENUS後のプラーク負荷量を検証するために、本発明者らは、9カ月齢のAPP/PS1マウスを使用した。6カ月齢のマウスでは顕著なプラーク発現を呈さないため9カ月齢を使用した。
プラーク数は、ACで52.65±7.53%、CA1で62.90±15.5%に有意に減少したことが観察された。プラークの大きさは、ACで67.90±6.18%、CA1で64.06±15.2%に有意に減少した。Aβ1-42抗体(BioLegend社;12F4)を使用したAβ1-42特異的免疫染色分析から、無刺激対照と比較してACおよびCA1のそれぞれでAβ1-42沈着に38.77±4.21%および4
7.63±6.08%の有意な減少が示唆された(図10C~10E)。まとめるとこれらの結果から、聴覚GENUSは、ADマウスモデルにおいてACおよびCA1においてガンマ活動を同調させ、アミロイド負荷量を減少させ得ることが実証される。
7.63±6.08%の有意な減少が示唆された(図10C~10E)。まとめるとこれらの結果から、聴覚GENUSは、ADマウスモデルにおいてACおよびCA1においてガンマ活動を同調させ、アミロイド負荷量を減少させ得ることが実証される。
聴覚GENUSは、5XFADマウスにおいてグリア反応および血管反応を誘導する
ミクログリアがニューロン活動の変化の原因であり、AD病変で何らかの役割を果たしているとする証拠が蓄積されつつある(Allen and Barres,2005,Mosher and Wyss-Coray,2014,Walker and Lue,2015)。ACおよびHPCでアミロイド負荷量を減少させる能力を鑑み、聴覚GENUSが6カ月齢の5XFADマウスにおいてミクログリア反応の変化を刺激し得るかを検証した。ミクログリアは貪食を含む活性化状態中に細胞形態を変化させることが示されており(Davies et al.,2016)、実際に本発明者らの過去の研究により、1時間の視覚GENUSで、VCの活性化と貪食活性の増加と合致したミクログリアの形態変化を誘導するのに充分であることが実証された(Iaccarino et al.,2016)。ミクログリアマーカーのIba1に対する抗体を使用して(図4Aおよび4B)、無刺激対照と比較し、聴覚GENUS群のACおよびCA1の両方でおよそ60%多いミクログリアが観察された(図4C)。無刺激対照と比較して、聴覚GENUS後、ミクログリア細胞体面積がACで70.60±4.78%、CA1で117.17±10.4%まで増加した(図4D)。さらに本発明者らは無刺激対照と比較して、ミクログリア突起長が46.44±3.2%(AC)および50.875.±4.8%(CA1)に減少し、突起分枝が36.00±9.5%(AC)および143.813±29.9%(CA1)まで増加したことを見出した(図4Eおよび4F)。ミクログリアのAβ取り込みを評価するために、本発明者らは、Iba1抗体およびAβ1-42に特異的なAβ抗体(12F4、方法を参照のこと)を用いて組織切片を共免疫染色することにより、ミクログリア内のAβの共局在を測定した。ミクログリア細胞体がAβと共局在しているミクログリアの割合は、無刺激対照と比較して、聴覚GENUS後にACで58.75±1.25%、CA1で61.33±3.71%まで増加していることが観察された(図4G)。
他のADマウスモデルで聴覚GENUS後にミクログリア反応が発生するかを検証するために、本発明者らは、7日間の聴覚GENUS後の9カ月齢のAPP/PS1マウスでミクログリアの形態を測定した。7日間の聴覚GENUS後の5XFADのミクログリアで見られた結果(図4A~4Gを参照)と類似して、無刺激対照と比較して、ACおよびCA1におけるミクログリア細胞体の直径および数の有意な増加、ならびに平均突起長の有意な減少が観察された(図11A~11C)。
聴覚GENUS後の5XFADマウスにおけるミクログリア反応の長期的な効果を理解するために、本発明者らは、1週間の聴覚GENUS後に無刺激の7日を置き、ミクログリアの形態を検証した。アミロイド(図10F~10H)と類似した傾向が観察された。具体的には、有意ではない聴覚皮質中のミクログリア細胞体直径の増加、平均突起長の減少、およびミクログリア数の増加である(図11D~11Fを参照)。しかし非刺激対照と比較した場合、CA1のミクログリア数には有意な増加(41.70±6.75%)が認められた。
星状細胞は中枢神経系におけるもう一つの主要グリア細胞であり、ホメオスタシスの維持、シナプス刈り込み(synaptic pruning)、老廃物のクリアランス、そして例えば脳血流の制御といった他の重要な生物プロセスに必須である(Chung et al.,2015,Kisler et al.,2017)。反応性様(reactive-like)星状細胞は、グリア細胞線維性酸性タンパク質(GFAP)を発
現する(Eng et al.,1971)。6カ月齢の5XFADマウスとWT同腹子の対照マウスの間に反応性星状細胞数の基準変化があるかを調べるために、本発明者らは100μmのCA1脳切片にCLARITYを実施し、GFAP抗体で染色した(図11G)。5XFADマウスは、WT対照と比較した場合、GFAP陽性の星状細胞数が有意に少ないことが観察された(図11H)。この結果は、他のADトランスジェニックマウスモデルが、類似したグリア細胞の機能低下を有することを示す報告と一致している(Rodriguez et al.,2009)。聴覚GENUSが星状細胞の反応性に影響を与え得るかを決定するために、本発明者らは、6カ月齢の5XFADマウスに1時間/日の聴覚GENUSまたは無刺激対照のいずれかを7日間行い、その後、GFAPに対する抗体、反応性様星状細胞で発現されていることが示されているもう一つのタンパク質であるS100カルシウム結合タンパク質B(S100B)に対する抗体を使用して脳切片を免疫染色した(図4Hおよび4I)。GFAP陽性の星状細胞は、ACおよびCA1のそれぞれで27.66±0.954%および18.14±0.799%まで増加していた。S100B陽性星状細胞は、ACで21.83±1.07%、CA1で15.57±0.869%(図4Jおよび4K)まで増加していた。聴覚GENUS後の星状細胞数において観察されたこの変化は、星状細胞生存数の潜在的な増加を示している。
現する(Eng et al.,1971)。6カ月齢の5XFADマウスとWT同腹子の対照マウスの間に反応性星状細胞数の基準変化があるかを調べるために、本発明者らは100μmのCA1脳切片にCLARITYを実施し、GFAP抗体で染色した(図11G)。5XFADマウスは、WT対照と比較した場合、GFAP陽性の星状細胞数が有意に少ないことが観察された(図11H)。この結果は、他のADトランスジェニックマウスモデルが、類似したグリア細胞の機能低下を有することを示す報告と一致している(Rodriguez et al.,2009)。聴覚GENUSが星状細胞の反応性に影響を与え得るかを決定するために、本発明者らは、6カ月齢の5XFADマウスに1時間/日の聴覚GENUSまたは無刺激対照のいずれかを7日間行い、その後、GFAPに対する抗体、反応性様星状細胞で発現されていることが示されているもう一つのタンパク質であるS100カルシウム結合タンパク質B(S100B)に対する抗体を使用して脳切片を免疫染色した(図4Hおよび4I)。GFAP陽性の星状細胞は、ACおよびCA1のそれぞれで27.66±0.954%および18.14±0.799%まで増加していた。S100B陽性星状細胞は、ACで21.83±1.07%、CA1で15.57±0.869%(図4Jおよび4K)まで増加していた。聴覚GENUS後の星状細胞数において観察されたこの変化は、星状細胞生存数の潜在的な増加を示している。
星状細胞は脳の脈管系ネットワークの制御に重要な役割を果たすことが知られており、ADでこのネットワークが機能障害になると病変が悪化し得ることを示唆する証拠が蓄積されている。脳からのアミロイドのクリアランスは多面的であり、脈管系を介した様々なプロセス、例えばグリアリンパ系(glymphatic)システムを通した、およびエンドサイトーシス受容体リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP1:endocytic receptor lipoprotein receptor-related protein 1)による輸送を介したプロセスが提唱されている。
脈管系の潜在的な変化を調べるために、本発明者らは最初に血管内皮の効率的なマーカーであるトマトレクチン(Lycopersicon esculentum)を使用して、聴覚GENUS後の5XFAD脳切片を染色した(図5Aおよび5B)。興味深いことに、無刺激対照と比較した聴覚GENUS後の血管の直径において、49.70±7.80%(AC)および104.70±10.96%(CA1)の増加が観察された(図5C)。さらにアミロイド-血管の相互作用が聴覚GENUS後に変化するかを探索した。聴覚GENUSが、LRP1とAβの共局在に影響を与えうるかを、1時間/日で7日間の聴覚GENUSに暴露されるか、または無刺激のいずれかの5XFADマウスの脳切片でLRP1とAβを染色することにより検証した(図5Dおよび5E)。LRP1は脈管系を介したAβの輸送と全身からの排泄に重要な役割を果たすことが示されている(Storck et al.,2016)。無刺激対照では、8.17±2.70%(AC)および6.97±1.73%(CA1)のAβとLRP1の共局在が観察された。一方で聴覚GENUS群では、AβとLRP1の共局在は、ACおよびCA1でそれぞれ17.71±2.78%および16.50±3.90%にまで有意に増加していた(図5F)。まとめると、聴覚GENUS後のACおよびCA1におけるAβレベルの低下に対する一つの説明としては、ミクログリアを通したAβクリアランスの増加と脈管系の変化による可能性があることが、これらの結果から示唆される。
聴覚GENUSは、ACおよび海馬においてタウのリン酸化を減少させる
ADのもう一つの古典的な病理的特徴は、リン酸化タウ凝集体の蓄積である。ADと関連した特定のアミノ酸残基でのタウのリン酸化が、その細胞骨格支持機能を変化させ、溶解度を低下させることが示されており、これが主要なニューロン損傷であると提唱されている。聴覚GENUSが、別のAD関連マウスモデルの病変に影響を与え得るかを調べるために、本発明者らはタウP301Sマウスを使用した。タウP301Sマウスは6カ月
齢で空間学習と文脈学習の欠落を呈し始めるため、本発明者らは、6カ月齢のタウP301SマウスのACおよびHPCにおいて、聴覚GENUSがリン酸化タウの減少を導き得るかを検証した。これらマウスの脳切片の免疫組織化学染色(図12A、12B、12Dおよび12E)から、聴覚GENUSが、タウリン酸化を、スレオニン-181(T181)で36.20±2.828%(AC)および38.70±2.737%(CA1)まで減少させ、セリン-396(S396)で37.90±3.469%(AC)および40.80±4.528%(CA1)まで減少させた(図12Cおよび12F)ことが示される。ウェスタンブロット(WB)実験により、S396でのタウリン酸化の免疫組織化学染色結果が確認され、ACおよび全海馬組織でそれぞれ、総タウと比較して33.83±0.20%および43.20±1.50%のリン酸化の減少が示された(図12G、12H、12Jおよび12K)。WB分析で、海馬でリン酸化T181タウの34.50±1.61%の減少が示されたが、ACでは差異は有意ではなかった(図12Iおよび12L)。まとめると、これらの結果から、聴覚GENUSが、AD関連の過リン酸化エピトープのレベルを減少させ得ること、および聴覚GENUSが、タウオパチーマウスモデルにおいて病変に影響を与え得ることが示される。
齢で空間学習と文脈学習の欠落を呈し始めるため、本発明者らは、6カ月齢のタウP301SマウスのACおよびHPCにおいて、聴覚GENUSがリン酸化タウの減少を導き得るかを検証した。これらマウスの脳切片の免疫組織化学染色(図12A、12B、12Dおよび12E)から、聴覚GENUSが、タウリン酸化を、スレオニン-181(T181)で36.20±2.828%(AC)および38.70±2.737%(CA1)まで減少させ、セリン-396(S396)で37.90±3.469%(AC)および40.80±4.528%(CA1)まで減少させた(図12Cおよび12F)ことが示される。ウェスタンブロット(WB)実験により、S396でのタウリン酸化の免疫組織化学染色結果が確認され、ACおよび全海馬組織でそれぞれ、総タウと比較して33.83±0.20%および43.20±1.50%のリン酸化の減少が示された(図12G、12H、12Jおよび12K)。WB分析で、海馬でリン酸化T181タウの34.50±1.61%の減少が示されたが、ACでは差異は有意ではなかった(図12Iおよび12L)。まとめると、これらの結果から、聴覚GENUSが、AD関連の過リン酸化エピトープのレベルを減少させ得ること、および聴覚GENUSが、タウオパチーマウスモデルにおいて病変に影響を与え得ることが示される。
聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせが、ミクログリアによるクラスター形成性の表現型反応を誘導することを示す
これまでのところ本発明者らの研究結果により、聴覚GENUSがアミロイドレベルを減少させ、皮質性感覚野と海馬においてグリア性および脈管性の変化を誘導し得ることが示された。これにより、聴覚GENUSと視覚GENUSの組み合わせが、より大きな細胞効果を惹起させ得るかについて調査を行うこととした。40Hzの聴覚音調刺激と40Hzの光明滅の組み合わせが、AC、CA1およびmPFCのニューロン反応を同調させ得るかを最初に決定した。本発明者らは、3~8カ月齢のオスの野生型(C57BL6J)マウスに、1ミリ秒のの長さの聴覚音調と12.5ミリ秒の長さの光パルスを40Hzの周波数で提示しながら、32チャンネルのシリコンプローブを使用して、動物が球状トレッドミル上で走ったり休息しているときのAC、CA1およびmPFCにおけるニューロン活動を記録した。それぞれの音調期間と点灯期間で周期的にスパイクは増減し、聴覚-視覚刺激の組み合わせの間、40Hzへと同調した(図6A~6C、左)。ベクトル強度分布は、無作為刺激条件または無刺激条件よりも、40Hzの聴覚-視覚刺激中のほうが有意に高かった(図6A~6C、右)。したがってAC、CA1およびmPFC中の単一ニューロンのスパイクは、基準期間中よりも聴覚-視覚刺激期間中により顕著に40Hzに同調した。AC、HPCおよびmPFC中の局所電場電位は、聴覚-視覚明滅刺激中、40Hzで高いパワーを示したが、その効果はmPFC中では非常に小さかった(図13A、13H、および13O)。したがって40Hzの音調と光刺激が、AC、CA1およびmPFCにおいてGENUSを誘導した。
局所電場電位(LFP)反応および単一ユニット平均発火頻度において、聴覚刺激と、聴覚-視覚刺激の組み合わせの間の差異が、小さくはあるがmPFCにおいて観察された。組み合わせ刺激中、40HzでLFPのパワーにわずかな上昇があったが、聴覚のみの刺激の間ではなかった(図8Nおよび図6O)。さらに組み合わせ刺激と基準の間の平均発火頻度差異の分布は、ゼロとは有意に異なるメジアンを有していたが、聴覚のみの刺激では、ゼロとは有意に異ならなかった(図8Oおよび図6U)。
1時間/日で7日間の組み合わせGENUS後、本発明者らは、ミクログリアの形態学的特徴と、AC、VCおよびCA1におけるAβとの相互作用を検証した(図6Dおよび6E)。高次認知領域は複合的な様式の感覚刺激を処理することが知られているため、本発明者らは、組み合わせGENUSが、内側前頭前皮質(mPFC)でも同様にミクログリア効果を惹起させ得るかを検証した。ミクログリアは非刺激対照と比較して体細胞面積
(soma area)で有意な増加を呈したが、突起長は有意に減少したことが判明した(図6Fおよび6G)。ミクログリア数も、組み合わせGENUSの後にAC、VC、CA1およびmPFCで有意に増加している(図6H)。聴覚刺激または視覚刺激の単独群のミクログリア(図14A~14D、14Gおよび14H)は、AC、VC、およびCA1において突起長の減少と体細胞面積の拡大を呈したが、mPFCでは呈さなかった。
(soma area)で有意な増加を呈したが、突起長は有意に減少したことが判明した(図6Fおよび6G)。ミクログリア数も、組み合わせGENUSの後にAC、VC、CA1およびmPFCで有意に増加している(図6H)。聴覚刺激または視覚刺激の単独群のミクログリア(図14A~14D、14Gおよび14H)は、AC、VC、およびCA1において突起長の減少と体細胞面積の拡大を呈したが、mPFCでは呈さなかった。
視覚GENUSとは対照的に、聴覚GENUSは、CA1においてミクログリア数の有意な増加を示した。しかし聴覚GENUSも視覚GENUSも単独ではmPFCにおいてミクログリア数の有意な変化を惹起しなかった(図14Eおよび14I)。これらの研究結果から、1週間のGENUSの後、聴覚刺激単独または視覚刺激単独ではなく、聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせのみがmPFCにおいてミクログリア反応を促進したことが示される。
興味深いことに、組み合わせGENUS群のミクログリアは、アミロイド沈着を取り囲む封入効果を呈することで活性に変化を示すと思われた。ミクログリア-Aβのクラスター形成表現型をさらに解明するために、本発明者らは、組み合わせGENUS後および無刺激対照の5XFAD脳切片から撮影されたAC、VC、CA1およびmPFCの画像からの三次元(3D)レンダリングを生成した(「図6Dおよび6E」の「3D再構成」カラムに示される)。IMARISイメージングソフトウェア(方法を参照のこと)を使用して、本発明者らは、アミロイド沈着(赤色スポット)とミクログリア細胞(緑色スポット)の3D表面を生成し、アミロイド沈着の半径25μm以内のミクログリアの近接性と数を定量した(右端差し込み図、図6Dおよび6E、組み合わせGENUS後および無刺激対照のミクログリア-Aβのクラスター形成表現型を示す映像例は、追加ビデオ1および2に提示される)。無刺激対照と比較して、組み合わせGENUS後のアミロイドプラーク周囲の半径25μmを取り囲むミクログリアの数において、ACで48.88±0.651%、VCで31.56±1.11%、およびmPFCで38.64±0.959%の有意な増加が観察された(図6I)。さらにCA1においても33.05±2.65%の有意ではない増加が観察された。ミクログリア-Aβのクラスター形成表現型が、組み合わせGENUS後に特異的な表現型であるかを検証するために、本発明者らは、聴覚GENUS単独または視覚GENUS単独後のアミロイド沈着の半径25μm以内のミクログリアの数を分析した。GENUSマウスと無刺激マウスの間に、1プラーク当たりのミクログリア数に有意差は観察されなかった(図14Fおよび14J)。
次に本発明者らは、AC、CA1およびmPFCにおける7日間の40Hzの聴覚GENUS、組み合わせGENUS、80Hz、または無作為周波数刺激の後の6カ月齢の5XFADマウスのミクログリア反応の周波数特異性に取り組んだ。追加周波数および無刺激対照と比較して、40Hzの聴覚刺激および組み合わせGENUSの後、ACおよびCA1においてミクログリア細胞体の直径および数の有意な増加、ならびに平均突起長の有意な減少が観察された。
40Hzの聴覚刺激、追加周波数および無刺激対照と比較して、組み合わせGENUSのみが、mPFCにおいてミクログリア反応を生じさせた(図14K~14M)。これらの結果から、組み合わせGENUSがニューロン活動の変化を通してミクログリア反応を強化することが示される。したがって、本発明者らは、組み合わせGENUSが、AC、VCおよびmPFCにおいて拡張されたミクログリアクラスター形成反応を誘導すると結論づけた。
聴覚単独または視覚単独ではなく、聴覚GENUSと視覚GENUSの並行が、mPFCにおいてアミロイド負荷量を減少させる
AC、VC、CA1およびmPFCにおけるミクログリア反応に関する研究結果から、組み合わせGENUSが、1時間刺激で7日後のそれら領域中のアミロイドレベルも変化させ得るかを調べることにした。抗Aβ抗体(D54D2)を使用した免疫組織化学解析から、無刺激対照と比較して、組み合わせGENUS後のプラークの面積(ACで56.34±6.35%、VCで71.50±6.51%、およびCA1で69.73±6.48%)および数(ACで50.02±3.74%、VCで50.60±10.9%、およびCA1で48.80±11.1%)の減少が示された。驚くべきことにこれら結果から、無刺激対照と比較して、組み合わせGENUS群においてmPFC中のプラークの大きさの59.64±8.71%の減少、およびプラーク数の2倍の減少が示された(図7A~7D)。聴覚GENUS単独および視覚GENUS単独のいずれも、mPFCにおいてアミロイドプラーク染色の減少を惹起させることができず、組み合わせGENUSに特異的な反応であったことが示唆される(図14N~14S)。視覚GENUSは、CA1でもプラークの大きさまたは数に変化を示さなかった。聴覚GENUS単独処置および組み合わせGENUS処置の両方とも、ACおよびHPCにおいて、Aβ-ELISAで測定した場合に可溶性Aβ1-42および不溶性Aβ1-42のレベル減少を示した。一方で、組み合わせ無作為明滅、8Hz、または80Hzの刺激は、ACまたはHPCにおいてアミロイドレベルに有意な効果を有していなかった(図14Tおよび14U)。
次に様々な周波数の感覚刺激を用いて6カ月齢の5XFADマウスを処置し、mPFC中のAβの減少が、刺激のタイプ特異的(聴覚単独と組み合わせの比較)であるのか、または周波数特異的であるのかを決定した。Aβ-ELISAを使用してmPFC中のアミロイドレベルの変化を測定したところ、組み合わせ8Hz、40Hzの聴覚刺激、組み合わせ無作為周波数刺激、または無刺激群の間では、可溶性または不溶性のAβ1-42に有意差は観察されなかった。対照的に組み合わせGENUS群は、無刺激群と比較して、mPFC中で可溶性Aβ1-42の59.58±7.26%の減少、および不溶性Aβ1-42の34.17±8.20%の減少を示した(図7Eおよび7F)。
さらにβ-アミロイド特異的抗体(Cell Signaling Technology社;D54D2)を使用した免疫組織化学分析により、7日間の40Hz聴覚GENUS、組み合わせGENUS、80Hzまたは無作為周波数刺激の後の6カ月齢の5XFADマウスにおけるプラーク負荷量を測定した。40Hzの聴覚刺激および組み合わせGENUS後のACおよびCA1において、平均プラーク数の有意な減少が観察された。しかし、組み合わせGENUSのみが、追加周波数対照および無刺激対照と比較して、mPFC中のプラーク数の有意な減少を生じさせた(図7Cおよび7D)。Aβ1-42抗体を使用したAβ1-42特異的免疫染色解析から、40Hzの聴覚刺激および組み合わせGENUSの後のACおよびCA1における顕著なAβの減少が示された。しかし組み合わせGENUSのみが、mPFCにおける免疫染色強度の有意な減少を生じさせた(図14V)。
mPFCにおけるアミロイド負荷量の減少から、組み合わせGENUSが、より広範囲の皮質領域に影響を与えることが提唱される。皮質全体のアミロイドプラーク存在量に対する、組み合わせGENUSの全体的な効果を決定するために、本発明者らは、1週間の組み合わせGENUS後の6カ月齢の5XFADマウスにおいて全脳SHIELD処理(方法)を実施し、アミロイドプラークを免疫染色した(D54D2抗体を使用)(図7Gおよび7H)。ライトシート顕微鏡を使用し、3Dでプラークを解析したところ、無刺激対照と比較して、新皮質中のプラークの総量および総数がそれぞれ37%および34%減少していたことが判明した(図7Iおよび7J、組み合わせGENUS後、および無刺激対照のプラークが免疫染色された3D全脳SHIELDサンプルを示す映像例は、追加映像3および4に提示される)。まとめると、これらの結果から、組み合わせGENUSは、5XFADマウスモデルの新皮質全体のアミロイドプラーク負荷量を有意に減少させる
ことが示される。
ことが示される。
方法
動物
すべての動物研究は、マサチューセッツ工科大学の比較医学部門の動物実験委員会およびジョージア工科大学の動物実験委員会の承認を受けた。マウスは標準的な12時間の明/12時間の暗のサイクルで、5匹以下の群で飼育された。すべての実験は、明サイクルの間に実施された。電気生理学実験はジョージア工科大学で実施され、オス(1~3ヵ月齢)の野生型マウス(C57Bl/6)は、Jackson laboratoryから入手した。マウスは12時間の明/12時間の暗の逆のサイクルで飼育され、すべての実験は暗サイクルの間に実施された。食物と水は制限なく提供された。
手術手順
すべての手術は、Iaccarino and Singer et al.,2016に記載されるとおりに実施された。簡潔に述べると、ヘッドプレートの配置手術前に、成体(2~3ヶ月齢の)マウスをイソフルランで麻酔した。カスタムステンレス鋼ヘッドプレートは、歯科セメント(C&B Metabond社、パーケル)を使用して固定され、LFP記録の標的開頭部位は、頭蓋骨上にマークされた(mm単位、前頂(bregma)から:CA1標的に対しては、-2.0前方/後方、±1.8内側/側方、聴覚皮質標的に対しては、-2.0~-3.0前方/後方、±1.8内側/側方、そして前頭前野皮質標的に対しては、+1.3~+1.4前方/後方、±1.0内側/側方)。開頭は後に3~8カ月齢のマウスで実施された。最初の記録セッションの前に、歯科ドリルを用いて頭蓋骨を薄く削り、27ゲージの針で穴をあけることで開頭部分(直径200~500μm)が作製された。記録しない場合、滅菌シリコンエラストマー(Kwik-Sil
WPI)で開頭部分を密閉した。
WPI)で開頭部分を密閉した。
電気生理記録
記録中、頭部が固定された動物は、空中浮動性の8インチ(約20.3センチ)の球状トレッドミル上で走った。すべての動物は、時折甘いコンデンスミルク(1:2水希釈)を与えられながら、快適になるまでトレッドミル上で動くことをすでに学習していた。動物は最大で5時間、ボール上にいて、その間、走ったり休んだりの複数の期間があった。シングルシャンク32チャンネルプローブ(NeuroNexus社)が標的位置に進められた。記録部位は250μmに及んだ。聴覚皮質記録については、プローブは、前頭面に沿って垂直線から45度の角度で、3~4.15mmの深さまで進められた。5、10、15および20kHzの一連の50ミリ秒の音調が提示され、平均LFPにおける聴覚反応を検出した。CA1記録については、プローブは、海馬錐体層の電気生理学的特徴(大きなシータ波と鋭い波紋、複数チャンネル上に150+μVスパイク)が観察されるまで、開頭部分を通して1.14~2.05mmの深さまで垂直に進められた。前頭前野皮質記録については、プローブは、前頭面から49度の角度で、垂直線から20度の角度で、1.48~2.15mmの深さまで進められた。同一の記録セッションの間に複数の深さでデータを収集した場合;新たな深さはマッピングされ、記録部位の位置が標的の位置に留まっていることが確認された(ACについては5匹のマウスの9回のセッションで、n=9の深さ記録、CA1については5匹のマウスの10回のセッションで、n=12の深さ記録、mPFCについては4匹のマウスの7回のセッションで、n=7の深さ記録)。データは、参照値としてグラウンドペレット(ground pellet)を使用し、Intan RHD2000 Evaluation Systemを使用して20k
Hzのサンプリングレートで取得された。
Hzのサンプリングレートで取得された。
電気生理学的記録のための聴覚刺激および視覚刺激
10秒間の刺激ブロックと10秒間の基準期間を交互において、動物に提示した。刺激ブロックは、20Hz、40Hz、80Hzまたは無作為刺激周波数(パルスは25ミリ秒の平均間隔で、一様分布から決定された無作為化パルス間隔で送達された)の聴覚刺激のみ、または聴覚刺激と視覚刺激の間で循環された。刺激ブロックは交互に配置され、観察結果が、ニューロン反応の経時的な変化が原因ではないことを確認した。すべての聴覚パルスは、1ミリ秒の長さ、10kHzの音調であった。すべての視覚パルスは、刺激周波数(25ミリ秒、12.5ミリ秒、または6.25ミリ秒の長さ)の50%負荷サイクルであった。組み合わせ刺激については、聴覚パルスと視覚パルスは、各パルスの開始に位置合わせされた。
データ取得
データは、Intan RHD2000 Evaluation Systemを使用して20kHzのサンプリングレートで取得された。
スパイク検出
未処理トレースは300~6,000Hzの間でバンドパスフィルタ処理された。次いで、フィルター処理シグナルのメジアンに5倍の推定標準偏差を足した閾値(メジアン/0.675)によりスパイクが検出された。
スパイクソーティングおよび単一ユニットの安定性
スパイクの検出とソーティングは、MountainSort automated spike sortingを使用して実施され、その後に波形と交差-相関曲線(cross-correlograms)の目視検査に基づく人力キュレーションが行われた。人力キュレーションの前に、クオリティ閾値が適用され、1以上のピークSNRを有し、10%未満のノイズ重複、そして他のユニットから95%超が単離され、綺麗に単離された単一ユニットが形成されたユニットのみが含まれた。記録中の単一ユニットが無くなる不安定期間を説明するために、安定性基準を適用し、安定期間(単一ユニットの発火頻度の突然の消失がない)のみを分析で検討した。各ユニットに対する発火頻度(FR)は、記録セッションの間にコンピューター計算された。発火頻度は、k-meansクラスタリングを使用し、低FRと高FRの二つの分布にクラスター化された。高FR平均の10%よりも下回ったFRを有するユニットについてはさらなる解析を行い、FRが低FR平均より2標準偏差高い、最も長い期間として規定される安定的記録期間を特定した。
局所的電場電位
LFPは、未処理トレースを2kHzにダウンサンプリングし、1~300Hzにバンドパスフィルタを行うことで取得された。
分析用記録部位
ACおよびCA1のデータを複数のチャンネルで分析した。ACでは、32個のチャネルのうち、低いほうの16個が、375μmにわたり利用された。プローブの最も低いチャンネルを使用してACの位置を決定し、高いほうの16個は、主要対象領域ではないと
決定された。CA1については、プローブ上のすべての機能チャンネルが250μmにおよび解析された(27/32または31/32)。ACおよびCA1の両方で、プローブ上の最も高いチャンネルはパワースペクトル解析用のプローブ基準として使用された。同様の結果が、基準としてグラウンドを使用して取得された。
決定された。CA1については、プローブ上のすべての機能チャンネルが250μmにおよび解析された(27/32または31/32)。ACおよびCA1の両方で、プローブ上の最も高いチャンネルはパワースペクトル解析用のプローブ基準として使用された。同様の結果が、基準としてグラウンドを使用して取得された。
前頭前野皮質の組織検査
各動物における最終のmPFC記録中、プローブはDilでコーティングされ、標的深度に挿入された。マウスは、麻酔(イソフルラン)下でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、4%パラホルムアルデヒドで経心臓かん流され、脳は1xPBS中、4%パラホルムアルデヒドで一晩、ポストフィックス(post-fixed)された。Leica VT1000S vibratome(Leica社)を用いて100μmの厚さに脳を切片化した。1xPBS中、0.2% 1mMol DAPIで切片を染色し、Vectashield標本培地を用いて顕微鏡スライド上に封入した。Zen Blue 2ソフトウェアを備えたZeiss Axio Observer Z1倒立落射蛍光顕微鏡上で画像を取得した。
パワースペクトル
パワースペクトル密度解析は、Chronux toolboxのマルチテーパ(multitaper)法を使用して実施された(時間帯域積=3、テーパ数=5)。LFPトレースは、各刺激条件の10秒トライアルに分割された。平均パワースペクトル密度は、これらトライアル全体で、頭蓋骨上の生理食塩水中のグラウンドペレットを基準とし、各動物に対してコンピューター計算された(同じ記録日および記録深度内で)。当初、パワースペクトル密度分析は、AC、CA1、およびmPFCのすべての記録部位に対して計算された。各記録深度から、40Hzの明滅刺激への反応で最も大きな40Hzピークを有するトレースが解析に含められた。提示データ中に示される深度あたりのトレースは、聴覚明滅刺激の反応で最も大きな40Hzピークを有していたものである。
明滅刺激中の発火
各刺激周波数に対する、単一ユニットの刺激周辺時間ヒストグラム(PSTH:peri-stimulus time histograms)には、四つの刺激サイクル
が含有され、1サイクルあたり10ビンが伴う場合、刺激列全体のスパイクが示される。PSTHは、各点灯パルスまたは各オーディオオンパルスの開始の前後の二つの刺激サイクルに対しスパイクをビニングすることで、すべての単一ユニットに対しコンピューター計算された。無刺激のヒストグラムは、無作為刺激条件と同様に無作為分布したパルス時間を使用して算出された。発火頻度は、1ビンあたりのスパイク数を、パルス総数およびビンサイズにより割ることで、各ビンでコンピューター計算された。刺激周波数に関連する発火頻度の周期性を定量するために、発火頻度ピーク間の時間間隔を、すべての単一ユニットヒストグラムに対して算出した。各PSTHのピークは、一つの刺激間隔内の最大発火頻度とした。刺激による発火頻度調節を定量し、角度統計(circular statistics)をコンピューター計算するために、刺激周辺スパイク時間をラジアンに転換した:
ベクトル強度は、CircStat toolboxの方法を使用してコンピューター計算された;レイリー統計値は、式RS=2nVS2を使用してコンピューター計算され、式中、nは、総スパイク数であり、VSはベクトル強度である(Berens,2009,Ma et al.,2013))。
が含有され、1サイクルあたり10ビンが伴う場合、刺激列全体のスパイクが示される。PSTHは、各点灯パルスまたは各オーディオオンパルスの開始の前後の二つの刺激サイクルに対しスパイクをビニングすることで、すべての単一ユニットに対しコンピューター計算された。無刺激のヒストグラムは、無作為刺激条件と同様に無作為分布したパルス時間を使用して算出された。発火頻度は、1ビンあたりのスパイク数を、パルス総数およびビンサイズにより割ることで、各ビンでコンピューター計算された。刺激周波数に関連する発火頻度の周期性を定量するために、発火頻度ピーク間の時間間隔を、すべての単一ユニットヒストグラムに対して算出した。各PSTHのピークは、一つの刺激間隔内の最大発火頻度とした。刺激による発火頻度調節を定量し、角度統計(circular statistics)をコンピューター計算するために、刺激周辺スパイク時間をラジアンに転換した:
ベクトル強度は、CircStat toolboxの方法を使用してコンピューター計算された;レイリー統計値は、式RS=2nVS2を使用してコンピューター計算され、式中、nは、総スパイク数であり、VSはベクトル強度である(Berens,2009,Ma et al.,2013))。
平均発火頻度
各刺激条件に対し、各単一ユニットの平均発火頻度がコンピューター計算された。各ユニットに関し、安定的期間のみが、平均FR算出に貢献した(上述のスパイクソーティングおよび単一ユニットの安定性を参照のこと)。刺激条件間の平均発火頻度の差異は、そのユニットの各条件における平均FRの差を取ることで、各ユニット内で計算された。
40Hzの視覚明滅刺激プロトコール
生化学分析および免疫組織化学分析のために、5XFADマウスを暗いチャンバー内に置き、発光ダイオード(LED)電球で照らし、以下の4刺激条件の内の一つの条件に曝した:暗、8Hz、40Hz(12.5ミリ秒の点灯、12.5ミリ秒の消灯、60W)、または無作為(平均25ミリ秒の一様分布により決定された無作為な間隔で光のパルスが与えられる)の刺激を1時間で7日間。
40Hzの聴覚音列刺激プロトコール
生化学分析、免疫組織化学分析、または行動分析のために、5XFADマウス、APP/PS1マウス、またはP301Sマウスを防音発泡体(McMaster-Carr社、5692T49)で遮音された静かな室内の薄暗いチャンバー内に置いた。スピーカー(AYL社、AC-48073)は、チャンバー上のマウスから届かない位置に置かれた。マウスを、以下の五つの刺激条件の内の一つの刺激条件に曝した:音調無し、8Hzの音調、40Hzの音調、80Hzの音調、または無作為に送達される音調(聴覚音調は、平均25ミリ秒の一様分布により決定された無作為な間隔で送達される)の刺激。刺激条件様の音調は、1ミリ秒の期間で、60dBで送達された10kHzの音調から構成された。電気生理学的記録については、プローブの設置後、室内の照明をオフにし、10秒間の聴覚のみ刺激と、視覚-聴覚刺激を交互に、照明無しまたは音調無しの10秒間をインターリーブして動物に提示した。聴覚のみ刺激については、10kHzの音調が、4%の負荷サイクルで40Hzにて再生された。聴覚-視覚刺激については、聴覚刺激には、50%の負荷サイクルで10秒間、40Hzにて明滅する周囲光が伴った。刺激は20分のセッションの間、この様式で提示され、セッションの間に1~10分間の停止時間があり、動物の行動がチェックされた。
並行する40Hzの聴覚刺激および視覚刺激のプロトコール
生化学的分析、免疫組織化学分析、または行動分析のために、5XFADマウスを暗いチャンバー内に置いてLED電球で照らし、同時に聴覚音列に曝した。マウスは以下の四つの刺激の内の一つに曝された:暗/静、40Hzの光の明滅、40Hzの聴覚音列、40Hzの光の明滅と聴覚音調の並行、または無作為な光の明滅/音調の刺激。
免疫組織化学法
マウスは、麻酔(2:1のケタミン/キシラジン)下でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、4%パラホルムアルデヒドで経心臓かん流され、脳はPBS中、4%パラホルムアルデヒドで一晩、ポストフィックス(post-fixed)された。Leica VT1000S vibratome(Leica社)を用いて40μmの厚さに脳を切片化した。切片を透過処理し、0.3% Triton X-100と、10%ロバ血清を含むPBS中で2時間、室温でブロッキングした。一次抗体を含有する、0.3% Triton X-100と10%ロバ血清を含むPBS中で4℃で一晩、切片をインキュベートした。一次抗体は以下であった:抗β-アミロイド(Cell Signaling Technology社;D54D2)、抗Iba1(Wako Chemicals社;019-19741)、抗グリア細胞線維性酸性タンパク質(GFAP)(Abcam社;ab4674)、抗S100B(Abcam社;ab868)、抗LRP1(Abcam社;28320)、DyLight 488標識Lycopersicon Esculentum(トマト)レクチン(Vector laboratories社;DL-1174)、抗アミロイドオリゴマー(Millipore Sigma社;AB9234)、抗ホスホ-タウ(Ser396)(Cell Signaling Technology社;9632)、抗-ホスホ-タウ(Thr181)(Cell Signaling Technology社、12885)、Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific社;H3570)。抗Aβ抗体12F4が使用された理由は、APPと反応しないためである。それにより標識がAβ特異的であるかを決定することができ、Iba1との共標識が可能となる。抗アミロイドオリゴマー抗体のAB9234は、LRP1との共標識に使用した。翌日、脳切片を蛍光結合二次抗体(Jackson ImmunoResearch社)とともに室温で2時間インキュベートし、核をHoechst 33342(Invitrogen社)で染色した。画像は、共焦点顕微鏡(LSM 710;Zeiss社)を使用し、全条件に対し同一設定、40xの対物レンズで取得した。画像は、処置群に対し盲検化された実験担当者により、ImageJ 1.42qを使用して定量された。各実験条件に対し、各動物からの二つの冠状切片を定量に使用した。図の説明中、別段の記載がない限り、スケールバーは50μmである。ImageJを使用して、Iba1+細胞体の直径を測定し、長さ測定のために突起を辿った。さらにColoc2プラグインを使用して、Iba1とAβの共局在を測定した。ミクログリア突起分枝は、Imarisx64 8.1.2(Bitplane社、スイス、チューリッヒ)を使用して定量された。ImageJの「粒子分析」機能を使用して、プラークの数と面積を計数した。少なくとも10μmの沈着が含まれ、対照群と実験群の両方に設定閾値を使用した。
脈管系-Aβの共局在性分析
ImarisColocモジュールを使用して、二つの別個のソースチャンネル(すなわちレクチンとAB、レクチンとLRP1)の間のシグナルの共局在を3Dで定量した。これらのソースチャンネルに閾値設定し、ノイズまたはバックグラウンドシグナルから生じる強度をマスクした。その後にImarisColocはソースチャンネルに対する閾値設定内に共局在するボクセルのみを含有する新たなチャンネルを作成し、関連統計解析に提示する。
ミクログリア-Aβのクラスター形成分析
IMARISを使用して、40uM切片におけるアミロイドプラーク周辺のミクログリアのクラスター形成パターンを分析した。表面モジュールを利用して、12F4シグナルに基づきプラーク(赤)を検出し、3Dレンダリングした。次いで、Iba1陽性ミクログリアをスポットモジュールを使用して計数し、各細胞の細胞体に球を配置した(緑)。最後にSpots Close To Surface XTensionを実行して、
規定の25uM閾値よりも表面物体に近いスポットのサブセットを見出し、この範囲の外側にあるスポットを除外した。アルゴリズムは、当該スポットの中心から、3D空間内の表面物体の最も近いポイントまでの距離を測定する。それによりプラーク近傍のミクログリア凝集を定量することができる。
規定の25uM閾値よりも表面物体に近いスポットのサブセットを見出し、この範囲の外側にあるスポットを除外した。アルゴリズムは、当該スポットの中心から、3D空間内の表面物体の最も近いポイントまでの距離を測定する。それによりプラーク近傍のミクログリア凝集を定量することができる。
脳切片におけるCLARITY免疫染色
マウスを氷冷PBS(1X)でかん流し、次いで氷冷した4% PFA、1%グルタルアルデヒドの1xPBS溶液でかん流した。脳を4%PFA/1%グルタルアルデヒド溶液中で解剖し、4℃で72時間、ポストフィックスした。不活化溶液(4%アクリルアミド、1Mグリシン、0.1% Triton-X100の1X PBS溶液)中、室温で48時間、脳をインキュベートすることにより固定を停止させた。1xPBSで洗浄した後、脳を、1xPBS中、ビブラトーム(Leica社 VT100S)上で100uMの冠状切片へと切り出した。対象領域(すなわち聴覚皮質と海馬)を含有する切片をAllen Mouse Brain Atlasを参照して選択し、クリアリング緩衝液(pH8.5-9.0、200mM ドデシル硫酸ナトリウム、20mM 水酸化リチウム一水和物、4mM ホウ酸のddH2O溶液)中で2~4時間、55℃で振盪しながらインキュベートした。清浄化された切片を、3x15分間、1xPBST(0.1% Triton-X100/1XPBS)中で洗浄し、ブロッキング溶液(2%ウシ血清アルブミン/1xPBST)内にRTで一晩おいた。続いて、1xPBST中で1時間の洗浄を3回、RTで振とうしながら行った。切片を弱結合緩衝液(pH8.5-9.0、37.75mM Na2HPO4、3.53mM KH2PO4、0.02% アジ化ナトリウムのPBST溶液)中で1時間、RTでインキュベートし、次いで1x弱結合緩衝液中、37℃で12時間、1:100に希釈された一次抗体へとトランスファーした。次いでリバーサル緩衝液(pH 7.4、37.75mM Na2HPO4、3.53mM KH2PO4の0.02% アジ化ナトリウムのPBST溶液)を分割量で1時間ごとに6時間かけて加えて、組織体積と一次抗体溶液を加えた体積と等しくする。1xPBST中、3x1時間の洗浄の別セットを行い、その後、切片を12時間、RTで、Hoechst
33258(1:250)(Sigma-Aldrich社、94403)および二次抗体(1:100)の1xPBS混合溶液中でインキュベートした。次いで切片を一晩、1xPBS中で洗浄し、RIMS(Refractive Index Matching Solution:75g Histodenz、20mLの0.1M リン酸緩衝液、60mL ddH2O)中で1時間、RTでインキュベートして、封入した。脳切片は、RIMS中、カバースリップを用いて顕微鏡スライド上に封入された(VWR VistaVision、VWR International,LLC、ペンシルバニア州ラドナー)。
33258(1:250)(Sigma-Aldrich社、94403)および二次抗体(1:100)の1xPBS混合溶液中でインキュベートした。次いで切片を一晩、1xPBS中で洗浄し、RIMS(Refractive Index Matching Solution:75g Histodenz、20mLの0.1M リン酸緩衝液、60mL ddH2O)中で1時間、RTでインキュベートして、封入した。脳切片は、RIMS中、カバースリップを用いて顕微鏡スライド上に封入された(VWR VistaVision、VWR International,LLC、ペンシルバニア州ラドナー)。
画像は、付属のZen Black 2.1ソフトウェア(Carl Zeiss Microscopy社、ドイツ、イエナ)を用いてZeiss LSM 880顕微鏡上で取得された。Z-スタック画像は、3D再構成に適した0.4~0.5μmの刻み幅、ピクセルドエル4.1ミリ秒、平均2、解像度1024x1024で撮影された。Imarisx64 8.3.1(Bitplane社、スイス、チューリッヒ)を3-Dレンダリングと分析に使用した。
マウス全脳の処理およびクリアリング
5XFADマウスの脳をSHIELDプロトコールに従って処理した。簡潔に述べると、5XFADマウスに、氷冷PBSを用いて経心臓かん流を行い、次いで20mLの4%PFA含有SHIELD-OFF溶液でかん流した。脳を解剖し、同じ溶液中で24時間、4℃でポストフィックスを行った。次いで脳を一晩、PFAを含まないSHIELD-
OFF溶液中、4℃でインキュベートした。次いで脳を24時間、SHIELD-ON溶液中、37℃でインキュベートした。固定後、脳を、200mM ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20mM 水酸化リチウム一水和物、40mM ホウ酸、pH8.5-9.0を含有するクリアリング水溶液中でインキュベートした。次いで脳を、確率論的エレクトロトランスポート(Kim et al.,PNAS,2015)に基づきSmartClear Pro(LifeCanvas Technologies社、マサチューセッツ州ケンブリッジ)を使用して数日間、透明になるまでクリアリングを行った。
OFF溶液中、4℃でインキュベートした。次いで脳を24時間、SHIELD-ON溶液中、37℃でインキュベートした。固定後、脳を、200mM ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20mM 水酸化リチウム一水和物、40mM ホウ酸、pH8.5-9.0を含有するクリアリング水溶液中でインキュベートした。次いで脳を、確率論的エレクトロトランスポート(Kim et al.,PNAS,2015)に基づきSmartClear Pro(LifeCanvas Technologies社、マサチューセッツ州ケンブリッジ)を使用して数日間、透明になるまでクリアリングを行った。
透明化した全半球の免疫染色
透明化した半球を、Alexa Fluor-488が結合した15ulのβ-アミロイド抗体(CST社、#51374)で、改変確率論的エレクトロトランスポート法のeTANGO(Kim et al.,PNAS,2015)を使用して、2日間にわたり染色した。
ライトシート顕微鏡
免疫染色されたサンプルを、hProtos(3g ジアトリゾ酸、5g N-メチル-d-グルダミン、125g イオヘキソールの105ml DI水溶液)とともにインキュベートして光学クリアリングを行い、次いでhProtos中、2%低融点アガロースを使用してアクリルホルダーへと封入した。カスタムメイドのライトシート顕微鏡には、10xCLARITY最適化対物レンズが備えられており、これを使用して、全半球を、ベータ-アミロイドの可視化には488チャンネル、自己蛍光には647チャンネルを使用して撮影した。
透明化全脳の画像処理、プラーク検出、およびアトラスアライメント
取得された画像データは、Matlab中に実装されたオープンソースソフトウェアであるCIDREを使用して光量補正された。得られた処理画像は、Terastitcher in Imaris(商標)(Bitplane(登録商標))を使用してまとめてステッチ(stitch)され、3D視覚化に使用された。ImageJ(National Institutes of Health)を使用して、代表的な切片ごとの2D視覚化が行われた。オープンソースのClearMapソフトウェア、カスタム細胞分類ニューロンネットワークモデル、および Elastixの組み合わせを使用して、自動プラーク検出を実施した。候補プラークは、ClearMapのスポット検出モジュールを用いて「スポット」として配置された。最初に、(21,21)の外径と内径のピクセルサイズを有するディスク構造エレメントを用いたグレースケール形態シルクハット(top-hat)変形を使用して、背景減算を切片ごとに行った。次に、データの局所最大値は、サイズ(7,7,4)のディスク構造エレメントで3D最大値フィルターを適用することによって検出される。これらの局所最大値は、強度閾値100でフィルタリングされる。各スポットの中心位置に対応するピクセル容量も、シードポイントとしてスポット中心を用いた3D流域変形を使用して算出される。次いで、10ミクロンの直径を有する球よりも小さい体積のプラーク候補はすべて除外された。真のプラークは、重畳ニューロンネットワーク(CNN:convolutional neural network)モデルを、Theano(商標)バックエンドとともにKeras(商標)中に実装された分類別プラーク/非プラーク分類子として使用して、候補プラークから識別された。CNNインプットは、候補プラーク中心を中心とする32x32ピクセルの境界ボックスであり、アウトプットは、プラークおよび非プラークのカテゴリーを表す2エレメントのone-hotベクトルである。アーキテクチャは、12個の総重畳レイヤーから構成され、それぞれが整流された線形ユニット(ReLU:rectified line
ar unit)のアクティブ化と、それに続くバッチ正規化を有している:64 2x2カーネルの3個、128 2x2カーネルの3個、それに続いて192 2x2カーネルの3個、256 2x2カーネルの1個、256 1x1カーネルの1個、そして2 1x1カーネルの1個。2x2のサブサンプリングは、第三、第六および第九の重畳レイヤーの後に実施される。0.5の比率を有するドロップアウト(Dropout)は、最後の9個の重畳/バッチ正規化レイヤーの後に適用され、正則化される。最終重畳レイヤーの後、グローバル平均プーリング(global average pooling)と、それに続くソフトマックスアクティブ化(softmax activation)が適用され、最終のカテゴリカルベクトルが生成される。トレーニング中、カテゴリー横断的なエントロピー損失が、デフォルトパラメーターのAdam最適化ツールとともに使用された。CNNは、Keras(商標)Image Data Generatorを使用し無作為な回転、せん断、および反転で増補された約10,000個の手動プラークアノテーションに対し、64のバッチサイズを含む400のエポックについてトレーニングされた。次いで得られたモデルを使用して、すべてのサンプルに対し、検出スポットからプラークを分類した。アトラスアライメントを実施するために、自己蛍光チャンネル画像を最初にアトラス解像度にダウンサンプルし、その後、Elastixを使用してアフィン変換パラメーターおよびB-スプライン変換パラメーターを算出して、固定画像として再サンプリングされた自己蛍光画像、および移動画像としてアトラスを用いて3D画像登録を実施した。得られたアライメントパラメーターを、プラーク位置(CNNモデルからのアウトプット)に適用し、プラークをアトラス空間内に変換する。その後、各脳領域に関するプラークの数と量の情報を含むCSVファイル(Allen Brain Atlasに準拠したセグメント化)を生成する。
ar unit)のアクティブ化と、それに続くバッチ正規化を有している:64 2x2カーネルの3個、128 2x2カーネルの3個、それに続いて192 2x2カーネルの3個、256 2x2カーネルの1個、256 1x1カーネルの1個、そして2 1x1カーネルの1個。2x2のサブサンプリングは、第三、第六および第九の重畳レイヤーの後に実施される。0.5の比率を有するドロップアウト(Dropout)は、最後の9個の重畳/バッチ正規化レイヤーの後に適用され、正則化される。最終重畳レイヤーの後、グローバル平均プーリング(global average pooling)と、それに続くソフトマックスアクティブ化(softmax activation)が適用され、最終のカテゴリカルベクトルが生成される。トレーニング中、カテゴリー横断的なエントロピー損失が、デフォルトパラメーターのAdam最適化ツールとともに使用された。CNNは、Keras(商標)Image Data Generatorを使用し無作為な回転、せん断、および反転で増補された約10,000個の手動プラークアノテーションに対し、64のバッチサイズを含む400のエポックについてトレーニングされた。次いで得られたモデルを使用して、すべてのサンプルに対し、検出スポットからプラークを分類した。アトラスアライメントを実施するために、自己蛍光チャンネル画像を最初にアトラス解像度にダウンサンプルし、その後、Elastixを使用してアフィン変換パラメーターおよびB-スプライン変換パラメーターを算出して、固定画像として再サンプリングされた自己蛍光画像、および移動画像としてアトラスを用いて3D画像登録を実施した。得られたアライメントパラメーターを、プラーク位置(CNNモデルからのアウトプット)に適用し、プラークをアトラス空間内に変換する。その後、各脳領域に関するプラークの数と量の情報を含むCSVファイル(Allen Brain Atlasに準拠したセグメント化)を生成する。
ウェスタンブロット
6カ月齢のオスの5XFADマウスから海馬および聴覚皮質を解剖し、溶解物を調製した。組織を1ml RIPA(50mM Tris HCl pH 8.0、150mM
NaCl、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS)緩衝液中で、ハンドホモジナイザー(Sigma社)を用いてホモジナイズし、氷上で15分間、インキュベートして、4℃で30分間、回転させた。細胞残渣は14,000r.p.m.で10分間の遠心分離を行うことで単離され、廃棄された。溶解物はナノドロップを使用して定量され、25μgのタンパク質を10%アクリルアミドゲルにローディングした。タンパク質は、アクリルアミドゲルからPVDF膜(Invitrogen社)に100Vで120分間トランスファーされた。膜は、TBS:Tweenで希釈されたウシ血清アルブミン(5% w/v)を使用してブロッキングされた。膜を、1次抗体中で一晩、4℃でインキュベートされ、2次抗体中で90分間、室温でインキュベートされた。一次抗体は抗ホスホ-タウ(Ser396)および抗ホスホ-タウ(Thr181)であった。二次抗体は、LI-COR IRDye二次抗体であった。シグナル強度は、ImageJ 1.46aを使用して定量され、総タウ Tau5(Thermo Fisher Scientific社;AHB0042)の値に正規化された。
NaCl、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS)緩衝液中で、ハンドホモジナイザー(Sigma社)を用いてホモジナイズし、氷上で15分間、インキュベートして、4℃で30分間、回転させた。細胞残渣は14,000r.p.m.で10分間の遠心分離を行うことで単離され、廃棄された。溶解物はナノドロップを使用して定量され、25μgのタンパク質を10%アクリルアミドゲルにローディングした。タンパク質は、アクリルアミドゲルからPVDF膜(Invitrogen社)に100Vで120分間トランスファーされた。膜は、TBS:Tweenで希釈されたウシ血清アルブミン(5% w/v)を使用してブロッキングされた。膜を、1次抗体中で一晩、4℃でインキュベートされ、2次抗体中で90分間、室温でインキュベートされた。一次抗体は抗ホスホ-タウ(Ser396)および抗ホスホ-タウ(Thr181)であった。二次抗体は、LI-COR IRDye二次抗体であった。シグナル強度は、ImageJ 1.46aを使用して定量され、総タウ Tau5(Thermo Fisher Scientific社;AHB0042)の値に正規化された。
ELISA
主要な聴覚皮質、内側前頭前皮質、および海馬は、6カ月齢の5XFADオスマウスから単離され、これにAβ42またはAβ40 ELISAキット(Invitrogen社)をメーカーの指示に従い使用して 、Aβ測定を行った。不溶性AβはELISA測定前に5M グアニジン/50mM Tris HCl(pH8.0)緩衝液で処理した。
行動実験
新規物体の認識
新規物体認識(NOR)タスクは、過去に記載されているとおり(Leger et al.,2013)、馴化フェーズとそれに続く翌日に実施されるトレーニングおよび検査から構成された。トレーニングの24時間前、マウスはオープン検査アリーナ(40cmLx40cmWx35cmH)に5分間、馴化され、その間の総距離(cm)、中心滞在時間(秒)、および速度(cm/秒)が算出される(TSE Systems社)。トレーニング中、マウスは同じ箱内に置かれ、その箱には向かい合わせの角に置かれた二つの同じ物体がある。マウスはトータルで20秒の物体相互作用時間(10分間の最大時間フレーム内)が与えられ、その後直ちにアリーナから取り出された。物体記憶は、一つの物体がその位置で新しい物体で置き換えられた点は除き、トレーニング中と同じ手順を使用して1時間後に検査された。物体探索は、いずれか物体と鼻先が接触したときに記録され、認識インデックス、RI=T新規/(T新規+T慣れた)、により算出された。式中、T新規およびT慣れたはそれぞれ新規物体および慣れた物体に費やされた時間を示す。
新規物体位置
新規位置認識(NOL)タスクは、二つの同一物体がトレーニングと検査の両方に使用され、検査の間は一つの物体が新規の位置に移された点を除き、物体認識タスクと同じ手順を使用して実施された。
モリス水迷路検査
空間参照記憶検査は、およそ22℃の白い不透明な水で満たされた環状タンク(直径1.2m)中で実施された。参照合図は異なる色と形状から構成され、タンクを取り囲む壁に沿って配置された。タンク内には固定プラットフォーム(直径10cm)が標的四分円に置かれた。検査中、プラットフォームは沈められ、マウスは、タンクの壁に無作為に面する7ポイントのうちの一つで、タンク内に置かれた。マウスはプラットフォーム探索に60秒が与えられ、発見できなかった場合、穏やかにプラットフォームに誘導された。マウスは15秒間、プラットフォーム上に置かれた。1日あたり2回のトライアルを実施し、トライアルの間は1時間の間隔を置いた。トライアルの間、マウスは穏やかに足を乾かされ、ヒートパッド上で暖められた。マウスの行動は、TSE Systemsを使用してビデオ記録された。逃避潜時、またはマウスがプラットフォームに到達するまでにかかった時間は、各トライアルでスコア化され、検査日ごとに平均化された。6日目にプラットフォームを取り外し、記憶検査(プローブ検査)が実施された。四つの四分円のそれぞれで過ごした時間と、プラットフォームがあったエリアを交差した回数が記録された。遊泳速度は自動的に記録された。
結論
本開示の発明に関する態様は、本明細書に記載する個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法を対象とする。加えて、二つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
また、様々な発明の概念が、一つ以上の方法として具現化されてもよく、その例を提供してきた。方法の一部として行われる行為は、任意の適切な手段で順序付けられうる。したがって、行為が例示するものとは異なる順序で行われる実施形態を構築してもよく、そ
れは、例示的実施形態に連続する行為として示す場合であっても、一部の行為を同時に行うことを含みうる。
れは、例示的実施形態に連続する行為として示す場合であっても、一部の行為を同時に行うことを含みうる。
本明細書で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本明細書で定義および使用するすべての定義は、辞書定義、参照により組み込まれる文書の定義、および/または定義された用語の通常の意味を統制するものと理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、不定冠詞「a」および「an」は、明確にそうでないと示されない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「および/または」という語句は、結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味し、すなわち、一部の場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および/または」で挙げられる複数の要素は、同じ形式、すなわち、等位接続される要素のうちの「一つ以上」と解釈されるべきである。他の要素は、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、「および/または」節によって具体的に識別される要素以外に、随意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」への言及は、「備える」などの制限のない語法と連動して使われるときに、一実施形態においては、Aのみ(任意選択的にB以外の要素を含む)、別の実施形態では、Bのみ(任意選択的にA以外の要素を含む)、さらに別の実施形態では、AとBと両方(任意選択的に他の要素を含む)などを指すことができる。
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上で定義した「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および/または」は包括的なもの、すなわち、多数の要素または要素のリスト、および随意にリストに無い追加の項目のうちの少なくとも一つを含むが、二つ以上も含むと解釈されるものとする。それとは反対であると明確に指示した用語のみ、例えば、「のうちの一つのみ」もしくは「のうちの正確に一つ」、または特許請求の範囲において使用するときの「から成る」は、例えば多数の要素またはリストの要素のうちの正確に一つの要素の包含とみなす。概して、本明細書で使用する場合、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの一つ」、「のうちの一つのみ」、または「のうちの正確に一つ」など、排他性の用語が先行するときには、排他的な選択肢(すなわち、「両方ともでなくどちらか一方」)を示すとのみ解釈されるものとする。「から基本的に成る」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野において使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、一つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも一つ」という語句は、要素のリストの中の要素のいずれか一つ以上から選択される、少なくとも一つの要素を意味するが、要素のリスト内で具体的に列挙したありとあらゆる要素のうちの、少なくとも一つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストのいかなる要素の組み合せも除外するものではない、と理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも一つ」という語句が指す、要素のリスト内で具体的に識別される以外の要素が、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、任意に存在しうることを許容する。したがって、非限定的な例として、「AおよびBのうち少なくとも一つ」(または、等価的に、「AまたはBのうちの少なくとも一つ」、もしくは、等価的に「Aおよび/またはBのうちの少なくとも一つ」)は、一実施形態においては、
Bは存在せず、任意選択的に二つ以上のAを含む、少なくとも一つのA(任意選択的にB以外の要素を含む)、別の実施形態においては、Aは存在せず、任意選択的に二つ以上のBを含む、少なくとも一つのB(任意選択的にA以外の要素を含む)、また別の実施形態においては、任意選択的に二つ以上のAを含む、少なくとも一つのA、および任意選択的に二つ以上のBを含む、少なくとも一つのB(任意選択的に他の要素を含む)などを指すことができる。
Bは存在せず、任意選択的に二つ以上のAを含む、少なくとも一つのA(任意選択的にB以外の要素を含む)、別の実施形態においては、Aは存在せず、任意選択的に二つ以上のBを含む、少なくとも一つのB(任意選択的にA以外の要素を含む)、また別の実施形態においては、任意選択的に二つ以上のAを含む、少なくとも一つのA、および任意選択的に二つ以上のBを含む、少なくとも一つのB(任意選択的に他の要素を含む)などを指すことができる。
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書で、すべての移行句、例えば、「備える(comprising)」、「含む(including)」、「持つ(carrying)」、「有する(having)」、「包含する(containing)」、「伴う(involving)」、「保つ(holding)」、「から構成される(composed of)」、および類似のものは制限がないと理解され、すなわち、含むがそれに限定はされないということを意味する。「から成る(consisting of)」および「から基本的に成る(consisting essentially of)」という移行句のみが、米国特許局の特許審査手続便覧、セクション2111.03に記載されている、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句であるものとする。
本発明は以下の態様であってもよい。
(1)その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、A)約20Hz~約60Hzの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせを前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導することを含む、方法。
(2) A)において、前記聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが、約35Hz~約45Hzの周波数を有する、上記(1)に記載の方法。
(3) A)において、前記聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが、約40Hzの周波数を有する、上記(2)に記載の方法。
(4) A)が、聴覚皮質(AC)、視覚皮質(VC)、海馬(HPC)および内側前頭前皮質(mPFC)から選択される少なくとも一つの皮質領域の5%以上の記録部位に、周期的なスパイク反応を誘導することを含む、上記(1)~(3)のいずれか1つに記載の方法。
(5) A)が、mPFCに約40Hzの局所電場電位(LFP)を誘導することを含む、上記(1)~(4)のいずれか1つに記載の方法。
(6) A)が、A1)新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域中のミクログリア反応を増加させること、を含む、上記(1)~(5)のいずれか1つに記載の方法。
(7) A1)が、アミロイドプラークの25マイクロメートル以内のミクログリア数を増加させること、ミクログリアの細胞体の直径を増加させること、ミクログリアの突起長を減少させること、およびミクログリア細胞数を増加させること、のうちの少なくとも一つを含む、上記(6)に記載の方法。
(8) A1)が、ミクログリアの細胞体の直径を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(7)に記載の方法。
(9) A1)が、ミクログリアの突起長を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%減少させることを含む、上記(7)に記載の方法。
(10) A1)が、ミクログリアの細胞数を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(7)に記載の方法。
(11)前記少なくとも一つの皮質領域が、mPFCを含む、上記(6)~(10)のいずれか1つに記載の方法。
(12) A1)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(6)~(11)のいずれか1つに記載の方法。
(13) A1)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(12)に記載の方法。
(14) A)が、A2)新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域中のアミロイドプラークを減少させることを含む、上記(1)~(13)のいずれか1つに記載の方法。
(15) A2)が、プラークの大きさを少なくとも約50%減少させることを含む、上記(14)に記載の方法。
(16) A2)が、プラーク数を少なくとも約50%減少させることを含む、上記(14)に記載の方法。
(17)前記少なくとも一つの皮質領域が、mPFCを含む、上記(14)~(16)のいずれか1つに記載の方法。
(18) A2)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(14)~(17)のいずれか1つに記載の方法。
(19) A2)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(18)に記載の方法。
(20) A)が、A3)新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域中のアミロイド-β(Aβ)ペプチドの量を減少させることを含む、上記(1)~(19)のいずれか1つに記載の方法。
(21) A3)が、前記Aβペプチドの量を少なくとも50%減少させることを含む、上記(20)に記載の方法。
(22) A3)において、前記Aβペプチドは、Aβ1-40ペプチドアイソフォームおよびAβ1-42ペプチドアイソフォームのうちの少なくとも一つを含む、上記(20)または(21)のいずれか1つに記載の方法。
(23) A3)において、前記Aβペプチドは、可溶性Aβペプチドおよび不溶性Aβペプチドのうちの少なくとも一つを含む、上記(20)~(22)のいずれか1つに記載の方法。
(24)前記少なくとも一つの皮質領域が、mPFCを含む、上記(20)~(23)のいずれか1つに記載の方法。
(25) A3)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(20)~(24)のいずれか1つに記載の方法。
(26) A3)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(25)に記載の方法。
(27)その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、約35Hz~約45Hzの周波数で視覚刺激を発する少なくとも一つの視覚刺激装置を制御すること、電気音声シグナルを、約35Hz~約45Hzの周波数の対応する聴覚刺激へと転換する少なくとも一つの電気音響変換器を制御すること、および前記対象に組み合わせ刺激を非侵襲的に送達することであって、前記組み合わせ刺激は、同期して並んだ前記視覚刺激と音刺激を含み、前記組み合わせ刺激は、前記対象の少なくとも一つの脳領域に同期化ガンマ振動を誘導し、前記同期化ガンマ振動は、前記対象の認知機能の改善を生じさせること、を含む、方法。
(28)前記視覚刺激は、12.5ミリ秒の点灯と、次いで12.5ミリ秒の消灯の反復を含む、上記(27)に記載の方法。
(29)前記視覚刺激装置が、40~80Wの電力を有する発光ダイオードである、上記(27)または(28)のいずれかに1つに記載の方法。
(30)前記聴覚刺激が、約4%~約80%の負荷サイクルで40Hzで再生される10kHzの音調を含む、上記(27)~(29)のいずれか1つに記載の方法。
(31)前記視覚刺激が、約10%~約80%の負荷サイクルで10秒間、40Hzで明滅される光を含む、上記(27)~(30)のいずれか1つに記載の方法。
(32)前記視覚刺激および前記聴覚刺激が、同期化される、上記(27)~(31)のいずれか1つに記載の方法。
(33)前記視覚刺激および前記聴覚刺激が、-180~0度または0~180度位相がずれている、上記(27)~(31)のいずれか1つに記載の方法。
(34)前記認知症が、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、および加齢に伴う記憶障害のうちの少なくとも一つと関連している、上記(1)~(33)のいずれか1つに記載の方法。
(35)その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、A)約35Hz~約45Hzの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせを前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導することを含み、前記A)が、A1)前記対象の内側前頭前皮質(mPFC)に周期的なスパイク反応を誘導すること、A2)前記mPFCに約40Hzの局所電場電位(LFP)を誘導すること、およびA3)前記mPFC中のミクログリア反応を増加させること、のうちの少なくとも一つを含む、方法。
(36) A)が、A3)を含み、前記A3)が、アミロイドプラークの25マイクロメートル以内のミクログリア数を増加させること、ミクログリアの細胞体の直径を増加させること、ミクログリアの突起長を減少させること、およびミクログリア細胞数を増加させること、のうちの少なくとも1つを含む、上記(35)に記載の方法。
(37) A3)が、ミクログリアの細胞体の直径を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(36)に記載の方法。
(38) A3)が、ミクログリアの突起長を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%減少させることを含む、上記(36)に記載の方法。
(39) A3)が、ミクログリアの細胞数を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(36)に記載の方法。
(40) A3)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(36)~(39)のいずれか1つに記載の方法。
(41) A3)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(40)に記載の方法。
(1)その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、A)約20Hz~約60Hzの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせを前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導することを含む、方法。
(2) A)において、前記聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが、約35Hz~約45Hzの周波数を有する、上記(1)に記載の方法。
(3) A)において、前記聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせが、約40Hzの周波数を有する、上記(2)に記載の方法。
(4) A)が、聴覚皮質(AC)、視覚皮質(VC)、海馬(HPC)および内側前頭前皮質(mPFC)から選択される少なくとも一つの皮質領域の5%以上の記録部位に、周期的なスパイク反応を誘導することを含む、上記(1)~(3)のいずれか1つに記載の方法。
(5) A)が、mPFCに約40Hzの局所電場電位(LFP)を誘導することを含む、上記(1)~(4)のいずれか1つに記載の方法。
(6) A)が、A1)新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域中のミクログリア反応を増加させること、を含む、上記(1)~(5)のいずれか1つに記載の方法。
(7) A1)が、アミロイドプラークの25マイクロメートル以内のミクログリア数を増加させること、ミクログリアの細胞体の直径を増加させること、ミクログリアの突起長を減少させること、およびミクログリア細胞数を増加させること、のうちの少なくとも一つを含む、上記(6)に記載の方法。
(8) A1)が、ミクログリアの細胞体の直径を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(7)に記載の方法。
(9) A1)が、ミクログリアの突起長を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%減少させることを含む、上記(7)に記載の方法。
(10) A1)が、ミクログリアの細胞数を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(7)に記載の方法。
(11)前記少なくとも一つの皮質領域が、mPFCを含む、上記(6)~(10)のいずれか1つに記載の方法。
(12) A1)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(6)~(11)のいずれか1つに記載の方法。
(13) A1)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(12)に記載の方法。
(14) A)が、A2)新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域中のアミロイドプラークを減少させることを含む、上記(1)~(13)のいずれか1つに記載の方法。
(15) A2)が、プラークの大きさを少なくとも約50%減少させることを含む、上記(14)に記載の方法。
(16) A2)が、プラーク数を少なくとも約50%減少させることを含む、上記(14)に記載の方法。
(17)前記少なくとも一つの皮質領域が、mPFCを含む、上記(14)~(16)のいずれか1つに記載の方法。
(18) A2)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(14)~(17)のいずれか1つに記載の方法。
(19) A2)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(18)に記載の方法。
(20) A)が、A3)新皮質、AC、VC、HPC、およびmPFCから選択される少なくとも一つの皮質領域中のアミロイド-β(Aβ)ペプチドの量を減少させることを含む、上記(1)~(19)のいずれか1つに記載の方法。
(21) A3)が、前記Aβペプチドの量を少なくとも50%減少させることを含む、上記(20)に記載の方法。
(22) A3)において、前記Aβペプチドは、Aβ1-40ペプチドアイソフォームおよびAβ1-42ペプチドアイソフォームのうちの少なくとも一つを含む、上記(20)または(21)のいずれか1つに記載の方法。
(23) A3)において、前記Aβペプチドは、可溶性Aβペプチドおよび不溶性Aβペプチドのうちの少なくとも一つを含む、上記(20)~(22)のいずれか1つに記載の方法。
(24)前記少なくとも一つの皮質領域が、mPFCを含む、上記(20)~(23)のいずれか1つに記載の方法。
(25) A3)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(20)~(24)のいずれか1つに記載の方法。
(26) A3)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(25)に記載の方法。
(27)その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、約35Hz~約45Hzの周波数で視覚刺激を発する少なくとも一つの視覚刺激装置を制御すること、電気音声シグナルを、約35Hz~約45Hzの周波数の対応する聴覚刺激へと転換する少なくとも一つの電気音響変換器を制御すること、および前記対象に組み合わせ刺激を非侵襲的に送達することであって、前記組み合わせ刺激は、同期して並んだ前記視覚刺激と音刺激を含み、前記組み合わせ刺激は、前記対象の少なくとも一つの脳領域に同期化ガンマ振動を誘導し、前記同期化ガンマ振動は、前記対象の認知機能の改善を生じさせること、を含む、方法。
(28)前記視覚刺激は、12.5ミリ秒の点灯と、次いで12.5ミリ秒の消灯の反復を含む、上記(27)に記載の方法。
(29)前記視覚刺激装置が、40~80Wの電力を有する発光ダイオードである、上記(27)または(28)のいずれかに1つに記載の方法。
(30)前記聴覚刺激が、約4%~約80%の負荷サイクルで40Hzで再生される10kHzの音調を含む、上記(27)~(29)のいずれか1つに記載の方法。
(31)前記視覚刺激が、約10%~約80%の負荷サイクルで10秒間、40Hzで明滅される光を含む、上記(27)~(30)のいずれか1つに記載の方法。
(32)前記視覚刺激および前記聴覚刺激が、同期化される、上記(27)~(31)のいずれか1つに記載の方法。
(33)前記視覚刺激および前記聴覚刺激が、-180~0度または0~180度位相がずれている、上記(27)~(31)のいずれか1つに記載の方法。
(34)前記認知症が、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、および加齢に伴う記憶障害のうちの少なくとも一つと関連している、上記(1)~(33)のいずれか1つに記載の方法。
(35)その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、A)約35Hz~約45Hzの周波数を有する聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせを前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも一つの脳領域において同期化ガンマ振動を誘導することを含み、前記A)が、A1)前記対象の内側前頭前皮質(mPFC)に周期的なスパイク反応を誘導すること、A2)前記mPFCに約40Hzの局所電場電位(LFP)を誘導すること、およびA3)前記mPFC中のミクログリア反応を増加させること、のうちの少なくとも一つを含む、方法。
(36) A)が、A3)を含み、前記A3)が、アミロイドプラークの25マイクロメートル以内のミクログリア数を増加させること、ミクログリアの細胞体の直径を増加させること、ミクログリアの突起長を減少させること、およびミクログリア細胞数を増加させること、のうちの少なくとも1つを含む、上記(35)に記載の方法。
(37) A3)が、ミクログリアの細胞体の直径を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(36)に記載の方法。
(38) A3)が、ミクログリアの突起長を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%減少させることを含む、上記(36)に記載の方法。
(39) A3)が、ミクログリアの細胞数を少なくとも10%、20%、30%、40%、または50%増加させることを含む、上記(36)に記載の方法。
(40) A3)が、複数日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(36)~(39)のいずれか1つに記載の方法。
(41) A3)が、7日間の聴覚刺激および視覚刺激の組み合わせの非侵襲的な送達の後に生じる、上記(40)に記載の方法。
Claims (1)
- 対象の内側前頭前皮質(mPFC)におけるアミロイド負荷を低下させるための使用のためのデバイスであって、前記デバイスは、
A)少なくとも7日間の期間にわたって1日当たり少なくとも1時間で、約20Hz~約60Hzの周波数を有する聴覚刺激を前記対象に非侵襲的に送達し;
B)前記期間にわたる前記少なくとも1時間で、前記聴覚刺激と固定された位相関係を有する視覚刺激を前記周波数で前記対象に非侵襲的に送達し:及び
C)A)及びB)の聴覚刺激と視覚刺激の組み合わせに対して前記mPFCにおけるミクログリアの活性化を増加させ、前記mPFCにおける前記アミロイド負荷を低下させる
ように構成されている、前記デバイス。
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