KR102460060B1 - 치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents
치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
치매 또는 알츠하이머병의 치료를 요하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 장치, 시스템 및 방법. 일 실시예에서, 대상체의 적어도 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위해 약 20 Hz 내지 약 60 Hz, 보다 구체적으로는 약 40 Hz의 주파수를 갖는 청각 및 시각 복합 자극이 대상체에게 비침습적으로 전달된다. 특히, 다양한 치료 및 노출 프로토콜에 따라, (청각 또는 시각의 단독 자극과 반대로) 청각 및 시각 복합 자극이 내측 전두엽 피질(mPFC)에서 소교반응을 촉진한다. 보다 일반적으로는, 청각 및 시각 복합 자극은 청각 피질, 시각 피질, 및 mPFC에서 확장된 소교세포 클러스터링 반응을 유도한다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 다음의 미국 특허 가출원 각각에 대한 우선권의 이익을 주장한다: 제62/570,250호(2017년 10월 10일에 출원) "NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF COMBINED SENSORY STIMULATION"(변리사 문서 번호 MITX-9699/00US); 및 제62/570,929호(2017년 10월 11일에 출원) "GAMMA ENTRAINMENT BINDS HIGHER ORDER BRAIN REGIONS AND OFFERS NEUROPROTECTION"(변리사 문서 번호 MITX-0070/00US). 이들 가출원 각각은 각각은 그 전체가 참조로써 본원에 통합된다.
정부 지원 진술
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 보조금 번호 RF1 AG047661 하에 미국 정부 지원을 받아 만들어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
알츠하이머병(AD)은 기억, 방향 및 추론의 감퇴를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질병이다. 이것은 세계적으로 치매의 가장 흔한 형태로서, 65세가 넘은 사람 8명 중 1명 꼴로 발병하며, 미국에서는 사망 원인 중 여섯 번째에 해당한다. 이러한 진행성 신경퇴행성 장애의 유병률은 향후 10 년간 40%만큼 증가할 것으로 추정된다.
조직병리학적으로, AD는 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드를 포함하는 아밀로이드 플라크 및 타우 단백질로 만들어진 신경원섬유 매듭(NFT)의 축적을 특징으로 할 수 있다. Aβ 펩티드는 36~43개 아미노산 단백질로서 정상적인 생리학적 기능은 확인되지 않았다. Aβ 펩티드는 β-세크레타아제 1(BACE1) 및 γ-세크레타아제에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이 순차적으로 단백질분해에 의해 절단됨으로써 형성된다. C 말단 단편 β(β-CTF)는 BACE1에 의해 APP를 절단하여 아밀로이드를 형성하는 동안 생성된 APP 유도체이므로 Aβ 펩티드 생산의 또 다른 지표이다. 정상적인 조건 하에서, 가용성 Aβ 펩티드는 뉴런에 의해 생성 및 분비되고, 후속하여 뇌척수액(CSF) 경로를 통해 뇌로부터 소실된다. 그러나, AD를 앓는 대상체에서, Aβ 펩티드는 고차 종으로 응집하여, 농도 의존성 방식으로 가용성 올리고머 및 불용성 플라크를 형성하는 것으로 보인다. 이러한 응집으로 인해 뇌 대사 장애, 신경염증, 기능적 연결성의 감소, 시냅스 및 뉴런 상실 및/또는 NFT의 형성을 비롯한 많은 신경독성 사건이 개시될 수 있다.
Aβ 농도 및 뉴런 활성 사이에 근본적인 관계가 입증되었다. 먼저, APP를 과발현하는 유전자도입(Tg) 마우스로부터 제조한 해마의 기관형 절편을 테트로도톡신으로 처리한 결과 뉴런 활성이 감소하였고, 후속하여 Aβ 수준이 감소하였다. 이어서, 피크로톡신으로 처리 시 반대 효과(뉴런 활성 증가)가 관찰되었다. 생체 내에서 Aβ 펩티드 농도 및 최종 플라크 침착의 동적 조정 또한, 뉴런 활성을 이용하여 입증되었다. 인간 AD 환자에서, 신경 영상화는 가장 심각한 플라크 침착이 "디폴트-방식 네트워크(default-mode network)"로서 알려져 있는 가장 일관되게 활동적인 뇌 영역과 정렬될 수 있다는 것을 보여준다.
현재 AD는 완치되지 않으며, 치료 옵션은 AD의 병리학적 진행을 저해하지 못하고, 주로 임시 방편이고/이거나 여러 가지 곤란한 부작용을 동반할 수 있다. 예를 들어, Aβ 펩티드 및/또는 이의 전구체를 표적으로 하는 예방 및/또는 치료 전략(예를 들어, Aβ 면역요법 및 β-와 γ-세크레타아제의 억제)은 임상 시험에서 독성이 있었고/있었거나 AD 병리를 감소시키는데 효과가 없었다. 아밀로이드 베타 백신(예를 들어, 바피뉴주맙)이 포함된 임상 시험은 인지 이득의 결여로 인해 실패하였다. 감마-세크레타아제 억제제(예를 들어, 세마가세스타트)는 대상체에서 인지 결손의 악화로 인해 임상 시험에 실패하였다. 심지어, 아세틸콜린에스테라아제 억제제(예를 들어, 도네페질 및 리바스티그민) 및 N-메틸-D-아스파르트산염(NMDA)-수용체 길항제(예를 들어, 메만틴)와 같은 현존하는 약제조차도 경미한 인지 이득만을 나타내는 정도이다.
2016년 11월 23일에 "SYSTEMS AND METHODS FOR PREVENTING, MITIGATING, AND/OR TREATING DEMENTIA"라는 명칭으로 출원된 미국 특허 출원 제15/360,637호(이로써 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 개시된 바와 같이, 시각 또는 청각 자극을 통해 뇌에서 동기화된 감마 진동을 유도하면 아밀로이드 부하가 줄어들고 일부 뇌 영역에서 형태학적 변화가 나타난다. 그러나, 본 발명자들은, 치매 및 알츠하이머병을 치료하는 시스템 및 방법으로서, 학습과 기억 및 다른 고차 뇌 기능을 특히 담당하는 다수의 뇌 중추에 영향을 미치는 회로 전반의 질병을 다루는 시스템 및 방법이 여전히 필요하다는 것을 인식하고 이해하였다.
전술한 내용을 고려하여, 본 개시는 "감각 자극을 이용한 감마 혼입(Gamma ENtrainment Using Sensory stimuli, GENUS)"으로 본원에서 일반적으로 지칭되는 다양한 기술에 따라 대상체의 뇌에서 감마 진동을 유도하는 청각 및 시각 복합자극에 적어도 부분적으로 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같이 청각 및 시각 복합 자극(예를 들어, 시각 및 청각 복합 GENUS)은 시각 또는 청각 GENUS 단독으로는 관찰되지 않은 긍정적인 생리적 및 행동적 변화를 예기치 않게 발생시킨다. 청각 및 시각 복합 GENUS에서 발생하는 뇌에 대한 긍정적인 효과는 청각 피질(AC) 및 해마(HPC)에 국한되는 것이 아니라, 내측 전두엽 피질(mPFC)에서의 소교세포(microglia)-클러스터링 반응 유도 및 신피질 전체에 걸친 아밀로이드 부하 감소까지 특히 확장되었다. 또한, 청각 및 시각 GENUS의 효과는 짧은 시간 단위의 치료/노출(몇 주 단위로)로도 관찰된다.
일 양태에서, 본 개시는 치매 또는 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 장치, 방법 및 시스템을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 적어도 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위해 대상체에게 약 20 Hz 내지 약 60 Hz의 주파수를 갖는 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치매는 AD, 혈관성 치매, 전두 측두 치매, 루이소체 치매, 및/또는 연령 관련 인지 감소와 연관된다. 대상체는 인간 또는 동물일 수 있다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 주파수를 갖는다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 청각 피질(AC), 시각 피질(VC), 해마(HPC) 및 내측 전두엽 피질(mPFC)로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역 중 기록 부위의 5% 이상에서 주기적 스파이크 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 mPFC에서 약 40 Hz의 국소장 전위(LFP)를 유도한다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 적어도 하나의 피질 영역에서 소교반응을 증가시킨다. 피질 영역은 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소교반응은 mPFC에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 다수의 피질 영역에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 전체 신피질에 걸쳐 유도된다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 아밀로이드 플라크의 25 마이크로미터 이내에서 소교세포 수의 증가, 소교세포체 직경의 증가, 소교세포 돌기 길이의 감소, 및 소교세포 수의 증가로부터 선택된 적어도 하나의 효과를 포함한다. 일 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 소교세포체 직경을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 소교세포 돌기 길이를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 감소시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 소교세포 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 단계를 포함한다. 피질 영역은 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소교반응은 mPFC에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 다수의 피질 영역에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 전체 신피질에 걸쳐 유도된다.
일 구현예에서, 아밀로이드 플라크를 감소시키는 단계는 플라크 사이즈를 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60% 감소시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 아밀로이드 플라크를 감소시키는 단계는 플라크 수를 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60% 감소시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역에서 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드의 양을 감소시키는 단계를 포함한다. 피질 영역은 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소교반응은 mPFC에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 다수의 피질 영역에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 전체 신피질에 걸쳐 유도된다.
일 구현예에서, Aβ 펩티드 양을 감소시키는 단계는 양을 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60% 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, Aβ 펩티드는 동종형 Aβ1 40 펩티드 및 동종형 Aβ1-42 펩티드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, Aβ 펩티드는 가용성 Aβ 펩티드 및 불용성 Aβ 펩티드 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다.
제2 양태에서, 본 개시는 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 치매 또는 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수로 시각 자극을 방출하도록 적어도 하나의 시각 자극기를 제어하는 단계; 전기 오디오 신호를 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수의 상응하는 청각 자극으로 변환하기 위해 적어도 하나의 전기 음향 변환기를 제어하는 단계; 및 대상체에게 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하되, 복합 자극은 동기적으로 정렬된 시각 자극과 청각 자극을 포함하고, 복합 자극은 대상체의 적어도 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위한 것이다. 동기화된 감마 진동은 대상체에서 인지 기능의 개선을 초래한다.
일부 구현예에서, 시각 자극은 12.5 ms의 점등과 12.5 ms의 소등을 반복하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 발광 자극기는 40~80 W 출력을 갖는 발광 다이오드이다. 일부 구현예에서, 청각 자극은 약 4 % 내지 약 80 %의 듀티 사이클로 40 Hz로 재생되는 10 kHz 음조를 포함한다. 일부 구현예에서, 시각 자극은 약 10% 내지 약 80%의 듀티 사이클로 10초 동안 40 Hz로 깜박이는 광을 포함한다.
일부 구현예에서, 시각 자극과 청각 자극은 동기화된다. 일부 구현예에서, 시각 자극과 청각 자극은 -180 내지 0도 또는 0 내지 180도 만큼 위상이 다르다.
아래에서 더욱 상세히 논의되는 전술한 개념 및 추가 개념의 모든 조합이(이들 개념이 상호 불일치하지 않는다면) 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부로서 고려됨을 이해해야 한다. 특히, 본 개시의 끝에서 나타나는 청구된 주제의 모든 조합은, 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부로서 간주된다. 또한 본원에 참조로서 통합된 임의의 개시에서 나타날 수도 있는 용어로서, 본원에서 명시적으로 사용된 용어에는, 본원에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 함을 또한 이해해야 한다.
다음의 도면 및 상세한 설명을 검토하면, 다른 시스템, 프로세스 및 특징은 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 모든 추가적인 시스템, 공정 및 특징은 본 설명 내에 포함되고, 본 발명의 범주 내에 있고, 첨부된 청구범위에 의해 보호되도록 의도한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다.
당업자는, 도면들이 주로 예시적인 목적을 위한 것이며 본원에 기술된 본 발명의 주제의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율은 아니며; 일부 경우에, 본원에 개시된 본 발명의 주제의 다양한 양태들은 도면에서 과장되거나 확대되어 상이한 특징의 이해를 용이하게 할 수 있다. 도면에서, 유사한 참조 부호는 일반적으로, 예를 들어, 유사한 특징(예: 기능적으로 유사한 요소 및/또는 구조적으로 유사한 요소)을 나타낸다.
도 1a~1l은 40 Hz 청각 자극이 AC, CA1, 및 mPFC에서 스파이크 활성을 조절하는 것을 보여준다.
도 2a~2j는 5XFAD 마우스에서 청각 GENUS가 인지 및 공간 기억 작업을 향상시키는 것을 보여준다.
도 3a~3i는 5XFAD 마우스에서 청각 GENUS가 AC와 HPC에서 아밀로이드 부하를 감소시키는 것을 보여준다.
도 4a~4k는 5XFAD 마우스에서 청각 GENUS가 AC와 CA1에서 교세포(glial) 반응을 유도하는 것을 보여준다.
도 5a~5f는 청각 GENUS가 아밀로이드-맥관구조 결합을 증가시키는 것을 보여준다.
도 6a~6i는 청각 및 시각 복합 GENUS가 소교세포에 의한 클러스터링 표현형 반응을 유도하는 것을 보여준다.
도 7a~7j는 청각 및 시각 복합 GENUS가 mPFC 및 신피질에서 아밀로이드 부하를 감소시키는 것을 보여준다.
도 8a~8r는 20 Hz 및 80 Hz 청각 자극이 AC, CA1, 및 mPFC에서 활성을 조절하는 것을 보여준다.
도 9a~9l는 청각 GENUS가 마우스 행동에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
도 10a~10h는 청각 GENUS가 APP/PS1 마우스에서 플라크 부하를 개선하는 것을 보여준다.
도 11a~11h는 청각 GENUS가 APP/PS1 마우스에서 소교반응을 유도하는 것을 보여준다.
도 12a~12l는 청각 GENUS가 P301S 마우스에서 인산화 타우를 감소시키는 것을 보여준다.
도 13a~13u는 40 Hz의 청각 및 시각 복합 자극이 AC, CA1, 및 mPFC에서 스파이크 활성을 조절하는 것을 보여준다.
도 14a~14v는 1주 동안의 청각 또는 시각 단독 GENUS가 mPFC 병리에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
당업자는, 도면들이 주로 예시적인 목적을 위한 것이며 본원에 기술된 본 발명의 주제의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율은 아니며; 일부 경우에, 본원에 개시된 본 발명의 주제의 다양한 양태들은 도면에서 과장되거나 확대되어 상이한 특징의 이해를 용이하게 할 수 있다. 도면에서, 유사한 참조 부호는 일반적으로, 예를 들어, 유사한 특징(예: 기능적으로 유사한 요소 및/또는 구조적으로 유사한 요소)을 나타낸다.
도 1a~1l은 40 Hz 청각 자극이 AC, CA1, 및 mPFC에서 스파이크 활성을 조절하는 것을 보여준다.
도 2a~2j는 5XFAD 마우스에서 청각 GENUS가 인지 및 공간 기억 작업을 향상시키는 것을 보여준다.
도 3a~3i는 5XFAD 마우스에서 청각 GENUS가 AC와 HPC에서 아밀로이드 부하를 감소시키는 것을 보여준다.
도 4a~4k는 5XFAD 마우스에서 청각 GENUS가 AC와 CA1에서 교세포(glial) 반응을 유도하는 것을 보여준다.
도 5a~5f는 청각 GENUS가 아밀로이드-맥관구조 결합을 증가시키는 것을 보여준다.
도 6a~6i는 청각 및 시각 복합 GENUS가 소교세포에 의한 클러스터링 표현형 반응을 유도하는 것을 보여준다.
도 7a~7j는 청각 및 시각 복합 GENUS가 mPFC 및 신피질에서 아밀로이드 부하를 감소시키는 것을 보여준다.
도 8a~8r는 20 Hz 및 80 Hz 청각 자극이 AC, CA1, 및 mPFC에서 활성을 조절하는 것을 보여준다.
도 9a~9l는 청각 GENUS가 마우스 행동에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
도 10a~10h는 청각 GENUS가 APP/PS1 마우스에서 플라크 부하를 개선하는 것을 보여준다.
도 11a~11h는 청각 GENUS가 APP/PS1 마우스에서 소교반응을 유도하는 것을 보여준다.
도 12a~12l는 청각 GENUS가 P301S 마우스에서 인산화 타우를 감소시키는 것을 보여준다.
도 13a~13u는 40 Hz의 청각 및 시각 복합 자극이 AC, CA1, 및 mPFC에서 스파이크 활성을 조절하는 것을 보여준다.
도 14a~14v는 1주 동안의 청각 또는 시각 단독 GENUS가 mPFC 병리에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
감각 자극을 이용한 청각 및 시각 복합 감마 혼입(Gamma ENtrainment Using Sensory stimuli, GENUS)은 시각 또는 청각 GENUS 단독으로는 관찰되지 않은 긍정적인 생리적 및 행동적 변화를 예기치 않게 발생시킨다. 뇌에 대한 긍정적인 효과는 청각 피질(AC) 및 해마(HPC)에 국한되지 않고, 오히려 내측 전두엽 피질(mPFC)에서 소교세포-클러스터링 반응을 유도하고 신피질 전체에 걸친 아밀로이드 부하를 감소시키는 것까지 확장되었다. 또한, 청각 및 시각 GENUS의 효과는 짧은 시간 단위 (수 주 단위)에 걸쳐서 관찰된다. 약 1주 동안의 청각 및 시각 복합 GENUS는 대형 회로망에 걸쳐있는 뇌 영역에서 알츠하이머병(AD)의 병리를 개선한다. 특히, 청각 및 시각 복합 GENUS는 AC, 시각 피질(VC), 해마 서브영역 CA1, 및 mPFC에서 아밀로이드 부하를 상당한 감소시킨다. 청각 및 시각 복합 GENUS는 내측 전두엽 피질에서 소교세포-클러스터링 반응을 생성하고 아밀로이드를 감소시킨다. 청각 및 시각 복합 GENUS는 신피질 전체에 걸쳐 아밀로이드 플라크의 광범위한 감소를 초래한다.
일 양태에서, 본 개시는 치매 또는 알츠하이머병의 치료를 요하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 장치, 방법 및 시스템을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 적어도 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위해 대상체에게 약 20 Hz 내지 약 60 Hz의 주파수를 갖는 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치매는 AD, 혈관성 치매, 전두 측두 치매, 루이소체 치매, 및/또는 연령 관련 인지 감소와 연관된다. 대상체는 인간 또는 동물일 수 있다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 주파수를 갖는다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 청각 피질(AC), 시각 피질(VC), 해마(HPC) 및 내측 전두엽 피질(mPFC)로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역 중 기록 부위의 5% 이상에서 주기적 스파이크 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 mPFC에서 약 40 Hz의 국소장 전위(LFP)를 유도한다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 적어도 하나의 피질 영역에서 소교반응을 증가시킨다. 피질 영역은 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소교반응은 mPFC에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 다수의 피질 영역에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 전체 신피질에 걸쳐 유도된다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 아밀로이드 플라크의 25 마이크로미터 이내에서 소교세포 수의 증가, 소교세포체 직경의 증가, 소교세포 돌기 길이의 감소, 및 소교세포 수의 증가로부터 선택된 적어도 하나의 효과를 포함한다. 일 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 소교세포체 직경을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 소교세포 돌기 길이를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 감소시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 소교세포 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개월 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 단계를 포함한다. 피질 영역은 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소교반응은 mPFC에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 다수의 피질 영역에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 전체 신피질에 걸쳐 유도된다.
일 구현예에서, 아밀로이드 플라크를 감소시키는 단계는 플라크 사이즈를 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60% 감소시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 아밀로이드 플라크를 감소시키는 단계는 플라크 수를 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60% 감소시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개월 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다.
일부 구현예에서, 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계는 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역에서 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드의 양을 감소시키는 단계를 포함한다. 피질 영역은 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소교반응은 mPFC에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 다수의 피질 영역에서 유도된다. 일부 구현예에서, 소교반응은 전체 신피질에 걸쳐 유도된다.
일 구현예에서, Aβ 펩티드 양을 감소시키는 단계는 양을 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60% 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, Aβ 펩티드는 동종형 Aβ1 40 펩티드 및 동종형 Aβ1-42 펩티드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, Aβ 펩티드는 가용성 Aβ 펩티드 및 불용성 Aβ 펩티드 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개월 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 소교반응을 증가시키는 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년 동안 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달한 후에 이루어진다.
제2 양태에서, 본 개시는 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 치매 또는 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수로 시각 자극을 방출하도록 적어도 하나의 시각 자극기를 제어하는 단계; 전기 오디오 신호를 약 35 Hz 내지 약 45 Hz 주파수의 상응하는 청각 자극으로 변환하기 위해 적어도 하나의 전기 음향 변환기를 제어하는 단계; 및 대상체에게 복합 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하되, 복합 자극은 동기적으로 정렬된 시각 자극 및 청각 자극을 포함하고, 복합 자극은 대상체의 적어도 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위한 것이다. 동기화된 감마 진동은 대상체에서 인지 기능의 개선을 초래한다.
일부 구현예에서, 시각 자극은 12.5 ms의 점등과 12.5 ms의 소등을 반복하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 발광 자극기(optogenetic stimulator)는 40~80 W 출력을 갖는 발광 다이오드이다. 일부 구현예에서, 청각 자극은 약 4 % 내지 약 80 %의 듀티 사이클로 40 Hz로 재생되는 10 kHz 음조를 포함한다. 일부 구현예에서, 시각 자극은 약 10% 내지 약 80%의 듀티 사이클로 10초 동안 40 Hz로 깜박이는 광을 포함한다.
일부 구현예에서, 시각 자극과 청각 자극은 동기화된다. 일부 구현예에서, 시각 자극과 청각 자극은 -180 내지 0도 또는 0 내지 180도 만큼 위상이 다르다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "위상(phase)"은 청각 자극과 시각 자극 사이의 도 단위로 표시된 지연을 지칭하며, 0도는 청각 및 시각 자극이 동시에 이루어지는 것을 의미하고, -180 또는 +180도는 시각 및 청각 자극이 교번으로 이루어지는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료(treatment 또는 treating) "는 치료적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 둘 다를 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 질병이나 병태가 있는 대상체들 뿐만 아니라 질병이나 병태가 발생할 수 있는 대상체들을 포함하고, 대상체에서의 목적은 질병이나 병태를 예방, 지연 또는 약화시키는 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 장치, 방법, 및 시스템은 대상체가 유전적으로 소인되는 질병 또는 질환, 예컨대 AD를 예방, 지연 또는 약화시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 장치, 방법, 및 시스템은 대상체가 걸린 것으로 이미 진단된 AD와 같은 질병 또는 질환의 증상을 치료, 완화, 감소시키고/시키거나 그 진행을 지연시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체(subject)"는 설치류, 고양이, 개과, 또는 영장류와 같은 포유류를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 대상체는 인간이다.
용어 "약(about)"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, "약"이 한정하는 대상의 +/- 10%를 지칭한다.
치매는 지적 능력의 상실 및/또는 기억 장애를 특징으로 하는 장애이다. 치매는, 예를 들어, AD, 혈관성 치매, 루이소체 치매, 피크병, 전두 측두 치매(FTD), 에이즈 치매, 연령 관련 인지 손상, 및 연령 관련 기억 장애를 포함한다. 치매는 또한, 예를 들어, 뇌종양, 뇌 병변, 뇌전증, 다발성 경화증, 다운 증후군, 렛 증후군, 진행성 상부 핵 마비, 전두엽 증후군, 조현병, 및 외상성 뇌 손상과 같은 신경학적 및/또는 정신과적 질환과 연관될 수 있다.
AD는 선진국에서 가장 빈번한 신경퇴행성 질병이다. AD는 타우 단백질로 만들어진 NFT 및 Aβ 펩티드로 이루어진 아밀로이드 플라크의 축적을 특징으로 하는 조직병리학적 특징을 갖는다. 임상적으로, AD는 기억, 기능, 언어 능력, 판단, 및 집행 기능의 손실을 특징으로 하는 진행성 인지 장애와 연관된다. AD는 종종 말기 단계에서 중증 거동 증상을 유발한다.
혈관성 치매는 뇌혈관 치매로도 지칭될 수 있고, 뇌혈관 질병(예를 들어, 뇌 반구의 경색)을 지칭하는데, 일반적으로는 호전과 단계별 악화의 기간을 동반하는 등락 과정을 거친다. 혈관성 치매는 방향 감각 상실, 기억 장애 및/또는 판단 장애 중 하나 이상의 증상을 포함할 수 있다. 혈관성 치매는 이산된 다발성 경색, 또는 다른 혈관성 발병 원인에 의해 유발될 수 있는데, 이에는 예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스에서 발견된 것과 같은 자가면역 혈관염; 라임병과 같은 감염성 혈관염; 재발성 뇌내 출혈; 및/또는 뇌졸중이 포함된다.
전두 측두 치매(FTD)는 진행성 신경퇴행성 장애이다. FTD를 가진 대상체는 흔히 언어 장애를 동반하는 두드러진 행동 및 인격 변화를 일반적으로 나타낸다.
루이소체 치매는 치매 발생의 하나 이상의 증상(AD의 특징과 중복되는 것들을 포함함); 파킨슨병의 특징의 발생; 및/또는 환각의 조기 발생을 특징으로 한다. 루이소체 치매는 일반적으로, 증상의 중증도가 매일 변동하는 것을 특징으로 한다.
일부 양태에서, 본 개시는 대상체에게 치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체의 뇌에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 신경학적 질병 또는 장애 또는 연령 관련 퇴행을 앓고 있는 대상체에서 감마 진동을 유도하는 것은, 질병이나 장애 또는 노인성 퇴행에 의해 손상되었거나 이와 관련하여 손상된 감마 진동 리듬을 복원하는 작용을 한다.
일부 구현예에서, 감마 진동의 유도는 동종형 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 생성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 감마 진동의 유도는 대상체의 뇌로부터 Aβ(예를 들어, 동종형 Aβ1-40 및 Aβ1-42)의 제거를 강화시킨다. 일부 구현예에서, 감마 진동의 유도는 대상체의 뇌에서 Aβ의 축적을 예방한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 치료 전 대상체의 뇌에서의 Aβ 수준에 비해, 대상체의 뇌에서의 Aβ의 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%만큼, 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 구현예에서, 대상체의 뇌에서의 Aβ 수준은 치료 전 대상체의 뇌에서의 Aβ 수준에 비해 최소한 약 50%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 대상체의 뇌에서의 Aβ 수준은 대상체의 뇌에서 APP의 절단 감소를 통해 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 치료 전 대상체의 뇌에서의 APP 절단 수준에 비해 대상체의 뇌에서의 APP 절단을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%만큼, 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 구현예에서, 대상체의 뇌에서의 APP 절단 수준은 치료 전 대상체의 뇌에서의 APP 절단 수준에 비해 최소한 약 50%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, APP 절단 수준은 대상체의 뇌에서 C-말단 단편 β(β-CTF)의 수준에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 뇌에서의 APP 절단 수준은 β- 및/또는 γ-세크레타아제의 저해를 통해, 예컨대, β- 및/또는 γ-세크레타아제 활성의 저해 수준을 증가시킴으로써 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법은 대상체의 뇌에서 Aβ 플라크의 응집을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 이들 방법은 대상체에서 인지 능력 및/또는 기억을 향상시킨다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체의 뇌에서 신경보호 프로파일 또는 신경보호 환경을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체의 뇌에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 신경 보호 프로파일은 신경 보호 소교세포 프로파일과 연관된다. 추가 구현예에서, 신경보호 프로파일은 M-CSF 경로의 활성 증가에 의해 유도되거나 이와 연관된다. 일부 구현예에서, 신경보호 환경은 항염증성 신호전달 경로와 연관된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항염증성 신호 전달 경로는 항염증성 소교세포 신호 전달 경로이다.
일부 구현예에서, 신경보호 프로파일은 전-염증성 교세포 활성의 감소 또는 결여와 연관된다. 전-염증성 교세포 활성은 소교세포에서의 M1 표현형과 연관되고, 활성 산소종(ROS), 신경분비 단백질 크로모그래닌 A, 분비 보조인자 시스타인 C, NADPH 산화효소, iNOS와 같은 산화 질소 합성 효소, NF-κB-의존성 염증 반응 단백질, 및 전-염증성 사이토카인 및 케모카인(예를 들어, TNF, IL-1β, IL-6, 및 IFNγ)의 생성을 포함한다.
대조적으로, 소교세포의 M2 표현형은 염증의 하향 조절 및 염증 유도 손상의 회복과 연관된다. 항-염증 사이토카인 및 케모카인(IL-4, IL-13, IL-10, 및/또는 TGFβ)뿐만 아니라 식균 활성의 증가도 M2 표현형과 연관된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 소교세포에서 신경보호성 M2 표현형을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법은 대상체의 뇌에서 식균 활성을 증가시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 Aβ의 제거가 증가되도록, 소교세포의 식균 활성을 증가시킨다.
감마 진동은 약 20 Hz 내지 약 100 Hz를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 치매를 예방, 완화, 또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 뇌에서 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 또는 약 30 내지 약 60 Hz, 또는 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 감마 진동을 유도하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 감마 진동은 약 40 Hz이다.
자극은 적어도 하나의 뇌 영역에서 감마 진동을 직접적으로 또는 궁극적으로 유도하는, 대상체의 내부 또는 외부 환경에서 임의의 검출 가능한 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 자극은 전자기 방사선 수용체(가령, 광수용체, 적외선 수용체 및/또는 자외선 수용체), 기계적 자극 수용기(가령, 기계적 응력 및/또는 응력 수용기), 통각 수용기(즉, 통증 수용기), 소리 수용기, 전기 수용기(가령, 전기장 수용기), 자기 수용기(가령, 자기장 수용기), 수분 수용기, 화학 수용체, 온도 수용기, 삼투 수용기 및/또는 고유 수용기(즉, 위치 감각 수용기)를 자극하도록 설계될 수 있다. 수용기로부터 반응을 이끌어내는데 필요한 감각의 절대적 역치 또는 최소량은 자극의 유형 및 대상체에 근거하여 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극은 개별 감수성에 근거하여 조정된다.
일부 구현예에서, 감마 진동은 뇌 영역 특이적 방식으로 유도된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 감마 진동은 해마, 시각 피질, 배럴 피질, 청각 피질, 또는 이들의 임의의 조합에서 유도된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 감마 진동은 섬광을 이용하여 시각 피질에서 유도되고; 그리고 다른 구현예에서, 감마 진동은 특정 주파수의 청각 자극을 이용하여 청각 피질에서 유도된다. 일부 구현예에서, 감마 진동은 시각, 청각 및/또는 다른 자극의 조합을 동시에 이용하여 다수의 뇌 영역에서 유도된다. 일부 구현예에서, 감마 진동은 가상 현실 시스템에서 유도된다.
일부 구현예에서, 대상체는 감마 진동을 유도하도록 설정된 환경, 예를 들면, 관련 없는 자극을 수동적으로 또는 능동적으로 차단하는 챔버(가령, 광 차단 또는 잡음 상쇄)를 통해 자극을 제공받는다. 대안적으로 또는 추가적으로, 대상체는, 예를 들어, 차광 양태 또는 잡음 소거 양태를 포함하는 시스템을 통해 자극을 제공받을 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 자극을 전달하도록 설계된 자극-방출 장치, 예를 들면, 안경류를 통해 시각 자극을 제공받는다. 상기 장치는 다른 광을 차단할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 자극을 전달하도록 설계된 자극-방출 장치, 예를 들면, 헤드폰을 통해 청각 자극을 제공받는다. 상기 장치는 다른 잡음을 상쇄할 수 있다.
자극을 방출하기 위한 적어도 하나의 인터페이스에 더하여, 일부 구현예는 (예를 들어, 자극을 산출하고, 자극의 방출을 제어하고, 자극/결과의 방출을 모니터링하고 및/또는 자극/결과에 관한 피드백을 처리하기 위한) 적어도 하나의 프로세서, (예를 들어, 프로세서-이행식 명령어, 최소한 하나의 자극, 자극 산출 정책, 피드백 및/또는 결과를 보관하기 위한) 적어도 하나의 메모리, (예를 들어, 개체, 건강 관리 제공자, 관리인, 임상 연구 조사관, 데이터베이스, 모니터링 애플리케이션 등과 통신하기 위한) 적어도 하나의 통신 인터페이스 및/또는 (예를 들어, 감마 진동이 유도되는 지의 여부, 개체 감수성, 인지 기능, 물리적 또는 화학적 변화, 스트레스, 안전성 등을 비롯하여, 자극 및/또는 개체를 검출하고 이들에 관한 피드백을 제공하기 위한) 검출 장치를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 감마 진동은 시각 자극에 의해, 예를 들어, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz의 섬광에 의해 유도된다. 특정 구현예에서, 감마 진동은 약 20 Hz 내지 약 50 Hz의 섬광에 의해 유도된다. 추가 구현예에서, 감마 진동은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 섬광에 의해 유도된다. 또 다른 추가 구현예에서, 감마 진동은 약 40 Hz의 섬광에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 대상체는 약 20 Hz 내지 약 100 Hz의 섬광, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz의 섬광 또는 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 섬광, 또는 약 40 Hz의 섬광을 제공받는다(가령, 이들 섬광을 방출하는 차광 장치가 구비된 챔버 내에 배치되거나 이러한 장치를 착용한다).
일부 구현예에서, 감마 진동은 청각 자극에 의해, 예를 들어, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 또는 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 주파수를 갖는 소리에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 대상체는 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 청각 자극을 제공받는다(가령, 이러한 청각 자극을 방출하는 잡음 소거 장치가 구비된 챔버 내에 배치되거나 이러한 장치를 착용한다).
일부 구현예에서, 대상체는 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 또는 그 이상의 시간 동안 시각 및/또는 청각 자극을 제공받는다(가령, 이러한 자극을 방출하는 차광 장치가 구비된 챔버 내에 배치되거나 이러한 장치를 착용한다). 일부 구현예에서, 대상체는 약 6시간 이하, 약 5시간 이하, 약 4시간 이하, 약 3시간 이하, 약 2시간 이하, 또는 약 1시간 이하의 시간 동안 자극을 제공받는다(가령, 이러한 자극을 방출하는 차광 장치가 구비된 챔버 내에 배치되거나 이러한 장치를 착용한다). 일부 구현예에서, 대상체는 1시간 미만의 시간 동안 자극을 제공받는다(가령, 이러한 자극을 방출하는 차광 장치가 구비된 챔버 내에 배치되거나 이러한 장치를 착용한다).
일부 구현예에서, 대상체는 본원에서 제공된 방법을 거친다. 다른 구현예에서, 대상체는 다수의 별도 시점에 본원에서 제공된 방법을 사용하는 치료 과정을 거친다. 대상체는 규칙적인 일정으로 치료를 받거나 증상이 발생하거나 악화될 때 치료를 받을 수 있다. 일부 구현예에서, 장기 치료는 가용성 Aβ 펩티드 및/또는 불용성 Aβ 펩티드(즉, 플라크)를 감소시키는데 효과적일 수 있다.
일부 구현예에서, 감마 진동은 세포 유형 특이적 방식으로 유도된다. 일부 구현예에서, 감마 진동은 FS-PV-개재뉴런에서 유도된다. 뉴런의 부류를 설명하는데 사용되는 용어 "빠른-스파이크(fast-spiking, FS)"은 스파이크 빈도 적응이 거의 없거나 스파이크 높이의 약화가 거의 없는 상태로 장 시간동안 높은 속도로 방출할 수 있는 뉴런의 능력을 지칭한다. 따라서, 이들 뉴런은 상당한 조절 없이 고주파(가령, 약 100 Hz 이상 또는 약 150 Hz 이상) 방출을 지속할 수 있다. FS 뉴런의 이러한 성질은 빠른 지연된 정류기 통로, 즉, 매우 빠르게 활성화되고 불활성화되는 통로의 발현에 상당히 기인한다.
일 양태에서, 자극은 비침습성일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "비침습성(non-invasive)"은 신체의 외과적 개입 또는 조작, 예를 들면, 조성물 또는 장치의 주입 또는 이식을 필요로 하지 않는 장치, 방법 및 시스템을 지칭한다. 예를 들어, 자극은 시각(가령, 깜박거리는 불빛), 청각(가령, 소리 진동) 및/또는 촉각(힘, 진동 또는 운동으로 기계적 자극)일 수 있다.
또 다른 양태에서, 자극은 침습성 또는 최소한 부분적으로 침습성일 수 있다. 예를 들어, 시각, 청각 및/또는 촉각 자극은 조성물(가령, 광-민감성 단백질) 또는 장치(가령, 통합된 광섬유 및 고체-상태 광원)의 주입 또는 이식과 합동될 수 있다.
실험 데이터
본원에 기술된 본 발명의 개념에 관한 실험 데이터가 다양한 도면과 관련하여 아래에 제시되며, 이는 먼저 요약되고 이어서 상세한 설명이 이어진다.
도 1a는 AC에서 40 Hz 청각 자극(각 쌍의 좌측 패널) 및 무작위 자극(각 쌍의 우측 패널) 동안 2개의 추정 단일 유닛의 흥분율 변화를 보여준다. 점은 청각 펄스를 나타내며; 밝은색 막대는 무작위로 분포된 펄스를 나타낸다. 래스터 플롯은 10초의 40 Hz 청각 또는 무작위 자극에 대한 2개의 예시적인 추정 단일 유닛의 스파이크 반응을 보여준다.
도 1b 모든 단일 유닛에 대해 무자극(no stim으로 표시), 무작위(random으로 표시), 및 40Hz 청각 자극(40Hz stim으로 표시) 조건에 대해 AC에서 흥분율의 피크 간 간격 분포를 보여준다(5마리 마우스에서 9회 기록 세션동안 n=292 유닛. 자극 간 간격 주변의 간격 비율 : P = 0 40 Hz vs. 무자극, P = 0 40 Hz vs. 무작위; 두 비율에 대한 z-검정).
도 1c는 40 Hz 청각 자극 동안 자극의 개시에 대한 흥분율 변화의 예시적인 극도표(좌측, 0에서 자극 개시), 40 Hz 청각 자극, 무작위, 및 무자극 동안 단일 유닛 흥분율 변화의 벡터 강도 분포(중앙, ****P<0.0001, P = 4x10-54 40 Hz vs. No Stim, P = 2x10-13 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test), 및 단일 유닛 흥분율 변화의 레일리 통계값의 분포(우측, ****P<0.0001, P = 5x10-68 40 Hz vs. No Stim, P = 6x10-72 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test; 26 유닛은 30 보다 큰 40 Hz 자극 RS값을 가졌다; 1 유닛은 30 보다 큰 무작위 자극 RS값을 가졌다)를 보여준다.
도 1d는 AC의 자극 조건들 사이의 평균 흥분율 값의 분포를 보여준다.
도 1e는 CA1에 대해 도 1a와 동일하게 보여준다.
도 1f는 CA1에 대해 도 1b와 동일하게 보여준다(5마리 마우스에서 10회 기록 세션동안 n = 338 유닛. P = 0 40 Hz vs. No stim, P = 0 40 Hz vs. Random; 두 비율에 대한 z-검정).
도 1g는 CA1에 대해 도 1c와 동일하게 보여준다(중앙, ****P<0.0001, P = 4x10-40 40 Hz vs. No Stim, P = 9x10-11 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test; 우측, ****P<0.0001, P = 1x10-74 40 Hz vs. No Stim, P = 2x10-73 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test).
도 1h는 CA1에 대해 도 1d와 동일하게 보여준다.
도 1i는 mPFC에 대해 도 1a와 동일하게 보여준다.
도 1j는 mPFC에 대해 도 1b와 동일하게 보여준다(4마리 마우스에서 7회 기록 세션동안 n = 115 유닛. P = 0 40 Hz vs. No stim, P = 0 40 Hz vs. Random; 두 비율에 대한 z-검정).
도 1k는 mPFC에 대해 도 1c와 동일하게 보여준다(중앙, ****P<0.0001, P = 2x10-27 40 Hz vs. No Stim, P = 4x10-5 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test; 우측, ****P<0.0001, P = 1x10-28 40 Hz vs. No Stim, P = 5x10-30 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test).
도 1l는 mPFC에 대해 도 1d와 동일하게 보여준다.
도 2a는 5XFAD 청각 GENUS 마우스에 대한 행동 실험의 일정표를 보여준다.
도 2b는 5XFAD 청각 GENUS 마우스의 신규 물체 인지(NOR) 테스트의 인지 지수를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 원은 'n'을 나타냄, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001, n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 2c는 신규 물체 인지 테스트 동안 평균 속도(cm/s)를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 2d는 신규 물체 인지 테스트 동안 이동한 총 거리(cm)를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 2e는 5XFAD 청각 GENUS 마우스의 신규 물체 위치(NOL) 테스트의 인지 지수를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001, n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 2f는 신규 물체 위치 테스트 동안 평균 속도(cm/s)를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 2g는 신규 물체 위치 테스트 동안 이동한 총 거리(cm)를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 2h는 Morris Water Maze에서 5XFAD 무자극, 무작위 주파수, 및 40 Hz 청각 자극된 마우스의 탈출 잠복기(s)를 보여준다(무자극군의 n=25 마우스, 40 Hz군의 n=28 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001, n.s.= 유의미하지 않음, Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 2-way ANOVA).
도 2i는 프로브 시험동안 목표 사분면에서 수영한 시간을 보여준다(무자극군의 n=25 마우스, 40 Hz군의 n=28 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 2j는 프로브 시험동안 플랫폼 교차점의 수를 보여준다(무자극군의 n=25 마우스, 40 Hz군의 n=28 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 3a는 7일 동안 하루에 1시간씩, 무자극 대조군으로 표준화된, 40 Hz, 8 Hz, 80 Hz, 또는 무작위 주파수 청각 자극에 따른 6개월령 5XFAD 마우스에서 청각 피질(AC) 및 해마(HPC)에서 상대적인 가용성 Aβ1-42를 보여준다(무자극군의 n=19 마우스, 40 Hz군의 n=19 마우스, 8 Hz군의 n=4 마우스, 80Hz군의 n=7, 무작위 주파수군의 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001, n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 3b는 불용성 Aβ1-42에 대해 도 3a에서 처럼 보여준다.
도 3c는 7일 동안 하루 1시간 씩, 청각 GENUS 또는 무자극 후에 5XFAD 마우스의 6개월령 AC에서 항-Aβ(D54D2, 녹색) 항체를 갖는 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=7 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 3d는 CA1에 대해 도 3c에서 처럼 보여준다.
도 3e는 AC 및 CA1에서 Aβ 양성 플라크의 평균 개수를 보여준다(그룹 당 n=7 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitney Test).
도 3f는 AC 및 CA1에서 Aβ 양성 플라크의 평균 구역을 보여준다(그룹 당 n=7 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01, ***P<0.001; 비대응 Mann-Whitney Test).
도 3g는 7일 동안 하루 1시간 씩, 청각 GENUS 또는 무자극 후에 5XFAD 마우스의 6개월령 AC에서 항-Aβ(12F4, 적색) 항체를 갖는 면역 조직 화학을 보여준다(삽화, 20x, 스케일 바, 50μm).
도 3h는 CA1에 대해 도 3g에서 처럼 보여준다.
도 3i는 무자극 대조군으로 표준화된, Aβ(12F4) 평균 강도값(12F4 항체)을 보여준다(그룹 당 n=7 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001, 비대응 Mann-Whitney Test).
도 4a는 7일 동안 하루 1시간 씩 무자극 또는 청각 GENUS 후에 5XFAD 마우스의 AC에서 항-Iba1(019-19741, 녹색) 및 항-Aβ(12F4, 적색) 항체를 갖는 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 4b는 CA1에 대해 도 4a처럼 보여준다.
도 4c는 AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포의 수를 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney Test).
도 4d는 무자극 대조군으로 표준화된, AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포체의 직경을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitney Test).
도 4e는 무자극 대조군으로 표준화된, AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포 1차 돌기의 평균 길이를 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitney Test).
도 4f는 무자극 대조군으로 표준화된, AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포의 평균 돌기 수지상을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, **P<0.01; 비대응 Mann-Whitney Test).
도 4g는 AC와 CA1에서 또한 Aβ 양성인 Iba1-양성 소교세포체의 비율을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01, ***P<0.001; 비대응 Mann-Whitney Test).
도 4h는 7일 동안 하루 1시간 씩 무자극 또는 청각 GENUS 후에 5XFAD 마우스의 AC에서 항-S100B(ab868, 자색) 및 항-GFAP(ab4674, 회색) 항체를 갖는 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 4i는 CA1에 대해 도 4h에서 처럼 보여준다.
도 4j는 AC 및 CA1에서 S100B-양성 성상세포의 수를 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, *P<0.05; 비대응 Mann-Whitneyn Test).
도 4k는 GFAP-양성 성상세포에 대해 도 4j에서 처럼 보여준다.
도 5a는 하루 1시간의 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC에서 렉틴 염색(DL-1174, 녹색)을 갖는 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 5b는 CA1에 대해 도 5a에서 처럼 보여준다.
도 5c는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간 무자극 또는 청각 GENUS의 7일 후 6개월령의 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 혈관 직경의 배수 변화를 보여준다(그룹 당 n=7 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitneyn Test).
도 5d는 하루 1시간의 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC에서 항-LRP1(28320, 적색), 항-Aβ(AB9234, 녹색), 및 렉틴 염색(DL-1174, 회색) 항체를 갖는 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 5e는 CA1에 대해 도 5d에서 처럼 보여준다.
도 5f는 하루 1시간의 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 Aβ-LRP1 공동-국소화의 비율을 보여준다(그룹 당 n=8 마우스, *P<0.05; 비대응 Mann-Whitneyn Test).
도 6a는 40 Hz 시청각 자극 동안 단일 유닛의 흥분율 변화를 보여준다(좌측, 아래). 래스터 플롯은 10초의 40 Hz 청각 또는 무작위 자극에 대한 2개의 예시적인 추정 단일 유닛의 스파이크 반응을 보여준다(좌측, 위). 40 Hz 시청각 자극, 무작위 시청각 자극, 및 무자극 기간의 벡터 강도 분도(오른쪽, ****P<0.0001, P = 9x10-59 40 Hz vs. No Stim, P = 1x10-13 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test).
도 6b는 CA1에 대해 도 6a와 동일하게 보여준다(우측, ****P<0.0001, P = 6x10-41 40 Hz vs. No Stim, P = 2x10-11 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test).
도 6c는 mPFC에 대해 도 6a와 동일하게 보여준다(우측, ****P<0.0001, P = 2x10-23 40 Hz vs. No Stim, P = 9x10-5 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test).
도 6d는 하루 1시간의 무자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, VC, CA1, 및 mPFC에서 항-Iba1(019-19741) 및 항-Aβ(12F4) 항체의 IMARIS(방법)를 이용한 면역 조직 화학 및 3D 재구성을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 상측 삽화: 아밀로이드 플라크 주위에 25 μm 반경을 둘러싼 소교세포 수를 정량화하고자 IMARIS를 이용한 예시. 플라크는 적색 점으로, 소교세포는 녹색 점으로, 흰색 화살표는 클러스터를 나타냄. 하측 삽화: AC에서 병합, 확대된 이미지. 스케일 바, 20 μm).
도 6e는 복합 GENUS에 대해 도 6d에서 처럼 보여준다.
도 6f는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극 또는 복합 GENUS(A+V 자극) 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, VC, CA1, 및 mPFC에서 평균 소교세포체 직경을 보여준다(비 대조군 n=6 마우스, 복합 GENUS군 n=7 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitney test).
도 6g는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극 또는 복합 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, VC, CA1, 및 mPFC에서 평균 소교세포 돌기 길이를 보여준다(비 대조군 n=6 마우스, 복합 GENUS군 n=7 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01, ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitney test).
도 6h는 하루 1시간의 무자극 또는 복합 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, VC, CA1, 및 mPFC에서 관심 영역 당 소교세포 개수를 보여준다(비 대조군 n=6 마우스, 복합 GENUS군 n=7 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, **P<0.01, 비대응 Mann-Whitney test).
도 6i는 무자극 또는 복합 GENUS 후에 AC, VC, CA1, 및 mPFC에서 플라크의 25 μm 라듐을 둘러싼 소교세포의 평균 수를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 7a는 하루 1시간의 무자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, VC, CA1, 및 mPFC에서 항-Aβ 플라크(D54D2, 녹색)의 면역 조직 화학을 보여준다(40배 대물 렌즈로 촬영한 이미지, 스케일 바, 50 μm).
도 7b는 복합 GENUS에 대해 도 7a에서 처럼 보여준다.
도 7c는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극 또는 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 80 Hz, 및 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1, mPFC, 및 VC에서 평균 플라크 코어 면적을 보여준다(그룹 당 n=12 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 7d는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극 또는 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 80 Hz, 및 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1, mPFC, 및 VC에서 평균 플라크 수를 보여준다(그룹 당 n=12 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 7e는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 8 Hz, 또는 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 mPFC에서 상대적 가용성 Aβ1-42 수준을 보여준다(그룹 당 n=4~5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 7f는 불용성 Aβ1-42에 대해 도 7e에서 처럼 보여준다(n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05).
도 7g는 하루 1시간의 무자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 항-Aβ 플라크(D54D2, 백색) 항체의 SHIELD 처리된 전체 뇌(뇌의 25 μm 부분의 시상면)의 면역 조직 화학을 보여준다(광-시트 현미경, 스케일 바, 700 μm).
도 7h는 복합(A+V) GENUS에 대해 도 7g에서 처럼 보여준다.
도 7i는 무자극 또는 복합(A+V) GENUS 후 평균 피질 플라크를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 7j는 복합(A+V) GENUS 후 평균 피질 플라크 용적(μm3)을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 8a는 청각 피질을 검출하기 위해 사용되는 청각 맵핑 음조에 대한 평균 LFP 응답을 보여준다(좌측). 청색 영역은 50 ms 맵핑 음조가 재생되었을 때를 나타낸다. 클러스터화된 추정 단일 유닛의 예시(우측).
도 8b는 기록한 날에 대한 평균 및 표준 편차와 함께, 40 Hz 청각 플리커 자극 및 무자극 주기에 대한 출력 스펙트럼 밀도(PSD) 응답(좌측), AC에서 모든 기록한 날의 청각 플리커에 대한 출력 스펙트럼 LFP 응답(레코딩 깊이 당 40 Hz 청각 플리커 동안 최대 40 Hz 피크를 갖는 레코딩 사이트가 표시됨, 방법 참조)(우측)을 보여준다.
도 8c는 40 Hz 청각 자극 vs. 무자극 기간동안 AC에서 단일 유닛의 평균 흥분율(FR)(좌측), 대략 0 Hz의 AC 중심에서 단일 유닛의 다중 자극 조건 사이의 평균 흥분율 차이(우측, ****P<0.0001 40 Hz - 무자극, 다른 모든 n.s.; 제로 중앙값(zero median)에 대한 Wilcoxon signed rank test)를 보여준다.
도 8d는 20 Hz 청각 플리커 자극에 대응하는 추정 단일 유닛의 흥분율 변화를 보여주고(왼쪽, 아래), 래스터 플롯은 10초 자극에 대응하는 스파이크을 보여준다(왼쪽, 위). 20 Hz 청각 자극에 대한 흥분율 응답의 피크 간 간격의 분포(우측, 자극 간 간격 주변에 간격의 비율: P = 0 20 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 8e는 80 Hz 청각 플리커 자극에 대응하는 d 에서 보여준 동일 유닛의 흥분율 변화를 보여주고(왼쪽, 아래), 래스터 플롯은 10초 자극에 대응하는 스파이크을 보여준다(왼쪽, 위). 80 Hz 청각 자극에 대한 흥분율 응답의 피크 간 간격의 분포(우측, 자극 간 간격 주변에 간격의 비율: P = 0 80 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 8f는 20 Hz 및 80 Hz 청각 자극 vs. 무자극 조건의 벡터 강도 분포(좌측, ****P<0.0001, P = 3x10-61 20 Hz vs. No Stim, P = 3x10-61 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test), 및 20 Hz와 80 Hz 청각 자극 vs 무자극의 레일리 통계 분포(우측, ****P<0.0001, P = 3x10-73 20 Hz vs. No Stim, P = 1x10-68 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test; 30 보다 큰 20 Hz 자극 RS값을 가지는 54 유닛; 30 보다 큰 80 Hz 자극 RS값을 가지는 28 유닛)를 보여준다.
도 8g는 CA1을 검출하는 데 사용되는, 해마의 특징인, 세타 리듬의 예를 보여준다.
도 8h는 CA1에 대해 b와 동일하게 보여준다.
도 8i는 CA1에 대해 c와 동일하게 보여준다(우측, n.s.; 제로 중앙값에 대한 Wilcoxon signed rank test).
도 8j는 CA1에 대해 d와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 20 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 8k는 CA1에 대해 e와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 80 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 8l은 CA1에 대해 f와 동일하게 보여준다(좌측, ****P<0.0001, P = 1x10-40 20 Hz vs. No Stim, P = 9x10-45 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test; 우측, ****P<0.0001, P = 1x10-71 20 Hz vs. No Stim, P = 8x10-73 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test).
도 8m은 mPFC에서 탐침 경로 및 레코딩 위치를 보여주는 조직학 이미지를 보여준다. 빨간색 화살표는 레코딩 위치를 나타낸다.
도 8n은 mPFC에 대해 b와 동일하게 보여준다.
도 8o는 mPFC에 대해 c와 동일하게 보여준다(우측, n.s.; 제로 중앙값에 대한 Wilcoxon signed rank test).
도 8p는 mPFC에 대해 d와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 20 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 8q는 mPFC에 대해 e와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 80 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 8r은 mPFC에 대해 f와 동일하게 보여준다(좌측, ****P<0.0001, P = 1x10-23 20 Hz vs. No Stim, P = 6x10-24 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test; 우측, ****P<0.0001, P = 2x10-17 20 Hz vs. No Stim, P = 4x10-26 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test).
도 9a는 무자극, 40 Hz, 및 무작위 주파수 자극된 5XFAD 마우스의 NOR 테스트 동안 기존 및 신규 물체를 탐색하는데 소요된 시간(초)을 보여준다(무자극군 n=20 마우스, 40 Hz군 n=20 마우스, 무작위 주파수군 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01, ****p<0.0001, n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9b는 NOR 테스트 동안 20초의 총 물체 탐석 요건에 도달하기 위해 마우스가 필요한 시간(분)을 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9c는 무자극, 40 Hz, 및 무작위 주파수 자극된 5XFAD 마우스의 NOL 테스트 동안 기존 및 신규 위치에서 물체를 탐색하는데 소요된 시간(초)을 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ***P<0.001, ****p<0.0001, n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9d는 NOL 테스트 동안 20초의 총 물체 탐석 요건에 도달하기 위해 마우스가 필요한 시간(분)을 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9e는 습관화 동안 평균 속도(cm/s)를 보여준다((무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9f는 습관화 동안 이동한 총 거리(cm)를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9g는 습관화 동안 행동 챔버의 중심부에서 소요된 시간(초)를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9h는 습관화 동안 행동 챔버의 주변부에서 소요된 시간(초)를 보여준다(무자극군의 n=20 마우스, 40 Hz군의 n=20 마우스, 무작위 주파수군의 n=9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9i는 모리스 수중 미로 동안 평균 수영 속도(cm/s)를 보여준다(무자극군의 n=25 마우스, 40 Hz군의 n=28 마우스, 무작위 주파수군의 n= 9, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9j는 1시간 무자극, 청각 GENUS, 또는 무작위 주파수 자극 동안 평균 속도(cm/s)를 보여준다(무자극군의 n=6 마우스, 40 Hz군의 n=6 마우스, 무작위 주파수군의 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9k는 1시간 무자극, 청각 GENUS, 또는 무작위 주파수 자극 동안 이동한 총 거리(cm)를 보여준다(무자극군의 n=6 마우스, 40 Hz군의 n=6 마우스, 무작위 주파수군의 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 9l은 1시간 무자극, 청각 GENUS, 또는 무작위 주파수 자극 동안 2 cm/s 미만에서 소요된 시간(초)를 보여준다(무자극군의 n=6 마우스, 40 Hz군의 n=6 마우스, 무작위 주파수군의 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 10a는 7일 동안 하루에 1시간씩, 무자극 대조군으로 표준화된, 40 Hz, 8 Hz, 80 Hz, 또는 무작위 주파수 청각 자극에 따른 6개월령 5XFAD 마우스에서 청각 피질(AC) 및 해마(HPC)에서 상대적인 가용성 Aβ1-40를 보여준다(참고: 80 Hz에 대한 ELISA 및 무작위 주파수 HPC 샘플은 실패하였고 보고할 수 없음, 무자극군의 n=19 마우스, 40 Hz군의 n=19 마우스, 8 Hz군의 n=4 마우스, 80 Hz군의 n=7, 무작위 주파수군의 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01, n.s.= 유의미하지 않음, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 10b는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 이후 6개월령 APP/PS1 마우스의 청각 피질(AC) 및 해마(HPC)에서 상대적 가용성 Aβ1-42 수준을 보여준다(무자극군의 n=4 마우스, 40 Hz군의 n=4 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 10c는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 이후 9개월령 APP/PS1 마우스의 AC 및 CA1('관심 영역', ROI)에서 평균 플라크 수를 보여준다(무자극군의 n=5 마우스, 40 Hz군의 n=5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, 비대응 Mann-Whitneyn Test).
도 10d는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 이후 9개월령 APP/PS1 마우스의 AC 및 CA1에서 평균 플라크 코어 면적을 보여준다(무자극군의 n=5 마우스, 40 Hz군의 n=5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, 비대응 Mann-Whitneyn Test).
도 10e는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 이후 9개월령 APP/PS1 마우스의 AC 및 CA1에서 Aβ(12F4) 평균 세기값(12F4 항체)을 보여준다(무자극군의 n=5 마우스, 40 Hz군의 n=5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, 비대응 Mann-Whitneyn Test).
도 10f는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 후 7일 무자극 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 평균 플라크 수를 보여준다(무자극군의 n=6 마우스, 40 Hz군의 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitneyn test).
도 10g는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 후 7일 무자극 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 평균 플라크 코어 면적을 보여준다(무자극군의 n=6 마우스, 40 Hz군의 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitneyn test).
도 10h는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 후 7일 무자극 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 Aβ(12F4) 평균 세기값(12F4 항체)를 보여준다(무자극군의 n=6 마우스, 40 Hz군의 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitneyn test).
도 11a는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안 청각 GENUS 이후 9개월령 APP/PS1 마우스의 AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포체의 직경을 보여준다(그룹 당 n=5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 11b는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안 청각 GENUS 이후 9개월령 APP/PS1 마우스의 AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포 1차 돌기의 평균 길이를 보여준다(그룹 당 n=5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 11c는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안 청각 GENUS 이후 9개월령 APP/PS1 마우스의 AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포의 수를 보여준다(그룹 당 n=5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 11d는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 후 7일 무자극 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포체의 직경을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitney test).
도 11e는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 후 7일 무자극 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포 1차 돌기의 평균 길이를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitney test).
도 11f는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간씩 7일 동안, 청각 GENUS 후 7일 무자극 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 CA1에서 Iba1-양성 소교세포의 수를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05, n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitney test).
도 11g는 6개월령 WT 및 5XFAD 마우스의 CA1에서 항-GFAP(ab4674, 적색)와 렉틴 염색(DL-1174, green) 내 항-GFAP(ab4674, 적색) 및 렉틴 염색(DL-1174, 녹색) 항체를 갖는 CLARITY 처리된 뇌섹션의 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=5 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 11h는 6개월령 WT 및 5XFAD 마우스의 CA1에서 GFAP 양성 세포(관심 이미지 당, IMARIS 사용)의 수를 보여준다(그룹 당 n=5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01, 비대응 Mann-Whitney test).
도 12a는 하루 1시간의 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 P301S 마우스의 AC에서 항-pTau(T181, 적색) 항체를 사용한 면역 조직 화학을 보여준다(40배 대물 렌즈로 촬영한 이미지, 스케일 바, 50 μm).
도 12b는 CA1에 대해 도 12a에서 처럼 보여준다.
도 12c는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 P301S 마우스의 AC 및 CA1에서 상대적인 pTau(T181) 세기 수준을 보여준다(그룹 당 n=10 마우스, ***P<0.001, ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitney test).
도 12d는 하루 1시간의 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 P301S 마우스의 AC에서 항-pTau(S396, 녹색) 항체를 사용한 면역 조직 화학을 보여준다(스케일 바, 50 μm).
도 12e는 CA1에 대해 도 12d에서 처럼 보여준다.
도 12f는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 P301S 마우스의 AC 및 CA1에서 상대적인 pTau(S396) 세기 수준을 보여준다(그룹 당 n=10 마우스, ****P<0.0001; 비대응 Mann-Whitney test).
도 12g는 하루 1시간씩 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 P301S 마우스의 AC에서 pTau(S396)와 총 타우의 수준을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯을 보여준다.
도 12h는 해마에 대해 도 12g에서 처럼 보여준다.
도 12i는 하루 1시간씩 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 P301S 마우스의 해마에서 pTau(T181)와 총 타우의 수준을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯을 보여준다.
도 12j는 하루 1시간씩 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 (g에 있는 웨스턴 블롯으로 부터) P301S 마우스의 AC에서 총 타우에 대해 표준화된 pTau(S396)의 상대적인 면역반응성을 보여준다(그룹 당 n=3 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 12k는 하루 1시간씩 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 (h에 있는 웨스턴 블롯으로 부터) P301S 마우스의 HPC에서 총 타우에 대해 표준화된 pTau(S396)의 상대적인 면역반응성을 보여준다(40 Hz군의 n=2 마우스 및 무자극군의 n=3, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., ***P<0.001; 비대응 Mann-Whitney test).
도 12l은 하루 1시간씩 무자극 또는 청각 GENUS 7일 후에 (i에 있는 웨스턴 블롯으로 부터) P301S 마우스의 해마에서 총 타우에 대해 표준화된 pTau(T181)의 상대적인 면역반응성을 보여준다(40 Hz군의 n=2 마우스 및 무자극군의 n=3, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., **P<0.01; 비대응 Mann-Whitney test).
도 13a는 기록한 날에 대한 평균 및 표준 편차와 함께, 40 Hz 시청각 플리커 자극 및 무자극 주기에 대한 출력 스펙트럼 밀도(PSD) 응답(좌측), AC에서 모든 기록한 날의 시청각 플리커 자극에 대한 출력 스펙트럼 LFP 응답(레코딩 깊이 당 40 Hz 시청각 플리커 동안 최대 40 Hz 피크를 갖는 레코딩 사이트가 표시됨, 방법 참조)(우측)을 보여준다.
도 13b는 시청각 무작위 자극에 대해 도 13a에서 보여주는 추정 단일 유닛의 흥분율 변화(아래)를 보여주고, 래스터 플롯(위)은 10초의 무작위 자극에 대해 단일 유닛의 스파이크을 보여준다(좌측). AC에서 시청각 자극에 대한 흥분율 피크 간 간격의 분포(중심, 자극 간 간격 주변에 간격의 비율: P = 0 40 Hz vs. No stim, P = 0 40 Hz vs. Random; 두 비율에 대한 z-검정), 40 Hz 시청각 자극에 대한 단일 유닛 응답의 레일리 통계 분포(우측, ****P<0.0001, P = 2x10-79 40 Hz vs. No Stim, P =1x10-72 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test; 30 보다 큰 40 Hz 자극 RS값을 가지는 20 유닛: 30 보다 큰 무작위 자극 RS값을 가지는 2 유닛).
도 13c는 모든 시청각 자극 조건 동안 단일 유닛 평균 흥분율을 보여준다.
도 13d는 20 Hz 시청각 플리커 자극에 대응하는 추정 단일 유닛의 흥분율 변화를 보여주고(왼쪽, 아래), 래스터 플롯은 10초 자극에 대응하는 스파이크을 보여준다(왼쪽, 위). 20 Hz 시청각 자극에 대한 흥분율 응답의 피크 간 간격의 분포(우측, 자극 간 간격 주변에 간격의 비율: P = 0 20 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13e는 80 Hz 시청각 플리커 자극에 대응하는 d에서 보여준 동일 유닛의 흥분율 변화를 보여주고(왼쪽, 아래), 래스터 플롯은 10초 자극에 대응하는 스파이크을 보여준다(왼쪽, 위). 80 Hz 시청각 자극에 대한 흥분율 응답의 피크 간 간격의 분포(우측, 자극 간 간격 주변에 간격의 비율: P = 0 80 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13f는 20 Hz 및 80 Hz 청각 자극의 벡터 강도 분포가 무자극 상태보다 높다는 것(좌측, ****P<0.0001, P = 2x10-63 20 Hz vs. No Stim, P = 1x10-56 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test)과, 그리고 무자극보다 높은 20 Hz와 80 Hz 청각 자극의 레일리 통계 분포(우측, ****P<0.0001, P = 1x10-88 20 Hz vs. No Stim, P = 5x10-72 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test; 30 보다 큰 20 Hz 자극 RS값을 가지는 50 유닛; 30 보다 큰 80 Hz 자극 RS값을 가지는 19 유닛)를 보여준다.
도 13g는 0 Hz 주변에서 AC 중심부 내 다수의 자극 조건 사이에서 단일 유닛의 평균 흥분율 차이를 보여준다(*P<0.05 20 Hz - 80 Hz, *P<0.05 20 Hz-40 Hz, 모든 다른 n.s.; 제로 중앙값에 대한 Wilcoxon signed rank test).
도 13h는 CA1에 대해 a와 동일하게 보여준다.
도 13i는 CA1에 대해 b와 동일하게 보여준다(우측, ****P<0.0001, P = 1x10-71 40 Hz vs. No Stim, P = 1x10-71 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test. 중앙, 자극 간 간격 주변에 간격의 비율: P = 0 40 Hz vs. No stim, P = 0 40 Hz vs. Random; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13j는 CA1에 대해 c와 동일하게 보여준다.
도 13k는 CA1에 대해 d와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 20 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13l은 CA1에 대해 e와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 80 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13m은 CA1에 대해 f와 동일하게 보여준다(좌측, ****P<0.0001, P = 8x10-43 20 Hz vs. No Stim, P = 8x10-40 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test; 우측, ****P<0.0001, P = 2x10-70 20 Hz vs. No Stim, P = 1x10-57 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test).
도 13n은 CA1에 대해 g와 동일하게 보여준다(모든 n.s.; 제로 중앙값에 대한 Wilcoxon signed rank test).
도 13o는 mPFC에 대해 a와 동일하게 보여준다.
도 13p는 mPFC에 대해 b와 동일하게 보여준다(우측, ****P<0.0001, P = 5x10-23 40 Hz vs. No Stim, P = 3x10-21 40 Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov test. 중앙, 자극 간 간격 주변에 간격의 비율: P = 0 40 Hz vs. No stim, P = 0 40 Hz vs. Random; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13q는 mPFC에 대해 c와 동일하게 보여준다.
도 13r은 mPFC에 대해 d와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 20 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13s는 mPFC에 대해 e와 동일하게 보여준다(우측, P = 0 80 Hz vs. No stim; 두 비율에 대한 z-검정).
도 13t는 mPFC에 대해 f와 동일하게 보여준다(좌측, ****P<0.0001, P = 1x10-23 20 Hz vs. No Stim, P = 2x10-25 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test; 우측, ****P<0.0001, P = 1x10-23 20 Hz vs. No Stim, P = 8x10-25 80 Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov test).
도 13u는 mPFC에 대해 g와 동일하게 보여준다(*P<0.05 40Hz - No Stim, 모든 다른 n.s.; 제로 중앙값에 대한 Wilcoxon signed rank test).
도 14a는 하루 1시간의 청각 GENUS 7일 후에 6개월령의 5XFAD 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 항-Iba1(019-19741, 녹색)과 항-Aβ(12F4, 적색) 항체의 면역 조직 화학을 보여준다(삽화 배율, 100x; 스케일 바, 50 μm).
도 14b는 하루 1시간의 시각 GENUS 7일 후에 6개월령의 5XFAD 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 항-Iba1(019-19741, 녹색)과 항-Aβ(12F4, 적색) 항체의 면역 조직 화학을 보여준다(삽화 배율, 100x; 스케일 바, 50 μm).
도 14c는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 평균 소교세포체 직경을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, **P<0.01; 비대응 Mann-Whitney test).
도 14d는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 평균 소교세포 돌기 길이를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, **P<0.01; 비대응 Mann-Whitney test).
도 14e는 하루 1시간의 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 관심 영역 당 소교세포 개수를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, **P<0.01; 비대응 Mann-Whitney test).
도 14f는 무자극 또는 청각 GENUS 후에 AC, CA1, 및 mPFC에서 플라크의 25 μm 라듐을 둘러싼 소교세포의 평균 수를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14g는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 시각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 VC, CA1, 및 mPFC에서 평균 소교세포체 직경을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 14h는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 시각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 VC, CA1, 및 mPFC에서 평균 소교세포 돌기 길이를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05; 비대응 Mann-Whitney test).
도 14i는 하루 1시간의 시각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 VC, CA1, 및 mPFC에서 관심 영역 당 소교세포 개수를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14j는 무자극 또는 시각 GENUS 후에 VC, CA1, 및 mPFC에서 플라크의 25 μm 라듐을 둘러싼 소교세포의 평균 수를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14k는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 80 Hz, 또는 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1 및 mPFC에서 평균 소교세포체 직경을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, **P<0.01, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14l은 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 80 Hz, 또는 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1 및 mPFC에서 평균 소교세포 돌기 길이를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14m은 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 80 Hz, 또는 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 이후 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1 및 mPFC에서 관심 영역 당 소교세포 개수를 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14n은 하루 1시간의 청각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 항-Aβ 플라크(D54D2, 녹색) 항체의 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 14o는 하루 1시간의 시각 GENUS 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 VC, CA1, 및 mPFC에서 항-Aβ 플라크(D54D2, 녹색) 항체의 면역 조직 화학을 보여준다(그룹 당 n=6 마우스, 스케일 바, 50 μm).
도 14p는 무자극 대조군으로 표준화한, 관심 영역 당 평균 플라크 코어 면적을 보여준다(그룹 당 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s. = 유의미하지 않음, *P<0.05, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14q는 무자극 대조군으로 표준화한, 청각 GENUS 이후 AC, CA1, 및 mPFC에서 플라크의 평균 수를 보여준다(그룹 당 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s. = 유의미하지 않음, *P<0.05, ***P<0.001, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14r은 무자극 대조군으로 표준화한, 관심 영역 당 평균 플라크 코어 면적을 보여준다(그룹 당 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s. = 유의미하지 않음, *P<0.05, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14s는 무자극 대조군으로 표준화한, 시각 GENUS 이후 VC, CA1, 및 mPFC에서 플라크의 평균 수를 보여준다(그룹 당 n=6, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s. = 유의미하지 않음, *P<0.05, 비대응 Mann-Whitney test).
도 14t는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극, 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 8 Hz, 및 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 HPC에서 상대적 가용성 Aβ1-42 수준을 보여준다(그룹 당 n=4~5, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 14u는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극, 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 8 Hz, 및 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC 및 HPC에서 상대적 불용성 Aβ1-42 수준을 보여준다(그룹 당 n=4~5, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
도 14v는 무자극 대조군으로 표준화된, 하루 1시간의 무자극 또는 40 Hz 청각 자극, 복합(A+V) GENUS, 복합(A+V) 80 Hz, 및 복합(A+V) 무작위 주파수 자극 7일 후에 6개월령 5XFAD 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 Aβ(12F4) 평균 세기값(12F4 항체)를 보여준다(그룹 당 n=4-5 마우스, 막대 그래프 내 평균 s.e.m., n.s.= 유의미하지 않음, *P<0.05, Dunn의 다중 비교 테스트를 통한 Kruskal-Wallis test).
40 Hz에서의 청각 자극은 AC, CA1, 및 mPFC에서 스파이크 활성을 조절한다
우리는 먼저 청각 음조 자극이 청각 피질(AC), 해마 소구역 CA1, 및 내측 전두엽 피질(mPFC)에서 GENUS를 생성할 수 있는지 여부를 결정하였다. 우리는 20 Hz, 40 Hz, 80 Hz에서 음조의 트레인, 또는 무작위 간격 음조의 트레인을 가진 동물을 제시하였다(1 ms 길이, 12.5 ms, 25 ms, 50 ms, 평균 25 ms인 무작위적 음조 간 간격마다 재생되는 10 kHz 음조, 이제부터 "청각 플리커 자극"이라고 지칭됨). 음조 프레젠테이션 동안 우리는 구형 트레드밀(treadmill)에서 뛰거나 휴식 중인 3-8개월령 수컷 야생형(C57BL6J) 마우스의 AC, CA1, 및 mPFC에서 32개의 통로 실리콘 탐침을 사용하여 전기생리학적 기록을 수행하였다. AC의 위치를 파악하기 위해, 일시적인 LFP 응답이 음조 개시 후 20 ms 주변에서 검출될 때 까지 일련의 50 ms 청각 맵핑 음조(이제부터 "맵핑 자극"으로 지칭됨)를 다양한 깊이에서 재생하였다(도 8a). CA1을 전기생리학적 특징을 기초로 하여 위치를 파악하였고, mPFC 기록 위치를 각 동물에서 최종 기록 후 조직학적으로 확인하였다(도 8g 및 8m).
표적 영역에 도달한 후, 신경 활동을 기록하는 동안 조용하고 청각 플리커 자극의 인터리빙된 주기를 동물에게 제시했다. 자극 블록은 20Hz, 40Hz, 80Hz, 및 무작위 청각 플리커 자극 사이에서 회전하였다. 추정 단일 유닛의 흥분율은 각 음조마다 주기적으로 증가 및 감소하여 40 Hz 청각 플리커 자극을 동반하였다(도 1a, 도 1e, 및 도 1i, 청색). 유닛을 또한 무작위 자극으로 조절하였다. 모든 무작위 펄스를 정렬하였을 때, 자극 후 흥분율 변화에 변경이 있었으며, 이는 단일 유닛이 무작위 자극 펄스에 반응한다는 것을 나타낸다. 그러나, 청각 음조의 무작위 트레인은 주기적인 흥분 변화를 유조하지 않았다(도 1a, 1e 및 1i, 주황색). 혼입은 위상 분포와 진폭 모두에서, 단일 유닛 간에 다양하였다. 플리커 자극 동안, 신경은 자극의 함수로서 흥분하였으나, 사이클마다 흥분하지는 않았고 종종 광범위한 위상에서 흥분하였다(도 1a, 도 1e, 및 도 1i). 청각 플리커 자극 동안, 흥분율 피크 간 간격은 단일 유닛의 대부분(AC의 75%, CA1의 79%, 및 mPFC의 74%)에서 대략 25 ms(40 Hz에 해당)였다. (도 1b, 1f 및 1j).
대조적으로, 음조가 없는 기준 기간 및 무작위 음조를 갖는 기간 동안, 피크 간 간격은 대략 25 ms의 피크 간격을 가지는 AC 내 세포의 11% 미만, CA1 내 세포의 12%, mPFC 내 세포의 16%를 갖는 넓은 분포를 가졌다(즉, 흥분율은 40 Hz에서 조절되지 않았음; 도 1b, 1f 및 1j). 변화 강도를 자극 위상의 함수로서 단일 유닛 흥분율을 고려하고 그 벡터 강도(VS)를 계산하여 정량화하였다(도 1c, 1g 및 1k, 좌측 ). 벡터 강도값의 범위는 0에서 1까지 이며, 0은 자극에 의해 변화되지 않는 흥분의 균일한 분포(VS = 0)를 나타내고, 1은 뉴런이 특정 자극 위상에만 흥분되는 분포(VS = 1)를 나타낸다. 40 Hz 청각 자극에 대한 단일 유닛 반응의 벡터 강도의 분포는 AC에서 0.002 내지 1, HPC에서 0.0005 내지 1, 및 PFC에서 0.1 내지 0.6의 범위이고, 무작위 자극 뿐만 아니라 무자극인 것보다 유의하게 높았다(도 1c, 1g 및 1k, 중앙 ). 벡터 강도가 자극에 의한 변화를 측정하기 때문에, 무작위 자극 벡터 강도는 또한 무자극 조건보다 유의하게 높았다. 그러나, 벡터 강도는 변화의 주기성을 정량화하지 않으며, 무작위 자극이 단일 유닛 반응을 유발한 반면, 주기적인 흥분 변화는 유도하지 않았다.
유사하게, 40 Hz 청각 자극 동안 단일 유닛에 대한 레일리 통계의 분포는 무자극 및 무작위 자극 대조군의 것보다 유의하게 높았다(도 1c, 1g 및 1k, 우측 ). 단일 뉴런의 평균 흥분율은 40 Hz 청각 플리커자극과 무자극, 무작위 자극, 20 Hz 및 80 Hz 청각 플리커 자극의 대조군 사이에서 유사하였다(도 1d, 1h, 및 1l; 도 8c, 도 1i, 및 도 1o, , 우측 ). AC에서 국소장 전위는 청각 플리커 자극 동안 40 Hz에서 상승된 출력을 보였으나, 효과는 맵핑 음조에 대한 기록 위치, 기록 세션, 및 응답 지연 사이에서 다양하였다(도 8b, 1h, 및 1n). 이러한 결과는 40 Hz 청각 플리커 자극이 AC, CA1, 및 mPFC에서 GENUS를 강력하게 유도함을 시사한다.
청각 GENUS는 5XFAD 마우스에서 기억 성능을 향상시킨다
청각 GENUS가 해마 신경 활동에 영향을 줄 수 있다는 점을 고려하여, 우리는 다음으로 6개월 령 5XFAD 마우스에서 해마-의존적 학습 및 기억에 대한 영향을 평가하였다(도 2a). 우리는 행동 장애가 처음으로 명백해질 때인 6개월령 5XFAD 동물을 사용하였다. 우리는 모든 후속 실험에 대해 1주간의 청각 GENUS를 수행하였으며, 특히, 마우스를 조용한 챔버에 놓고 40 Hz의 주파수로 7일 동안 1 시간/일 씩 1 ms 길이의 10 kHz 청각 음조의 트레인에 노출시켰다(따라서, 40 (10 kHz) 음조/초). 우리는 인간 AD 대상체에서 영향을 받는 것으로 알려진 행동인, 특정 상황에서 물체의 동일성 또는 배치를 기억하는 능력을 평가하는, 신규 물체 인지(NOR) 및 신규 물체 위치(NOL) 기억 성능을 시험하기 24 시간 전에 마우스를 행동 챔버에 습관화하는 것으로 시작했다. 이러한 테스트는 인지 지수를 사용하여 행동 성능을 측정하는데, 이는 전체 탐색 기간 동안, 신규 물체 또는 새로운 위치에서, 각각, 물체를 탐색하는 데 소요된 시간의 백분율이다.
습관화 동안, 청각 GENUS, 무작위 주파수, 또는 무자극군은 평균 속도, 총 거리, 중심부에서 소요된 시간, 또는 주변부에서 소요된 시간에서 유의한 변화를 나타내지 않았으며, 이는 세 그룹이 일반적인 활동 또는 불안과 유사한 행동에서 차이를 보이지 않았다는 것을 나타낸다(도 9e-9h). 청각 GENUS에 이어서, 5XFAD 마우스는 물체에 대해 65.50 ± 1.40%, 위치 기억 작업에 대해 61.41 ± 2.0%의 유의하게 높은 인지 지수를 나타낸 반면, 무자극 및 무작위 주파수 대조군은, 두 테스트 각각에서, 신규 물체 또는 새롭게 대체된 물체에 대한 선호도를 나타내지 않았다(도 2b 및 2e). 세 그룹 사이의 작업 기간 동안 이동한 거리 또는 평균 속도에 있어서 유의한 차이가 없었는데, 이는 활동개의 그룹 사이의 작업 기간 동안 이동된 거리 또는 평균 속도에 있어서 유의한 차이가 없었는데, 이러한 효과는 활동의 일반적인 차이로 인한 것이 아니라는 것을 나타낸다(도 2c, 2d, 2f 및 2g).
NOR 동안 신규 및 기존 물체를 탐색하는 데 소요된 시간의 양을 검사하였고; 우리는 청각 GENUS 후의 마우스는 신규 물체와 상당히 많은 시간을 소비한 반면 무자극 및 무작위 주파수 대조군은 탐색 선호도를 나타내지 않은 것을 관찰하였다(도 9a). 유사하게, 우리는 청각 GENUS 후의 마우스는 신규 위치(NOL)에서 물체와 상당히 많은 시간을 소비한 반면, 무자극 및 무작위 주파수 대조군은 탐색 선호도를 나타내지 않은 것을 관찰하였다(도 9c). 탐색 활동의 차이를 조사하기 위한 추가 제어 수단으로서, 우리는 마우스가 객관적 작업 동안 20초의 물체 탐색 요구 조건에 도달하는 데 소요된 시간(분)을 측정하였다. 우리는 세 그룹 간의 물체 탐색 요구 사항에 도달하는 데 걸리는 시간에는 큰 차이가 없음을 관찰하였다(도 9b 및 9d).
해마-의존적 행동에 대한 청각 GENUS의 효과를 추가로 특성화하기 위해, 우리는 주변 상황 신호와 관련하여 숨겨진 플랫폼의 위치를 기억하는 능력을 측정하는, 모리스 수중 미로 테스트를 수행하였다. 마우스는 연속 시도를 통해 숨겨진 플랫폼의 위치를 점차 학습하고, 플랫폼 위치의 공간 기억은 탈출 잠복기로 측정되는데, 이는 개별 마우스가 숨겨진 플랫폼을 찾는 데 걸리는 시간이다. 훈련 단계 동안, 세 그룹 모두 숨겨진 플랫폼의 위치를 성공적으로 학습할 수 있었지만, 청각 GENUS를 받은 군의 탈출 잠복기는 무자극 및 무작위 주파수 대조군 모두에서 보다 일관되고 유의하게 짧았다(도 2h). 세 그룹 사이에서 수영 속도에는 유의미한 차이가 없었다(도 9i). 탐침 시험 동안, 또는 숨겨진 플랫폼이 탱크에서 제거될 때, 청각 GENUS를 받은 마우스는 누락된 플랫폼을 포함하는 사분면을 탐색하는 데 상당히 더 긴 기간을 보냈으며, 무자극 및 무작위 주파수 대조군 모두와 비교할 때, 이전 플랫폼 위치에서 더 많은 교차점의 수를 보여주었다(도 2i 및 2j).
최종 행동 측정으로서, 우리는 1시간 청각 GENUS, 무자극, 또는 무작위 주파수 자극 동안 5XFAD 마우스의 활성을 조사하고, 평균 속도(cm/s)와 이동 거리(cm)에서 유의미한 차이가 없음을 관찰하였다(도 9j 및 9k). '수면' 상태, 또는 무활동 기간에 차이가 있는지 조사하기 위해, 우리는 1시간 자극 그룹 동안 2cm/s 미만으로 소비한 시간을 측정하였다. 우리는 세 그룹 간 유의한 차이가 없음을 관찰하였다(도 9l). 종합하면, 이러한 결과는 청각 GENUS가 6개월령 5XFAD 마우스에서 인지 및 공간 기억을 개선할 수 있음을 보여준다.
청각 GENUS는 5XFAD 마우스에서 AC 및 해마 내 아밀로이드 부하를 감소시킨다
인지 기능에 대한 청각 GENUS의 유익한 효과는 5XFAD 마우스 모델에서 기저 아밀로이드 병리가 변형될 수 있는지의 여부를 조사하게 하였다. 이전에, 우리는 어린 3개월령 마우스에서 아밀로이드 부하에 대한 시각 GENUS의 개선 효과를 보여주었다. 여기서, 우리의 목표는 AD의 더 진행 상태에 있고 더 높은 아밀로이드 플라크 부하를 나타내는, 6개월령 마우스에 대한 청각 GENUS의 효과를 추가로 연구하는 것이었다. 마우스를 조용한 챔버에 놓고 40 Hz, 8 Hz, 80 Hz, 무작위 주파수 자극, 또는 무자극을 포함하는 일련의 다른 청각 음조-트레인 주파수 자극에 노출시켰다. 7일 자극 완료 24시간 후, 우리는 Aβ 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 AC 및 전체 해마(HPC)에서의 아밀로이드 부하를 분석하였다. 40 Hz 청각 자극 후, 우리는 가용성 Aβ1-42 수준은 AC에서 51.84 + 4.98% 및 HPC에서 46.89 ± 3.89% 감소한 반면, AC 및 HPC에서 가용성 Aβ1-40 수준은, 무음조 또는 추가 주파수 대조군과 비교했을 때, 각각, 20.65 ± 3.21% 및 34.15 ± 4.83%감소한 것으로 관찰되었다(도 3a 및 도 10a). 유사하게, 불용성 Aβ1-42 수준은 AC에서 36.68 ± 3.21% 및 HPC에서 43.84 ± 2.42% 감소하였다(도 3b). 불용성 Aβ1-40은 청각 GENUS 또는 자극 대조군 모두에서 ELISA를 통해 검출할 수 없었다.
우리의 결과는, 아밀로이드에서 관찰된 감소가 8 Hz, 80 Hz, 또는 무작위 주파수 자극이 무자극 대조군과 비교할 때 Aβ 수준을 크게 변화시키지 않기 때문에 40 Hz 자극에 특이적인 것을 나타낸다. 이러한 효과가 다른 AD-마우스 모델에 적용되는지 여부, 및 우리의 결과가 당사 5XFAD 모델에 특이적인지 여부를 확인하기 위해, 우리는 청각 GENUS 7일 후, 잘 검증된 AD 모델인, 6개월령 APP/PS1 유전자 변형 마우스의 Aβ 수준을 조사하였다. 우리는 가용성 Aβ1-42가 무자극 대조군과 비교할 때 AC에서 48.39 + 3.50% 및 HPC에서 35.54 ± 4.27%만큼 현저하게 감소되는 것을 발견하였다(도 10b).
우리는 다음으로, β-아밀로이드 특이적 항체(Cell Signaling Technology; D54D2)를 이용한 면역 조직 화학 분석으로 5XFAD 마우스 모델에서 플라크 부하를 검사하였다(도 3c 및 3d). 플라크 수는 청각 GENUS의 7 일 후, 무자극 대조군과 비교하여, AC 및 CA1에서, 각각, 45.73 ± 2.818% 및 59.30 + 2.083%만큼 현저하게 감소되었다(도 3e). 플라크 크기는 또한 AC 및 CA1에서, 각각, 54.37 ± 5.603% 및 40.70 ± 5.321%만큼 현저히 감소되었다(도 3f). Aβ1-42 특이적 면역 염색의 분석은 AC 및 CA1에서, 각각, Aβ1-42 침착 물이 45.35 ± 0.011% 및 43.21 ± 0.0285%만큼 실질적인 감소를 나타내었다 (도 3g-3i). 40Hz 자극 후 플라크 부하의 역학을 조사하기 위해, 우리는 처음으로 1주일 동안 청각 GENUS에 적용한 후 다음 7일 동안 자극하지 않은 채로 둔 5XFAD 마우스에서 β-아밀로이드 특이적 항체(Ceil Signaling Technology; D54D2)를 사용하여 면역 조직 화학 분석을 수행하였다. 우리는 평균 플라크 수, 면적, 및 아밀로이드 세기에서 약간의 감소를 관찰했지만, 이러한 차이는 유의미하지 않았다(도 10f-10h 참조). 다른 AD 모델에서 청각 GENUS 이후 플라크 부하를 조사하기 위해서, 6개월령 마우스는 유의한 플라크 발달을 나타내지 않기 때문에, 우리는 9개월령 APP/PS1 마우스를 사용하였다.
우리는 플라크 수가 AC에서 52.65 ± 7.53%, CA1에서 62.90 ± 15.5%만큼 현저히 감소된 것으로 관찰하였다. 플라크 크기는 AC에서 67.90 ± 6.18%, CA1에서 64.06 ± 15.2%만큼 현저히 감소하였다. Aβ1-42 항체(BioLegend; 12F4)를 사용한 Aβ1-42 특이적 면역 염색의 분석은 무자극 대조군과 비교하여, AC와 CA1에서, 각각, 38.77 ± 4.21%와 47.63 ± 6.08%만큼 Aβ1-42 침착에서 실질적인 감소를 나타냈다(도 10c-10e). 종합적으로, 이러한 결과는 청각 GENUS가 AC 및 CA1에서 감마 활성을 동반하고 AD 마우스 모델에서 아밀로이드 부하를 감소시킬 수 있음을 입증한다.
청각 GENUS는 5XFAD 마우스에서 교아세포와 혈관 반응을 유도한다
축적 증거는 소교세포가 뉴런의 활성 변화에 반응하고, AD 병리학에서 역할을 수행하는 것을 시사한니다(Allen 및 Barres, 2005, Mosher 및 Wyss-Coray, 2014, Walker 및 Lue, 2015). AC와 HPC에서 아밀로이드 부하를 감소시키는 능력으로 우리는 청각 GENUS가 6개월령 5XFAD 마우스에서 미세아세포 반응의 변화를 자극할 수 있는지 여부를 조사할 수 있었다. 소교세포는 탐식과 관련된 활성화 상태 동안 세포 형태를 변화시키는 것(Davies 등, 2016)으로 나타났으며, 실제로, 우리의 초기 연구는 1시간의 시각 GENUS가 활성화와 일치하는 소교세포의 형태학적 변화를 유도하기에 충분하고 VC에서 식세포 활성을 증가시킨다는 것을 입증하였다(Iaccarino 등, 2016). 소교세포 마커 Iba1에 대한 항체를 사용하여(도 4a 및 도 4b), 우리는 무자극 대조군과 비교하였을 때 청각 GENUS군에서 AC 및 CA1 둘 다에서 대략 60% 더 많은 소교세포를 관찰하였다(도 4c). 소교세포체 면적은 무자극 대조군과 비교하였을 때 청각 GENUS 이후, AC에서 70.60±4.78% 및 CA1에서 117.17±10.4%만큼 증가하였다(도 4d). 무자극 대조군과 비교하였을 때, 우리는 소교세포 돌기 길이에서 46.44 + 3.2 %(AC) 및 50.875 + 4.8 %(CA1)만큼의 감소뿐만 아니라 돌기 수지상에서 36.00 + 9.5%(AC) 및 143.813 + 29.9%(CA1)만큼의 증가를 추가로 확인하였다(도 4e 및 도 4f). Aβ의 소교세포로 흡수를 평가하기 위해, 우리는 Iba1과 Aβ1-42에 특이적인 Aβ 항체로 공동 면역 염색된 조직 섹션에 의해 소교세포 내 Aβ의 공동-국소화를 측정하였다(12F4, 참조 방법). 우리는 무자극 대조군과 비교하였을 때 청각 GENUS 후에 Aβ와 공동-국소화된 소교세포 세포체의 백분율이 AC에서 58.75 ± 1.25% 및 CA1에서 61.33 ± 3.71%만큼 증가한 것을 관찰하였다(도 4g).
청각 GENUS에 따른 소교반응이 발생하는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 7일의 청각 GENUS 후에 9개월령 APP/PS1 마우스로부터 소교세포 형태를 측정하였다. 7일의 청각 GENUS 이후 5XFAD 소교세포에서 보여지는 우리의 결과(도 4a-4g 참조)와 유사하게, 우리는 소교세포체 직경 및 개수에서 유의한 증가 뿐만 아니라, 무자극 대조군과 비교하였을 때 AC 및 CA1에서 평균 돌기 길이의 유의한 감소를 관찰하였다(도 11a-11c).
청각 GENUS 이후 5XFAD 마우스에서 소교반응의 종 방향 효과를 이해하기 위해, 우리는 1주일의 청각 GENUS 후 7일의 무자극 이후 소교세포 형태를 조사하였다. 우리는 아밀로이드와 유사한 경향(도 10f-10h), 특히 소교세포체 직경의 유의미하지 않은 증가, 평균 돌기 길이의 감소, 및 청각 피질에서 소교세포 개수의 증가를 관찰 하였다(도 11d-11f 참고). 그러나, 우리는 무자극 대조군과 비교했을 때 CA1에서 소교세포 개수의 유의한 증가(41.70 ± 6.75%만큼)를 보았다.
성상 세포는 중추 신경계의 또 다른 1차 교세포이며, 항상성 유지, 시냅스 축소, 폐기물 제거, 및 뇌 혈류 조절과 같은 다른 중요한 생물학적 과정에 중요하다(Chung 등, 2015, Kisler 등, 2017). 반응성 유사 성상 세포는 교세포 원 섬유의 산성 단백질(GFAP)을 발현한다(Eng 등, 1971). 6개월령 5XFAD 및 WT 한배 새끼 대조군 마우스 사이의 반응성 성상 세포 수의 임의의 기준선 변화가 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 GFAP 항체에 대해 염색된 100μm CA1 뇌 섹션에 대해 CLARITY를 수행하였다(도 11g). 우리는 WT 대조군과 비교할 때 5XFAD 마우스가 GFAP- 양성 성상 세포의 수가 훨씬 낮음을 관찰하였다(도 11h). 이러한 관찰은 유사한 교세포 위축을 갖는 다른 AD 유전자 변형 마우스 모델을 보여주는 보고서와 일치한다(Rodriguez 등, 2009). 청각 GENUS가 성상 세포의 반응성에 영향을 줄 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 6 개월령 5XFAD 마우스를 1시간/일의 청각 GENUS 또는 무자극 대조군에 7일까지 노출시킨 다음, GFAP 및 S100 칼슘 결합 단백질 B(S100B), 반응성 유사 성상 세포에서 발현되는 것으로 나타난 또 다른 단백질에 대한 항체를 사용하여 뇌 섹션을 면역 염색 시켰다(도 4h 및 도 4i). GFAP에 대해 양성인 성상 세포는 AC 및 CA1에서, 각각, 27.66±0.954% 및 18.14±0.799%만큼 증가하였고, S100B 양성 성상 세포는 AC에서 21.83±1.07%, CA1에서 15.57±0.869%만큼 증가하였다(도 4j 및 4k). 청각 GENUS에 따른 성상 세포 수의 이러한 관찰된 변화는 성상 세포 생존의 잠재적 증가를 나타낼 수 있다.
성상 세포는 뇌의 혈관 네트워크를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 축적된 증거는 AD에서이 네트워크의 기능 장애가 병리를 악화시킬 수 있음을 시사한다. 뇌로부터의 아밀로이드 소거는 다면적이며, 글림프 시스템을 통하고 세포 내 수용체 지단백질 수용체 관련 단백질 1(LRP1)에 의한 수송체를 통하는 것과 같은, 혈관계를 통한 다양한 과정이 제안되었다.
혈관 구조의 잠재적인 변화를 조사하기 위해, 우리는 먼저 혈관 내피의 효과적인 마커인 토마토 렉틴(Lycopersicon esculentum)을 사용하여 청각 GENUS 이후 5XFAD 뇌 조각을 염색하였다(도 5a 및 도 5b). 흥미롭게도, 무자극 대조군과 비교하였을 때, 청각 GENUS 이후 혈관 직경이 49.70 ± 7.80%(AC) 및 104.70 ± 10.96%(CA1) 증가한 것으로 관찰되었다(도 5c). 우리는 또한 청각 GENUS 이후 아밀로이드-혈관 상호 작용 변화 여부를 탐구하였다. 우리는 청각 GENUS가 LRP1과 Aβ의 공동 국소화에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하였는데, 7일 동안 1시간/일 자극 GEUNS 또는 무자극에 노출시킨 5XFAD 마우스로부터 뇌 조각에서 LRP1 및 Aβ에 대해 염색함으로써, 혈관 구조를 통한 Aβ 수송 및 전신 제거에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(Storck 등, 2016)(도 5d 및 5e). 무자극 대조군에서, 우리는 LRP1과 Aβ의 공동 국소화를 8.17±2.70%(AC) 및 6.97±1.73%(CA1) 관찰한 반면, 청각 GENUS군에서는, LRP1과 Aβ의 공동 국소화를 AC와 CA1, 각각에서, 17.71±2.78% 및 16.50±3.90%로 유의하게 증가하였다(도 5f). 종합하면, 이러한 결과는 청각 GENUS 다음 AC 및 CA1에서 감소되는 Aβ 수준에 대한 하나의 설명이 소교세포를 통한 Aβ의 제거 증가및 혈관 구조의 변화를 통해 될 수 있을 것이라고 시사하였다.
청각 GENUS는 AC 및 해마에서 타우 인산화를 감소시킨다
AD의 또 다른 고전적인 병리학적 특징은 인산화된 타우 응집체의 축적이다. AD와 관련된 특정 아미노산 잔기에서의 타우 인산화는 그의 세포 골격지지 기능을 변경시키고 그의 용해도를 감소시키는 것으로 입증되었으며, 따라서 주요 뉴런 손상인 것으로 제안된다. 청각 GENUS가 또 다른 AD 관련 마우스 모델에서 병리에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하기 위해, Tau P301S 마우스를 사용하였다. 타우 P301S 마우스가 6개월령에 공간적 및 상황적 학습 부족을 나타내기 시작하기 때문에, 우리는 청각적 GENUS가 6개월령 타우 P301S 마우스의 AC와 HPC에서 인산화 타우의 감소를 야기할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이러한 마우스로부터 뇌 조각의 면역조직화학 분석(도 12a, 12b, 12d, 및 12e)은 트레오닌-181 (T181)에서 36.20±2.828%(AC) 및 38.70±2.737%(CA1), 그리고 세린-396(S396)에서 37.90±3.469%(AC) 및 40.80±4.528%(CA1)까지 타우 인산화를 감소시켰음을 확인하였다(도 12c 및 12f). 웨스턴 블롯(WB) 실험으로 S396에서 타우 인산화의 면역 조직 화학 결과를 확인하였으며,총 타우와 비교하였을 때, AC와 전체 해마 조직에서, 각각, 33.83±0.20% 및 43.20±1.50%의 인산화 감소를 나타냈다.(도 12g, 12h, 12j, 및 12k). WB 분석은 해마에서 인산화된 T181 타우가 34.50±1.61% 감소한 것으로 나타났지만, 그 차이는 AC에서는 유의하지 않았다(도 12i 및 12l). 전체적으로, 우리의 결과는 청각 GENUS가 AD 관련 과인산화 타우 에피토프의 수준을 감소시킬 수 있고, 청각 GENUS는 타우병증 마우스 모델에서 병리에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
청각 및 시각 복합 GENUS가 소교세포에 의해 클러스터링 표현형 반응을 유도한다
이처럼, 우리의 결과는 지금까지 청각 GENUS가 아밀로이드 수준을 감소시키고 피질 감각 영역과 해마에서 교아세포와 혈관 구조 변화를 유도할 수 있음을 입증한다. 이는 우리에게 청각과 시각 GENUS를 복합하는 것이 더 큰 세포 효과를 유발할 수 있는지 여부를 조사하게 하였다. 우리는 먼저 40 Hz 광 플리커와 40 Hz 청각 음조 자극의 조합이 AC, CA1, 및 mPFC에서 신경 반응을 동반할 수 있는지 여부를 결정하였다. 우리는 동물이 구형 트레드밀에서 뛰거나 쉴 때는 32채널 실리콘 탐침을 사용하여 AC, CA1, 및 mPFC에서 40 Hz의 주파수에서 1 ms 길이의 청각 음조와 12.5 ms 길이의 광 펄스의 조합으로 3-8개월령 수컷 야생형(C57BL6J) 마우스를 제시하였다. 음조와 점등 시기마다 주기적으로 스파이크이 증가 및 감소하였고, 따라서 청각-시각 복합 자극 동안 40 Hz로 동반하였다(도 6a 내지 도 6c, 좌측 ). 벡터 강도 분포는 무작위 자극 또는 무자극 조건보다 40 Hz 시청각 자극 동안 유의하게 더 높았다(도 6a-6c , 오른쪽). 따라서, AC, CA1, 및 mPFC에서 단일 뉴런의 스파이크은 기준 기간 동안 보다 시청각 자극 기간 동안 유의하게 40 Hz로 상당히 더 많이 동반하였다. AC, HPC, 및 mPFC에서 국소장 전위는, 시청각 플리커 자극을 동안 40 Hz에서 높은 출력을 나타내었지만, mPFC에엇 그 효과는 매우 작았다(도 13a, 13h, 및 13o). 따라서, 40 Hz 음조 + 광 자극은 AC, CA1 및 mPFC에서 GENUS를 유도하였다.
작지만, 우리는 국소장 전위 응답 및 단일 단위 평균 흥분율에서 mPFC의 청각 및 시청각 조합 자극 사이의 차이를 관찰한다. 복합 자극 동안 40 Hz에서 LFP의 출력이 약간 증가했으나, 청각 자극 동안에는 그렇지 않았다(도 8n 및 도 6o). 또한, 복합 자극과 기준선 사이의 평균 흥분율 차이의 분포는 0과 유의하게 다른 중앙값을 갖는 반면, 청각 자극만으로는 0과 크게 다르지 않았다(도 8o 및 도 6u).
7일 동안 1시간/일 복합 GENUS 이후, 우리는 소교세포의 형태학적 특성 및 AC, VC, 및 CA1에서 Aβ와의 상호작용에 대해 조사하였다(도 6d 및 6e). 고차원 인지 영역은 다중-모드 감각 자극을 처리하는 것으로 알려져 있기 때문에, 복합 GENUS가 내측 전두엽 피질(mPFC)에도 소교세포 효과를 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. 우리는 소교세포가 소마 영역에서 유의미한 증가를 나타내는 반면, 무자극 대조군과 비교할 때 돌출부 길이가 유의하게 감소한 것을 발견하였다(도 6f 및 6g). AC, VC, CA1 및 mPFC에서 복합 GENUS 이 후 소교세포 수도 크게 증가했습니다(도 6h). 청각 또는 시각 자극군 단독에서의 소교세포(도 14a~14d, 14g, 및 14h)는 mPFC에서는 아니지만, AC, VC 및 CA1에 감소된 돌출부 길이와 확대된 소마 영역을 나타냈다.
시각 GENUS와 대조적으로, 청각 GENUS는 CA1에서 소교세포의 유의미한 증가를 나타내었지만; 청각 또는 시각 GENUS 단독만으로는 mPFC에서 소교세포의 개수에 유의미한 변화를 유도하지 않았다(도 14e 및 14i). 이러한 결과는, 1주일의 GENUS 이후, 청각 또는 시각 자극 단독이 아니라, 청각 및 시각 복합 자극만이 mPFC에서 소교반응을 촉진하였음을 보여준다.
흥미롭게도, 복합 GENUS군의 소교세포는 아밀로이드 침착물을 둘러싸는 캡슐화 효과를 나타냄으로써 활성의 변화를 나타내는 것으로 나타났다. 클러스터링 소교세포-Aβ 표현형을 더 잘 해결하기 위해, 우리는 복합 GENUS와 무자극 대조군에 따른 5XFAD 뇌 조각에서 가져온, AC, VC, CA1 및 mPFC 이미지로 부터 3차원(3D) 렌더링을 만들었다(도 6d 및 6e). IMARIS 이미징 소프트웨어(방법 참조)를 사용하여 아밀로이드 침착물(적색 점)과 소교세포(녹색 점)의 3D 표면을 만들고, 아밀로이드 침착 반경 25 μm 이내에서 소교세포의 근접성과 수(가장 우측 삽화, 도 6d 및 6e, 복합 GENUS 및 무자극 대조군에 따른 클러스터링 소교세포-Aβ 표현형을 보여주는 예시 동영상이 보충 동영상 1 및 2에 제공됨). 무자극 대조군과 비교하였을 때, 복합 GENUS 이후 아밀로이드 플라크 주변의 25 μm 반경 주위의 소교세포 수에서 AC 중 48.88 ± 0.651%, VC 중 31.56 ± 1.11%, mPFC 중 38.64 ± 0.959%의 유의한 증가를 관찰하였다(도 6i). 우리는 또한 CA1에서 33.05 ± 2.65%의 유의미하지 않은 증가를 관찰하였다. 복합 GENUS에 따른 클러스터링 소교세포-Aβ 표현형이 특정 표현형인지 여부를 조사하기 위해, 청각 또는 시각 단독 GENUS 이후의 아밀로이드 침착물의 25 μm 반경 이내에서 소교세포의 수를 분석하였다. GENUS와 무자극된 마우스 사이의 플라크 당 소교세포의 수에는 유의미한 차이가 발견되지 않았다(도 14f 및 14j).
다음으로, AC, CA1, 및 mPFC에서 7일의 40 Hz 청각 GENUS, 복합 GENUS, 80 Hz, 또는 무작위 주파수 자극 이후 6개월 령 5XFAD 마우스에서 소교반응의 주파수 특이성을 다루었다. 추가적인 주파수 및 무자극 대조군와 비교했을 때 40 Hz 청각 자극과 복합 GENUS 둘 다에 따른 후 AC 및 CA1에서 평균 돌기 길이의 유의미한 감소 뿐만 아니라, 소교세포체 직경 및 개수의 유의미한 증가를 관찰하였다.
복합 GENUS만이 40 Hz 청각 자극, 추가 주파수 및 무자극 대조군과 비교했을 때 mPFC에서 소교반응을 초래하였다(도 14k-14m). 이러한 결과는 복합 GENUS가 신경계 활성의 변화를 통해 소교반응을 증강시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 복합 GENUS는 AC, VC 및 mPFC에서 확장된 소교세포 클러스터링 반응을 유도한다고 결론 내렸다.
청각 또는 시각 단독이 아닌, 청각 또는 시각 동시 GENUS mPFC에서 아밀로이드 부하를 감소시킨다
AC, VC, CA1 및 mPFC에서의 소교반응의 관찰은 복합 GENUS가 7일의 1시간 자극 후에 이들 영역에서 아밀로이드 수준을 또한 변화시킬 수 있는지 여부를 조사하도록 촉구했다. 항-Aβ 항체(D54D2)를 이용한 면역 조직 화학 분석은 무자극 대조군과 비교하였을 때 복합 GENUS 이후 플라크 면적(AC에서 56.34±6.35%, VC에서 71.50±6.51%, 및 CA1에서 69.73±6.48%) 및 수(AC에서 50.02±3.74%, VC에서 50.60±10.9%, 및 CA1에서 48.80±11.1%)에서 감소를 입증하였다. 놀랍게도, 우리의 결과는, 무자극된 대조군과 비교하였을 때, 복합 GENUS군에서 mPFC에서 59.64±8.71%의 플라크 크기 감소 및 플라크 수에서의 2배 감소를 입증한다(도 7a-7d). 청각 또는 시각 GENUS 단독만으로는 으로 mPFC에서 아밀로이드 플라크 염색의 감소를 유도할 수 없었고, 이는 복합 GENUS에 특이적인 반응을 시사한다(도 14n-14s). 시각 GENUS는 또한 CA1에서 플라크 크기 또는 수의 변화를 나타내지 않았다. 청각만 및 복합 GENUS 처리는 모두 AC 및 HPC에서 Aβ-ELISA에 의해 측정된 바와 같이 가용성 Aβ1-42 및 불용성 Aβ1-42 수준의 감소를 나타낸 반면, 복합 무작위 플리커, 8 Hz, 또는 80 Hz 자극은 AC 또는 HPC의 아밀로이드 수준에 있어서 유의미한 영향을 미치지 않았다(도 14t 및 14u).
다음으로, mPFC에서 Aβ의 감소가 자극의 유형(청각 단독 vs 복합) 또는 주파수에 특이적이었는지를 결정하기 위해 다양한 주파수에서 감각 자극을 6개월령 5XFAD 마우스에게 처리 하였다. mPFC에서 아밀로이드 수준의 변화를 측정하기 위해 Aβ-ELISA를 이용하여, 복합 8 Hz, 40 Hz 청각 자극, 복합 무작위 주파수 자극, 또는 무자극군들 사이에서 가용성 또는 불용성 Aβ1-42의 유의미하지 않은 차이를 관찰하였다. 대조적으로, 결합된 GENUS군은 무자극군과 비교하여 mPFC에서 가용성 Aβ1-42에서 59.58±7.26% 감소, 및 불용성 Aβ1-42에서 34.17±8.20% 감소를 나타냈다(도 7e 및 7f).
또한, 7일의 40 Hz 청각 GENUS, 복합 GENUS, 80 Hz, 또는 무작위 주파수 자극 이후 6개월령 5XFAD 마우스에서 β-아밀로이드 특이적 항체(Cell Signaling Technology; D54D2)를 이용한 면역 조직 화학 분석을 통해 플라크 부하를 측정하였다. 40 Hz 청각 자극과 복합 GENUS 이후 AC 및 CA1에서 평균 플라크 수의 현저한 감소를 관찰하였으나, 복합 GENUS만이 추가 주파수 대조군 및 무자극 대조군과 비교할 때 mPFC에서 플라크 수의 현저한 감소를 초래하였다(도 7c 및 7d). Aβ1-42 항체를 이용한 Aβ1-42 특이적 면역염색 분석은 40 Hz 청각 자극 및 복합 GENUS 이후 AC 및 CA1에서 Aβ의 실질적인 감소를 나타내었으나, 복합 GENUS만이 mPFC에서 면역염색 세기에서 상당한 감소를 초래하였다(도 14v).
mPFC에서 감소된 아밀로이드 부하는 복합 GENUS가 더 넓은 피질 영역에 영향을 준다는 것을 시사한다. 전체 피질에서 아밀로이드 플라크 풍부에 대한 복합 GENUS의 전반적인 효과를 확인하기 위해, 1주의 복합 GENUS에 따른 6개월령 5XFAD 마우스에서 전체 뇌 SHIELD 처리(방법)를 수행하였고 아밀로이드 플라크에 대해 면역염색(D54D2 항체 이용)하였다(도 7g 및 7h). 3D에서 플라크를 분석하기 위해 광 시트 현미경을 이용하여, 무자극 대조군과 비교하였을 때, 신피질에서 총 플라크 용적 및 수에서, 각각, 37 % 및 34 % 감소를 발견하였다(도 7i 및 7j, 복합 GENUS 및 무자극 대조군에 따른 플라크에 대한 면역 염색된 3D 전체 뇌 SHIELD 샘플을 보여주는 예시 동영상이 보충 동영상 3 및 4에 제공됨). 종합하면, 이러한 결과는 복합 GENUS가 5XFAD 마우스 모델의 신피질에 걸쳐 아밀로이드 플라크 부하를 상당히 감소시킨다는 것을 나타낸다.
방법
동물
모든 동물 작업은 Massachusetts Institute of Technology의 Committee for Animal Care of the Division of Comparative Medicine 및 Georgia Institute of Technology의 Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다. 마우스를 표준 12시간 밝음/12 시간 어둠 주기에서 5마리보다 적은 군에 수용하였고, 모든 실험은 밝음 주기 동안 수행하였다. 전기생리학 실험은 Georgia Institute of Technology에서 수행하였으며, 수컷(1-3개월령) WT 마우스(C57Bl/6)는 Jackson 실험실에서 수득하였다. 마우스를 역방향 12시간 밝음/12시간 어둠 주기에서 수용하고, 모든 실험을 어둠 주기 동안 수행하였다. 사료 및 물은 무제한으로 제공하였다.
수술 절차
모든 수술은 Iaccarino 및 Singier 등, 2016에 기술된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 성체(2-3개월령) 마우스를 헤드플레이트 배치 수술 전에 이소플루란으로 마취시켰다. 맞춤형 스테인리스 스틸 헤드플레이트를 치과용 시멘트(C&B Metabond, Parkell)를 사용하여 고정하고 LFP 기록을 위한 표적 개두술 부위를 두개골 상에 표시하였다(mm로, 정수리점으로부터: CA1의 경우 -2.0 전/후, +/-1.8 내/외, 청각 피질의 경우 -2.0 to -3.0 전/후, +/-1.8 내/외, 및 전두엽 피질의 경우 +1.3 내지 +1.4 전/후, +/- 1.0 내/외). 개두술은 3-8개월령 마우스에서 수행하였다. 첫 번째 기록 세션 전에, 두개골을 치아 드릴로 얇게 만들고 이어서 27 게이지 바늘을 이용하여 작은 구멍을 만들어서 개두(200-500 μm 직경)하였다. 기록하지 않을 때, 개두술은 멸균 실리콘 엘라스토머(Kwik-Sil WPI)로 밀봉되었다.
전기생리학 기록
기록하는 동안, 머리가 고정된 동물은 공기-유동성 8인치 구형 트레드밀에서 이동하였다. 모든 동물은 가끔 가당 연유(1:2 물 희석)를 받아 먹는 동안 편안해질 때까지 트레드밀에서 기동하는 것을 사전에 배웠다. 동물은 최대 5시간 동안 볼에 있었고, 이 기간 동안 여러 차례 달리기와 휴식을 가졌다. 단일 생크 32채널 탐침(NeuroNexus)을 목표 위치로 전진시켰다. 기록 부위는 250 μm에 걸쳐 있었다. 청각 피질을 기록하는 경우, 탐침은 관상면에 대해 수직 평행으로 3~4.15 mm의 깊이까지 45°의 각도로 전진시켰다. 평균 LFP에서 청각 반응을 검출하기 위해 5, 10, 15, 및 20 kHz의 일련의 50 ms 음조를 제시하였다. CA1 기록을 위해, 탐침을 해마 피라미드 층 전기 생리학적 특성이 관찰될 때까지 1.14~2.05 mm의 깊이로 개두술을 통해 수직으로 전진시켰다(큰 세프로브는 해마 피라미드층 전기생리학 특성이 관찰될 때까지 두요개두를 통해 까지 수직으로 전진되었다(큰 세타파와 예리한 잔물결, 다수 통로에서 150+ μV 스파이크). 전두엽 피질을 기록하는 경우, 탐침은 1.48~2.15 mm의 깊이까지 관상면으로부터 49°의 각도로, 수직에서 20°의 각도로 전진시켰다. 동일한 기록 세션 동안 여러 깊이에서 데이터를 수집한 경우; 기록 부위의 위치가 목표 위치에 남아있는지 확인하기 위해 새로운 깊이를 매핑하였다(AC의 경우 5마리 마우스에서 9개의 세션으로 부터 기록 깊이 n = 9, 및 CA1의 경우 5마리 마우스에서 10개의 세션으로 부터 기록 깊이 n = 12, mPFC의 경우 4마리 마우스에서 7개의 세션으로 부터 기록 깊이 n = 7). 그라운드 펠릿을 참조로서 사용하는 Intan RHD2000 평가 시스템을 이용하여 20 kHz의 샘플링 속도로 데이터를 획득하였다.
전기생리학 기록을 위한 청각 및 시각 자극
동물에게 10초 기준 주기로 인터리빙된 10초 자극 블록을 제시하였다. 자극 블록은 청각 전용 또는 청각과 시각 자극 사이에서 20 Hz, 40 Hz, 80 Hz, 또는 무작위 자극으로 회전하였다(펄스는 25 ms의 평균 간격으로 균일한 분포로부터 결정된 무작위 펄스 간 간격으로 전달됨). 관찰된 결과가 신경 반응의 시간 경과에 따른 변화로 인한 것이 아니라는 것을 보장하기 위해 자극 블록을 인터리빙 하였다. 모든 청각 펄스는 1 ms 길이의 10 kHz 음조였다. 모든 시각 펄스는 자극 주파수의 50% 듀티 사이클이었다(25 ms, 12.5 ms 또는 6.25 ms 길이). 복합 자극을 위해, 청각 및 시각 펄스를 각 펄스 개시와 정렬시켰다.
데이터 획득
Intan RHD2000 평가 시스템을 이용하여 20 kHz의 샘플링 속도로 데이터를 획득하였다.
스파이크 검출
미가공 추적을 300~6000 Hz 사이로 대역 통과 여과하였다. 그런 다음, 필터링된 신호의 중앙값의 임계값 + 추정된 표준 편차의 5배(중앙값/0.675)에 의해 스파이크를 검출하였다.
스파이크 분류 및 단일 유닛 안정성
스파이크 검출 및 분류는 MountainSort 자동 스파이크 분류 후 파형 및 상호-상관도의 육안 검사에 기초하여 수동 큐레이션에 의해 수행되었다. 수동 큐레이션 전에, 품질 임계값은 1 이상인 피크 SNR, 잡음과 10 % 미만의 중첩, 및 다른 유닛과의 95 % 이상의 단리를 포함하여 단리가 잘 이루어진 단일 유닛만을 포함하도록 적용되었다. 단일 유닛을 잃어버린 기록에서 불안정한 기간을 설명하기 위해, 안정된 기간(단일 유닛의 흥분율의 갑작스런 손실 없음)만 분석에 고려되도록 안정성 기준을 적용하였다. 각 유닛에 대한 흥분율(FR)을 기록 세션 동안 연산하였다. 흥분 속도를 k-평균 클러스터링을 사용하여, 낮은 FR 및 높은 FR의 두 개의 분포로 클러스터링하였다. 높은 FR 평균의 10% 미만으로 떨어지는 FR을 갖는 유닛의 경우, 추가 분석은 FR이 낮은 FR 평균보다 2 표준 편차 높은 가장 긴 시간으로 정의된 안정한 기록 기간을 확인하였다.
국소장 전위
LFP는 미가공 트레이스(raw traces)를 2 kHz로 하향하고, 1-300 Hz 사이의 대역 통과 필터링에 의해 획득하였다.
분석을 위한 기록 부위
AC 및 CA1의 데이터를 다수 통로에서 분석하였다. AC에서, 탐침상의 가장 낮은 통로를 AC의 위치를 결정하기 위해 사용하였고, 가장 높은 16개의 통로를 주요 관심 영역에 있지 않은 것으로 결정하였기 때문에, 32개의 채널 중 하위 16개는 375 μm에 걸쳐 사용하였다. CA1의 경우, 250 μm에 걸쳐 탐침의 모든 기능 통로를 분석하였다(27/32 또는 31/32). AC 및 CA1 모두에서 탐침의 가장 높은 통로는 출력 스펙트럼 분석을 위한 탐침 참조로 사용하였다. 접지를 기준으로 하여 유사한 결과를 얻었다.
전전두엽 피질 조직학
각 동물에서 최종 mPFC 기록 동안, 탐침을 Dil로 코팅하고 표적 깊이에 삽입하였다. 마우스는 마취(이소플루란) 하에 인산 완충 식염수(PBS)에서 4% 파라포름알데히드를 사용하여 관류하였고, 뇌를 1xPBS에서 4% 파라포름알데히드로 하룻밤 동안 후위-고정시켰다. 뇌는 Leica VT1000S 비브라톰(Leica)을 이용하여 100μm 두께로 절단하였다. 섹션을 1xPBS 중 0.2 % 1 mMol DAPI로 염색하고 Vectashield 장착 매질을 사용하여 현미경 슬라이드에 장착하였다. 이미지는 함께 제공된 Zen Blue 2 소프트웨어를 사용하여 Zeiss Axio Observer Z1 역위 형광 현미경에서 획득하였다.
출력 스펙트럼
출력 스펙트럼 밀도 분석은 Chronux 도구 박스로부터의 멀티테이퍼 방법(시간-대역폭 산물 = 3, 테이퍼의 숫자 = 5)을 이용하여 수행하였다. LFP 추적을 각 자극 조건의 10초 시험으로 나누었다. 두개골 위의 식염수에 있는 그라운드 펠릿을 참조하여, 이들 시험 동안 (동일한 기록일과 기록 깊이 내에서) 각 동물에 대한 평균 출력 스펙트럼 밀도를 연산하였다. 출력 스펙트럼 밀도 분석을 AC, CA1 및 mPFC의 모든 기록 부위에 대해 초기에 연산하였다. 각 기록 깊이로 부터, 40 Hz 플리커 자극에 대응하는 최대 40 Hz 피크가 있는 추적을 분석에 포함하였다. 제시된 데이터에 표시되는 깊이 별 추적은 청각 플리커 자극에 대응하여 최대 40 Hz 피크를 가졌다.
플리커 자극 중 흥분
각 자극 주파수에 대한 단일 유닛 peri-자극 시간 히스토그램(PSTH)은 자극 트레인에 걸쳐 스파이크을 나타내기 위해, 주기 당 10개의 빈을 갖는, 4개의 자극 주기(여기서 
)를 포함하였다. PSTH는 각각의 빛 켜짐 또는 소리 켜짐 펄스의 시작 전후에 2개의 자극 주기 동안 스파이크를 비닝함으로써 모든 단일 유닛에 대해 연산하였다. 무작위 자극 조건에서와 같이, 무작위 분포 펄스 시간을 사용하여 무자극 히스토그램을 계산하였다. 빈당 스파이크 수를 총 펄스 수와 빈 크기로 나누어 각 빈에서 흥분율을 연산하였다. 자극 주파수와 관련하여 흥분율 주기성을 정량화하기 위해, 흥분율 피크 사이의 시간 간격을 모든 단일 단위 히스토그램에 대해 계산하였다. 각 PSTH의 피크는 하나의 자극 간격 내에서 최대 흥분율이었다. 자극에 의한 흥분율 변화를 정량화하고 순환 통계를 연산하기 위해, peri-자극 스파이크 시간을 라디안으로 변환하였다: (peri-자극 스파이크 시간) * 2π * (자극 주파수). 벡터 강도는 CircStat 도구 상자의 방법을 사용하여 계산하였다; 레일리 통계를 방정식 RS = 2nVS 2 를 이용하여 연산하였는데, 여기서 n은 총 스파이크 개수이고, VS는 벡터 강도이다(Berens, 2009, Ma 등, 2013).
평균 흥분율
각각의 자극 조건에 대해 각각의 단일 유닛에 대해 평균 흥분율을 계산하였다. 각 단위에 대해 안정적인 기간만 평균 FR 계산에 기여하였다(스파이크 분류 및 단일 유닛 안정성 참고, 위). 자극 조건들 사이의 평균 흥분율의 차이를 그 유닛에 대한 각각의 조건에서 평균 FR의 차이를 취함으로써 각 유닛 내에서 연산하였다.
40 Hz 시각 플리커 자극 프로토콜
생화학 및 면역 조직 화학 분석을 위해, 발광 다이오드(LED) 전구에 의해 조사된 어두운 챔버에 5XFAD 마우스를 놓고, 4가지 자극 조건 중 하나에 노출시켰다: 1시간씩 7일 동안 어두운, 8 Hz, 40 Hz(12.5 ms 점등, 12.5 ms 소등, 60W), 또는 무작위(광 펄스를 25 ms의 평균을 갖는 균일한 분포로 결정된 무작위 간격으로 전달함) 자극).
40 Hz 청각 음조 트레인 자극 프로토콜
생화학적, 면역 조직 화학적, 또는 행동 분석을 위해, 5XFAD, APP/PS1 또는 P301S 마우스를 방음 발포체(McMaster-Carr, 5692T49)로 방음된 조용한 방에 있는 불빛이 어렴풋이 비치는 챔버에 두었다. 스피커(AYL, AC-48073)를 챔버 위의 마우스로 부터 닿지 않는 곳에 배치하였다. 마우스를 5가지 자극 조건 중 하나에 노출시켰다: 무음, 8 Hz 음조, 40 Hz 음조, 80 Hz 음조, 또는 무작위로 전달되는 음조(청각 음조를 25 ms 의 평균을 가진 균일한 분포에 의해 결정되는 무작위 간격으로 전달함) 자극. 자극 조건에 대한 음조를 지속 시간이 1 ms이고 60 dB로 전달되는 10 kHz 음조로 구성하였다. 전기 생리학 기록의 경우 탐침 배치 후 방의 조명이 꺼지고, 동물에게 10초 동안 빛이나 소리가 들리지 않는 교차하는 10초의 기간의 청각 전용 및 시청각 자극이 나타난다. 청각 전용 자극의 경우, 4% 듀티 사이클로 40 Hz에서 10 kHz의 음조로 재생하였다. 시청각 자극의 경우, 청각 자극을 50% 듀티 사이클로 10초 동안 40 Hz에서 깜빡이는 주변 광을 동반했다. 자극은 동물의 행동을 확인하기 위해 세션 사이에 1-10분 정지와 함께 20분 세션에 대해 이러한 방식으로 제시되었다.
40 Hz 청각 및 시각 동시 자극 프로토콜
생화학적, 면역 조직 화학적, 또는 행동 분석을 위해, 5XFAD 마우스를 LED 전구에 의해 비춰지는 어두운 챔버에 놓고, 동시에 청각 음조 트레인에 노출시켰다. 마우스를 4가지 자극 중 하나에 노출시켰다: 어두운/조용한, 40 Hz 점멸, 40 Hz 청각 음조 트레인, 동시 40 Hz 점멸 및 청각 음조, 또는 무작위 점멸/음조 자극.
면역 조직 화학
마우스는 마취(2:1의 케타민/자일라진) 하에 인산 완충 식염수(PBS)에서 4% 파라포름알데히드를 사용하여 관류하였고, 뇌를 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 하룻밤 동안 후위-고정시켰다. 뇌는 Leica VT1000S 비브라톰(Leica)을 이용하여 40μm 두께로 절단하였다. 섹션은 투과화되고, 실온에서 2시간 동안 0.3% Triton X-100 및 10% 당나귀 혈청을 내포하는 PBS에서 차단되었다. 섹션을 0.3% Triton X-100 및 10% 당나귀 혈청을 포함하는 PBS에서 일차 항체에서 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 일차 항체는 항-β-아밀로이드(Cell Signaling Technology; D54D2), 항-Iba1(Wako Chemicals; 019-19741), 항-교세포 섬유질 산성 단백질(GFAP)(Abcam; ab4674), 항-S100B(Abcam; ab868), 항-LRP1(Abcam; 28320), Lycopersicon Esculentum라고 표기된 DyLight 488(토마토) 렉틴(Vector laboratories; DL-1174), 항-아밀로이드 올리고머(Millipore Sigma; AB9234), 항-포스포-타우(Ser396)(Cell Signaling Technology; 9632), 항-포스포-타우(Thr181)(Cell Signaling Technology, 12885), Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific; H3570)이었다. 항-Aβ 항체 12F4를 이용하였는데, 그 이유는 이것이 APP와 반응하지 않고, 상기 표지화가 Aβ에 특이적인지 여부를 결정할 뿐만 아니라, Iba1으로 공동 표지화를 허용하였기 때문이다. 항-아밀로이드 올리고머 항체 AB9234를 LRP1과 공동 표지하기 위해 사용하였다. 다음날, 뇌 섹션을 실온에서 2시간 동안 형광 접합된 이차 항체(Jackson ImmunOresearch)로 배양하고, 핵을 Hoechst 33342(Invitrogen)로 염색하였다. 이미지는 모든 조건에 대해 동일한 설정에서 40배의 대물렌즈를 갖는 공초점 현미경(LSM 710; Zeiss)을 이용하여 획득하였다. 이미지를 처리군에 대해 맹검자인 실험자가 ImageJ 1.42q를 이용하여 정량화하였다. 각 실험 조건에 대해, 각 동물로부터 2개의 두정 섹션을 정량에 이용하였다. 스케일 바는 도 범례에서 달리 언급되지 않는 한, 50 μm이다. ImageJ를 사용하여 Iba1+ 세포체의 직경을 측정하고 길이 측정 과정을 추적하였다. 또한, Coloc2 플러그인을 Iba1 및 Aβ의 공동 국소화를 측정하는데 이용하였다. Imaris x64 8.1.2(Bitplane, Zurich, Switzerland)를 사용하여 소교세포 돌기 수지상을 정량하였다. ImageJ에서 '분석 입자' 기능을 플라크 수 및 면적을 계수하기 위해 사용하였고, 적어도 10 μm의 침착물을 포함하였고, 설정된 임계값을 대조군 및 실험군 둘 다에 사용하였다.
혈관 구조-Aβ 공동 국소화 분석
ImarisColoc 모듈을 사용하여 3D에서 두 개의 개별 소스 통로(즉, 렉틴 및 AB, 렉틴 및 LRP1) 사이의 신호의 공동 국소화를 정량화하였다. 이 소스 통로는 잡음 또는 배경 신호에서 나오는 모든 세기를 가리기 위한 임계값이다. 그런 다음, ImarisColoc은 소스 통로에 대해 설정된 임계값 내에서 공동 국소화하는 복셀만을 포함하는 신규 통로를 생성하고, 관련 통계 분석을 제공한다.
소교세포-Aβ 클러스터링 분석
IMARIS를 사용하여 40 uM 슬라이스에서 아밀로이드 플라크 주변의 소교세포 클러스터링 패턴을 분석하였다. 표면 모듈을 12F4 신호를 기반으로 3D 렌더 플라크(적색)를 감지하는 데 사용하였다. 그런 다음, 스폿 모듈을 사용하여 각 세포의 소마에 구를 배치(녹색)하여, Iba1-양성 소교세포를 계수하였다. 마지막으로, Spots Close To Surface XTension을 실행하여 정의된 25 uM 임계값보다 표면 물체에 더 가까운 스폿의 하위 세트를 찾고, 이 범위를 벗어난 스폿을 제외하였다. 이 알고리즘은 3D 공간에서 표면 물체의 가장 가까운 점까지의 스팟의 중심으로 부터 거리를 측정하여, 플라크 부근의 소교세포 응집을 정량화할 수 있게 한다.
뇌 슬라이스에서 CLARITY 면역 염색
마우스를 얼음처럼 차가운 PBS(1X), 이어서 1xPBS에서 얼음처럼 차가운 4% PFA, 1% 글루타르알데히드로 관류하였다. 뇌를 절개하고 4°C에서 72시간 동안 4% PFA/1% 글루타르알데히드 용액에 사후 고정하였다. 불활성화 용액(1X PBS 중 4% 아크릴아미드, 1 M 글리신, 0.1% triton-X100)에서 48시간 동안 실온에서 뇌를 배양함으로써 고정을 종료하였다. 1xPBS에서 세척한 후, 1xPBS에서 비브라톰(Leica VT100S)에서 100 uM 관상면으로 잘랐다. Allen Mouse Brain Atlas를 참조하여, 관심 영역(즉, 청각 피질 및 해마)을 함유하는 섹션을 선택하고, 청소 완충액(pH 8.5-9.0, ddH2O에서 200 mM 나트륨 도데실술페이트, 20 mM 수산화리튬 일수화물, 4 mM 붕산)에서 2-4시간 동안 배양하고, 55℃에서 진탕시켰다. 청소된 섹션을 1xPBST(0.1% Triton-X100/1XPBS)에서 3 x15분 세척하고, 실온에서 차단 용액 (2% 소 혈청 알부민/1xPBST) 내로 하룻밤 동안 집어넣었다. 이어서, 실온에서 진탕하면서, 1x PBST에서 3회 1시간 세척을 수행하였다. 섹션을 약한 결합 완충액(pH 8.5-9.0, PBST에서 37.75 mM Na2HPO4, 3.53 mM KH2PO4, 0.02% 나트륨 아자이드)에서 실온에서 1시간 동안 배양하고 나서, 일차 항체로 옮기고, 37℃에서 12시간 동안 1x 약한 결합 완충액에서 1:100으로 희석하였다. 반전 완충액(pH 7.4, PBST에서 0.02% 소듐 아자이드 중 37.75 mM Na2HPO4, 3.53 mM KH2PO4)을 6시간에 걸쳐 1시간 분량씩 첨가하여, 일차 항체 용액의 부피와 조직의 부피를 동일하게한다. 섹션을 실온에서 12시간동안 1xPBST 내 Hoechst 33258(1:250)(Sigma-Aldrich, 94403)와 이차 항체(1:100)의 혼합물에서 배양하기 전에, 1xPBST에서 3x1시간 세척의 또 다른 세트를 수행하였다. 이어서, 섹션을 1xPBS에서 밤새 세척하고, 장착 전에 실온에서 1시간 동안 RIMS(굴절률 정합 용액: 75g 히스토덴즈, 20 mL 0.1 M 인산염 완충액, 60 mL ddH2O)에서 배양하였다. 뇌 섹션을 RIMS에서 커버슬립(VWR VistaVision, VWR International, LLC, Radnor, PA)이 있는 현미경 슬라이드 상에 장착하였다.
이미지는 Zen Black 2.1 소프트웨어(Carl Zeiss Microscopy, Jena, 독일)를 수반하는 Zeiss LSM 880 현미경에서 확득하였다. Z-스택 이미지를 3D 재구성에 적합한 0.4-0.5 μm의 단계 크기, 픽셀 체류 4.1 ms, 2의 평균, 해상도 1024x1024로 획득하였다. Imarisx64 8.3.1(Bitplane, Zurich, 스위스)을 3-D 렌더링 및 분석에 이용하였다.
전체 마우스 뇌 처리 및 제거
5XFAD 마우스 뇌를 SHIELD 프로토콜에 따라 처리하였다. 간략하게, 5XFAD 마우스를 얼음처럼 차가운 PBS 다음 4% PFA를 함유하는 20 mL SHIELD-OFF 용액으로 심장을 통해 관류시켰다. 뇌를 해부하고, 4℃에서 24시간 동안 동일한 용액으로 사후 고정시켰다. 그런 다음, 뇌를 4℃에서 PFA 없이 SHIELD-OFF 용액에 하룻 밤 동안 배양하였다. 이어서, 뇌를 37℃에서 SHIELD-ON 용액에 24시간 동안 배양하였다. 고정 후, 뇌를 pH 8.5-9.0에서 200 mM 도르실 황산나트륨(SDS), 20 mM 수산화 리튬 일수화물, 40 mM 붕산을 함유하는 수성 세척 용액에 배양하였다. 그런 다음, 투명할 때까지 며칠 동안, 확률적 전계 수송(Kim 등, PNAS, 2015)을 기반으로 SmartClear Pro(LifeCanvas Technologies, Cambridge, MA)를 사용하여 뇌를 제거하였다.
제거된 전체 반구의 면역 염색
변형된 확률적 전계 수송 방법(Kim 등, PNAS, 2015)인, eTANGO를 사용하여, 2일에 걸쳐 Alexa Fluor-488(CST, # 51374)과 컨쥬게이션된 15 ul의 베타-아밀로이드 항체로 제거된 반구를 염색하였다.
광 시트 현미경
면역 염색된 샘플을 광학 클리어링하기 위해 hProtos(105 ml DI-물 중의 3g 다이아트라이조산, 5g N-메틸-d-글루다민, 125g 이오헥솔)과 함께 배양한 다음, hProtos 내에서 2% 저온 용융 아가로스를 사용하여 아크릴 홀더에 장착하였다. 10x CLARITY에 최적화된 대물 렌즈가 장착된 맞춤형 광 시트 현미경을 사용하여 베타 아밀로이드 시각화를 위한 488개 통로 및 자가 형광을 위한 647개 통로를 사용하여 전체 반구를 이미지화 하였다.
제거된 전체 뇌 이미지 처리, 플라크 검출, 및 아틀라스 정렬
획득된 이미지 데이터는 Matlab에서 구현된 오픈 소스 소프트웨어 패키지인, CIDRE를 사용하여 조명 보정하였고, 생성된 처리된 이미지는 Imaris™의 Terastitcher(Bitplane®)를 사용하여 함께 봉합하였고, 3D 시각화를 위해 ImageJ(National Institutes of Health)를 사용하여 대표적인 슬라이스 별 2D 시각화를 만들었다. 자동화된 플라크 검출은 오픈 소스 ClearMap 소프트웨어, 맞춤형 세포 분류 신경망 모델, 및 Elastix의 조합을 사용하여 수행하였다. 후보 플라크는 ClearMap의 스팟 검출 모듈과 함께 "스팟"으로 배치했다. 먼저, 배경 감산은 (21,21)의 주 및 부 직경 픽셀 크기를 갖는 디스크 구조 요소와 함께 그레이 스케일 형태학적 탑-햇 변환을 사용하여 슬라이스 단위로 수행하였다. 다음으로, 데이터의 로컬 최대값은 크기 (7,7,4)의 디스크 구조 요소를 가진 3D 최대 필터를 적용하여 감지하며,이 로컬 최대값은 강도 임계값 100으로 필터링한다. 각 스팟 중심 위치에 해당하는 픽셀 볼륨은 또한 스팟 중심을 시드 포인트로 사용하여 3D 분기점 변환을 사용하여 연산한다. 이어서, 10 마이크론 직경을 갖는 구보다 작은 부피를 갖는 모든 후보 플라크를 여과 제거하였다. Theano™ backend와 함께 Keras™에서 구현된 범주형 플라크/비-플라크 분류기로서 신경 회로망 콘볼루션(CNN) 모델을 사용하여 후보 플라크로부터 진짜 플라크를 확인하였다. CNN 입력은 후보 플라크 중앙을 중심으로 한 32 x 32 픽셀 경계 상자이며, 출력은 플라크 및 비-플라크 범주를 나타내는 2 요소 원-핫 벡터이다. 이 아키텍처는 12개의 전체 콘볼루션 레이어로 구성되며, 각각 정류된 선형 단위(ReLU) 활성화와 배치 정규화가 이어진다: 64 2x2 커널 3개, 128 2x2 커널 3개, 이어서 192 2x2 커널 3개, 256 2x2 커널 1개 , 256 1x1 커널 1개 및 2 lxl 커널 1개. 2x2 서브 샘플링은 세번째, 여섯번째 및 아홉번째 콘볼루션 레이어 이후에 수행되며, 정규화를 위해 마지막 9개의 convoiutional/batch 정규화 레이어 후에 0.5의 비율로 드롭아웃이 적용된다. 최종 콘볼루션 레이어 이후, 글로벌 평균 풀링 다음에 소프트맥스 활성화가 적용되어 최종 범주 벡터를 생성한다. 훈련 동안, 범주형 크로스 엔트로피 손실을 기본 파라미터와 같이 Adam optimizer와 함께 사용하였다. CNN은 Keras™ 이미지 데이터 생성기를 사용하여 무작위 회전, 전단 및 반사로 보강된 ~10,000개의 수동 플라크 주석에서 배치 크기가 64인 400 사건에 대해 훈련하였다. 이어서, 생성된 모델을 사용하여 모든 샘플에 대해 검출 된 지점으로부터 플라크를 분류하였다. 아틀라스 정렬을 수행하기 위해, 자가 형광 통로 이미지를 먼저 아틀라스 해상도로 다운 샘플링한 다음, Elastix를 사용하여, 고정 이미지로 리샘플링된 자가 형광 이미지와, 동영상으로 아틀라스와 함께, 3D 이미지 등록을 수행하기 위해 아핀 및 B- 스플라인 변환 매개 변수를 계산하였다. 생성된 정렬 매개 변수를 플라크 위치(CNN 모델에서 출력)에 적용하여 플라크를 아틀라스 공간으로 변환한 후 각 뇌 영역(Allen Brain Atlas에 따른 분할)에 대한 플라크 수 및 용적 정보가있는 CSV 파일을 생성하였다.
웨스턴 블롯
해마 및 청각 피질을 절개하고 용해물을 6개월령 수컷 5XFAD로부터 용해물을 준비하였다. 조직을 1 ml RIPA (50 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 완충액에서 손 균질기(Sigma)로 균질화하고, 얼음 위에서 15분 동안 배양되고, 그리고 4℃에서 30분 동안 회전시켰다. 세포 조직파편을 10분 동안 14,000 r.p.m.에서 원심분리에 의해 단리하여 폐기하였다. 용해물은 나노드롭을 이용하여 정량화하였고, 25 μg 단백질을 10% 아크릴아미드 겔 위에 로딩하였다. 단백질을 아크릴아미드 겔로부터 PVDF 막(Invitrogen)으로 120분 동안 100 V에서 이전하였다. 막은 TBS:Tween에서 희석된 소 혈청 알부민(5% w/v)을 이용하여 차단하였다. 막은 4℃에서 하룻밤 동안 일차 항체 및 실온에서 90분 동안 이차 항체에서 배양하였다. 일차 항체는 항-포스포-타우(Ser396) 및 항-포스포-타우(Thr181)이었다. 이차 항체는 LI-COR IRDye 이차 항체였다. 신호 강도는 ImageJ 1.46a를 이용하여 정량되고 타우5의 값으로 정규화하였다(Thermo Fisher Scientific; AHB0042).
ELISA
일차 청각 피질, 내측 전두엽 피질, 및 해마는 6개월령 5XFAD 수컷 마우스로부터 단리되고, 제조업체의 사용설명서에 따라서 Aβ42 또는 Aβ40 ELISA 키트(Invitrogen)를 사용하여 Aβ 측정을 실시하였다. 불용성 Aβ를 ELISA 측정 전에 5 M 구아니딘/50 mM Tris HCL(pH 8.0) 완충액으로 처리하였다.
행동 실험
신규 물체 인지
신규 물체 인지(NOR) 작업은 전술한 바(Leger 등, 2013)와 같이, 습관화 단계 이후 다음 날 수행되는 훈련 및 시험으로 구성되어 있다. 훈련 24시간 전에, 마우스를 5분 동안 개방된 시험 경기장(40 cm L x 40 cm W x 35 cm H)에 적응시키고, 그 동안 총 거리(cm), 중심에서의 시간(초) 및 속도(cm/s)를 계산 하였다(TSE 시스템). 훈련하는 동안, 마우스를 반대쪽 모서리에 동일한 두 개의 물체를 배치한 동일한 상자에 넣었다. 마우스에게 총 20초의 물체 상호 작용 시간(최대 10분 이내)을 허용 한 후, 경기장에서 즉시 제거했습니다. 훈련하는 동안 동일한 절차를 사용하여 1 시간 후에 물체 기억을 테스트했으나, 한 물체는 그 대신 새로운 물체로 교체했다. 코가 물체에 닿았을 때 물체 탐색을 기록하고 인지 지수 RI=T신규/(T신규+T기존)로 계산하였고, 여기서 T 신규 및 T 기존 은 신규 및 기존 물체와 함께 보낸 시간을 각각 나타낸다.
신규 물체 위치
훈련 및 테스트 모두에 대해 2개의 동일한 물체가 사용되었고, 시험 동안 하나의 물체가 새로운 위치로 옮겨졌다는 점을 제외하고는, 물체 인지 작업과 동일한 절차를 사용하여 신규 위치 인지(NOL) 작업을 수행하였다.
모리스 수중 미로 테스트
공간 기준 기억 시험은 대략 22℃에서 흰색 불투명한 물로 채워진 원형 탱크(직경, 1.2 m)에서 수행하였다. 다른 색상과 모양으로 구성된 참조 큐를 탱크를 둘러싼 벽을 따라 배치하였다. 탱크 안에는 목표 사분면에 위치한 고정 플랫폼(직경 10 cm)이 있다. 시험하는 동안, 플랫폼을 침지시키고 마우스를 탱크 벽에 무작위로 대면하는 7개 지점 중 하나에서 탱크에 넣었다. 플랫폼을 검색하기 위해 마우스에게 60 초를 제공하였고, 발견하지 못했다면, 플랫폼으로 부드럽게 안내하였다. 동물을 15초 동안 플랫폼 상에 유지시켰다. 1시간의 시험 간격으로 하루 2회의 시험을 수행하였다. 트레일 사이에서, 마우스를 부드럽게 건조시키고 가열 패드에서 따뜻하게 하였다. 마우스 거동을 TSE Systems를 사용하여 동영상 촬영하였다. 탈출 잠복기, 또는 마우스가 플랫폼에 도달하는 데 걸리는 시간을 각 시험에 대해 점수를 매기고 시험일당 평균화하였다. 6일차에, 플랫폼을 제거하고 기억 시험(탐침 시험)를 수행하였다. 4사분면 각각에서 소요된 시간과 플랫폼이 사용되었던 지역의 교차 횟수를 기록하였다. 수영 속도를 자동으로 기록하였다.
결론
본 개시의 발명의 양태는 본원에 기술된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 일치하지 않는 경우, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합이 본 개시의 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 다양한 본 발명의 개념이 하나 이상의 방법으로서 구현될 수 있으며, 그 중 하나가 실시예로서 제공되었다. 상기 방법의 일부로서 수행되는 작동은 임의의 적절한 방식으로 주문될 수 있다. 따라서, 구현예는 도시된 것과 상이한 순서로 작동이 수행되도록 구성될 수 있으며, 예시적인 구현예에서 순차적인 작동으로 나타나더라도, 일부 작동을 동시에 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조문헌은 그 전체가 참고로 원용된다.
본원에 정의되고 사용된 모든 정의는, 사전적 정의, 참조로서 통합된 문서 내의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 통제하는 것으로 이해해야 한다.
본원에서 사용된 부정관사("a" 및 "an")는, 달리 명백히 나타내지 않는 한 "적어도 하나"라는 의미로 이해해야 한다.
본원에서 사용된 "및/또는"이라는 문구는, 본 명세서 및 청구범위 내에서, 접합된, 즉 어떤 경우에는 결합하여 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소, 중 "둘 중 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해해야 한다. "및/또는"으로 열거된 다중 요소는 동일한 방식, 즉, 접합된 요소 중 "하나 이상의"로 해석되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소들, 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있거나 관련이 없는 다른 요소 이외의 다론 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비한정적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, "A 및/또는 B"에 대한 언급은: 일 구현예에서 A만(선택적으로 B이외의 요소를 포함); 다른 구현예에서, B만(선택적으로 A이외의 요소를 포함); 또 다른 구현예에서는 A 및 B 둘 다(선택적으로 다른 요소를 포함); 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 있어서 본원에서 사용되는 바와 같이, "또는"은 위에 정의된 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 목록에서 물품을 분리할 때 "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것, 즉, 적어도 하나를 포함하되, 하나를 초과하는 숫자 또는 요소 목록, 및, 선택적으로, 추가적인 목록에 없는 물품 또한 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 반대로, 예컨대 "단지 하나의" 또는 "정확하게 하나의", 또는 청구범위에서 사용될 때, "구성되는"과 같이, 명확하게 지시된 용어들 만이, 숫자 또는 요소 목록에서 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 참조할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은, 예컨대 "어느 하나의," "중 하나의," "단지 하나의," 또는 "정확히 하나의" 와 같이 배타적인 용어가 앞에 올 때, 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 하나이되 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용되는 경우, "본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같이 통상적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 있어서 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록에 관하여 "적어도 하나의"라는 어구는, 요소 목록 내의 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하되, 요소 목록에 구체적으로 나열된 각 요소 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하고, 요소 목록 내의 요소의 임의의 조합을 배제할 필요는 없다. 이러한 정의는, 또한, 구체적으로 식별된 요소 이외에 상응 요소가 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있는지 여부와 상관없이, 문구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에 선택적으로 존재할 수 있게 한다. 따라서, 비한정적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 등등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나," 또는, 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는: 일 구현예에서, B가 없이, 적어도 하나의 A, 선택적으로는 둘 이상(및 선택적으로 B외의 요소를 포함함); 다른 구현예에서, A가 없이, 적어도 하나의 B, 선택적으로 둘 이상(및 선택적으로 A외의 요소를 포함함); 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 A, 선택적으로 둘 이상, 및 적어도 하나의 B, 선택적으로 둘 이상(및 선택적으로 다른 요소를 포함함); 등을 지칭할 수 있다.
상기 명세서에서와 같이, 청구범위에서 "포함하는(comprising/including", "갖는(carrying/having)", "함유하는(containing)", "포함되는(involving)", "보유하는(holding)", "구성되는(composed of)" 등과 같은 전환구는, 개방형(open-ended)으로서, 즉, 포함하되 이에 한정되지 않음을 의미한다는 것을 이해해야 한다. "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"의 전환구 만이, 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼 2111.03에 기술된 바와 같이, 폐쇄형 또는 반 폐쇄형 전환구에 상응한다.
Claims (41)
- 대상체에게 20 Hz 내지 60 Hz의 주파수를 갖는 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하여, A) 대상체의 적어도 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하도록 구성된 자극 방출 장치를 포함하고, 청각 및 시각 자극은 동기적으로 정렬되는, 대상체에서 치매 또는 알츠하이머병을 치료하도록 구성된 시스템.
- 제1항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극은 35 Hz 내지 45 Hz의 주파수를 갖는, 시스템.
- 제2항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극은 40 Hz의 주파수를 갖는, 시스템.
- 제1항에 있어서, A)는 청각 피질(AC), 시각 피질(VC), 해마(HPC) 및 내측 전두엽 피질(mPFC)로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역 내 기록 부위의 5% 이상에서 주기적 스파이크 반응(spiking response)을 유도하는 것을 추가로 포함하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, A)는 mPFC에서 40 Hz에서 국소장 전위(LFP)를 유도하는 것을 추가로 포함하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, A)는
A1) 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역에서 소교반응 (microglial response)을 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 시스템. - 제6항에 있어서, A1)은
아밀로이드 플라크의 25 마이크로미터 이내에서 소교세포 수를 증가시키는 것;
소교세포체 직경을 증가시키는 것;
소교세포 돌기 길이를 감소시키는 것; 및
소교세포 수를 증가시키는 것 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 시스템. - 제7항에 있어서, A1)은 소교세포체 직경을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 시스템.
- 제7항에 있어서, A1)은 소교세포 돌기 길이를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 시스템.
- 제7항에 있어서, A1)은 소교세포 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 시스템.
- 제6항에 있어서, 적어도 하나의 피질 영역은 mPFC를 포함하는, 시스템.
- 제6항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 수일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A1)이 이루어지는, 시스템.
- 제12항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 7일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A1)이 이루어지는, 시스템.
- 제1항에 있어서, A)는
A2) 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 시스템. - 제14항에 있어서, A2)는 플라크 크기를 적어도 50%만큼 감소시키는 것을 포함하는, 시스템.
- 제14항에 있어서, A2)는 플라크 수를 적어도 50%만큼 감소시키는 것을 포함하는, 시스템.
- 제14항에 있어서, 적어도 하나의 피질 영역은 mPFC를 포함하는, 시스템.
- 제14항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 수일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A2)가 이루어지는, 시스템.
- 제18항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 7일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A2)가 이루어지는, 시스템.
- 제1항에 있어서, A)는
A3) 신피질, AC, VC, HPC 및 mPFC로부터 선택된 적어도 하나의 피질 영역에서 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드의 양을 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 시스템. - 제20항에 있어서, A3)는 Aβ 펩티드의 양을 적어도 50%만큼 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 시스템.
- 제20항에 있어서, A3)에서, Aβ 펩티드는 동종형 Aβ1-40 펩티드 및 동종형 Aβ1-42 펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 시스템.
- 제20항에 있어서, A3)에서, Aβ 펩티드는 가용성 Aβ 펩티드 및 불용성 Aβ 펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 시스템.
- 제20항에 있어서, 적어도 하나의 피질 영역은 mPFC를 포함하는, 시스템.
- 제20항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 수일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A3)이 이루어지는, 시스템.
- 제25항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 7일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A3)이 이루어지는, 시스템.
- 대상체에게 35 Hz 내지 45 Hz의 주파수를 갖는 청각 및 시각 복합 자극을 비침습적으로 전달하여, A) 대상체의 적어도 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하도록 구성된 자극 방출 장치로서, 청각 및 시각 자극은 고정된 위상 관계를 갖고, A)는:
A1) 대상체의 내측 전두엽 피질(mPFC)에서 주기적인 스파이크 반응을 유도하는 것;
A2) mPFC에 40Hz로 국소장 전위(LFP)를 유도하는 것; 및
A3) mPFC에서 소교반응을 증가시키는 것 중 적어도 하나를 포함하고,
대상체에서 치매 또는 알츠하이머병을 치료하도록 추가로 구성된, 자극 방출 장치. - 제27항에 있어서, A)는 A3)을 추가로 포함하고, A3)은:
아밀로이드 플라크의 25 마이크로미터 이내에서 소교세포 수를 증가시키는 것;
소교세포체 직경을 증가시키는 것;
소교세포 돌기 길이를 감소시키는 것; 및
소교세포의 수를 증가시키는 것 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 자극 방출 장치. - 제28항에 있어서, A3)은 소교세포체 직경을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 자극 방출 장치.
- 제28항에 있어서, A3)은 소교세포 돌기 길이를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 자극 방출 장치.
- 제28항에 있어서, A3)은 소교세포 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 증가시키는 것을 포함하는, 자극 방출 장치.
- 제28항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 수일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A3)이 이루어지는, 자극 방출 장치.
- 제32항에 있어서, 청각 및 시각 복합 자극을 7일 동안 비침습적으로 전달한 후에 A3)이 이루어지는, 자극 방출 장치.
- 제1항에 있어서, 청각 자극은 4% 내지 80%의 듀티 사이클(duty cycle)을 갖는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 시각 자극은 10% 내지 80%의 듀티 사이클을 갖는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 청각 자극은 4%의 듀티 사이클을 갖고 시각 자극은 50%의 듀티 사이클을 갖는, 시스템.
- 제27항에 있어서, 청각 자극 4% 내지 80%의 듀티 사이클을 갖고, 시각 자극은 10% 내지 80%의 듀티 사이클을 갖는, 자극 방출 장치.
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