KR102509169B1

KR102509169B1 - 뇌의 내측 전전두피질에서의 아밀로이드 침착수준 및 미토콘드리아 결핍 시냅스 분석을 통한 알츠하이머병의 조기 진단방법

Info

Publication number: KR102509169B1
Application number: KR1020210116826A
Authority: KR
Inventors: 이계주; 서나영; 김규현
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2023-03-10
Also published as: KR20230033887A

Abstract

본 발명은 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 대뇌의 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)에서의 아밀로이드 침착 여부 또는 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도를 분석하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 본 발명은 알츠하이머병이 발병하게 되면 뇌의 V1 영역이 아닌 mPFC 영역 특이적으로 아밀로이드 축적이 증가하고, 특히 mPFC의 층 2(layer 2)에서 흥분성 시냅스 밀도가 감소되며, 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된 시냅스와 미토콘드리아 결핍 축삭말단과 접촉하는 얇은형 가시의 밀도가 선택적으로 감소될 뿐만 아니라, 축삭말단 당 미토콘드리아 수와 다중 미토콘드리아를 함유하는 축삭말단의 수가 감소된다는 것을 규명하였다. 따라서 본 발명은 알츠하이머병 발병 시 뇌 영역 특이적으로 발생하는 상기와 같은 현상을 확인함으로써 알츠하이머병을 조기에 진단할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 효과를 갖는다.

Description

뇌의 내측 전전두피질에서의 아밀로이드 침착수준 및 미토콘드리아 결핍 시냅스 분석을 통한 알츠하이머병의 조기 진단방법{Method for diagnosis of Alzheimer's disease through the analysis of amyloid deposition level and mitochondria-deficient synapses in the medial prefrontal cortex of the brain}

본 발명은 뇌의 내측 전전두피질에서의 아밀로이드 침착수준 및 미토콘드리아 결핍 시냅스 분석을 통한 알츠하이머병의 조기 진단방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 평균수명이 늘어나고 노인 인구가 증가하는 고령화 사회로 되면서 알츠하이머 질환으로 대표되는 노인성 치매, 뇌졸중 또는 파킨슨병과 같은 뇌신경 질환의 발병률이 크게 증가하고 있다. 특히, 뇌신경 질환 중 하나인 알츠하이머 질환은 신경세포의 퇴화 및 이로 인한 인지, 기억능력의 상실을 가져오는 대표적인 퇴행성 뇌질환으로, 오래 지속될 경우 여타 합병증으로 사망에 이르게 된다.

한편, 현재 이용되고 있는 알츠하이머 진단기술로는 인지심리검사, 뇌척수액검사, 혈액검사, 유전적 표지, 및 뇌영상 촬영 등이 있다. 인지심리검사는 간이 정신상태 검사(MMSE), 몬트리올 인지검사(MoCA) 및 후각인지도검사(UPSIT) 등이 치매 검사법으로 활용되고 있으며, 국내에서는 SNSB (Seoul Neuropsychological Screening Battery)가 널리 활용되고 있다. 뇌척수액 검사는 알츠하이머성 치매의 대표적 특이 물질인 베타-아밀로이드(Aβ) 또는 타우 (tau) 단백질의 뇌척수액 내 정량을 통한 진단을 수행하며, 최근 뇌척수액 내 miRNA(microRNA)의 변화를 측정하여 바이오마커로 사용하고자 하는 연구가 진행되고 있다.

그러나 현재까지 알려진 알츠하이머 질환의 진단은 많은 시간과 경비가 소요된다는 단점이 있어 조기 진단 및 예방이 어려운 상황이다.

그러므로 빠르게 증가하고 있는 알츠하이머 질환의 발병속도를 고려할 때, 알츠하이머 질환을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 10-2164490 대한민국 등록특허 10-1623138

이에 본 발명자들은 알츠하이머 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구하던 중, 알츠하이머병이 발병된 마우스의 내측 전전두 피질(mPFC)에서의 아밀로이드 침착이 1차 시각 피질부위에 비해 조기에 나타난다는 사실을 확인하였고, 알츠하이머병 마우스의 mPFC 특이적으로 미토콘드리아가 결핍된 시냅스의 밀도가 감소되어 있다는 것을 확인함에 따라, mPFC 영역 특이적으로 아밀로이드 침착수준 및 미토콘드리아가 결핍된 시냅스를 분석할 경우, 알츠하이머병의 발병여부를 조기에 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

그러므로 본 발명의 목적은 뇌의 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)에서의 아밀로이드 침착 여부 또는 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도를 분석하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뇌의 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)에서의 아밀로이드 침착 여부 또는 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도를 분석하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분석은 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)의 층 2/3(layer 2/3) 영역에서의 아밀로이드 침착 여부 또는 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도 분석을 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아밀로이드 침착이 1차 시각 피질 영역(V1)이 아닌 내측 전전두피질(mPFC)의 층 2/3(layer 2/3) 영역에서 특이적으로 확인되거나 또는 층 2/3(layer 2/3) 영역에서 아밀로이드 침착이 증가된 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도가 1차 시각 피질 영역(V1)이 아닌 내측 전전두피질(mPFC)의 층 2(layer 2) 영역에서 특이적으로 감소되어 있는 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 다중 미토콘드리아를 함유하는 시냅스 축삭 말단(presynaptic boutons)의 수가 감소된 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다중 미토콘드리아는 2개 이상의 미토콘드리아일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 내측 전전두피질(mPFC)에서 특이적으로 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된 얇은 형태의(thin spines) 수상돌기가시(dendritic spines)가 감소되어 있는 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서는 알츠하이머병이 발병하게 되면 뇌의 V1 영역에 비해 mPFC 영역 특이적으로 아밀로이드 축적이 증가하고, 특히 mPFC의 층 2(layer 2)에서 흥분성 시냅스 밀도가 감소되며, 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된 시냅스(미토콘드리아 결핍 축삭 말단과 접촉하는 얇은형 가시)의 밀도가 선택적으로 감소될 뿐만 아니라, 축삭 말단 당 미토콘드리아 수와 다중 미토콘드리아를 함유하는 축삭 말단의 수가 감소된다는 것을 규명하였다. 따라서 본 발명은 알츠하이머병 발병 시 뇌 영역 특이적으로 발생하는 상기와 같은 현상을 확인함으로써 알츠하이머병을 조기에 진단할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은 알츠하이머병 유발 마우스의 mPFC에서 특이적으로 아밀로이드 침착의 증가 현상을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A 및 B는 야생형 마우스(WT) 및 알츠하이머병 유발 5xFAD 마우스의 mPFC 및 V1 영역에서 6E10 항체로 염색된 아밀로이드 플라크의 형광 이미지를 나타낸 것으로, 전체 뇌 이미지에서 점선 상자는 관심영역을 나타낸 것이고, 점선은 정량화된 피질층을 나타낸 것이며, mPFC는 내측 전전두피질을 나타낸 것이고, V1은 일차 시각피질을 나타낸 것이며, 눈금 막대, 1mm(저배율) 및 100μm(고배율)로 확인한 결과를 나타낸 것이다. C 및 D는 mPFC(C) 및 V1(D)의 층 2/3(layer 2/3)에서 아밀로이드 반점(amyloid puncta) 크기를 정량화한 결과를 나타낸 것이고(그룹당 n= 5마리), E 및 F는 mPFC(E) 및 V1(F)의 층 2/3에서 아밀로이드 반점 밀도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n= 5마리). (**P<0.01; Mann-Whitney U 테스트 결과임).
도 2는 알츠하이머병(5xFAD) 마우스의 피질 층별 아밀로이드의 축적 수준을 분석한 결과로서, A는 야생형 마우스(WT) 및 5xFAD 마우스의 mPFC 및 V1에서 6E10 항체로 염색된 아밀로이드 플라크에 대한 형광 이미지를 나타낸 것이며, mPFC에는 층 4가 없으며, 점선은 피질 경계를 나타낸 것이고, 실선은 정량화된 피질층을 나타낸 것이다. 눈금 막대, 500μm. B 내지 E는 각각 mPFC 및 V1의 층 1에서 아밀로이드 반점 크기(B 및 C) 및 반점 밀도(D 및 E)의 정량화 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=5마리). (층 1[반점 크기, μm²]: mPFC, P = 0.02, V1, P>0.99, [반점 #/mm²]: mPFC, P = 0.008, V1, P>0.99, Mann-Whitney U 테스트 결과임). F 및 G는 V1의 층 4에서 아밀로이드 반점 크기(F) 및 반점 밀도(G)의 정량화 결과이다(그룹당 n=5마리). (층 4 [반점 크기, μm²]: V1, P = 0.02, [반점 #/mm²]: V1, P = 0.02, Mann-Whitney U 테스트 결과임). H 내지 K는 mPFC 및 V1의 층 5/6에서 아밀로이드 반점 크기(H 및 I) 및 반점 밀도(J 및 K)의 정량화 결과이다(그룹당 n=5마리). (층 5/6 [점 크기, μm²]: mPFC, P = 0.008, V1, P = 0.008, [반점 #/mm²]: mPFC, P = 0.008, V1, P = 0.008, Mann-Whitney U 테스트 결과임). *P<0.05, **P<0.01.
도 3은 알츠하이머병(5xFAD) 마우스의 뇌에서 V1 영역이 아닌 mPFC 영역에서 시냅스의 손실이 나타남을 확인한 결과로서, A는 WT 및 5xFAD 마우스의 mPFC 및 V1에서 대표적인 수상돌기 세그먼트를 보여주는 SB-SEM(연속블록면 전자현미경) 이미지의 3차원 재구성 도면을 나타낸 것으로, 회색은 수상돌기를, 파란색은 전시냅스 축삭말단을, 노란색은 미토콘드리아를 나타낸 것이며, 스케일 바는 2μm의 크기를 나타낸 것이다. B는 WT 및 5xFAD 마우스의 mPFC 및 V1에서 시냅스 밀도를 정량화한 결과를 나타낸 것이며(그룹당 mPFC의 경우 n=12개의 수상돌기 및 V1의 경우 9개의 수상돌기), C는 WT 및 5xFAD 마우스의 mPFC에서 평균 가시 부피(C, 그룹당 n=228-289개의 가시)를, D는 시냅스 접촉면(ASI: axon-spine interface)의 면적을 분석한 결과를 나타낸 것이다(D, 그룹당 n=188-251개의 시냅스).
도 4는 야생형 마우스(WT) 및 알츠하이머병(5xFAD) 마우스의 mPFC 및 V1 영역에 대한 SB-SEM 이미지를 나타낸 것으로, 야생형 및 알츠하이머병 마우스의 mPFC 및 V1에서 층 2(layer 2) 시냅스의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다. 동일한 시냅스의 4개 연속 이미지는 각 유전자형 및 영역에 대해 나타낸 것이다. 눈금 막대, 1μm.
도 5는 5xFAD mPFC에서 시냅스 전(presynaptic) 축삭말단에 미토콘드리아가 결핍된 시냅스의 선택적 손실을 확인한 결과로서, 시냅스 전 미토콘드리아가 함유 또는 결핍된 시냅스에 대한 전자현미경(좌) 및 3차원 재구성(우) 영상을 나타낸 것이며, 여기서 푸른색은 시냅스전 축삭말단을, 노란색은 미토콘드리아를, 회색은 수상돌기가시(dendritic spine)를, 빨간색은 시냅스 접촉면(ASI: axon-spine interface)을 나타낸 것이며, 스케일 바는 1μm의 크기를 나타낸 것이다. B 및 C는 WT 및 5xFAD 마우스의 mPFC 및 V1에서 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된(B) 또는 함유한(C) 시냅스의 밀도를 정량분석한 결과이며(n = 그룹당 9-12 수상돌기), D 및 E는 시냅스 전 미토콘드리아가 함유 또는 결핍된 시냅스의 평균 가시부피(D) 및 시냅스 접촉면(ASI) 면적을 정량분석한 결과이고(n=87-95 미토콘드리아 함유 시냅스; 100-154 미토콘드리아 결손 시냅스), F는 가시 종류별 형태의 대표적인 이미지를 나타낸 것이며, G는 각 가시 종류별 가시(spine) 밀도(가시의 수)를 비교분석한 결과를 나타낸 것이고, H는 각 수상돌기에서 미토콘드리아가 함유 또는 결핍된 축삭말단과 접촉하는 얇은형 가시(H) 및 버섯형 가시(I)의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다(n=그룹당 9-12 수상돌기). 도면에서 NS는 무의미한 결과에 대한 표기를 나타낸 것이다.
도 6은 6개월 된 야생형 마우스(WT) 및 알츠하이머병(5xFAD) 마우스의 V1에서 수상돌기 가시의 형태학적 분석결과를 나타낸 것으로, A 및 B는 야생형 및 5xFAD 마우스의 V1에서 시냅스전 미토콘드리아가 있거나 없는 시냅스의 평균 가시 부피(A) 및 ASI 면적(B)을 정량화한 결과이고(n=61-63 미토콘드리아 함유 시냅스, 123-126 미토콘드리아-결핍 시냅스). ****P<0.0001; post-hoc Dunn 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 테스트임. C는 10 μm 수상돌기 길이 당 모양에 따른 가시 수의 정량화 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=9 수상돌기). ([가시 #/10 μm]: 얇은형태, P = 0.16; 버섯형태, P = 0.92, 뭉툭한 형태, P = 0.84, 분지형태, P = 0.96, unpaired t-검정, 사상위족형태, P>0.99, Mann-Whitney U 검정). D는 각 수상돌기 세그먼트(그룹당 n=9 수상돌기)에서 미토콘드리아가 있거나 없는 시냅스 축삭말단과 접촉하는 얇은형 가시의 비율을 나타낸 것이다. ****P<0.0001; post-hoc Tukey 검정을 사용한 양방향 ANOVA 분석이며, E는 각 수상돌기 세그먼트(그룹당 n=9 수상돌기)에서 미토콘드리아가 있거나 없는 시냅스 축삭 말단과 접촉하는 버섯형 가시의 비율을 나타낸 것이다(WT, P = 0.73, 5xFAD, P = 0.94, post-hoc Tukey 테스트를 사용한 양방향 ANOVA 결과임).
도 7은 알츠하이머병 5xFAD 마우스 mPFC의 축삭말단에서 미토콘드리아의 수적 감소를 확인한 결과로서, A는 WT 및 5xFAD 마우스의 mPFC 및 V1에서 미토콘드리아를 포함하는 시냅스 전 축삭말단의 전자현미경(상단) 및 3차원 재구성된 이미지(하단)를 나타낸 것이며(파란색은 시냅스 전 축삭말단을, 노란색은 미토콘드리아를 나타낸 것임), B는 축삭말단 당 미토콘드리아 수를 정량화한 결과이며(n = 그룹당 61-96 축삭말단), C는 다중 미토콘드리아(2개 이상)를 포함하는 시냅스의 밀도를 나타낸 것이고(n = 그룹당 3마리 마우스의 9-12개의 수상돌기), D는 각각의 미토콘드리아의 평균 부피를 나타낸 것이며(n = 그룹 당 71-138), E는 5xFAD mPFC에서 시냅스의 변화를 도식화하여 나타낸 것이다.

본 발명은 알츠하이머병의 새로운 조기 진단 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 본 발명은 뇌의 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)에서의 아밀로이드 침착 여부 또는 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도를 분석하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.

본 발명자들은 알츠하이머병을 조기에 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 새로운 방법을 개발하기 위해 연구하던 중, 알츠하이머병이 발병된 마우스 동물모델의 내측 전전두피질(mPFC)에서의 아밀로이드 침착이 알츠하이머병 발병 마우스의 1차 시각 피질부위에 비해 조기에 나타날 뿐만 아니라 아밀로이드 침착 수준이 더 높은 것을 확인하였고, 이러한 아밀로이드 침착은 정상 마우스 군에서는 확인되지 않는다는 사실을 확인하였다.

특히 본 발명자들은 알츠하이머병 마우스의 mPFC 영역에 대해, 층 1(layer 1)내지 층 6(layer 6) 부위에 따른 아밀로이드 침착 수준을 분석하였는데, 특이하게도 알츠하이머병 마우스의 층 2 및 층 3 영역(layer 2/3)에서 특이적으로 아밀로이드 침착이 일어남을 확인하였고, 특히 알츠하이머병 마우스 뇌의 다른 부위(1차 시각 피질: V1)에 비해 층 2 영역에서의 아밀로이드 침착이 조기에 두드러지게 증가되어 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해, 뇌의 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)에서의 아밀로이드 침착 여부 분석으로 알츠하이머병의 발병여부를 조기에 진단할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

뿐만 아니라 본 발명자들은 알츠하이머병 마우스를 대상으로 분석한 결과, mPFC 영역 특이적으로 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도가 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

상기 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도 역시 알츠하이머병 마우스의 층 2 (layer 2)에서 특이적으로 나타나는 것을 확인하였다. 한편 상기 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도 감소는 알츠하이머병 마우스의 1차 시각피질 영역에서는 확인되지 않았다.

한편, 시냅스의 손실은 알츠하이머병을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 중요한 병리학적 특징으로 알려져 있다. 따라서 시냅스 손실의 예방 또는 복구를 통한 알츠하이머병의 발병지연, 개선 또는 치료 연구가 수행되고 있으나, 미토콘드리아가 결핍된 시냅스의 손실이 알츠하이머병 대뇌에서 특이적으로 발생한다는 결과는 보고된 바 없다.

이러한 점에서 본원발명은 알츠하이머병 발병에 따른 특이적 현상으로 mPFC의 layer 2 영역에서 미토콘드리아가 결핍된 시냅스가 특이적으로 감소함을 확인할 수 있었고, 이러한 시냅스 손실이 알츠하이머병 마우스의 대뇌 1차 시각피질(V1) 영역에서는 확인되지 않는 것을 확인하였다.

뇌의 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)은 총 5개의 층(layer)을 포함(총 6개의 층 중 층 4는 관찰되지 않음)하고 있는데, 층 1(layer 1)은 대뇌피질의 가장 표면에 위치하며, 신경세포가 거의 없고 하부층 및 근위/원위 뇌 영역의 풍부한 신경섬유로 채워져 있다. 층 2/3 및 층 5/6은 피라미드형 뉴런을 포함하고 있으며, 이 신경세포들의 수상돌기는 여러 뇌 영역에서 입력을 받는다. 최근 보고에 의하면 층 2/3 피질층이 스트레스 조절에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

나아가 본 발명자들은 알츠하이머병 발병 시, mPFC의 층 2 영역 특이적인 시냅스 손실에 대한 구체적인 현상을 연구한 결과, 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된 시냅스가 선택적으로 감소된다는 것을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 정상마우스 및 알츠하이머병 마우스의 mPFC 및 V1 영역에서 시냅스 수의 분석을 미토콘드리아가 함유 또는 결핍된 시냅스로 구분하여 분석한 결과, 알츠하이머병 마우스의 경우, mPFC 영역 특이적으로 시냅스 전 미토콘드리아가 없는 시냅스의 수가 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났고, 이외 다른 실험군에서는 시냅스 수의 변화가 없는 것으로 나타났다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는, 유형별 수상돌기 가시(spine)에 대한 정량분석을 수행하였는데, 그 결과, 알츠하이머병 마우스의 mPFC에서 얇은형(thin spine) 가시가 다른 종류의 가시에 비해 정상마우스에 비해 현저하게 감소되어 있는 것을 확인하였다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도가 1차 시각 피질 영역(V1)이 아닌 내측 전전두피질(mPFC)의 층 2(layer 2) 영역에서 특이적으로 감소되어 있는 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단할 수 있음을 알 수 있었다.

또한 내측 전전두피질(mPFC)에서 특이적으로 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된 얇은형(thin spines) 수상돌기가시(dendritic spines)가 감소되어 있는 경우에도 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단할 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 알츠하이머병이 발병된 마우스의 내측 전전두피질(mPFC) 특이적으로 다중 미토콘드리아를 함유하는 시냅스의 수(밀도)가 감소되어 있는 것을 확인하였고, 시냅스 부톤 당 미토콘드리아의 수도 감소되어 있는 것을 확인하였다. 한편, 각 미토콘드리아의 크기 및 부피는 알츠하이머병 마우스 및 정상 마우스 모두에서 큰 변화가 없는 것으로 나타났다.

따라서 이를 통해 본 발명자들은 뇌의 내측 전전두피질(mPFC) 특이적으로 다중 미토콘드리아를 함유하는 시냅스의 수(밀도)가 감소되어 있거나, 시냅스 축삭말단 당 미토콘드리아의 수가 감소한 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단할 수 있음을 알 수 있었다.

또한 상기 다중 미토콘드리아는 2개 이상의 미토콘드리아 일 수 있다.

이상의 결과를 통해 본 발명자들은 알츠하이머병의 발병 초기인 경우, 뇌의 V1 영역이 아닌 mPFC 영역 특이적으로 아밀로이드의 축적이 일어나고, 특히 mPFC의 층 2(layer 2)에서 흥분성 시냅스 밀도가 감소되어 있으며, 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된 시냅스와 미토콘드리아가 결핍된 축삭말단과 접촉하는 얇은형 가시의 밀도가 선택적으로 감소되어 있으며, 축삭말단 당 미토콘드리아 수와 다중 미토콘드리아를 함유하는 축삭말단의 수가 감소되어 있음을 확인하였고, 이러한 분석을 통해 알츠하이머병을 조기에 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

하기 실시예의 기재는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<준비예 및 실험방법>

(1) 실험동물

본 실험에서 사용된 동물 마우스는 C57BL/6를 토대로 한 반접합체(hemizygous)가 유지되는 5xFAD 마우스(Tg6799, MMRRC 재고 번호: 34840-JAX, MGI: 3693208)를 사용하였다. 모든 마우스들은 한국뇌연구원 동물시설에서 12시간의 명암 사이클을 유지하면서 사육하였다. 또한, 모든 동물실험을 위한 실험실 관리 및 사용은 동물 및 기관동물 관리와 사용 승인위원회(IACUC-19-00033 및 IACUC-20-00040)의 지침에 따라 수행하였다.

(2) 면역조직화학법

6개월 된 5xFAD 마우스 및 야생형(WT) 마우스(n = 5/그룹; 수컷 3마리, 암컷 2마리)를 이소플루레인(isoflurane)을 이용하여 마취시켰고, 0.1M PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 경심관류시켰다. 이후 마우스의 뇌를 적출하였고, 4% 파라포름알데히드 용액에서 4℃의 온도로 48시간 동안 침수시킨 후, 4℃ 30% 수크로스 용액에서 동결보존시켰다. 동결된 마우스의 뇌는 동결절편기(cryostat)을 이용하여 40㎛ 두께로 절편화시켰다. 뇌 절편들은 1% TritonX-100 및 10% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum)을 함유한 PBS 용액에서 2시간 동안 투과시켰고, 이후 mouse anti-6E10 항체(BioLegend, Cat #803002, PRID: AB_2564654)를 처리하여 반응시켰다. 다음날 뇌 절편을 PBS로 세척하고 Alexa 555-접합된 당나귀 anti-mouse 항체(Invitrogen, Cat#A-31570, PRID: AB_2536180)로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Cat #B2261) 시약은 핵 염색에 사용하였다. mPFC 및 V1 영역을 함유하고 있는 뇌절편은 유리 슬라이드 상에 고정시켰고, 디지털 슬라이드 스캐너(3D Histech)를 이용하여 이미지를 획득하였다. 이후 20x/NA 0.8 objective를 이용하여 0.32 μm/pixel의 해상도 및 1858 x 1057 pixels의 크기로 이미징화하였다. 분석하고자 하는 관심영역은 Hoechst 33342(마우스당 분석된 총 면적: mPFC 0.39 ± 0.009, V1 0.24 ± 0.005 mm2)로 염색된 이미지를 사용하였다. 단위 면적당 puncta의 수 및 아밀로이드 침착물의 puncta 크기는 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 임계값 이미지에서 정량화하였다. 각 영역에 있어서, 각 동물당 2개 섹션의 puncta의 크기 및 밀도 값을 동물 평균값으로 산출하였다. 섹션의 브레그마 좌표는 다음과 같다: mPFC(2.22- 및 0.98-mm anterior to bregma) 및 V1(2.54- 및 3.52mm posterior to bregma)이다.

(3) 전자현미경 및 분석

수컷 마우스(n=3 각 그룹당)는 2% 파라포름알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드가 함유된 0.15M 카코딜레이트(cacodylate)(pH 7.4) 버퍼로 관류고정시켰다. 뇌 조직을 수집하였고, prelimbic mPFC 및 V1 영역이 포함된 150 μm 두께의 뇌 절편을 획득하였다. 절편화된 슬라이스는 2% OsO4/1.5% 페로시안화칼륨(2% OsO4/1.5% potassium ferrocyanide)으로 1시간 동안 후고정 하였다. 시료들은 1% thiocarbohydrazide(Sigma-Aldrich, Cat #223220)가 함유된 ddH2O에 20분 동안 담가둔 후, 이후 2% OsO4에서 30분 동안 반응시켰다. 이 후, 시료를 1% uranyl acetate에서 밤새도록 4℃의 온도로 반응시켰고, 이후 납-아스파르트산염 용액(lead aspartate solution)으로 60℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그런 뒤 시료들을 에탄올에서 연속적으로 탈수한 후 아세톤으로 치환하였고, Ketjen 블랙 분말이 혼합된 7%(w/v) 전도성 Epon 812 수지(EMS, Cat #14120)에 포매하였다. 뇌 조직 블록은 3View2(Gatan)이 장착된 Merlin VP 전계 방출 스캐닝 전자현미경(SEM; Carl Zeiss)으로 이미지화하였다. 이미지는 30μm 조리개, 높은 진공 모드, 전압 1.5kV, 이미지 크기 5,000 × 5,000 픽셀 및 50 nm의 절편 두께에서 8 nm의 x-y 해상도로 획득하였다. 피질층(cortical layer) 2에서 200장의 연속 이미지 스택(two stacks)을 각 마우스의 mPFC 및 V1 영역에서 각각 확보하였다(32,000 μm3 per mouse). 5xFAD 마우스에서 가시와 시냅스의 손실을 광범위하게 분석하기 위해 이미지는 플라크가 없는 영역에서 획득하였고, 이미지 분석은 ImageJ (NIH) 및 Fiji plugins (http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji)를 이용하였다. TrakEM2는 연속 이미지의 정렬을 위해 사용하였다. 무작위로 12~15μm의 길이를 갖는 가시 함유 수상돌기 세그먼트(spiny dendritic segments)를 임의적으로 선택하였다. 또한 분석 대상을 피라미드 뉴런으로 제한하기 위해 가시가 적거나 또는 없는 수상돌기는 제외시켰다. mPFC에서 총 24개의 수상돌기(그룹당 12개)를, V1에서 18개의 수상돌기(그룹당 9개)를 3차원 재구성 소프트웨어(https://synapseweb.clm.utexas.edu/)를 사용하여 3명의 주석자가 시각화하였다. 가시의 밀도, 미토콘드리아가 있거나 없는 시냅스 및 다중 미토콘드리아가 있는 시냅스의 밀도는 수상돌기의 길이 10μm당 정량화하였다. 또한 분석은 중추신경계에서 대부분의 흥분성 시냅스를 형성하는 수상돌기 가시에 형성된 시냅스로 제한하였다. 시냅스 강도, 가시의 머리와 목을 포함하는 가시 부피, 시냅스 접촉면(ASI: Axon-Spine Interface)의 면적을 SB-SEM 이미지에서 측정하였다. 가시(spine) 모양의 분류를 위해 돌기는 얇은 형태(thin), 버섯형(mushroom), 뭉툭한 형태(stubby), 분지형(branched) 또는 사상위족형(filopodia)으로 분류하였다. 가시 모양의 분류를 위해, 가시의 부피 및 가시 머리와 목의 최대 지름을 3ds max 소프트웨어(Autodesk)를 사용하여 측정하였고, 목이 수축되지 않고(constricted neck) 길이가 1μm 미만인 가시를 뭉툭한 형태(stubby)로 정의하였다. 또한 머리 지름이 목 지름보다 2배 이상인 가시는 버섯형으로 분류하였고, 머리가 2개 이상인 가시를 분지형으로 정의하였다. presynaptic partner가 없는 3μm 이상의 돌출은 사상위족형(filopodia)으로 정의하였고, 나머지는 얇은형태로 분류하였다. 또한, 각 수상돌기(dendritic shaft)의 최대 및 최소 직경을 측정하고 최소 직경을 최대 직경으로 나누어 수상돌기 두께에 대한 규칙성 지수를 산출하였다. 모든 정량화된 매개변수는 표 1에 기재되어 있다.

(4) 통계처리

모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였고, GraphPad Prism 소프트웨어(RRID: SCR_002798)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. SB-SEM 데이터의 밀도 분석에는 수상돌기 당 하나의 측정을 포함하였다. D'Agostino-Pearson 또는 Shapiro-Wilk 정규성 검정 후, 정규 분포 데이터는 Student's t-검정 또는 이원 분산 분석(ANOVA)과 사후 Tukey 검정을 사용하여 비교하였다. 비정규 분포 데이터는 Mann-Whitney U 테스트 또는 사후 Dunn의 다중 비교와 함께 Kruskal-Wallis 테스트로 비교하였다. P < 0.05 값에 대해 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

<실시예 1>

알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌피질에서 아밀로이드 축적의 영역별 차이

아밀로이드의 침착이 뇌 영역별 차이가 있는지 확인하기 위해 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌피질을 대상으로 분석하였다. 구체적으로 6개월 된 알츠하이머병 5xFAD와 정상마우스(WT)를 대상으로 mPFC 및 V1 영역에서 아밀로이드 침착 수준을 피질층 별로 구분하여 비교하였다. 여기서 5xFAD 마우스는 알츠하이머병(AD) 마우스 모델 중 하나이며, 5개의 가족성 AD-연관 돌연변이(인간 APP에서 3개, 인간 PSEN1에서 2개 돌연변이)를 발현한다. 또한 상기 마우스는 생후 6개월에 피질의 세포외 아밀로이드 침착, 비정상적인 시냅스 활성, 시냅스 마커 단백질의 발현 감소 및 인지 장애를 비롯한 신경병리학적 표현형을 나타내는 것으로 알려진 동물모델이다.

먼저, 항-Aβ 6E10 항체를 이용한 면역조직화학 분석결과, 정상마우스의 mPFC와 비교하여 5xFAD 마우스의 mPFC 영역 내 층 2/3(L2/3)에서 아밀로이드 punta 크기 및 punta 밀도가 모두 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(punta 크기, P=0.008; 밀도, P=0.008, Mann-Whitney U 테스트)(도 1A, 1C 및 1E).

한편, V1의 층 2/3(L2/3)에서는 아밀로이드 침착의 유의미한 차이가 유전형 간에서 나타나지 않았다(puncta 크기, P = 0.52, 밀도, P = 0.29, Mann-Whitney U 테스트)(도 1B, 1D 및 1F). 또한, 층 1(layer 1)의 경우, 아밀로이드 punta 크기와 밀도는 5xFAD mPFC에서는 증가한 것으로 나타났으나, V1은 그룹 사이에서 이러한 증가 현상이 나타나지 않았다(도 2A-2E).

mPFC 영역에는 층 4(layer 4)가 관찰되지 않지만, V1 영역에서는 층 4(layer 4)의 아밀로이드 침착이 정상마우스에 비해 5xFAD에서 다소 증가한 것으로 나타났다(도 2F, 2G). 층 5/6에서 아밀로이드 puncta의 크기와 밀도는 5xFAD 마우스의 mPFC와 V1 모두에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다(도 2H-2K). 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 6개월령의 정상마우스군과 알츠하이머병 5xFAD 마우스군 사이에서 아밀로이드의 침착 현상이 피질층 특이적인 차이를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2>

알츠하이머병 마우스의 mPFC에서 시냅스전(presynaptic) 미토콘드리아가 결핍된 시냅스의 선택적 손실 확인

상기 실시예 1의 실험을 통해 알츠하이머병 5xFAD 마우스 mPFC의 층 2/3에는 상당한 아밀로이드 축적이 있음을 확인한 반면, V1에는 이러한 아밀로이드 축적 현상을 확인할 수 없었다. 이에 본 발명자들은 SB-SEM을 사용하여 5xFAD 및 WT 마우스의 mPFC 및 V1의 층 2(layer 2)에 대한 흥분성 시냅스 수와 구조를 3차원 분석하였다(도 3 및 4).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 시냅스의 밀도는 정상마우스 군에 비해 알츠하이머병 5xFAD 마우스의 mPFC에서 유의하게 감소된 것으로 나타난 반면, V1에서는 이러한 차이가 나타나지 않았다(도 3A, 3B 및 표 1 참조)(mPFC, P=0.009; V1, P = 0.42; 사후 Dunn 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 테스트).

또한, 정상마우스 군 및 5xFAD 마우스 군의 mPFC에서 수상돌기 가시(spine)의 부피 및 시냅스 접촉면의 (ASI) 면적을 정량한 결과, 그룹 간 차이는 없는 것으로 나타났다(가시 부피, P = 0.62, ASI 면적, P= 0.18 ; Mann-Whitney U 테스트)(도 3C, 3D).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 알츠하이머병의 발병 초기 시, 5xFAD mPFC의 층 2(layer 2)에서 흥분성 시냅스의 숫자가 정상군에 비해 감소함을 알 수 있었다.

또한 본 발명자들은 시냅스 전 축삭말단(presynaptic bouton)의 미토콘드리아가 시냅스 활성 조절을 위한 칼슘 완충 능력과 에너지를 제공할 수 있음을 고려하여, 미토콘드리아를 함유한 시냅스가 미토콘드리아 결핍 시냅스에 비해 5xFAD mPFC에서 아밀로이드베타로 유도되는 시냅스 제거에 더 내성을 가질 수 있을 것으로 예상하였다. 이에 본 발명자들은 이러한 예상을 확인하기 위해, 시냅스전 미토콘드리아의 존재 여부에 따른 시냅스를 구분하여 분석하였다(도 5 및 표 1).

그 결과, 알츠하이머병 5xFAD mPFC에서 시냅스 전 미토콘드리아가 없는 시냅스 밀도(시냅스 수)가 특이적으로 감소한 것을 확인하였다(도 5A, 5B). 한편, V1 영역에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다. 또한, 미토콘드리아를 포함하는 시냅스의 경우, 알츠하이머병 유발여부(유전자형) 및 뇌 영역별(mPFC vs V1)에 관계없이 시냅스 밀도(시냅스 수)의 변화는 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다(도 5C)(시냅스 전 미토콘드리아가 없는 시냅스의 밀도: mPFC, P=0.045; V1, P=0.95; 시냅스 전 미토콘드리아가 있는 시냅스의 밀도: mPFC, P = 0.84; V1, P = 0.85; post-hoc Tukey 테스트를 통한 양방향 ANOVA 분석).

또한, 미토콘드리아 함유 시냅스는 유전자형이나 뇌 영역에 관계없이 미토콘드리아가 없는 시냅스에 비해 훨씬 더 큰 가시 부피와 ASI 크기를 나타내었다(도 5D-E 및 도 6A-B).(P <0.0001, post-hoc Dunn을 사용한 Kruskal-Wallis 테스트 시험).

또한 본 발명자들은 이러한 결과를 검증하기 위해 3D로 재구성된 가시(spine)를 얇은형(thin), 버섯형(mushroom), 뭉툭한 형태(stubby), 분지형(barnched) 또는 사상위족형(filopodia)의 5가지로 분류하였고 정상마우스 및 알츠하이머병 마우스의 mPFC에서 가시의 형태를 분석하였다.

그 결과, 알츠하이머병 5xFAD 마우스가 정상마우스에 비해 mPFC에서 특이적으로 얇은형 가시가 적게 존재하고 있음을 확인할 수 있었다(도 5F, 5G 및 표 1 참조)(얇은형, P = 0.03; 버섯형, P = 0.42; 분지형, P = 0.63; unpaired t-test; 뭉툭한 형태, P = 0.84; 사상위족형, P > 0.99, Mann-Whitney U 테스트).

한편, V1 영역에 대한 가시 모양의 분포에서는 그룹 간 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 6C). 미토콘드리아가 없는 축삭말단(bouton)과 접촉하는 얇은형 가시의 비율은 5xFAD mPFC를 제외하고, 유전자형이나 뇌 영역에 관계없이 미토콘드리아 함유 축삭말단(bouton)과 접촉하는 얇은 가시의 비율보다 월등히 높은 것으로 나타났다(도 5H, 도 6D)(WT, P = 0.008; 5xFAD, P = 0.12, post-hoc Tukey 테스트를 통한 양방향 ANOVA 분석), 이는 5xFAD mPFC에서 시냅스 전 미토콘드리아가 없는 얇은형 가시가 우선적으로 손실된다는 것을 의미한다. 한편, 미토콘드리아가 있거나 없는 축삭말단과 접촉하는 버섯형 가시의 비율은 유전자형이나 뇌영역에 관계없이 비슷한 것으로 나타났다(도 5I, 도 6E)(WT, P = 0.98, 5xFAD, P = 0.63, post-hoc Tukey 테스트가 있는 양방향 ANOVA 분석).

<실시예 3>

알츠하이머병 마우스의 mPFC에서 다중 미토콘드리아를 함유하는 축삭말단(bouton) 수 감소 확인

아밀로이드의 침착이 미토콘드리아 함유 시냅스의 미토콘드리아 수와 부피에 영향을 미치는 지 확인하고자, 본 발명자들은 시냅스 전 축삭말단(bouton)당 미토콘드리아의 수와 부피를 정량분석하였다.

그 결과, 도 7 및 표 1에 나타낸 바와 같이, mPFC에서의 축삭말단 당 미토콘드리아의 수는 정상 마우스에 비해 알츠하이머병 5xFAD 마우스에서 감소된 것으로 나타났다(도 7A, 7B)(mPFC, P = 0.03; V1, P > 0.99; post-hoc Dunn 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 시험).

또한, 미토콘드리아 함유 축삭말단 중에서 다중 미토콘드리아가 있는 말단의 수도 정상마우스 군에 비해 5xFAD 마우스의 mPFC에서 유의하게 낮은 것으로 나타난 반면, V1 영역에서는 이러한 현상을 확인할 수 없었다(도 7C)(mPFC, P = 0.005; V1, P = 0.89; post-hoc Tukey를 사용한 양방향 ANOVA 시험).

정상마우스군의 mPFC에서 축삭말단 당 미토콘드리아의 수와 다중 미토콘드리아를 포함하는 시냅스 밀도는 정상마우스군 및 알츠하이머병 마우스 군의 V1에 비해 높은 것으로 나타났다(도 7B, 7C)(미토콘드리아 #/축삭말단: WT-mPFC vs WT-V1, P = 0.0004; WT-mPFC vs 5xFAD-V1, P = 0.02; post-hoc Dunn 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 테스트; 2이상의 미토콘드리아를 갖는 시냅스 밀도: WT-mPFC vs WT-V1, P < 0.000 ; WT-mPFC vs 5xFAD-V1, P = 0.0007, post-hoc Tukey 테스트를 통한 양방향 ANOVA 시험).

한편, 미토콘드리아의 부피 분석에서는 질병 발병 유무 및 뇌 영역별 특별한 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다(도 7D)(P>0.38, 사후 Dunn 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 시험).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 알츠하이머병의 조기 진단 방법으로서 뇌의 특정 영역, 구체적으로 V1 영역이 아닌 mPFC의 층 2/3(layer 2/3) 영역에서의 아밀로이드 베타의 축적 정도를 분석하여 아밀로이드 베타의 축적이 관찰되는 경우, 알츠하이머병이 발병되었음을 조기에 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

뿐만 아니라 본 발명자들은 뇌의 mPFC에서 시냅스 전 미토콘드리아가 없는 시냅스의 선택적 손실여부 및 축삭말단 당 미토콘드리아 수의 분석을 통해, 시냅스 전 미토콘드리아가 없는 시냅스의 손실이 있거나, 다중(2개 이상) 미토콘드리아를 함유한 시냅스가 감소된 경우, 알츠하이머병이 발병되었다고 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

뇌의 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)의 층 2/3(layer 2/3) 영역에서의 아밀로이드 침착 여부 또는 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도를 분석하는 단계를 포함하는,
알츠하이머병의 조기 진단을 위한 정보제공방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 분석은 내측 전전두피질(mPFC; medial prefrontal cortex)의 층 2(layer 2) 영역에서의 아밀로이드 침착 여부 또는 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도 분석을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 아밀로이드 침착이 1차 시각 피질 영역(V1)이 아닌 내측 전전두피질(mPFC)의 층 2(layer 2) 영역에서 특이적으로 확인되거나 또는 층 2(layer 2) 영역에서 아밀로이드 침착이 증가된 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 미토콘드리아가 결핍된 시냅스 밀도가 1차 시각 피질 영역(V1)이 아닌 내측 전전두피질(mPFC)의 층 2(layer 2) 영역에서 특이적으로 감소되어 있는 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
다중 미토콘드리아를 함유하는 시냅스 축삭말단(presynaptic bouton)의 수가 감소된 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 다중 미토콘드리아는 2개 이상의 미토콘드리아인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
내측 전전두피질(mPFC)에서 특이적으로 시냅스 전 미토콘드리아가 결핍된 얇은형 수상돌기가시(thin spines)가 감소되어 있는 경우, 알츠하이머병이 유발된 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.