KR101623138B1 - 베타 아밀로이드 플라크 검출 및 알츠하이머 질환 진단 또는 치료용 조성물 - Google Patents

베타 아밀로이드 플라크 검출 및 알츠하이머 질환 진단 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 베타 아밀로이드 플라크 검출하기 위한 진단 조성물로서 분자량이 작고 제조방법이 간단하며, 형광 특성이 크고, 베타 아밀로이드 플라크에 대한 선택성이 매우 높으며, 베타 아밀로이드 플라크만이 아닌 단일 베타 아밀로이드에도 결합친화력이 우수하며, 임상적으로 영상 진단이 가능한 베타 아밀로이드 플라크 검출을 통한 알츠하이머 질환 진단 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

Description

베타 아밀로이드 플라크 검출 및 알츠하이머 질환 진단 또는 치료용 조성물{Compositions and methods for the detection of amyloid plaques and the diagnosis of alzheimer′s disease}
본 발명은 베타 아밀로이드 플라크 검출 및 알츠하이머 질환 진단 조성물에 관한 것이다.
우리나라는 급속한 인구의 고령화로 인하여 치매 유병률 또한 급속도로 증가하고 있다. 보건복지부의 ‘치매유병률조사’ 통계에 따르면 전국 65세 이상 치매노인 인구는 2012년 기준 52만2,000명으로 2020년에는 75만여명에 이를 것으로 예상되고 있다. 그러나 우리나라는 치매 위험성에 대한 경각심은 높지만 치매 증상에 대한 인식은 세계 평균보다 낮다는 조사결과도 있다.
특히 치매는 서서히 증상이 진행되기 때문에 조기에 병원을 찾아 정확한 진단을 받을 경우 충분한 호전 가능성이 있음에도 많은 사람들이 치료 시기를 놓치고 단시간에 중증 치매증상으로 발전하기 쉬워 이는 삶의 질이 급격히 떨어지는 것은 물론 가족들까지도 매우 큰 영향을 끼쳐 사회적 문제로도 발전하고 있어 치매의 조기진단은 매우 중요한 요소이다.
치매 환자의 약 70%는 알츠하이머병 환자이며, 수많은 연구들이 진행되면서 알츠하이머에 관여하는 단백질들이 발견되고는 있으나 그 발병 원인은 아직 명확히 알려지지는 않은 상태이다. 다만, 환자들의 사후 뇌 조직을 분석한 결과, 신경세포 사이에 베타-아밀로이드 펩타이드가 축적되어 형성된 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)와 신경세포 내의 과인산화된 타우 단백질 필라멘트에 의하여 형성된 신경섬유덩어리(neurofibrillary tangles)의 존재가 보고된 바 있다.
베타 아밀로이드는 펩타이드 36-43 개의 아미노산으로 구성되며, 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적은 뇌 손상과 신경섬유덩어리의 발달에 앞서는 조기 병인으로 이제는 정설처럼 받아드려지면서 이와 관련된 활발한 연구가 진행되고 있다.
최근에는 베타 아밀로이드 생성을 억제하거나 제거하는 방법들이 알츠하이머병의 치료법으로 연구되고 있으며, 베타 아밀로이드 플라크에 특이적으로 결합하여 새로운 베타 아밀로이드 플라크 검출용 리간드들이 개발되고 있다.
종래 개발된 베타 아밀로이드 플라크 검출 형광 리간드들은 제조과정이 매우 복잡하고, 형광 리간드들이 인산화된 타우(tau) 단백질 섬유에도 결합하여, 베타 아밀로이드 플라크에 대한 선택성이 떨어진다고 평가되고 있으며, 베타 아밀로이드와 결합 후에 형광 특성의 큰 변화를 보여 주지 못해 실질적으로 임상 진단적으로 효과를 가진 베타 아밀로이드 검출 리간드들이 개발의 가장 큰 숙제이다.
제 10-2012-0115538호
본 발명의 목적은 베타 아밀로이드 플라크 검출하기 위한 진단용 조성물로서 분자량이 작고 제조방법이 간단하며, 형광 특성이 크고, 베타 아밀로이드 플라크에 대한 선택성이 매우 높으며, 베타 아밀로이드 플라크만이 아닌 단일 베타 아밀로이드에도 결합친화력이 우수하며, 임상적으로 영상 진단이 가능한 베타 아밀로이드 플라크 검출을 통한 알츠하이머 질환 진단 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디메틸벤젠아민 유도체 화합물 또는 그의 약제학적 허용되는 염을 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014103534173-pat00001
(상기 Z는 질소 또는 붕소로부터 선택되는 헤테로원자이고,
상기 R1 내지 R2는 서로 독립적으로 수소, (C1-C10)알킬, 히드록시 또는 카르복시로 치환될 수 있다.)
본 발명의 상기 Z는 질소 또는 붕소에서 선택되는 1종의 헤테로원자이며, 상기 R1 내지 R2은 수소, (C1-C5)알킬 또는 히드록시인 것을 특징으로 하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 상기 R1 내지 R2 가 수소, 히드록시, 메틸 또는 에틸인 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1은 하기 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물로 예시할 수 있다.
Figure 112014103534173-pat00002
Figure 112014103534173-pat00003
Figure 112014103534173-pat00004
본 발명의 상기 조성물은 베타 아밀로이드 올리고머 및 베타 아밀로이드 플라크에 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 노인성 치매, 신경변성 장애 또는 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.
본 발명의 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머병, 노인성 치매, 신경변성 장애 또는 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 진단 영상제를 제공한다.
본 발명의 상기 진단 영상제를 포함하는 알츠하이머병, 노인성 치매, 신경변성 장애 또는 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 진단 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 알츠하이머 질환 진단 조성물은 아밀로이드 플라크에만 선택성을 가지도록 국한되었던 기존의 베타 아밀로이드 플라크 진단제에서 아밀로이드 플라크 뿐만 아니라, 단일 베타 아밀로이드에도 결합이 가능한 베타 아밀로이드 형광 진단 조성물을 제조함으로써, 알츠하이머의 초기 진단에 탁월한 영상효과를 가질 수 있도록 하였으며, 베타 아밀로이드와 결합 한 후 형광 특성이 현저히 증가하는 형광리간드 화합물을 함유하는 진단 조성물을 진단 영상제로서 제공함으로써 임상학적으로도 알츠하이머 질환에서 가장 중요한 조기진단이 가능하며, 진단 정확성을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 화합물의 단일 베타아밀로이드 및 복합 베타아밀로이드와 결합 전과 후의 형광세기 변화 비교 그래프이다.
도 2는 마우스 뇌 조직의 베타 아밀로이드에 대한 본 발명의 화합물의 결합친화력 측정 결과이다.
도 3은 치매유발 마우스의 뇌 및 조직 섹션에서의 본 발명의 화합물의 베타 아밀로이드 플라크 선택적 결합력을 in -vivo(인 비보) 측정한 결과이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디메틸벤젠아민 유도체 화합물 또는 그의 약제학적 허용되는 염을 포함하는 진단 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014103534173-pat00005
(상기 Z는 질소, 붕소, 산소 또는 황으로부터 선택되는 헤테로원자로 치환될 수 있으며,
상기 R1 내지 R2는 서로 독립적으로 수소, (C1-C10)알킬, 히드록실기 또는 카르복실기로 치환될 수 있다.)
본 발명의 디메틸벤젠아민 유도체인 상기 화학식 1의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물은 베타 아밀로이드와 결합하여 베타 아밀로이드 검출 형광리간드로서 매우 용이하게 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 화학식 1에서 Z는 질소 또는 붕소에서 선택되는 1종의 헤테로원자이며, 상기 R1 내지 R2는 (C1-C5)알킬, 히드록실기 중 적어도 1개를 갖는 구조일 수 있다.
본 명세서에서 용어 ‘알킬’은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, 펜틸 또는 헥실 등을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1은 하기 화합물에서 선택 될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
Figure 112014103534173-pat00006
Figure 112014103534173-pat00007
Figure 112014103534173-pat00008

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 디메틸벤젠아민 유도체는 베타 아밀로이드 검출 형광리간드로써 상기 화학식 1로 표시되는 디메틸벤젠아민 유도체 또는 그의 약제학적 허용되는 염을 포함하는 진단 조성물은 바람직하게 단일 베타-아밀로이드 또는 베타-아밀로이드 플라크에 선택적으로 결합하여 베타 아밀로이드를 검출할 수 있는 영상 진단 조성물일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 화합식 1 에서 R1 내지 R2가 보론산(boronic acid)으로 치환되는 화합물을 포함하는 영상 진단 조성물일 수 있다.
상기 영상 진단 조성물은 베타 아밀로이드 플라크에 국한된 선택성을 가진 진단제가 아닌 베타 아밀로이드 플라크 뿐만 아니라 베타 아밀로이드 올리고머(단일 베타 아밀로이드)에도 선택성을 가지는 진단제를 개발하기 위한 연구 끝에 베타 아밀로이드 올리고머와 형광리간드의 결합을 유도하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 형광리간드 화합물에 보론산(boronic acid)을 도입함으로써 베타 아밀로이드의 결합친화력이 우수한 디메틸벤젠아민 유도체 화합물을 완성하였다.
알츠하이머 치매는 베타 아밀로이드 올리고머가 플라크를 만들고 타우(tau)단백질을 유도하며 각종 혈관변성을 일으키며 발생한다. 이에 본 발명은 베타 아밀로이드 플라크에만 결합하는 것이 아니라, 플라크를 만드는 베타 아밀로이드 올리고머(단일 베타 아밀로이드)에도 선택성을 가지는 형광리간드로서의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로는 상기 디메틸벤젠아민 유도체 화합물 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 포함하는 진단 조성물은 단일 베타-아밀로이드 또는 베타 아밀로이드 플라크에 선택적으로 결합하여 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적 및 침착과 관련된 질병의 진단 또는 치료용 조성물로 제공할 수 있다.
상기 유도체 화합물 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적 및 침착과 관련된 질병의 진단 또는 치료용 조성물로써 베타 아밀로이드에 대한 높은 결합친화력, 높은 초기 뇌섭취도 및 우수한 약동학 등을 가지므로 아밀로이드 축적 및 침착과 관련된 질병을 영상학적으로 조기진단하고, 치료, 예방 또는 이의 발병을 지연시키는 치료용도로서 매우 우수한 효과를 가질 수 있다.
상기 조성물을 영상학적으로 조기진단하고, 치료, 예방 또는 이의 발병을 지연시키는 치료용도로서 사용할 시에 치료용도의 약제학적 물질과 같이 첨가제가 더 포함될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 첨가제로서는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 배합하여 투여 목적에 따라 정제, 경질 또는 연질 캡슐제, 과립제, 환제, 분말 등의 경구 투여용 제제 또는 주사제 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화 할 수 있다.
이러한 목적에 바람직한 제형으로는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 비경구투여 제제로서 주사용 용액 또는 현탁액 또는 주사기에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 주사용 제제 또는 연고제 등의 국소 투여용 제제 등이 바람직하다.
이때, 일반적으로 사용되는 충진제; 증량제; 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 습윤제; 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제; 계면활성제 등의 희석제 또는 인산이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제를 함께 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물는 베타아밀로이드 검출 형광 리간드로서 상기 화합물을 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환 또는 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적 및 침착과 관련된 질병을 진단하는 영상 진단제로서 사용될 수 있다.
기존 보고된 베타 아밀로이드 영상 진단제는 그 제조과정이 매우 복잡하고, 베타 아밀로이드 플라크만 아닌 인산화된 타우(tau) 단백질 섬유에도 결합하는 특징을 가져 베타 아밀로이드 플라크의 선택성이 부족하다는 한계점을 가진다.
이에 본 발명은 본 발명의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물을 이용하여 영상 진단제를 개발함으로써 베타 아밀로이드 플라크뿐만 아니라, 단일 베타 아밀로이드에 특이적인 선택성을 가지며, 베타 아밀로이드와 결합 후, 형광 세기가 현저히 증가하여 퇴행성 뇌질환 또는 베타 아밀로이드 축적 및 침착과 관련된 질병에 대해 진단 영상제로서의 탁월한 효과를 가질 수 있다.
상기 퇴행성 뇌질환 또는 베타 아밀로이드 축적 및 침착과 관련된 질병은 예컨대, 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증의 인지 장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 혈관병증(cerebral amyloid angiopathy), 혈관 치매(vascular dementia), 다발경색 치매(multi-infarct dementia)일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
또한 상기 영상 진단제는 베타 아밀로이드 응집물과 결합 후 형광 강도가 증가하여 형광의 방출 파장 영역이 400 내지 700 nm 의 파장 범위에서도 검출이 가능하기 때문에 표면으로부터 250 μm 깊이의 생체 세포 또는 생체 조직에서 특이적으로 베타 아밀로이드 플라크를 탐지할 수 있으므로, 생체 내외(ex vivo/in vivo)에서 베타 아밀로이드 플라크의 영상화 능력이 우수하다.
보다 구체적으로는, 상기 화학식 1로 표시되는 디메틸벤젠아민 유도체 화합물에 boronic acid를 도입한 하기 화합물이 베타 아밀로이드와 결합 친화력이 높으
Figure 112014103534173-pat00009
며, 베타 아밀로이드와 결합 후 형광세기 증가가 결합하기 전에 비해 90배 이상 증가하여 표면으로부터 깊은 생체 세포 또는 생체 조직에서 특이적으로 베타 아밀로이드를 검출할 수 있으며, 단일 베타 아밀로이드의 검출과 높은 정확도를 가질 수 있어 생체 내외(ex vivo/in vivo)의 영상화 능력이 매우 탁월한 진단 영상제로 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 양태로는 상기 진단 영상제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 베타 아밀로이드 축적 및 침착과 관련된 질병의 진단 또는 치료용 키트를 제공할 수 있다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩(chip) 키트, 마이크로어레이 또는 단백질 칩(chip) 키트인 것을 특징으로 하나 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 진단 또는 치료용 키트는 상기 퇴행성 뇌질환 또는 베타 아밀로이드 축적 및 침착과 관련된 질병의 진단 또는 치료용 조성물이나, 진단 영상제를 사용하여 당업계에서 사용되는 통상의 방법으로 키트를 제조할 수 있다.
이하, 본 발명에서는 실시예 및 비교예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 예시적으로 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
[실시예 1-3] 디메틸벤젠아민 유도체 화합물의 합성
Figure 112014103534173-pat00010

1-(5-(4-(디메틸아미노)페닐)퓨란-2-일)에탄온(화합물 b)의 합성
5-브로모-2-아세틸퓨란(화합물 a)(1.6 g,8.5 mmol)이 용해된 DME 용액에 4-(디메틸아미노)벤젠보로닉산(4-(dimethylamino)benzeneboronic acid)(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)을 첨가하였다. 2M Na2CO3 (10mL)에 용액에 Pd(PPh3)4(0.98 g, 0.85 mmol)를 녹인 후, 상기 용액에 더 첨가하고 12시간동안 질소 하에서 환류 시켰다. 상기 용액은 에틸아세테이트로 추출하였고, 물로 워싱한 후, MgSO4상에서 건조시켰다. 용매를 진공에서 증발시킨 후, 잔류물을 크로마토그래피(chromatographed)로 분석하여(SiO2, EtOAc/ n-hexane=4/1(v/v)), 상기 화합물 b를 수득하였다(1.3g, 71%).
디메틸벤젠아민 유도체 화합물의 합성
상기 제조된 상기 1-(5-(4-(디메틸아미노)페닐)푸란-2-일)에탄온(화합물 b) 및 상응하는 4-벤즈알데하이드(4-benzaldehyde)(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)가 용해된 DMF 용액에 0℃에서 5 N NaOH (50 mL)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 출발 물질들이 사라질 때까지 8시간동안 실온에서 스터링(stirring)하였다. 이후, 반응 혼합물을 차가운 얼음물에 넣은 다음, 1 N HCl으로 pH 6이 되도록 조절하였다. 생성된 침전물은 여과하였고, 잔류물을 chromatographed하여(SiO2, EtOAc/ n-hexane=1/4(v/v)), 하기 표 1의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물을 수득하였다.
디메틸벤젠아민 유도체 화합물
실시예 1 (4-((E)-3-(5-(4-(디메틸아미노)페닐)퓨란-2-일)프로프-1-에닐)페닐브로닉산)
(4-((E)-3-(5-(4-(dimethylamino)phenyl)furan-2-yl)prop-1-enyl)phenylboronic acid)
Figure 112014103534173-pat00011

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6,d, ppm): 2.96 (6H, s), 6.77 (2H, d, J = 9.2 Hz), 6.96 (1H, d, J = 3.7 Hz), 7.68 (2H, m), 7.71 (2H, m), 7.77 (2H, m), 7.84 (2H, m), 7.88 (1H, d, J = 3.7 Hz), 8.11 (OH, s); 13CNMR(125MHz,DMSO-d6, d, ppm): 39.8, 105.4, 111.9, 116.3, 122.6, 122.8, 126.2, 127.5, 134.5, 135.9, 141.5, 150.9, 151.2, 159.4, 162.2, 175.1; ESI-MS (M + H) m/z = 362.0.
실시예 2
(E)-3-4-(디에틸아미노)페닐)-1-(5-4-(디메틸아미노)페닐)퓨란-2일)프로프-2-엔-1-온)
(E)-3-(4-(diethylamino)phenyl)-1-(5-(4-(dimethylamino)phenyl)furan-2-yl)prop-2-en-1-one
Figure 112014103534173-pat00012


1H NMR (500 MHz, CDCl3,d, ppm): 1.20 (6H, t, J = 7.1 Hz), 3.03 (6H, s), 3.41 (4H, q, J = 7.1 Hz), 6.59 (1H,d, J = 3.7 Hz), 6.66 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.75 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.28 (1H, d, J = 15.4 Hz),, 7.33 (1H, d, J = 3.7 Hz ), 7.54 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.71 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.82 (H, d, J = 15.4 Hz); 13CNMR(125MHz,CDCl3,d, ppm): 12.6, 40.2, 44.5, 104.9, 111.3, 112.0, 116.2, 117.9, 119.4, 122.2, 126.3, 130.6, 143.6, 149.5, 150.8, 152.5, 158.7, 177.4; ESI-MS (M + H) m/z = 389.1.
실시예 3
(E)-3-(4-이메틸아미노)페닐)-1-(5-4-(디메틸아미노)페닐)퓨란-2-일)프로프-2-엔-1-온)
(E)-3-(4-(dimethylamino)phenyl)-1-(5-(4-(dimethylamino)phenyl)furan-2-yl)prop-2-en-1-one
Figure 112014103534173-pat00013


1H NMR (500 MHz, CDCl3,d, ppm): 3.03 (6H, s), 3.04 (6H, s), 6.61 (1H, d, J = 3.7 Hz), 6.71 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.74 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.31 (1H, d, J = 15.4 Hz),, 7.34 (1H, d, J = 3.7 Hz ), 7.57 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.72 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.84 (H, d, J = 15.4 Hz); 13CNMR(125MHz,CDCl3,d, ppm): 40.1, 40.2, 104.9, 111.8, 112.0, 116.7, 117.8, 119.6, 123.0, 126.3, 130.3, 143.6, 150.1, 151.9, 152.5, 158.8, 177.3; ESI-MS (M + H) m/z = 361.1.
[실시예 4] 베타 아밀로이드에 대한 디메틸벤젠아민 유도체 화합물의 형광특성 평가.
상기 실시예 1~3의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물의 단일 베타아밀로이드 및 복합 베타 아밀로이드와 결합 전과 후의 형광세기 변화를 측정하기 위한 실험을 진행하였다.
표 1의 화합물을 단일 베타아밀로이드 및 복합 베타아밀로이드와 각각 상온에서 15분 동안 교반하여 결합하도록 한 후, 결합하기 전의 화합물의 형광세기와 결합 후 형광세기를 비교하여 그 결과를 하기 표 2와 도면 1에 나타내었다.
(1) Aβ42 피브릴(fibril)의 제조
Aβ펩타이드는 pH7.4 PBS 버퍼 용액에 최종농도 100μM로 Aβ42(rPeptide (Bogart, GA, 30622))를 녹인 다음, 실온에서 3일동안 1200rpm으로 마그네틱바를 사용하여 교반(stirring)하였다. Aβ피브릴의 형성은 ThT assay에 의해 확인하였다.
(2) in vitro 내에서 본 발명의 화합물들의 형광 스펙트라 측정
본 발명에 따른 실시예 1 내지 3 의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물 3종의 최대 여기(Excitation) 및 방출(emission) 파장 λmax를 SpectraMax M2(Molecular Devices)로 측정하였다. PBS 버퍼용액에 상기 방법에 의해 제조한 10 mM의 Ab42 피브릴, 5μM 의 실시예 1 내지 3의 화합물을 최종농도로 사용하였다. 일반적으로 여기 λmax 는 고정된 첫 방출을 스캐닝하는 것에 의해 결정되고, 방출 λmax는 고정된 λem로 여기 스펙트럼을 스캐닝하는 것에 의해 결정된다.
그 결과 응집 Aβ 펩티드에 대하여 형광 반응성과 관련하여, 실시예 1 내지 3의 FAβ/F0 수치가 각각 93.62, 58.9 및 48.9로 높은 형광특성을 가지는 것으로 나타났다(표 2). 또한 도 1에서는, 본 발명에 따른 화합물이 아밀로이드 플라크와 결합 전 후의 방출 파장이 확연한 차이가 있음을 시사한다.
(3) 결합 친화력 측정(ement of binding affinity (Kd)).
10 μM의 응집 Aβ42 펩티드를 이용하여 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물 3종에 대한 해리상수(Kd)를 측정하였다. 응집된 Aβ42(10μM 최종 농도)는 PBS 버퍼에서 다양한 농도의 각 화합물들과 혼합하였다(10, 5, 2.5, 1.25, 0.5 μM). GraphPad Prism을 이용하여 비선형 회귀 분석(nonlinear regression analysis)을 실시하였다. 해리 상수(Kd)는 가장 잘 적합화된 곡선으로부터 얻었다.
하기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 화합물의 Kd 값이 모두 2.5 이하로 Aβ42에 대하여 높은 결합 친화도를 가지는 것으로 나타났다. 바람직한 아밀로이드 응집물 검출용 화합물이 되기 위해서는 우선적으로 베타 아밀로이드에 대해서 결합 친화도가 높아야 하는데, 본 발명에 따른 화합물들이 높은 결합 친화도를 가지는 것을 볼 때, 우수한 아밀로이드 검출용 프로브로서 가능성이 있음을 알 수 있다.
Figure 112014103534173-pat00014
상기 표 2는 도 1의 형광세기 결과를 수치로 나타낸 표이며, 실시예 1 내지 3의 화합물을 베타 아밀로이드와 결합시켰을 시에 상기 화합물의 형광세기가 급증하였으며, 실시예 1의 경우, 베타 아밀로이드와 결합 후 형광세기가 약 90배 이상 증가하는 것을 나타내고 있다.
[실시예 5] 본 발명의 디메틸벤젠아민 유도체 화합물을 이용한 알츠하이머 질환모델 마우스의 뇌 조직절편 인비보 영상화 (in vivo imaging) 실험.
(1) 실시예 1의 화합물을 이용한 일반마우스와 치매유발 마우스의 베타 아밀로이드 검출 영상화 비교 실험.
생후 13개월 된 치매유발 마우스와 일반 마우스의 꼬리 정맥에 실시예 1의 화합물을 주입하고 30분 후, 각 마우스의 브레인(Brain) 및 각 장기들을 적출하여 형광 이미지 촬영(Maestro 2.0 in vivo imaging system(Cambridge Research & Instrumentation, Woburn, MA)을 수행하였다. 도 2의 결과로 보아, 일반 마우스에 정맥 주사한 후 적출한 뇌 조직에서는 형광이 검출되지 않았으나, 치매유발 마우스에 정맥 주사한 후 적출한 뇌 조직에서는 뇌 조직에 다발적으로 존재하는 베타 아밀로이드 플라크에 실시예 1의 화합물이 결합하여 높은 형광 세기를 나타냄을 확인할 수 있는 결과이다.
(2) 실시예 1 내지 3의 화합물을 이용한 치매유발 마우스의 뇌 조직절편 형광이미지 실험.
질환모델 마우스를 이용한 실시예 1 내지 3의 화합물들의 인비보(in-vivo) 진단 영상제로서의 결합친화력을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
생후 13개월 된 치매유발 마우스의 꼬리 정맥에 실시예 1 내지 3의 화합물을 주입하고 30분 후, 각 마우스의 브레인(Brain) 및 각 장기들을 적출하여 뇌 조직을 두께 20um로 절편하여 뇌 섹션 조직에서의 실시예 1 내지 3의 화합물과 결합한 베타 아밀로이드 플라크를 확인하기 위해 형광 이미지(laser confocal scanning microscope)를 촬영하였다. 그 결과를 도 3에 나타내고 있다. 적출한 뇌 조직을 형광 현미경으로 촬영한 결과, 실시예 1 내지 3의 화합물이 베타 아밀로이드가 축적되어 있는 병변을 정확히 검출(Detection)하고 있음을 알 수 있는 결과이다.

Claims (8)

  1. 하기 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 베타 아밀로이드 검출용 조성물로서,
    Figure 112016030179405-pat00022

    Figure 112016030179405-pat00023
    및
    Figure 112016030179405-pat00024

    상기 베타 아밀로이드는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증의 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 혈관 치매 및 다발경색 치매로 이루어진 군에서 선택되는 질환에서 생성되는 베타 아밀로이드인 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 영상화제.
  8. 삭제
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