JP2023551508A - カスパーゼ阻害剤を含有する注射用組成物及びその製造方法 - Google Patents

カスパーゼ阻害剤を含有する注射用組成物及びその製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、カスパーゼ阻害剤を含有する注射用医薬組成物及びその製造方法に関し、より詳細には、有効成分としてカスパーゼ阻害剤である（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）を含むミクロスフェア；を含む注射用医薬組成物、及びその製造方法に関する。

Description

本発明は、カスパーゼ阻害剤を含有する注射用医薬組成物及びその製造方法に関し、より詳細には、有効成分としてカスパーゼ阻害剤である（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）を含むミクロスフェア；を含む注射用医薬組成物、及びこれの製造方法に関するものである。
カスパーゼは、酵素の一種で、α２β２四量体として存在するシステインプロテアーゼである。カスパーゼ阻害剤は、これらのカスパーゼの活性を阻害し、それによってカスパーゼの作用によって引き起こされる誘発される炎症やアポトーシスを制御する化合物である。これらの化合物の投与により症状が除去又は軽減される疾患には、骨関節炎、リウマチ性関節炎、変性性関節炎、破壊性骨障害、肝炎ウィルスによる肝疾患、急性肝炎、肝硬変、肝炎ウィルスによる脳損傷、ヒト劇症肝不全、敗血症、臓器移植拒絶反応、虚血性心臓疾患、認知症、脳卒中、ＡＩＤＳによる脳損傷、糖尿、胃潰瘍などがある。
カスパーゼ阻害剤として、下記式（１）の（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミドが、有効なカスパーゼ阻害剤として注目されている。
しかし、前記式（１）の化合物を経口剤型で投与する場合、式（１）の化合物が全身にいきわたるだけでなく、関節腔内にほとんど侵入しないため、薬物送達効率が低い。従って、関節腔内の式（１）の化合物の濃度を長期間維持できる、高い薬物送達効率を有する新しい製剤の開発が求められている。
したがって、本発明の技術的課題は、カスパーゼ阻害剤である式（１）の（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミドの関節腔内の濃度を長期間維持できる高い薬物送達効率を有する注射用組成物を提供することである。
また、本発明の別の課題は、前記注射用組成物を効率的に製造することができる方法を提供することである。
前記課題を解決するために、本発明では、有効成分として下記式（１）の（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）；を含むミクロスフェアを含む注射用医薬組成物を提供する。
また、前記別の課題を解決するために、本発明では、（ｉ）有効成分として（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）を有機溶媒に溶解して分散相を製造する工程；（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた分散相を連続相に加えることによりエマルションを製造する工程；及び（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られたエマルションから溶媒を除去し、硬化してミクロスフェアを製造する工程；を含む注射用医薬組成物の製造方法を提供する。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の一態様によれば、有効成分として前記式（１）の（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド（以下、「式（１）の化合物」と称する）又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）；を含むミクロスフェアを含む注射用医薬組成物を提供する。
本発明において、前記式（１）の化合物は、薬学的に許容される塩を形成することができる。薬学的に許容される塩としては、薬学的に許容されるアニオンを含有する無毒性酸付加塩を形成する酸、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などの有機酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などのスルホン酸などによって形成された酸付加塩が含まれる。また、薬学的に許容されるカルボン酸塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどによって形成されたアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩；リシン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン、トリエチルアミンなどの有機塩などが含まれる。本発明による式（１）の化合物は、常法によりその塩に転換することができる。
一方、本発明による化合物は、不斉炭素中心と不斉軸又は不斉平面を有することができるので、Ｅ又はＺ異性体、Ｒ又はＳ異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体混合物及び各ジアステレオ異性体として存在することができ、これらはすべての本発明の範囲内である。
本明細書では、特に断りのない限り、「式（１）の化合物」という用語は、式（１）の化合物、その薬学的に許容される塩及び異性体をすべて含む意味するために使用される。
本発明の一実施形態において、式（１）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体と、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比は、５～２０：８０～９５であってもよい。本発明の一実施形態において、式（１）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体と、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比は７～１８：８２～９３であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記生体適合性高分子として、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）は、触媒の存在下での開環重合によってラクチドとグリコリドから重合されることができる。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、４０：６０～９０：１０であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、７０：３０～９０：１０であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、５０：５０であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、７５：２５であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、８５：１５であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）は、ラクチドとグリコリドとの異なるモル比を有する混合物中で使用することができる。例えば、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとしては、ラクチドとグリコリドとのモル比が５０：５０のものとラクチドとグリコリドとのモル比が７５：２５のものを混合して使用してもよく、又はラクチドとグリコリドとのモル比が７５：２５のものと８５：１５のものを混合して使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の分子量は、２０～５００ｋＤａであってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の分子量は、７０～２００ｋＤａであってもよい。
本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）は、末端基としてエステル又は酸、より好ましくは、末端基としてエステルを有していてもよい。
本発明の一実施形態において、注射用医薬組成物は、溶媒をさらに含むことができる。溶媒の例には、水（注射用水）、生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の注射用医薬組成物は、必要に応じて、分散剤、湿潤剤又は懸濁剤などの他の成分をさらに含むことができる。
本発明の注射用医薬組成物により予防又は治療できる疾患としては、アポトーシス関連疾患、炎症疾患、骨関節炎、リウマチ性関節炎、変性性関節炎及び破壊性骨障害が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、本発明による注射用医薬組成物は、骨関節炎の予防、治療又は鎮痛のために使用することができる。
本発明の別の態様によれば、（ｉ）有効成分として（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）を有機溶媒に溶解して分散相を製造する工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた分散相を連続相に加えることによりエマルションを製造する工程；及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られたエマルションから溶媒を除去し、硬化してミクロスフェアを製造する工程；を含む注射用医薬組成物の製造方法が提供される。
本発明の一実施形態において、前記工程（ｉ）において、式（１）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体と、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比は、５～２０：８０～９５であってもよい。本発明の一実施形態において、式（１）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体、とポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比は、７～１８：８２～９３であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は４０：６０～９０：１０であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は７０：３０～９０：１０であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、５０：５０であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、７５：２５であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比は、８５：１５であってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）は、ラクチド対グリコリドの異なるモル比を有する混合物中で使用することができる。例えば、記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）としては、ラクチとグリコリドとのモル比が５０：５０のものとラクチとグリコリドとのモル比が７５：２５のものを混合して使用してもよく、又はラクチドとグリコリドのモル比が７５：２５のものと８５：１５のものを混合して使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の分子量は、２０～５００ｋＤａであってもよい。本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の分子量は、７０～２００ｋＤａであってもよい。
本発明の一実施形態において、前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）は末、端基としてエステル又は酸、さらに好ましくは末端基としてエステルを有することができる。
本発明の一実施形態において、前記工程（ｉ）において、有機溶媒は、ジクロロメタン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酢酸、塩酸、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン、酢酸プロピル、酢酸メチル及びこれらの混合物から選ばれることが使用されることができる。
本発明の一実施形態において、前記工程（ｉ）において、有機溶媒は、ジクロロメタン、酢酸エチル及びこれらの混合物から選ばれるものを使用することができる。本発明の一実施形態において、前記工程（ｉ）において、有機溶媒は、ジクロロメタンと酢酸エチルの混合物を使用することができる。本発明の一実施形態において、前記ジクロロメタンと酢酸エチルの混合比は、９：１であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記工程（ｉｉ）の連続相は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液であってもよい。例えば、０．５重量％ポリビニルアルコール溶液、１重量％ポリビニルアルコール溶液又は２重量％ポリビニルアルコール溶液を使用することができる。本発明の一実施形態において、前記工程（ｉｉ）の連続相は、酸を用いてｐＨ３～５に調整することができる。本発明の一実施形態において、前記工程（ｉｉ）における連続相は、酸を用いてｐＨ４に調整することができる。本発明の一実施形態において、前記酸は酢酸であってもよい。
本発明の一実施形態において、前記工程（ｉｉ）のエマルションの製造は、ホモジナイザー、インクジェット印刷又は膜乳化法で行うことができるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、前記膜乳化法は、ＳＰＧ（シラス多孔質ガラス）膜を用いて行うことができる。
本発明では、カスパーゼ阻害剤である式（１）の化合物を含む注射用医薬組成物を提供することにより、関節腔内の式（１）の化合物濃度を長期間維持できる生分解性徐放性薬物送達システムを提供することができる。
実施例１～３で製造されたミクロスフェアを走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影した写真である。 実施例４～２３で製造されたミクロスフェアを光学顕微鏡で撮影した写真である。 実施例２４及び２５で製造されたミクロスフェアを走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影した写真である。 ジクロロメタン（ＤＣＭ）／酢酸エチル（ＥＡ）の比による分散相の密度及び式（１）の化合物の溶解度を示すグラフである。 実施例２６～２９で製造されたミクロスフェアの性状及び粒度分布を示す結果である。 実施例２６～２９で製造されたミクロスフェアのインビトロ溶出試験結果を示すグラフである。 実施例３０～３２で製造されたミクロスフェアの性状及び粒度分布を示す結果である。 実施例３０～３２で製造されたミクロスフェアのインビトロ溶出試験結果を、実施例２６、２８及び２９で製造されたミクロスフェアのインビトロ溶出試験結果と比較して示すグラフである。 実施例３３～３６で製造されたミクロスフェアを光学顕微鏡で撮影した写真である。 実験例１３における垂直及び水平撹拌の比較を示す図でる。 実験例１３における垂直及び水平撹拌によるインビトロ溶出試験結果を示すグラフである。 実施例３８で製造されたミクロスフェアのＰＫ試験結果を示すグラフである。 実施例３８及び比較例１で製造されたミクロスフェアのＰＯＣ（proof of concept）試験結果を示すグラフである。
以下、製造例及び実施例により本発明をより具体的に説明する。ただし、これら実施例は単なる例示であり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
製造例：（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミドの合成
（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド（以下、「試験化合物」と称する）は、国際公開番号ＷＯ２００６／０９０９９７号に開示されているのと同じ方法に従って合成した。
実施例１～３：ホモジナイザーを使用したミクロスフェアの製造
下記表１に示す組成に従って、関節腔投与用の薬物徐放性担体である試験化合物が封入されたミクロスフェアを製造した。
試験化合物とＰＬＧＡの重量比は、表１に示すように約１：１０に秤量し、これに有機溶媒ジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えて撹拌して分散相を製造した。使用されたＰＬＧＡは、Ｌ／Ｇ比が５０：５０、分子量（Ｍ．Ｗ．）が３２，０００であった。
連続相としては、０．５％ポリビニルアルコール（Ｍ．Ｗ．３１，０００～５０，０００、加水分解度８７～８９％）５０ｍＬを使用した。分散相を連続相に入れ、ホモジナイザーでｒｐｍ（８，０００～２０,５００）に応じてエマルション粒径を調整した。
製造されたエマルションは、４時間撹拌し、有機溶媒を気化してエマルションを硬化させてミクロスフェアを製造した。
実験例１：ミクロスフェアの性状分析
実施例１～３で製造されたミクロスフェアの性状を走査電子顕微鏡を使用して分析し、その結果を図１に示した。
図１から分かるように、製造されたミクロスフェアは、数μｍから１００μｍ以上の粒子分布をし、ホモジナイザーの回転速度に応じて粒径が小さくなる傾向があった。したがって、回転速度に応じて粒径を調整できることが分かった。
実施例４～２３：インクジェット印刷を使用したミクロスフェアの製造
分散相溶液をインクジェットヘッドに充填後、ヘッド表面を連続相で濡らし、適切な頻度の流量で噴射を行った。
表２に示すように、分散相のＰＬＧＡ比率は、１０重量％～３３重量％、周波数は０．５ｋＨｚ～３ｋＨｚ、流量は５ｍＬ／分～２０ｍＬ／分であった。ＰＬＧＡとして、５０５０ＤＬＧ４．５Ｅ（Ｌ／Ｇ比５０：５０、Ｍ．Ｗ．６２，０００、エステル末端）を使用した。
実験例２：ミクロスフェアの性状分析
実施例４～２３で製造されたミクロスフェアの性状を光学顕微鏡を使用して分析し、その結果を図２に示した。
図２から分かるように、周波数及び流量に応じてエマルション粒径が調整されることが確認された。分散相濃度（粘度）高くなると、噴射速度が遅い領域で粒子形成が可能となり、ノズル詰まりが発生した。特に、大きくて底粘度（ＰＬＧＡ１０重量％、約３ｃｐ以下）又は高粘度（約８０ｃｐ以上）の分散相では粘度の影響が大きく、適用は困難であると考えられた。
実施例２４及び２５：ＳＰＧ膜を用いたミクロスフェアの製造
下記３の組成に従ってミクロスフェアを製造した。
試験化合物を封入（実施例２５）する場合、表３に示すように、試験化合物とＰＬＧＡの重量比が約１：１０になるように秤量し、有機溶媒ジクロロメタン（ＤＣＭ）１０ｍＬを加えて撹拌して分散相を製造した。使用されたＰＬＧＡは、Ｌ／Ｇ比が５０：５０、分子量（Ｍ．Ｗ．）が３２，０００であった。連続相として、０．５％ポリビニルアルコール（Ｍ．Ｗ．３１，０００～５０，０００、加水分解度８７～８９％）１５０ｍＬを使用した。
シラス多孔質ガラス（ＳＰＧ）装置及び孔径２０μｍの親水性膜を製造し、作業圧力は１．３ｋＰａ～２．１ｋＰａであった。
実験例３：ミクロスフェアの性状分析
実施例２４及び２５で製造されたミクロスフェアの性状を走査電子顕微鏡を使用して確認し、その結果を図３に示した。
図３から分かるように、製造されたミクロスフェアの大きさが２０μｍ～６０μｍ、ＳＰＧ膜を介してミクロスフェアをかなり均一な粒子に製造することができるが分かった。
実験例４：連続相に応じたＡＰＩ損失のテスト
一定の量の試験化合物（ＡＰＩ）を有機溶媒（ジクロロメタン、ＤＣＭ）に溶解して分散相を製造し、製造された分散相は、それぞれの連続相に１ｍＬずつ加えて撹拌し、その量を測定した。連続相に抽出されたＡＰＩの量を確認し、その結果を表４に示した。
連続相中のエマルションの安定化剤として使用されるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の濃度が増加するにつれて、連続相に抽出されたＡＰＩの量が増加した。高濃度のＰＶＡが連続相中で可溶化剤として作用し、ＡＰＩの溶解度を高めると判断された。また、酸性条件下で溶解度が低いＡＰＩの特性から、１重量％のＰＶＡに１ＮのＨＣｌを加えると、ＡＰＩの抽出量が減少することが確認された。
実験例５：分散相適合性の評価
試験化合物の溶解度が低いため、分散相の温度変化がわずかでも試験化合物の析出が発生することを確認された。そこで、各種溶媒の物理化学的特性を確認し、分散相として使用するのに適した溶媒を見つけることを試み、溶解度、エマルションの安定性、水への溶解度、密度、沸点及び適性を試験した結果を表５に示した。
各溶媒（１０ｍＬ）に試験化合物を少量加え、溶解しなくなる時点の濃度を確認した。既存処方の分散相に使用されたジクロロメタン（ＤＣＭ）の場合、約２０．０ｍｇ／ｍＬの溶解度を示し、ほとんどの溶媒はそれより高い溶解度を有することが確認された。
連続相（ＰＶＡ １ｗｔ％）に同量の有機溶媒を加えてエマルションを製造し、エマルションの凝集／相分離を経時的に確認した。ジクロロメタン、酢酸ブチル（ＢＡ）、プロピオン酸メチル（ＭＰ）は、エマルションの安定性を長時間維持することが確認された。
各溶媒の物理化学的特性を文献等により確認した。エマルションの硬化過程で、有機溶媒の一部が水相に溶解し、空気中に蒸発することから、水への溶解度及び沸点を確認した。また、形成されたエマルションの密度が低すぎると、連続相の表面にエマルションが浮び上がり、表面に高分子膜が形成される可能性があると判断して、溶媒の密度を確認した。
ミクロスフェア製造に広く使用される溶媒であるジクロロメタン（ＤＣＭ）と酢酸エチル（ＥＡ）の共溶媒比に応じた密度及び溶解度を測定した結果を図４に示した。
分散相の密度が連続相（ＰＶＡ水溶液）の密度よりも低い場合、エマルションが水相の表面で固まり、高分子膜が形成される場合がある。したがって、図４に示すように、密度が高く、試験化合物の溶解度が高い条件のＤＣＭ／ＥＡ（９：１）共溶媒が好ましいことが分かった。
実施例２６～２９：ミクロスフェアの製造（ＰＬＧＡの特性に応じた効果の評価）
ＰＬＧＡは乳酸とグリコール酸の共重合体であり、両単量体の重合比（Ｌ／Ｇ比）と分子量が分解や薬物の放出に影響を及ぼすことが知られている。異なるＬ／Ｇ比及び分子量、末端基を有するＰＬＧＡを適用して試験化合物ミクロスフェアを製造し、薬物放出に対するＰＬＧＡ特性の影響を評価した。
ミクロスフェアの製造にはＳＰＧ膜装置を使用し、表６の条件で４種のミクロスフェアを製造した。また、ＰＬＧＡの特性の影響を評価するために、分散相及び連続相の組成、硬化条件、工程条件は可能な限り同一にした。
試験化合物とＰＬＧＡの重量比は、表６に示すように、約１６．７：８３．３となるように秤量した。ＰＬＧＡと有機溶媒ジクロロメタン（ＤＣＭ）の重量比１：１０で加え、撹拌して分散相を製造した。
使用されたＰＬＧＡは以下の４種類である。
ａ．５０５０ ＤＬＧ ４．５Ｅ（Ｌ／Ｇ比５０：５０、Ｍ．Ｗ．６２，０００、エステル末端）
ｂ．７５２５ ＤＬＧ ４Ａ（Ｌ／Ｇ比７５：２５、Ｍ．Ｗ．５１，０００、酸末端）
ｃ．７５２５ ＤＬＧ ４Ｅ（Ｌ／Ｇ比７５：２５、Ｍ．Ｗ．５２，０００、エスエル末端）
d．７５２５ ＤＬＧ ８Ｅ（Ｌ／Ｇ比７５：２５、Ｍ．Ｗ．１３３，０００、エステル末端）
連続相には２％ポリビニルアルコール（Ｍ．Ｗ．３１，０００～５０，０００,加水分解度８７～８９％）１５０ｍＬを使用し、酢酸を用いてｐＨを３に調整した。膜乳化法によりエマルションを製造し、その際の圧力は５．０～６．０ｋＰａ、回転速度１６０～１６５ｒｐｍで約３時間噴射した。エマルションを最初に３５℃で１時間、次に２５℃で１５時間撹拌しながら溶媒を除去することによって、ミクロスフェアを製造した。
実験例６：ミクロスフェアの性状分析
実施例２６～２９で製造されたミクロスフェアの性状を走査電子顕微鏡法を使用して分析し、粒度を粒度分析装置を利用して粒度分布曲線（ＰＳＤ）を測定した。その結果を図５に示した。
図５から分かるように、実施例２６～２９で製造された微粒子はいずれも表面が滑らかで、形状が球状であることが確認された。また、実施例２６～２９で製造されたミクロスフェアはいずれも、その大きさが約４０～７０μｍであり、スパン値が１．０以下の均一な粒度分布を有することが確認された。
実験例７：ミクロスフェアのインビトロ溶出試験
実施例２６～２９で製造されたミクロスフェアを透析膜に入れ、１ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を入れたチューブ中で溶出を行った。所定の日にチューブ内の溶出液を採取し、ろ過した後、放出された薬物の量をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により測定した。約４５日間溶出を行い、封入量に対する溶出量の百分率を表すことにより累積溶出を算出し、その結果を図６に示した。
乳酸比及び固有粘度（ＩＶ）値が高いと薬物の放出が遅れることが確認された。また、ＰＬＧＡの末端基がエステルの場合、酸の場合よりも放出遅延効果が高く、ＰＬＧＡの種類に関わらず特定の時点でバーストが起こるが発生する二峰性相を示した。最終溶出率は低く（約５０～７０％）、これは試験化合物が塩基性条件（溶出液：１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４）下での試験化合物の安定性が低いためであると考えられた。
実施例３０～３２：大きなミクロスフェアの製造
実施例２６、２８及び２９よりの大きなミクロスフェアを製造した。ミクロスフェアの製造には、ＳＰＧ膜装置を使用したし、表７に記載の条件で３種のミクロスフェアを製造した。また、粒子径による効果を確認するため、実施例２６,２８及び２９と工程圧力を除いた他の条件（分散相及び連続相の組成、硬化条件、工程条件など）は、できるだけ同様に行った。
試験化合物とＰＬＧＡの重量比は表７に示すように約１６．７：８３．３となるように秤量した。ＰＬＧＡと有機溶媒ジクロロメタン（ＤＣＭ）の重量比１：１０で加え、撹拌して分散相を製造した。
使用されたＰＬＧＡは以下の３種類である。
ａ．５０５０ ＤＬＧ ４．５Ｅ（Ｌ／Ｇ比５０：５０、Ｍ．Ｗ．６２，０００、エステル末端）
ｂ．７５２５ＤＬＧ ４Ｅ（Ｌ／Ｇ比７５：２５、Ｍ．Ｗ．５２，０００、エステル末端）
ｃ．７５２５ ＤＬＧ ８Ｅ（Ｌ／Ｇ比７５：２５、Ｍ．Ｗ．１３３，０００、エステル末端）
連続相には２％ポリビニルアルコール（Ｍ．Ｗ．３１，０００～５０，０００、加水分解度８７～８９％）１５０ｍＬを使用し、酢酸を用いてｐＨ３に調整した。膜乳化法によりエマルションを製造し、その際の圧力は０．８～１．０ｋＰａ、回転速度１５０～１５４ｒｐｍで約１時間噴射した。エマルションを最初に３５℃で１時間、次に２５℃で１５時間撹拌しながら溶媒を除去することによって、ミクロスフェアを製造した。
実験例８：ミクロスフェアの性状分析
実施例３０～３２で製造されたミクロスフェアの性状を走査電子顕微鏡を使用して確認し、粒度を粒度分析器を利用して粒度分布曲線（ＰＳＤ）を確認して、その結果を図７に示した。
図７から分かるように、実施例３０～３２で製造された微粒子はいずれも表面が滑らで、形が球状であることが確認された。また、実施例３０～３２で製造されたミクロスフェアは、Ｄ（０．１）５８～６４μｍ、Ｄ（０．９）１００～１７０μｍ程度であり、スパン値は０．５～１．２の広い粒度分布を有することが確認された。
実験例９：ミクロスフェアのインビトロ溶出試験
実施例３０～３２で製造されたミクロスフェアを透析膜入れ、１ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を入れたチューブ中で溶出を行った。所定の日にチューブ内の溶出液を収集し、ろ過した後、放出された薬物の量をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により測定した。約４５日間溶出を行い、封入量に対する溶出量の百分率で累積溶出を計算し、その結果を実施例２６、２８及び２９のインビトロ溶出試験結果と比較した。結果を図８に示し、サイズによる効果を分析した。
ミクロスフェアの粒径が大きい場合に比べて、ミクロスフェアの粒径が小さい場合には、最初から破裂が起こる前の工程まで比較的早く薬物放出量が現れた（初期傾き）。特に、ＰＬＧＡのＬ／Ｇ比が５０：５０の場合、粒径がさらに小さいほど破裂時点が約２日早くなった。
このことから、粒子が小さいと同じ質量の表面積が大きくなるため、ＰＬＧＡ粒子表面の薬物の放出が早くなり、より多くのＰＬＧＡが水にさらされるため、ＰＬＧＡはより早く加水分解され、内部の薬物破裂する時間も早くなる可能性がある。
実施例３３～３６：ミクロスフェアのスケールアップ製造
ミクロスフェアの製造には、ＳＰＧ膜装置を使用し、表８に記載の条件で４種のミクロスフェアを製造した。
ＰＬＧＡと有機溶媒ジクロロメタン（ＤＣＭ）の重量比１：１０で加え、撹拌して分散相を製造した。使用されたＰＬＧＡは、ＲＧ５０４（Ｌ／Ｇ比＝５０／５０、ＭＷ＝３８，０００～５４，０００、エステル末端）であった。連続相には０．５％ポリビニルアルコール（Ｍ．Ｗ．３１，０００～５０，０００、加水分解度８７～８９％）５，１００ｍＬを使用した。膜乳化法によりエマルションを製造し、この際の圧力は０．３～１．１ｋＰａ、回転速度１８０ｒｐｍで約１時間噴射した。エマルションを室温で４時間撹拌して溶媒を除去した後、凍結乾燥してミクロスフェアを製造した。
実験例１０：ミクロスフェアの性状分析
実施例３３～３６で製造されたミクロスフェアの性状を光学顕微鏡を使用して分析し、その結果を図９に示した。
図９から分かるように、実施例３３～３６で製造された微粒子の形状はいずれも球状であり、噴射圧力が１．１ｋＰａから０．３ｋＰａに低下するにつれてサイズが小さくなり、均一になることが確認された。
実験例１１：ミクロスフェアの粒径分析
実施例３３～３６で製造されたミクロスフェアの粒径分布（ＰＳＤ）を粒度分析装置を使用して測定した結果を表９に示した。
実施例３７及び３８：ＰＯＣ用のミクロスフェアの製造
概念実証（ＰＯＣ）試験用のミクロスフェアの製造には、パイロットスケールのＳＰＧ膜装置を使用し、表１０に記載の条件で２種のミクロスフェアを製造した。
試験化合物とＰＬＧＡの重量比は、表１０に示すように約１６．７：８３．３となるように秤量した。ＰＬＧＡと有機溶媒（ＤＣＭ：ＥＡ＝９：１）の重量比は表１０に示す１：１０で加えた後、撹拌して、分散相を製造した。使用されたＰＬＧＡは、ＲＧ５０４（Ｌ／Ｇ比＝５０／５０、ＭＷ＝３８，０００～５４、０００、エステル末端）及びＲＧ７５６Ｓ（Ｌ／Ｇ比＝７５／２５、ＭＷ＝７６，０００～１１５，０００、エステル末端）であった。
連続相には、１％ポリビニルアルコール（Ｍ．Ｗ．３１，０００～５０，０００、加水分解度８７～８９％）５,１００ｍＬを使用し、酢酸を用いてｐＨ４に調整した。膜乳化法でエマルションを製造し、その際の圧力は０．３ｋＰａ、回転速度１８０ｒｐｍで約１時間噴射した。製造されたエマルションを室温で４時間撹拌して溶媒を除去し、凍結乾燥してミクロスフェアを製造した。
実験例１２：ミクロスフェアの封入率及び粒径の測定
実施例３７及び３８で製造されたミクロスフェアの封入率及び粒径を測定した。封入率は、以下の方法により測定した。
１）試験化合物がロードされた約３０ｍｇのミクロスフェアを秤量し、正確に記録し、５０ｍＬ容量フラスコに入れた。
２）前記１）のメスフラスコに８０％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）の約１／３を加え、試験化合物がロードされたミクロスフェアを超音波処理により完全に溶解した。
３）ミクロスフェアが完全に溶解したら、８０％ＭｅＣＮを５０ｍＬのマークまで加えた。
４）シリンジフィルターを使用用してろ過し、ＨＰＬＣを測定した。
５）測定されたクロマトグラムから試験化合物のピーク面積を求め、この面積を試験化合物の検量線関数（適切な濃度の試験化合物溶液を３種類以上作製し、ＨＰＬＣで測定し、ｘ（濃度）とｙ（ピーク面積）関係式を求めた。）のｙの値に代入し、ｘの値に対応する試験化合物の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を求めた。
６）ミクロスフェアを溶解した溶液の体積は５０ｍＬであるので、上記５）で得られた濃度に５０を乗じることにより、クロスフェアに封入された試験化合物の量（ＡＰＩ量）が求められる。
７）前記６）で測定された試験化合物の量を最初に添加した試験化合物の量で割り、１００を乗じて封入率（％）を求めた。
測定されたミクロスフェアの封入率及び粒度結果を表１１に示した。
実施例３７及び３８で製造されたミクロスフェアの封入率は約８％であった。実施例３７で製造されたミクロスフェアは、平均サイズ４５μｍ、スパン０．６で小さく均一であり、実施例３８で製造されたミクロスフェアは、平均サイズ６０μｍ、スパン約２．１であった。実施例３８のミクロスフェアは、実施例３７に比べてサイズが大きく、分布が広いことが確認された。
実験例１３：ミクロスフェアのインビトロ溶出試験（垂直撹拌と水平撹拌の違い）
実施例３７及び３８で製造されたミクロスフェアを透析膜に入れ、１ｘＰＢＳ含むチューブ中で溶出を行った。所定の日にチューブ内溶出液を採取及びろ過した後、放出された薬物の量をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により測定した。約３９日間溶出を行い、封入量に対する溶出量の百分率を表すことにより累積溶出量を算出した。
図１０に示すように、チューブを横にして撹拌した場合と、縦にして撹拌した場合の撹拌方法の違いを確認した。実施例３７（水平）及び実施例３８（水平）のグラフは、チューブを横にして撹拌して得られたグラフであり、実施例３７（垂直）及び実施例３８（垂直）のグラフは、チューブを縦にして撹拌して得られたグラフであり、比較結果を図１１に示した。
図１１で分かるように、試験化合物は、試験管を垂直に置き、撹拌する試験法の方がわずかに速く放出された。
実験例１４：ミクロスフェアの薬物動態学（ＰＫ）試験
実施例３８で製造されたミクロスフェアの薬物動態学（ＰＫ）試験を行った。実施例３８のミクロスフェアを３０ｍｇ、１００ｍｇ及び３００ｍｇをイヌの関節腔内に投与し、４週目に１回同量を追加投与した。即ち、試験化合物が関節腔内に合計８週間存在するように投与間隔を設計した。サンプリングポイントで関節液を収集し、関節腔内の試験化合物の濃度を分析した。その結果を図１２に示した。
図１２から分かるように、３０ｍｇ、１００ｍｇ及び３００ｍｇのミクロスフェアをイヌ関節腔に投与した場合、検出される試験化合物の量は、用量の増加に伴って増加し、剤形は試験化合物を３～４週間持続的に放出されることが確認された。４週目に再度同量を注射したところ、合計８週間関節腔内に試験化合物が存在することが確認された。
比較例１：ＰＯＣ用薬物を封入しないミクロスフェアの製造
パイロットスケールのＳＰＧ膜装置を使用し、以下の条件でミクロスフェアを製造した。
ＰＬＧＡと有機溶媒ジクロロメタンを重量比１：１０で加えて撹拌して、分散相を製造した。使用されたＰＬＧＡは、ＲＧ７５６Ｓ（Ｌ／Ｇ比＝７５／２５、ＭＷ＝７６，０００～１１５，０００、エステル末端）であった。
連続相として、１％ポリビニルアルコール（Ｍ．Ｗ．３１，０００～５０，０００、加水分解度８７～８９％）５，１００ｍＬを使用した。膜乳化法でエマルションを製造し、この際の圧力は０．３ｋＰａ、回転速度１８０ｒｐｍで約１時間噴射した。エマルションを室温で４時間撹拌して溶媒を除去し、凍結乾燥してミクロスフェアを製造した。
実験例１５：ミクロスフェアの粒度分析
比較例１で製造されたミクロスフェアの粒度分布（ＰＳＤ）を粒度分析装置を利用して側定した。その結果を表１２に示した。
比較例１で製造されたミクロスフェアは、平均粒径４７μｍ、Ｓｐａｎ＝０．６であり、実施例３８で製造されたミクロスフェアよりも平均粒径（６０μｍ）が小さく、分布（Ｓｐａｎ＝２．１）が狭いことが確認された。
実験例１６：ＰＯＣ（概念実証）試験
実施例３８で製造されたミクロスフェアのＰＯＣ実験を行った。イヌにおける有効性を評価するために、を見るために、半月板切除術を実施し、術後１週間には強制運動を実施し、術後２週間にＰＯＣ試料を投与した。試験化合物は実験例１４と同様に初回投与から４週間後に濃度を維持するために再投与した。初回投与後８週間の歩行能力評価により効果を検証した。比較のために、比較例１で製造した薬剤を含まないミクロスフェアも同様に投与した。
表１３に示す跛行スコアに基づいて、イヌの歩行能力を８週間観察し、スコアとして数値化した結果を図１３に示した。
図１３から分かるように、試験化合物を含まない比較例１のミクロスフェアを投与しても何ら効果もなく、手術した足は床に立つことが困難であった。比較例１のミクロスフェアを投薬した群の跛行スコアは、２週間でスコア３から始まり、徐々に悪化して８週間でスコア４となった。
試験化合物を封入した実施例３８のミクロスフェアを３０ｍｇ投与した場合、投薬後２週間は効果がなかった。しかし、２週間後には歩けなかったイヌも元気に歩けるようになり、８週間後には跛行スコアが1程度となり、効果は抜群であった。１００ｍｇ及び３００ｍｇを投与した場合、ほぼ即効性が現れ、用量が多いほど早く効果が大きくなることが確認された。

Claims (30)

  1. 有効成分として（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び
    生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）；
    を含むミクロスフェアを含む注射用医薬組成物。
  2. （Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体とポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比が、５～２０：８０～９５であることを特徴とする請求項１に記載の注射用医薬組成物。
  3. （Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体とポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比が、７～１８：８２～９３であることを特徴とする請求項２に記載の注射用医薬組成物。
  4. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比が、４０：６０～９０：１０であることを特徴とする請求項１に記載の注射用医薬組成物。
  5. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比が、７０：３０～９０：１０であることを特徴とする請求項４に記載の注射用医薬組成物。
  6. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の分子量が、２０～５００ｋＤａであることを特徴とする請求項１に記載の注射用医薬組成物。
  7. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の分子量が、７０～２００ｋＤａであることを特徴とする請求項６に記載の注射用医薬組成物。
  8. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の末端基が、エステル又は酸であることを特徴とする請求項１に記載の注射用医薬組成物。
  9. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の末端基が、エステルであることを特徴とする請求項８に記載の注射用医薬組成物。
  10. さらに溶媒を含むことを特徴とする請求項１に記載の注射用医薬組成物。
  11. 前記溶媒が、水、生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水であることを特徴とする請求項１０に記載の注射用医薬組成物。
  12. アポトーシス関連疾患、炎症疾患、骨関節炎、リウマチ性関節炎、変性性関節炎及び破壊性骨障害から選ばれる疾患の予防又は治療用であることを特徴とする請求項１に記載の注射用医薬組成物。
  13. 骨関節炎の予防、治療又は鎮痛用であることを特徴とする請求項１２に記載の注射用医薬組成物。
  14. （ｉ）有効成分として（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体；及び生体適合性高分子としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）を有機溶媒に溶解して分散相を製造する工程；
    （ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた分散相を連続相に加えることによりエマルションを製造する工程；及び
    （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られたエマルションから溶媒を除去し、硬化してミクロスフェアを製造する工程；
    を含む注射用医薬組成物の製造方法。
  15. 前記工程（ｉ）において、（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体と、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比が、５～２０：８０～９５であることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  16. 前記工程（ｉ）において、（Ｒ）－Ｎ－（（２Ｓ，３Ｓ）－２－（フルオロメチル）－２－ヒドロキシ－５－オキソテトラヒドロフラン－３－イル）－５－イソプロピル－３－（イソキノリン－１－イル）－４，５－ジヒドロイソオキサゾール－５－カルボキサミド、又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体と、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）との重量比が、７～１８：８２～９３であることを特徴とする請求項１５に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  17. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比が、４０：６０～９０：１０であることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  18. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドとグリコリドとのモル比が、７０：３０～９０：１０であることを特徴とする請求項１７に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  19. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドの分子量が、２０～５００ｋＤａであることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  20. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）のラクチドの分子量が、７０～２００ｋＤａであることを特徴とする請求項１９に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  21. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の末端基が、エステル又は酸であることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  22. 前記ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）の末端基が、エステルであることを特徴とする請求項２１に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  23. 前記工程（ｉ）の有機溶媒が、ジクロロメタン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酢酸、塩酸、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン、酢酸プロピル、酢酸メチル及びこれらの混合物から選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  24. 前記工程（ｉ）の有機溶媒が、ジクロロメタン及び酢酸エチルの混合物であることを特徴とする請求項２３に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  25. 前記ジクロロメタン及び酢酸エチルの混合比が、９：１であることを特徴とする請求項２４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  26. 前記工程（ｉｉ）の連続相が、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液であることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  27. 前記工程（ｉｉ）の連続相が、酸を用いてｐＨ３～５に調整されることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  28. 前記酸が、酢酸であることを特徴とする請求項２７に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  29. 前記工程（ｉｉ）において、エマルションの製造が、ホモジナイザー、インクジェット印刷又は膜乳化法によって行われることを特徴とする請求項１４に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
  30. 前記膜乳化法が、ＳＰＧ（シラス多孔質ガラス）膜を用いて行われることを特徴とする請求項２９に記載の注射用医薬組成物の製造方法。
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