JP2023549878A

JP2023549878A - 自己抗体に対する回避率又は活性が向上したａｄａｍｔｓ１３バリアント

Info

Publication number: JP2023549878A
Application number: JP2023529074A
Authority: JP
Inventors: ヒョン－ジャナム，; スンホファン，; ヒチョンクワック，; カヒチェ，; スヨンキム，; ユヨンキム，; ヨンミンイ，; ジェモクイ，; スンヘシン，; ヨンウンクォン，; スンヒョンチョ，
Original assignee: GREEN CROSS CORP
Current assignee: GREEN CROSS CORP
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-11-29
Also published as: EP4249594A4; IL302984A; US20230405096A1; KR20220068144A; CN116745426A; ZA202305424B; EP4249594A1; WO2022108148A1; CO2023006605A2; MX2023005661A; CA3201986A1; AU2021382506A1

Abstract

本発明は、自己抗体に対する回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３変異体タンパク質、及びこれを使用して血栓性疾患を予防又は治療するための組成物に関する。本発明のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３の主要なドメインに対して高い結合親和性を有することが知られている代表的な自己抗体を効率的に回避することにより、そのような自己抗体の存在が主要な病因である様々な血栓性疾患、例えばＴＴＰ（血栓性血小板減少性紫斑病）等に対する有効な治療用組成物として使用することができ、身体に投与される場合その生物活性を安定に維持することができる。さらに、自己抗体によって認識される新たな部位がＡＤＡＭＴＳ１３内で同定されることから、対応する部位内の様々な変異の組み合わせを適用することによって、本発明は、自己抗体回避率が改善された新規のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントをスクリーニングする上で有用に使用することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、自己抗体に対する酵素活性が低下した又は高い酵素活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３バリアント、及びこれを使用して血栓性疾患を治療するための組成物に関する。

血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、凝血塊が全身の微小血管にでき、直ちに治療しなければ死に至る、血栓性微小血管症に属する稀な血液疾患である。発生頻度は年間１００万人に１．５～６症例であることが知られており、発生頻度は主に平均年齢４０歳の成人及び女性で高い（Ｍｉｅｓｂａｃｈら、２０１９）。その病理学的特徴としては、血小板の減少、赤血球の減少、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）の上昇等が挙げられ、凝血塊のため、腎臓、心臓、脳などの多くの臓器で機能障害が生じることが知られている。その症状としては、内出血、発熱、倦怠感、呼吸困難、意識の混乱、頭痛等が挙げられる（Ｈｏｖｉｎｇａら、２０１７）。

血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は２種類に分類される：ＡＤＡＭＴＳ１３（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｗｉｔｈａｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｔｙｐｅ１ｍｏｔｉｆ，ｍｅｍｂｅｒ１３）（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ、メンバー１３）をコードする遺伝子の機能障害により先天性ＡＤＡＭＴＳ１３機能欠損症を引き起こす先天性ＴＴＰ（ｃＴＴＰ）；及び後天的原因によるＡＤＡＭＴＳ１３活性の低下に起因する後天性ＴＴＰ（ａＴＴＰ）。一般には、ＡＤＡＭＴＳ１３活性が通常のＴＴＰの１０％未満である場合、ＴＴＰと診断される。ａＴＴＰは、細菌感染、特定の薬物、自己免疫疾患、例えばループス、妊娠等に起因することが報告されており、発病の主要な機序の１つとして、ＡＤＡＭＴＳ１３を認識する自己抗体によるＡＤＡＭＴＳ１３活性の抑制が報告されている（ＧＡＲＤプログラム、２０１８）。ＡＤＡＭＴＳ１３酵素は、フォンヴィレブランド因子（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ）（ｖＷＦ）の大きな多量体をより小さな単位に分解する上で役割を果たす。ｖＷＦではａＴＴＰ患者で見出される抗体がＡＤＡＭＴＳ１３に結合し、その機能を抑制し、ｖＷＦの分解を妨げ、これが最終的に血小板と一緒になった凝血塊の過剰産生をもたらし、疾患を引き起こす。

ｃＴＴＰ患者に対する標準的な治療として、新鮮凍結血漿の注射により欠損分解酵素が提供される補充療法が使用されるのに対し、ａＴＴＰ患者に対しては、血漿交換（ＰＥＸ）を行って中和抗体を除去することにより症状を軽減することが目的とされる。ａＴＴＰ患者の場合、治療効果を高め、再発を防止するために、免疫抑制薬（プレドニゾロン、コルチコステロイド等）が組み合わせて投与され、中和抗体の産生を低減するためにＢ細胞死を誘導するリツキシマブが使用され得る。血漿交換の回数は疾患の重症度及び症状の進行に依存するが、血小板数を正常化するのに数回の血漿交換が一般的には必要とされる。現在の治療は、血漿交換を繰り返す不便さ、及び免疫抑制薬の使用から生じる感染症に対する脆弱性の増加などの限界がある。

したがって、ＴＴＰの従来の療法の限界を克服するために、本発明者らは、患者の自己抗体への結合を効率的に回避することによって、自己抗体の存在下でも活性を維持することができる組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質バリアントを調製し、ＴＴＰ疾患マウスモデルにおける有効性評価により、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質バリアントはＴＴＰ疾患の有効な治療として有用に使用され得ることが確認された。

多くの学術論文及び特許文献が本明細書を通して参照され、それらの引用が示される。引用された学術論文及び特許文献の開示は、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の詳細をより明白に記載するために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明者らは、ほとんどが難治性希少疾患に属する様々なＡＤＡＭＴＳ１３機能障害性疾患を治療する有効で基本的な方法を開発するために広範な研究を行った。その結果、本発明者らは、自己抗体によって認識されるＡＤＡＭＴＳ１３のコア領域が同定され、これらの領域のいくつかのアミノ酸が置換されている場合、自己抗体への結合がブロックされ、ｖＷＦ分解及び血栓症抑制のための活性が維持され、故に血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を含む過剰な血栓形成に起因する様々な疾患の効率的な治療用組成物として使用することができることを発見し、本発明を完成させた。

したがって、本発明の目的は、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質又はその機能性断片を提供することである。

本発明の別の目的は、血栓性疾患を予防又は治療するための組成物を提供することである。

本発明のさらなる別の目的は、ＡＤＡＭＴＳ１３自己抗体に対する回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質をスクリーニングする方法を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、本発明の以下の詳細な説明、特許請求項の範囲、及び図面からより明らかになるであろう。

本発明の一態様によれば、配列番号１の８５番目、９３番目、１２６番目、１３５番目、２７８番目、２８２番目、３０８番目、３１４番目、３１７番目、３３４番目、３６４番目、３７６番目、４１３番目、４２７番目、４５２番目、４６５番目、５６７番目、５７８番目、５８５番目、５８９番目、６０７番目、６０８番目、６０９番目、６１２番目、６１８番目、６２４番目、６３０番目、６３５番目、６４３番目、６５０番目、６５１番目、６５４番目、６５５番目、６５６番目、６５８番目、６６４番目、及び６７２番目の残基からなる群から選択される１つ若しくは複数のアミノ酸残基の置換を含むＡＤＡＭＴＳ１３（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｗｉｔｈａｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｔｙｐｅ１ｍｏｔｉｆ，ｍｅｍｂｅｒ１３）（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ、メンバー１３）バリアントタンパク質、又はその機能性断片が提供される。

本発明者らは、ほとんどが難治性希少疾患に属する様々なＡＤＡＭＴＳ１３機能障害性疾患を治療する有効で基本的な方法を開発するために広範な研究を行った。その結果、本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ１３自己抗体によって認識されるコア領域が同定され、これらの領域のいくつかのアミノ酸が置換されている場合、自己抗体への結合がブロックされ、ｖＷＦ分解及び血栓症抑制のための活性が維持され、故に血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を含む過剰な血栓形成に起因する様々な疾患の効率的な治療用組成物として使用することができることを発見した。

本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」とは、ペプチド結合によるアミノ酸残基の相互結合によって形成される直鎖状分子を指す。

本明細書で使用される場合、用語「機能性断片」とは、いくつかのアミノ酸残基が欠失されている完全長タンパク質の断片であることから、元々の生物活性及び機能を維持する完全長タンパク質のアナログを指す。

本発明によれば、配列番号１は、１４２７個のアミノ酸からなるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のアミノ酸配列である。したがって、本発明のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質又はその機能性断片は、完全長（１４２７ａ．ａ．）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質か、又は上記の変異が７５番目～６８５番目の領域を含むその機能性断片に導入されるＡＤＡＭＴＳ１３バリアントであってもよい。７５番目～６８５番目の領域を含むいくつかの断片は、例えば、１～６８５（６８５ａ．ａ．）又は７５～６８５（６１１ａ．ａ．）であってもよい。

本発明のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質及びその機能性断片に本質的に含まれるアミノ酸配列である配列番号１はまた、上記の配列に対して実質的な同一性を示すアミノ酸配列も含む。実質的な同一性とは、上記のアミノ酸配列と最大限整列させた後、当技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムを使用して分析される場合、上記のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の相同性、具体的には少なくとも８０％の相同性、より具体的には少なくとも９０％の相同性、最も具体的には少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を指す。

本明細書で使用される場合、用語「自己抗体」とは、抗原のエピトープに結合し、それによって抗原を特異的に認識することができる１つ又は複数の可変ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質の１つであり、個体自身の免疫系によって産生され、個体自身のタンパク質を認識し、標的にする抗体を指す。自己抗体の存在は、対応する自己抗体によって特異的に認識されるタンパク質の内因性機能又は生物活性の減少又は喪失をもたらし、故に様々な疾患の原因になる。

本発明の特定の実施形態によれば、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質は、以下の位置にアミノ酸残基の置換を含む各バリアントタンパク質からなる群から選択される：
８５番目及び３１７番目の残基；６１２番目の残基；２８２番目、４６５番目、及び６７２番目の残基のうち２つ以上；６３５番目の残基；４５２番目及び６１２番目の残基；２７８番目、３３４番目、及び４２７番目の残基のうち２つ以上；６１８番目の残基；１３５番目の残基；１２６番目、５６７番目、及び６５１番目の残基のうち２つ以上；４１３番目の残基；３３４番目の残基；３１４番目の残基；９３番目、３６４番目、及び３７６番目の残基のうち２つ以上；３０８番目の残基；６５６番目の残基；６０７番目の残基；６１２及び６２４番目の残基；５８９番目の残基；６５０番目及び６５６番目の残基；６４３番目の残基；５８５番目及び６５８番目の残基；６３０番目、６５４番目、及び６６４番目の残基のうち２つ以上；５８９番目、６０８番目、６０９番目、６２４番目、及び６５５番目の残基のうち４つ以上；５７８番目の残基；５８５番目の残基；３１４番目及び６３５番目の残基；並びに３１４番目及び６１２番目の残基。

本発明の特定の実施形態によれば、本発明に適用される変異位置のうち、８５番目の残基はＰｈｅで、９３番目の残基はＶａｌで、１２６番目の残基はＭｅｔで、１３５番目の残基はＩｌｅで、２７８番目の残基はＩｌｅで、２８２番目の残基はＡｌａで、３０８番目の残基はＬｙｓで、３１４番目の残基はＴｈｒで、３１７番目の残基はＨｉｓで、３３４番目の残基はＴｈｒ又はＶａｌで、３６４番目の残基はＡｒｇで、３７６番目の残基はＡｓｐで、４１３番目の残基はＡｓｐで、４２７番目の残基はＡｓｎで、４５２番目の残基はＩｌｅで、４６５番目の残基はＡｓｐで、５６７番目の残基はＳｅｒで、５７８番目の残基はＬｅｕで、５８５番目の残基はＡｓｎ又はＭｅｔで、５８９番目の残基はＧｌｎで、６０７番目の残基はＡｒｇで、６０８番目の残基はＭｅｔで、６０９番目の残基はＬｅｕで、６１２番目の残基はＰｈｅ又はＴｙｒで、６１８番目の残基はＳｅｒで、６２４番目の残基はＡｓｐ又はＣｙｓで、６３０番目の残基はＬｅｕで、６３５番目の残基はＶａｌで、６４３番目の残基はＰｈｅで、６５０番目の残基はＨｉｓで、６５１番目の残基はＡｓｐで、６５４番目の残基はＧｌｙで、６５５番目の残基はＶａｌで、６５６番目の残基はＡｒｇ又はＨｉｓで、６５８番目の残基はＨｉｓで、６６４番目の残基はＡｓｎで、及び６７２番目の残基はＶａｌでそれぞれ置換されている。

本発明の別の態様によれば、本発明は、（ａ）上記本発明のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質又はその機能性断片；及び（ｂ）上記の（ａ）にコンジュゲートされたＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質を提供する。

本発明者らは、本発明で発見されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質にＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＦｃ領域がコンジュゲートされると、インビボでの安定性は有意に向上するが、内因性ｖＷＦ切断の活性及び中和抗体を回避する活性は維持することができること、並びに特に、遠位末端の一部が除去されている開いた形態の断片で示される構造的不安定性が有意に改善されることを見出した。

本発明の特定の実施形態によれば、Ｆｃ領域は、配列番号２の２２番目、２４番目、及び２６番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。より具体的には、２２番目の残基はＴｙｒで、２４番目の残基はＴｈｒで、及び２６番目の残基はＧｌｕでそれぞれ置換されている。

本発明によれば、配列番号２は、ＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＦｃ領域（２１７ａ．ａ．）である。本発明者らは、上記に記載されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質又はその機能性断片が、２２番目、２４番目、及び２６番目の残基がそれぞれＴｙｒ、Ｔｈｒ、及びＧｌｕで置換されているＩｇＧ４免疫グロブリン由来Ｆｃ領域［ＩｇＧ４（ＹＴＥ）］と融合されると、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質又はその機能性断片の血中半減期が最大化されること、故に、投与後の生理的活性が長期間維持され得ることを見出した。

本発明の特定の実施形態によれば、本発明の融合タンパク質は、上記に記載された（ａ）と（ｂ）の間にＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域をさらに含む。

本発明によれば、ＩｇＧ１免疫グロブリンに由来するヒンジ領域は、配列番号３（１５ａ．ａ．）によって表される場合がある。

本発明のさらなる別の態様によれば、本発明は、上記本発明のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質若しくはその機能性断片；又は上記融合タンパク質をコードするヌクレオチドを提供する。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含むという意味を有し、核酸分子の基本的構造単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基領域が修飾されたそのアナログも含む。本発明において治療、薬物製造等の目的で発現されるヌクレオチド配列は、添付配列表に記載されたヌクレオチド配列に限定されないことは当業者に明らかである。ヌクレオチドのいくつかの変異は、タンパク質に変化をもたらさない。そのような核酸は、機能的に同等のコドン、コドンの縮重により同じアミノ酸をコードするコドン、及び生物学的に同等のアミノ酸をコードするコドンを有する全ての分子を包含する。

生物学的に同等の活性を有する上記変異を考慮すると、本発明で使用されるヌクレオチドは、配列表に記載された配列に対して実質的な同一性を示す配列を含むと解釈される。実質的な同一性とは、上記のアミノ酸配列と最大限整列させた後、当技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムを使用して分析される場合、本発明の配列に対して少なくとも７０％の相同性、少なくとも８０％の相同性、より具体的には少なくとも９０％の相同性、最も具体的には少なくとも９５％の相同性を示す配列を指す。配列比較のためのアラインメント方法は、当技術分野で開示されている。アラインメントの様々な方法及びアルゴリズムは、Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５～６５頁（１９９２）及びＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３１頁（１９９４）に記載されている。ＮＣＢＩＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～１０頁（１９９０））は、米国国立生物学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）等からアクセス可能であり、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘなどの配列決定プログラムと併せて使用することができる。

本発明のヌクレオチドは、本発明の上記バリアントＡＤＡＭＴＳ１３を遺伝子の形態で対象に送達する遺伝子療法の形態で使用され得るか、又は宿主細胞でＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質を発現させることによって剤形で組換えタンパク質の製造に使用され得る。

本明細書で使用される場合、用語「発現する」とは、対象が内因性遺伝子を発現又は導入できるようにするために、内因性遺伝子の天然の発現レベルを高めるように遺伝子担体を使用し、遺伝子を染色体外因子として複製可能にするか、又は対象の細胞内で染色体組み込みを完成させることを意味する。したがって、用語「発現」は「形質転換」、「トランスフェクション」、及び「形質導入」と同義である。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子担体」とは細胞への遺伝子の輸送の任意の手段を指し、遺伝子送達は細胞への遺伝子の形質導入と同じ意味を有する。組織レベルでは、遺伝子送達という用語は遺伝子の拡散と同じ意味を有する。したがって、本発明の遺伝子送達系は、遺伝子浸透系及び遺伝子拡散系と記載することができる。

本発明の遺伝子送達系は、導入される遺伝子の自己発現に必要な全てのエレメントを含むポリヌクレオチド構築物である発現カセットの形態で含まれてもよい。発現カセットは通常、遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含む。発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。

本発明で使用される遺伝子送達系は、従来の遺伝子挿入に使用される任意の遺伝子送達系に適用することができ、例えば、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、及びレンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、リポソーム、及びニオソームが挙げられ得るが、これらに限定されない。

本発明のさらなる別の態様によれば、本発明は、本発明の上記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質若しくはその機能性断片；上記融合タンパク質；又はこれらをコードするヌクレオチドを活性成分として含む、血栓性疾患を予防又は治療するための組成物を提供する。

本発明のさらなる別の態様によれば、本発明は、本発明の上記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質若しくはその機能性断片；上記融合タンパク質；又はこれをコードするヌクレオチドを活性成分として含む組成物を対象に投与するステップを含む、血栓性疾患を予防又は治療するための方法を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「血栓性疾患」とは、血管の微小循環系における血小板凝集によって生成される血栓により血流が低下するか又は遮断され、腎臓、心臓、及び脳などの各臓器に虚血性損傷が引き起こされる全身疾患を指す。

ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性が中和抗体によって抑制され、故にフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）を正しく分解しない場合、過剰な血小板凝集及び血栓過剰産生が起こる。したがって、中和抗体を高効率で回避しながらｖＷＦ分解活性が維持又は改善される本発明のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質は、様々な血栓性疾患の有効な予防又は治療のための組成物として使用することができる。

本明細書で使用される場合、用語「予防」とは、障害又は疾患を有すると診断されていないが、障害又は疾患を有する可能性がある対象における障害又は疾患の発生を抑制することを指す。

本明細書で使用される場合、用語「治療」とは、（ａ）障害、疾患、若しくは症状の進行の抑制；（ｂ）障害、疾患、若しくは症状の軽減；又は（ｃ）障害、疾患、又は症状の排除を指す。本発明の組成物が対象に投与されると、該組成物は、中和抗体の存在と関係なくｖＷＦを特異的に認識及び分解する役割を果たして過剰な血栓の生成をブロックし、血栓性疾患の進行を抑制するか、排除するか、又は軽減する。したがって、本発明の組成物はそのままでこれらの疾患を治療するための組成物になり得るか、又は他の薬理学的成分と一緒に投与され、上記の疾患の治療補助剤として適用され得る。したがって、本明細書で使用される場合、用語「治療」又は「治療剤」は「補充治療」又は「治療補助剤」の意味を含む。

本明細書で使用される場合、用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」又は「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」とは、本発明の組成物の治療有効量が対象の体内で形成されるように本発明の組成物の治療有効量を対象に直接投与することを指す。

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」とは、組成物中に含有される薬理学的成分が、本発明の医薬組成物が投与される個体に治療又は予防効果をもたらすのに十分な組成物の含量を指し、用語「治療有効量」は「予防有効量」の意味を含む。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒ、及びアカゲザルを含むが、これらに限定されない。具体的には、本発明の対象はヒトである。

本発明の特定の実施形態によれば、本発明の組成物によって予防又は治療することができる血栓性疾患は血栓性微小血管症（ＴＭＡ）である。より具体的には、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、ＨＥＬＬＰ（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ，ＥｌｅｖａｔｅｄＬｉｖｅｒｅｎｚｙｍｅｓ，ａｎｄＬｏｗＰｌａｔｅｌｅｔｃｏｕｎｔ（溶血、肝酵素上昇、及び血小板減少））症候群、妊娠高血圧腎症、及び鎌状赤血球症、より具体的には血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）又は鎌状赤血球症、さらにより具体的には血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である。

本発明の組成物が医薬組成物として調製される場合、その中に含まれる薬学的に許容できる担体は製剤で一般的に使用される担体であり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニールピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油等が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の医薬組成物は、上記の成分に加えて、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存料等をさらに含んでもよい。適切な薬学的に許容できる担体及び薬剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の医薬組成物は経口又は非経口投与されてもよく、具体的には非経口様式で投与されてもよく、より具体的には皮下、経皮、又は静脈内投与されてもよい。

本発明の医薬組成物の適切な用量は、製剤方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、健康状態、食べ物、投与時間、投与経路、排出速度、及び反応感度などの要因に応じて様々に処方され得る。本発明の医薬組成物の好ましい用量は、成人については０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。

本発明の医薬組成物は、本発明が属する技術分野の当業者によって容易に行われ得る方法に従って、薬学的に許容できる担体及び／又は賦形剤を使用して製剤化することによって単位剤形で調製され得るか、又は複数回投与容器に組み込むことによって調製され得る。この場合、製剤は、油中溶液若しくは水性媒体、懸濁液、シロップ、若しくはエマルションの形態であってもよいか、又はエキス、粉末、粉末剤、顆粒、錠剤、若しくはカプセルの形態であってもよく、分散剤又は安定剤をさらに含んでもよい。

本発明のさらなる別の態様によれば、本発明は、自己抗体回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントをスクリーニングする方法であって：
（ａ）配列表の第１の配列の８５番目、９３番目、１２６番目、１３５番目、２７８番目、２８２番目、３０８番目、３１４番目、３１７番目、３３４番目、３６４番目、３７６番目、４１３番目、４２７番目、４５２番目、４６５番目、５６７番目、５７８番目、５８５番目、５８９番目、６０７番目、６０８番目、６０９番目、６１２番目、６１８番目、６２４番目、６３０番目、６３５番目、６４３番目、６５０番目、６５１番目、６５４番目、６５５番目、６５６番目、６５８番目、６６４番目、及び６７２番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基が置換又は欠失されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントを調製するステップ；並びに
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ１３に対する自己抗体を、上記のステップ（ａ）で調製されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと接触させるステップを含み；
自己抗体が、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３に対する親和性より低い親和性でＡＤＡＭＴＳ１３バリアントに結合する場合、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、自己抗体に対する回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントとして決定される、上記方法を提供する。

本発明によれば、本発明者らは、使用してＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体に結合することができるか否かについて、ランダム変異誘発によって得られた約８００ほどのバリアントのライブラリーを分析した；その結果、本発明者らは、中和抗体への結合において配列番号１のアミノ酸残基の位置が重要な役割を果たすこと、及び中和抗体に対する親和性はこれらの位置における変異によって制御され得ることを見出した。したがって、様々なバリアントが、変異のタイプ、及び本発明者らによって発見されたこれらの残基位置を通じて導入されるそれらの変異の組み合わせにより得られ得、自己抗体の存在によって活性が低減されないＡＤＡＭＴＳ１３バリアント酵素が、これらのバリアントと自己抗体の結合の測定により選択され得る。

本明細書で使用される場合、用語「自己抗体回避率」とは、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３と比較した自己抗体に結合しないＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの比のパーセンテージとして表される値を指し、自己抗体に対する高い回避率とは、自己抗体に対する親和性が低く、故に、ＡＤＡＭＴＳ１３の固有の生物活性（例えば、ｖＷＦ分解活性）が自己抗体によって抑制されないことを意味する。したがって、用語「自己抗体回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアント」は、「自己抗体に対する親和性が低下したＡＤＡＭＴＳ１３バリアント」又は「自己抗体への結合能が低下したＡＤＡＭＴＳ１３バリアント」としても表現することができる。

本発明によれば、自己抗体に対する候補バリアントの回避率は、上記のステップ（ａ）で調製されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと自己抗体の結合を測定して評価することができる。自己抗体への結合は様々な方法によって測定することができ、そのうちの１つが、抗体を抗原（又は抗原を発現する細胞）と共に培養し、非結合抗体を除去（例えば、洗浄）し、結合抗体をこれに結合した標識抗体により検出するステップを含む方法である。抗原と抗体の結合は、典型的には抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗原のエピトープを通じて媒介され、タンパク質のランダム及び非特異的結合とは異なり、抗原及び可変ドメインの特定の三次元構造はこれらの２つの構造が正確な結合を形成できるようにする。したがって、本発明を通じて発見された自己抗体との主要な反応部位の変異の適切な組み合わせが適切な組み合わせで行われるならば、自己抗体の結合は効果的にブロックすることができる。

測定の結果、野生型と比べて自己抗体に対する親和性又は結合能が低下した候補バリアントが、自己抗体に対する回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントとして決定され得る。

本明細書で使用される場合、用語「親和性の減少」とは、ＡＤＡＭＴＳ１３の内因性酵素活性が測定可能なレベルまで改善される程度の、ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントと自己抗体の結合の有意な減少を指し、「結合能の低下」としても記載される場合がある。具体的には、用語「親和性の減少」とは、野生型と比べて結合が２０％以上、より具体的には４０％以上、より具体的には６０％以上減少した状態を指す。

本発明の特定の実施形態によれば、上記のステップ（ａ）は、８５番目、９３番目、１２６番目、１３５番目、２７８番目、２８２番目、３０８番目、３１４番目、３１７番目、３３４番目、３７６番目、４１３番目、４２７番目、４６５番目、５６７番目、５７８番目、５８５番目、６０７番目、６０９番目、６１２番目、６２４番目、６３０番目、６４３番目、６５０番目、６５４番目、６５５番目、６５６番目、６５８番目、及び６７２番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基を置換することによって行われる。

本発明の特徴及び利点は、以下のように要約することができる：
（ａ）本発明は、自己抗体に対する回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質、及びこれを使用して血栓性疾患を予防又は治療するための組成物を提供する。
（ｂ）本発明のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３の主要なドメインに対して高い結合親和性を有することが知られている代表的な自己抗体を効率的に回避することにより、自己抗体が主要な病因になる様々な血栓性疾患、例えば血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）に対する効率的な治療用組成物として使用することができ、身体に投与される場合、生物活性を安定に維持することができる。
（ｃ）したがって、本発明では、自己抗体によって認識される新たな部位もＡＤＡＭＴＳ１３内で同定されることから、様々な変異の組み合わせが対応する部位内に適用され得、自己抗体に対する回避率が改善された新規のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントをスクリーニングするのに有効に使用され得る。

ランダム変異誘発を使用してヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントライブラリーの構築を示す略図、及び変異率を確かめた結果を示す図である。図１ａは、ランダム変異誘発によるライブラリー構築プロセスの模式図である。ランダム変異を、エラープローンＰＣＲ（ＥＰＰＣＲ）によりＭＤＴＣＳ領域又はＳドメインに誘導し、アクセプターベクターに挿入し、クローニングし、次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換してコロニーを確保した。ＤＮＡをコロニーから抽出し、変異したヌクレオチド配列をサンガー配列決定分析により確かめた。ランダム変異誘発を使用してヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントライブラリーの構築を示す略図、及び変異率を確かめた結果を示す図である。図１ｂは、配列決定分析の結果を示すグラフを示す。ＭＤＴＣＳ又はＳドメインを標的にすることによって構築されたライブラリーの総変異率及び変異形態をそれぞれ確かめた。中和抗体に結合するＡＤＡＭＴＳ１３の各ドメインの結合部位を確かめた結果を示す略図である。図２ａは、ＡＤＡＭＴＳ１３の発現率又は中和抗体の結合部位を確かめるために調製された、様々なドメインが組み合わされた６種類のＡＤＡＭＴＳ１３断片（又は野生型完全長ＡＤＡＭＴＳ１３）の模式図を示す。中和抗体に結合するＡＤＡＭＴＳ１３の各ドメインの結合部位を確かめた結果を示す略図である。図２ｂは、各ＡＤＡＭＴＳ１３ドメインで発現されたタンパク質を使用してプロテインＡ－セファロース及び各中和抗体を混合して免疫沈降させた後、抗Ｖ５抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果を示す。「インプット」は、各ドメインのタンパク質の発現レベルを示す。中和抗体に結合するＡＤＡＭＴＳ１３の各ドメインの結合部位を確かめた結果を示す略図である。図２ｃは、Ａｂ４－１６抗体がＳドメインに、Ａｂ６７抗体がＤドメインに、Ａｂ６６抗体がＴ２～Ｔ８ドメインにそれぞれ特異的に結合することを示す、ＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体の結合部位の模式図である。抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を回避するか又は野生型ＡＤＡＭＴＳ１３より優れた活性を有するバリアントのスクリーニング結果を示す略図である。Ａｂ４－１６抗体又はＡｂ６７抗体の回避率及びＡＤＡＭＴＳ１３活性は、野生型クローン及びＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。相対活性は、野生型クローン及びバリアントの特異的力価を確かめ、それらを以下の方程式に代入して算出した：相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００。抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を回避するか又は野生型ＡＤＡＭＴＳ１３より優れた活性を有するバリアントのスクリーニング結果を示す略図である。Ａｂ４－１６抗体又はＡｂ６７抗体の回避率及びＡＤＡＭＴＳ１３活性は、野生型クローン及びＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。相対活性は、野生型クローン及びバリアントの特異的力価を確かめ、それらを以下の方程式に代入して算出した：相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００。単一中和抗体に対する１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの回避率を確かめた結果を示す図である。７種類の中和抗体（Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に対する抗体回避率を、１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。中和抗体回避率は、相対的結合レベルをＷＴＡＤＡＭＴＳ１３値と比較し、これを使用して以下の方程式に相対的回避率を代入して算出した：回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００。単一中和抗体に対する１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの回避率を確かめた結果を示す図である。７種類の中和抗体（Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に対する抗体回避率を、１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。中和抗体回避率は、相対的結合レベルをＷＴＡＤＡＭＴＳ１３値と比較し、これを使用して以下の方程式に相対的回避率を代入して算出した：回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された１２種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、次いでＦｃ結合バリアントを選択された変異アミノ酸残基と組み合わせ、２つのアミノ酸変異を有するＤＭ１及びＤＭ２バリアントを含む合計１４種類のバリアントを発現させた培養培地を使用して、８種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）のＡＤＡＭＴＳ１３の中和抗体回避率及び相対活性を測定した。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された１２種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、次いでＦｃ結合バリアントを選択された変異アミノ酸残基と組み合わせ、２つのアミノ酸変異を有するＤＭ１及びＤＭ２バリアントを含む合計１４種類のバリアントを発現させた培養培地を使用して、８種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）のＡＤＡＭＴＳ１３の中和抗体回避率及び相対活性を測定した。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される９種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－Ｆｃ（すなわち、対照群）及び１２種類の候補バリアントを発現する４ｎＭ培養培地に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を以下の方程式に代入して算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地及び精製溶液の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に関する中和抗体の回避率及び相対活性を、１２種類のバリアント（１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、３Ｂ０５、４Ｅ１１、４Ｈ０７、５Ｇ０８、７Ａ０２、８Ｄ０１、８Ｄ０５、ＤＭ１、及びＤＭ２）を発現させた培養培地か、又はＰｈｙｔｉｐシステムを使用して精製した精製溶液を使用して測定した（図７ａ及び７ｂ）。精製溶液の濃度をＦｃＥＬＩＳＡにより確かめた。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの結合能）×１００、相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの特異的力価×１００。それぞれ、青色のバーは精製バリアントタンパク質を示し、灰色のバーは発現したバリアントタンパク質の中央値を示す。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地及び精製溶液の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に関する中和抗体の回避率及び相対活性を、１２種類のバリアント（１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、３Ｂ０５、４Ｅ１１、４Ｈ０７、５Ｇ０８、７Ａ０２、８Ｄ０１、８Ｄ０５、ＤＭ１、及びＤＭ２）を発現させた培養培地か、又はＰｈｙｔｉｐシステムを使用して精製した精製溶液を使用して測定した（図７ａ及び７ｂ）。精製溶液の濃度をＦｃＥＬＩＳＡにより確かめた。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの結合能）×１００、相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの特異的力価×１００。それぞれ、青色のバーは精製バリアントタンパク質を示し、灰色のバーは発現したバリアントタンパク質の中央値を示す。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地及び精製溶液の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される８種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－Ｆｃ（すなわち、対照群）及び１２種類の候補バリアントを発現する培養培地か又は４ｎＭ精製溶液に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を測定した。残存活性を以下の方程式に代入して算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントの薬物動態の結果を示すグラフである。ＭＤＴＣＳ又はＦｃ（ＩｇＧ１－ＹＴＥ）結合ＭＤＴＣＳ及び４つの最終候補バリアント（１Ｃ０３、５Ｃ０９、７Ａ０２、及びＤＭ２）断片タンパク質をマウスの尾静脈に投与後、血漿を１時間ごとに得た。タンパク質は、各物質の特異的力価が１６０ＩＵ／ｋｇとなり得るように投与し、１時間ごとに得た血漿中に残留している物質の活性を活性アッセイにより測定した。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された５種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）の中和抗体を回避する率及び相対活性を、ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合バリアントを発現する培養培地を使用して測定した（図１０ａ及び１０ｂ）。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの特異的力価×１００。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された５種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）の中和抗体を回避する率及び相対活性を、ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合バリアントを発現する培養培地を使用して測定した（図１０ａ及び１０ｂ）。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの特異的力価×１００。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される９種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ（すなわち、対照群）及び５種類の候補バリアントを発現する４ｎＭ培養培地に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を以下の方程式によって算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される９種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ（すなわち、対照群）及び５種類の候補バリアントを含む４ｎＭ精製溶液に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を以下の方程式によって算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。それぞれ、ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して中和抗体を回避する率をテストするための手順を示す模式図（図１３ａ）、及びバリアント候補の用量に応じた残存ＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す略図（図１３ｂ）である。それぞれ、ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して中和抗体を回避する率をテストするための手順を示す模式図（図１３ａ）、及びバリアント候補の用量に応じた残存ＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す略図（図１３ｂ）である。ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して最も優れた中和抗体回避率（図１４ａ）、血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善を示す模式図（図１４ｂ）、並びに臨床症状の観察結果（図１４ｃ）をそれぞれ示した、ＤＡＭＴＳ１３の残存活性を維持するためのテスト手順を示す模式図、及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの濃度に応じた臨床症状を示す図である。ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して最も優れた中和抗体回避率（図１４ａ）、血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善を示す模式図（図１４ｂ）、並びに臨床症状の観察結果（図１４ｃ）をそれぞれ示した、ＤＡＭＴＳ１３の残存活性を維持するためのテスト手順を示す模式図、及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの濃度に応じた臨床症状を示す図である。ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して最も優れた中和抗体回避率（図１４ａ）、血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善を示す模式図（図１４ｂ）、並びに臨床症状の観察結果（図１４ｃ）をそれぞれ示した、ＤＡＭＴＳ１３の残存活性を維持するためのテスト手順を示す模式図、及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの濃度に応じた臨床症状を示す図である。ｃＴＴＰマウスモデルへのＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの投与による血液症状及び臨床症状の改善の存在／非存在、及びヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の程度に関するテスト手順を示す模式図（図１５ａ）、並びに血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善、及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の観察結果（図１５ｂ）をそれぞれ示す図である。ｃＴＴＰマウスモデルへのＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの投与による血液症状及び臨床症状の改善の存在／非存在、及びヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の程度に関するテスト手順を示す模式図（図１５ａ）、並びに血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善、及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の観察結果（図１５ｂ）をそれぞれ示す図である。

以下、本発明は例を通してより詳細に記載される。これらの例は、本発明をより詳細に示すためにすぎず、本発明の趣旨によりこれらの例によって本発明の範囲が限定されないことは当業者に明らかであろう。

実験方法
ランダム変異誘発によるヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントライブラリーの構築
ヒト野生型ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する発現ベクター、及び変異ＭＤＴＣＳ（メタロプロテアーゼ、Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｌｉｋｅ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎタイプ１（ＴＳＰ１）ｒｅｐｅａｔ、Ｃｙｓ－ｒｉｃｈ、ａｎｄＳｐａｃｅｒ）（メタロプロテアーゼ、ディスインテグリン様、ロンボスポンジン１型（ＴＳＰ１）リピート、Ｃｙｓリッチ、及びスペーサー）又はスペーサー（Ｓ）ドメイン領域のクローニング用の２つの受容体ベクターを調製した。以下の表１のオリゴヌクレオチドを使用してＡＤＡＭＴＳ１３のＭＤＴＣＳ又はＳドメイン領域についてエラープローンＰＣＲ（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を行い、増幅したＭＤＴＣＳ又はＳドメインのＰＣＲ産物を、電気泳動によって溶出されるアガロースゲル電気泳動後の溶出によって得た。ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅクローニング方法を使用して、溶出したＰＣＲ産物及びアクセプターベクターのライゲーション後、得られたものを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））に形質転換して、ランダム変異誘発によって産生されたバリアントのライブラリーを調製した。トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡを、ＰｌａｓｍｉｄＰｌｕｓ９６Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して１ライブラリーあたり３８４個の大腸菌コロニーから抽出して、合計７６８個の変異ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントを得た。アミノ酸変異のタイプ及び位置を、対応するＤＮＡのヌクレオチド配列分析により確かめた。

ヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの一過性発現
ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントのタンパク質の発現のために、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１４５２７）をＥｘｐｉ２９３発現培地に希釈して３×１０^６細胞／ｍＬの濃度に調製した。第１のチューブでは、プラスミドＤＮＡ２．５μｇをｏｐｔｉ－ＭＥＭＩＲｅｄｕｃｅｄ血清Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５－０７０）で最終容量１５２．５μＬに希釈し、他のチューブでは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３８μＬ及びｏｐｔｉ－ＭＥＭＩＲｅｄｕｃｅｄ血清Ｍｅｄｉｕｍ１４０μＬを混合し、５分間放置した。希釈したプラスミドＤＮＡ１５２．５μＬを第２のチューブの混合溶液に添加し、２０分間放置した。調製した細胞２．５ｍＬを２４ディープウェルプレートの各ウェルに等分した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３及び前もって調製したプラスミドＤＮＡの混合物を細胞に分配し、３７℃、ＣＯ_２条件のインキュベーターで２２５ｒｐｍで振盪しながら培養した。２４時間後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションエンハンサー１１５μＬ及びエンハンサー２１５０μＬをそこに添加し、５日間培養した。６日目に、培養物を３００ｒｃｆで５分間遠沈して上清を回収し、得られたものをバリアントの選択のための分析に使用した。

ヒト及びマウスＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体の構築
異なるドメインに結合するＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体を構築するために、抗原としての完全長組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６１５６－ＡＤ）及びＨｕｍａｎＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＬｉｂｒａｒｙ（ＨｕＣＡＬ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージライブラリーを使用して、ＡＤＡＭＴＳ１３に対して優れた結合能を有する１６種類のＦａｂを選択し、それらのうち、ＭＤＴＣＳ部分及びＣ末端部分のそれぞれに結合する６種類の抗体（Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を完全長抗体として調製した。ａＴＴＰ患者の血漿中、Ｓドメインに特異的に結合することが知られているＡｂ３－０１、Ａｂ４－１６、及びＡｂ４－２０も完全長抗体として構築し、バリアントの選択分析に使用した。

ヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの発現濃度の測定
一過性発現により得られた培養培地に存在するＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質の発現レベルを確かめるために抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体（Ａｂ６６、ＧＣＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓ抗体）を使用してＥＬＩＳＡを行った。ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、１７－５１６Ｑ）中２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体１００μＬを、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡ高結合型マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９０）のウェルごとに分注し、室温で２時間反応させた。次いで、洗浄バッファー（０．１ｖ／ｖ％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）を使用してマイクロプレートを３回洗浄した。ブロッキングバッファー（１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ）を１ウェルあたり３００μＬで分注し、室温で２時間反応させ、その後、洗浄バッファーで３回洗浄した。組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、６１５６－ＡＤ）を標準試料として使用し、測定する培養物をブロッキングバッファーで１６倍又は３２倍希釈し、１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１時間、５００ｒｐｍで撹拌して反応させた。３回洗浄後、抗６×Ｈｉｓタグ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ１１８７）を１：１０，０００希釈し、１ウェルあたり１００μＬで分注し、その後、室温で１時間、５００ｒｐｍで撹拌して反応させた。６回洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１０分間反応させた。その後、停止バッファー（Ｈ_２ＳＯ_４）を１ウェルあたり１００μＬで分注し、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を４５０ｎｍで測定した。測定した吸光度を標準試料反応曲線に代入し、濃度を算出した後、希釈係数を校正して最終濃度を決定した。

Ｆｃ融合ＭＤＴＣＳ断片及びバリアントの発現濃度の測定
ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１７－５１６Ｑ）を使用して２μｇ／ｍＬに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａ３８０３）を、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡ高結合型マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９０）に１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で２時間反応させた。次いで、洗浄バッファー（０．１ｖ／ｖ％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）を使用してマイクロプレートを３回洗浄した。ブロッキングバッファー（１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ）を１ウェルあたり３００μＬで分注し、室温で２時間反応させ、その後洗浄バッファーで３回洗浄した。標準試料として、濃度を確保したＦｃ融合ＭＤＴＣＳ断片タンパク質を使用し、測定する試料を標準範囲に含まれるようにブロッキングバッファーで希釈した。その後、得られたものを１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１時間、４００ｒｐｍで撹拌して反応させた。３回洗浄後、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ抗体（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ０１７０）を１：１０，０００希釈し、１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１時間、４００ｒｐｍで撹拌して反応させた。６回洗浄後、ＴＭＢを１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で３０分間反応させた。その後、停止バッファー（０．５ＭＨ_２ＳＯ_４）を１ウェルあたり１００μＬで分注し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。

ヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの活性の測定
ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの活性を測定するために、ＴｅｃｈｎｏｚｙｍｅＡＤＡＭＴＳ１３活性キット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、カタログ番号５４５０７０１）のマニュアルを使用して実験を行った。ＧＳＴ－ｖＷＦ７３基質を１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１時間反応させ、次いで洗浄バッファーで３回洗浄した。標準試料としてキットのキャリブレーターを使用し、測定する培養物としてストック溶液又はその３倍希釈物を、加熱不活性化血漿を使用して１ウェルあたり１００μＬで添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後、コンジュゲートを１ウェルあたり１００μＬで添加し、室温で１時間反応させ、洗浄バッファーで再び３回洗浄した。ＴＭＢ発色試薬を１ウェルあたり１００μＬで添加し、３０分間反応させ、次いで停止バッファー１００μＬを添加して反応を止め、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。特異的力価（ＩＵ／ｍｇ）を算出するために、発現結果（μｇ／ｍＬ）を活性値（ＩＵ／ｍＬ）に当てはめ、野生型（ＷＴ）ＡＤＡＭＴＳ１３及びバリアントの特異的力価を使用して、以下の方程式に代入して相対活性（％）を算出した：
相対活性（％）＝バリアントの特異的力野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の価／特異的力価×１００

ヒトＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体の回避率の確認
ＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体を回避するための各ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの能力を確かめるために、８種類の抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７、ＧＣＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓ）を使用してＥＬＩＳＡを行った。ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１７－５１６Ｑ）を使用して１～２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡ高結合型マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９０）に１ウェルあたり１００μＬで添加し、室温で２時間反応させた。次いで、マイクロプレートを洗浄バッファー（０．１％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で３回洗浄した。ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１ウェルあたり３００μＬで添加し、室温で２時間反応させ、次いで洗浄バッファーで３回洗浄した。標準試料として組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６１５６－ＡＤ）を使用し、測定する培養物をブロッキングバッファーで２５～５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１時間、５００ｒｐｍで振盪して反応させた。３回洗浄後、抗６×Ｈｉｓタグ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ１１８７）を１：１０，０００希釈し、１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１時間、５００ｒｐｍで振盪して反応させた。６回洗浄後、ＴＭＢを１ウェルあたり１００μＬで分注し、室温で１０～２０分間反応させた。次いで、停止バッファー（Ｈ_２ＳＯ_４）を１ウェルあたり１００μＬで分注し、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を４５０ｎｍで測定した。中和抗体回避率は、相対的結合レベルを野生型ＡＤＡＭＴＳ１３値と比較するように算出し、次いで、これを使用して以下の方程式に相対的回避率を代入した：
回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００
ＭＤＴＣＳ及びＦｃ（ＩｇＧ１－ＹＴＥ）コンジュゲートＭＤＴＣＳバリアントの構築及びタンパク質産生

ＩｇＧ１－ＹＴＥ（ヒンジ－Ｆｃ）をＭＤＴＣＳ又はＭＤＴＣＳバリアント断片にコンジュゲートした発現ベクターを構築し、遺伝子合成（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）を以下の表２に示すように行った。表２の各合成遺伝子をｐＭＳＩＤ２ベクター（ＧＣＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓによって構築された）に挿入して発現ベクターを構築した。ＣＨＯＤＧ４４（Ｓ）細胞を、ＣＤＭ４ＣＨＯ（ＧＥ、カタログ番号ＳＨ３０５５７．０２）培地を使用して３×１０^５細胞／ｍＬで期待量に応じて継代培養した。トランスフェクション当日、３×１０^７生細胞を回収し、ＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２３０９０１９）に懸濁し、１×１０^７細胞／ｍＬ（３ｍＬ）の最終容量に希釈し、１２５ｍＬ振盪フラスコに添加し、ＣＯ_２振盪インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）、１４０ｒｐｍで培養した。発現ベクター３０μｇを、ＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭを使用して合計容量１．５ｍＬに混合した（チューブ１）。トランスポーター５（商標）ＰＥＩ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ５^ＴＭＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号２６００８－５）９０μＬ、及びＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ１，４１０μＬを混合した（チューブ２）。前もって調製したチューブ２をチューブ１に添加し、穏やかに混合した後、混合物を室温で２０～３０分間反応させた。ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体３ｍＬを、前もって調製したＣＨＯＤＧ４４（Ｓ）細胞３ｍＬに滴下した。得られたものをＣＯ_２振盪インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）、１４０ｒｐｍで培養し、その４時間後、ＣＤＭ４ＣＨＯ培地２４ｍＬをＣＨＯＤＧ４４（Ｓ）／ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体６ｍＬに添加し、同じ条件下で培養した。インキュベーションの４８時間後、細胞数及び細胞の生存を測定し、得られたものを１５×１０^５細胞の容量まで遠心チューブに添加し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、２０ｎＭＭＴＸを含有するＣＤＭ４ＣＨＯ培地３０ｍＬに懸濁し、次いで振盪フラスコに接種し、培養した。細胞の生存が９０％以上に回復するまで継代培養を３～４日間おきに行った。最終過剰発現細胞株を大規模に培養し、タンパク質精製に使用した。ＭＤＴＣＳタンパク質精製のために、調製した培養物を遠心分離して細胞を除去し、次いで、調製した培養溶液を遠心分離後、酢酸セルロースで作られた滅菌フィルター（ＳａｒｔｏｂｒａｎＰ、５２３５３０７Ｈ７－ＯＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濾過した。濾過培養物を濃縮し、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー（ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ＧＥ）、マルチモードクロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイト、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、及び親和性クロマトグラフィー（ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ）を使用して精製し、ＭＤＴＣＳバリアントＩｇＧ１－ＹＴＥコンジュゲートタンパク質を、過剰発現細胞株の培養物を遠心分離して該細胞を除去するように濾過し、次いで酢酸セルロース（ＳａｒｔｏｂｒａｎＰ、５２３５３０７Ｈ７－ＯＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で作られた抗菌フィルターを使用して精製した。精製は、濾過培養物を使用して親和性クロマトグラフィー（プロテインＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して行った。精製タンパク質は９５％以上の純度を有することが確かめられた。

ＭＤＴＣＳ－ヒンジ－Ｆｃ融合物の薬物動態の確認
ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ（ヒンジ－Ｆｃ）融合物の血中持続時間及び薬物動態パラメーターを比較するために、４４匹又は５２匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（４匹／採血時）を各群で使用した。ＭＤＴＣＳ（対照群）、及びＩｇＧ１－ＹＴＥがＭＤＴＣＳバリアントに融合された３種類の物質（テスト群）１６０ＩＵ／ｋｇを尾静脈に注射した後、血液試料を０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、及び１６８時間時点で採取した。血液５００μＬを、１０％三クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｔｒｉ－ｃｉｔｒａｔｅ）（すなわち、抗凝固薬）を含有するシリンジにより心臓から採取し、２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して上清を分離し、血漿を得た。血漿中に存在するＭＤＴＣＳバリアント－ヒンジ－Ｆｃの活性を、ＴｅｃｈｎｏｚｙｍｅＡＤＡＭＴＳ１３活性キット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、カタログ番号５４５０７０１）のマニュアルに従って測定した。さらに、４４匹のマウスから得た血漿について活性アッセイを行って、マウス血漿中のマウスＡＤＡＭＴＳ１３活性の平均値（０．０７７２ＩＵ／ｍＬ）を得た。ＰＫ試験試料の活性の測定値から対応する値を除くことによって、マウス血漿に固有のマウスＡＤＡＭＴＳ１３活性を除外することができ、投与物質の活性の結果のみが得られた。ネイティブプール法（ｎａｔｉｖｅｐｏｏｌｅｄｍｅｔｈｏｄ）及びＷＩＮＮＯＮＬＩＮを使用して非コンパートメント解析によりデータを解析した。ｔ_１／２は薬物の血中半減期を示し、ＡＵＣ_Ｉｎｆは０～無限大時間までの活性グラフ下の面積を示し、平均滞留時間（ＭＲＴ）は体内の薬物分子の平均滞留時間を示す。

中和抗体のＡＤＡＭＴＳ１３結合部位の確認
完全長野生型又はＣ末端ドメインを連続的に欠失させた６種類のＡＤＡＭＴＳ１３の核酸配列を、ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５－ＨｉｓＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ８１０２０）にクローニングした。上記の一過性発現方法により得られた培養物を使用して、構築したＤＮＡをプロテインＡ－セファロース４Ｂを添加して免疫沈降し、その後ウェスタンブロットした。具体的には、３種類の３０ｎＭＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体（Ａｂ４－１６、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を正常な対照血漿（ＨｅｍｏｓＩＬ、カタログ番号０００２０００３１１０）に添加した。中和抗体を含有する血漿１０ｍＬ及びＡＤＡＭＴＳ１３の各断片タンパク質５０ｎｇを含有する培養物を一緒に添加した後、結合バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及び１％ＢＳＡ）５００μＬをそれに添加し、４℃で２４時間反応させた。反応の完了後、プロテインＡ－セファロース４Ｂ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０１０４１）２０μＬを５０％スラリーとしてそれに添加し、４℃で４時間反応させた。樹脂を８４５ｒｃｆで１分間、遠心分離によって回収し、次いで洗浄バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で３回洗浄した。樹脂に結合したタンパク質を、１０％ β－メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ試料バッファー（Ｎｏｖｅｘ、カタログ番号ＮＰ０００７）により溶出し、９５℃で５分間加熱し、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＶ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ９６０－２５）による抗免疫ブロットを行った。

ａＴＴＰ模倣疾患を有するマウスモデルにおけるバリアントのＰｏＣ評価
ａＴＴＰ模倣疾患を有するマウスモデルは、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスをヒトＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体で処理して確立した。ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子のエクソン１と６の間に大きな欠失及びフレームシフト変異を誘導してＭａｃｒｏｇｅｎにより調製された。等比で混合した９種類のＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、１２～２５週齢ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスに０．５４ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。１５分後、対照物質（ＭＤＴＣＳ－Ｆｃ）又は５種類のバリアント（１Ｃ０３、２Ｂ０２、５Ｃ０９、７Ａ０２、及びＤＭ２）を５，０００ＩＵ／ｋｇ又は７，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与した。投与の６時間後に血液試料を採取して、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定した。

ａＴＴＰモデルマウスで示されたＡＤＡＭＴＳ１３活性及び血液学的特性の回復が、ＤＭ２バリアントの投与によって改善されるかを確かめるために、等比で混合した９種類のＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、１２～２５週齢ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスに０．５４ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。１５分後、対照物質（ＭＤＴＣＳ－Ｆｃ）又はバリアントＤＭ２を、５，０００ＩＵ／ｋｇ、７，０００ＩＵ／ｋｇ、又は１４，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与した。中和抗体の投与の３０分後、組換えヒトｖＷＦ（ＶＥＹＶＯＮＤＩ）２，０００ＩＵ／ｋｇの投与後、その６時間後に血液７００μＬを採取し、血液３００μＬをＥＤＴＡチューブ（ＢＤＭｅｄｉｃａｌ、ＲＥＦ３６５９７４）に添加し、他の３００μＬをＳＳＴチューブ（ＢＤＭｅｄｉｃａｌ、ＲＥＦ３６５９６７）に添加し、３０分間室温に置き、次いで４℃、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を分離した。残存血液をクエン酸ナトリウムと９：１比（血液：クエン酸ナトリウム）で混合し、血漿を分離し、血漿中のヒトＡＤＡＭＴＳ１３の残存活性を分析するのに使用した。ＥＤＴＡチューブの白血球は、血球計（ＡＤＶＩＡｐ２１２０ｉ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して血小板（ＰＬＴ）などの一般的血液検査にかけ、ＳＳＴチューブで分離された血清は、血液生化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉ、７１８０）を使用して乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定するのに使用した。統計解析は、Ｔｕｋｅｙ検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用した。

ｃＴＴＰ疾患を有するマウスモデルにおけるバリアントのＰｏＣ評価
ｃＴＴＰ疾患を有するマウスモデルは、ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスを使用して確立した。１２～２５週齢ＡＤＡＭＴＳ１３ＫＯマウスに、ビヒクル又はＤＭ２バリアントを２０ＩＵ／ｋｇ、６０ＩＵ／ｋｇ、１８０ＩＵ／ｋｇ、及び３６０ＩＵ／ｋｇの用量で静脈内投与し、その１５分後、組換えヒトｖＷＦ（ＶＥＹＶＯＮＤＩ）を２，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与し、その６時間後に血液試料を採取した。白血球は血小板レベルの測定を含む一般的血液検査に使用し、血清はＬＤＨレベルの測定に使用し、血漿はヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性の分析に使用した。

実験結果
ランダム変異誘発を使用したヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの構築
ａＴＴＰ患者が持つＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体の場合、ＡＤＡＭＴＳ１３の様々なドメインのうちＭＤＴＣＳへの結合の割合が相対的に極めて高く、９７％を超えること、及びＳドメインが最もよく見られる結合部位であることが報告されている（Ｔｅｒｓｔｅｅｇら、２０１６；Ｋｌａｕｓら、２００４；Ｌｅｋｅｎら、２００５）。上記に基づき、ＭＤＴＣＳ部分又はＳドメインを標的にする変異が生じ得るように、エラープローンＰＣＲを行って各ライブラリーを調製した（図１ａ）。各ライブラリーから３８４個のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントのＤＮＡを得、ヌクレオチド配列を分析した結果、ＭＤＴＣＳ部分のライブラリーの総変異率は７２．９％であり、具体的には、サイレント変異又は非変異は２３．７％、空ベクター又は乏しい配列３．１％、ナンセンス変異８．９％、フレームシフト変異４．９％、及びミスセンス変異５９．１％の割合を示した（図１ｂ）。Ｓドメインライブラリーの場合、全体の変異率は５０．８％であり、サイレント変異又は非変異は４４．５％、空ベクター又は乏しい配列４．７％、ナンセンス変異２．３％、フレームシフト変異３．１％、及びミスセンス変異４５．３％を占めた（図１ｂ）。上記の変異のうち、サイレント又は非変異、空ベクター又は乏しい配列、及びナンセンス変異を示したそれらのバリアントを除外して、約５００個のバリアントを使用して選択実験を行った。

ＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体の調製及び結合部位の確認
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３の異なるエピトープを認識する抗体に関して、ＭＤＴＣＳ領域又はＳドメインに変異を有するバリアントがＡＤＡＭＴＳ１３の中和抗体を回避することができるかを確かめるために、ＨｕＣＡＬシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＦａｂを構築し、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３に対して優れた結合能を有する１６種類を選択した。１６種類の間で異なるドメインに特異的に結合することが確認されたＡｂ６６及びＡｂ６７を、完全長抗体の形態で作製した。Ａｂ４－１６は、ａＴＴＰ患者の血漿中でＳドメインに特異的に結合することが知られているため、完全長抗体の形態で作製し（Ｃａｓｉｎａら、２０１５）、各抗体の結合領域は、図２ｃに示す通り、Ａｂ４－１６がＳドメインに、Ａｂ６７がＭＤＴＣＳ領域に、Ａｂ６６がＣ末端（ＴＳＰ－２～ＴＳＰ－８ドメイン）に特異的に結合していた。

バリアントの選択基準の設定
バリアントの評価は、ランダム変異誘発により構築したバリアントのうち、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３と同じアミノ酸配列を有する非変異又はサイレント変異バリアント（以下、野生型クローン）に関して相対的結果を分析して実施した。合計５９個の野生型クローンを、Ａｂ４－１６及びＡｂ６７に対する活性及び結合親和性について分析し、各野生型クローンの分析結果を野生型ＡＤＡＭＴＳ１３構築物の結果と比べて示し、図３に示す。図３に見て取れるように、Ａｂ４－１６及びＡｂ６７抗体に対する野生型ＡＤＡＭＴＳ１３（５９種類）、変異ＡＤＡＭＴＳ１３（３０４種類）、及び保存的アミノ酸置換を含有する選択されたＡＤＡＭＴＳ１３（２６種類）に関する回避率及び相対活性が示されている。野生型クローンは、変異がないにもかかわらず野生型ＡＤＡＭＴＳ１３構築物による結果において相対的差異を示し、以下の表３に示すように、変異ＡＤＡＭＴＳ１３（３０４種類）のうち、回避率の特定の値又は相対活性より大きい値若しくは等しい値を有する２６種類のＡＤＡＭＴＳ１３変異体を選択した。

具体的には、変異ＡＤＡＭＴＳ１３に関して、Ａｂ４－１６に対する回避率は－２９．５％～３３．４％の範囲であり、Ａｂ６７に対する回避率は－２４．４％～３０．５％の範囲であり、相対活性は６２．７％～１２８．９％の範囲であることが示された（表３）。３シグマのルールを使用して正規分布を適用した結果、Ａｂ４－１６に対する回避率は－３４．１％～３８．５％であり、Ａｂ６７に対する回避率は－３８．５％～４２．３％であり、相対活性は４７．０％～１４５．２％の範囲であり、故にほとんど全てのＷＴクローンがこの分布内に入ると予測された。したがって、バリアントの選択において、選択基準を以下のように適用した：３シグマの最大に基づきＡｂ４－１６については３８．５％を超える回避率、Ａｂ６７については４２．３％の回避率、又は４７．０％以上の相対活性。

ＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体を回避し、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３のレベルより高いか又は等しい活性を有するバリアントの選択
ＷＴクローン及びアミノ酸変異を有するバリアントを細胞にトランスフェクション後、培養物中に存在するタンパク質の量を測定し、５０ｎｇ／ｍＬ以上の発現濃度を有する３０４個のバリアントについて中和抗体に対する結合親和性及び活性アッセイを行った。アミノ酸変異を有するバリアントは、ＷＴクローンと比べて中和抗体に対する結合親和性又は相対活性において様々な分布を有することが示され、それらのうち、選択基準を満足する２６種類のバリアントを最終的に選択した（図３ａ及び３ｂ）。２６個のバリアントのうち、１８種類のバリアントはＳドメインに変異を有することが示され、特に、Ｓドメイン変異を有する１３種類のバリアント（１Ｃ０３、１Ｇ０７、２Ｂ０１、２Ｂ０２、３Ｂ０５、３Ｇ０４、５Ｃ０９、５Ｇ０８、６Ｂ１２、７Ａ０２、８Ｃ０４、８Ｄ０１、及び８Ｆ０１）は、ａＡｂ４－１６に対する高い回避率を有することが示され、５種類のバリアント（７Ｅ０１、７Ｇ０８、８Ｃ０２、８Ｄ０１、及び８Ｄ０５）は、高い相対活性の特徴を有することが示された（表４）。６種類のバリアントはＤドメインに変異を有することが示され、それらのうち５種類（４６、３Ａ０６、４Ｃ０７、４Ｅ１１、及び４Ｈ０７）はＡｂ６７に対する高い回避率の特徴を示した。さらに、Ｍドメインの変異を有する６種類のバリアント、Ｃドメインの変異を有する２種類のバリアント、及びＴドメインの変異を有する２種類のバリアントを同定した。結果の繰り返し再現性を、２６個の選択されたバリアントについて３回の繰り返し実験により確かめ、ＷＴクローンと比べて繰り返しテストでも優位性を持続的に維持する１２種類のバリアントをインビトロ効力テストの対象として選択した。１２種類のバリアントのうち、１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、３Ｂ０５、５Ｃ０９、５Ｇ０８、７Ａ０２、及び８Ｄ０１をそれらの優れたＡｂ４－１６抗体回避率のために選択し、４Ｃ０７、４Ｅ１１及び４Ｈ０７をＡｂ６７抗体に対するそれらの優れた回避率のために選択した。最後に、８Ｄ０５をその優れた相対活性のために選択した。

１２種類の選択されたバリアントにおける追加の中和抗体を回避する能力を確かめるために、本発明者らは、スクリーニングに使用したＡｂ４－１６及びＡｂ６７抗体に加えて、中和抗体Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、及びＡｂ６５も回避することができるかを確かめようとした。１２種類のバリアントのうち、Ｓドメインにアミノ酸変異を有する９種類のバリアントの、８Ｄ０５を除く８種類のバリアント、１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、３Ｂ０５、５Ｃ０９、５Ｇ０８、７Ａ０２、及び８Ｄ０１は、ａＴＴＰ患者が持つＡＤＡＭＴＳ１３自己抗体の配列に基づき調製されたＡｂ４－１６及びＡｂ４－２０に対する優れた回避率を示し、これらのバリアントはまた、Ａｂ６０及びＡｂ６１に対する優れた回避能力も示した。対照的に、Ｄドメインにアミノ酸変異を有するバリアント４Ｃ０７、４Ｅ１１、及び４Ｈ０７の場合、Ａｂ６７に対する回避率が優れていた（図４、表５）。

Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントの中和抗体回避能力の確認
構造機能試験では、ＡＤＡＭＴＳ１３の合計１４個のドメインのうち、ＣＵＢ２ドメインがＣ末端ＴＳＰ－２から除去されたＭＤＴＣＳドメインは、ＡＤＡＭＴＳ１３に類似したメタロプロテアーゼ機能を有することが示され、故にＶＷＦを切断することができることが報告された（Ｓｈｅｌａｔら、２００５）。これは、完全長ＡＤＡＭＴＳ１３の代わりにＭＤＴＣＳ断片のみでもＴＴＰ疾患の治療剤として機能できること、及び患者の血漿中に存在する、Ｃ末端部分に結合する切断型の中和抗体を回避できることを示唆している。

さらに、本発明者らは、ＭＤＴＣＳ断片の構造的安定性をさらに改善し、Ｆｃを結合することによって半減期を延長しようと試みた。選択された１２種類のバリアントをＭＤＴＣＳを含む断片にし、Ｆｃ結合バリアントを調製し、２つのアミノ酸変異を有するＤＭ１及びＤＭ２バリアントを、選択されたバリアントアミノ酸残基を組み合わせてさらに調製した。最終候補物質は、上述の方法によって細胞で発現させた培養物及び精製溶液を使用して、単一又は混合中和抗体の回避率及び相対活性を測定して選択した。培養物を使用して８種類の単一中和抗体への結合の回避率及び該抗体に対する相対活性を測定した結果、２Ｂ０１、３Ｂ０５、４Ｈ０７、５Ｇ０８、８Ｄ０５、及びＤＭ１は、同じようなレベルで全ての中和抗体を回避することが示された（図５、表６）。１Ｃ０３、２Ｂ０２、５Ｃ０９、７Ａ０２、８Ｄ０１、及びＤＭ２は、３－０１及びＡｂ６０に対する結合の優れた回避率を示した。６種類の候補の全てがＳドメインにアミノ酸変異を有し、８Ｄ０１を除いて、６１２番目のアミノ酸に共通して変異を有することが示された。４Ｅ１１及びＤＭ２の場合、それらはＡｂ６７への結合の優れた回避率を有することが示され、両方ともＤドメインの３１４番目のアミノ酸に変異を有することが示された。相対活性の場合、ＤＭ１は５７．９％という最も低い相対活性を示し、１Ｃ０３は１３３．１％という最も高い相対活性を示した。上記の２種類を除く全ての候補は７８．２％～１２５．１％の相対活性を示し、ＭＤＴＣＳ－Ｆｃ対照群の相対活性と類似していた（表６）。９種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を同じ比で混合する条件下、対照群ＭＤＴＣＳ－Ｆｃと比べた４Ｃ０７及び５Ｃ０９を除く候補バリアントの回避能力を確かめるために、７．５ｎＭの混合中和抗体及び４ｎＭの各バリアント発現培養物を混合し、室温で１時間反応させて残存活性を測定した。ＭＤＴＣＳ－Ｆｃは３．５％の残存活性を維持することが示され、３Ｂ０５、４Ｅ１１、４Ｈ０７、５Ｇ０８、及び８Ｄ０５は１．２４％～２．４２％の残存活性を有することが確認され、故に残存活性はＭＤＴＣＳ－Ｆｃより低いことを示した（図６）。対照的に、１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、７Ａ０２、８Ｄ０１、ＤＭ１、及びＤＭ２の場合、残存活性は７．６９％～１８．８１％で維持され、故に、混合中和抗体による回避能力はＭＤＴＣＳ－Ｆｃと比べて優れていることを裏付けた（図６）。

精製溶液を使用して候補物質バリアントの中和抗体回避能力を確かめるために、Ｐｈｙｔｉｐシステム（プロテインＡ樹脂）を使用して４Ｃ０７及び５Ｃ０９を除く１２種類の培養物でタンパク質精製を行った。精製溶液の濃度をＦｃＥＬＩＳＡにより確かめ、標的タンパク質が銀染色により溶出されることが確認された。精製溶液を使用して単一中和抗体の回避率を確かめた結果、バリアントのほとんどが、培養物で評価された結果と同じような傾向を有することが確認された（図７）。２Ｂ０１５Ｇ０８、８Ｄ０５、及びＤＭ１バリアントは、８種類の中和抗体全てに関して中和抗体を２４．６％以上回避することが示され、１Ｃ０３、２Ｂ０２、７Ａ０２、８Ｄ０１、及びＤＭ２は、培養物の結果と同じような３－０１及びＡｂ６０への結合の優れた回避率を示した。４Ｅ１１及びＤＭ２の場合、それらは、培養物の結果と同じ、Ａｂ６７への結合の優れた回避率を有することが確認された。各バリアントの相対活性を図７及び表７に示す。混合中和抗体の条件下の残存活性を測定した結果、ＭＤＴＣＳ－Ｆｃは３．７６％の残存活性を維持することが確認され、３Ｂ０５、４Ｅ１１、４Ｈ０７、及び８Ｄ０５バリアントは２．０５％～３．５０％の残存活性を示すことが確認され、故にＭＤＴＣＳ－Ｆｃと比べてより高い抑制を示した。対照的に、１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、５Ｇ０８、７Ａ０２、８Ｄ０１、ＤＭ１、及びＤＭ２の場合、６．３４％～１２．８％の残存活性が維持されることが確認され、故に、ＭＤＴＣＳ－Ｆｃと比べて混合中和抗体が中和抗体を回避する優れた能力を有することを裏付けた（図８）。

上記の結果に基づき、混合中和抗体に対する相対活性又は回避率を包括的に考慮し、６１２番目のアミノ酸における変異のため混合中和抗体を回避する優れた能力を有すると予測される１Ｃ０３、２Ｂ０２、７Ａ０２、ＤＭ２、及び５Ｃ０９を、さらなる試験の５種類の候補として選択した。

最終的に選択された５種類のＭＤＴＣＳバリアント断片にＩｇＧ１－ＹＴＥがコンジュゲートされたＤＮＡを構築して細胞で発現させた培養物で、８種類の単一中和抗体の結合を回避する能力及び相対活性を測定した。その結果、１Ｃ０３、２Ｂ０２、５Ｃ０９、及び７Ａ０２はＡｂ３－０１及びＡｂ６０への結合の優れた回避率を示し、ＤＭ２の場合、Ａｂ３－０１、Ａｂ６０、及びＡｂ６７への結合の回避率が優れていることが確認された（図１０）。相対活性は、（図１０）のＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの相対活性と同様の９８．６～１２７．７％であった。９種類の中和抗体が同じ比で混合される条件下で、対照群ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥと比べて５種類のバリアント物質の回避能力を確かめるために、混合中和抗体（９種類）及び各バリアント発現培養物を混合し、室温で１時間反応させ、残存活性を測定した。ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの場合、残存活性は５．５％で維持され、５種類の物質の場合、残存活性は８．１８％～１３．４２で維持され、故に中和抗体による回避能力が対照群と比べて優れいることを裏付けた（図１１）。

タンパク質を、ＩｇＧ１－ＹＴＥが上記の５種類のＭＤＴＣＳバリアント断片にコンジュゲートされた発現培養物からＰｈｙｔｉｐシステム（プロテインＡ樹脂）を使用して精製し、混合中和抗体の残存活性及び特異的力価を精製溶液で測定した。対応する精製溶液の濃度をＦｃＥＬＩＳＡにより確かめ、標的タンパク質の溶出を銀染色により確かめた。混合中和抗体の条件下の残存活性を測定した結果、ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥは０．４％で維持されることが確認され、１Ｃ０３、２Ｂ０２、５Ｃ０９、７Ａ０２、及びＤＭ２の残存活性はそれぞれ５．７％、１．７％、８．８％、２．６％、及び７．９％で維持され、故に混合抗体回避能力はＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥより優れていることが裏付けられた。特異的力価を測定した結果、７Ａ０２（１０，２８８ＩＵ／ｍｇ）を除く４種類のバリアントは、対照群（１８，０３０ＩＵ／ｍｇ）と同じような１９，０９１ＩＵ／ｍｇ～２２，３７９ＩＵ／ｍｇの特異的力価を示すことが確認された（図１２）。その結果、５つのバリアント断片のＩｇＧ１－ＹＴＥコンジュゲート物質は、対照群と比べて混合中和抗体における優れた回避能力を有すること、及び７Ａ０２を除く４種類のバリアントは対照群と同じような特異的力価を有することが確認された。

ＭＤＴＣＳ断片バリアントの半減期がＦｃ結合によって増加したかの評価
ＭＤＴＣＳ（ＩｇＧ１－ＹＴＥ）に結合されたＦｃが半減期を実際に増加させるかを決定するために、マウスにおいて薬物動態分析を行った。この目的のために、ＩｇＧ１－ＹＴＥが結合されるＭＤＴＣＳ又はＭＤＴＣＳ、及び４種類の最終候補（１Ｃ０３、５Ｃ０９、７Ａ０２、及びＤＭ２）バリアント断片タンパク質をマウスの尾静脈に投与し、次いで血漿を各設定時間に得た。これらの物質を各物質の特異的力価に基づき１６０ＩＵ／ｋｇの濃度に投与し、各設定時間に得た血漿中に残存している物質の活性を活性アッセイにより測定した。得られた結果をナイーブプール法（ｎａｉｖｅｐｏｏｌｅｄｍｅｔｈｏｄ）によってまとめ、非コンパートメント解析法を使用して薬物動態解析を行った。ＭＤＴＣＳの半減期は２．８９８時間と測定され、ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥは１１．５１時間であり、各バリアントは５．１８４～９．９０２時間の半減期を示した。対照ＭＤＴＣＳと比べて、半減期はＩｇＧ１－ＹＴＥコンジュゲーションにより１．７９～３．９７倍延長された。さらに、ＩｇＧ１－ＹＴＥコンジュゲーションによる物質の平均滞留時間を示す平均滞留時間（ＭＲＴ）値は７．１８９～１１．６７時間であり、故に３．７４３時間と比べて滞留時間の増加を示した（表８、図９）。その結果、ＩｇＧ１－ＹＴＥ融合は、インビボでの血中半減期及び平均持続時間による活性の維持において有効であることが確認された。

上記のように、本発明者らは、ＭＤＴＣＳ領域若しくはＳドメインに結合するＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体を回避するか、又は野生型ＡＤＡＭＴＳ１３と同等以上の活性を示す２６種類の新規のバリアントを発見した。これらのうち、９種類の中和抗体に対する最も優れた回避能力又は著しく優れた相対活性を有する１２種類を選択し、次いで、ｖＷＦ切断に不可欠であるが、Ｃ末端に結合する中和抗体を効率的に回避することができるＭＤＴＣＳ断片を構築し、Ｄ、Ｃ又はＳドメインに結合する自己抗体を回避する割合が有意に改善されたバリアントを同定した。本発明のバリアントは、ＩｇＧ１－ＹＴＥコンジュゲーションにより血中半減期を増加させることによって、生理的活性の安定性及び耐久性が改善された有効な薬理学的成分として有用に使用することができる。

ａＴＴＰ模倣疾患マウスモデルにおけるバリアントＰｏＣの確認結果
確立したａＴＴＰ模倣マウスモデルから最終候補物質を選択するために、対照物質（ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ）又は選択された５つのバリアント候補物質（１Ｃ０３－ＩｇＧ１－ＹＴＥ、２Ｂ０２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ、５Ｃ０９－ＩｇＧ１－ＹＴＥ、７Ａ０２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ、及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ）を投与し、中和抗体を回避する割合を評価した（図１３ａ）。５種類のバリアント候補物質のうち、ＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥは、５，０００ＩＵ／ｋｇ及び７，０００ＩＵ／ｋｇの両方の用量で最も高いヒトＡＤＡＭＴＳ１３残存活性を示した（図１３ｂ）。最も良い中和抗体回避率を示したＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ物質を最終的に選択し、様々な濃度で投与してヒトＡＤＡＭＴＳ１３の残存活性を維持する能力及び臨床症状の軽減の程度を確認した（図１４ａ）；その結果、軽減の程度はＤＭ２用量が増加するにつれて増加することが確認され、血小板及びＬＤＨレベルの改善は、７，０００ＩＵ／ｋｇ投与群でＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ投与と比べてＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ投与により比較的高いことが観察された（図１４ｂ）。血小板及びＬＤＨレベルの改善と一致して、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性テストの結果、対照物質又は候補物質の投与用量に比例する残存活性の増加を観察することができた（図１４ｂ）。臨床症状の観察の結果、ａＴＴＰ模倣マウスモデルで示された死亡率又は血尿は、対照物質又は候補物質の投与によって低下することが確認された。特に、ＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ治療群の場合、いずれの用量でも死亡はなく、７，０００ＩＵ／ｋｇ以上の用量で投与した場合、血尿症状を有する対象は観察されなかった（図１４ｃ）。７，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与した場合、平均残存活性はＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの０．３２ＩＵ／ｍＬであり、これはＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの０．０３ＩＵ／ｍＬの平均残存活性より９．６倍高く、臨床症状の観察結果の差は、残存活性のそのような差によると決定された。一般的血液検査、臨床化学検査、及び臨床症状の観察の結果、ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの投与は、ａＴＴＰ模倣マウスモデルにおけるａＴＴＰの臨床症状を改善する傾向があることが確認され、これにより、インビボでのＰｏＣを確認することができた。特に、７，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与した場合、ＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ投与はＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ投与と比べて優れた改善効果を示すことが確認された。

ｃＴＴＰ疾患マウスモデルにおけるバリアントＰｏＣの確認の結果
ｃＴＴＰマウスモデルにおけるＴＴＰ疾患で現れる血液症状及び臨床症状の改善の存在並びにヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の程度を、ａＴＴＰ模倣マウスモデルでの５種類のバリアント候補のうち最も優れた効果を示したＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥを使用して確かめた（図１５ａ）。血小板及びＬＤＨレベルの改善は、ＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの用量の増加に従って濃度依存的に生じることを確認することができ、血小板の有意な増加は、対照群と比べてＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥ１８０を３６０ＩＵ／ｋｇで投与された群で観察され、特に、３６０ＩＵ／ｋｇで投与された群の場合、正常レベルに匹敵する回復が示された（図１５ｂ）。ＬＤＨレベルの場合、ＬＤＨは、１８０ＩＵ／ｋｇで投与された群において対照群と同じようなレベルまで回復することが確認された（図１５ｂ）。ＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥを６０ＩＵ／ｋｇ群の用量で投与した群から出発するＡＤＡＭＴＳ１３活性の場合、０．１ＩＵ／ｍＬ以上の平均活性が示され、３６０ＩＵ／ｋｇの用量で投与された群では、１．０８ＩＵ／ｍＬの平均活性が測定された（図１５ｂ）。したがって、ＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥバリアントは、ｃＴＴＰ疾患マウスにおいて臨床症状を効果的に改善し、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を回復させることができることが見出された。

本発明の特定の部分が上記に詳細に説明されたように、これらの特定の説明は当業者にとっての好ましい実施形態にすぎず、本発明の範囲がそれに限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びその同等物によって規定されることになる。

参考文献
1. Miesbach W, Menne J, Bommer M,Schonermarck U, Feldkamp T, Nitschke M, Westhoff TH, Seibert FS, Woitas R, SousaR, Wolf M, Walzer S, Schwander B. Orphanet Journal of Rare Diseases (2019)14:260. doi: 10.1186/s13023-019-1240-0.
2. Ercig B, Wichapong K,Reutelingsperger CPM, Vanhoorelbeke K, Voorberg J, Nicolaes GAF. ThrombHaemost. 2018;118(1):28-41. doi:10.1160/TH17-06-0404
3. Johanna A Kremer Hoving, Paul Coppo,Bernhard Lammle, Joel L Moake, Toshiyuki Miyata, Karen Vanhoorelbeke. Nat RevDis Primers. 2017 Apr 6; 3:17020. doi: 10.1038/nrdp.2017.20.
4. Genetic and Rare Diseases InformationCenter (GARD)-an NCATS Program. 10 October 2018
5. Tersteeg C, Verhenne S, Roose E, etal. Expert Rev Hematol. 2016; 9(2): 209-221. doi:10.1586/17474086.2016.1122515
6. Klaus C, Plaimauer B, Studt JD, etal. Blood. 2004; 103(12): 4514-4519. doi:10.1182/blood-2003-12-4165
7. Luken BM, Turenhout EA, Hulstein JJ,Van Mourik JA, Fijnheer R, Voorberg J. Thromb Haemost. 2005; 93(2):267-274.doi:10.1160/TH04-05-0301
8. Veronica C. Casina, Wenbing Hu,Jian-Hua Mao, Rui-Nan Lu, Hayley A. Hanby, Brandy Pickens, Zhong-Yuan Kan, WoonK. Lim, Leland Mayne, Eric M. Ostertag, Stephen Kacir, Don L. Siegel, S. WalterEnglander, and X. Long Zheng. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Aug 4; 112(31):9620-5. doi: 10.1073/pnas.1512561112.
9. Suresh G Shelat, Jihui Ai, and X.Long Zheng. Semin Thromb Hemost. 2005 Dec; 31(6):659-72. doi:10.1055/s-2005-925472.

本発明の特定の実施形態によれば、本発明に適用されるアミノ酸残基の置換は、８５番目の残基のＰｈｅでの置換、９３番目の残基のＶａｌでの置換、１２６番目の残基のＭｅｔでの置換、１３５番目の残基のＩｌｅでの置換、２７８番目の残基のＩｌｅでの置換、２８２番目の残基のＡｌａでの置換、３０８番目の残基のＬｙｓでの置換、３１４番目の残基のＴｈｒでの置換、３１７番目の残基のＨｉｓでの置換、３３４番目の残基のＴｈｒ又はＶａｌでの置換、３６４番目の残基のＡｒｇでの置換、３７６番目の残基のＡｓｐでの置換、４１３番目の残基のＡｓｐでの置換、４２７番目の残基のＡｓｎでの置換、４５２番目の残基のＩｌｅでの置換、４６５番目の残基のＡｓｐでの置換、５６７番目の残基のＳｅｒでの置換、５７８番目の残基のＬｅｕでの置換、５８５番目の残基のＡｓｎ又はＭｅｔでの置換、５８９番目の残基のＧｌｎでの置換、６０７番目の残基のＡｒｇでの置換、６０８番目の残基のＭｅｔでの置換、６０９番目の残基のＬｅｕでの置換、６１２番目の残基のＰｈｅ又はＴｙｒでの置換、６１８番目の残基のＳｅｒでの置換、６２４番目の残基のＡｓｐ又はＣｙｓでの置換、６３０番目の残基のＬｅｕでの置換、６３５番目の残基のＶａｌでの置換、６４３番目の残基のＰｈｅでの置換、６５０番目の残基のＨｉｓでの置換、６５１番目の残基のＡｓｐでの置換、６５４番目の残基のＧｌｙでの置換、６５５番目の残基のＶａｌでの置換、６５６番目の残基のＡｒｇ又はＨｉｓでの置換、６５８番目の残基のＨｉｓでの置換、６６４番目の残基のＡｓｎでの置換、及び６７２番目の残基のＶａｌでの置換からなる群から選択される少なくとも１つである。

本発明の特定の実施形態によれば、Ｆｃ領域は、配列番号２の２２番目、２４番目、及び２６番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。より具体的には、アミノ酸残基の置換は、２２番目の残基のＴｙｒでの置換、２４番目の残基のＴｈｒでの置換、及び２６番目の残基のＧｌｕでの置換からなる群から選択される少なくとも１つである。

ランダム変異誘発を使用してヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントライブラリーの構築を示す略図、及び変異率を確かめた結果を示す図である。図１ａは、ランダム変異誘発によるライブラリー構築プロセスの模式図である。ランダム変異を、エラープローンＰＣＲ（ＥＰＰＣＲ）によりＭＤＴＣＳ領域又はＳドメインに誘導し、アクセプターベクターに挿入し、クローニングし、次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換してコロニーを確保した。ＤＮＡをコロニーから抽出し、変異したヌクレオチド配列をサンガー配列決定分析により確かめた。ランダム変異誘発を使用してヒトＡＤＡＭＴＳ１３バリアントライブラリーの構築を示す略図、及び変異率を確かめた結果を示す図である。図１ｂは、配列決定分析の結果を示すグラフを示す。ＭＤＴＣＳ又はＳドメインを標的にすることによって構築されたライブラリーの総変異率及び変異形態をそれぞれ確かめた。中和抗体に結合するＡＤＡＭＴＳ１３の各ドメインの結合部位を確かめた結果を示す略図である。図２ａは、ＡＤＡＭＴＳ１３の発現率又は中和抗体の結合部位を確かめるために調製された、様々なドメインが組み合わされた６種類のＡＤＡＭＴＳ１３断片（又は野生型完全長ＡＤＡＭＴＳ１３）の模式図を示す。中和抗体に結合するＡＤＡＭＴＳ１３の各ドメインの結合部位を確かめた結果を示す略図である。図２ｂは、各ＡＤＡＭＴＳ１３ドメインで発現されたタンパク質を使用してプロテインＡ－セファロース及び各中和抗体を混合して免疫沈降させた後、抗Ｖ５抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果を示す。「インプット」は、各ドメインのタンパク質の発現レベルを示す。中和抗体に結合するＡＤＡＭＴＳ１３の各ドメインの結合部位を確かめた結果を示す略図である。図２ｃは、Ａｂ４－１６抗体がＳドメインに、Ａｂ６７抗体がＤドメインに、Ａｂ６６抗体がＴ２～Ｔ８ドメインにそれぞれ特異的に結合することを示す、ＡＤＡＭＴＳ１３中和抗体の結合部位の模式図である。抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を回避するか又は野生型ＡＤＡＭＴＳ１３より優れた活性を有するバリアントのスクリーニング結果を示す略図である。Ａｂ４－１６抗体又はＡｂ６７抗体の回避率及びＡＤＡＭＴＳ１３活性は、野生型クローン及びＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。相対活性は、野生型クローン及びバリアントの特異的力価を確かめ、それらを以下の方程式に代入して算出した：相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００。抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を回避するか又は野生型ＡＤＡＭＴＳ１３より優れた活性を有するバリアントのスクリーニング結果を示す略図である。Ａｂ４－１６抗体又はＡｂ６７抗体の回避率及びＡＤＡＭＴＳ１３活性は、野生型クローン及びＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。相対活性は、野生型クローン及びバリアントの特異的力価を確かめ、それらを以下の方程式に代入して算出した：相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／野生型ＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００。単一中和抗体に対する１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの回避率を確かめた結果を示す図である。７種類の中和抗体（Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に対する抗体回避率を、１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。中和抗体回避率は、相対的結合レベルをＷＴＡＤＡＭＴＳ１３値と比較し、これを使用して以下の方程式に相対的回避率を代入して算出した：回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００。単一中和抗体に対する１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントの回避率を確かめた結果を示す図である。７種類の中和抗体（Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に対する抗体回避率を、１２種類の完全長ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントで測定した。中和抗体回避率は、相対的結合レベルをＷＴＡＤＡＭＴＳ１３値と比較し、これを使用して以下の方程式に相対的回避率を代入して算出した：回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された１２種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、次いでＦｃ結合バリアントを選択された変異アミノ酸残基と組み合わせ、２つのアミノ酸変異を有するＤＭ１及びＤＭ２バリアントを含む合計１４種類のバリアントを発現させた培養培地を使用して、８種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）のＡＤＡＭＴＳ１３の中和抗体回避率及び相対活性を測定した。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された１２種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、次いでＦｃ結合バリアントを選択された変異アミノ酸残基と組み合わせ、２つのアミノ酸変異を有するＤＭ１及びＤＭ２バリアントを含む合計１４種類のバリアントを発現させた培養培地を使用して、８種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）のＡＤＡＭＴＳ１３の中和抗体回避率及び相対活性を測定した。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＷＴＡＤＡＭＴＳ１３の特異的力価×１００Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される９種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－Ｆｃ（すなわち、対照群）及び１２種類の候補バリアントを発現する４ｎＭ培養培地に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を以下の方程式に代入して算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地及び精製溶液の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に関する中和抗体の回避率及び相対活性を、１２種類のバリアント（１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、３Ｂ０５、４Ｅ１１、４Ｈ０７、５Ｇ０８、７Ａ０２、８Ｄ０１、８Ｄ０５、ＤＭ１、及びＤＭ２）を発現させた培養培地か、又はＰｈｙｔｉｐシステムを使用して精製した精製溶液を使用して測定した（図７ａ及び７ｂ）。精製溶液の濃度をＦｃＥＬＩＳＡにより確かめた。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの結合能）×１００、相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの特異的力価×１００。それぞれ、黒色のバーは精製バリアントタンパク質を示し、白色のバーは発現したバリアントタンパク質の中央値を示す。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地及び精製溶液の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）に関する中和抗体の回避率及び相対活性を、１２種類のバリアント（１Ｃ０３、２Ｂ０１、２Ｂ０２、３Ｂ０５、４Ｅ１１、４Ｈ０７、５Ｇ０８、７Ａ０２、８Ｄ０１、８Ｄ０５、ＤＭ１、及びＤＭ２）を発現させた培養培地か、又はＰｈｙｔｉｐシステムを使用して精製した精製溶液を使用して測定した（図７ａ及び７ｂ）。精製溶液の濃度をＦｃＥＬＩＳＡにより確かめた。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの結合能）×１００、相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－Ｆｃの特異的力価×１００。それぞれ、黒色のバーは精製バリアントタンパク質を示し、白色のバーは発現したバリアントタンパク質の中央値を示す。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地及び精製溶液の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される８種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－Ｆｃ（すなわち、対照群）及び１２種類の候補バリアントを発現する培養培地か又は４ｎＭ精製溶液に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を測定した。残存活性を以下の方程式に代入して算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。Ｆｃ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントの薬物動態の結果を示すグラフである。ＭＤＴＣＳ又はＦｃ（ＩｇＧ１－ＹＴＥ）結合ＭＤＴＣＳ及び４つの最終候補バリアント（１Ｃ０３、５Ｃ０９、７Ａ０２、及びＤＭ２）断片タンパク質をマウスの尾静脈に投与後、血漿を１時間ごとに得た。タンパク質は、各物質の特異的力価が１６０ＩＵ／ｋｇとなり得るように投与し、１時間ごとに得た血漿中に残留している物質の活性を活性アッセイにより測定した。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された５種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）の中和抗体を回避する率及び相対活性を、ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合バリアントを発現する培養培地を使用して測定した（図１０ａ及び１０ｂ）。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの特異的力価×１００。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地の条件下で単一中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。選択された５種類のバリアントをＭＤＴＣＳ断片化に供し、８種類の単一中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、及びＡｂ６７）の中和抗体を回避する率及び相対活性を、ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合バリアントを発現する培養培地を使用して測定した（図１０ａ及び１０ｂ）。回避率（％）＝（１－バリアントの結合能／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの結合能）×１００；相対活性（％）＝バリアントの特異的力価／ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥの特異的力価×１００。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアントを発現する培養培地の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される９種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ（すなわち、対照群）及び５種類の候補バリアントを発現する４ｎＭ培養培地に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を以下の方程式によって算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。ＩｇＧ１－ＹＴＥ結合ＭＤＴＣＳ断片バリアント培養培地の条件下で混合中和抗体を回避する能力を確かめた結果を示す図である。等比で混合される９種類の中和抗体（Ａｂ３－０１、Ａｂ４－１６、Ａｂ４－２０、Ａｂ６０、Ａｂ６１、Ａｂ６４、Ａｂ６５、Ａｂ６６、及びＡｂ６７）を、ＭＤＴＣＳ－ＩｇＧ１－ＹＴＥ（すなわち、対照群）及び５種類の候補バリアントを含む４ｎＭ精製溶液に混合し、反応させた。次いで、各候補バリアントの残存活性を以下の方程式によって算出した：残存活性（％）＝Ａ÷Ｂ×１００（Ａ：混合中和抗体の条件下の活性、Ｂ：中和抗体で治療しない条件下の活性）。それぞれ、ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して中和抗体を回避する率をテストするための手順を示す模式図（図１３ａ）、及びバリアント候補の用量に応じた残存ＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す略図（図１３ｂ）である。それぞれ、ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して中和抗体を回避する率をテストするための手順を示す模式図（図１３ａ）、及びバリアント候補の用量に応じた残存ＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す略図（図１３ｂ）である。ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して最も優れた中和抗体回避率（図１４ａ）、血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善を示す模式図（図１４ｂ）、並びに臨床症状の観察結果（図１４ｃ）をそれぞれ示した、ＤＡＭＴＳ１３の残存活性を維持するためのテスト手順を示す模式図、及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの濃度に応じた臨床症状を示す図である。ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して最も優れた中和抗体回避率（図１４ａ）、血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善を示す模式図（図１４ｂ）、並びに臨床症状の観察結果（図１４ｃ）をそれぞれ示した、ＤＡＭＴＳ１３の残存活性を維持するためのテスト手順を示す模式図、及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの濃度に応じた臨床症状を示す図である。ａＴＴＰ模倣マウスモデルを使用して最も優れた中和抗体回避率（図１４ａ）、血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善を示す模式図（図１４ｂ）、並びに臨床症状の観察結果（図１４ｃ）をそれぞれ示した、ＤＡＭＴＳ１３の残存活性を維持するためのテスト手順を示す模式図、及びＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの濃度に応じた臨床症状を示す図である。ｃＴＴＰマウスモデルへのＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの投与による血液症状及び臨床症状の改善の存在／非存在、及びヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の程度に関するテスト手順を示す模式図（図１５ａ）、並びに血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善、及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の観察結果（図１５ｂ）をそれぞれ示す図である。ｃＴＴＰマウスモデルへのＤＭ２－ＩｇＧ１－ＹＴＥの投与による血液症状及び臨床症状の改善の存在／非存在、及びヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の程度に関するテスト手順を示す模式図（図１５ａ）、並びに血小板及びＬＤＨレベル及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の改善、及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の回復の観察結果（図１５ｂ）をそれぞれ示す図である。

Claims

配列番号１の８５番目、９３番目、１２６番目、１３５番目、２７８番目、２８２番目、３０８番目、３１４番目、３１７番目、３３４番目、３６４番目、３７６番目、４１３番目、４２７番目、４５２番目、４６５番目、５６７番目、５７８番目、５８５番目、５８９番目、６０７番目、６０８番目、６０９番目、６１２番目、６１８番目、６２４番目、６３０番目、６３５番目、６４３番目、６５０番目、６５１番目、６５４番目、６５５番目、６５６番目、６５８番目、６６４番目、及び６７２番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含むＡＤＡＭＴＳ１３（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｗｉｔｈａｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｔｙｐｅ１ｍｏｔｉｆ，ｍｅｍｂｅｒ１３）バリアントタンパク質、又はその機能性断片。
前記ＡＤＡＭＴＳ１３のバリアントタンパク質が、以下の位置にアミノ酸残基の置換を含む各バリアントタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質又はその機能性断片：
８５番目及び３１７番目の残基；６１２番目の残基；２８２番目、４６５番目、及び６７２番目の残基のうち２つ以上；６３５番目の残基；４５２番目及び６１２番目の残基；２７８番目、３３４番目、及び４２７番目の残基のうち２つ以上；６１８番目の残基；１３５番目の残基；１２６番目、５６７番目、及び６５１番目の残基のうち２つ以上；４１３番目の残基；３３４番目の残基；３１４番目の残基；９３番目、３６４番目、及び３７６番目の残基のうち２つ以上；３０８番目の残基；６５６番目の残基；６０７番目の残基；６１２及び６２４番目の残基；５８９番目の残基；６５０番目及び６５６番目の残基；６４３番目の残基；５８５番目及び６５８番目の残基；６３０番目、６５４番目、及び６６４番目の残基のうち２つ以上；５８９番目、６０８番目、６０９番目、６２４番目、及び６５５番目の残基のうち４つ以上；５７８番目の残基；５８５番目の残基；３１４番目及び６３５番目の残基；並びに３１４番目及び６１２番目の残基。
８５番目の残基がＰｈｅで、９３番目の残基がＶａｌで、１２６番目の残基がＭｅｔで、１３５番目の残基がＩｌｅで、２７８番目の残基がＩｌｅで、２８２番目の残基がＡｌａで、３０８番目の残基がＬｙｓで、３１４番目の残基がＴｈｒで、３１７番目の残基がＨｉｓで、３３４番目の残基がＴｈｒ又はＶａｌで、３６４番目の残基がＡｒｇで、３７６番目の残基がＡｓｐで、４１３番目の残基がＡｓｐで、４２７番目の残基がＡｓｎで、４５２番目の残基がＩｌｅで、４６５番目の残基がＡｓｐで、５６７番目の残基がＳｅｒで、５７８番目の残基がＬｅｕで、５８５番目の残基がＡｓｎ又はＭｅｔで、５８９番目の残基がＧｌｎで、６０７番目の残基がＡｒｇで、６０８番目の残基がＭｅｔで、６０９番目の残基がＬｅｕで、６１２番目の残基がＰｈｅ又はＴｙｒで、６１８番目の残基がＳｅｒで、６２４番目の残基がＡｓｐ又はＣｙｓで、６３０番目の残基がＬｅｕで、６３５番目の残基がＶａｌで、６４３番目の残基がＰｈｅで、６５０番目の残基がＨｉｓで、６５１番目の残基がＡｓｐで、６５４番目の残基がＧｌｙで、６５５番目の残基がＶａｌで、６５６番目の残基がＡｒｇ又はＨｉｓで、６５８番目の残基がＨｉｓで、６６４番目の残基がＡｓｎで、及び６７２番目の残基がＶａｌでそれぞれ置換されている、請求項１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質又はその機能性断片。
（ａ）請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３のバリアントタンパク質又はその機能性断片；及び
（ｂ）前記（ａ）にコンジュゲートされたＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃ領域
を含む融合タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、配列番号２の２２番目、２４番目、及び２６番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記２２番目の残基がＴｙｒで、前記２４番目の残基がＴｈｒで、及び前記２６番目の残基がＧｌｕでそれぞれ置換されている、請求項５に記載の融合タンパク質。
前記（ａ）と（ｂ）の間にＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域をさらに含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質若しくはその機能性断片；又は請求項４～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド。
請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３バリアントタンパク質若しくはその機能性断片；又は請求項４～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質；又は請求項８に記載のヌクレオチドを活性成分として含む、血栓性疾患を予防若しくは治療するための組成物。
前記血栓性疾患が血栓性微小血管症（ＴＭＡ）である、請求項９に記載の組成物。
前記血栓性微小血管症（ＴＭＡ）が、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、ＨＥＬＬＰ（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ，ＥｌｅｖａｔｅｄＬｉｖｅｒｅｎｚｙｍｅｓ，ａｎｄＬｏｗＰｌａｔｅｌｅｔｃｏｕｎｔ）症候群、妊娠高血圧腎症、及び鎌状赤血球症からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
自己抗体に対する回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントをスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（ａ）配列番号１の８５番目、９３番目、１２６番目、１３５番目、２７８番目、２８２番目、３０８番目、３１４番目、３１７番目、３３４番目、３６４番目、３７６番目、４１３番目、４２７番目、４５２番目、４６５番目、５６７番目、５７８番目、５８５番目、５８９番目、６０７番目、６０８番目、６０９番目、６１２番目、６１８番目、６２４番目、６３０番目、６３５番目、６４３番目、６５０番目、６５１番目、６５４番目、６５５番目、６５６番目、６５８番目、６６４番目、及び６７２番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基が置換又は欠失されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントを調製するステップ；並びに
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ１３に対する自己抗体を、前記ステップ（ａ）で調製されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントに接触させるステップを含み；
前記自己抗体が、野生型ＡＤＡＭＴＳ１３に対する親和性より低い親和性で前記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントに結合する場合、前記ＡＤＡＭＴＳ１３バリアントは、自己抗体に対する回避率が改善されたＡＤＡＭＴＳ１３バリアントとして決定される、前記方法。
前記ステップ（ａ）が、配列番号１の８５番目、９３番目、１２６番目、１３５番目、２７８番目、２８２番目、３０８番目、３１４番目、３１７番目、３３４番目、３７６番目、４１３番目、４２７番目、４６５番目、５６７番目、５７８番目、５８５番目、６０７番目、６０９番目、６１２番目、６２４番目、６３０番目、６４３番目、６５０番目、６５４番目、６５５番目、６５６番目、６５８番目、及び６７２番目の残基からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基を置換することによって行われる、請求項１２に記載の方法。