JP2023549017A - 多価担体および関連するワクチン組成物 - Google Patents

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Abstract

本明細書には、異なるコロナウイルスに由来する複数の異種コロナウイルスタンパク質抗原を含む多価担体が開示される。本明細書に記載の多価担体は、コロナウイルス抗原が多価担体を産生するために由来するコロナウイルスとは異なるコロナウイルスに対する異種結合および中和特性を誘発することができる。また、本明細書で提供されるのは、多価担体を含むワクチン組成物、および様々な治療的および予防的適用においてワクチン組成物を使用する関連方法である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月１１日に出願された米国仮出願第６３／１１２，４９５号の優先権を主張する。この関連出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
連邦政府支援の記載
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた付与番号AI１３８９３８の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表
本出願は、電子形式で配列表と共に出願されている。配列表は、サイズが４７キロバイトで、２０２１年１０月２５日に作製した、「Sequence＿Listing＿３０KJ－３０２４３０－WO」というタイトルのファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は一般に、免疫医学の分野に関し、特に、ウイルス障害に対するワクチンに関する。
関連技術の説明
重症急性呼吸器症候群（SARS）は、発熱、頭痛、ならびに咳、呼吸困難および肺炎を含む重症呼吸器症状を特徴とする、高死亡率を伴うコロナウイルス感染によって引き起こされる重症の新興ウイルス疾患である。２つの人獣共通ベータコロナウイルス、SARS－CoVおよびMERS－CoVは、過去２０年以内に集団発生をもたらした。新たに出現したベータコロナウイルス、SARS－CoV－２は２０２０年に世界的感染爆発をもたらし、何百万もの感染および、呼吸器疾患COVID－１９を引き起こした。SARS－CoV－２およびSARS関連緊急人獣共通コロナウイルスに対する防御が緊急に必要とされている。
本明細書において提供されるのは、多価担体および関連ワクチン組成物、多価担体およびワクチン組成物を使用するための方法、ならびに対象をコロナウイルス感染から保護するためのキットである。
本明細書には、ワクチン組成物が開示される。ワクチン組成物は例えば、複数のコロナウイルス抗原に関連する多価担体を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原と、第１のコロナウイルスとは異なる第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原とを含む。複数のコロナウイルス抗原は多価担体の表面上に提示され得るか、または多価担体に部分的に（例えば、実質的に）包埋され得る。複数のコロナウイルス抗原は、コロナウイルススパイクタンパク質（Sタンパク質）もしくはその一部、コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質（Nタンパク質）もしくはその一部、コロナウイルスヘマグルチニン－エステラーゼタンパク質（HEタンパク質）もしくはその一部、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼもしくはその一部、コロナウイルス３CLプロテアーゼもしくはその一部、コロナウイルス膜タンパク質（Mタンパク質）もしくはその一部、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
複数のコロナウイルス抗原は、同じタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原が異なるタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含む。複数のコロナウイルス抗原は例えば、コロナウイルスSタンパク質またはその一部を含むことができる。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原がコロナウイルスSタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）またはその一部を含む。いくつかの実施形態では第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルス抗原、またはその両方はコロナウイルスSタンパク質またはその一部を含む。いくつかの実施形態では第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルス抗原、またはその両方はコロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部を含む。複数のコロナウイルス抗原のうちの１つまたは複数、または複数のコロナウイルス抗原の各々は、互いに約、少なくとも、または少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原はそれぞれ、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分を含み、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分は互いに約、少なくとも、または少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原のうちの１つまたは複数、または複数のコロナウイルス抗原の各々は（１）配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（２）配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、第１のコロナウイルス抗原は、（１）配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（２）配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列を含み得る。第２のコロナウイルス抗原は例えば、（１）配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（２）配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列を含み得る。第１のコロナウイルス抗原分子の数および第２のコロナウイルス抗原分子の数は例えば、１：１００～１００：１の比であり得る。
いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原が３つ、４つ、５つ、サイズ７つ、または８つのコロナウイルス抗原を含み、コロナウイルスの各々は互いに異なる。いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原が第３のコロナウイルスの少なくとも第３のコロナウイルス抗原および第４のコロナウイルスの第４のコロナウイルス抗原をさらに含み、第１、第２、第３および第４のコロナウイルスは互いに異なる。いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原が第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原、第４のコロナウイルスの第４の抗原コロナウイルス、第５のコロナウイルスの第５のコロナウイルス抗原、第６のコロナウイルスの第６のコロナウイルス抗原、第７のコロナウイルスの第７のコロナウイルス抗原、および第８のコロナウイルスの第８のコロナウイルス抗原のうちの１つまたは複数をさらに含み、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８のコロナウイルスは互いに異なる。いくつかの実施形態ではワクチン組成物が３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのコロナウイルスSタンパク質RBDを含み、複数のコロナウイルスSタンパク質RBDのそれぞれは互いに異なる。
複数のコロナウイルス抗原のうちの１つ以上は、アルファ－コロナウイルスおよび／またはベータ－コロナウイルスの属におけるコロナウイルスのものであり得る。いくつかの実施形態において、複数のコロナウイルス抗原の各々は、ベータコロナウイルスの属におけるコロナウイルスのものである。いくつかの実施形態において、複数のコロナウイルス抗原は、Sarbecovirus亜属におけるコロナウイルスのものである。いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスがベータ－コロナウイルスの属にあり、任意選択で、サルベコウイルスの亜属にある。複数のコロナウイルス抗原は、SARS、SARS－２、WIV１、SHC０１４、Rf１、RmYN０２、pang１７、RaTG１３、およびRs４０８１から選択されるコロナウイルスであり得る。例えば、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、またはその両方は、SARS、SARS－２、WIV１、SHC０１４、Rf１、RmYN０２、pang１７、RaTG１３、およびRs４０８１から選択することができる。
複数のコロナウイルス抗原を多価担体に共有結合させることができ、場合により複数のコロナウイルス抗原を多価担体にコンジュゲートさせる。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原がクリックケミストリーを介して多価担体に結合される。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原が多価担体に非共有結合的に結合している。多価担体の非限定的な例としては、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノワイヤー、デンドリマー、リポソーム、エトソームおよびアクアソーム、ポリマーソームおよびニオソーム、発泡体、ハイドロゲル、立方体、量子ドット、エキソソーム、マクロファージ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、多価担体が脂質ベースのナノ粒子、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルジョン、ナノワイヤー、シリカナノ粒子、ウイルス様粒子、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子、脂質－ポリマー粒子、ナノリポタンパク質粒子、およびそれらの組み合わせから選択されるナノ粒子を含む。多価担体は例えば、ウイルス様粒子（VLP）を含むことができ、例えば、ウイルス様粒子は、Ap２０５ VLPであることができる。いくつかの実施形態において、多価担体は、自己組織化ナノ粒子を含む。自己組織化ナノ粒子は例えば、i３０１ナノ粒子もしくはその変異体、またはmi３ナノ粒子もしくはその変異体であり得る。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物が複数の粒子形成タンパク質を含む。複数の粒子形成タンパク質の１つ以上は例えば、２－デヒドロ－３－デオキシ－ホスホグルコン酸（KDPG）アルドラーゼまたはその変形例を含むことができる。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原のうちのコロナウイルス抗原が複数の粒子形成タンパク質のうちの粒子形成タンパク質に結合される。例えば、複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原は、Spyタグ／SpyCatcher結合対を介して複数の粒子形成タンパク質の粒子形成タンパク質に結合させることができる。
いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原がコロナウイルス抗原のC末端にSpyタグを含み、複数の粒子形成タンパク質の粒子形成タンパク質は粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherを含む。いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原がコロナウイルスSタンパク質RBDを含み、コロナウイルスSタンパク質RBDはコロナウイルスSタンパク質RBDのC末端にSpyタグを含み、複数の粒子形成タンパク質の粒子形成タンパク質は粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherを含む。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含むことができる。アジュバントの非限定的な例としては、水酸化アルミニウム、アルヒドロゲル、AddaVax、MF５９、AS０３、フロイントアジュバント、モンタニドISA５１、CpG、ポリI：C、グルコピラノシルリピドA、フラジェリン、レシキモド、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書には、それを必要とする対象において免疫反応を刺激する方法が開示される。本方法は例えば、本明細書に開示されるワクチン組成物のいずれか１つの薬学的有効量を対象に投与し、それによって対象における免疫応答を刺激することを含む。本明細書には、それを必要とする対象におけるコロナウイルス感染を治療または予防するための方法が開示される。本方法は例えば、本明細書に開示されるワクチン組成物のいずれか１つの薬学的有効量を対象に投与し、それによって対象におけるコロナウイルス感染を治療または予防することを含むことができる。また、本明細書には、それを必要とする対象におけるコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を治療または予防するための方法が含まれる。本方法は例えば、本明細書に開示されるワクチン組成物のいずれか１つの薬学的有効量を対象に投与し、それによって対象におけるコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を治療または予防することを含むことができる。ワクチン組成物は例えば、２週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、またはそれ以上の間に１回、２回、３回、４回、またはそれ以上、対象に投与することができる。ワクチン組成物は例えば、少なくとも２週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、またはそれ以上の間隔で、１回、２回、３回、４回、またはそれ以上、対象に投与することができる。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物の投与が第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が存在するコロナウイルスとは異なるさらなるコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が存在するコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療または予防することをもたらす。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が有するコロナウイルスとは異なるさらなるコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療または予防することをもたらす。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が原因であるコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療または予防することをもたらす。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を治療または予防することをもたらす。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与すると、複数のコロナウイルス抗原が有するコロナウイルスとは異なるさらなるコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害が治療または予防される。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が有するコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を治療または予防することをもたらす。
ワクチン組成物を投与することは、例えば、第１のワクチン組成物を対象に投与すること、および第２のワクチン組成物を対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のワクチン組成物を対象に投与することは第１のワクチン組成物を対象に投与した後、約２、３、４週間、またはそれ以上で行われる。
また、本明細書に開示されるキットは、本明細書に開示されるワクチン組成物のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、キットが（１）それを必要とする対象において免疫反応を刺激すること、（２）それを必要とする対象においてコロナウイルス感染を処理または予防すること、および（３）それを必要とする対象においてコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を処理または予防することのうちの１つまたは複数についての説明を提供することを含む。
図１A～図１Dは、この研究のために選択されたRBDの非限定的な例示的実施形態を示す。図１Aの左は、１つのRBD(破線の円）が「上」位置にあるSARS－CoV－２ S三量体（PDB ６VXX）の例示的な構造を示す図である。図１Aの中間および右は、RBD構造（PDB ７BZ５）の表面表現上にプロットされたConSurf Databaseによって計算された１２個のRBDの配列保存に関する非限定的な例示的データを示す。破線で示されるRBD結合抗体の定義されたクラス（クラス１～クラス４）からの代表のエピトープである。図１Bは、１２種のサルベコウイルスRBDが由来するウイルス株の非限定的な例示的実施形態を示す。図１Cは、RBDタンパク質配列に基づくヒトおよび選択された他のコロナウイルスの非限定的な例示的系統樹を示す。赤色の陰影は、ACE２を受容体として使用することが知られている株を示す。図１Dは、１２のサルベコウイルスRBD間の％アミノ酸配列同一性を示す非限定的な例示的ヒートマップを示す。 図２A～図２Cは、RBDナノ粒子の構築の非限定的な例示的実施形態を示す。図２Aは、相同型粒子および３つのモザイク粒子を作製するためにSpyCatcher００３－mi３に結合されたSpyTagged RBDの非限定的な例示的実施形態を示す。明瞭にするために、mi３上の６０個の電位結合部位のうちの１０個を示す。図２Bは、RBDナノ粒子および遊離RBDタンパク質の分離を示すSECプロファイルの非限定的な例示的データを示す。図２Cは、RBD結合ナノ粒子、遊離RBDタンパク質、および非結合SpyCatcher００３－mi３粒子（SC３－mi３）のクーマシー染色SDS－PAGEの非限定的な例示的データを示す。 図３A～図３Fは、RBDナノ粒子が免疫マウスにおいて交差反応性IgG応答を誘導することを示す非限定的な例示的データを示す。ELISAおよび中和データの下の赤色および灰色の長方形は、ミスマッチ株（赤色、その株からのRBDは免疫粒子上に存在しなかった）またはマッチ株（灰色、RBDは免疫粒子上に存在した）を表す。図３Aは、免疫化スケジュールの非限定的な例示的実施形態を示す。アジュバント=AddaVax(Invivogen)。図３B～図３Fは、水溶性SARS－CoV－２ S三量体（SARS－２S、茶色のバー）、または以下のナノ粒子、相同型SARS－２（赤色）、モザイク－４a（緑色）、モザイク－４b（黄色）、モザイク－８（青色）、または非コンジュゲートSpyCatcher００３－mi３（mi３；黒色）で免疫化したマウスを示す非限定的な例示的データを示す。SARS－２スパイク三量体（図３B）またはRBD（図３C～図３F）に対する血清IgG応答からのELISAデータを曲線下面積（AUC）として示す。図３C～図３Eについて、中和効力は、示されたコロナウイルス株由来の偽ウイルスに対する血清の半最大阻害希釈（ID50値）として示される。破線の水平線は、検出限界を表す最低希釈に対応する。それぞれの点は、ワクチン接種群の手段および基準偏差を長方形（平均）および水平線（標準偏差）で表した、１匹からの血清を表す。水平線で結ばれたグループ間の有意差は、アスタリスクおよびp値によって示される。NS＝有意ではない。（図３B～図３F）（図３B)SARS－２スパイク三量体、（図３C)SARS－２ RBDおよびSARS－２偽ウイルス、（図３D)SHC０１４およびWIV１ RBDならびに対応する偽ウイルス、（図３E)SARS RBDおよびSARS偽ウイルス、（図３F)Yun１１、BM－４８３１、およびBtKY７２ RBDの認識のための血清IgGの中和および／または結合データである。 図４A～図４Hは、回復期COVID－１９プラズマからのIgGを示す非限定的な例示的データを示し、交差反応性応答はほとんどまたは全く示さない。図４A～図４Fは、（図４A)SARS－２、（図４B)RaTG１３、（図４C)SHC０１４、（図４D)WIV１、（図４E)Rs４０８１、および（図４F)BM－４８３１からのRBDに対するELISAによって評価されたプラズマIgG応答に関連する非限定的な例示的データ（プラズマ名を列挙した結合曲線として示すデータ）を示す。データ点は、二重測定の平均および標準偏差としてプロットされる。抗HIV－１ IgGであるIOMAを対照として使用した。図４Gは、曲線下面積（AUC）として示される図４A～図４FからのELISA結果に関連する非限定的な例示的データを示し、ここで、各点は１つのプラズマ試料を表し、平均および基準偏差は長方形（平均）および水平線（SD）によって表される。水平線で結ばれたグループ間の有意差は、アスタリスクおよびp値によって示される。図４Hは、示された株に対する、COV７、COV２１、およびCOV７２プラズマ（１５００μg／mLの最高濃度で評価された）からのIgGを使用する偽型中和アッセイのIC50値に関する非限定的な例示的データを示す。平均＝算術平均IC50、SD=標準偏差。 モザイク粒子を作製するために使用されるRBD配列のアラインメントに関する非限定的な例示的データを示す。配列が、SARS－CoV－２（SARS－２、GenBank:MN９８５３２５．１、配列番号１５）、RaTG１３（QHR６３３００、配列番号１６）、SHC０１４（RsSHC０１４、KC８８１００５、配列番号１７）、Rs４０８１（KY４１７１４３、配列番号１８）、PCoV＿GX－P５L(pang１７)(QIA４８６３２、配列番号１９）、RmYN０２(GSAID EPI_ISL_４１２９７７、配列番号２０）、Rf１（DQ４１２０４２、配列番号２１）、WIV１（KF３６７４５７、配列番号２２）、SARS-CoV(AAP１３４４１．１、配列番号２３）、Yun１１（Cp／Yunnan２０１１、JX９９３９８８、配列番号２４）のRBD、BM－４８３１（BM４８－３１／BGR／２００８、NC０１４４７０、配列番号２５）、およびBtKY７２（KY３５２４０７、配列番号２６）として表示されている。ACE２と直接相互作用するSARS－２RBD残基は、アスタリスクによって示される。ACE２結合残基の直接結合による抗体中和は、ACE２指向性ウイルスに対する中和の唯一の機構を表すものではないことに留意されたい。これは、COVID－１９患者に由来するモノクローナルヒト抗体について示されている、いくつかの実施形態において、中和抗体はRBD上のACE２結合部位と直接相互作用しない（例えば、クラス３抗SARS－CoV－２中和抗体）。赤色の陰影は、ACE２を受容体として使用することが知られている株を示す。 図６A～図６Bは、SpyCatcher００３－mi３と等価な８種のサルベコウイルスSタンパク質コンジュゲートからのRBDを示す非限定的な例示的データを示し、モザイク粒子上のRBDの統計的混合物を示唆する。図６Aは、RBDナノ粒子および遊離RBDタンパク質の分離を示すSECプロファイルの非限定的な例示的データを示す。図６Bは、RBD結合ナノ粒子、遊離RBDタンパク質、および非結合SpyCatcher００３－mi３粒子（SC３－mi３）のクーマシー染色SDS－PAGEを示す非限定的な例示的データを示す。 図７A～図７Fは、水溶性SARS－CoV－２ S三量体（SARS－２ S）またはナノ粒子上のRBD（相同型SARS－２、モザイク－４a、モザイク－４b、モザイク－８、または非コンジュゲートSpyCatcher００３－mi３（mi３））で免疫したマウスからの曲線下面積（AUC）として示されるELISAによって評価されたRBDに対する１４日血清IgG応答に関する非限定的な例示的データを示す。それぞれの点は１匹の動物の血清を表し、平均および標準偏差は、長方形（平均）および水平線（標準偏差）によって表される。免疫化粒子上に存在しなかった、または免疫化粒子上に存在した株由来のRBDはELISAデータの下に、それぞれ赤色および灰色の長方形によって示される。水平線で結ばれたグループ間の有意差は、アスタリスクおよびp値によって示される。NS＝有意ではない。図７A～図７Bは、（図７A)Rs４０８１および（図７B)RaTG１３ RBDへの血清IgGの結合に関する非限定的な例示的データを示す。図７Cは、SARS－２ RBD(左上）、出現したUK SARS-CoV－２系統（https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov－２-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutations/５６３)（右上）、およびY４５３F、「デンマークミンク変形例」（左下）におけるN５０１Y RBD変異に隣接する置換を含む、マウス適応SARS－CoV－２における三重RBD変形例への血清IgGの結合に関する非限定的な例示的データを示す。図７Dは、MERS-CoV(非ACE２結合メルベコウイルス、サルベコウイルス由来の異なる亜属を表す）からのRBDへの血清IgGの結合に関する非限定的な例示的データを示す。図７E～図７Fは、AUC、終点力価、中点力価、または結合曲線として提示される選択されたRBDに対する血清結合についてのELISAデータの比較に関連する非限定的な例示的データを示す。（図７E)SARS－２または（図７F)SARS RBDに対する１４日目の血清IgG応答は、AUC(左上）、終点力価（中央上）、中点（EC50）力価（右上）、または結合曲線（左下）として示されるELISAによって評価された。また、AUCについては、それぞれの点は１匹からの血清を表し、平均および標準偏差は長方形（平均）および水平線（標準偏差）で表される。終点および中点の力価について、それぞれの点は１匹からの血清を表し、幾何学的平均および幾何学的標準偏差は、長方形（平均）および水平線（SD）によって表される。結合曲線を、モザイク－８および相同型SARS－２で免疫した動物についての結合モデル（以下の実施例１の材料および方法を参照されたい）に適合する二重測定の平均およびSDを表すデータ点で示す。 図８A～図８Dは、ELISAと中和力価との相関に関する非限定的な例示的データを示す。スピアマン相関係数（rS）およびp値は、偽ウイルス中和ID50値に対する抗RBD ELISA力価（AUC）のグラフについて示され、有意性はアスタリスクとして示される。（図８A)SARS－２、（図８B)SARS、（図８C)SHC０１４、（図８D)WIV１である。 図９A～図９Eは、モザイク－RBDナノ粒子で免疫化された動物から単離された脾細胞の抗原特異的IgG+ B細胞解析に関する非限定的な例示的データを示す。図９Aは、脾細胞から単離されたRBD特異的IgG+ B細胞を特徴付けるためのフローサイトメトリーゲーティング手法の非限定的な例示的実施形態を示す。抗CD４、抗CD８、抗F４／８０、抗Ly６G、および抗IgMを、T細胞、マクロファージ、およびIgM+ B細胞を除去するためにダンプ中で使用した。標識された抗CD１９および抗IgG抗体を用いて抗原特異的IgG+ B細胞を単離し、一対のフルオロフォア共役RBD四量体（SARS－２ RBDおよびRs４０８１ RBD）とのRBDの結合についてプローブした。図９Bは、モザイク－RBD粒子で免疫化された動物から単離された抗原特異的IgG+ 脾細胞についてのフローサイトメトリー解析に関連する非限定的な例示的データを示す。各動物について示される４方向ゲートはRBD単一正および二重正細胞の各集団を分離し、図９C～図９Eに示される％抗原特異的集団のために使用された。Q１はRs４０８１ RBD+集団を表し、Q２はRs４０８１ RBD+／SARS－２ RBD+集団を表し、Q３はSARS－２ RBD+集団を表し、Q４は、RBD-集団を表す。図９C～図９Eは、示された群についての単一正（SP）および二重正（DP）細胞のパーセントに関する非限定的な例示的データを示す。水平線で結ばれたグループ間の有意差は、アスタリスクおよびp値によって示される。NS=有意ではない。（図９C）IgG+ B細胞集団内のSARS－２ RBD+ B細胞の割合、（図９D）IgG+ B細胞集団内のRs４０８１ RBD+ B細胞の割合、（図９E）IgG+ B細胞集団内のSARS－２ RBD+／Rs４０８１ RBD+ B細胞の割合である。
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面では文脈上別段の指示がない限り、類似の記号は典型的には同様の構成要素を識別する。説明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変化が行われ得る。本明細書で一般的に発明され、図に示される本開示の態様は多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、および設計することができ、そのすべてが本明細書で明示的に企図され、本明細書の開示の一部をなすことが容易に理解されよう。
GenBankからのすべての特許、公開された特許出願、他の刊行物、および配列、ならびに本明細書で言及される他のデータベースは、関連する技術に関してその全体が参照により組み込まれる。
新たに出現したベータコロナウイルスであるSARS－CoV－２は２０２０年に世界的感染爆発をもたらし、何百万もの感染を引き起こし、呼吸器疾患COVID－１９を引き起こした。他の２種の人獣共通ベータコロナウイルス、SARS－CoVおよびMERS－CoVも、過去２０年以内に流行した。３つのウイルスはすべて、おそらくコウモリに由来し、SARS－CoVおよびMERS－CoVは、ヒトにジャンプする前に中間の動物宿主に適応していた。SARS様ウイルスはコウモリに流行し、洞穴付近に住む人々の血清学的サーベイランスで循環し、コウモリは多様なコロナウイルスを保有し、パンデミックの可能性を有するSARS様ウイルスの直接伝播を示し、将来のアウトブレイクおよびパンデミックから保護するためにパンコロナウイルスワクチンが必要であることを示唆している。特に、bat WIV１およびSHC０１４株は、ヒトに対する進行中の脅威を表すと考えられている。
既存のワクチンはSARS－CoV－２などの１つのタイプのコロナウイルスに対する防御を提供し得るが、コウモリにおけるコロナウイルス保有者は将来の種間伝播を示唆し、SARS－CoV－２と同様に、新興コロナウイルスに対しても防御するワクチンを必要とする。より高次の中和抗体を誘発し、広範囲のコロナウイルスに対する異種結合および中和応答を誘導することができる、効果的でより長く持続するワクチンが強く緊急に必要とされている。SARS－CoV－２に対するワクチンの必要性に加えて、将来のパンデミックを引き起こすためにヒトに流出する可能性がある関連する人獣共通コロナウイルスから保護する緊急の必要性もある。本明細書には、潜在的に出現する動物コロナウイルスならびにSARS－CoV－２からの感染に対して保護するための免疫化組成物および方法が開示される。
本明細書に記載されるように、例えば「プラグアンド表示装置」アプローチを使用して、SARS－CoV－２単独（相同型ナノ粒子）のいずれかの受容体結合ドメイン（RBD）を提示するか、またはヒトに対する脅威を表すコウモリおよびパンゴリンベータコロナウイルス由来の多様なRBDセット（モザイクナノ粒子）と共にSARS－CoV－２ RBDを共提示する一連のナノ粒子を作製した。SARS－CoV－２相同型ナノ粒子に対する自己応答（例えば、SARS－CoV－２ナノ粒子の射出後のSARS－CoV－２ウイルスに対する応答）を記載する最近の報告を超えて、相同型ナノ粒子免疫化はブースト後に異種コロナウイルスに結合し、それを中和する応答を生じる。SARS－CoV－２ RBDと共に他のRBDを共表示することは、相同型のナノ粒子に対する応答と比較して反応性を減少させず、それによって、SARS－CoV－２に対して保護するためにモザイクナノ粒子を使用することに不都合がないことを示す。相同型SARS－CoV－２ナノ粒子に対するモザイクRBDの利点は相同型SARS－CoV－２－RBDナノ粒子による免疫化と比較して、異種RBDの優れた交差反応性認識を有するモザイクナノ粒子誘発抗体であり、特に、交差反応性応答がモザイクナノ粒子によるプライムの後にのみ観察されたが、相同型粒子に対する交差反応性応答はプライムおよびブースト注射の両方を必要としたためである。１回の注射のみの後に中和応答を誘導することは、数百万／数十億人に送達される必要があるワクチンにとって大きな利点である。いくつかの実施形態では本明細書に記載されるタイプのモザイクナノ粒子が新しい人獣共通コロナウイルスからのRBDを発見されたときに提示するように適合させることができ、その結果、人獣共通サルベコウイルスのワクチン誘導性認識は将来のコロナウイルス関連パンデミックからの保護を提供する一方で、SARS－CoV－２に対する保護にも使用される。
本明細書に記載されるように、COVID－１９回復期ヒトプラズマ由来のIgGを評価し、SARS－CoV－２以外のコロナウイルスの認識をほとんどまたは全く示さないことを示した。したがって、ヒトにおける感染誘発性免疫は、新しい人獣共通コロナウイルスの流行に対して防御的である可能性は低く、新興サルベコウイルスに対して防御するためのワクチンを開発する必要性の別の指標である。
本明細書には、多価担体および関連ワクチン組成物、方法およびキットが開示される。多価担体およびそのワクチン組成物は異なる分類学的群のヒトおよび動物コロナウイルス由来のコロナウイルス抗原を同時に提示し、交差反応性抗体応答を誘発することができる。多価担体およびそのワクチン組成物は例えばSARS－CoV－２感染によってヒトにおいて誘発されるプラズマ抗体とは対照的に、実質的に増強された広い結合および中和応答を誘発することができる。多価担体およびそのワクチン組成物はまた、相同型ナノ粒子（例えば、相同型SARS－CoV－２ナノ粒子）と比較して、ヒトおよびコウモリβ－コロナウイルス（例えば、サルベコウイルス）に対する増強された異種結合および中和特性を示す。
本明細書では、多価担体を含む。多価担体は複数のコロナウイルス抗原を含み、複数のコロナウイルス抗原は、第１のコロナウイルスの少なくとも第１のコロナウイルス抗原と、第１のコロナウイルスとは異なる第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原とを含む。本明細書には、本明細書に記載の多価担体を含むワクチン組成物も開示される。
本明細書には、それを必要とする対象において免疫反応を刺激する方法が開示される。いくつかの実施形態では、方法が本明細書に記載のワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与し、それによって対象における免疫応答を刺激することを含む。本明細書には、それを必要とする対象におけるコロナウイルス感染を治療または予防する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法が本明細書に記載のワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与し、それによって対象におけるコロナウイルス感染を治療または予防することを含む。さらに、それを必要とする対象におけるコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を治療または予防する方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、方法が本明細書に記載のワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することを含み、それによって、対象におけるコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を治療または予防する。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology ２nd ed、J.Wiley & Sons(New York、NY １９９４); Sambrook et al、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor、NY １９８９)を参照されたい。本開示の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
本明細書で使用される場合、「抗原」または「免疫原」という用語は対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）において免疫反応を誘導することができる物質、典型的にはタンパク質を指すために互換的に使用される。この用語はまた、対象に投与されると、直接的に、またはタンパク質をコードする核酸配列もしくはベクトルの形成で、そのタンパク質またはその変異体に対する液性および／または細胞型の免疫反応を誘発することができるという意味で、免疫学的に活性であるタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大の対応のために整列された場合に同じで２つの配列中のヌクレオチド塩基または残基を指す。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。各種プログラムとアライメントアルゴリズムについては、Smith & Waterman、Adv. Appl. Math. 2:482、1981、Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol. 48:443、1970、Pearson & Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444、1988、Higgins & Sharp、Gene、73:237-44、1988、Higgins & Sharp、CABIOS 5:151-3、1989、Corpet et al.、Nuc. Acids Res. 16:10881-90、1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8、155-65、1992、Pearson et al.、Meth. Mol. Bio. 24:307-31、1994、およびAltschul et al.、J. Mol. Biol. 215:403-10、1990（これらの参考文献の各々の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
タンパク質に関して配列同一性または類似度性の割合が使用される場合、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なることが多く、アミノ酸残基は類似の生理化学的特性を有するアミノ酸残基の機能的に同等の残基で置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させないことが認識される。本明細書で使用されるアミノ酸の機能的に等価な残基は、典型的には元のアミノ酸に実質的に類似する生理化学的および立体化学的特性を有する他のアミノ酸残基を指すことができる。生理化学的特性としては、水溶性（疎水性または親水性）、誘電体および電気化学的特性、生理学的pH、側鎖の部分電荷（正、負または中性）、および当業者に同定可能な他の特性が挙げられる。立体化学的特性には、アミノ酸の空間的および立体配座的配置ならびにそれらのキラリティーが含まれる。例えば、グルタミン酸は、本開示の意味において、アスパラギン酸と機能的に等価な残基であると考えられる。チロシンおよびトリプトファンは、フェニルアラニンと機能的に等価な残基であると考えられる。アルギニンおよびリジンは、ヒスチジンと機能的に等価な残基であると考えられる。
２つ以上の配列の文脈において本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は特定の領域にわたって、または配列全体にわたって、同一または機能的に等価で特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチド、例えば、約、少なくともまたは少なくとも約６５％の同一性、任意選択で、少なくとも、または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を指す。
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は参照（例えば、親）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと実質的に類似または同一の配列を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、参照ポリヌクレオチドと比較して、５’末端、３’末端、および／または１つ以上の内部部位に１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加を有することができる。変異体と参照ポリヌクレオチドとの間の配列の類似性および／または相違は、当技術分野で公知の従来の技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびハイブリダイゼーション技術を用いて検出することができる。変異体ポリヌクレオチドはまた、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるものなどの、合成由来のポリヌクレオチドを含む。一般に、限定されないが、DNAを含むポリヌクレオチドの変形例は当技術分野で公知の配列アラインメントプログラムによって決定されるように、参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも、または少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。ポリペプチドの場合、変異体は、参照ポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有することができる。変異体と参照ポリペプチドとの間の配列の類似性および／または相違は、当技術分野で公知の従来の技術、例えばウェスタンブロットを用いて検出することができる。ポリペプチドの変形例は例えば、当技術分野で公知の配列アラインメントプログラムによって決定される参照ポリペプチドに対して、少なくとも、または少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
標準的な技術は組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当技術分野において一般的に達成されるか、または本明細書に記載されるように実施することができる。前述の技法および手順は一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、および本明細書全体にわたって引用および考察される各種一般的およびより特定の基準に記載されるように、実施することができる。例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(２d ed、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N．Y（１９８９））を参照されたい。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬化学に関連して使用される命名法、ならびに研究所の手順および技術は、当該技術分野で一般に知られ使用されるものである。標準的な技術は、患者の化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達、ならびに治療に使用することができる。
コロナウイルスおよびコロナウイルス抗原
本明細書に記載の多価担体、ならびに関連するワクチン組成物、方法およびキットは、複数の異種コロナウイルス抗原を含む。「異種抗原」という語は抗原が異なる起源であることを意味し、例えば、異なる株、種、亜属、属、サブファミリーもしくはファミリーなどの異なる分類群の病原体に由来し、および／または抗原的に異なる病原体（例えば、その変形例）に由来する。多価担体は、モザイク担体とも称され得る。ウイルスの様々な分類学的群への分類は、当業者によって十分に理解されている。本明細書に記載される実施形態において、本明細書に記載される多価担体の異種コロナウイルス抗原はコロナウイルス科の異なる株、種、亜属、属、および／または亜科のコロナウイルスに由来する。
本明細書で使用される「コロナウイルス」という用語はコロナウイルス科のウイルスを指し、これは、今度はニドウイルス目に分類される。コロナウイルスは、大型のエンベロープを有するプラス鎖RNAウイルスである。コロナウイルスは当技術分野で知られているRNAウイルスの最大のゲノムを有し、高周波の組換えをもたらす独特の機構によって複製する。コロナウイルスには、抗原性群I、II、およびIIIが含まれる。コロナウイルスの非限定的な例としては、SARSコロナウイルス（例えば、SARS－CoVおよびSARS－CoV－２）、MERSコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）、ヒト呼吸器コロナウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネコ腸コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ウサギコロナウイルス、マウス肝炎ウイルス、シアロダクリオアデニティスウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ウシコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、およびシチメンチョウコロナウイルス、ならびにそれらのキメラが挙げられる。分類、ビリオン構造、ゲノム構造、遺伝学および病理学を含むコロナウイルスに関するさらなる情報は例えば、KV Holmes、Encyclopedia of Virology、１９９９：２９１－２９８に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコロナウイルスはアルファ－コロナウイルスの属にあり、コロナウイルス抗原は、アルファ－コロナウイルスの属における任意の種または株のものであり得るか、またはそれらに由来し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコロナウイルスはベータコロナウイルスの属にあり、コロナウイルス抗原は、ベータコロナウイルスの属における任意の種または株のものであり得るか、またはそれらに由来し得る。アルファ－コロナウイルスおよびベータ－コロナウイルスの属における部材ウイルスは、哺乳動物に感染し得るエンベロープを有するプラス鎖RNAウイルスである。
本明細書に記載のコロナウイルスは限定されないが、コラコウイルス（例えば、batコロナウイルスCDPHE１５）、デカコウイルス（例えば、batコロナウイルスHKU１０およびRhinolophus ferrumequinum αコロナウイルスHuB－２０１３）、デュビナコウイルス（ヒトコロナウイルス２２９E）、ルカコウイルス（例えば、Lucheng Rnラットコロナウイルス）、ミナコウイルス（例えば、Mink コロナウイルス１）、Minunacovirus（例えば、Miniopterus Batコロナウイルス１およびMiniopterus バットコロナウイルスHKU８）、ミオタコウイルス（例えば、Myotis ricketti αコロナウイルスSax－２０１１）、ニクタコウイルス（例えば、Nyctalus velutinus αコロナウイルスSC－２０１３およびPipistrellus kuhliiコロナウイルス３３９８）、Pedacovirus (例えば、ブタ流行性下痢ウイルスおよびScotophilus バットコロナウイルス512)、ライナコロナウイルス(例えば、ライノルフィスバットコロナウイルスHKU２)、セトラコウイルス（例えば、ヒトコロナウイルスNL６３およびNL６３関連バットコロナウイルスBtKYNL６３－９b株）、ソラコウイルス（例えば、ソレックス・アラヌスコロナウイルスT１４）、スナコウイルス（例えば、サンクス・マウスコロナウイルスX７４）、およびTegacovirus(例えば、アルファコロナウイルス１）を含む任意の亜属であり得る。
ベータ－コロナウイルス属内では、エムベコウイルス（系統A）、サルベコウイルス（系統B）、メルベコウイルス（系統C）、ノベコウイルス（系統D）、およびヒベコウイルスを含む５つの亜属または系統が認識されている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコロナウイルスがベータコロナウイルスの亜属または系統のいずれかにおける任意の株または種であり得る。
例えば、コロナウイルス抗原は限定されないが、ベータ－コロナウイルス１（例えば、ウシコロナウイルスおよびヒトコロナウイルスOC４３）、チャイナ・ラツスコロナウイルスHKU２４、ヒトコロナウイルスHKU１、マウスコロナウイルス（例えば、マウスヘプタチスウイルス）、およびミオデスコロナウイルス２JL１４を含む、エムベコウイルスの亜属における任意の種または株のものであり得るか、またはそれに由来し得る。コロナウイルス抗原は限定されないが、SARS－CoV、SARS－CoV２、１６BO１３３、Bat SARS CoV Rf1、BatコロナウイルスHKU３(BtCoV KU３）、LYRa１１、Bat SARS-CoV/Rp３、Bat SL-CoV YNLF_３１C、Bat SL-CoV YNLF_３４C、SHC０１４－CoV、WIV１、WIV１６、Civet SARS-CoV、Rc－o３１９、SL－ZXC２１、SL－ZC４５、Pangolin SARSr-COV-GX、Pangolin SARSr-COV-GD、RshSTT１８２、RshSTT２００、RacCS２０３、RmYN０２、RpYN０６、RaTG１３、Bat CoV BtKY７２、およびBat CoV BM４８－３１の亜属を含む、サルベコウイルスの亜属における任意の種または株のものであり得るか、またはそれに由来し得る。コロナウイルス抗原は限定されないが、Hedgehogコロナウイルス１、MERS－CoV、Pipistrellus batコロナウイルスHKU５、およびTylonycteris batコロナウイルスHKU４を含む、メルベコウイルスの亜属における任意の種または株であり得る。コロナウイルス抗原は限定されないが、Eidolon batコロナウイルスC７０４、Rousettus batコロナウイルスGCCDC１、およびRousettus batコロナウイルスHKU９を含む、ノベコウイルスの亜属における任意の種または株であり得る。コロナウイルス抗原はBat Hp-ベータコロナウイルスZhejiang ２０１３を含むがこれらに限定されない、ヒベコウイルスの亜属における任意の種または株であり得る。
本明細書に記載されるコロナウイルスは例えば、機能的に別個クレードにおいて系統発生的にクラスター化され得る。例えば、系列Bβ－コロナウイルス（サルベコウイルス）のコロナウイルスは非構造タンパク質遺伝子ORF１aおよびORF１ｂのヌクレオチド配列を使用して、クレード１、クレード２、クレード１／２、またはクレード３にクラスター化することができる（例えば、Hu et al、PLoS Pathog１３（１１):e１００６６９８を参照されたい）。したがって、コロナウイルス抗原は、これらのクレードのいずれか１つにおける任意の種または株のものであり得るか、またはそれらに由来し得る。例えば、コロナウイルス抗原は限定されないが、SARS－CoV、WIV１、LYRa１１、Rs７３２７、Rs４２３１、Rs４０８４、およびSHC０１４を含む、クレード１における任意の種または株のものであり得る。コロナウイルス抗原はAs６５２６、Yunnan２０１１、Shaanxi２０１１、２７９－２００５、Rs４２３７、Rs４０８１、Rp３、Rs４２４７、HKU３－８、HKU３－１３、GX２０１３、Longquan－１４０、YN２０１３、Rf４０９２、ZXC２１、ZC４５、JL２０１２、HuB２０１３、Rf１、HeB２０１３、および２７３－２００５を含むがこれらに限定されない、クレード２における任意の種または株のものであり得る。コロナウイルス抗原は限定されるものではないが、SARS－CoV２を含む、クレード１／２における任意の種または株のものであり得る。コロナウイルス抗原はBM４８－３１を含むがこれらに限定されない、クレード３における任意の種または株のものであり得る。本明細書に記載されるコロナウイルス抗原はコロナウイルス、例えば、SARS、SARS－２、WIV１、SHC０１４、Rf１、RmYN０２、pang１７、RaTG１３、およびRs４０８１のものであり得る。
本明細書に例示されるように、SARSウイルス（例えば、SARS－CoVおよびSARS－CoV－２）は、コロナウイルス科のBetacoronavirus属に属する一本鎖プラスセンスRNAゲノム（～３０kb）を保有するエンベロープコロナウイルスである。ウイルスRNAは、スパイク（S）、エンベロープ（E）、膜（M）、およびヌクレオカプシド（N）タンパク質を含む４つの構造タンパク質、１６の非構造タンパク質、ならびに９つのアクセサリータンパク質をコードする。S糖タンパク質は、S１およびS２サブユニットにプロセシングされ得る外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含有する。SARS－CoVおよびSARS－CoV－２の両方はS１サブユニット内の受容体結合ドメインを介してヒトACE２に結合し、宿主細胞への侵入を促進し、続いてS２サブユニットによって媒介される膜融合を促進する。
本明細書に記載されるコロナウイルスのコロナウイルス抗原は、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導することができる様々なコロナウイルスタンパク質のいずれかであり得る。適切なコロナウイルス抗原は、広範囲に中和する抗体を産生するなど、防御免疫応答を誘発することができるものである。例えば、コロナウイルス抗原は、コロナウイルススパイク（S）タンパク質、スパイク受容体結合ドメイン（RBD）、S１サブユニット、S２サブユニット、スパイクフルエクトドメインタンパク質、パパイン様プロテアーゼ、３CLプロテアーゼ、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質、またはコロナウイルスを形成する構造タンパク質、非構造タンパク質もしくはアクセサリータンパク質のいずれかを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるコロナウイルス抗原がスパイク（S）タンパク質またはその一部を含む。Sタンパク質は、各ビリオンの表面を覆う４つの主要な構造タンパク質のうちの１つである。S１サブユニットおよびS２サブユニットを含むSタンパク質は宿主細胞受容体に結合することができ、ウイルス侵入を媒介する高度にグリコシル化されたI型膜貫通タンパク質である。Sタンパク質は、１つ以上のRBDが宿主受容体に結合するための「上方」位置を取った後に宿主細胞に入るように宿主細胞受容体との相互作用を媒介する、RBDと呼ばれるドメインを含む。受容体に結合した後、近くの宿主プロテアーゼがスパイクを切断し、スパイク融合ペプチドを放出し、ウイルス侵入を促進すると考えられている。コロナウイルス（例えば、ベータ－コロナウイルス）のための公知の宿主受容体としては、アンチオテンシン変換酵素２（ACE２）、ジペプチジルペプチダーゼ－４（DPP４）またはシアル酸が挙げられる。例えば、ヒトコロナウイルスSARS－CoV－２、SARS－CoV、HCoV－NL６３、および関連動物コロナウイルス（WIV１およびSCH０１４）のRBDはその宿主受容体としてACE２を使用し、一方、MERS－CoVは、その宿主受容体としてDPP４を使用する。
本明細書で使用されるコロナウイルス抗原は例えば、コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質（Nタンパク質）またはその一部を含むことができる。Nタンパク質は、ウイルスRNAの転写、複製、およびパッケージングに必要な多官能RNA結合タンパク質である。Nタンパク質は、３つのドメイン、すなわちN端末RNA結合ドメイン、中心の本質的に無秩序な領域、続いてC端末二量体化ドメインからなる。RNA結合ドメインは、そのらせん配列を促進するRNAと荷電相互作用を形成する複数の正に荷電した結合表面を含む。本明細書で使用されるコロナウイルス抗原は、これらのNタンパク質ドメインのいずれかまたはその一部を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるコロナウイルス抗原がコロナウイルス膜タンパク質（Mタンパク質）またはその一部を含む。Mタンパク質は最も豊富な構造タンパク質であり、ウイルスエンベロープの形状を規定する。Mタンパク質は、他の主要なコロナウイルス構造タンパク質と相互作用するウイルス集合の中心的なオーガナイザーとみなされる。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるコロナウイルス抗原がコロナウイルスエンベロープタンパク質（Eタンパク質）またはその一部を含む。Eタンパク質は小さな膜タンパク質であり、ウイルス粒子の微量成分である。いかなる理論にも拘束されるものではないが、Eタンパク質はビリオンの集合および形態形成、宿主細胞の膜の変更、ならびにウイルス－宿主細胞相互作用において役割を果たすと考えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるコロナウイルス抗原がコロナウイルスヘマグルチニン－エステラーゼタンパク質（HEタンパク質）またはその一部を含む。別のエンベロープタンパク質であるHEタンパク質は、レクチンおよび受容体破壊酵素の両方として作用することによって、O－アセチル化シアル酸への可逆的付着を媒介する。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるコロナウイルス抗原がコロナウイルスパパイン様プロテアーゼまたはその一部を含む。コロナウイルスパパイン様プロテアーゼはいくつかの非構造タンパク質のうちの１つ、成熟中のウイルスタンパク質の機能的な成熟サブユニットへのプロセシングを担う。例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼは、ウイルスレプリカーゼ領域のアミノ末端の部位を切断することができる。ウイルスタンパク質成熟におけるその役割に加えて、パパイン様プロテアーゼは、脱ユビキチン化活性および脱ISG１５イル化活性の両方を示す。インビボでは、このプロテアーゼがIFNβおよびNFκBシグナル伝達経路に作用することによって、先天性免疫に拮抗する。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるコロナウイルス抗原がコロナウイルス３CLプロテアーゼまたはその一部を含む。３CLプロテアーゼはパパイン様プロテアーゼに加えて別の主要なプロテアーゼであり、ウイルスポリペプチドを異なる機能性タンパク質に処理するために必要とされる。いくつかの実施形態において、３CLプロテアーゼは、ウイルスポリペプチドの非構造タンパク質３（NS３）領域内に位置するC３０型システインプロテアーゼであるSARS－CoV－２ ３CLプロテアーゼである。コロナウイルスゲノムの分析は３CLプロテアーゼの切断の少なくとも１１部位を明らかにし、多くはアミノ酸配列LQ［S／A／G］を含む。
本明細書に開示されるコロナウイルス抗原は、いくつかの実施形態ではSタンパク質もしくはその一部、Nタンパク質もしくはその一部、HEタンパク質もしくはその一部、パパイン様プロテアーゼもしくはその一部、コロナウイルス３CLプロテアーゼもしくはその一部、Mタンパク質もしくはその一部、またはそれらの組合せを含むことができる。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原が本明細書に記載のコロナウイルスタンパク質の免疫原性部分であり得る。コロナウイルス抗原の免疫原性部分はSタンパク質（例えば、スパイクタンパク質RBD）、Nタンパク質、HEタンパク質、パパイン様プロテアーゼ、３CLプロテアーゼ、または１つ以上のコロナウイルスに対する免疫応答を誘発することができるMタンパク質の断片であり得ることが、当業者によって理解される。免疫原性部分は、コロナウイルスタンパク質由来の、約、少なくとも、または少なくとも約、多くとも、または多くとも約、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、またはこれらの値のいずれか２つの間の数または範囲の連続アミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原性部分がSタンパク質RBDまたはその部分を含む。Sタンパク質RBDの部分は、Sタンパク質RBDの受容体結合モチーフを含むことができる。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がSARS－CoV、SARS－CoV２、WIV１、Rs７３２７、Rs４２３１、Rs４０８４、SHC０１４、As６５２６、Yunnan２０１１、Shaanxi ２０１１、２７９－２００５、Rs４２３７、Rs４０８１、Rp３、Rs４２４７、HKU３－８、HKU３－１３、GX２０１３、Longquan－１４０、YN２０１３、Rf４０９２、ZXC２１、ZC４５、JL２０１２、HuB２０１３、Rf１、HeB２０１３、２７３－２００５、およびBM４８－３１から選択され、SARS、SARS－２、WIV１、SHC０１４、Rf１、RmYN０２、pang１７、RaTG１３、およびRs４０８１から選択される１つ以上のコロナウイルスSタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と約、少なくとも、または少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するか、または有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、Sタンパク質またはその部分である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がSARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選択され、SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から任意に選択される１つ以上のコロナウイルスNタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と約、少なくとも、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するか、または有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるNタンパク質またはその部分である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がSARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選択され、SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から任意に選択される１つ以上のコロナウイルスNタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と約、少なくとも、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する、またはそれからなるHEタンパク質またはその部分である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がSARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選択され、SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から任意に選択される１つ以上のコロナウイルスNタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と約、少なくとも、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する、またはそれからなるパパイン様プロテアーゼまたはその部分である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がSARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選択され、SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から任意に選択される１つ以上のコロナウイルスNタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と約、少なくとも、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する、またはそれからなる３CLプロテアーゼまたはその部分である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原が
SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選択され、SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から任意に選択される１つ以上のコロナウイルスNタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と約、少なくとも、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する、またはそれからなるMタンパク質またはその部分である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がコロナウイルススパイクRBDまたはその一部もしくは変形例を含む。コロナウイルススパイクRBDはコアを形成する短い接続ヘリックスおよびループを有する、ねじれた５本鎖逆平行βシート（例えば、SARS－CoV－２におけるβ１、β２、β３、β４およびβ７）の三次元構造を有することが知られている。コア中の２つのβストランド（例えば、SARS－CoV－２中のβ４およびβ７ストランド）の間には、２つの短いβストランド（例えば、SARS－CoV－２中のβ５およびβ６）、２つのαヘリックス（例えば、SARS－CoV－２中のα４およびα５）、ならびに２つのβストランドおよび／または２つのαヘリックスを連結するループを含む延長された挿入が存在する。この延長された挿入は受容体結合モチーフ（RBM）と呼ばれ、これは、宿主細胞受容体（例えば、ACE２）に結合することができる残基を含有する。本明細書に記載の実施形態では、コロナウイルススパイクRBD、特にRBMはスパイクタンパク質媒介性ウイルス侵入を開始するために、宿主細胞受容体を認識し、それに結合することができる。コロナウイルススパイクRBDおよび宿主細胞受容体（例えば、ACE２）界面および関連する接触残基の詳細な情報は例えば、Lan et al、Nature volume ５８１、pages２１５－２２０（２０２０）に記載されており、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書で使用されるコロナウイルススパイクRBDまたはその一部分は、コロナウイルス科の任意のウイルス種または株のものであり得るか、またはそれに由来し得る。本明細書で使用されるコロナウイルススパイクRBDまたはその一部は、アルファ－コロナウイルスの属における任意の種または株のものであり得る。本明細書で使用されるコロナウイルススパイクRBDまたはその一部は、ベータ－コロナウイルスの属における任意の種または株のものであり得る。本明細書で使用するコロナウイルススパイクRBDまたはその一部は、Embecovirus亜属（系統A）、Sarbecovirus(系統B）、Merbecovirus(系統C）、Nobecovirus(系統D）、およびBeta－coronavirusのHibecovirusのいずれかのウイルス種または株であり得る。
例えば、コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部は限定されないが、ベータ－コロナウイルス１（例えば、ウシコロナウイルスおよびヒトコロナウイルスOC４３）、チャイナ・ラツスコロナウイルスHKU２４、ヒトコロナウイルスHKU１、マウスコロナウイルス（例えば、マウスヘプタチスウイルス）、およびミオデスコロナウイルス２JL１４を含む、エムベコウイルスの亜属における任意の種または株のものであり得る。コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部は、SARS-CoV、SARS-CoV2、16BO133、Bat SARS CoV Rf1、Bat coronavirus HKU3 (BtCoV HKU3)、LYRa11、Bat SARS-CoV/Rp3、Bat SL-CoV YNLF_31C、Bat SL-CoV YNLF_34C、SHC014-CoV、WIV1、WIV16、Civet SARS-CoV、Rc-o319、SL-ZXC21、SL-ZC45、Pangolin SARSr-COV-GX、Pangolin SARSr-COV-GD、RshSTT182、RshSTT200、RacCS203、RmYN02、RpYN06、RaTG13、Bat CoV BtKY72、およびBat CoV BM４８－３１が挙げられるが、これらに限定されない。コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部は限定されないが、ヘッジホッグコロナウイルス１、MERS－CoV、ピピストレルスバットコロナウイルスHKU５、およびタイロニクテリスバットコロナウイルスHKU４を含む、メルベコウイルスの亜属における任意のウイルス種または株のものであり得る。コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部は限定されるものではないが、Eidolon bat coronavirus C７０４、Rousettus bat coronavirus GCCDC１、およびRousettus bat coronavirus HKU９を含む、Nobecovirus亜属における任意のウイルス種または株であり得る。コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部はヒベコウイルスの亜属における任意のウイルス種または株のものであり得、Bat Hp-ベータコロナウイルスZhejiang ２０１３が挙げられるが、これらに限定されない。
コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部は、系統Bコロナウイルス（サルベコウイルス）の系統発生的にクラスター化されたクレードのいずれか１つにおける任意のウイルス種または株のものであり得る。例えば、コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部は限定されるものではないが、SARS－CoV、WIV１、LYRa１１、Rs７３２７、Rs４２３１、Rs４０８４、およびSHC０１４を含む、クレード１の任意の種または株のものであり得る。コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部はAs６５２６、Yunnan２０１１、Shaanxi２０１１、２７９－２００５、Rs４２３７、Rs４０８１、Rp３、Rs４２４７、HKU３－８、HKU３－１３、GX２０１３、Longquan－１４０、YN２０１３、Rf４０９２、ZXC２１、ZC４５、JL２０１２、HuB２０１３、Rf１、HeB２０１３、および２７３－２００５を含むがこれらに限定されない、クレード２における任意の種または株のものであり得る。コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部分はSARS－CoV２を含むがこれらに限定されない、クレード１／２における任意の種または株のものであり得る。コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部はBM４８－３１を含むがこれらに限定されない、クレード３における任意の種または株のものであり得る。
いくつかの実施形態において、コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部は、SARS－CoV、SARS－CoV２、WIV１、LYRa１１、Rs７３２７、Rs４２３１、Rs４０８４、SHC０１４、As６５２６、Yunnan ２０１１、Shaanxi ２０１１、２７９－２００５、Rs４２３７、Rs４２３７、Rs４０８１、Rp３、Rs４２４７、HKU３－８、HKU３－１３、GX２０１３、Longquan－１４０、YN２０１３、Rf４０９２、ZXC２１、ZC４５、JL２０１２、HuB２０１３、Rf１、HeB２０１３、２７３－２００５、およびBM４８－３１から選択されるコロナウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部がSARS、SARS－２、WIV１、SHC０１４、Rf１、RmYN０２、pang１７、RaTG１３、およびRs４０８１から選択されるコロナウイルスに由来する。
コロナウイルススパイクRBDタンパク質またはその一部もしくは変異体は例えば、本明細書に開示されるコロナウイルススパイクタンパク質RBDのいずれかのアミノ酸配列（例えば、配列番号１～１２および１５～２６のいずれか１つのコロナウイルススパイクタンパク質RBD）に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質RBDまたはその変異体が配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列に対して、約、少なくとも、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の数または範囲の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質RBDまたはその変異体が配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列に対して、約、少なくとも、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質RBDまたはその変異体が配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列に対して、約、少なくとも、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコロナウイルススパイクタンパク質RBDは、配列番号１～１２および１５～２６のうちの１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質RBDのアミノ酸配列が配列番号１～１２および１５～２６から選択される。
コロナウイルススパイクRBDまたはその変異体は例えば、本明細書に開示されるコロナウイルススパイクRBDのいずれかのアミノ酸配列（例えば、配列番号１～１２および１５～２６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するコロナウイルススパイクRBD）と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲を有するか、または有するアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクRBDまたはその変異体が配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列と比較して、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個のミスマッチを有するか、または有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるミスマッチは、コロナウイルススパイクRBDのRBMにおいて生じる。
コロナウイルススパイクRBDまたはその変異体は例えば、本明細書に開示されるコロナウイルススパイクRBDのいずれかのアミノ酸配列（例えば、配列番号１～１２および１５～２６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するコロナウイルススパイクRBD）と比較して、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲を有するか、または有するアミノ酸配列、欠失または挿入を有する。
したがって、本開示の文脈におけるコロナウイルス抗原は、本明細書に開示されるコロナウイルスタンパク質と比較してアミノ酸置換を含むことができる。タンパク質の免疫原性活性が有意に変化せず（例えば、本明細書に開示されるコロナウイルスタンパク質抗原に対して最大で１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の減少）、変異体が所望の活性を保持する限り、任意のアミノ酸置換が許容される。好ましい変異体は、典型的にはそれらの機能的等価物で置換された１つまたは複数のアミノ酸による置換を含む。
担体
本明細書で使用される担体は一般に、分子（例えば、コロナウイルス抗原などの治療薬剤）を取り込み、輸送して、それらの選択性、バイオアベイラビリティおよび効率を高める能力を有する生体適合性分子系と称され得る。本明細書に記載される方法、組成物、およびシステムにおいて使用される担体は本明細書に記載される複数のタンパク質抗原または免疫原ポリペプチドへのカップリング（例えば、共有結合または非共有結合）のために官能化またはコンジュゲートされ得る、天然または合成のいずれかの生体適合性分子系であり得る。担体は、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノワイヤー、デンドリマー、リポソーム、エトソームおよびアクアソーム、ポリマーソームおよびニオソーム、発泡体、ハイドロゲル、キューボソーム、量子ドット、エキソソーム、マクロファージ、ならびに当業者に同定可能な他のものを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される担体がナノ粒子などのナノサイズの担体であり得る。本明細書で使用するとき、用語「ナノ粒子」は、ナノメートル（nm）で測定されるサイズを有するナノスケール粒子を指すことができる。ナノ粒子のサイズは、それらの最大寸法によって特徴付けることができる。本明細書で使用される「最大寸法」という用語はナノ粒子の中心を通過し、周辺で終わる直線セグメントの最大長さを指すことができる。ナノスフェアの場合、ナノスフェアの最大寸法は、その直径に対応する。「平均最大寸法」という用語はナノ粒子の平均または平均最大寸法を指すことができ、各ナノ粒子の最大寸法の合計をナノ粒子の総数で割ることによって計算することができる。したがって、最大寸法の値は、球、半球、立方体、プリズム、またはダイヤモンド、または不規則形状などの規則的形状を有するナノ粒子など、任意の形状のナノ粒子について計算され得る。本明細書で提供されるナノ粒子は球状である必要はなく、例えば、立方体、円筒、チューブ、ブロック、フィルム、および／またはシートなどの形状を含むことができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の最大寸法が約１nm～約５０００nm、例えば、約２０nm～約１０００nm、約２０nm～約５００nm、約５０nm～約３００nm、または約１００nm～約２００nmの範囲である。
ナノ粒子は脂質ベースのナノ粒子（その構造を構成する材料の大部分が脂質、例えばリポソームまたは脂質小胞であるナノ粒子）、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子（例えば、磁性、セラミックおよび金属ナノ粒子）、界面活性剤ベースのエマルジョン、シリカナノ粒子、ウイルス様粒子（主に感染性ではないか、または低感染性を有するウイルス構造タンパク質から構成される粒子）、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子（その構造を構成する材料の大部分がペプチドまたはタンパク質である粒子）、および／または当業者によって理解されるように、足場タンパク質によって安定化された膜脂質二重層内に配置された脂質を形成する膜によって形成される脂質シェルまたはナノリポタンパク質粒子によって形成される脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子などのナノ材料の組み合わせを使用して開発されるナノ粒子のいずれか１つとなり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、担体が共有結合力および／または非共有結合力を介して互いに組み立てられて担体を形成する複数のモノマーサブユニットから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の担体がタンパク質ナノ粒子を形成するモノマーサブユニットタンパク質である複数の粒子形成タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子である。タンパク質ナノ粒子は、非ウイルスタンパク質ナノ粒子およびウイルス様粒子に分類することができる。非ウイルスタンパク質ナノ粒子の実施例としてはフェリチン、ヴォールト、熱ショックタンパク質、シャペロニン、ルマジンシンターゼ、エンカプシリン、およびバクテリア微小区画が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス様粒子はこれらに限定されないが、アデノウイルス、ササゲモザイクウイルス、ササゲクロロティックモトルウイルス、ブロムモザイクウイルス、ブロードビーンモトルウイルス、バクテリオファージラムダ（例えば、バクテリオファージラムダプロカプシド）、MS２バクテリオファージ、Qβバクテリオファージ、P２２ファージカプシド、および当業者に同定可能な他のものを含むウイルスに由来し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子は、ウイルス様粒子（VLP）を含む。VLPは、いくつかのウイルスのいずれかに由来する、非複製性のウイルスシェルを指す。VLPは天然に存在するか、またはウイルス構造タンパク質の個々の発現を通して合成することができ、次いで、ウイルス様構造に自己集合することができる。VLPは一般に、キャプシド、コート、シェル、表面および／またはエンベロープタンパク質と呼ばれる粒子形成タンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドなどの、１つまたは複数のウイルスタンパク質から構成される。いくつかの実施形態では、VLPが適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現の際に自発的に形成することができる。VLPは、サブユニットのモルフォロジー、サイズおよび数において異なり得る。特定のVLPを産生するための方法は、当技術分野において公知である。ウイルスタンパク質の組換え発現後のVLPの存在は電子顕微鏡法、生物物理学的特徴付けなどによって、当技術分野で公知の従来の技術を用いて検出することができる（例えば、Baker et al（１９９１) Biophys. J. ６０：１４４５－１４５６、およびHagensee et al（１９９４)J.Virol．６８:４５０３－４５０５を参照されたい)。例えば、VLPは密度勾配遠心分離によって単離することができ、および／または特性密度バンディングによって同定することができる。あるいは、当該VLP調製物のガラス化水性試料に対して低温電子顕微鏡法を実施し、適切な露光条件下で画像を記録することができる。Aquifex aeolicus lumazine合成酵素、Thermotoga maritima encapsulin、Myxococcus xanthus encapsulin、バクテリオファージQβウイルス粒子、フロック収容ウイルス（FHV）粒子、ORSAYウイルス粒子、および感染性滑液包病ウイルス（IBDV）粒子を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の様々なVLPのいずれかを本明細書で使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるナノ粒子がAp２０５ VLPなどのバクテリオファージVLPであり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子は、自己集合性ナノ粒子を含む。自己組織化ナノ粒子は、典型的にはVLPと同様の外観を有するナノ粒子に自動的に組織化することができる非ウイルスタンパク質の同一のコピーによって形成される、直径が数十ナノメートルで明確な表面形状を有するボール形状タンパク質シェルを指す。自己組織化ナノ粒子の例としてはフェリチン(FR)(例えば、Helicobacter pylori ferritin)が挙げられるが、これらは種を超えて保存され、２４量体を形成し、同様に、B.stearothermophilus dihydrolipoyl acyltransferase(E２p）、Aquifex aeolicus lumazine synthase(LuS)、およびThermotoga maritima encapsulinが挙げられ、これらはすべて６０量体を形成する。
いくつかの実施形態では、自己集合性ナノ粒子が好熱性細菌Theremotoga Maritimaまたはその変異体のEntner－Doudoroff経路由来の２－ケト－３－デオキシ－ホスホグルコン酸（KDPG）アルドラーゼの複数の粒子形成タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、改善された粒子収率、安定性、および均一性のために、変異がKDPGアルドラーゼに導入される。例えば、いくつかの実施形態では、変異を導入して、KDPGアルドラーゼの野生型タンパク質三量体間の界面を変化させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるナノ粒子がi３０１ナノ粒子またはその変形例である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるナノ粒子が変異型i３０１ナノ粒子（例えば、mi３ナノ粒子）である。自己集合性ナノ粒子は、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現の際に自発的に形成することができる。ナノ粒子の製造、検出、および特徴付けのための方法は、VLPのために開発された同じ技術を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多価担体および関連するワクチン組成物、方法およびキットは様々な公知のナノ粒子のいずれか、いくつかのアミノ酸残基が機能的に等価な残基で置換されているそれらの保存的に修飾された変異体、ならびに実質的に同一の配列（例えば、少なくとも９０％、９５％、または９９％同一）を有する変異体を使用することができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本明細書で使用される担体は多価担体である。コロナウイルス抗原の単一種を提示する一価担体とは対照的に、多価ナノ粒子は、本明細書に記載の亜科、属、または亜属を含むコロナウイルス科の異なるコロナウイルス株または種の少なくとも２つのコロナウイルス抗原を含む、またはそれに由来する免疫原の異種集団を提示する。したがって、本明細書に記載される多価担体上に提示される異種免疫原は、異なるタンパク質配列を有する。
化合物（例えば、抗原）または官能基に関して本明細書で使用される「存在する」という用語は、結合した化合物または官能基の化学反応性を維持するために行われる結合を示す。したがって、担体上に提示される官能基は、適切な条件下で、官能基を化学的に特徴付ける１つまたは複数の化学反応を行うことができる。担体上に提示される化合物は、適切な条件下で、化合物を化学的に特徴付ける１つまたは複数の化学反応を行うことができる。例えば、化合物がコロナウイルス抗原であるか、またはコロナウイルス抗原を含む場合、担体によって提示されるコロナウイルス抗原は、コロナウイルス抗原を特徴付ける免疫学的活性に関連する反応の複合体を維持する。したがって、コロナウイルス抗原の提示は、付着したコロナウイルス抗原に関連する免疫学的活性が維持されるような付着を示す。
本明細書に記載される多価担体上に提示される異種コロナウイルス抗原は、その表面上に提示され得る。あるいは、本明細書に記載される多価担体上に提示される異種コロナウイルス抗原がコロナウイルス抗原の少なくとも免疫原性部分が免疫反応を誘導するように、宿主細胞受容体によって曝露され、アクセス可能であるように、部分的にカプセル化または包埋され得る。
コロナウイルス抗原と担体のカップリング
コロナウイルス抗原は、担体に共有結合または非共有結合で付着させることができる。用語「付着」、「付着した」、「結合」および「結合した」は互換的に使用され、１つの実体（例えば、化学部分）と別の実体との化学的会合を指す。付着は例えば、第１の実体が第２の実体に直接的にバインドされる場合、または第１の実体が１つまたは複数の中間実体を介して第２の実体にバインドされる場合、直接的または間接的であり得る。いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原のC末端が担体を形成するサブユニットのN末端に付着している。
いくつかの実施形態では、付着またはカップリングが２つの実体間の共有結合の存在の文脈で付着が起こるように共有結合性である。いくつかの実施形態では、付着またはカップリングが非共有結合相互作用（電荷相互作用、親和性相互作用、金属配位、疎水性相互作用、水素結合相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、双極子－双極子相互作用、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない）によって媒介される。いくつかの実施形態において、カプセル化は、付着の形態である。いくつかの実施形態において、複数のコロナウイルス抗原は、多価担体にコンジュゲートされる。
本明細書に記載の担体は例えば、コロナウイルス抗原の対応する官能基または対応する反応性部分との結合のために提示される官能基または反応性部分で官能化することができる。したがって、コロナウイルス抗原と多価担体との間の付着は、官能基対または反応性部分対の間の付着を介して起こり得る。例示的な官能基対または反応性部分対としてはアビジン（例えば、ストレプトアビジン、NeutrAvidin、CaptAvidin）およびビオチン対、Strep－TactinおよびStrep－tag対、チオールおよびチオール反応性部分（例えば、マレイミド、ハロアセトアミド、ヨードアセトアミド、ベンジルハロゲン化物およびブロモメチルケトン）対、ならびにアミンおよびアミン反応性部分（例えば、スクシンイミジル、テトラフルオロフェニル、カルボジイミド、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、ジクロロトリアジン、ハロゲン化アクリル、アシルアジドなどの活性エステル）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原が２つの反応性基を含有する化学的および／または光反応性架橋剤（例えば、架橋剤）を介して多価担体に付着させることができ、それによって、抗原と担体とを共有結合させる手段を提供する。化学架橋試薬中の反応性基は、典型的にはスクシンイミジルエステル、マレイミドおよびヨードアセトアミド、ならびに当業者に同定可能な他のものを含む、官能基のクラスに属する。架橋および光活性化可能な試薬のさらなる例は例えば、thermofisher．com／us／en／home／references／molecular－probes－the－handbook／crosslinking－and－photoactivatable－reagents．htmlに記載されており、その内容は参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がクリックケミストリー部分を介して多価担体に結合することができる。本明細書で使用される「クリックケミストリー」という用語はK.Barry Sharpless of The Scripps Research Instituteによって導入された化学哲学を指すことができ、反応性基を含む小単位を一緒に結合することによって迅速かつ確実に共有結合を生成するように調整された化学を説明する。クリックケミストリーは、特定の反応を指すのではなく、自然界に見られる反応を模倣する反応を含む概念を指す。いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応がモジュール式であり、範囲が広く、高い化学収率を与え、非毒性副生成物を生成し、立体特異的であり、単一の反応生成物との反応に有利に働く８４kJ／molを超える大きな熱力学的駆動力を示し、および／または生理学的条件下で実施することができる。特に、生理学的条件下で実施することができ、毒性または他の有害な副生成物を生成しないクリックケミストリー反応は、インサイチュでのヒドロゲルの生成に適している。クリックケミストリー反応に関与し得る反応性部分は当業者に周知であり、アルキンおよびアジド、アルケンおよびテトラゾールまたはテトラジン、またはジエンおよびジチオエステルが挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合の文脈での使用に適した他の適切な反応性クリックケミストリー部分は、当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原がSpyタグ／SpyCatcher結合対を介して多価担体（例えば、多価担体の粒子形成タンパク質）に結合される。Spyタグ／SpyCatcher結合対は化膿連鎖球菌由来のFbaBのCnaB２ドメインの内部イソペプチド結合に基づくタンパク質連結系を指す（例えば、Zakeri et al、Proc．Natl．Acad．Sci．USA．２０１２、１０９：E６９０－E６９７を参照されたい）。CnaB２は、２つの相補的フラグメントに分割および操作され、その結果、第１のフラグメント（SpyCatcher）はSpyCatcherにおけるリジンおよびSpyTagにおけるアスパラギン酸塩の側鎖を介して、第２のフラグメント（SpyTag）と結合し、共有イソペプチド結合を形成することができる。次いで、複数のコロナウイルス抗原を提示する多価担体を、SpyTag／SpyCatcher媒介性の抗原の担体へのコンジュゲーションの結果として生成することができる。SpyTag／SpyCather結合系は、いくつかの実施形態において、コロナウイルス抗原と多価担体の粒子形成タンパク質との間の相互作用の改善された安定性および特異性を提供することができる。
いくつかの実施形態では、多価担体の粒子形成タンパク質がペプチド結合を介して一緒に連結されて単一のタンパク質を作製している少なくとも２つの無関係のタンパク質由来のアミノ酸配列を含有する融合タンパク質である。例えば、コロナウイルスタンパク質抗原をSpyTagモチーフに融合させることができ、担体サブユニット配列をSpyCatcherモチーフに融合させることができる。あるいは、コロナウイルスタンパク質抗原をSpyCatcherモチーフに融合させることができ、担体サブユニット配列をSpyTagモチーフに融合させることができる。複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原はコロナウイルス抗原のC末端にSpyTagを含むことができ、複数の粒子形成タンパク質の粒子形成タンパク質は、粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherを含む。
いくつかの実施形態では、粒子形成タンパク質が粒子形成タンパク質のC末端にmi３単量体サブユニットタンパク質を含有し、粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherタンパク質を含有する融合タンパク質、または粒子形成タンパク質のC末端にAP２０５－CP３単量体サブユニットタンパク質を含有し、SpyCatcherタンパク質がコロナウイルス抗原のSpyTagに結合するために提示または表示されるように粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherタンパク質を含有する融合タンパク質であり得る。
いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原がコロナウイルスSタンパク質RBDを含み、コロナウイルスSタンパク質RBDはコロナウイルスSタンパク質RBDのC末端にSpyタグを含み、複数の粒子形成タンパク質の粒子形成タンパク質は粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherを含む。
多価担体
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本明細書で使用される多価担体が複数のコロナウイルスに由来する複数のコロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルスは互いに異なる。複数のコロナウイルス抗原は、第１のコロナウイルスの少なくとも第１のコロナウイルス抗原と、第１のコロナウイルスとは異なる第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原とを含むことができる。
１つのコロナウイルスは、２つのコロナウイルスがコロナウイルス科の異なる株、種、亜属、属、亜科を含む異なる分類群に由来する場合、別のコロナウイルスとは異なると考えられる。１つのコロナウイルスはまた、２つのコロナウイルスが抗原的に異なるウイルスである場合、別のコロナウイルスとは異なると考えられる。「抗原的に分岐したコロナウイルス」という用語はコロナウイルス株を指し、コロナウイルス株は経時的に変異する傾向を有するか、または変異を発症し、したがって、免疫系に提示されるアミノ酸を変化させる。経時的なそのような突然変異は、「抗原ドリフト」とも称され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスがコロナウイルス科内の異なる属に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスが同じコロナウイルス科内の異なる亜属に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスが同じコロナウイルス科内の異なる種に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスが同じコロナウイルス科内の異なる株である。
いくつかの実施形態において、多価担体は複数のコロナウイルス抗原を含み、複数のコロナウイルス抗原は少なくとも２、３、４、５、６、７、または８個の異種コロナウイルス抗原を含み、その各々は、互いに異なるコロナウイルスのものであるか、またはそれに由来する。
例えば、多価担体は複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原、および第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原を少なくとも含み、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、および第３のコロナウイルスは互いに異なる。
多価担体は複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は少なくとも、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原、第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原、および第４のコロナウイルスの第４のコロナウイルス抗原を含み、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、第３のコロナウイルス、および第４のコロナウイルスは互いに異なる。
多価担体は複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は少なくとも、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原、第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原、第４のコロナウイルスの第４のコロナウイルス抗原、および第５のコロナウイルスの第５のコロナウイルス抗原を含み、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、第３のコロナウイルス、４つのコロナウイルス、および第５のコロナウイルスは互いに異なる。
多価担体は複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は少なくとも、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原、第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原、第４のコロナウイルスの第４のコロナウイルス抗原、第５のコロナウイルスの第５のコロナウイルス抗原、および第６のコロナウイルスの第６のコロナウイルス抗原を含み、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、第３のコロナウイルス、第４のコロナウイルス、第５のコロナウイルス、および第６のコロナウイルスは互いに異なる。
多価担体は複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は少なくとも、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原、第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原、第４のコロナウイルスの第４のコロナウイルス抗原、第５のコロナウイルスの第５のコロナウイルス抗原、第６のコロナウイルスの第６のコロナウイルス抗原、および第７のコロナウイルスの第７のコロナウイルス抗原を含み、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、第３のコロナウイルス、第４のコロナウイルス、第５のコロナウイルス、第６のコロナウイルス、および第７のコロナウイルス抗原は互いに異なる。
多価担体は複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は少なくとも、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原、第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原、第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原、第４のコロナウイルスの第４のコロナウイルス抗原、第５のコロナウイルスの第５のコロナウイルス抗原、第６のコロナウイルスの第６のコロナウイルス抗原、第７のコロナウイルスの第７のコロナウイルス抗原、および第８のコロナウイルスの第８のコロナウイルス抗原を含み、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、第３のコロナウイルス、第４のコロナウイルス、第５のコロナウイルス、第６のコロナウイルス、第７のコロナウイルス、および第８のコロナウイルス抗原は互いに異なる。
いくつかの実施形態では、多価担体が複数のコロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は８を超える異種コロナウイルス抗原を含み、その各々は互いに異なるコロナウイルス（すなわち、異なる分類学的群のコロナウイルスおよび／または抗原的に異なるウイルス）のものであるか、またはそれに由来する。
多価担体によって提示される異種コロナウイルス抗原の数は、異なる実施形態において異なり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多価担体が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲の異種コロナウイルス抗原である。
多価担体によって提示されるコロナウイルス抗原の総数は、異なる実施形態において異なり得る。いくつかの実施形態では、多価担体が約、少なくとも約、最大で、または最大で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の数もしくは範囲のコロナウイルス抗原の総数を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子によって提示されるコロナウイルス抗原の総数が脂質ベースのナノ粒子中の粒子形成脂質の数およびタンパク質ベースのナノ粒子中の粒子形成タンパク質の数などの、ナノ粒子を構成する粒子形成サブユニットの数によって制限されることを理解されたい。例えば、Thermotoga maritima由来のカプセル化タンパク質は、６０－mersを有するナノ粒子を形成する。したがって、封入体ベースのナノ粒子（例えば、mi３ナノ粒子およびi３０１ナノ粒子）は、最大６０個のタンパク質抗原を提示することができる。いくつかの実施形態では、担体の粒子形成サブユニットが２つ以上のコロナウイルス抗原と結合することができる。
多価担体に結合した複数のコロナウイルス抗原は、同じタンパク質型または対応するタンパク質であり得る。同じタンパク質型のコロナウイルス抗原は同一のアミノ酸配列を有しても有しなくてもよいが、一般に、いくつかの配列相同性を共有する。例えば、異なるコロナウイルスのコロナウイルスSタンパク質は、同じタンパク質タイプまたは対応するタンパク質である。別の実施例として、異なるコロナウイルス由来のエンベロープタンパク質は、同じタンパク質タイプまたは対応するタンパク質とみなされる。いくつかの実施形態では、同じ機能を有する異なるコロナウイルス分類群のタンパク質が同じタンパク質タイプまたは対応するタンパク質とみなされる。いくつかの実施形態において、同じタンパク質型のコロナウイルス抗原は少なくとも５０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。
あるいは、いくつかの実施形態では多価担体に結合した複数のコロナウイルス抗原が異なるタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含むことができる。異なるタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質は、典型的には異なる機能を有する。例えば、多価担体に結合した複数のコロナウイルス抗原は、コロナウイルスSタンパク質またはその一部、ならびにコロナウイルスNタンパク質またはその一部、コロナウイルスHEタンパク質またはその一部、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼまたはその一部、コロナウイルス３CLプロテアーゼまたはその一部、および／またはコロナウイルスMタンパク質またはその一部などの他のコロナウイルスタンパク質を含むことができる。
複数のコロナウイルス抗原のうちの１つまたは複数、または複数のコロナウイルス抗原の各々は、互いに約、少なくとも、または少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では複数のコロナウイルス抗原はそれぞれ、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分を含み、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分は互いに約、少なくとも、または少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原はそれぞれ、配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルス抗原はそれぞれ、配列番号１～１２および１５～２６から選択されるアミノ酸配列を含む。
異なるコロナウイルスの付着コロナウイルス抗原の数は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原の数および第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原の数は、１：５０～５０：１の比であり得る。いくつかの実施形態では、上記比率は、約、少なくとも、少なくとも約、最大で、最大で約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４、１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、または任意の２つの値の間の数値であり得る。いくつかの実施形態では、比率は約、少なくとも、少なくとも約、最大で、最大で約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４、１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、または任意の２つの値の間の範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスのコロナウイルス抗原の数および別のコロナウイルスのコロナウイルス抗原の数が１：５０～５０：１の比であり得る。いくつかの実施形態では
比率は約、少なくとも、少なくとも約、最大で、最大で約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４、１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、または任意の２つの値の間の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、
比率は約、少なくとも、少なくとも約、最大で、最大で約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４、１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、または任意の２つの値の間の範囲であり得る。
本明細書に記載の多価担体は広範な中和抗体を誘発することにより、広範な保護抗コロナウイルス応答を誘導することができる。広範な中和抗体は、抗体を誘発するために使用されるコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスの分類群と同じであるだけでなく、それとは異なる分類群からのコロナウイルスを中和することができる抗体である。広範な中和応答は、異種中和応答とも称され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多価担体がコロナウイルス抗原が多価担体を産生するために由来するコロナウイルスのサブファミリー、属、亜属、種、および／または株とは異なる、サブファミリー、属、亜属、種、および／または株由来の１つまたは複数のコロナウイルスを中和する広範な中和抗体を誘発することができる。
いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルス由来の異種コロナウイルス抗原を含む多価担体が第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスだけでなく、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスとは異なる１つまたは複数のコロナウイルス（例えば、第３のコロナウイルス、第４のコロナウイルスなど）に対する異種結合および中和応答も誘導することができる。特に、１つ以上の特定のコロナウイルスを含まない複数のコロナウイルス由来の異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、１つ以上の特定のコロナウイルスに対する異種結合および中和応答を誘導することができる。
例えば、多価担体がSARS－CoV２およびSHC０１４－CoV由来のコロナウイルス抗原を用いて構築される場合、そのような多価担体によって誘発される抗体は、SARS－CoV２およびSHC０１４－CoV以外の属、亜属、種および／または株の１つまたは複数のコロナウイルスを中和することができる。別の例として、WIV１、Rf１、RmYN０２およびpang１７由来のコロナウイルス抗原を使用して構築された多価担体は、WIV１、Rf１、RmYN０２およびpang１７だけでなく、SARS－CoV２、SHC０１４、SARS－CoV、Yun１１、BM－４８３１およびBtKY７２などの他のコロナウイルスに対する異種結合および中和応答を誘発することができる（例えば、図３C～Fを参照されたい）。さらに別の例では、SARS－CoV－２、SHC０１４、RaTG１３、およびRs４０８１由来のコロナウイルス抗原を使用して構築された多価担体はSARS－CoV－２、SHC０１４、RaTG１３、およびRs４０８１だけでなく、WIV１、SARS－CoV、Yun１１、BM－４８３１、およびBtKY７２などの他のコロナウイルスに対しても、異種結合および中和応答を誘発することができる（例えば、図３C～Fを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルス由来の異種コロナウイルス抗原を含む多価担体が第１のコロナウイルスまたは第２のコロナウイルス由来の単一コロナウイルス抗原の相同集団を含む一価担体（「相同型ナノ粒子」とも呼ばれる）と比較して、第１のコロナウイルスおよび／または第２のコロナウイルスに対する免疫応答のほぼ同じまたは同等の大きさ（例えば、約、少なくとも、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の数または範囲）を誘導することができる。言い換えれば、異なる分類群のコロナウイルス由来のコロナウイルス抗原の共提示はコロナウイルス由来の抗原を提示する相同型担体（例えば、相同型SARS－CoV２ナノ粒子）と比較して、コロナウイルス（例えば、SARS－CoV２）に対する免疫反応を減少させない。非限定的な例では、SARS－CoV２に対する免疫応答の大きさに関して、SARS－CoV２タンパク質抗原ならびに他のコロナウイルスタンパク質抗原を含むモザイクナノ粒子を用いて免疫化を行うのに、相同型SARS－CoV２ナノ粒子に対して有利であり得る（例えば、図３Cを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルス由来の異種コロナウイルス抗原を含む多価担体が第１のコロナウイルスまたは第２のコロナウイルス由来の単一コロナウイルス抗原の相同集団を含む一価担体と比較した場合、第１のコロナウイルスおよび／または第２のコロナウイルスに対する免疫応答の増大した大きさを誘導することができる。多価担体によって誘導される免疫応答の大きさは、約、少なくとも、または少なくとも約０．２、０．５、０．９、１．１、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはこれらの値のいずれかの間の数または範囲であり得、一価担体によるよりも大きい。いくつかの実施形態では、多価担体によって誘導される免疫応答の大きさは一価担体によるものと比較して、約、少なくとも、または少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはこれらの値のいずれかの間の数もしくは範囲だけ増加させることができる。
いくつかの実施形態では、多価担体が特定のコロナウイルス由来のコロナウイルス抗原を提示しないが、例えば、その特定のコロナウイルス由来のコロナウイルス抗原を提示する一価担体と比較して、同等の、またはさらに増強された大きさで、その特定のコロナウイルスに対する広範な中和抗体を依然として産生することができる。例えば、第１のコロナウイルスを含まない複数のコロナウイルス由来の異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は第１のコロナウイルス由来の単一コロナウイルス抗原の相同集団を含む一価担体と比較した場合、第１のコロナウイルスに対する免疫応答のほぼ同じまたは同等の大きさ（例えば、約、少なくとも、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％、またはこれらの値のいずれかの間の数または範囲）を誘導することができる。
いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルスを含まない複数のコロナウイルス由来の異種コロナウイルス抗原を含む多価担体が第２のコロナウイルス由来の単一コロナウイルス抗原の相同集団を含む一価担体と比較した場合、第１のコロナウイルスに対する増強された異種結合および中和応答を誘発することができる。１番目と２番目のコロナウイルスは互いに異なっている。多価担体によって誘導される中和応答の大きさは、約、少なくとも、または少なくとも約０．２、０．５、０．９、１．１、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはこれらの値のいずれかの間の数または範囲であり得、一価担体によるよりも大きい。いくつかの実施形態では、多価担体によって誘導される免疫応答の大きさは一価担体によるものと比較して、約、少なくとも、または少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはこれらの値のいずれかの間の数もしくは範囲だけ増加させることができる。
いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルス由来の異種コロナウイルス抗原を含む多価担体が第１のコロナウイルスまたは第２のコロナウイルス由来の水溶性コロナウイルス抗原と比較した場合、第１のコロナウイルスおよび／または第２のコロナウイルスに対する実質的に増強された中和応答を誘発することができる。多価担体によって誘導される中和応答の大きさは、水溶性コロナウイルス抗原によるよりも約、少なくとも、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍、またはこれらの値のいずれかの間の数または範囲であり得る。
本明細書に記載される多価担体は、当業者に公知の任意の標準的な分子生物学的手順ならびに本明細書に例示されるプロトコルを使用して調製することができる（例えば、実施例２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、粒子形成サブユニットおよび／またはコロナウイルスタンパク質抗原が当業者に公知の液相または固相化学タンパク質合成方法によって産生することができる。
粒子形成サブユニットおよび／またはコロナウイルスタンパク質抗原の産生は、当技術分野で周知の組換えDNA技術を使用することができる。例えば、タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原またはタンパク質タグで機能化されたコロナウイルスタンパク質抗原は、当業者に公知の細胞ベースまたは無細胞方法などの生合成方法を使用して合成することができる。タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原は、コロナウイルスタンパク質抗原を符号化する核酸分子を含む発現ベクターを用いて産生することができる。核酸分子は、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、終止部位、および翻訳開始部位を含むがこれらに限定されない適宜調節エレメントに作動可能に連結され得る。ベクトルはまた、１つ以上のタンパク質タグ（例えば、ポリ（His）タグ、SpyTag）を符号化する核酸分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、ベクトルが三量体化モチーフ（例えば、T４フィブリチンまたはウイルスカプシドタンパク質SHP由来のフォールドオン三量体化ドメイン）を符号化する核酸分子をさらに含むことができる。ベクトルはまた、発現されたタンパク質を上清培地に分泌させるためのシグナルペプチドなどの、タンパク質を適切な細胞経路に導くシグナルペプチドをコードする核酸分子を含むことができる。ベクトルは、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性を提供する遺伝子などの１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含み得る。核酸構築物の構築のための方法は周知である。例えば、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、３rd edition、Sambrook et al、２００１ Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al、eds．、John Wiley & Sons、１９９４を参照されたい。タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原のタンパク質生合成は、タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原をコードする発現ベクターを用いて、細胞ベースまたは無細胞タンパク質翻訳系を提供することによって行うことができる。同様に、タグ付き粒子形成タンパク質は粒子形成サブユニットを符号化する核酸分子およびタンパク質タグを符号化する核酸分子（例えば、SpyCatcher）を含む発現ベクターを用いて産生することができる。例示的な実施形態では、多価担体がCohen AA et al、２０２１、PLoS ONE １６（３): e０２４７９６３に記載されているプロトコルに従って生成され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、担体サブユニットおよびコロナウイルス抗原を発現する構築物は、ホストまたは変態コンピテント細胞に一緒に導入され得る。多価担体は発現されたコロナウイルス抗原の、本明細書に記載の官能基対または反応性部分対（例えば、SpyTag／SpyCatcher）を介した自己組織化ナノ粒子へのコンジュゲーションの結果として生成することができる。
担体（例えば、SpyCatcherを有するナノ粒子）およびコロナウイルス抗原（例えば、SpyTaggedタンパク質抗原）は例えば、別々に調製され得、次いで、一定の期間（例えば、少なくとも、または少なくとも約１時間、２時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間）、条件下（例えば、室温でTBS緩衝液中）でインキュベートされ。いくつかの実施形態において、コロナウイルスタンパク質抗原は担体の粒子形成サブユニットと比較して過剰量、例えば、粒子形成サブユニットよりも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上で提供される。
医薬組成物および治療用途
ワクチン組成物
また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の多価担体を、１つ以上の適合性および薬学的に許容可能な担体含むワクチン組成物である。ワクチン組成物は対象における予防的（例えば、疾患の発症を予防もしくは遅延させるため、またはその臨床症状もしくは無症状の発現を予防するため）または治療的（例えば、症状の抑制もしくは緩和）免疫反応を誘発することができる医薬組成物である。
「薬学的に許容される」という語句は適正な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に相応して、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した、それらの薬剤、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で使用される。
本明細書で使用される「薬学的に許容される車両」という語句は、対象化学物質を１つの器官または身体の一部から別の器官または身体の一部に運搬または輸送することに関与する、液状または固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを手段する。各担体は配合の他の成分と適合性があり、対象に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として役立つことができる物質のいくつかの実例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガント；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオ脂および坐剤蝋などの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、ゴマ油などの油が挙げられる。オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１８）等張生理食塩水;)リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；および（２１）医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、薬学的に許容される塩を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」は、本明細書に記載される組成物の成分の１つの酸形態の塩を含む。これらには、アミンの有機または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容される塩は当業者に周知であり、様々な無機および有機酸の塩基性塩を含む。
ワクチン組成物は、適切なアジュバントをさらに含むことができる。アジュバントは被験体における免疫応答を増強、改善、またはそわなければ調節するために、本明細書に記載のタンパク質抗原と組み合わせることができる任意の免疫調節物質を指す。アジュバントは、当技術分野で公知の様々なアプローチのいずれかを介して、多価担体の表面に共有結合的または非共有結合的に結合またはカップリングされ得る。担体に結合させることができる例示的なアジュバントとしては、免疫刺激性ペプチド、オリゴヌクレオチドCpGモチーフ、免疫刺激性炭水化物および多糖類、ならびに免疫刺激性タンパク質またはペプチド分子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、フラジェリン、およびそれらの誘導体）、フロイントアジュバント、サパニン（例えば、行列M１）、レシチン、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドA、インターロイキン－１２、STINGアゴニスト、Advax、およびAS０１B、STINGアゴニスト（例えば、ビス－（３´，５´）－環状二量体グアノシン一リン酸（c－。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ワクチン組成物がアルミニウム塩ベースのアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、アルヒドロゲル）、エマルジョンアジュバント（例えば、AddaVaxTM、MF５９（登録商標）、AS０３、フロイントアジュバント、モンタニドISA５１）、およびtoll様受容体ゴニスト（例えば、CpG、ポリI：C、グルコピラノシルリピドA(GLA)、フラジェリン、およびレシキモド（R８４８））を含むか、またはそれらからなる群から選択される１つまたは複数のアジュバントを含む。当業者が理解するように、MF５８（登録商標）およびAddaVaxTMの両方は、スクアレンベースの水中油型ナノエマルジョンである。
ワクチン組成物は、様々な投与様式のために製剤化することができる。製剤化および投与のための技術は例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences"、１８ th ed．、１９９０、Mack Publishing Co、Easton、Paに見出すことができる。いくつかの実施形態では、本開示のワクチン組成物が以下のもの：（１）経口投与、例えば、ドレンチ（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト；（２）例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射による、例えば、滅菌溶液または懸濁液としての非経口投与：（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏またはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリームまたはフォームとしての膣内または直腸内；または（５）例えば、水性エアロゾル、リポソーム製剤またはヒドロゲル組成物を含有する中実粒子としてのエアロゾルを含む、固体または液体形態での投与のために特に製剤化され得る。薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体を含むことができる。
本開示の方法において有用な製剤には、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾルおよび／または非経口投与に適したものが含まれる。製剤は、好都合には単位剤形で提供され得、薬局の技術分野において周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を製造するために薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができる活性成分の量は、治療されるホスト、特定の投与様式に応じて変化する。単一剤形を製造するために薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができる活性成分の量は一般に、治療効果または免疫反応を生じる多価担体の量である。一般に、１００％のうち、この量は、活性成分の約１％～約９９％、好ましくは約５％～約７０％、最も好ましくは約１０％～約３０％の範囲である。
経口投与に適した製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（風味付けされた基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用する）、散剤、粒剤の形態、または水性もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用する）として、および／または洗口剤などとしての形態であってよい。
経口投与のための固体剤形（カプセル剤、錠剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）では、多価担体が１つ以上の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または（１）澱粉、ラクトース、スクロース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシアなどの結合剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶液遅延剤；（６）例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；（９）潤滑剤 、そのようなタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸薬の場合、薬学的組成物は、緩衝剤も含んでよい。ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールおよび類似物のような医薬品添加物を用いるソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中の充填剤として同様な種類の固体組成物も使用してよい。
経口投与用の液体製剤には、医薬的に許容される乳濁液、微細乳濁液、液剤、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤などがある。活性成分に加えて、液体剤形は例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などの当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有する可能性がある。
ワクチン組成物は、注射による、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射用製剤は単位剤形、例えば、アンプルまたは多用量容器中に、場合により防腐剤を添加して提供することができる。医薬組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとしてさらに製剤化することができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含む他の薬剤を含有することができる。
用途
本明細書に開示されるワクチン組成物は必要とする被験体における免疫応答を刺激するため、必要とする被験体におけるコロナウイルス感染を治療もしくは予防するため、および／または必要とする被験体におけるコロナウイルスによって引き起こされる疾患もしくは障害を治療もしくは予防するために、様々な治療的または予防的適用において使用することができる。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は患者によって現れる疾患、障害または生理学的状態（例えば、コロナウイルス感染）に応答して行われる介入を指す。治療の目的にはこれらに限定されないが、症状の緩和または予防、疾患、障害、または状態の進行または悪化の遅延または停止、および疾患、障害、または状態の寛解の１つまたは複数が含まれ得る。「治療する」および「治療」という用語は例えば、治療的処置、予防的処置、および対象が障害または他の危険因子を発症する危険性を低減する適用を含む。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状または根底にある危険因子を低減する実施形態を包含する。いくつかの実施形態では、「治療」が治療的処置および予防的または予防策両方を指す。処理を必要とするものとしては、疾患もしくは障害または望ましくない生理学的状態によってすでに影響を受けているもの、ならびに疾患もしくは障害または望ましくない生理学的状態が予防されるべきものが挙げられる。本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、後にこれらの症状を発現する個々の負担を軽減する任意の活性を指す。これは、一次、二次および／または三次予防レベルで行うことができ、ここで、a）一次予防は症状／障害／状態の発症を回避する; b)二次予防活動が状態／障害／症状の治療の早期段階を目的とし、それによって、状態／障害／症状の進行および症状の出現を予防するための介入の機会を増加させる；およびc）三次予防は例えば、機能を回復させること、および／または任意の状態／障害／症状または関連合併症を減少させることによって、すでに確立された状態／障害／症状の負の影響を減少させる。「予防する」という用語は、事象の可能性を１００％排除することを必要としない。むしろ、それは、事象の発生の可能性が化合物または方法の存在下で低減されたことを示す。
本明細書で使用される「条件」という用語は個々の完全な身体的、精神的、および社会的幸福の条件に関連する標準的な身体的条件に適合しない、個々の身体の身体的条件（全体として、またはその部分の１つもしくは複数として）を示す。本明細書に記載される状態は限定されるものではないが、障害および疾患を含み、用語「障害」は身体またはその任意の部分の機能的異常に関連する生存個体の状態を示し、用語「疾患」は身体またはその任意の部分の正常な機能を損なう生存個体の状態を示し、典型的には徴候および症状を区別することによって現れる。
コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を発現する徴候および症状としては限定されるものではないが、発熱、咳、疲労、味覚または嗅覚の喪失、息切れまたは呼吸困難、筋肉痛、悪寒、咽頭痛、鼻水、頭痛、胸痛、ピンク目（結膜炎）、悪心、嘔吐、下痢、発疹、肺炎および急性呼吸窮迫症候群が挙げられ得る。コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害はまた、不整脈、心筋症、急性心損傷、血栓塞栓症および肺塞栓症を含む凝固障害、播種性血管内凝固（DIC）、出血および動脈血餅形成を含む心臓障害、ギラン－バレー症候群、敗血症、ショック、多臓器不全、および多系統炎症症候群、ならびにそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない重篤な合併症を含み得る。
「対象」、「必要とする対象」、および「個体」という用語は、本明細書で使用される場合、動物、特に高等動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトなどの脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象または個体がコロナウイルスに曝露されている。「曝露された」という用語は、対象がコロナウイルスに感染していることが知られているヒトまたは動物と接触したことを示す。いくつかの実施形態では、必要とする対象がコロナウイルスに曝露された、または曝露されるリスクのある健康な対象であり得る。いくつかの実施形態では、必要とする対象がコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害に既に罹患している対象、またはコロナウイルス感染と診断された対象を含む。
したがって、ワクチン組成物は、任意の症状に先立って、例えばコロナウイルス感染に先立って投与することができる。ワクチン組成物はまた、疾患または感染症の症状の開始時または開始後、例えば、感染症の症状の開始後または感染症の診断後に投与され得る。
本明細書で使用される「治療的有効量」という語句はある所望の治療効果をもたらし、および／または所望の応答を生じさせるのに有効で本明細書に開示される多価担体の量を手段し、例えば、合理的な利益／リスク比率で、肺炎などの状態または疾病の症状または符号を低減または排除する。治療有効量はまた、当業者に理解されるように、多価担体の構造および抗原、利用される投与経路、ならびに治療される特定の疾患または障害に応じて変化する。例えば、所与の臨床治療が疾患または障害に関連する測定可能なパラメータの少なくとも２０％の低下がある場合に有効であると考えられる場合、その疾患または障害の治療のための多価担体の治療有効量は、その測定可能なパラメータの少なくとも２０％の低下を達成するために必要な量である。
いくつかの実施形態では、治療有効量がコロナウイルス複製を阻害するため、またはウイルス感染の外向きの症状を測定可能に緩和するため、または疾患、状態、もしくは障害のさらなる現像を阻害するために必要である。いくつかの実施形態では、治療有効量がコロナウイルス感染によって引き起こされ得る１つまたは複数の徴候または症状を予防する量である。いくつかの実施形態では、治療有効量が特定の疾患または状態の１つまたは複数の徴候または症状、例えばコロナウイルス感染に関連する１つまたは複数の徴候または症状を発症させない量であり得る。
本明細書に記載のワクチン組成物の治療有効量は細胞培養アッセイから得られたデータから推定することができ、動物研究で得られたデータからさらに決定し、その後ヒト臨床試験を行うことができる。例えば、本明細書に記載されるワクチン組成物の毒性および治療有効性は例えば、LD５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびED５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性および治療効果の用量比は治療指数であり、LD５０とED５０ との比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物の治療有効量の判定がコロナウイルスに対して産生された抗体の力価を測定することによって測定することができる。抗体力価を決定する方法およびウイルス中和アレイを実施する方法は当業者に公知であり、本開示の実施例の項に例示される（例えば、実施例２を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、必要とする対象において免疫反応を刺激する方法が本明細書に開示され、この方法は薬学的有効量のワクチン組成物を対象に投与することを含み、それによって、必要とする対象において免疫反応を刺激する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物の投与が第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスとは異なるさらなるコロナウイルスに対する中和応答を誘導して、ワクチン組成物を生成する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスに対する中和応答を誘導して、ワクチン組成物を生成する。
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象においてコロナウイルス感染を治療または予防するための方法が開示され、この方法は対象に薬学的有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を投与することを含み、それによって対象におけるコロナウイルス感染を治療または予防する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療結果予防することをもたらす。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスとは異なるさらなるコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療または予防して、ワクチン組成物を生成することをもたらす。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療または予防して、ワクチン組成物を生成することをもたらす。
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象においてコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を治療または予防する方法が開示され、この方法は本明細書に記載されるワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することを含み、それによって、対象におけるコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を治療または予防する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を治療または予防することをもたらす。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスとは異なるさらなるコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を治療または予防して、ワクチン組成物を生成することをもたらす。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を投与することは複数のコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を治療または予防して、ワクチン組成物を生成することをもたらす。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物が広い保護抗コロナウイルス応答を誘導することによって、広いコロナウイルス感染またはそのような感染によって引き起こされる疾患および障害を治療および予防するために使用することができる。例えば、本明細書に記載のワクチン組成物は、コロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスのサブファミリー、属、亜属、種、および／または株とは異なる、サブファミリー、属、亜属、種、および／または株由来の１つまたは複数のコロナウイルスを中和して、ワクチン組成物を生成する広範な中和抗体を誘発することができる。
本明細書に記載のワクチン組成物は、注射、吸入もしくは絶縁などの当業者に周知の技術を用いて、または経口、非経口もしくは直腸投与によって投与することができる。ワクチン組成物は限定されるものではないが、従来のシリンジおよび無針注射装置を含む手段によって投与することができる。適切な投与経路としては非経口送達、例えば、筋肉内、皮内、皮下、髄内注射、ならびにくも膜下腔の、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が挙げられるが、これらに限定されない。注射のために、本明細書に記載のワクチン組成物は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液中に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、多価担体およびそのワクチン組成物が対象に系統的に投与することができる。本明細書で使用される「全身投与」という表現はワクチン組成物が個々の身体と接触させられる任意の投与経路を示し、その結果、体内の得られる組成物の位置は全身性である（すなわち、ワクチンが投与される特定の組織、臓器、または他の身体部分に限定されない）。全身投与には、経腸および非経口投与が含まれる。経腸投与は物質が消化管を介して与えられる全身投与経路であり、経口投与、胃栄養チューブによる投与、十二指腸栄養チューブによる投与、胃瘻造設術、経腸栄養、および直腸投与を含むが、これらに限定されない。非経口投与は物質が消化管以外の経路によって与えられる全身投与経路であり、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、投与、腹腔内投与、および膀胱内注入を含むが、これらに限定されない。
本明細書に開示されるワクチン組成物は、プライム／昇圧プロトコルを用いて対象に投与することができる。そのようなプロトコルでは、第１のワクチン組成物を対象に投与し（プライム）、その後、ある期間の後、第２のワクチン組成物を対象に投与することができる（昇圧）。第２の組成物（昇圧組成物）の投与は、第１の組成物（プライム組成物）の投与後、数日、数週間、または数ヶ月後に行うことができる。例えば、昇圧組成物は、プライム組成物が投与された後、約３日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、もしくは２８週間、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の数もしくは範囲で投与され得る。いくつかの実施形態では、昇圧組成物がプライム組成物の投与の約４週間後に投与することができる。
したがって、ワクチン組成物は、２回以上を必要とする対象に投与することができる。例えば、本明細書に記載の方法は第１のワクチン組成物を対象に投与すること、およびある期間の後に、第２のワクチン組成物を対象に投与することを含むことができる。
プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物は同じ組成物であることができるが、必ずしもそう必要はない。いくつかの実施形態では、プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物が多価担体に結合した同じまたは異なるコロナウイルス抗原を含有することができる。いくつかの実施形態では、プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物が多価担体に付着した同じコロナウイルス抗原を、異なる薬学的有効量で多価担体と共に含有することができる。いくつかの実施形態では、プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物が異なるアジュバントを含有することができる。いくつかの実施形態において、プライムワクチン組成物は、本明細書に開示される多価担体を含む。
多価担体およびそのワクチン組成物は異種コロナウイルス（例えば、異なる分類群のコロナウイルス）による感染から対象を保護するために使用することができる。言い換えれば、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスのコロナウイルス抗原を用いて作製されたワクチン組成物は第１および第２のコロナウイルス（すなわち、適合株）だけでなく、異なる分類群（すなわち、第１および第２のコロナウイルスとは異なるミスマッチ株またはコロナウイルス株）由来のコロナウイルスによっても、個体を感染から保護することができる。例えば、WIV１、Rf１、RmYN０２およびpang１７由来のコロナウイルス抗原を用いて作製されたワクチン組成物は広範な中和抗体を誘発し、それによって、WIV１、Rf１、RmYN０２およびpang１７による感染に対して同等の大きさで被験体を保護することができるだけでなく、コロナウイルスSARS－CoV２、SHC０１４、SARS－CoV、Yun １１、BM－４８３１およびBtKY７２に対しても保護することができる（例えば、図３C～Fを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、多価担体およびそのワクチン組成物が抗原的に分岐したコロナウイルスによる感染から個体を保護することができる。したがって、いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルスおよび第２のコロナウイルスのコロナウイルス抗原を使用して作製されたワクチン組成物が第１および第２のコロナウイルスの新生コロナウイルス変形例による感染に対して個体を保護することもできる。例えば、SARS－CoV２およびSHC０１４のコロナウイルス抗原を用いて作製されたワクチン組成物は、サルベコウイルスの抗原的に分岐したコロナウイルス株による感染に対して、および将来の分岐したコロナウイルス株による感染に対して個体を防御することができる。
キット
本明細書に記載の多価担体および多価担体を含有するワクチン組成物は、キットの構成要素として提供することができる。
キットは、本開示の多価担体またはワクチン、ならびにそのような多価担体およびワクチンを作製するための成分を含むことができる。そのようなものとして、キットは例えば、本明細書に記載のタンパク質抗原および／または粒子形成サブユニットをコードするプライマー、核酸分子、発現ベクター、核酸構築物、電池、緩衝液、基材、試薬、投与手段（例えば、シリンジ）、および前記成分のいずれかを使用するための説明書を含むことができる。キットはまた、本明細書に記載の予め形成された担体およびコロナウイルスタンパク質抗原を含むことができる。キットは、前述の、または関連する構成要素のいずれかを含む２つ以上の容器を含み得ることを理解されたい。例えば、キットの特定の部品は冷蔵を必要とし得るが、他の部品は室温で保管することができる。したがって、本明細書で使用される場合、キットは、その中に含まれる成分を一緒に使用することを意図して、１つまたは複数の実体によって別々の容器で販売される成分を含むことができる。
上記で論じた実施形態のいくつかの態様は以下の実施例においてさらに詳細に開示され、これらの実施例は本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない。
実施例１
モザイクナノ粒子の例示的な実施形態は、マウスにおいて人獣共通コロナウイルスに対する交差反応性免疫応答を誘発する
最新のSARS－CoV－２ワクチン候補はスパイク三量体（S）、すなわち、そのRBDの１つまたは複数が宿主受容体に結合するために「上方」位置をとった後にターゲット細胞侵入を媒介するウイルスタンパク質を含む（図１A）。ヒトコロナウイルスSARS－CoV－２、SARS－CoV、HCoV－NL６３、および関連動物コロナウイルス（WIV１およびSCH０１４）のRBDはそれらの宿主受容体としてアンギオテンシン変換酵素２（ACE２）を使用するが、他のコロナウイルスはジペプチジルペプチダーゼ４またはシアル酸などの受容体を使用する。ウイルス侵入におけるその機能と一致して、Sは中和抗体の主要な標的であり、多くはRBDを標的とする。
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、抗原の多価ディスプレイはB細胞応答を増強し、一価抗原よりも長く持続する免疫を提供することができ、したがって、タンパク質ベースのワクチン候補はしばしば、抗原多量体化を可能にするナノ粒子を含む。多くのナノ粒子およびカップリング方策がワクチン設計のために探求されており、「プラグアンドディスプレイ」方策が特に有用である。１つのそのようなアプローチでは、ウイルス様粒子のサブユニットに融合されたSpyCatcherと呼ばれる操作されたタンパク質ドメインの複数のコピーが１３残基のSpyTagでタグ付けされた精製された抗原への自発的イソペプチド結合を形成する。SpyCatcher－SpyTagシステムを用いて、高力価の中和抗体を誘発する多量体化SARS－CoV－２ RBDまたはS三量体を調製した。SARS－CoV－２に対する防御には有望であるが、コウモリのコロナウイルス保有者は将来の種間伝播を示唆しており、SARS－CoV－２と同様に新興コロナウイルスに対しても防御するワクチンが必要である。ここで、SpyCatcher００３－mi３ナノ粒子を、ヒトおよび動物コロナウイルス由来のSpyTagged RBDを同時に提示して調製し、モザイク粒子がインフルエンザヘッドドメインモザイク粒子について以前に実証されたように、交差反応性抗体応答を誘発し得るかどうかを評価した。相同型またはモザイクナノ粒子で免疫したマウスはSARS－CoV－２感染によってヒトにおいて誘発されたプラズマ抗体とは対照的に、広い結合および中和応答を生じた。さらに、モザイクナノ粒子は、同型SARS－CoV－２ナノ粒子と比較して、ヒトおよびbat SARS様ベータコロナウイルス（サルベコウイルス）に対して増強された異種結合および中和特性を示した。
SARS－CoV－２およびSARS関連緊急人獣共通コロナウイルスに対する防御が緊急に必要とされている。この実施例では、SARS－CoV－２のRBDを示す、またはSARS－CoV－２ RBDを共提示する相同型ナノ粒子を、ヒトに対する脅威を表す動物ベータコロナウイルス（モザイクナノ粒子；４～８個の別個RBD）由来のRBDと共に作製した。可溶性抗原ではないが、RBDナノ粒子で免疫したマウスは交差反応性結合および中和応答を誘発した。モザイク－RBD－ナノ粒子は、同型SARS－CoV－２－RBD－ナノ粒子またはCOVID－１９回復期ヒトプラズマによる免疫からの血清と比較して、異種RBDの優れた交差反応性認識を有する抗体を誘発した。さらに、モザイクRBD免疫化マウス由来の血清は同型SARS－CoV－２－RBDナノ粒子免疫化由来の血清よりもプライミング後に同等またはより良好に異種偽型コロナウイルスを中和し、共表示装置から生じる特定のRBDに対する免疫原性損失を示さなかった。この実施例に示すように、モザイク－RBD－ナノ粒子による単一の免疫化は、SARS－CoV－２および新興人獣共通コロナウイルスに対して同時に防御する潜在的な戦略を提供する。
Letko M et al、Nature Microbiology ５、５６２－５６９ （２０２０）に記載されているサルベコウイルスRBD受容体利用および細胞指向性の研究を利用して、モザイク粒子上での共表示のためのRBDの選択を導いた。別個クレード（クレード１、２、１／２、および３）に分類された２９のRBDから、多様なRBDがSARS－CoV、WIV１、およびSHC０１４（クレード１）、SARS－CoV－２（クレード１／２）、Rs４０８１、Yunnan ２０１１（Yun１１）、およびRf１（クレード２）、ならびにBM４８－３１（クレード３）から同定され、そのうちSARS－CoV－２およびSARS－CoVはヒトコロナウイルスであり、残りは中国またはブルガリア（BM４８－３１）に由来するコロナウイルスである。また、GXパンゴリンクレード１／２コロナウイルス（ここではpang１７と呼ぶ）、RaTG１３、SARS－CoV－２に最も密接に関連するbatクレード１／２ウイルス、RmYN０２、中国由来のクレード２バットウイルス、およびケニアバットクレード３ウイルスであるBtKY７２由来のRBDも含まれた。選択されたRBDにわたる配列保存のマッピングはSARS－CoV－AC２ ACE２受容体結合モチーフ（図１A～図１D；図５A～図５C）に対応する残基において様々な程度の配列同一性（６８～９５％）を示し、１２個のRBDのうちの８個は、３つのタイプのモザイクナノ粒子：モザイク－４a（SARS－２、RaTG１３、SHC０１４、およびRs４０８１ RBDに結合）、モザイク－４b（pang１７、RmYN０２、RF１、およびWIV１。モザイク粒子に結合していないSARS、Yun１１、BM－４８３１、およびBtKY７２由来のRBDを用いて、交差反応性応答について血清を評価した。
SpyTag００３－RBDをSpyCatcher００３－mi３（６０の電位共役部位）にカップリングさせて、相同型およびモザイクナノ粒子を作製した（図２A）。粒子をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって精製し、SDS－PAGEによって分析し、単分散SECプロファイルおよびほぼ１００％のコンジュゲーションを明らかにした（図２B～図２C）。代表的なRBDを、類似または同一の効率でSpyCatcher００３－mi３にコンジュゲートさせ（図６A～図６B）、モザイク粒子が異なるRBDのほぼ等モルの混合物を含有することを示唆した。
水溶性SARS－CoV－２スパイク三量体（SARS－２ S）、SARS－２ RBDのみを示すナノ粒子（同型SARS－２）、RBDを共提示するナノ粒子（モザイク－４a、モザイク－４b、モザイク－８）、または非共役ナノ粒子（mi３）のいずれかでマウスを免疫した。IgG応答を、SARS－２ S（図３B）またはRBDのパネル（図３C～図３F；図７A～図７F）に対するELISAによるプライムまたはブースト免疫化（図３A）の後に評価した。ブラックコンジュゲートナノ粒子免疫化動物由来の血清（図３A～図３F、図７A～図７F）は、背景技術を超える応答を示さなかった。抗SARS－２ S三量体および抗SARS－２ RBD血清応答は類似しており（図３B～図３C）、RBDに対して誘発された抗体がSARS－２ S三量体上のそれらの抗原決定基にアクセスできることを実証している。２９３TACE2標的細胞（SARS－CoV－２、SARS、WIV１およびSHC１０４）に感染することが知られている株について、真正ウイルス中和と定量的に相関する偽型ウイルスアッセイを用いて、インビトロ中和アッセイも行った。中和およびELISA力価は有意に相関し（図８A～図８D）、したがって、未知のウイルス侵入受容体利用のために偽型中和アッセイが不可能であった場合、ELISAは中和結果を予測することが示唆された。
水溶性SARS－２ S三量体（茶色のバー）で免疫したマウスは、ブースト後のSARS－２に対する自己応答を除いて、結合または中和を示さなかった（図３C～図３F）。対照的に、RBDナノ粒子免疫化動物由来の血清（赤色、緑色、黄色、および青色のバー）は全てのRBDへの結合（図３C～図３F；図７A）、および追加免疫後の全ての４つの株に対する中和（図３C～図３E）を示し、これは、可溶性抗原に対するナノ粒子上の多量体化抗原の免疫原性の増加と一致する。水溶性SARS－２三量体ではなく、相同型SARS－２ナノ粒子は、人獣共通RBDに対する異種応答および異種コロナウイルスの中和を誘導した（図３D～図３F）。SARS－２ RBDの、モザイク－４a上の他のRBDおよびモザイク－８対SARS－２ RBDの相同型表示装置（相同型SARS－２）での共表示装置が抗SARS－２応答、SARS－２特異的ELISAおよびモザイク対相同型免疫（図３C）での中和力価を減少させるかどうかに対処するために、比較した：相同型ナノ粒子（図３Cでは緑色および青色）で免疫された動物について、IgG抗SARS－２力価に有意差はなかった。したがって、SARS－２に対する免疫応答の大きさに関して、SARS－２ RBDを含むモザイクナノ粒子と比較して、相同型RBDナノ粒子による免疫化の利点はなかった。
マッチしたRBD（注入されたナノ粒子上に存在するRBD；灰色の水平シェーディング）対ミスマッチしたRBD（注入されたナノ粒子上に存在しないRBD；赤色の水平シェーディング）に対する血清応答を次に比較した（図３A～図３F；図７A～図７F）。SARS－２ RBDはモザイク－４b上に提示されなかったが、モザイク－４b免疫化（黄色）によって誘発された抗体力価はマッチさせたナノ粒子免疫化（相同型SARS－２（赤色）、モザイク－４a（緑色）、およびモザイク－８（青色））によって誘発された力価と有意に異ならず、追加免疫したモザイク－４b免疫化マウス由来の血清はSARS－２偽ウイルスを中和した（図３C）。他のマッチ対ミスマッチ比較において、血清は、これらのRBDが注入されたナノ粒子上に含まれたかどうかにかかわらず、SHC０１４およびWIV１の結合および中和を示し（図３D）、RBD間の共通エピトープの共有を強調した（図１A）。
モザイク対相同型SARS－２ナノ粒子の利点を実証すると、モザイク－８－免疫化マウス由来の血清は相同型SARS－２－免疫化マウス由来の血清よりもプライム後に有意に良好にSHC０１４およびWIV１ RBDに結合し、ブースト後にSHC０１４ RBDへのより良好な結合を保持した（図３D）。したがって、モザイク－８ナノ粒子よりも１つのタイプのRBDのみを示す相同型SARS－２ナノ粒子の電位増加した結合活性は、増加した幅を与えなかった。さらに、モザイク－８免疫血清および追加免疫血清は中和SHC０１４およびWIV１において相同型SARS－２免疫動物由来の血清よりも７～４４倍強力であった（図３D）モザイク－８血清によるSHC０１４およびWIV１偽ウイルスの中和がモザイクナノ粒子上のRBDを組み合わせることが、特定のRBDに対する免疫応答を減少させないことを示唆し、また、Rs４０８１およびRaTG１３に対する血清のELISA結合によって示唆される（図７A～図７B）。
RBDナノ粒子が完全にミスマッチの株およびSARS－CoV－２ RBD変異体を認識する抗体を誘発するかどうかをさらに検討するために、血清を、SARS、Yun１１、BM－４８３１、およびBtKY７２ RBDへの結合について（図３E～図３F）、SARS－２ RBD変異体（図７C）、MERS-CoV RBD(図７D）、およびSARS偽ウイルスアッセイにおける中和について（図３E）評価した。変異（Y４５３F、「デンマークミンク変異体」またはQ４９３K／Q４９８Y／P４９９T三重変異体）（図７C）の結果、SARS－２ RBD結合の低下は見られず、MERS-CoV RBDへの誘発血清の結合は見られず（図７D）、相同型SARS－２免疫化と比較して、モザイク免疫化のためのより高い交差反応性抗体応答が見られた：例えば、モザイク－８－初回刺激動物および追加免疫動物は、相同型SARS－２免疫化マウス由来の血清よりもSARS RBDに対して有意に高い力価を示した（図３E）。プライム後、相同型SARS－２免疫化動物由来の血清はSARSを中和しなかったが、モザイク－４bおよびモザイク－８血清は中和し（図３E）、おそらく、SARS RBDと９５％のアミノ酸同一性によって関連するWIV１ RBDを含むこれらのナノ粒子によって促進された（図１D）。追加免疫後、SARS－２およびモザイク－４a血清も中和したが、力価はモザイク－８免疫化動物の場合よりも約４倍低かった（図３E）。他のミスマッチRBD（Yun１１、BM－４８３１、BtKY７２）に対するELISA力価は相同型SARS－２プライミング由来の血清と比較して、モザイク－８プライミング後に収集された血清について有意に高く、増強された結合はブースティング後に保持された（図３F）。したがって、モザイクナノ粒子、特にモザイク－８は相同型SARS－２ナノ粒子よりもミスマッチRBDに対して高い抗体力価を誘導し、特に単一プライム後に、より広い抗コロナウイルス応答を誘導するための共表示装置アプローチを再び好む。
RBDナノ粒子昇圧動物由来のIgG＋脾臓B細胞上のB細胞受容体がSARS－２およびRs４０８１由来のRBD（７０％の配列同一性によって関連する）を同時に認識できるかどうかを尋ねるために、フローサイトメトリーを用いて交差反応性認識の可能性を調べた（図１D；図９A～図９E）。対照動物は陰性であったが、他の全ての群はSARS－２およびRs４０８１RBDを同時に認識するB細胞を示し、両方のRBDと交差反応する抗体の存在を示唆した（図９E）。
RBD－ナノ粒子免疫によって誘発された抗体をSARS－CoV－２感染によって誘発された抗体と比較するために、RBDパネルに対するELISAを、COVID－１９プラズマドナー由来のIgGを用いて繰り返した（図４A～図４H）。回復期プラズマのほとんどは、SARS－２ RBDへの検出可能な結合を示した（図４A）。しかしながら、他のサルベコウイルスRBD（RaTG１３、SHC０１４、WIV１、Rs４０８１およびBM－４８３１）への結合はSARS ２ RBDへの結合よりも有意に弱く、多くのヒトプラズマIgGはバックグラウンドを超えて結合しなかった（図４B～図４G）。さらに、回復期プラズマIgGはSARS－CoV－２偽ウイルスを中和したが、それらはSARS、SHC０１４、またはWIV１偽ウイルスの弱い中和を示したか、または中和を示さなかった（図４H）。これらの結果は、ヒトにおけるSARS－CoV－２感染に起因する人獣共通コロナウイルス株からのRBDの交差反応性認識とはほとんどまたは全く一致していない。
結論として、ナノ粒子上のRBDの多量体化は可溶性抗原と比較して免疫原性を増強し、同型SARS－２ナノ粒子免疫化は人獣共通RBDに結合し、ブースト後に異種コロナウイルスを中和するIgG応答を生じた。対照的に、水溶性SARS－２ S免疫化およびSARS－CoV－２による自然感染は、プラズマにおいて弱いまたは異種応答をもたらさなかった。SARS－２ RBDを、モザイクナノ粒子上の多様なRBDと共に共ディスプレイすることは、同型SARS－２ナノ粒子と比較して、SARS－CoV－２に対する中和抗体を誘発するための欠点を示さず、モザイクナノ粒子がCOVID－１９に対して防御するための候補ワクチンとして示唆された。さらに、相同型SARS－２ RBD粒子と比較して、モザイク共ディスプレイ戦略は人獣共通サルベコウイルスに対する中和抗体を誘発するための利点を実証し、したがって、ヒトスピルオーバーの可能性を有する新興コロナウイルスに対する防御も潜在的に提供する。一致株およびミスマッチ株の中和がモザイクプライミング後に観察され、モザイク－RBDナノ粒子の単回注射がワクチンにおいて十分であり得ることが示唆された。COVID－１９回復期プラズマはSARS－CoV－２以外のコロナウイルスRBDの認識をほとんどまたは全く示さなかったので、ヒトにおけるCOVD－１９誘導性免疫は別の緊急コロナウイルスに対して防御しない可能性がある。本明細書に記載のモザイクナノ粒子の実施形態は、新たに発見された人獣共通コロナウイルス由来のRBDを提示するために使用することができる。
実施例２
例示的な材料および方法
以下の例示的な材料および方法は、本明細書に開示される実施形態の調製および実施において使用される。
系統樹。コロナウイルスRBDドメインの配列アラインメントを、Clustal Omegaを用いて作製した。このアミノ酸アラインメントからPhyML ３．０を用いて系統樹を算出し、PRESTO(http://wwwatgc－montpellier．fr／PRESTO）を用いて本樹の図を作成した。
RBDおよびSタンパク質の発現。N端末装置ヒトIL－２またはMuホスファターゼシグナルペプチドを有するSARS－CoV－２(GenBank MN９８５３２５．１; Sタンパク質残基３１９～５３７；配列番号１）およびSARS-CoV S(GenBank AAP１３４４１．１；残基３１８～５１０；配列番号９）のRBDをコードする哺乳動物発現ベクターは、以前に記載された。発現ベクターは、以下のものからRBDについて同様に構築した。以下の他のサルベコウイルス株：RaTG１３-CoV(GenBank QH３３００；Sタンパク質残基３１９～５４１；配列番号２）、SHC０１４-CoV(GenBank KC８８１００５；残基３０７～５２４；配列番号３）、Rs４０８１-CoV(GenBank KY４１７１４３; Sタンパク質残基３１０～５１３；配列番号４）、パンゴリン１７-CoV(GenBank QIA４８６３２；残基３１７～５３９；配列番号５）、RmYN０２-CoV(GSAID EPI_ISL_４１２９７７；残基２９８～５０１；配列番号６）、Rf１-CoV(GenBank DQ４１２０４２；残基３１０～５１３；配列番号７）、WIV１-CoV(GenBank KF３６７４５７；残基３０７～５２８；配列番号Yun１１-CoV(GenBank JX９３９８８；残基３１０～５１３；配列番号１０）、BM－４８３１-CoV(GenBank NC０１４４７０；残基３１０～５２８；配列番号１１）、BtkY７２-CoV(GenBank KY３５２４０７；残基３０９ －５３０； 配列番号１２）。各RBD発現ベクターの２つのバージョンを作製した：C末端ヘキサヒスチジンタグ（G－HHHHHH、配列番号１３）およびSpyTag００３（RGVPHIVMVDAYKRYK、配列番号１４）を含むもの（SpyCatcher００３－mi３にカップリングするため）およびヘキサヒスチジンタグのみを含むもの（ELISAのため）。ビオチン化SARS－CoV－２およびRs４０８１ RBDを、Avi／Hisタグ付きRBD発現プラスミドを、ER指向性BirA酵素をコードする発現プラスミド(Michael Anaya、Caltechの種類の贈り物）と同時トランスフェクションすることによって作製した。RBDタンパク質を、ニッケル親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーによって、一過性にトランスフェクトされたi２９３F電池（Gibco）上清から精製した。RBDに対応するピークフラクションをSDS－PAGEによって同定し、次いでプールし、４℃で保存した。６P安定化突然変異を有する三量体SARS－CoV－２エクトドメインを、記載のように発現させ、精製した。水溶性SARS－CoV－２ S三量体の正確なフォールディングは、免疫化に使用される三量体調製物と複合体化された中和抗体の３．３Åのcryo－EM構造によって検証された。蛍光色素結合ストレプトアビジン四量体化RBDを調製するために、ビオチン化SARS－２およびRs４０８１RBDを、それぞれ、ストレプトアビジン-APC(eBioscience TM）およびストレプトアビジン-PE(ThermoFisher)と共に、４℃で、RBD対ストレプトアビジンサブユニットのモル比１：１で一晩インキュベートした。
ヒトプラズマIgGの調製。COVID－１９回復期および健康なドナーから採取されたプラズマ試料は、Robbiani et al、Nature ５８４、４３７－４４２ （２０２０）に記載されている。記載されるように、５mLのHiTrap MabSelect SuReカラム(GE Healthcare Life Sciences)を用いて、熱不活性プラズマ試料からヒトIgGを単離した。
RBD－mi３ナノ粒子の調製。SpyCatcher００３－mi３粒子はCohen AA et al、２０２１、PLoS ONE １６（３): e０２４７９６３に記載されているように、pET２８a SpyCatcher００３－mi３遺伝子（N端末装置６x－Hisタグを含む）で形質転換したBL２１（DE３)-RIPL E coli(Agilent)から精製することによって調製した。簡単に述べると、形質転換された細菌からの電池ペレットを、２．０mM PMSF(Sigma)の存在下で電池破壊剤で溶解した。溶解物を２１，０００xgで３０分間回転させ、０．２μmフィルターで濾過し、mi３粒子を、プレパックドHisTrapTMカラム（GEヘルスケア）を使用するNi－NTAクロマトグラフィによって単離した。溶出した粒子を、Amicon Ultra １５mL ３０K濃縮機（MilliporeSigma）を用いて濃縮し、２５mM Tris-HCl pH ８。０、１５０mM NaCl、０．０２% NaN3（TBS）で平衡化したHiLoad（登録商標）１６／６００ Superdex（登録商標）２００(GE Healthcare)カラムを。SpyCatcher－mi３粒子を４℃で保存し、０．２μmフィルターで濾過した後、または２１，０００xgで１０分間回転させた後、１ヶ月までコンジュゲーションに使用した。
精製SpyCatcher００３－mi３を、３倍モル過剰（RBDからmi３サブユニット）の精製SpyTagged RBD(相同型SARS－CoV－２ RBD粒子を作製するための単一のRBDまたはモザイク粒子を作製するための４つもしくは８つのRBDの等モル混合物のいずれか）と共に、TBS中、室温で一晩インキュベートした。共役mi３粒子を、PBS(２０mMリン酸ナトリウムpH ７．５、１５０mM NaCl)で平衡化したSuperose ６ １０／３００カラム(GE Healthcare)上のSECによって遊離RBDから分離した。共役mi３粒子に対応する画分を収集し、SDS－PAGEによって分析した。コンジュゲートmi３粒子の濃度を、Bio－Radタンパク質アッセイを用いて決定した。
予防接種。動物手順および実験は、IACUCによって承認されたプロトコールに従って行った。実験は４～６週齢の雌Balb／cマウス(Charles River Laboratories)を用いて行い、それぞれ５匹の動物を水溶性SARS－CoV－２ SまたはSpyCatcher００３－mi３で免疫したコホートについて、およびそれぞれ１０匹の動物を残りのコホートについて用いた（図３A）。免疫化は、５０% v/vのAddaVaxTM アジュバント（インビボジェン）１００μL中の、５μgの共役RBD（SpyCatcher００３－mi３への共役の１００％の効率を仮定して、RBDの質量として計算される）、５μgの水溶性SARS－CoV－２ S、または６μgの非共役SpyCatcher００３－mi３のいずれかの腹腔内（ip）注射を用いて行った。初回刺激の４週間後に、アジュバント中の同量の抗原で動物を追加免疫した。動物を尾静脈を介して２週間ごとに採血し、次いで、プライム（５６日目、５７日目）の８週間後に安楽死させ、心臓穿刺を通して採血した。MiniCollect（登録商標)Serum and Plasma Tubes(Greiner)中で、血試料を室温で凝固させ、血清を採取し、液体窒素中で保存し、使用するまで－８０℃で保存した。
ELISAの血清は、１４日目（プライム）および４２日目（昇圧）に採取した。中和アッセイの血清を、２８日目（プライム）および５６日目（昇圧）に収集した（図３A～図３F、図７A～図７F）。
ELISA：０。１M NaHCO3 pH ９。８中の精製RBD（SpyTaggedではない）１０μg／mlをNunc（登録商標）MaxiSorp（商標）３８４－ウェルプレート（Sigma）上にコーティングし、４o Cで一晩保存した。プレートを、室温で１時間、TBS－T中の３％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロッキングした後、０。１% Tween ２０（TBS－T）を含むトリス緩衝生理食塩水で洗浄した。マウス血清を１：１００に希釈し、次いでTBS－T／３% BSAで４倍に連続希釈し、室温で３時間板に添加した。１：５０，０００希釈の二次HRP結合ヤギ抗マウスIgG(Abcam)を、室温で１時間洗浄した後に添加した。プレートを、SuperSignal（商標)ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(ThermoFisher)を用いて開発し、４２５nmで読み取った。ヒル係数を有する１部位結合モデルを仮定して、グラフパッドプリズム８．３を用いて曲線下面積（AUC）を得るために、曲線をプロットし、積分した（図３A～図３F、図７A～図７F）。EC50および終点力価も計算し、これは、ELISA結合データーについて、平板制御（一次血清を添加しない）の平均＋２x標準偏差以下の希釈を用いて決定した（図７E～図７F）。最大結合における変化をより良好に捕捉するため、AUC計算を使用した。群間の力価差の統計的有意性は、Graphpad Prism ８．３を用いてTukeyの多重比較検定を用いて計算した。
中和アッセイ。HIVレンチウイルス粒子に基づくSARS－CoV－２、SARS、WIV１、およびSHC０１４偽ウイルスを、細胞質尾部にC末端残基を欠くSタンパク質配列をコードする遺伝子：SARS－CoV－２、WIV１、およびSHC０１４の２１アミノ酸削除、ならびにSARS－CoVの１９アミノ酸削除を用いて、記載のように調製した。この偽型中和試験法から得られたIC50は、真正SARS－CoV－２ウイルスを用いた中和試験の結果と定量的に相関することが示された。偽ウイルス中和アッセイのために、免疫したマウスからの４倍連続希釈血清を、偽型ウイルスと共に３７℃で１時間インキュベートした。２９３TACE2標的細胞と３７℃で４８時間インキュベートした後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で２回洗浄し、ルシフェラーゼ細胞培養溶解５x試薬（プロメガ）で溶解した。溶解物中のNanoLucルシフェラーゼ活性を、Nano－Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて測定した。相対発光単位（RLU）を、血清の非存在下で偽型ウイルスに感染した細胞に由来する値に正規化した。半最大阻害希釈（ID50）を、値ボディデータベースにおける４パラメータ非線形回帰を用いて決定した。群間の力価差の統計的有意性は、グラフパッドプリズム８．３を用いて対数10スケールに変換されたID50のツーキーの多重比較検定を用いて計算した。
統計解析。ELISAおよび中和アッセイについての群間の比較は、Prism ９．０（Graphpad）におけるTukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析（ANOVA）を用いて計算した。Prism ９．０（グラフパッド）を用いて、ELISAと中和力価との相関解析のために、有意性（p）、スピアマン係数（rs）、および線形プロットを計算した。p値が０．０５未満の場合、差は有意であるとみなした。正確なp値はそれぞれの対応する線付近の関連する図面にあり、有意水準を表すアスタリスク（＊は０．０１＜p＜０．０５を示し、＊＊は０．００１＜p＜０．０１を示し、＊＊＊は０．０００１＜p＜０．００１を示し、＊＊＊＊はp＜０．０００１を示す）を有する。
フローサイトメトリー。フローサイトメトリーを用いたB細胞分析を、記載のように行った。簡単に述べると、機械的解離を用いてマウス脾臓から単細胞懸濁液を調製し、ACK溶解緩衝液（Gibco）を用いて赤血球を除去した。マウス記憶部B細胞単離キット（Miltenyi）においてネガティブ選択プロトコルを使用して、白血球調製物をIgG+ B細胞について濃縮した。以下の市販の試薬を用いて濃縮脾細胞を染色した: CD４－APC－eFluor ７８０（クローン: RM４－５）、F４／８０－APC－eFluor ７８０（クローン: BM８）、CD８a－APC－eFluor ７８０（クローン： ５３－６．７）、Ly－６G－APC－eFluor ７８０（クローン: RB６－８C５）、IgMAPC－eFluor ７８０（クローン: II/４１)(Thermo Fisher Scientific)、CD１９-FITC(クローン： ６D５)(Biolegend)、IgG１ BV４２１（クローン: X４０）およびIgG２ BV４２１（クローン: R１９－１５)(BD Bioscience。抗原特異的B細胞を同定するために使用されるSARS－２ RBD－APCおよびRs４０８１ RBD－PE。細胞生存率を、Fixable Viability Stain ７００(BD Bioscience)で分析した。染色した細胞を、６つの蛍光色素を検出するように構成されたSY３２００ Cell Sorter(Sony)で分析した。試料当たり２，０００，０００の事象を収集し、FlowJoソフトウェア（TreeStar）を介して分析した。
用語
前述の実施形態の少なくともいくつかでは、実施形態で使用される１つまたは複数の要素がそのような置換が技術的に実現可能でない場合を除き、別の実施形態で互換的に使用され得る。特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、上記で説明された方法および構造に様々な他の省略、追加、および修正を行うことができることが、当業者によって理解されるのであろう。すべてのそのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される主題の範囲内に入ることが意図される。
本明細書における実質的に任意の複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は文脈および／または用途に適切であるように、複数から単数に、および／または単数から複数に翻訳することができる。各種単数／複数の置換は、明確にするために本明細書に明示的に記載され得る。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の参照を含む。本明細書における「または」へのいかなる言及も、特に明記しない限り、「および／または」を包含することを意図する。
一般に、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の体）では一般に、「開いた」用語として意図されることが当業者によって理解されるのであろう（例えば、「含む」という用語は「含むが限定されない」と解釈されるべきであり、「有する」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む」という用語は「含むが限定されない」と解釈されるべきであるなど）。導入された請求項の特定の数が意図される場合、そのような意図は請求項に明示的に列挙され、そのような列挙がない場合、そのような意図は存在しないことが、当業者によってさらに理解されるのであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲の記載を導入するための導入句「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」の使用を含むことができる。しかしながら、そのような語句の使用は不定冠詞「a」または「an」による請求項の引用の導入が同じ請求項が導入語句「１つ以上」または「少なくとも１つ」および「a」または「an」などの不定冠詞（例えば、「a」および／または「an」は「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）を含む場合であっても、そのような引用を含むいずれかの特定の請求項がそのような引用を１つのみ含む実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきではなく、同じことが、請求項の引用を導入するために使用される確定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、導入されたクレームの具体的な数が明示的に列挙されたとしても、当業者はそのような列挙が少なくとも列挙された数を意味すると解釈されるべきであることを認識するのであろう（例えば、他の修飾語、手段少なくとも２つの列挙、または２つ以上の列挙を伴わない、「２つの列挙」の裸の列挙）。さらに、「A、B、およびCなどのうちの少なくとも１つ」に類似する慣例が使用される場合、一般に、そのような構成は当業者には理解されるのであろう（たとえば、「A、B、およびCのうちの少なくとも１つを有するシステム」はAのみ、Bのみ、Cのみ、AおよびBとともに、AおよびCとともに、BおよびCとともに、ならびに／またはA、B、およびCとともになどを有するシステムを含むが、これらに限定されない）。「A、B、またはCなどのうちの少なくとも１つ」に類似する慣例が使用される場合、一般に、そのような構成は当業者には理解されるのであろう（例えば、「A、B、またはCのうちの少なくとも１つを有するシステム」はAのみ、Bのみ、Cのみ、AおよびBとともに、AおよびCとともに、BおよびCとともに、ならびに／またはA、B、およびCとともになどを有するシステムを含むが、これらに限定されない）。説明、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の選言語および／または語句が、用語のうちの１つ、用語のうちのいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者によってさらに理解されるのであろう。
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群の部材の任意の個々の部材またはサブグループに関しても記載されることを認識するのであろう。
当業者によって理解されるように、書面による説明を提供するなどの任意のおよびすべての目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲は、任意のおよびすべての可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、等に分解されることを十分に説明し、可能にするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられる各温度範囲は、下側の第３、中側の第３、および上側の第３などに容易に分解することができる。また、当業者によって理解されるように、「～まで」、「少なくとも」、「～より大きい」、「～未満」などのすべての言語は列挙された数を含み、上で論じられたように、その後に部分範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、各個々の部材を含む。したがって、例えば、１～３個の物品を有する基は、１、２、または３個の物品を有する基を指す。同様に、１～５個の物品を有する群は、１、２、３、４、または５個の物品を有する群などを指す。
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されてきたが、他の態様および実施形態が当業者には明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様および実施形態は説明を目的とするものであり、限定することを意図するものではなく、真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。
関連出願の相互参照
本出願は、2020年11月11日付け出願の米国仮出願第63/112,495号に対する優先権を主張する。この関連出願の内容は、その全体が参照によってここに明示的に組み込まれる。
（連邦政府支援のR＆Dに関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所から授与された認可番号AI138938の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明について一定の権利を有する。
（シークエンスリスティングへの言及）
本出願は、電子形式においてシークエンスリスティングとともに提出する。シークエンスリスティングは、2021年10月25日に作成されたSequence_Listing_30KJ-302430-WOと題するファイルとして提供され、そのサイズは、47キロバイトである。シークエンスリスティングの電子形式における情報は、その全体が参照によってここに組み込まれる。
本開示は、概して、免疫医学の分野に、特に、ウイルス障害に対するワクチンに関する。
重症急性呼吸器症候群（SARS）は、発熱、頭痛および、咳、呼吸困難および肺炎を含む重症呼吸器症状によって特徴付けられる致死率の高いコロナウイルス感染による重症新興ウイルス性疾患である。二つの人獣共通感染症ベータコロナウイルス、SARS-CoVおよびMERS-CoVが、過去20年内にアウトブレイクをもたらした。新たに現れたベータコロナウイルス、SARS-CoV-2は、2020年に世界的な大流行となり、数百万人が感染し、および呼吸器疾患COVID-19の原因となった。SARS-CoV-2およびSARS関連の緊急人獣共通コロナウイルスに対する保護は、差し迫って必要とされている。
ここに提供するものには、多価担体および関連するワクチン組成物、多価担体およびワクチン組成物を使用するための方法、ならびにコロナウイルス感染に対して対象を保護するためのキットが含まれる。
ここで開示するものには、ワクチン組成物が含まれる。ワクチン組成物は、例えば、複数のコロナウイルス抗原と関係する多価担体を含むことができ、そこで複数のコロナウイルス抗原には、第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原および第一のコロナウイルスとは異なる第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原が含まれる。複数のコロナウイルス抗原は、多価担体の表面に表示されるか、または多価担体に部分的に（例は、実質的に）埋めることができる。複数のコロナウイルス抗原は、コロナウイルスのスパイクタンパク質（Sタンパク質）またはその一部分、コロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（Nタンパク質）またはその一部分、コロナウイルスのヘマグルチニン-エステラーゼタンパク質（HEタンパク質）またはその一部分、コロナウイルスのパパイン様プロテアーゼまたはその一部分、コロナウイルス3CLプロテアーゼまたはその一部分、コロナウイルス膜タンパク質（Mタンパク質）またはその一部分、あるいはそれらの組合せを含むことができる。
複数のコロナウイルス抗原は、同じタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含むことができる。いくらかの実施態様において、複数のコロナウイルス抗原は、異なるタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含む。複数のコロナウイルス抗原は、例えば、コロナウイルスSタンパク質またはその一部分を含むことができる。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原はコロナウイルスSタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）またはその一部分を含む。いくらかの実施態様では、第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルス抗原、または双方は、コロナウイルスSタンパク質またはその一部分を含む。いくらかの実施態様では、第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルス抗原、または双方は、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分を含む。複数のコロナウイルス抗原の一またはそれよりも多く、または各々の複数のコロナウイルス抗原は互いに次の、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の配列同一性を有することができる。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原はそれぞれ、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分を含み、コロナウイルスSタンパク質RBDsまたはその一部分は互いにおよそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の配列同一性を有する。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原の一またはそれよりも多く、または各々の複数のコロナウイルス抗原は、（1）配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（2）配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列を含む。例えば、第一のコロナウイルス抗原は、（1）配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（2）配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列を含むことができる。第二のコロナウイルス抗原は、例えば、（1）配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（2）配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列を含むことができる。第一のコロナウイルス抗原分子の数および第二のコロナウイルス抗原分子の数は、例えば、1：100から100：1までの比率にあることができる。
いくらかの実施態様において、複数のコロナウイルス抗原は、の三、四、五、サイズ七（size seven）、または八のコロナウイルス抗原を含み、各々のコロナウイルスは互いに異なる（each of a coronavirus different from one another）。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原および第四のコロナウイルスの第四のコロナウイルス抗原をさらに含み、およびそこで第一、第二、第三および第四のコロナウイルスは互いに異なる。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原は、第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原、第四のコロナウイルスの第四の抗原コロナウイルス（fourth antigen coronavirus）、第五のコロナウイルスの第五のコロナウイルス抗原、第六のコロナウイルスの第六のコロナウイルス抗原、第七のコロナウイルスの第七のコロナウイルス抗原、および第八のコロナウイルスの第八のコロナウイルス抗原の一またはそれよりも多くをさらに含み、およびそこで第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八のコロナウイルスは互いに異なる。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物には、三、四、五、六、七、または八のコロナウイルスSタンパク質RBDsが含まれ、およびそこで各々の複数のコロナウイルスSタンパク質RBDsは互いに異なる。
複数のコロナウイルス抗原の一またはそれよりも多くは、アルファコロナウイルス（Alpha-coronavirus）および／またはベータコロナウイルス（Beta-coronavirus）の属におけるコロナウイルスに属することができる。いくらかの実施態様では、各々の複数のコロナウイルス抗原はベータコロナウイルスの属におけるコロナウイルスに属する。いくらかの実施態様において、複数のコロナウイルス抗原はサルベコウイルス（Sarbecovirus）の亜属におけるコロナウイルスに属する。いくらかの実施態様において、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスはベータコロナウイルスの属に、随意に、サルベコウイルスの亜属にある。複数のコロナウイルス抗原は次の：SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ばれるコロナウイルスに属することができる。例えば、第一のコロナウイルス、第二のコロナウイルス、または双方は次の：SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ぶことができる。
複数のコロナウイルス抗原は、多価担体に共有結合的に付着することができ、および随意に、複数のコロナウイルス抗原は多価担体にコンジュゲーションされる。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原はクリックケミストリーを通して多価担体に付着される。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原は多価担体に非共有結合的に付着される。多価担体の非制限的な例には、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノワイヤ、デンドリマー、リポソーム、エソソームおよびアクアソーム、ポリマーソームおよびニオソーム、フォーム、ヒドロゲル、キュボソーム、量子ドット、エクソソーム、マクロファージ、およびそれらの組合せが含まれる。いくらかの実施態様では、多価担体には、次の：脂質ベースのナノ粒子、重合体ナノ粒子、無機ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルション、ナノワイヤ、シリカナノ粒子、ウイルス様粒子、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子、脂質ポリマー粒子、ナノリポタンパク質粒子、およびそれらの組合せから選ばれるナノ粒子が含まれる。多価担体には、例えば、ウイルス様粒子（VLP）が含まれることができ、例えば、ウイルス様粒子はAp205 VLPであることができる。いくらかの実施態様では、多価担体には、自己集合性ナノ粒子が含まれる。自己集合性ナノ粒子は、例えば、i301ナノ粒子もしくはその多様体、またはa mi3ナノ粒子もしくはその多様体であることができる。
いくらかの実施態様において、ワクチン組成物は、複数の粒子形成性タンパク質を含む。複数の粒子形成性タンパク質の一またはそれよりも多くは、例えば、2-デヒドロ-3-デオキシ-ホスホグルコナート（KDPG）アルドラーゼまたはその多様体を含むことができる。いくらかの実施態様において、複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原は複数の粒子形成性タンパク質の粒子形成性タンパク質に付着している。例えば、複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原は、スパイ・タグ/スパイキャッチャー結合対を通して複数の粒子形成性タンパク質の粒子形成性タンパク質に付着されることができる。
いくらかの実施態様において、複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原には、コロナウイルス抗原のC末端にてスパイ・タグが含まれ、および複数の粒子形成性タンパク質の粒子形成性タンパク質には、粒子形成性タンパク質のN末端にてスパイキャッチャーが含まれる。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原には、コロナウイルスSタンパク質RBDが含まれ、およびコロナウイルスSタンパク質RBDには、コロナウイルスSタンパク質RBDのC末端にてスパイ・タグが含まれ、および複数の粒子形成性タンパク質の粒子形成性タンパク質には、粒子形成性タンパク質のN末端にてスパイキャッチャーが含まれる。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントをさらに含むことができる。アジュバントの非制限的な例には、次の：水酸化アルミニウム、アルヒドロゲル、AddaVax、MF59、AS03、フロイントアジュバント、モンタニド（Montanide）ISA51、CpG、ポリI:C、グルコピラノシル脂質A、フラジェリン、レシキモド、およびそれらの組合せが含まれる。
ここに開示するものには、必要がある対象において免疫応答を刺激する方法が含まれる。本方法は、例えば、ここに開示されるいずれか一つのワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することを含み、それによって対象において免疫応答が刺激される。ここに開示するものには、必要がある対象においてコロナウイルス感染を処理または防止するための方法が含まれる。本方法は、例えば、次の：ここに開示されるいずれか一つのワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することを含むことができ、それによって対象においてコロナウイルス感染が処理または防止される。また、ここに開示するものには、必要がある対象においてコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を処理または防止するための方法が含まれる。本方法は、例えば、次の：ここに開示されるいずれか一つのワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することを含むことができ、それによって対象のコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害が処理され、または防止される。ワクチン組成物は、例えば、二週間、四週間、一か月、二か月、三か月、四か月、またはそれらよりも長い期間内に一回、二回、三回、四回、またはそれらよりも多くの回数、対象に投与することができる。ワクチン組成物は、例えば、少なくとも二週間、四週間、一か月、二か月、三か月、六か月、一年、二年、三年、またはそれらよりも長い間隔で一回、二回、三回、四回、またはそれらよりも多くの回数、対象に投与することができる。
いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が属しているコロナウイルス（the coronaviruses the plurality of coronavirus antigens are of）とは異なる追加のコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が属しているコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。
いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる感染を処理することまたは防止することをもたらす。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が属しているコロナウイルスとは異なる追加のコロナウイルスによって引き起こされる感染を処理することまたは防止することをもたらす。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が属しているコロナウイルスによって引き起こされる感染を処理することまたは防止することをもたらす。
いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を処理することまたは防止することをもたらす。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が属しているコロナウイルスとは異なる追加のコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を処理することまたは防止することをもたらす。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原が属しているコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を処理することまたは防止することをもたらす。
ワクチン組成物を投与することには、例えば、第一のワクチン組成物を対象に投与すること、および第二のワクチン組成物を対象に投与することを含むことができる。いくらかの実施態様では、第二のワクチン組成物を対象に投与することは、第一のワクチン組成物を対象に投与することの後約二、三、四週間、またはそれらよりも長くに行われる。
また、ここに開示するものには、ここに開示されるいずれかのワクチン組成物を含むキットが含まれる。いくらかの実施態様において、キットには、一またはそれよりも多くの（1）必要がある対象において免疫応答を刺激すること、（2）必要がある対象においてコロナウイルス感染を処理することまたは防止すること、および（3）必要がある対象においてコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を処理することまたは防止ことについての指示を提供するマニュアルが含まれる。
図１Ａ－図１Ｄは、この研究のために選定されたRBDsの非制限的な模範的実施態様を描く。図１Ａ左側は、一つのRBD（破線の円）が「上」の位置にあるSARS-CoV-2 S三量体（PDB 6VXX）の模範的な構造を示す。図１Ａ中間および右側は、RBD構造（PDB 7BZ5）の表面表現にプロットされたConSurf（コンサーフ）データベースによって計算された12のRBDsの配列保存に関連する非制限的な模範的データを示す。破線によって指し示されたRBD結合抗体の規定されたクラス（クラス1-クラス4）からの代表物についてのエピトープである。図１Ｂは、12のサルベコウイルスRBDsが導き出されるウイルス株の非制限的な模範的実施態様を描く。図１Ｃは、RBDタンパク質配列に基づく、ヒトおよび選定された他のコロナウイルスの非制限的な模範的系統樹を示す。赤色の網掛けは、ACE2を受容体として使用することが知られる株を指し示す。図１Ｄは、12のサルベコウイルスRBDs間のパーセントアミノ酸配列同一性を示す非制限的な模範的ヒートマップを描く。 図２Ａ－図２Ｃは、RBDナノ粒子の構築の非制限的な模範的実施態様を描く。図２Ａは、同型粒子および三つのモザイク粒子を作成するためにスパイキャッチャー003-mi3に付着されたスパイタグドRBDs（SpyTagged RBDs）の非制限的な模範的な実施態様を描く。明確にするためにmi3上の60個の潜在的カップリング部位のうち10個を示す。図２Ｂは、SECプロファイルの非制限的な模範的データを示し、RBDナノ粒子および遊離RBDタンパク質の分離が示される。図２Ｃは、RBD接合ナノ粒子、遊離RBDタンパク質、および非接合（uncoupled）スパイキャッチャー003-mi3粒子（SC3-mi3）のクーマシー染色SDS-PAGEの非制限的な模範的データを示す。 図３Ａ－図３Ｆは、RBDナノ粒子が免疫化マウスにおいて交差反応性IgG応答を誘導することを示す非制限的な模範的データを描く。ELISAおよび中和データの下の赤色および灰色の矩形は、不一致株（赤；その株からのRBDは免疫化粒子上に存在しなかった）または一致株（灰；RBDは免疫化粒子上に存在した）を表す。図３Ａは、免疫化スケジュールの非制限的な模範的実施態様を描く。アジュバント=AddaVax（アダヴァックス）（Invivogen（インビボゲン））．図３Ｂ－図３Ｆは、可溶性SARS-CoV-2 S三量体（SARS-2 S；茶色バー）、または以下のナノ粒子：同型SARS-2（赤）、モザイク-4a（緑）、モザイク-4b（黄）、モザイク-8（青）、または非共役スパイキャッチャー003-mi3（mi3；黒）により免疫化したマウスを示す非制限的な模範的データを描く。血清IgGからのELISAデータは、曲線下面積（AUC）として示す、SARS-2スパイク三量体（図３Ｂ）またはRBDs（図３Ｃ－図３Ｆ）に応答する。図３Ｃ－図３Ｅについて、中和効力は、指し示されたコロナウイルス株からの偽ウイルスに対する血清の最大半量の抑制希釈値（ID50値）として提示される。破線の横線は検出限界を表す最低希釈値に対応する。各ドットは一匹の動物からの血清を表し、ワクチン接種を受けたコホートについての平均および標準偏差を矩形（平均）および横線（SD）で表す。横線によって連結されたグループ間の有意差は、アスタリスクおよびp値によって指し示される。NS=有意ではない。（図３Ｂ）SARS-2スパイク3量体、（図３Ｃ）SARS-2 RBDおよびSARS-2偽ウイルス、（図３Ｄ）SHC014およびWIV1 RBDsならびに対応する偽ウイルス、（図３Ｅ）SARS RBDおよびSARS偽ウイルス、（図３Ｆ）Yun11、BM-4831、およびBtKY72 RBDsの認識のための血清IgGsについての（図３Ｂ－図３Ｆ）中和および／または結合データである。 図４Ａ－図４Ｈは、回復期のCOVID-19血しょうからのIgGsが、ほとんどよりまったくまで交差反応性応答を見せないことを示す非制限的な模範的データを描く。図４Ａ－図４Ｆは、（図４Ａ）SARS-2、（図４Ｂ）RaTG13、（図４Ｃ）SHC014、（図４Ｄ）WIV1、（図４Ｅ）Rs4081、および（図４Ｆ）BM-4831からのRBDsに対してELISAによって評価される血しょうIgG応答（リストされた血しょう名を有する結合曲線として示されるデータ）に関連する非制限的な模範的データを示す。データポイントは重複測定（duplicate measurements）の平均および標準偏差としてプロットされる。IOMA、抗HIV-1 Igをコントロールとして使用した。図４Ｇは、曲線下面積（AUC）として表す図４Ａ－図４ＦからのELISA結果に関連する非制限的な模範的データを示し、そこで各ドットは一つの血しょうサンプルを表し、矩形（平均）および横線（SD）によって表される平均および標準偏差を有する。横線によって連結されたグループ間の有意差は、アスタリスクおよびp値によって指し示される。図４Ｈは、示された株に対するCOV7、COV21、およびCOV72血しょうからのIgGs（1500μg/mLの最高濃度にて評価）を使用する偽型中和アッセイについてのIC50値に関する非制限的な模範的データを示す。平均＝算術平均IC50；SD＝標準偏差． モザイク粒子を作成するために使用されるRBD配列のアライメントに関連する非制限的な模範的データを示す。示された配列は、SARS-CoV-2のRBDs（SARS-2、GenBank（ジェンバンク）：MN985325.1、配列番号15）、RaTG13（QHR63300、配列番号16）、SHC014（RsSHC014、KC881005、配列番号17）、Rs4081（KY417143、配列番号18）、PCoV_GX-P5L（pang17）（QIA48632、配列番号19）、RmYN02（GSAID EPI_ISL_412977、配列番号20）、Rf1（DQ412042、配列番号21）、WIV1（KF367457、配列番号22）、SARS-CoV（AAP13441.1、配列番号23）、Yun11（Cp/Yunnan（雲南）2011、JX993988、配列番号24）、BM-4831（BM48-31/BGR/2008、NC014470、配列番号25）、およびBtKY72（KY352407、配列番号26）を支持する（are for）。ACE2と直接相互作用するSARS-2 RBD残基はアスタリスクによって指し示される。ACE2結合残基の直接結合によっての抗体の中和は、ACE2-向性ウイルスのための中和の唯一の機構を表さないことに注目される。これは、COVID-19ペイシェント（人間で言う患者）から導き出されるモノクローナルヒト抗体について示され：いくらかの実施態様では、中和抗体はRBD上のACE2結合部位と直接相互作用しない（例えば、クラス3抗SARS-CoV-2中和抗体）。赤色の網掛けは、ACE2を受容体として使用することが知られる株を指し示す。 図６Ａ－図６Ｂは、八つのサルベコウイルスSタンパク質からのRBDsがスパイキャッチャー003-mi3に等価にコンジュゲーションすることを示す非制限的な模範的データを描き、モザイク粒子上のRBDsの統計的混合が示唆される。図６Ａは、RBDナノ粒子および遊離RBDタンパク質の分離を示すSECプロファイルの非制限的な模範的データを描く。図６Ｂは、RBD接合ナノ粒子、遊離RBDタンパク質、および非接合スパイキャッチャー003-mi3粒子（SC3-mi3）のクーマシー染色SDS-PAGEを示す非制限的な模範的データを描く。 図７Ａ－図７Ｆは、可溶性SARS-CoV-2 S三量体（SARS-2 S）またはナノ粒子上のRBDs（同型SARS-2、モザイク-4a、モザイク-4b、モザイク-8、または非共役スパイキャッチャー003-mi3（mi3））により免疫したマウスからの曲線下面積（AUC）として示したELISAによって評価したRBDsへの14日目の血清IgG応答に関する非制限的なの模範的データを示す。各ドットは一匹の動物からの血清を表し、矩形（平均）および横線（SD）によって表される平均および標準偏差を有する。免疫粒子上に存在しなかったか、または免疫粒子上に存在した株からのRBDsは、ELISAデータの下方にそれぞれ赤および灰色の矩形によって指し示される。横線で連結されたグループ間の有意差は、アスタリスクおよびp値によって指し示される。NS=有意ではない。図７Ａ－図７Ｂは、（図７Ａ）Rs4081および（図７Ｂ）RaTG13 RBDsへの血清IgGの結合に関連する非制限的な模範的データを描く。図７Ｃは、SARS-2 RBD（左上）、緊急（emergent）UK SARS-CoV-2系列（https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutations/563）におけるN501Y RBD変異に隣接する置換を含むマウス適応SARS-CoV-2における三重RBD変種（mutant）（右上）、およびY453F、「デンマークミンク多様体（Danish mink variant）」（左下）への血清IgGsの結合に関連する非制限的な模範的データを示す。図７Ｄは、MERS-CoV（サルベコウイルス（sarbecoviruses）とは異なる亜属を代表する、非ACE2結合性メルベコウイルス（merbecovirus））からのRBDへの血清IgGsの結合に関連する非制限的な模範的データを描く。図７Ｅ－図７Ｆは、AUC、終点力価、中間点力価、または結合曲線として示される選定されたRBDsへの血清結合についてのELISAデータの比較に関連する非制限的な模範的データを示す。14日目血清IgGは、AUC（左上）、終点力価（中央上）、中間点（EC50）力価（右上）、または結合曲線（左下）として示したELISAによって評価した（図７Ｅ）SARS-2または（図７Ｆ）SARS RBDに応答する。AUCについて、各ドットは一匹の動物からの血清を表し、矩形（平均）および横線（SD）で表される平均および標準偏差を有する。終点および中間点力価について、各ドットは一匹の動物からの血清を表し、矩形（平均）および横線（SD）によって表される幾何平均および幾何標準偏差を有する。結合曲線は、モザイク-8および同型SARS-2により免疫化した動物について、結合モデル（以下の例1の材料および方法を参照）に適合した重複測定の平均およびSDを表すデータ点と共に示す。 図８Ａ－図８Ｄは、ELISAおよび中和力価の相関に関連する非制限的な模範的データを描く。抗RBD ELISA力価（AUC）対偽ウイルス中和ID50値のグラフについて示されるスピアマン相関係数（rS）およびp値；アスタリスクとして指し示される有意性である。（図８Ａ）SARS-2．（図８Ｂ）SARS．（図８Ｃ）SHC014．（図８Ｄ）WIV1． 図９Ａ－図９Ｅは、モザイクRBDナノ粒子により免疫した動物から分離した脾細胞の抗原特異的IgG+B細胞分析に関連する非制限的な模範的データを描く。図９Ａは、脾細胞から分離したRBD特異的IgG+B細胞を特徴付けるためのフローサイトメトリーゲーティング戦略の非制限的な模範的実施態様を描く。抗CD4、抗CD8、抗F4/80、抗Ly6G、および抗IgMは、T細胞、マクロファージ、およびIgM+B細胞を除去するためにダンプ（dump）において使用した。抗原特異的IgG+B細胞を、標識した抗CD19および抗IgG抗体を用いて分離し、および一対のフルオロフォアコンジュゲーションしたRBD四量体（SARS-2 RBDおよびRs4081 RBD）によるRBDとの結合について探索した（probed）。図９Ｂは、モザイクRBD粒子で免疫化した動物から分離した抗原特異的IgG+脾細胞についてのフローサイトメトリー分析に関連する非制限的な模範的データを描く。各動物について示された4ウェイゲートは、RBDシングルポジティブおよびダブルポジティブ細胞の各集団を分離し、および図９Ｃ－図９Ｅにおいて示された％抗原特異的集団のために使用した。Q1はRs4081 RBD+集団を表し、Q2はRs4081 RBD+/SARS-2 RBD+集団を表し、Q3はSARS-2 RBD+集団を表し、およびQ4はRBD-集団を表す。図９Ｃ－図９Ｅは、指し示されたグループについてのパーセントのシングルポジティブ（SP）およびダブルポジティブ（DP）細胞に関連する非制限的な模範的データを示す。横線によって連結されたグループ間の有意差はアスタリスクおよびp値によって示される。NS＝有意でない。（図９Ｃ）IgG+B細胞集団内のSARS-2 RBD+B細胞のパーセントである。（図９Ｄ）IgG+B細胞集団内のRs4081 RBD+B細胞のパーセントである。（図９Ｅ）IgG+B細胞集団内のSARS-2 RBD+/Rs4081 RBD+B細胞のパーセントである。
（詳細説明）
以下の詳細な説明において、添付の図面を参照し、それは本書の一部を構成する。図面において、同様の符号は、文脈が別なふうに指示しない限り、典型的には同様の構成要素を識別する。詳細な説明、図面、および請求の範囲に記載された模範的な実施態様は、制限することを意図していない。ここに提示された主題の精神または範囲から離れることなく、他の実施態様が利用され得、および他の変化がなされ得る。ここで一般的に説明され、および図において例示されるように、本開示の態様が多種多様な（wide variety of）異なる構成において配置、置換、組み合わせ、分離、および設計されることができ、それらのすべてがここで明示的に企図され、および本開示の一部となることは容易に理解されるであろう。
ここで言及されるすべての特許、公開特許出願、他の刊行物、およびGenBank、および他のデータベースからの配列は、関連技術に関してそれらの全体が参照によって組み込まれる。
SARS-CoV-2、新たに発生した（newly-emergent）ベータコロナウイルスは、2020年に世界的な大流行をもたらし、数百万人が感染し、および呼吸器疾患COVID-19が引き起こされた。他の二つの人獣共通感染症のベータコロナウイルス、SARS-CoVおよびMERS-CoVも過去20年間内にアウトブレイクをもたらした。すべての三種のウイルスは、おそらくコウモリに始まり、SARS-CoVおよびMERS-CoVはヒトに飛び移る前に中間的な動物宿主に適応した。SARS様ウイルスはコウモリにおいて循環しており、および洞窟で、コウモリが多種の（diverse）コロナウイルスを保有するところの近くに住む人々の血清学的調査は、パンデミックの可能性を持つSARS様ウイルスの直接感染を論証し、将来のアウトブレイクおよびパンデミックに対して保護するために汎コロナウイルスワクチンが必要であることが示唆される。特に、コウモリのWIV1およびSHC014株は、ヒトに対する継続的な脅威を示すと考えられている。
既存のワクチンは、ある種類のコロナウイルス、例えば、SARS-CoV-2などのようなものに対する保護を提供し得るが、コウモリにおけるコロナウイルス保有宿主（coronavirus reservoir）は、将来の種を超えた伝搬（cross-species transmission）を示唆し、SARS-CoV-2と同様に新興コロナウイルス（emerging coronaviruses）に対して保護するワクチンが必要とされる。より一層高い段（higher tiers）の中和抗体を誘発し、および広域スペクトルのコロナウイルスに対して異種結合および中和反応を誘導することができる、効果的で長持ちするワクチンが強く、および緊急な必要性がある。SARS-CoV-2に対するワクチンの必要性に加えて、将来のパンデミックを生じさせるようにヒトに波及し得る関連人獣共通コロナウイルスに対して保護することも緊急の必要性がある。ここで開示するものには、潜在的に新興の動物コロナウイルスからの感染に対して、ならびにSARS-CoV-2に対して保護するための免疫化組成物および方法が含まれる。
ここに記載するように、例えば「プラグ・アンド・ディスプレイ」アプローチを使用して、一連のナノ粒子を作成し、いずれかのSARS-CoV-2単独（同型ナノ粒子）の受容体結合ドメイン（RBD）が表示されるか、またはヒトへの脅威を表すコウモリおよび鱗甲類（pangolin）のベータコロナウイルスからのRBDsの多種のセット（diverse set）と共にSARS-CoV-2のRBD（モザイクナノ粒子）が共表示された。SARS-CoV-2同型ナノ粒子に対する自己応答（例は、SARS-CoV-2ナノ粒子の注射後のSARS-CoV-2ウイルスに対する応答）を説明する最近の報告を超えて、同型ナノ粒子免疫化はブースティング後に異種コロナウイルスの結合および中和の双方をもたらす応答を生じさせる。SARS-CoV-2のRBDに加えて他のRBDsの共表示（Co-display）は、同型ナノ粒子に対する反応と比較して反応性を低下させず、それによって、SARS-CoV-2から保護するためにモザイクナノ粒子を使用することに不利益はないだろうということが示される。同型SARS-CoV-2ナノ粒子を超えるモザイクRBDの利益は、同型SARS-CoV-2-RBD-ナノ粒子による免疫と比較して、異種RBDsの優れた交差反応認識を有する抗体を誘発したモザイクナノ粒子であり；特に、交差反応応答はモザイクナノ粒子によるプライムだけの後に観察されたが、同型粒子に対する交差反応応答はプライムおよびブーストの双方の注射を必要としたからである。単一の注射だけの後、中和反応が誘導されることは、数百万人／数十億の人々にデリバリーする必要があるワクチンにとって大きな利益であろう。いくらかの実施態様では、ここに記載されるタイプのモザイクナノ粒子は、新しい人獣共通感染症コロナウイルスが発見されたときに、それらからのRBDsを提示するように適合させることができ、人獣共通感染症サルベコウイルスのワクチン誘導性認識が将来のコロナウイルス関連パンデミック（複数形）からの保護を提供する一方、またSARS-CoV-2に対する保護のために使用されるようにもなる。
ここに記載したように、COVID-19回復期ヒト血しょうからのIgGsが評価され、それらがSARS-CoV-2以外のコロナウイルスの認識をほとんどないしまったく見せないことが示された。このように、ヒトにおける感染誘導免疫は、新しい人獣共通感染症コロナウイルスのアウトブレイクに対して保護する見込みは低く、新興のサルベコウイルスから保護するためのワクチンを開発する必要性の別の徴候となるであろう。
ここで開示するものには、多価担体（multivalent carrier、多価キャリアとも言う）および関連するワクチン組成物、方法およびキットが含まれる。多価担体およびそのワクチン組成物は、異なる分類群のヒトおよび動物のコロナウイルスからのコロナウイルス抗原を同時に提示し、および交差反応性抗体応答を誘発することができる。多価担体およびそのワクチン組成物は、例えば、SARS-CoV-2感染によってヒトにおいて誘発されるプラズマ抗体とは対照的に、実質増強され、および広範な結合および中和応答を誘発することができる。多価担体およびそのワクチン組成物はまた、同型ナノ粒子（例は、同型SARS-CoV-2ナノ粒子）と比較して、ヒトおよびコウモリのBeta-coronaviruses（例は、Sarbecoviruses（サルベコウイルス））に対する増強された異種結合および中和特性をも論証する。
ここで開示するものには、多価担体が含まれる。多価担体には、複数のコロナウイルス抗原が含まれ、複数のコロナウイルス抗原には、第一のコロナウイルスの少なくとも第一のコロナウイルス抗原、および第一のコロナウイルスとは異なる第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原が含まれる。ここで開示するものにはまた、ここに記載される多価担体を含むワクチン組成物も含まれる。
ここに開示するものには、必要がある対象において免疫応答を刺激する方法が含まれる。いくらかの実施態様において、本方法には、ここに記載のワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することが含まれ、それによって対象において免疫応答が刺激される。ここに開示するものにはまた、必要がある対象においてコロナウイルス感染を処理または防止する方法も含まれる。いくらかの実施態様において、本方法には、ここに記載のワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することが含まれ、それによって対象においてコロナウイルス感染が処理され、または防止される。加えて、必要がある対象においてコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を処理または防止する方法はここに開示される。いくらかの実施態様において、本方法には、ここに記載のワクチン組成物の薬学的有効量を対象に投与することが含まれ、それによって対象においてコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害が処理され、または防止される。
＜定義＞
別なふうに規定されない限り、ここで使用される技術および科学用語は、本開示が属する技術における通常の熟練の者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。例は、Singleton（シングルトン）ら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.（微生物学おおび分子生物学の辞典第2版）、J. Wiley & Sons（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）(New York（ニューヨーク）、NY（ニューヨーク州）1994)；Sambrook（サムブルック）ら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press（モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス）(Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照。本開示の目的のために、以下の用語は以下に規定される。
ここで使用する場合、「抗原」または「免疫原」という用語は、対象（例は、哺乳動物、例えば、ヒトなどのようなもの）において免疫応答を誘導することができる物質、典型的には、タンパク質に言及するために交換可能に使用される。本用語はまた、一旦対象に投与されると、直接またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはベクターの形態のいずれかでも、そのタンパク質またはその多様体（variant）に対して向けられる体液性および/または細胞型の免疫応答を呼び起こすことが可能であるという意味で、免疫学的に活性であるタンパク質に言及する。
ここで使用するように、二つの核酸またはポリペプチド配列の関係における「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大対応するようにアライメントしたときに同じである二つの配列のヌクレオチド塩基または残基を参照する。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術においてよく知られる。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、以下に記載される：Smith & Waterman（スミス・アンド・ウォーターマン）、Adv. Appl. Math.（アドバンシーズ・イン・アプライド・マセマティクス）2:482, 1981；Needleman（ニードルマン）& Wunsch（ブンシュ）、J. Mol. Biol.（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー）48:443, 1970；Pearson（ピアソン）& Lipman（リップマン）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ）85:2444, 1988；Higgins（ヒギンス）& Sharp（シャープ）、Gene（ジーン）, 73:237-44, 1988；Higgins & Sharp, CABIOS（コンピューター・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシーズ）5:151-3, 1989；Corpet（コルペ）ら、Nuc. Acids Res.（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）16:10881-90、1988；Huang（ヒュアン）ら、Computer Appls. in the Biosciences（コンピューター・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシーズ）8、155-65、1992；Pearsonら、Meth. Mol. Bio.（メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー）24:307-31, 1994；およびAltschul（アルトシュル）ら、J. Mol. Biol.215:403-10, 1990（これらの文献の各内容は、その全体がここに組み込まれる）。
配列同一性または類似性のパーセンテージがタンパク質に関して使用されるとき、同一ではない残基位置が保存的アミノ酸置換によって異なることが多く、そこでアミノ酸残基は、同様の物理化学的特性を有するアミノ酸残基の機能的に等価な残基により置換され、および従って分子の機能特性を変えないことが認識される。ここで使用されるアミノ酸の機能的に等価な残基は典型的には、元のアミノ酸と実質類似の物理化学的および立体化学的特性を有する他のアミノ酸残基に言及することができる。物理化学的特性には、水溶性（疎水性または親水性）、誘電性および電気化学的特性、生理的pH、側鎖の部分電荷（正、負または中性）および当技術において熟練の者に識別可能な他の特性が含まれる。立体化学的特性には、アミノ酸の空間的およびコンフォメーション的配置、ならびにそれらのキラリティが含まれる。例えば、グルタミン酸は目下の開示の意味において、アスパラギン酸に機能的に等価な残基であると考えられる。チロシンおよびトリプトファンは、フェニルアラニンと機能的に等価な残基と考えられる。アルギニンおよびリジンはヒスチジンと機能的に等価な残基と考えられる。
ここで二以上の配列の関係において使用される「実質同一」という用語は、同一または機能的に同等であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定割合、例えば、特定領域にわたる、または配列全体にわたるおよそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、65％の同一性、随意に、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99％の同一性などのようなものに言及する。
ここで使用するように、用語「多様体」は、参照（例は、親）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと実質類似または同一の配列を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドに言及する。ポリヌクレオチドの場合、多様体は、参照ポリヌクレオチドと比較して、5'端、3'端、および／または一またはそれよりも多くの内部部位にて、一またはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失、置換、付加を有することができる。多様体および参照ポリヌクレオチド間の配列における類似性および／または相違は、当技術で知られる慣習的技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびハイブリダイゼーション技術を使用して検出することができる。多様体ポリヌクレオチドにはまた、合成的に誘導されたポリヌクレオチド、例えば、部位特異的突然変異誘発法を用いることによって生成されたものなどのようなものも含まれる。概して、ポリヌクレオチドの多様体は、制限されないが、DNAを含め、当技術において既知の配列アラインメントプログラムによって決定されるように参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を有することができる。ポリペプチドの場合、多様体は、参照ポリペプチドと比較して一またはそれよりも多くのアミノ酸の欠失、置換、付加を有することができる。多様体および参照ポリペプチド間の配列における類似性および/または相違は、当技術において知られる慣習的技術、例えば、ウェスタンブロットを用いて検出することができる。ポリペプチドの多様体は、例えば、当技術において知られる配列アラインメントプログラムによって決定されるように、参照ポリペプチドに対して少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれよりも高い配列同一性を有することができる。
標準的な技術は、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例は、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造会社の明細に従って、または当技術において普通に達成されるように、またはここに記載されるように実行することができる。前述の技術および手順は概して、当技術においてよく知られる慣習的方法に従って、および本明細全体にわたって引用および議論される種々の一般的およびより一層具体的な参考文献に記載されるように実行することができる。例は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照し、それは任意の目的について、参照によってここに組み込まれる。特定の定義が提供されない限り、ここに記載される分析化学、有機合成化学、ならびに薬および薬剤化学に関連して利用される命名法、ならびに実験室の手順および技術は、当技術において普通に知られ、および使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬剤調製物、調剤物、およびデリバリー、ならびにペイシェント（人間で言う患者）の処理のために使用することができる。
＜コロナウイルスおよびコロナウイルス抗原＞
ここに記載の多価担体、ならびに関連するワクチン組成物、方法およびキットには、複数の異種コロナウイルス抗原が含まれる。用語「異種抗原」は、抗原が、異なる起源、例えば、異なる分類群、例えば、異なる株（strains、系統と言うこともある）、種、亜属、属、亜科または科などのようなものの病原体から、および／または抗原的に相違した病原体（例は、それらの多様体）から導き出されるものなどのようなものに属していることを意味する。多価担体はまた、モザイク担体に言及することができる。ウイルスを種々の分類群に分類することは、当技術において熟練する者（当業者とも言う）によって十分に理解される。ここに記載の実施態様において、ここに記載の多価担体の異種コロナウイルス抗原は、Coronaviridae（コロナウイルス科）ファミリーにおいて異なる株、種、亜属、属、および／または亜科のコロナウイルスから導き出される。
ここで使用する用語「コロナウイルス」は、ファミリーのCoronaviridaeにおけるウイルスに言及し、それは次には、オーダーのNidovirales（ニドウイルス目）内に分類される。コロナウイルスは、大型の、エンベロープを有する（enveloped）、プラス鎖（positive-stranded）RNAウイルスである。コロナウイルスは、当技術において知られるRNAウイルスの最も大きなゲノムを有し、および高い頻度の組換えをもたらす独自の機構によって複製する。コロナウイルスには、抗原性グループI、II、およびIIIが含まれる。コロナウイルスの非制限的な例には、SARSコロナウイルス（例は、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2）、MERSコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）、ヒト呼吸器コロナウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネコ腸内コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ウサギコロナウイルス、ネズミ肝炎ウイルス、唾液腺涙腺炎（sialodacryoadenitis）ウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ウシコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、およびシチメンチョウコロナウイルス、ならびにそれらのキメラが含まれる。分類、ビリオン構造、ゲノム構造、遺伝学および病理学を含め、コロナウイルスに関連する追加情報は、例えば、KV Holmes（ホームズ）、Encyclopedia of Virology（エンサイクロペディア・オブ・バイロロジー）、1999：291-298に記載され、その内容は参照によってここに組み込まれる。
いくらかの実施態様において、ここに記載のコロナウイルスは、Alpha-coronavirus（アルファ-コロナウイルス）の属にあり、およびコロナウイルス抗原は、Alpha-coronavirusの属の任意の種または株に属するか、またはそれらから導き出すことができる。いくらかの実施態様では、ここに記載されるコロナウイルスは、Beta-coronavirus（ベータコロナウイルス）の属にあり、およびコロナウイルス抗原は、Beta-coronavirusの属の任意の種または株に属するか、またはそれらから導き出すことができる。Alpha-coronavirusおよびBeta-coronavirusの属におけるメンバーのウイルスは、哺乳動物に感染することができる、エンベロープを有する、プラス鎖（positive-strand）のRNAウイルスである。
ここに記載されるコロナウイルスは、Alpha-coronavirusの属の任意の亜属に属することができ、制限されないが、Colacovirus（コラコウイルス）（例は、Bat coronavirus（バット・コロナウイルス）CDPHE15）、Decacovirus（デカコウイルス）（例は、Bat coronavirus HKU10およびRhinolophus ferrumequinum alphacoronavirus（リノロフス・フェルメクイウム・アルファコロナウイルス）HuB-2013）、Duvinacovirus（ドゥヴィナコウイルス）（Human coronavirus（ヒューマン・コロナウイルス）229E）、Luchacovirus（ルチャコウイルス）（例は、Lucheng Rn rat coronavirus（ルチョンRnラット・コロナウイルス））、Minacovirus（ミナコウイルス）（例は、Mink coronavirus 1（ミンクコロナウイルス1））、Minunacovirus（ミヌナコウイルス）（Miniopterus bat coronavirus 1（ミニオプテルス・バット・コロナウイルス1）およびMiniopterus bat coronavirus HKU8）、Myotacovirus（マイオタコウイルス）（例は、Myotis ricketti alphacoronavirus Sax-2011（ミオティス・リケット・アルファコロナウイルスSax-2011））、Nyctacovirus（ニクタコウイルス）（例は、Nyctalus velutinus alphacoronavirus SC-2013（ニクタラス・ベルチヌス・アルファコロナウイルスSC-2013）およびPipistrellus kuhlii coronavirus 3398（ピピストレルス・クーリー・コロナウイルス3398））、Pedacovirus（ペダコウイルス）（例は、Porcine epidemic diarrhea virus（ブタ流行性下痢ウイルス）およびScotophilus bat coronavirus 512（スコトフィラス・バット・コロナウイルス512））、Rhinacovirus（ライナコウイルス）（例は、Rhinolophus bat coronavirus HKU2（リノロフス・バット・コロナウイルスHKU2））、Setracovirus（セトラコウイルス）（例は、Human coronavirus NL63（ヒューマン・コロナウイルスNL63）およびNL63-related bat coronavirus strain BtKYNL63-9b（NL63関連バット・コロナウイルス株BtKYNL63-9b）、Soracovirus（ソラコウイルス）（例は、Sorex araneus coronavirus T14（ソレックス・アラネウス・コロナウイルスT14、ヨーロッパトガリネズミコロナウイルスT14））、Suncus murinus coronavirus X74（スンクス・ムリヌス・コロナウイルスX74、ジャコウネズミコロナウイルスX74））、およびTegacovirus（テガコウイルス）（例は、Alphacoronavirus 1（アルファコロナウイルス1））が含まれる。
属のベータ-コロナウイルス内では、Embecovirus（エンベコウイルス）（系統（lineage）A）、Sarbecovirus（系統B）、Merbecovirus（メルベコウイルス）（系統C）、Nobecovirus（ノベコウイルス）（系統D）、およびHibecovirus（ヒベコウイルス）を含め、五つの亜属または系統が認識された。したがって、いくらかの実施態様では、ここに記載のコロナウイルスは、ベータ-コロナウイルスの亜属または系統のいずれかにおける任意の株または種であることができる。
例えば、コロナウイルス抗原は、Embecovirus（エンベコウイルス）の亜属における任意の種または株に属するか、またはそれらから導き出すことができ、制限されないが、Beta-coronavirus 1（例は、Bovine coronavirus（ボバイン・コロナウイルス）およびhuman coronavirus（ヒューマン・コロナウイルス）OC43）、China Rattus coronavirus（チャイナ・ラタス・コロナウイルス）HKU24、Human coronavirus HKU1（ヒューマン・コロナウイルスHKU1）、Murine coronavirus（ミュアライン・コロナウイルス）（例は、マウス肝炎ウイルス）、およびMyodes coronavirus（ミオデス・コロナウイルス）2JL14が含まれる。コロナウイルス抗原は、Sarbecovirusの亜属における任意の種または株におけるか、またはそれらから導き出すことができ、制限されないが、SARS-CoV、SARS-CoV2、16BO133、Bat（コウモリ）SARS CoV Rf1、BatコロナウイルスHKU3（BtCoV HKU3）、LYRa11、Bat SARS-CoV/Rp3、Bat SL-CoV YNLF_31C、Bat SL-CoV YNLF_34C、SHC014-CoV、WIV1、WIV16、Civet（ジャコウネコ）SARS-CoV、Rc-o319、SL-ZXC21、SL-ZC45、Pangolin（鱗甲類、センザンコウなど）SARSr-Cov-GX、Pangolin SARSr-COV-GD、RshSTT182、RshSTT200、RacCS203、RmYN02、RpYN06、RaTG13、Bat CoV BtKY72、およびBat CoV BM48-31が含まれる。コロナウイルス抗原は、Merbecovirusの亜属における任意の種または株に属することができ、制限されないが、Hedgehog coronavirus 1（ヘッジホッグ・コロナウイルス1）、MERS-CoV、Pipistrellus bat coronavirus（ピピストレルス・バット・コロナウイルス）HKU5、およびTylonycteris bat coronavirus（タイロニクテリス・バット・コロナウイルス）HKU4が含まれる。コロナウイルス抗原は、Nobecovirusの亜属における任意の種または株に属することができ、制限されないが、Eidolon bat coronavirus（アイドロン・バット・コロナウイルス）C704、Rousettus bat coronavirus（ルーセット・バット・コロナウイルス）GCCDC1、およびRousettus bat coronavirus HKU9が含まれる。コロナウイルス抗原は、Hibecovirusの亜属における任意の種または株に属することができ、制限されないが、Bat Hp-betacoronavirus Zhejiang（バットHP-ベータコロナウイルス・チョーチャン）2013が含まれる。
ここに記載のコロナウイルスは、例えば、機能的に別個なクレードにおいて系統学的にクラスター化することができる。例えば、系統Bのベータ-コロナウイルス（Sarbecovirus）のコロナウイルスは、非構造タンパク質遺伝子ORF1aおよびORF1bのヌクレオチド配列を使用して、クレード1、クレード2、クレード1/2、またはクレード3にクラスター化することができる（例えば、Hu（フー）ら、PLoS Pathog（PLoSパソジェンズ）13(11): e1006698参照）。したがって、コロナウイルス抗原は、これらのクレードのいずれか一つにおける任意の種または株に属するか、またはそれらから導き出すことができる。例えば、コロナウイルス抗原は、クレード1における任意の種または株に属することができ、制限されないが、SARS-CoV、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、およびSHC014が含まれる。コロナウイルス抗原は、クレード2における任意の種または株に属することができ、制限されないが、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi（陝西）2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan（竜泉）-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005が含まれる。コロナウイルス抗原は、クレード1/2における任意の種または株に属することができ、制限されないが、SARS-CoV2が含まれる。コロナウイルス抗原は、クレード3における任意の種または株に属することができ、制限されないが、BM48-31が含まれる。ここに記載のコロナウイルス抗原は、コロナウイルスで、例えば、SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081に属することができる。
ここで例示するように、SARSウイルス（例は、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2）は、Coronaviridaeファミリーからの属のBetacoronavirusに属する、一本鎖ポジティブセンスRNAゲノム（～30kb）を運搬するエンベロープを有するコロナウイルス（enveloped coronavirus）である。ウイルスRNAは、四つの構造タンパク質で、スパイク（S）、エンベロープ（E）、膜（M）、およびヌクレオカプシド（N）タンパク質が含まれるもの、16の非構造タンパク質、および九つのアクセサリータンパク質をコードする。S糖タンパク質には、S1およびS2サブユニットに加工することができる外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインが含まれる。SARS-CoVおよびSARS-CoV-2の双方は、宿主細胞への侵入を促進するためにS1サブユニット内の受容体結合ドメインを介してヒトACE2と結合し、次いでS2サブユニットによって媒介される膜融合が続く。
ここに記載のコロナウイルスのコロナウイルス抗原は、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導する能力がある任意の多様な（variety of）コロナウイルスタンパク質であることができる。適切なコロナウイルス抗原は、保護免疫応答、例えば、広範な中和抗体を生産することなどのようなものを引き出すことができるものである。例えば、コロナウイルス抗原は、コロナウイルスのスパイク（S）タンパク質、スパイク受容体結合ドメイン（RBD）、S1サブユニット、S2サブユニット、スパイクフル外部ドメインタンパク質、パパイン様プロテアーゼ、3CLプロテアーゼ、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質、またはコロナウイルスを形成する任意の構造、非構造またはアクセサリータンパク質を含むことができる。
いくらかの実施態様において、ここで使用されるコロナウイルス抗原には、スパイク（S）タンパク質またはその一部分が含まれる。Sタンパク質は、各ビリオンの表面を覆う四つの主要構造タンパク質の一つである。Sタンパク質は、S1サブユニットおよびS2サブユニットを含み、宿主細胞受容体に結合する能力がある高グリコシル化の、I型膜貫通タンパク質であり、およびウイルスの侵入を媒介する。Sタンパク質は、RBDと称されるドメインからなり、それは一またはそれよりも多くのRBDsが宿主受容体と結合するために「アップ」を採用した後、宿主細胞に入るために宿主細胞受容体との相互作用を媒介する。受容体に結合した後、近くの宿主プロテアーゼがスパイクを開裂させ、それはスパイク融合ペプチドを放出し、ウイルスの侵入が促進されると考えられる。コロナウイルス（例は、Beta-coronaviruses）についての既知の宿主受容体には、アンチオテンシン（antiotensin）変換酵素2（ACE2）、ジペプチジルペプチダーゼ4（DPP4）またはシアル酸が含まれる。例えば、ヒトコロナウイルスSARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-NL63、および関連動物コロナウイルス（WIV1およびSCH014）のRBDsは、それらの宿主受容体としてACE2を用い、一方でMERS-CoVはその宿主受容体としてDPP4を用いる。
ここで使用されるコロナウイルス抗原は、例えば、コロナウイルス核カプシドタンパク質（Nタンパク質）またはその一部分を含むことができる。Nタンパク質は、ウイルスRNAの転写、複製、およびパッケージングに必要な多機能性RNA結合タンパク質である。Nタンパク質は、N末端のRNA結合ドメイン、中央の天然変性領域（intrinsically disordered region）、次いでC末端の二量体化ドメインが続く三つのドメインからなる。RNA結合ドメインは、複数の正に荷電された結合表面を含み、それらはRNAとの荷電相互作用を形成し、そのヘリカル配置が促進される。ここで使用されるコロナウイルス抗原は任意のこれらのNタンパク質ドメインまたはその一部分を含むことができる。
いくらかの実施態様において、ここで使用されるコロナウイルス抗原は、コロナウイルスの膜タンパク質（Mタンパク質）またはその一部分を含む。Mタンパク質は、最も豊富な構造タンパク質であり、およびウイルスエンベロープの形状を規定する。Mタンパク質は、ウイルス集合体の中心オーガナイザーと考えられ、他の主要なコロナウイルス構造タンパク質と相互作用する。
いくらかの実施態様において、ここで使用されるコロナウイルス抗原は、コロナウイルスのエンベロープタンパク質（Eタンパク質）またはその一部分を含む。Eタンパク質は、小膜タンパク質およびウイルス粒子の微量構成要素である。いかなる理論にも束縛されることなく、Eタンパク質は、ビリオンの組み立ておよび形態形成、宿主細胞の膜の変動、およびウイルス-宿主細胞相互作用において役割を果たすと考えられる。
いくらかの実施態様において、ここで使用されるコロナウイルス抗原は、コロナウイルスのヘマグルチニン-エステラーゼタンパク質（HEタンパク質）またはその一部分を含む。HEタンパク質、それは別のエンベロープタンパク質であるが、レクチンおよび受容体破壊酵素の双方として作用することによって、O-アセチル化シアル酸への可逆的な付着を媒介する。
いくらかの実施態様において、ここで使用されるコロナウイルス抗原は、コロナウイルスのパパイン様プロテアーゼまたはその一部分を含む。コロナウイルスパパイン様プロテアーゼは、いくつかの非構造タンパク質の一つであり、および成熟中にウイルスタンパク質を機能的な、成熟したサブユニットに加工する原因である。例えば、コロナウイルスのパパイン様プロテアーゼはウイルスレプリカーゼ領域のアミノ末端にて部位を開裂することができる。パパイン様プロテアーゼは、ウイルスタンパク質の成熟におけるその役割に加えて、双方の脱ユビキチン化および脱ISG15化（deiSG15ylating）活性を見せる。インビボでは、このプロテアーゼは、IFNベータおよびNF-カッパBシグナル伝達経路に作用することによって、自然免疫（innate immunity）に拮抗する。
いくらかの実施態様において、ここで使用されるコロナウイルス抗原は、コロナウイルスの3CLプロテアーゼまたはその一部分を含む。3CLプロテアーゼは、パパイン様プロテアーゼに加えて別の主要なプロテアーゼであり、およびウイルスポリペプチドを別個の、機能的タンパク質へ加工することに必要である。いくらかの実施態様において、3CLプロテアーゼは、SARS-CoV-2 3CL Protease（プロテアーゼ）であり、それはウイルスポリペプチドの非構造タンパク質3（NS3）領域内に位置するC30型システインプロテアーゼである。コロナウイルスゲノムの分析は、3CLプロテアーゼについての少なくとも11の開裂部位にて、多くはアミノ酸配列LQ［S/A/G］が含まれることを明らかにする。
ここに開示されるコロナウイルス抗原は、いくらかの実施態様において、Sタンパク質またはその一部分、Nタンパク質またはその一部分、HEタンパク質またはその一部分、パパイン様プロテアーゼまたはその一部分、コロナウイルス3CLプロテアーゼまたはその一部分、Mタンパク質またはその一部分、またはそれらの組合せを含むことができる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、ここに記載されるコロナウイルスタンパク質の免疫原性部分であることができる。コロナウイルス抗原の免疫原性部分は、一またはそれよりも多くのコロナウイルスに対する免疫応答を引き出す能力があるSタンパク質（例は、スパイクタンパク質RBD）、Nタンパク質、HEタンパク質、パパイン様プロテアーゼ、3CLプロテアーゼ、またはMタンパク質の断片であることができることが、当技術において熟練する者によって認められるであろう。免疫原性部分は、コロナウイルスタンパク質からおよそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、せいぜい次の、またはせいぜいおよそ次の、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、またはこれらの値の任意の二つの間の数または範囲の、連続したアミノ酸残基を含むことができる。いくらかの実施態様では、免疫原性部分はSタンパク質RBDまたはその一部分を含む。Sタンパク質RBDの部分はSタンパク質RBDの受容体結合モチーフを含むことができる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選ばれ、随意にSARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ばれる一またはそれよりも多くのコロナウイルスからの任意のコロナウイルスSタンパク質のアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、98％、99％、またはそれらよりも多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれらからなるSタンパク質またはその一部分である。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選ばれ、随意にSARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ばれる一またはそれよりも多くのコロナウイルスからの任意のコロナウイルスNタンパク質のアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれらよりも多くの、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれらからなるNタンパク質またはその一部分である。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選ばれ、随意にSARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ばれる一またはそれよりも多くのコロナウイルスからの任意のコロナウイルスHEタンパク質のアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次のまたは少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれらよりも多くの、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれらからなるHEタンパク質またはその一部分である。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選ばれ、随意にSARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13およびRs4081から選ばれる一またはそれよりも多くのコロナウイルスの任意のコロナウイルスパパイン様プロテアーゼのアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれらよりも多くの、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれらからなるパパイン様プロテアーゼまたはその一部分である。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選ばれ、随意にSARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ばれる一またはそれよりも多くのコロナウイルスからの任意のコロナウイルス3CLプロテアーゼのアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれらよりも多くの、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれらからなる3CLプロテアーゼまたはその一部分である。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31から選ばれ、随意にSARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ばれる一またはそれよりも多くのコロナウイルスからの任意のコロナウイルスMタンパク質のアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれらよりも多くの、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれらからなるMタンパク質またはその一部分である。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、コロナウイルスのスパイクRBDまたはその一部分もしくは多様体を含む。コロナウイルスのスパイクRBDは、コアを形成する短い連結ヘリックス（short connecting helices）およびループを有する、ねじれた五本鎖の逆平行βシート（例は、SARS-CoV-2におけるβ1、β2、β3、β4およびβ7）の三次元構造を有することが知られる。コアにおける二本のβストランド（例は、SARS-CoV-2におけるβ4およびβ7ストランド）の間には、二本の短いβストランド（例は、SARS-CoV-2におけるβ5およびβ6）、二本のαヘリックス（例は、SARS-CoV-2におけるα4およびα5）および二本のβストランドおよび／または二本のαヘリックスを接続するループを含む拡張挿入部（extended insertion）が存在する。この拡張挿入部は、受容体結合モチーフ（RBM）と称され、それは宿主細胞受容体（例は、ACE2）に結合する能力がある残基を含む。ここに記載の実施態様では、コロナウイルスのスパイクRBD、および特にRBMは、スパイクタンパク質媒介ウイルス侵入を開始させるために、宿主細胞受容体を認識し、およびそれに結合する能力がある。コロナウイルスのスパイクRBDおよび宿主細胞受容体（例は、ACE2）インターフェースおよび関連する接触残基の詳細情報は、例えば、Lan（ラン）ら、Nature（ネイチャー）第581巻、215-220ページ（2020年）に記載されており、その内容は参照によってそれがその全体を組み込む（is incorporated by reference it its entirety）。
ここで使用されるコロナウイルスのスパイクRBDまたはその一部分は、Coronaviridaeのファミリーにおける任意のウイルス種または株に属し、またはそれらから導き出すことができる。ここで使用されるコロナウイルスのスパイクRBDまたはその一部分は、Alpha-coronavirusの属における任意の種または株に属することができる。ここで使用されるコロナウイルスのスパイクRBDまたはその一部分は、Beta-coronavirusの属の任意の種または株に属することができる。ここで使用されるコロナウイルスのスパイクRBDまたはその一部分は、Beta-coronavirusの亜属のEmbecovirus（系統A）、Sarbecovirus（系統B）、Merbecovirus（系統C）、Nobecovirus（系統D）、およびHibecovirusにおける任意のウイルス種または株に属することができる。
例えば、コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、亜属のEmbecovirusの任意の種または株に属することができ、制限されないが、Beta-coronavirus 1（例は、Bovine coronavirusおよびhuman coronavirus OC43）、China Rattus coronavirus HKU24、Human coronavirus HKU1、Murine coronavirus（例は、マウスヘプタティスウイルス（mouse heptatitis virus））、およびMyodes coronavirus 2JL14が含まれる。コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、Sarbecovirusの亜属における任意のウイルス種または株に属することができ、制限されないが、SARS-CoV、SARS-CoV2、16BO133、Bat SARS CoV Rf1、BatコロナウイルスHKU3（BtCoV HKU3）、LYRa11、Bat SARS-CoV/Rp3、Bat SL-CoV YNLF_31C、Bat SL-CoV YNLF_34C、SHC014-CoV、WIV1、WIV16、Civet SARS-CoV、Rc-o319、SL-ZXC21、SL-ZC45、Pangolin SARSr-COV-GX、Pangolin SARSr-COV-GD、RshSTT182、RshSTT200、RacCS203、RmYN02、RpYN06、RaTG13、Bat CoV BtKY72、およびBat CoV BM48-31が含まれる。コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、Merbecovirusの亜属における任意のウイルス種または株であることができ、制限されないが、Hedgehog coronavirus 1、MERS-CoV、Pipistrellus bat coronavirus HKU5、およびTylonycteris bat coronavirus HKU4が含まれる。コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、Nobecovirusの亜属における任意のウイルス種または株であることができ、制限されないが、アイドロン・バット・コロナウイルスC704、Rousettus bat coronavirus GCCDC1、およびRousettus bat coronavirus HKU9が含まれる。コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、Hibecovirusの亜属における任意のウイルス種または株であることができ、制限されないが、Bat Hp-betacoronavirus Zhejiang 2013が含まれる。
コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、系統Bコロナウイルス（Sarbecovirus）の系統的にクラスター化されたクレードのいずれか一つにおける任意のウイルス種または株に属することができる（can be of）。例えば、コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、クレード1における任意の種または株に属することができ、制限されないが、SARS-CoV、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、およびSHC014が含まれる。コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、クレード2における任意の種または株に属することができ、制限されないが、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3、Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、および273-2005が含まれる。コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、クレード1/2における任意の種または株に属することができ、制限されないが、SARS-CoV2が含まれる。コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、クレード3における任意の種または株に属することができ、制限されないが、BM48-31が含まれる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、以下から選ばれるコロナウイルスからであることができる：SARS-CoV、SARS-CoV2、WIV1、LYRa11、Rs7327、Rs4231、Rs4084、SHC014、As6526、Yunnan 2011、Shaanxi 2011、279-2005、Rs4237、Rs4081、Rp3．Rs4247、HKU3-8、HKU3-13、GX2013、Longquan-140、YN2013、Rf4092、ZXC21、ZC45、JL2012、HuB2013、Rf1、HeB2013、273-2005、およびBM48-31。いくらかの実施態様では、コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分は、SARS、SARS-2、WIV1、SHC014、Rf1、RmYN02、pang17、RaTG13、およびRs4081から選ばれるコロナウイルスからである。
コロナウイルスのスパイクRBDタンパク質またはその一部分もしくは多様体は、例えば、ここに開示されるコロナウイルスの任意のスパイクタンパク質RBDsのアミノ酸配列に対して少なくとも65％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなることができる（例は、配列番号1-12および15-26のいずれか一のコロナウイルスのスパイクタンパク質RBD）。いくらかの実施態様では、コロナウイルスのスパイクタンパク質RBDまたはその多様体は、配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、またはこれらの値のうち任意の二つの間の数もしくは範囲の、配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはそれらからなる。いくらかの実施態様では、コロナウイルスのスパイクタンパク質RBDまたはその多様体は、配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、またはこれらの値の任意の二つの間の範囲の、配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはそれらからなる。いくらかの実施態様では、コロナウイルスのスパイクタンパク質RBDまたはその多様体は、配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列と次の、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、またはこれら値の任意の二つの間の範囲の、配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはこれらからなる。いくらかの実施態様では、ここに記載されるコロナウイルスのスパイクタンパク質RBDは、配列番号1-12および15-26の一からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、またはそれらからなる。いくらかの実施態様では、コロナウイルスのスパイクタンパク質RBDのアミノ酸配列は、配列番号1-12および15-26から選ばれる。
コロナウイルスのスパイクRBDまたはその多様体は、例えば、ここに開示されるコロナウイルスの任意のスパイクRBDsのアミノ酸配列（例は、配列番号1-12および15-26のいずれか一つのアミノ酸配列を有するコロナウイルスのスパイクRBDs）と比較して、次の、またはおよそ次の、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十二、二十三、二十四、二十五、二十六、二十七、二十八、二十九、三十、またはこれらの値の任意の二つの間の範囲の、不一致を有するアミノ酸配列を含み、またはそれらからなる。いくらかの実施態様では、コロナウイルスのスパイクRBDsまたはその多様体は、配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列と比較して、せいぜい次の、せいぜいおよそ次の、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十二、二十三、二十四、二十五、二十六、二十七、二十八、二十九、三十の不一致を有するアミノ酸配列を含み、またはそれらからなる。いくらかの実施態様では、ここに記載される不一致（es（esは複数形））は、コロナウイルスのスパイクRBDのRBMにおいて生じる。
コロナウイルスのスパイクRBDまたはその多様体は、例えば、ここに開示する任意のコロナウイルスのスパイクRBDsのアミノ酸配列と比較して、次の、およそ次の、せいぜい次の、せいぜいおよそ次の、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十二、二十三、二十四、二十五、二十六、二十七、二十八、二十九、三十、またはこれらの値の任意の二つの間の範囲の、欠失または挿入を有するアミノ酸配列を含み、またはそれらからなることができる（例は、配列番号1-12および15-26のいずれか一つのアミノ酸配列を有するコロナウイルスのスパイクRBDs）。
したがって、本開示の関連におけるコロナウイルス抗原は、ここに開示されるコロナウイルスのタンパク質に関してアミノ酸置換を含むことができる。タンパク質の免疫原性活性が有意に変化せず（例は、ここに開示されるコロナウイルスのタンパク質抗原に関してせいぜい10％、20％、30％、40％または50％の減少）、および多様体が望ましい活性を保持する限り、任意のアミノ酸置換が許される。好ましい多様体は典型的に、一またはそれよりも多くのアミノ酸がそれらの機能的等価物により置換された置換を含む。
＜担体＞
ここで使用される担体は、概して、分子（例は、治療薬、例えば、コロナウイルス抗原などのようなもの）の選択性、バイオアベイラビリティおよび効率を高めるために、それらを組み込み、および輸送する能力を有する生体適合性分子システムに言及することができる。ここに記載の方法、組成物、およびシステムにおいて使用される担体は、自然に発生するか、または合成のいずれでもの生体適合分子システムであることができ、それはここに記載の複数のタンパク質抗原または免疫原ポリペプチドにカップリング（例は、共有結合または非共有結合）するために機能化またはコンジュゲーションすることができる。担体は、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノワイヤ、デンドリマー、リポソーム、エソソーム（ethosomes）およびアクアソーム（aquasomes）、ポリマーソーム（polymersomes）およびニオソーム（niosomes）、フォーム、ヒドロゲル、キュボソーム（cubosomes）、量子ドット、エクソソーム、マクロファージ、および当技術において熟練する人物に識別可能な他のものを含むことができる。
いくらかの実施態様において、ここで使用される担体は、ナノサイズの担体、例えば、ナノ粒子などのようなものであることができる。ここで使用するように、「ナノ粒子」という用語は、ナノメートル（nm）で測定されるサイズを有するナノスコピック粒子（nanoscopic particle）に言及することができる。ナノ粒子のサイズは、それらの最大寸法によって特徴付けられ得る。ここで使用されるナノ粒子のように用語「最大寸法」は、ナノ粒子の中心を通過し、および周辺部で終端する直線セグメントの最大長さに言及することができる。ナノスフェアの場合には、ナノスフェアの最大寸法はその直径に相当する。用語「平均最大寸法」は、ナノ粒子の平均または平均最大寸法に言及することができ、および各ナノ粒子の最大寸法の和をナノ粒子の合計数で割ることによって算出し得る。したがって、最大寸法の値は、任意の形状のナノ粒子、例えば、規則的な形状、例えば、球、半球、立方体、プリズム、またはダイヤモンドなどのようなもの、または不規則な形状を有するナノ粒子などのようなものについて算出し得る。ここで提供されるナノ粒子は、球形であることを必要としないことができ、および例えば、形状、例えば、立方体、筒、管、ブロック、フィルム、および／またはシートなどのようなものを含むことができる。いくらかの実施態様では、ナノ粒子の最大寸法は、約1nmから約5000nmまでの範囲、例えば、約20nmより約1000nmまで、約20nmより約500nmまで、約50nmより約300nmまで、または約100nmより約200nmまでの間にある。
ナノ粒子は、制限されないが、脂質ベースのナノ粒子（それらの構造を構成する物質の大部分が脂質であるナノ粒子、例は、リポソームまたは脂質ベシクル）、重合体ナノ粒子、無機ナノ粒子（例は、磁性物質、セラミックおよび金属のナノ粒子）、界面活性剤ベースのエマルション、シリカナノ粒子、ウイルス様粒子（主にウイルス構造タンパク質で作った粒子、それは感染性でなく、または低い伝染性を有する）、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子（それらの構造を構成する物質の大部分がペプチドまたはタンパク質である粒子）および／またはナノ材料の組合せを用いて開発されるナノ粒子で、例えば、当技術において熟練する人物には理解されるであろうように、ポリマーコアと脂質シェルとによって形成される脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子または足場タンパク質によって安定化された膜脂質二重層において配置された膜形成脂質によって形成されるナノリポタンパク質粒子などのようなものの任意の一つであることができる。
いくらかの実施態様において、担体は、複数の単量体サブユニットから構成され、それらは、担体を形成するために、共有結合力および／または非共有結合力を通して互いに組み立てられる。いくらかの実施態様において、ここに記載の担体は、複数の粒子形成性タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子であり、それらはタンパク質ナノ粒子を形成する単量体サブユニットタンパク質である。タンパク質ナノ粒子は、非ウイルス性タンパク質ナノ粒子およびウイルス様粒子に分類することができる。非ウイルス性タンパク質ナノ粒子の例には、制限されないが、フェリチン、ヴォールト（vaults）、熱ショックタンパク質、シャペロニン、ルマジン合成酵素、エンカプスリン（encapsulins、カプセル化物質などとも言う）、および細菌のマイクロコンパートメントが含まれる。ウイルス様粒子は、ウイルスから導き出すことができ、制限されないが、アデノウイルス、ササゲモザイクウイルス、ササゲクロロティックモトルウイルス、ブロムモザイクウイルス、ソラマメモトルウイルス（broad bean mottle virus）、バクテリオファージラムダ（例は、バクテリオファージラムダプロカプシド）、MS2バクテリオファージ、Qβバクテリオファージ、P22ファージカプシド、および当技術において熟練する人物に識別可能な他のものが含まれる。
いくらかの実施態様において、ここに記載のナノ粒子には、ウイルス様粒子（VLP）が含まれる。VLPはいくつかのウイルスのいずれかから導き出される、非複製、ウイルス殻に言及する。VLPsは、自然に生じ、またはウイルス構造タンパク質の個々の発現を通して合成することができ、それは次いで、ウイルス様構造に自己集合することができる。VLPsは、概して、一またはそれよりも多くのウイルスタンパク質、例えば、粒子形成性タンパク質で、カプシド、コート、シェル、表面および／またはエンベロープタンパク質と称されるもの、または粒子形成性ポリペプチドで、これらのタンパク質から導き出されるものなどのようなもので構成される。いくらかの実施態様では、VLPsは、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現の際に自発的に形成することができる。VLPsは形態、サイズおよびサブユニットの数において異なることができる。特定のVLPsを産生するための方法は、当技術において知られる。VLPsの存在、次いでウイルスタンパク質の組換え発現は、当技術においても知られる慣習的技術を用いて、例えば、電子顕微鏡、生物物理学的特性評価、およびその他同種類のものによってなどのようなものにより検出することができる（例は、Baker（ベーカー）ら（1991）Biophys. J.（バイオフィジカル・ジャーナル）60:1445-1456；およびHagensee（ハーゲンゼー）ら（1994）J. Virol.（ジャーナル・オブ・バイロロジー）68:4503-4505参照）。例えば、VLPsは、密度勾配遠心分離によって分離され、および／または特徴的な密度バンディングによって識別すことができる。あるいはまた、VLP調製物のガラス化水性サンプルに対して低温電子顕微鏡法を実行し、および適切な露光条件下で画像を記録することができる。当技術において知られる任意の多様なVLPsをここで使用することができ、制限されないが、Aquifex aeolicus（アクイフェックス・エオリカス）ルマジン合成酵素、Thermotoga maritima（サーモトガ・マリティマ）エンカプスリン、Myxococcus xanthus（ミキソコッカス・ザンサス）エンカプスリン、バクテリオファージQbeta（Qベータ）ウイルス粒子、Flock House Virus（フロックハウスウイルス）（FHV）粒子、ORSYウイルス粒子、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（infectious bursal disease virus）（IBDV）粒子が含まれる。いくらかの実施態様では、ここで使用されるナノ粒子は、バクテリオファージVLP、例えば、Ap205 VLPなどのようなものであることができる。
いくらかの実施態様において、ここに記載のナノ粒子は、自己集合性（self-assembling）ナノ粒子を含む。自己集合性ナノ粒子は、典型的には、数十ナノメートルの直径および明確に規定された表面形状を有するボール形状のタンパク質シェルに言及し、それはVLPsと同様の外観を有するナノ粒子に自動的に集合する能力がある非ウイルス性タンパク質の同一コピーによって形成される。自己集合性ナノ粒子の例には、制限されないが、フェリチン（FR）（例は、Helicobacter pylori（ヘリコバクター・ピロリ）フェリチン）が含まれ、それは種を超えて保存され、および24-mer（24量体）、B. stearothermophilus（バチルス・ステアロサーモフィルス）ジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（dihydrolipoyl acyltransferase）（E2p）、Aquifex aeolicusルマジン合成酵素（LuS）、およびThermotoga maritimaエンカプスリンを形成し、それらはすべて60-merを形成する。
いくらかの実施態様において、自己集合性ナノ粒子は、超好熱性細菌Theremotoga Maritima（テレモトガ・マリティマ）またはその多様体のエントナー－ドドゥロフ（Entner-Doudoroff）経路からの2-ケト-3-デオキシ-ホスホグルコナート（KDPG）アルドラーゼの複数の粒子形成性タンパク質を含む。いくらかの実施態様では、改善された粒子の収率、安定性、および均一性のために、変異をKDPGアルドラーゼに導入する。例えば、いくらかの実施態様では、KDPGアルドラーゼの野生型タンパク質三量体の間で界面を変えるために変異を導入することができる。いくらかの実施態様では、ここで使用されるナノ粒子はi301ナノ粒子またはその多様体である。いくらかの実施態様では、ここで使用されるナノ粒子は変異i301ナノ粒子（例えば、mi3ナノ粒子）である。自己集合性ナノ粒子は、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現に際し自発的に形成することができる。ナノ粒子の生産、検出、および特徴付けのための方法は、VLPsについて開発された同じ技術を使用して行うことができる。
いくらかの実施態様において、ここに開示される多価担体ならびに関連するワクチン組成物、方法およびキットは、任意の多様な既知のナノ粒子、いくらかのアミノ酸残基が機能的に等価な残基で置換されたそれらの保存的修飾多様体、ならびに実質同一な配列を有する多様体（例は、少なくとも90％、95％、または99％同一）を採用することができる。
ここに記載されるいくらかの実施態様において、ここで使用される担体は、多価担体である。多価ナノ粒子は、コロナウイルス抗原の単一種を提示する一価担体と対照的に、免疫原の異種の集団を提示し、ここに記載の亜科、属、または亜属が含まれるCoronaviridaeのファミリーにおける異なるコロナウイルス株または種の、またはそれらから導き出される少なくとも二つのコロナウイルス抗原が含まれる。したがって、ここに記載の多価担体上に提示される異種免疫原は、異なるタンパク質配列を有する。
化合物（例は、抗原）または官能基を参照してここで使用される用語「提示」は、付着した化合物または官能基の化学反応性を維持するために実行される付着を示す。したがって、担体上に提示される官能基は、その官能基を化学的に特徴付ける一またはそれよりも多くの化学反応を適切な条件下で実行することが可能である。担体上に提示される化合物は、その化合物を化学的に特徴付ける一またはそれよりも多くの化学反応を適切な条件下で実行することが可能である。例えば、化合物がコロナウイルス抗原であるか、またはコロナウイルス抗原を含む場合、担体によって提示されるコロナウイルス抗原は、コロナウイルス抗原を特徴付ける免疫学的活性に関係する反応の複合体を維持する。したがって、コロナウイルス抗原の提示は、付着したコロナウイルス抗原に関係する免疫学的活性が維持されるような付着を指し示す。
ここに記載の多価担体上に提示される異種コロナウイルス抗原は、その表面上に表示されることができる。あるいはまた、ここに記載の多価担体上に提示される異種コロナウイルス抗原は、免疫応答を誘導するように、コロナウイルス抗原の少なくとも免疫原性部分が露出され、および宿主細胞受容体によってアクセス可能なように、部分的にカプセル化または埋め込むことができる。
（コロナウイルス抗原および担体のカップリング）
コロナウイルス抗原は、担体に共有結合的または非共有結合的に付着させることができる。用語「付着する」、「付着した」、「カップリングする」および「カップリングした」は、一つの実体（例は、化学的モイエティ）と別のものとの化学的連関に言及するために交換可能に使用される。付着は、例えば、第一の実体が第二の実体に直接結合する場合、または第一の実体が一またはそれよりも多くの中間実体を介して第二の実体に結合する場合のように、直接的または間接的であることができる。いくらかの実施態様では、コロナウイルス抗原のC末端は、担体を形成するサブユニットのN末端に付着している。
いくらかの実施態様において、付着またはカップリングは、付着が二つの実体間の共有結合の存在の関連で起こるような共有結合である。いくらかの実施態様において、付着またはカップリングは、非共有結合相互作用によって媒介され、制限されないが、電荷相互作用、親和性相互作用、金属配位、疎水性相互作用、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、双極子－双極子相互作用、またはそれらの組合せが含まれる。いくらかの実施態様において、カプセル化は、付着の形態である。いくらかの実施態様において、複数のコロナウイルス抗原は、多価担体にコンジュゲートされる。
ここに記載の担体は、例えば、コロナウイルス抗原の対応する官能基または対応する反応性モイエティによる結合のために提示される官能基または反応性モイエティにより機能化することができる。したがって、コロナウイルス抗原と多価担体との間の付着は、官能基対または反応性モイエティ対の間の結合を介して生じることができる。模範的な官能基対または反応性モイエティ対には、制限されないが、アビジン（例は、ストレプトアビジン、NeutrAvidin（ニュートラアビジン）、CaptAvidin（カプトアビジン））とビオチンとの対、Strep-Tactin（ストレプ-タクチン）とStrep-tag（ストレプ-タグ）との対、チオールとチオール反応性モイエティ（例は、マレイミド、ハロアセトアミド、ヨードアセトアミド、ベンジルハライド、ブロモメチルケトン）との対、およびアミンとアミン反応性モイエティ（例は、活性エステル、例えば、スクシンイミジル、テトラフルオロフェニル、カルボジイミド、イソチオシアナート、スルホニルクロライド、ジクロルトリアジン、アクリルハライド、アシルアジドなどのようなもの）が含まれる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、二つの反応性基を含む化学的および／または光反応性架橋剤（例は、架橋試薬）を介して多価担体に付着させることでき、それによって抗原および担体を共有結合的に連結する手段が提供される。化学的架橋試薬の反応性基は典型的には、スクシンイミジルエステル、マレイミドおよびヨードアセトアミドおよび他の熟練した人物に識別可能なものを含めた、官能基のクラスに属している。架橋および光活性化可能な試薬の追加の例は、例えば、thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/crosslinking and-photoactivatable-reagents.htmlにおいて記載されており、その内容は参照によって組み込まれる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、クリックケミストリーモイエティを介して多価担体に付着することができる。ここで使用するように、用語「クリックケミストリー」は、The Scripps Research Institute（スクリプス研究所）のK. Barry Sharpless（カール・バリー・シャープレス）によって導入された化学的原理に言及することができ、反応性基を一緒に含む小さな単位を接合することによって共有結合を迅速および確実に生成するように調整された化学が説明される。クリックケミストリーは、特定の反応を指すのではなく、自然界で見られる反応を模擬した反応を含む概念である。いくらかの実施態様において、クリックケミストリー反応は、モジュール式であり、範囲が広く、高い化学収率を与え、非毒性の副生成物を生成し、立体特異的であり、単一の反応生産物との反応を裏付けるように＞84kJ/molの大きな熱力学的駆動力を見せ、および／または生理条件下に遂行することができる。特に、生理的条件下で遂行することができ、および毒性または別なふうに有害な副産物を生成しないクリックケミストリー反応は、ヒドロゲルのインサイツ生成に好適である。クリックケミストリー反応に関与することができる反応性モイエティは、当技術における熟練の者によく知られ、および制限されないが、アルキンとアジド、アルケンとテトラゾールまたはテトラジン、またはジエンとジチオエステルが含まれる。抗原結合の関連において使用するのに適した他の適切な反応性クリックケミストリーモイエティは、当技術において熟練の者に知られる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原は、Spy tag（スパイ・タグ）/SpyCatcher（スパイキャッチャー）結合対を通して多価担体（例は、多価担体の粒子形成性タンパク質）に付着する。スパイ・タグ／スパイキャッチャー結合対は、Streptococcus pyogenes（ストレプトコッカス・ピオゲネス）からのFbaBのCnaB2ドメインの内部イソペプチド結合に基づくタンパク質ライゲーションシステムに言及する（例は、Zakeri（ザケリ）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ）2012; 109:E690-E697参照）。CnaB2は、二つの相補的なフラグメントに分かれ、および操作され、そのように第一のフラグメント（SpyCatcher）が、スパイキャッチャーにおけるリジンおよびSpyTag（スパイタグ）のアスパルテートの側鎖を通して第二のフラグメント（SpyTag）と結合し、および共有結合のアイソペプチド結合を形成できるようにされる。次いで、SpyTag/SpyCatcherが媒介した抗原の担体へのコンジュゲーションの結果として、複数のコロナウイルス抗原を提示する多価担体を生成することができる。SpyTag/SpyCather（スパイキャザー）結合システムは、いくらかの実施態様において、コロナウイルス抗原と多価担体の粒子形成性タンパク質との間の相互作用の安定性および特異性の改善を提供することができる。
いくらかの実施態様において、多価担体の粒子形成性タンパク質は、単一のタンパク質を作成するためにペプチド結合を介して一緒に接合された、少なくとも二つの関連のないタンパク質からのアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。例えば、コロナウイルスタンパク質抗原はSpyTagモチーフに融合されることができ、および担体サブユニット配列は、SpyCatcherモチーフに融合されることができる。あるいはまた、コロナウイルスタンパク質抗原は、SpyCatcherモチーフに融合させることができ、および担体サブユニット配列は、SpyTagモチーフに融合させることができる。複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原は、コロナウイルス抗原のC末端にてSpyTagを含むことができ、および複数の粒子形成性タンパク質の粒子形成性タンパク質は、粒子形成性タンパク質のN末端にてSpyCatcherを含む。
いくらかの実施態様において、粒子形成性タンパク質は、粒子形成性タンパク質のC末端にてmi3単量体サブユニットタンパク質およびN末端にてSpyCatcherタンパク質が含まれる融合タンパク質、または粒子形成性タンパク質のC末端にてAP205-CP3モノマーサブユニットタンパク質および粒子形成性タンパク質のN末端にてSpyCatcherタンパク質が含まれる融合タンパク質であることができ、そのようにSpyCatcherタンパク質は、コロナウイルス抗原のSpyTagに結合するために提示または表示される。
いくらかの実施態様において、複数のコロナウイルス抗原のコロナウイルス抗原は、コロナウイルスSタンパク質RBDを含み、およびコロナウイルスSタンパク質RBDは、コロナウイルスSタンパク質RBDのC末端にてSpy tagを含み、および複数の粒子形成性タンパク質の粒子形成性タンパク質は、粒子形成性タンパク質のN末端にてSpyCatcherを含む。
（多価の担体）
ここに記載されるいくらかの実施態様において、ここで使用される多価担体は、複数のコロナウイルスから導き出される複数のコロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルスは、互いに異なるものである。複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原と、第一のコロナウイルスとは異なる第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原とを含むことができる。
二つのコロナウイルスが、Coronaviridaeのファミリーにおける異なる株、種、亜属、属、亜科からのものを含め、異なる分類群からのものであるとき、一のコロナウイルスは、別のコロナウイルスと異なると考えられる。また、あるコロナウイルスは、二つのコロナウイルスが抗原的に分岐した（divergent）ウイルスであるとき、別のコロナウイルスと異なると考えられる。「抗原的に分岐したコロナウイルス」という用語は、変異する傾向を有するか、または経時的に変異を生じたコロナウイルスの株に言及し、このように免疫系に表示されるアミノ酸が変化させられる。そのような経時的な変異はまた「抗原性ドリフト」とも称することができる。
いくらかの実施態様において、少なくとも第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスは、Coronaviridaeのファミリー内の異なる属からのものである。いくらかの実施態様において、少なくとも第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスは、同じCoronaviridaeのファミリー内の異なる亜属からのものである。いくらかの実施態様において、少なくとも第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスは、同じCoronaviridaeのファミリー内の異なる種からのものである。いくらかの実施態様では、少なくとも第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスは、同じCoronaviridaeのファミリー内の異なる株である。
いくらかの実施態様において、多価担体は、複数のコロナウイルス抗原を含み、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも二、三、四、五、六、七、または八の異種コロナウイルス抗原を含み、それらの各々は、互いに異なるコロナウイルスのものか、またはそれから導き出される。
例えば、多価担体は、複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原、および第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原を含み、そこで第一のコロナウイルス、第二のコロナウイルスおよび第三のコロナウイルスは、互いに異なる。
多価担体は、複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原、第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原、および第四のコロナウイルスの第四のコロナウイルス抗原を含み、そこで第一のコロナウイルス、第二のコロナウイルス、第三のコロナウイルス、および四のコロナウイルスは、互いに異なる。
多価担体は、複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原、第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原、第四のコロナウイルスの第四のコロナウイルス抗原、および第五のコロナウイルスの第五のコロナウイルス抗原を含み、そこで第一のコロナウイルス、第二のコロナウイルス、第三のコロナウイルス、四のコロナウイルス、および第五のコロナウイルスは、互いに異なる。
多価担体は、複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原、第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原、第四のコロナウイルスの第四のコロナウイルス抗原、第五のコロナウイルスの第五のコロナウイルス抗原、および第六のコロナウイルスの第六のコロナウイルス抗原を含み、そこで第一のコロナウイルス、第二のコロナウイルス、第三のコロナウイルス、四のコロナウイルス、第五のコロナウイルス、および第六のコロナウイルスは、互いに異なる。
多価担体は、複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原、第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原、第四のコロナウイルスの第四のコロナウイルス抗原、第五のコロナウイルスの第五のコロナウイルス抗原、第六のコロナウイルスの第六のコロナウイルス抗原、および第七のコロナウイルスの第七のコロナウイルス抗原を含み、そこで第一のコロナウイルス、第二のコロナウイルス、第三のコロナウイルス、四のコロナウイルス、第五のコロナウイルス、第六のコロナウイルス、および第七のコロナウイルスは、互いに異なる。
多価担体は、複数の異種コロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、少なくとも第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原、第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原、第三のコロナウイルスの第三のコロナウイルス抗原、第四のコロナウイルスの第四のコロナウイルス抗原、第五のコロナウイルスの第五のコロナウイルス抗原、第六のコロナウイルスの第六のコロナウイルス抗原、第七のコロナウイルスの第七のコロナウイルス抗原、第八のコロナウイルスの第八のコロナウイルス抗原を含み、そこで第一のコロナウイルス、第二のコロナウイルス、第三のコロナウイルス、四のコロナウイルス、第五のコロナウイルス、第六のコロナウイルス、第七のコロナウイルス、および第八のコロナウイルスは、互いに異なる。
いくらかの実施態様において、多価担体は、複数のコロナウイルス抗原を含むことができ、複数のコロナウイルス抗原は、八つよりも多くの異種コロナウイルス抗原を含み、それらの各々は、互いに異なるコロナウイルス（即ち、異なる分類群のコロナウイルスおよび/または抗原的に分岐したウイルス）のものであるか、またはそれらから導き出される。
多価担体によって提示される異種コロナウイルス抗原の数は、異なる実施態様において異なることができる。いくらかの実施態様において、ここに記載の多価担体は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはこれらの値の任意の二つの間の数または範囲の、異種コロナウイルス抗原を提示することができる。
多価担体によって提示されるコロナウイルス抗原の合計数は、異なる実施態様において異なることができる。いくらかの実施態様において、多価担体は、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、せいぜい次の、またはせいぜいおよそ次の、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはこれらの値の任意の二つの間の数または範囲のコロナウイルス抗原の合計数を含むことができる。
いくらかの実施態様において、ナノ粒子によって提示されるコロナウイルス抗原の合計数が、脂質ベースのナノ粒子における粒子形成性脂質の数およびタンパク質ベースのナノ粒子における粒子形成性タンパク質の数などのような、ナノ粒子を構成する粒子形成性サブユニットの数によって制限されることが理解されるべきである。例えば、Thermotoga maritimaからのエンカプスリンタンパク質は、60-merを有するナノ粒子を形成する。したがって、カプセルリンベースのナノ粒子（例は、mi3ナノ粒子およびi301ナノ粒子）は、最大60のタンパク質抗原を提示することができる。いくらかの実施態様において、担体の粒子形成性サブユニットには、一よりも多くのコロナウイルス抗原を付着させることができる。
多価担体に付着した複数のコロナウイルス抗原は、同じタンパク質タイプまたは対応するタンパク質に属することができる。同じタンパク質タイプのコロナウイルス抗原は、同一のアミノ酸配列を有していても、またはそうでなくてもよいが、大抵は、いくらかの配列相同性を共有する。例えば、異なるコロナウイルスのコロナウイルスSタンパク質は、同じタンパク質タイプまたは対応するタンパク質に属する。別の例として、異なるコロナウイルスからのエンベロープタンパク質は、同じタンパク質タイプまたは対応するタンパク質と考えられる。いくらかの実施態様において、同じ機能を有する異なるコロナウイルス分類群のタンパク質は、同じタンパク質タイプまたは対応するタンパク質と考えられる。いくらかの実施態様では、同じタンパク質タイプのコロナウイルス抗原は、少なくとも50％の配列同一性、例えば少なくとも65％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、またはそれらよりも高い配列同一性を有する。
あるいはまた、いくらかの実施態様において、多価担体に付着した複数のコロナウイルス抗原は、異なるタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含むことができる。異なるタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質は、典型的には、異なる機能を有する。例えば、多価担体に付着した複数のコロナウイルス抗原は、コロナウイルスSタンパク質またはその一部分、ならびに他のコロナウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスNタンパク質またはその一部分、コロナウイルスHEタンパク質またはその一部分、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼまたはその一部分、コロナウイルス3CLプロテアーゼまたはその一部分、および／またはコロナウイルスMタンパク質またはその一部分などのようなものを含むことができる。
複数のコロナウイルス抗原の一またはそれよりも多く、または複数のコロナウイルス抗原の各々は、互いにおよそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の配列同一性であることができる（can a sequence identity）。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原は、それぞれ、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分を含み、コロナウイルスSタンパク質RBDsまたはその一部分は互いにおよそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の配列同一性を有する。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原は、それぞれ、配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくらかの実施態様では、複数のコロナウイルス抗原は、それぞれ、配列番号1-12および15-26から選ばれるアミノ酸配列を含む。
異なるコロナウイルスの付着コロナウイルス抗原の数は、同じか、または異なることができる。例えば、第一のコロナウイルスの第一のコロナウイルス抗原の数と第二のコロナウイルスの第二のコロナウイルス抗原の数は、1：50から50：1までの比率にあることができる（can be in）。いくらかの実施態様において、比率は、次の、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、せいぜい次の、せいぜいおよそ次の、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、21：1、22：1、23：1、24：1、25：1、26：1、27：1、28：1、29：1、30：1、31：1、32：1、33：1、34：1、35：1、36：1、37：1、38：1、39：1、40：1、41：1、42：1、43：1、44：1、45：1、46：1、47：1、48：1、49：1、50：1、51：1、52：1、53：1、54：1、55：1、56：1、57：1、58：1、59：1、60：1、61：1、62：1、63：1、64：1、65：1、66：1、67：1、68：1、69：1、70：1、71：1、72：1、73：1、74：1、75：1、76：1、77：1、78：1、79：1、80：1、81：1、82：1、83：1、84：1、85：1、86：1、87：1、88：1、89：1、90：1、91：1、92：1、93：1、94：1、95：1、96：1、97：1、98：1、99：1、100：1、またはそれらの値の任意の二つの間の数値もしくは範囲であることができる。いくらかの実施態様において、比率は、次の、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、せいぜい次の、せいぜいおよそ次の、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、21：1、22：1、23：1、24：1、25：1、26：1、27：1、28：1、29：1、30：1、31：1、32：1、33：1、34：1、35：1、36：1、37：1、38：1、39：1、40：1、41：1、42：1、43：1、44：1、45：1、46：1、47：1、48：1、49：1、50：1、51：1、52：1、53：1、54：1、55：1、56：1、57：1、58：1、59：1、60：1、61：1、62：1、63：1、64：1、65：1、66：1、67：1、68：1、69：1、70：1、71：1、72：1、73：1、74：1、75：1、76：1、77：1、78：1、79：1、80：1、81：1、82：1、83：1、84：1、85：1、86：1、87：1、88：1、89：1、90：1、91：1、92：1、93：1、94：1、95：1、96：1、97：1、98：1、99：1、100：1、またはそれらの値の任意の二つ間の数値もしくは範囲であることができる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルスのコロナウイルス抗原の数および別のコロナウイルスのコロナウイルス抗原の数は、1：50から50：1までの比率にあることができる。いくらかの実施態様において、比率は、次の、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、せいぜい次の、せいぜいおよそ次の、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、21：1、22：1、23：1、24：1、25：1、26：1、27：1、28：1、29：1、30：1、31：1、32：1、33：1、34：1、35：1、36：1、37：1、38：1、39：1、40：1、41：1、42：1、43：1、44：1、45：1、46：1、47：1、48：1、49：1、50：1、51：1、52：1、53：1、54：1、55：1、56：1、57：1、58：1、59：1、60：1、61：1、62：1、63：1、64：1、65：1、66：1、67：1、68：1、69：1、70：1、71：1、72：1、73：1、74：1、75：1、76：1、77：1、78：1、79：1、80：1、81：1、82：1、83：1、84：1、85：1、86：1、87：1、88：1、89：1、90：1、91：1、92：1、93：1、94：1、95：1、96：1、97：1、98：1、99：1、100：1、またはそれらの値の任意の二つの間の数値もしくは範囲であることができる。いくらかの実施態様において、比率は、次の、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、せいぜい次の、せいぜいおよそ次の、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、21：1、22：1、23：1、24：1、25：1、26：1、27：1、28：1、29：1、30：1、31：1、32：1、33：1、34：1、35：1、36：1、37：1、38：1、39：1、40：1、41：1、42：1、43：1、44：1、45：1、46：1、47：1、48：1、49：1、50：1、51：1、52：1、53：1、54：1、55：1、56：1、57：1、58：1、59：1、60：1、61：1、62：1、63：1、64：1、65：1、66：1、67：1、68：1、69：1、70：1、71：1、72：1、73：1、74：1、75：1、76：1、77：1、78：1、79：1、80：1、81：1、82：1、83：1、84：1、85：1、86：1、87：1、88：1、89：1、90：1、91：1、92：1、93：1、94：1、95：1、96：1、97：1、98：1、99：1、100：1、またはそれらの値の任意の二つの間の数値もしくは範囲であることができる。
ここに記載の多価担体は、広範な中和抗体を誘発することによって、広範な防御的抗コロナウイルス応答を誘導することができる。広範な中和抗体は、抗体を誘発するために使用されるコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスの分類群と同じであるだけでなく異なる分類群からのコロナウイルスを中和できる抗体である。広範な中和応答は、異種中和応答とも称することができる。いくらかの実施態様では、ここに記載の多価担体は、多価担体を生産するためにコロナウイルス抗原が由来するコロナウイルスの亜科、属、亜属、種、および／または株とは異なる亜科、属、亜属、種、および／または株からの一またはそれよりも多くのコロナウイルスを中和する広義の中和抗体を誘発することができる。
いくらかの実施態様において、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルスからの異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスに対してだけではなく、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスとは異なる一またはそれよりも多く（一以上とも言う）のコロナウイルス（例は、第三のコロナウイルス、第四のコロナウイルスなど）に対して異種結合および中和応答を誘導することができる。特に、一以上の特定のコロナウイルスを含まない複数のコロナウイルスからの異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、一以上の特定のコロナウイルスに対する異種結合および中和応答を誘導することができる。
例えば、SARS-CoV2およびSHC014-CoVからのコロナウイルス抗原を用いて多価担体を構築した場合、そのような多価担体によって誘発される抗体は、SARS-CoV2およびSHC014-CoV以外の属、亜属、種および／または株の一以上のコロナウイルスを中和することが可能である。別の例として、WIV1、Rf1、RmYN02およびpang17からのコロナウイルス抗原を用いて構築される多価担体は、WIV1、Rf1、RmYN02およびpang17だけではなく、SARS-CoV2、SHC014、SARS-CoV、Yun11、BM-4831およびBtKY72などのような他のコロナウイルスに対する異種結合および中和応答を誘発することができる（例えば、図３Ｃ－Ｆを参照）。さらに別の例では、SARS-CoV-2、SHC014、RaTG13、およびRs4081からのコロナウイルス抗原を用いて構築される多価担体は、SARS-CoV-2、SHC014、RaTG13、およびRs4081に対してだけではなく、WIV1、SARS-CoV、Yun 11、BM-4831およびBtKY72などのような他のコロナウイルスに対しても異種結合および中和応答を誘発することができる（例えば、図３Ｃ－Ｆを参照）。
いくらかの実施態様において、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルスからの異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、ほぼ同じまたは同等の大きさ（例は、互いに関しておよそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、140％、150％、またはこれらの値の任意の二つの間の数もしくは範囲）の、第一のコロナウイルスまたは第二のコロナウイルスからの単一コロナウイルス抗原の相同集団を含む一価の担体（また「同型ナノ粒子」とも称される）と比較したときの第一のコロナウイルスおよび／または第二のコロナウイルスに対する免疫応答を誘導することができる。言い換えれば、異なる分類群のコロナウイルスからのコロナウイルス抗原の共表示は、コロナウイルスからの抗原を提示する同型担体（例は、同型SARS-CoV2ナノ粒子）に関してコロナウイルス（例は、SARS-CoV）に対する免疫応答を低下させることはない。非制限的な例では、SARS-CoV2に対する免疫応答の大きさの点で、それはSARS-CoV2タンパク質抗原ならびに他のコロナウイルスタンパク質抗原も含むモザイクナノ粒子により免疫化を行うことについて、同型SARS-CoV2ナノ粒子に対して有利となることができる（例は、図３Ｃ参照）。
いくらかの実施態様において、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルスからの異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、第一のコロナウイルスまたは第二のコロナウイルスからの単一のコロナウイルス抗原の相同集団を含む一価担体と比較するとき、第一のコロナウイルスおよび／または第二のコロナウイルスに対する免疫応答の増大した大きさを誘導することができる。多価担体によって誘導される免疫応答の大きさは、一価担体によってよりも、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、0.2、0.5、0.9、1.1、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、倍数（複数形）（fold（s））、または任意のこれらの値の数もしくは範囲で大きいことができる。いくらかの実施態様では、多価担体によって誘導される免疫応答の大きさは、一価担体によってものと比較して、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、5%、10%、20%、30%、50%、75%、100%、110%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、または任意のこれらの値の間の数もしくは範囲によって増大することができる。
いくらかの実施態様において、多価担体は、特定のコロナウイルスからのコロナウイルス抗原を提示しないが、例えば、その特定のコロナウイルスからのコロナウイルス抗原を提示する一価担体と比較して、同等またはさらに増強された大きさにて、その特定のコロナウイルスに対する広範な中和抗体をなお生産することができる。例えば、第一のコロナウイルスを含まない複数のコロナウイルスからの異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、第一のコロナウイルスからの単一のコロナウイルス抗原の相同集団を含む一価担体と比較するとき、ほぼ同じまたは同等の大きさ（例は、互いに関して、およそ次の、少なくとも次の、少なくともおよそ次の、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、140％、150％、または任意のこれらの値の間の数値もしくは範囲）の、第一のコロナウイルスに対する免疫応答を誘導することができる。
いくらかの実施態様において、第一のコロナウイルスを含まない複数のコロナウイルスからの異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、第二のコロナウイルスからの単一のコロナウイルス抗原の相同集団を含む一価担体と比較したとき、第一のコロナウイルスに対する強化された異種結合および中和性応答を引き出すことができる。第一および第二のコロナウイルスは、互いに異なる。多価担体によって誘導される中和応答の大きさは、一価担体によるものより、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、0.2、0.5、0.9、1.1、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍、または任意のこれらの値の間の数値もしくは範囲で大きいことができる。いくらかの実施態様では、多価担体によって誘導される免疫応答の大きさは、一価担体によるものと比較して、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、5%、10%、20%、30%、50%、75%、100%、110%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、または任意のこれらの値の間の数もしくは範囲で増大することができる。
いくらかの実施態様において、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスを含む複数のコロナウイルスからの異種コロナウイルス抗原を含む多価担体は、第一のコロナウイルスまたは第二のコロナウイルスからの可溶性コロナウイルス抗原と比較するとき、第一のコロナウイルスおよび／または第二のコロナウイルスに対する実質強化された中和性応答を誘発することができる。多価担体によって誘導される中和性応答の大きさは、可溶性コロナウイルス抗原によってよりも、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍、または任意のこれらの値の間の数値または範囲で大きいことができる。
ここに記載される多価担体は、当技術において熟練する人物に知られる任意の標準分子生物学的手順ならびにここに例証されるプロトコル（例は、例２を参照）を使用して調製することができる。いくらかの実施態様では、粒子形成性サブユニットおよび／またはコロナウイルスタンパク質抗原は、当技術において熟練の者に知られる液相または固相の化学タンパク質合成法によって生産することができる。
粒子形成性サブユニットおよび／またはコロナウイルスタンパク質抗原の生産は、当技術においてよく知られる組換えDNA技術を用いることができる。例えば、タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原またはタンパク質タグにより機能化されたコロナウイルスタンパク質抗原は、当技術において熟練する人物に知られる細胞ベースまたは細胞フリー法などのような生合成法を使用して合成することができる。タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原は、コロナウイルスタンパク質抗原をコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて生産することができる。核酸分子は、制限されないが、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、終結部位、および翻訳開始部位を含め、適切な調節要素に作動可能に連結することができる。ベクターはまた、一以上のタンパク質タグ（例は、ポリ(His)タグ、SpyTag）をコードする核酸分子を含むことができる。いくらかの実施態様において、ベクターは、三量化モチーフ（例は、T4フィブリチンまたはウイルスカプシドタンパク質SHPからのフォールドン（foldon）三量化ドメイン）をコードする核酸分子を追加的に含むことができる。ベクターはまた、タンパク質を適当な細胞経路に導くシグナルペプチド、例えば、発現したタンパク質を上清媒体中に分泌するためのシグナルペプチドをコードする核酸分子を含むことができる。ベクターは、一以上の選定可能なマーカー遺伝子、例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性を提供する遺伝子などのようなものを含み得る。核酸構築物の構築のための方法は、よく知られている。例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition（モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、第3版）、Sambrookら、2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）、およびCurrent Protocols in Molecular Biology（カレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー）、Ausubel et al. eds.（オースベルら編）、John Wiley & Sons（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）、1994参照。タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原のタンパク質生合成は、タグ付きコロナウイルスタンパク質抗原をコードする発現ベクターにより細胞ベースまたは細胞フリータンパク質翻訳システムを提供することによって実行することができる。同様に、タグ付き粒子形成性タンパク質は、粒子形成性サブユニットをコードする核酸分子およびタンパク質タグ（例は、SpyCatcher）をコードする核酸分子を含む発現ベクターを使用して生産することができる。模範的な実施態様では、多価担体は、Cohen（コーエン）AAら、2021、PLoS ONE 16(3)：e0247963に記載のプロトコルに従って生産され、その内容は参照によってここに組み込まれる。
いくらかの実施態様において、担体サブユニットおよびコロナウイルス抗原を発現する構築物は、宿主または形質転換コンピテント細胞中に一緒に導入することができる。多価担体は、発現したコロナウイルス抗原をここに記載の官能基対または反応性モイエティ対（例は、SpyTag/SpyCatcher）を通して自己集合した（self-assembled）ナノ粒子へのコンジュゲーションの結果として生成することができる。
担体（例は、SpyCatcherを有するナノ粒子）およびコロナウイルス抗原（例は、SpyTaggedタンパク質抗原）は、例えば、別々に調製し、および次に、ある条件下（例は、室温でのTBS緩衝剤において）に、一定の時間期間（例は、およそ次の、少なくとも次の、または少なくともおよそ次の、1時間、2時間、5時間、10時間、12時間、15時間）、担体とコロナウイルス抗原のコンジュゲーションを可能にするためにインキュベーションすることができる。いくらかの実施態様では、コロナウイルスタンパク質抗原は、担体の粒子形成性サブユニットと比較して、過剰量で、例えば、粒子形成性サブユニットよりも、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれらよりも多くなどのようなものにおいて提供される。
＜薬剤組成物および治療用途＞
（ワクチン組成物）
また、ここに記載のような多価担体を一以上の適合性の、および薬学的に許容可能な担体と組合せて含むワクチン組成物がここに提供される。ワクチン組成物は、対象において防止的（例は、疾患の発生を防止または遅延させること、またはその臨床的もしくは不顕性兆候の発現を防止すること）または治療的（例は、兆候の抑圧もしくは緩和）免疫応答を誘発することができる薬剤組成物である。
「薬学的に許容可能な」という句は、ここにおいて、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、痛み、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、人間および動物の組織と接触して使用するのに適している、妥当な利益/リスク比につり合ったそれらの薬剤、物質、組成物、および／または剤形について言及される。
ここで使用する「薬学的に許容可能な担体」という句は、薬学的に許容可能な物質、組成物またはビヒクルで、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化物質などのようなもの、対象化学物質をある器官または体の一部分から別の器官または体の一部分に運ぶまたは輸送するのに関与するものを意味する。各担体は、調剤物の他の成分と適合し、および対象に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として役立つことができる物質のいくらかの例は、以下を含む：（1）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどのようなもの；（2）スターチ、例えば、コーンスターチおよびポテトスターチなどのようなもの；（3）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのようなもの；（4）粉末トラガカント：（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）タルク；（8）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックスなどのようなもの；（9）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油などのようなもの；（10）グリコール、例えば、プロピレングリコールなどのようなもの；（11）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのようなもの；（12）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのようなもの；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどのようなもの；（15）アルギン酸；（16）パイロジェンフリー水；（17）等張セーリーン；（18）リンガー溶液；（19）エチルアルコール；（20）リン酸緩衝溶液；および（21）薬剤調剤物において採用される他の非毒性の適合物質である。
いくらかの実施態様において、薬学的に許容可能な担体は、薬学的に許容可能な塩を含む。ここで用いるように、「薬学的に許容可能な塩」は、ここに記載の組成物の成分の一つの酸形態の塩を含む。これらには、アミンの有機または無機酸性塩が含まれる。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容可能な塩は、当技術において熟練する者によく知られ、および多様な無機および有機酸の塩基性塩が含まれる。
ワクチン組成物は、適切なアジュバントをさらに含むことができる。アジュバントは、対象における免疫応答を増強、改善または別なふうに調整するために、ここに記載のタンパク質抗原と組み合わせる能力がある任意の免疫調節性物質に言及する。アジュバントは、当技術で知られる任意の多様なアプローチ（variety approaches）を介して多価担体の表面に共有結合的または非共有結合的に付着またはカップリングさせることができる。担体に付着させることができる模範的なアジュバントには、制限されないが、免疫刺激ペプチド、オリゴヌクレオチドCpGモチーフ、免疫刺激炭水化物および多糖類、および免疫刺激タンパク質またはペプチド分子（例は、サイトカイン、ケモカイン、フラジェリン、およびそれらの誘導体）、フロイントアジュバント（Freund's adjuvant）、サパニン（sapanin）（例は、Matrix M1（マトリクスM1））、レシチン、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドA、インターロイキン-12、STINGアゴニスト、Advax（アドバックス）、およびAS01B、STINGアゴニスト（例は、ビス-(3',5')-サイクリックダイメリックグアノシン一リン酸（cyclic dimeric guanosine monophosphate）（c-ジGMPまたはcdGMP））が含まれる。
ここに記載されるいくらかの実施態様において、ワクチン組成物には、アルミニウム塩ベースのアジュバント（例は．水酸化アルミニウム、アルハイドロゲル（alhydrogel））、エマルションアジュバント（例は、AddaVaxTM（アダヴァックス、TMは米国等でのトレードマーク表示）、MF59(R)（(R)は米国等での登録商標表示）、AS03、フロイントアジュバント、Montanide ISA51）、およびトール様受容体アゴニスト（例は、CpG、ポリI:C、グルコピラノシル脂質A（GLA）、フラジェリンおよびレシキモド（R848））を含むか、またはそれらからなる群より選ばれる一以上のアジュバントが含まれる。熟練する人物であれば理解できるように、MF58(R)およびAddaVaxTMの双方は、スクアレンベースの水中油型ナノエマルションである。
ワクチン組成物は、多様な投与様式のために調剤することができる。調剤物および投与のための技術は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンズ・ファーマスーティカル・サイエンシーズ）」、18thed.（第18版）、1990年、Mack Publishing Co.（マック・パブリッシング社）、Easton（イーストン）、Pa（ペンシルベニア州）に見出すことができる。いくらかの実施態様において、本開示のワクチン組成物は、以下のために適合されたものを含め、固形または液状形態での投与のために特別に調剤され得る：（1）経口投与、例えば、ドレンチ（水性または非水性の溶液または懸濁物）、錠剤、ボーラス、粉体、顆粒、ペースト；（2）非経口投与、例えば、滅菌溶液または懸濁物として、例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射によって：（3）局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏またはスプレーとして；（4）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリームまたはフォームとして；または（5）エアゾール、例えば、ヒドロゲル組成物を含め、水性エアゾール、リポソーム調剤物または固形粒子として、である。薬剤組成物は一以上の薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
本開示の方法において有用な調剤物には、経口、鼻腔、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣、エアゾールおよび／または非経口投与に適したものが含まれる。調剤物は、単位剤形において好都合に提示され得、および薬学の技術においてよく知られる任意の方法によって調製され得る。単一の剤形を生産するために薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができる活性原料の量は、処理される宿主、特定の投与様式に応じて変動する。単一の剤形を生産するために薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができる活性原料の量は、概して、治療効果または免疫応答をもたらす多価担体のその量である。概して、百パーセントのうち、この量は、活性原料の約1％から約99％まで、なるべくなら約5％から約70％まで、最もなるべくなら約10％から約30％までに及ぶ。
経口投与に適した調剤物は、カプセル、カシェ剤（cachets）、ピル、錠剤、トローチ剤（lozenges）（風味のあるベース、通常はスクロースとアカシアまたはトラガカントを使用）、粉体、顆粒の形態において、または水性もしくは非水性液体における溶液または懸濁物として、または水中油型もしくは油中水型の液状エマルションとして、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香錠（pastilles）（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどのようなものを使用）として、および／または洗口剤およびその他同種類のものなどとしてであってよい。
経口投与用の固形剤形（カプセル、錠剤、ピル、ドラジェ、粉体、顆粒およびその他同種類のものなど）において、多価担体は、一以上の薬学的に許容可能な担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどのようなもの、および／または任意の以下のものと混合する：（1）充填剤または増量剤（extenders）、例えば、スターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などのようなもの；（2）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどのようなもの；（3）保湿剤（humectants）、例えば、グリセロールなどのようなもの；（4）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ポテトまたはタピオカスターチ、アルギン酸、一定のシリカート、および炭酸ナトリウムなどのようなもの；（5）溶解遅延剤（solution retarding agents）、例えば、パラフィンなどのようなもの；（6）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物などのようなもの；（7）湿潤剤（wetting agents）、例えば、アセチルアルコールおよびグリセロールモノステアラートなどのようなもの；（8）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイなどのようなもの；（9）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール（solid polyethylene glycols）、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などのようなもの；および（10）着色剤である。カプセル、錠剤および丸薬の場合、薬剤組成物はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様のタイプの固形組成物は、ラクトースまたはミルクシュガー、ならびに高分子量ポリエチレングリコールおよびその他同種類のものなどのような賦形剤を用いて、軟および硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として採用してもよい。
経口投与用の液状剤形には、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが含まれる。活性原料に加えて、液状剤形は、当技術において普通に使用される不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶剤、可溶化剤および乳化剤などのようなもの、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油（特に、綿実、ラッカセイ、コーン、胚芽、オリーブ、キャスター（ひまし油）およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などのようなものを含み得る。
ワクチン組成物は、注射によって、例は、ボーラス注射または持続注入によって、非経口投与のために調剤することができる。注射用の調剤物は、単位剤形において、例は、アンプルまたはマルチ用量容器において、随意に、添加した保存剤と共に提供することができる。薬剤組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁物、溶液またはエマルションとしてさらに調剤することができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含め、他の薬剤を含み得る。
（適用）
ここに開示されるワクチン組成物は、必要がある対象において免疫応答を刺激するため、必要がある対象においてコロナウイルス感染を処理または防止するため、および／または必要がある対象においてコロナウイルスによって起因する疾患または障害を処理または防止するために、多様な治療上の、または防止の用途において採用することができる。
ここで使用するように、「処理」または「処理する」という用語は、ペイシェント（人間で言う患者）によって明らかになった疾患、障害または生理学的状態（例は、コロナウイルス感染）に応じて行われる介入に言及する。処理の目的には、制限されないが、兆候の緩和または防止や、疾患、障害または状態の進行または悪化の減速または停止、および疾患、障害または状態の寛解の一以上を含み得る。「処理する」および「処理」という用語は、例えば、治療上の処理、予防的処理、および対象が障害または他の危険因子を発生させるリスクをあるものにより低減させる用途を含む。処理は、障害の完全な治癒を必要とせず、およびあるものにより兆候または根底にある危険因子が軽減される実施態様を包含する。いくらかの実施態様において、「処理」は、治療上の処理および予防的または防止的措置の双方に言及する。処理が必要なものには、疾患もしくは障害または望ましくない生理的状態に既に冒されたそれらのもの、ならびに疾患もしくは障害または望ましくない生理的状態が予防されるべきそれらのものが含まれる。ここで使用するように、「防止」という用語は、個体が後にそれらの兆候を発現する負担を軽減する任意の活動に言及する。これは、一次、二次および／または三次の防止レベルで行うことができ、そこで：a）一次防止は、兆候／障害／状態の発達を回避し；b）二次防止活動は、状態／障害／兆候の処理の早期段階を目的としており、それによって状態／障害／兆候の進行および兆候の出現を防ぐように介入のための機会が増加し；およびc）三次防止は、例えば、機能を回復し、および／または任意の状態／障害／兆候もしくは関連合併症を低減することによって既に確立した状態／障害／兆候の負のインパクトを低減する。「防止」という用語は、ある事象の可能性の100％排除を必要としない。むしろ、それは化合物または方法の存在下で、その事象の発生の可能性が減少していることを表示する。
ここで使用されるように、用語「状態」は、個体の身体（全体として、または一以上のその部分として）の身体状況を指し示し、それは個体について完全な身体的、精神的および社会的な健康（well-being）の状態に関係する標準的な身体状況に適合していない。ここに記載される状態には、障害および疾患が含まれるが、それらには制限されず、そこで用語「障害」は、身体またはその部分のいずれかの機能異常と関連する生きた個体の状態を指し示し、および用語「疾患」は、身体または任意のその部分の正常機能を損ない、および区別できる徴候および兆候（signs and symptoms）によって典型的に明示される生きた個体の状態を指し示す。
コロナウイルス感染によって生じる疾患または障害を明示する徴候および兆候には、制限されないが、発熱、咳、倦怠、味覚または嗅覚の喪失、息切れまたは呼吸困難、筋痛、悪寒、咽喉痛、鼻汁、頭痛、胸痛、急性カタル性結膜炎（pink eye）（結膜炎）、吐き気、嘔吐、下痢、発疹、肺炎および急性呼吸促迫症候群が含まれる。コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害には、重度の合併症も含まれ得、制限されないが、不整脈、心筋症、急性心外傷（acute cardiac injury）を含む心臓障害、血栓塞栓症および肺塞栓、播種性血管内凝固（DIC）、出血、および動脈血栓形成を含む凝固障害、ギラン・バレー症候群、敗血症、ショック、多臓器不全、および多系統炎症症候群、ならびにそれらの任意の組合せが含まれる。
ここで使用されるように、「対象」、「必要がある対象」、および「個体」という用語は、動物、および特に、高等動物、および特に、脊椎動物、例えば、哺乳動物類などのようなもの、およびより一層特に、人間に言及する。いくらかの実施態様において、対象または個体は、コロナウイルスに曝露されている。「曝露された」という用語は、対象が、コロナウイルスに感染していることが知られている人物または動物と接触したことを指し示す。いくらかの実施態様では、必要がある対象は、コロナウイルスに曝露されたか、または曝露される危険性のある健康な対象であることができる。いくらかの実施態様では、必要がある対象は、コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を既に患っているもの、またはコロナウイルス感染と診断されたものを含む。
したがって、ワクチン組成物は、任意の症状に先立って、例えば、コロナウイルス感染に先立って投与することができる。ワクチン組成物はまた、疾患または感染の兆候の発生にて、またはその後、例えば、感染の兆候の発達後または感染の診断後に投与することができる。
ここで使用するように、「治療上有効な量」という句は、ここに開示する多価担体のその量を意味し、それはいくらかの望ましい治療効果の生成および／または望ましい反応の生成、例えば、合理的な利益／リスク比で、状態または疾患、例えば、肺炎などのようなものの徴候または兆候を低減または除去するなどのようなものに有効である。治療上有効な量はまた、当技術において熟練する人物に理解されるように、多価担体の構造および抗原、利用される投与経路、および処理される特定の疾患または障害に依存して変動する。例えば、与えられた臨床的処理が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータにおいて少なくとも20％の減少があるときに有効であると考えられる場合、その疾患または障害の処理のための多価担体の治療上有効な量は、その測定可能なパラメータにおいて少なくとも20％の減少を達成するのに必要な量である。
いくらかの実施態様において、治療上有効な量は、コロナウイルス複製を抑制するために、またはウイルス感染の外見上の症状を測定可能に緩和するために、または疾患、状態、もしくは障害のさらなる発達を抑制するために必要である。いくらかの実施態様では、治療上有効な量は、コロナウイルス感染によって生じさせることができる一以上の徴候または兆候を防止する量である。いくらかの実施態様では、治療上有効な量は、特定の疾患または状態の一以上の徴候または兆候、例えば、コロナウイルス感染に関係する一以上の徴候または兆候などのようなものを発達させることから防ぐ量であることができる。
ここに記載のワクチン組成物の治療上有効な量は、細胞培養アッセイから得られたデータから見積もることができ、および動物試験で得られたデータからさらに決定され、ヒト臨床試験によってフォローアップされる。例えば、ここに記載のワクチン組成物の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な製薬上の手順、例は、LD50（集団の50％までの致死する用量）およびED50（集団の50％における治療上有効な用量）を決定するためのものによって決定することができる。毒性および治療効果の間の用量比は、治療指数であり、およびそれは比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を見せる組成物が好ましい。
いくらかの実施態様において、ワクチン組成物の治療上有効な量の決定は、コロナウイルスに対して生産される抗体の力価を計測することによって測定することができる。抗体力価を決定する方法およびウイルス中和アレイを実行する方法は、当技術において熟練する者に知られ、ならびに本開示の例のセクションに例証される（例えば、例２参照）。
いくらかの実施態様において、必要がある対象における免疫応答を刺激する方法がここに開示され、本方法は、薬学的に有効な量のワクチン組成物を対象に投与することを含み、それによって必要がある対象における免疫応答が刺激される。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物を投与することは、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスに対する中和応答を誘導する。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原がワクチン組成物を生産するために導き出されるそれらのコロナウイルスとは異なる追加のコロナウイルスに対する中和応答が誘導される。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、ワクチン組成物を生産するために複数のコロナウイルス抗原が導き出されるそれらのコロナウイルスに対する中和応答が誘導される。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス感染を処理または防止する、その必要がある対象における方法が開示され、本方法は、ここに記載のワクチン組成物の薬学的に有効な量を対象に投与することを含み、それによって対象におけるコロナウイルス感染が処理または防止される。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物を投与することは、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる感染を処理または防止することをもたらす。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原がワクチン組成物を生産するために導き出されるそれらのコロナウイルスとは異なる追加のコロナウイルスによって引き起こされる感染を処理または防止することがもたらされる。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原がワクチン組成物を生産するために導き出されるそれらのコロナウイルスによって引き起こされる感染を処理または防止することがもたらされる。
いくらかの実施態様において、コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を処理または防止する、その必要がある対象における方法が開示され、本方法は、ここに記載のワクチン組成物の薬学的に有効な量を対象に投与することを含み、それによって対象においてコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害が処理または防止される。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物を投与することは、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を処理または防止することがもたらされる。いくらかの実施態様において、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原がワクチン組成物を生産するために導き出されるそれらのコロナウイルスとは異なる追加のコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を処理または防止することがもたらされる。いくらかの実施態様では、ワクチン組成物を投与することは、複数のコロナウイルス抗原がワクチン組成物を生産するために導き出されるそれらのコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を処理または防止することがもたらされる。
いくらかの実施態様において、ワクチン組成物は、広範に保護的な抗コロナウイルス応答を誘導することによって、コロナウイルス感染またはそのような感染によって引き起こされる疾患および障害の広いスペクトルを処理および防止するために使用することができる。例えば、ここに記載のワクチン組成物は、ワクチン組成物を生産するためにコロナウイルス抗原が導き出されるコロナウイルスの亜科、属、亜属、種、および／または株とは異なる亜科、属、亜属、種、および／または株からの一以上のコロナウイルスが中和される広義の中和抗体を誘発することができる。
ここに記載のワクチン組成物は、当技術において熟練する者によく知られた技術、例えば、注射、吸入または絶縁（insulation）などのようなものを用いて、あるいは経口、非経口または直腸投与によって投与することができる。ワクチン組成物は、制限されないが、伝統的な注射筒および無針注射装置が含まれる手段によって投与することができる。好適な投与経路には、制限されないが、非経口デリバリー、例えば、筋肉内、皮内、皮下、髄内、ならびに、髄腔内、直接脳室内（direct intraventricular）、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が含まれる。注射のために、ここに記載のワクチン組成物は、水溶液において、なるべくなら生理学的に適合する緩衝剤、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理的セーリーン緩衝剤などのようなものにおいて調剤することができる。
いくらかの実施態様において、多価担体およびそのワクチン組成物は、対象に対して体系的に投与することができる。ここで使用される「全身的投与」という文言は、任意の投与経路を指し示し、それによってワクチン組成物が個体の身体と接触させられ、それゆえ、身体において結果として得られる組成物の位置は全身的である（即ち、ワクチンが投与される特定の組織、器官または他の身体部分に制限されない）。全身的投与には、経腸および非経口投与が含まれる。経腸投与は、物質が消化管を介して与えられる全身投与経路であり、および制限されないが、経口投与、胃栄養チューブ（gastric feeding tube）による投与、十二指腸栄養チューブによる投与、胃瘻造設、経腸栄養、および直腸投与が含まれる。非経口投与は、物質が消化管以外の経路によって与えられる全身的投与経路であり、および制限されないが、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内、投与（intradermal, administration）、腹腔内投与、および膀胱内注入（intravesical infusion）が含まれる。
ここに開示されるワクチン組成物はプライム／ブーストプロトコルを用いて対象において投与することができる。そのようなプロトコルにおいて、第一のワクチン組成物を対象に投与し（プライム）、および次いで一定期間後に第二のワクチン組成物を対象に投与することができる（ブースト）。第二の組成物（ブースト組成物）の投与は、第一の組成物（プライム組成物）の投与から数日、数週間または数か月後に行うことができる。例えば、ブースト組成物は、プライム組成物が投与されて後、約三日、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、12週間、16週間、20週間、24週間、もしくは28週間、またはこれらの値の任意の二つの間の数もしくは範囲で投与することができる。いくらかの実施態様では、ブースト組成物はプライム組成物の投与後約4週間に投与することができる。
したがって、ワクチン組成物は、必要がある対象に二回以上投与することができる。例えば、ここに記載される方法は、対象において第一のワクチン組成物を投与すること、および一定期間後に、対象に第二のワクチン組成物を投与することを含むことができる。
プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物は、同じ組成物であることができるが、そうである必要はない。いくらかの実施態様では、プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物は、多価担体に付着した同じか、または異なるコロナウイルス抗原を含むことができる。いくらかの実施態様において、プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物は、多価担体に結合した同じコロナウイルス抗原を含むことができるが、異なる薬学的有効量においての多価担体を伴う。いくらかの実施態様では、プライムワクチン組成物およびブーストワクチン組成物は、異なるアジュバントを含有することができる。いくらかの実施態様では、プライムワクチン組成物はここに開示される多価担体を含む。
多価担体およびそのワクチン組成物は、異種コロナウイルス（例は、異なる分類群のコロナウイルス）による感染に対して対象を保護するために使用することができる。言い換えれば、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスのコロナウイルス抗原を用いて作成されたワクチン組成物は、第一のおよび第二のコロナウイルス（即ち、一致した株）のみならず、異なる分類群のコロナウイルス（即ち、不一致株または第一のおよび第二のコロナウイルスとは異なるコロナウイルス株）による感染に対して個体を保護する能力がある。例えば、WIV1、Rf1、RmYN02およびpang17からのコロナウイルス抗原を使用して作られたワクチン組成物は、広範な中和性抗体を引き出すことができ、それによって同等の大きさでWIV1、Rf1、RmYN02およびpang17のみならず、コロナウイルスSARS-CoV2、SHC014、SARS-CoV、Yun 11、BM-4831およびBtKY72（例は、図３Ｃ－Ｆを参照）による感染に対して対象が保護される。
いくらかの実施態様において、多価担体およびそのワクチン組成物は、抗原的に分岐したコロナウイルスによる感染に対して個体を保護することができる。したがって、いくらかの実施態様では、第一のコロナウイルスおよび第二のコロナウイルスのコロナウイルス抗原を使用して作られたワクチン組成物はまた、第一のおよび第二のコロナウイルスの新興コロナウイルス多様体による感染から個体を保護する能力もある。例えば、SARS-CoV2およびSHC014のコロナウイルス抗原を使用して作成されたワクチン組成物は、抗原的に分岐したSarbecovirusのコロナウイルス株による、および将来的に分岐するコロナウイルス株による感染から個体を保護することができる。
＜キット＞
ここに記載のように、多価担体および多価担体を含むワクチン組成物は、キットの構成要素として提供することができる。
キットは、本開示の多価担体またはワクチンだけでなく、そのような多価担体およびワクチンを作成するための構成要素も含むことができる。そのようなものとして、キットは、例えば、プライマー、核酸分子、発現ベクター、ここに記載のタンパク質抗原および／または粒子形成性サブユニットをコードする核酸構築物、細胞、緩衝剤、基質、試薬、投与手段（例は、注射筒）、および前記構成要素のいずれかの使用についての指示を含むことができる。キットはまた、ここに記載の前もって形成された担体およびコロナウイルスタンパク質抗原を含むことができる。キットは、前述の、または関連する、構成要素のいずれかを含む一よりも多くの容器を含むことができることを認めるべきである。例えば、キットの一定の部分は冷蔵を必要とし得る一方、他の部分は室温で貯蔵することができる。このように、ここで使用する場合、キットは、そこに含まれる構成要素が一緒に使用されることを意図して、一以上の実体によって別々の容器において販売される構成要素を含むことができる。
上述した実施態様のいくらかの態様は、以下の例においてさらに詳細に開示されるが、それらは決して本開示の範囲を制限することを意図しない。
＜例１＞
モザイクナノ粒子の模範的な実施態様は、マウスにおける人獣共通コロナウイルスに対する交差反応性免疫応答を引き出す
目下のSARS-CoV-2ワクチン候補のほとんどは、スパイク三量体（S）で、そのウイルスタンパク質を含み、それはそのRBDsの一以上が宿主受容体と結合するために「アップ」位置を採用して後、標的細胞の侵入を媒介する（図１Ａ）。ヒトコロナウイルスSARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-NL63、および関連動物コロナウイルス（WIV1およびSCH014）のRBDsは、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）をそれらの宿主受容体として使用し、その一方で他のコロナウイルスは受容体、例えば、ジペプチジルペプチダーゼ4またはシアル酸などのようなものを使用する。ウイルスの侵入におけるその機能と一致して、Sは中和抗体の主要な標的であり、多くがRBDを標的としている。
何らの特定の理論に縛られることなく、抗原の多価表示は、B細胞応答を高め、および一価の抗原よりも長持ちする免疫を提供することができ、このようにタンパク質ベースのワクチン候補には、抗原の多量化を可能にするナノ粒子がしばしば含まれる。ワクチン設計のために、多くのナノ粒子およびカップリング戦略が探索され、「プラグ・アンド・ディスプレイ」戦略は特に有用である。そのようなアプローチの一つでは、ウイルス様粒子のサブユニットに融合したスパイキャッチャー（SpyCatcher）と呼ばれるエンジニアリングタンパク質（engineered protein）ドメインの複数のコピーが、13残基のスパイタグ（SpyTag）によりタグ付けされた精製抗原に対して自発的イソペプチド結合を形成する。スパイキャッチャー－スパイタグシステムは、中和抗体の高力価を引き出す多量体化SARS-CoV-2 RBDまたはS三量体を調製するために使用した。SARS-CoV-2に対する保護は有望であるが、コウモリにおけるコロナウイルス保有宿主は将来の種を超えた伝搬を示唆し、SARS-CoV-2と同様に新興コロナウイルスに対して保護するワクチンが必要である。ここに、スパイキャッチャー003-mi3ナノ粒子は調製され、ヒトおよび動物コロナウイルスからのスパイタグドRBDsを同時に表示し、インフルエンザヘッドドメインモザイク粒子について前に論証されたように、モザイク粒子が交差反応性抗体応答を引き起こすことができるかどうかを評価する。同型またはモザイクのナノ粒子により免疫したマウスは、SARS-CoV-2感染によってヒトにおいて引き出されるプラズマ抗体（plasma antibodies）とは対照的に、幅広い結合および中和応答を生成した。さらに、モザイクナノ粒子は、同型SARS-CoV-2ナノ粒子と比較して、ヒトおよびコウモリSARS様ベータコロナウイルス（サルベコウイルス）に対する強化された異種結合および中和特性を示した。
SARS-CoV-2およびSARS関連の緊急人獣共通感染症コロナウイルスに対する保護が差し迫って必要とされている。この例では、SARS-CoV-2のRBDを表示する、またはSARS-CoV-2のRBDを共表示する同型ナノ粒子は、ヒトへの脅威を表す動物ベータコロナウイルスからのRBDsと一緒に作成した（モザイクナノ粒子；4-8の別個のRBDs）。免疫したマウスは、RBD-ナノ粒子により、可溶性抗原ではなく、交差反応性の結合および中和応答を引き出した。モザイクRBDナノ粒子は、同型のSARS-CoV-2-RBDナノ粒子またはCOVID-19回復期ヒト血しょうによる免疫化からの血清と比較して、異種RBDsの優れた交差反応性認識を有する抗体を引き出した。さらに、モザイクRBD免疫化マウスからの血清は、プライミング後、同型のSARS-CoV-2-RBD-ナノ粒子免疫化からの血清と同等またはそれよりも良好な異種偽型のコロナウイルスを中和し、共表示から結果として生じる特定のRBDsに対する免疫原性の損失はないことが論証された。この例において示すように、モザイクRBDナノ粒子による単一の免疫化は、SARS-CoV-2および新興人獣共通コロナウイルスに対して同時に保護するために潜在的戦略を提供する。
Letko（レトコ）Mら、Nature Microbiology（ネイチャー・マイクロバイオロジー）5、562-569（2020）に記載されたサルベコウイルスRBD受容体使用および細胞トロピズムの研究は、モザイク粒子上の共表示のためのRBDsの選定を指揮するために使用した。別個のクレード（クレード1、2、1/2、および3）に分類された29のRBDsから、多種のRBDsがSARS-CoV、WIV1、およびSHC014（クレード1）、SARS-CoV-2（クレード1/2）、Rs4081、Yunnan（雲南）2011（Yun11）、およびRf1（クレード2）、およびBM48-31（クレード3）から識別され、それらのうち、SARS-CoV-2およびSARS-CoVはヒトコロナウイルスであり、および残りは中国またはブルガリアにおいて由来するコウモリウイルス（BM48-31）である。また、GX pangolinのクレード1/2コロナウイルス（ここではpang17と称する）、RaTG13、SARS-CoV-2に最も近く関連するコウモリのクレード1/2ウイルス、RmYN02、中国からのクレード2コウモリウイルス、およびBtKY72、ケニアコウモリのクレード3ウイルスからのRBDsも含まれる。選定したRBDsにわたる配列保存のマッピングは、配列同一性の様々な程度を示し（68-95%）、SARS-CoV-2のACE2受容体結合性モチーフに対応する残基における最も高い配列変動性を有する（図１Ａ－図１Ｄ；図５Ａ－図５Ｃ）。12のRBDsのうち8つが、三種類のモザイクナノ粒子を作成するために選ばれ：モザイク-4a（SARS-2、RaTG13、SHC014、およびRs4081 RBDsにカップリングする）、モザイク-4b（pang17、RmYN02、RF1、およびWIV1 RBDsにカップリングする）、およびモザイク-8（八つのRBDsのすべてにカップリングする）であり、およびそれらはSARS-CoV-2 RBD単独（同型SARS-2）から構築した同型のmi3粒子と比べた。SARS、Yun11、BM-4831、およびBtKY72からのRBDs、それらはモザイク粒子にカップリングしておらず、交差反応性応答について血清を評価するために使用した。
SpyTag003-RBDsは、同型およびモザイクのナノ粒子を作成するために、SpyCatcher003-mi3（60の潜在的コンジュゲーション部位）にカップリングさせた（図２Ａ）。粒子をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって精製し、およびSDS-PAGEによって分析し、単分散SECプロファイルおよびほぼ100%のコンジュゲーションが明らかになった（図２Ｂ－図２Ｃ）。代表的なRBDsは、SpyCatcher003-mi3に似た、または同じ効率によりコンジュゲーションし（図６Ａ－図６Ｂ）、モザイク粒子が異なるRBDsのおおよそ等モル混合物を含むことが示唆された。
マウスは、可溶性SARS-CoV-2スパイク三量体（SARS-2 S）、SARS-2 RBDだけを表示するナノ粒子（同型SARS-2）、RBDsを共表示するナノ粒子（モザイク-4a、モザイク-4b、モザイク-8）、または非共役（unconjugated）ナノ粒子（mi3）のいずれかによって免疫した。IgG応答は、プライムまたはブースト免疫（図３Ａ）後に、SARS-2 S（図３Ｂ）またはRBDsのパネル（図３Ｃ－図３Ｆ；図７Ａ－図７Ｆ）に対するELISAによって評価した。非共役ナノ粒子免疫化動物からの血清（図３Ａ－図３Ｆ、図７Ａ－図７Ｆにおける黒）はバックグラウンドを超える応答を示さなかった。抗SARS-2 S三量体および抗SARS-2 RBD血清応答は類似し（図３Ｂ－図３Ｃ）、RBDsに対して引き出された抗体がSARS-2 S三量体上のそれらのエピトープにアクセスすることができると論証された。インビトロ中和アッセイもまた、293TACE2標的細胞に感染することが知られる株（SARS-CoV-2、SARS、WIV1およびSHC104）について真正な（authentic）ウイルス中和と定量的に相関する偽型のウイルスアッセイを用いて行った。中和およびELISA力価は有意に相関し（図８Ａ－図８Ｄ）、このようにウイルス侵入受容体の使用法が不明なために偽型の中和アッセイが可能でなかったとき、ELISAsが中和結果の前兆となることが示唆された。
可溶性SARS-2 S三量体（茶色のバー）で免疫したマウスは、ブースティング後のSARS-2に対する自己応答を除いて、結合または中和を示さなかった（図３Ｃ－図３Ｆ）。対照的に、RBD-ナノ粒子免疫化動物からの血清（赤、緑、黄、および青のバー）は、すべてのRBDsへの結合（図３Ｃ－図３Ｆ；図７Ａ）およびブースティング後の四株すべてに対する中和（図３Ｃ－図３Ｅ）を見せ、ナノ粒子上の多量体化抗原の増加した免疫原性対可溶性抗原と一致した。同型のSARS-2ナノ粒子は、可溶性SARS-2三量体ではなく、人獣共通RBDsへの異種応答、および異種コロナウイルスの中和を誘発した（図３Ｄ－図３Ｆ）。モザイク-4aおよびモザイク-8上の他のRBDsといっしょのSARS-2 RBDの共表示対SARS-2 RBDの同型表示（同型SARS-2）が抗SARS-2応答を減らすかどうかに取り組むために、モザイク対同型免疫についてのSARS-2特異的ELISAおよび中和力価（図３Ｃ）を比較した：同型（図３Ｃでの赤）対モザイクナノ粒子（図３Ｃでの緑および青）により免疫した動物についてのIgG抗SARS-2力価における有意差はなかった。このようにSARS-2に対する免疫応答の大きさの点で、SARS-2 RBDを含む同型RBDナノ粒子対モザイクナノ粒子による免疫化の利益はなかった。
一致したRBDs（注入されたナノ粒子上に存在するRBDs；灰色の水平網掛け）対不一致のRBDs（注入されたナノ粒子上に存在しないRBDs；赤色の水平網掛け）に対する血清反応を次に比較した（図３Ａ－図３Ｆ；図７Ａ－図７Ｆ）。SARS-2 RBDは、モザイク-4b上に提示されなかったが、モザイク-4b免疫化によって誘発された抗体力価（黄）は、一致したナノ粒子免疫化（同型SARS-2（赤）、モザイク-4a（緑）、およびモザイク-8（青））によって誘発された力価と有意差がなく、およびブーステッドモザイク-4b免疫マウスからの血清は、SARS-2偽ウイルス（図３Ｃ）を中和した。他の一致対不一致の比較では、これらのRBDsが注射されたナノ粒子に含まれているかどうかにかかわらず、血清は、SHC014およびWIV1の結合および中和を示し（図３Ｄ）、RBDs間の共通エピトープの共有（図１Ａ）が強められた。
モザイク対同型SARS-2ナノ粒子の利益を論証すると、モザイク-8免疫化マウスからの血清は、同型SARS-2免疫化マウスからの血清よりもプライム後にSHC014およびWIV1 RBDに有意に良好に結合し、およびブースティング後もSHC014 RBDへのより一層良好な結合性を維持した（図３Ｄ）。このように一種類のRBDだけを表示する同型SARS-2ナノ粒子のモザイク-8ナノ粒子を超える潜在的な増加したアビディティ（avidity、親和力とも言う）は、増加した幅を付与しなかった。さらに、モザイク-8免疫化およびブーステッド血清は、SHC014およびWIV1の中和において、同型SARS-2免疫化動物からの血清よりも7-44倍強力であった（図３Ｄ）。モザイク-8血清によるSHC014およびWIV1偽ウイルスの中和は、モザイクナノ粒子上のRBDsを組み合わせることが特定のRBDに対する免疫応答を低下させないことを示唆し、またRs4081およびRaTG13への血清のELISA結合によっても示唆される（図７Ａ－図７Ｂ）。
RBD-ナノ粒子が、まったく不一致な株およびSARS-CoV-2 RBD変種を認識する抗体を誘発するかどうかにさらに取り組むために、血清は、SARS、Yun11、BM-4831、およびBtKY72 RBDs（図３Ｅ－図３Ｆ）、SARS-2 RBD変種（図７Ｃ）、MERS-CoV RBD（図７Ｄ）への結合に関して、およびSARS偽ウイルスアッセイにおける中和（図３Ｅ）に関して評価した。変異の結果として、SARS-2 RBD結合における減少は見られず（Y453F、「デンマークミンク多様体」またはQ493K/Q498Y/P499T三重変種）（図７Ｃ）、MERS-CoV RBDに対する任意の誘発血清の結合はなく（図７Ｄ）、および同型のSARS-2免疫化と比較してモザイク免疫化についてより一層高く、およびより一層多くの交差反応性の抗体応答：例は、モザイク8をプライムし、およびブーストした動物は、同型のSARS-2免疫化マウスからの血清よりもSARS RBDに対して有意に高い力価を示した（図３Ｅ）。プライム後、同型のSARS-2免疫化動物からの血清は、SARSを中和しなかったが、モザイク-4bおよびモザイク-8の血清は、中和され（図３Ｅ）、おそらくWIV1 RBDを含むこれらのナノ粒子によって促進され、それはSARS RBDとの95％のアミノ酸同一性によって関連している（図１Ｄ）。ブースティング後、SARS-2およびモザイク-4a血清も中和していたが、力価は、モザイク-8免疫化動物よりも～4倍低かった（図３Ｅ）。他の不一致RBDs（Yun11、BM-4831、BtKY72）に対するELISA力価は、同型SARS-2プライミングからの血清と比較してモザイク-8プライミング後に収集した血清について有意に高く、および高められた結合はブースティング後に維持された（図３Ｆ）。このようにモザイクナノ粒子、特にモザイク-8は、同型SARS-2ナノ粒子よりも不一致RBDsに対して高い抗体力価を誘導し、特に単一のプライミング後により一層幅広い抗コロナウイルス応答を誘導するための共表示アプローチを再び支持する。
交差反応性認識の可能性は、RBDナノ粒子でブーストした動物からのIgG+脾臓B細胞上のB細胞受容体が、SARS-2およびRs4081からのRBDs（配列同一性70％で関連）を同時に認識できるかどうかを問うために、フローサイトメトリーを使って調べた（図１Ｄ；図９Ａ－図９Ｅ）。コントロール動物が陰性であったのに対し、他のすべてのグループは、SARS-2およびRs4081のRBDsを同時に認識するB細胞を示し、双方のRBDsと交差反応する抗体の存在が示唆された（図９Ｅ）。
RBDナノ粒子免疫化によって誘発された抗体をSARS-CoV-2感染によって誘発された抗体と比較するために、RBDパネルに対するELISAsを、COVID-19血しょうドナーからのIgGsを用いて繰り返した（図４Ａ－図４Ｈ）。ほとんどの回復期血しょうは、SARS-2 RBDに対する検出可能な結合を示した（図４Ａ）。しかし、他のサルベコウイルスRBDs（RaTG13、SHC014、WIV1、Rs4081およびBM-4831）への結合は、SARS 2 RBDへの結合よりも著しく弱く、多くのヒト血しょうIgGsがバックグラウンドを超える結合を示さなかった（図４Ｂ－図４Ｇ）。加えて、回復期血しょうIgGsはSARS-CoV-2偽ウイルスを中和したが、それらはSARS、SHC014、またはWIV1偽ウイルスの弱いか、またはまったくない中和しか示さなかった（図４Ｈ）。これらの結果は、ヒトにおけるSARS-CoV-2感染に起因する人獣共通コロナウイルス株からのRBDsの交差反応性認識がほとんど、乃至まったくないことと一致する。
結論として、ナノ粒子上のRBDsの多量体化は、可溶性抗原と比較して免疫原性を高め、および同型SARS-2ナノ粒子免疫化は、ブースティング後に人獣共通RBDsに結合し、および異種コロナウイルスを中和するIgG応答を生産した。対比してみると、可溶性SARS-2 S免疫化およびSARS-CoV-2による自然感染は、血しょうにおける弱いか、またはまったくない異種反応しかもたらさなかった。モザイクナノ粒子上の多種のRBDsといっしょのSARS-2 RBDの共発現は、同型のSARS-2ナノ粒子と比較してSARS-CoV-2に対する中和性抗体を誘発することについて不利益を示さず、モザイクナノ粒子がCOVID-19に対して保護するためにワクチン候補として示唆された。さらに、同型のSARS-2 RBD粒子と比較して、モザイク共表示戦略は、人獣共通サルベコウイルスに対する中和抗体を誘発することについて利益が論証され、このようにヒトの溢流の可能性を有する新興コロナウイルスに対する保護も提供できる可能性があった。モザイクプライミング後、一致および不一致株の中和が観察され、モザイク-RBDナノ粒子の単一の注射がワクチンにおいて十分である可能性が示唆された。COVID-19回復期血しょうはSARS-CoV-2以外のコロナウイルスRBDsをほとんど、乃至まったくない認識しか示さなかったので、ヒトにおけるCOVD-19誘導免疫は、別の緊急コロナウイルスに対して保護しないかもしれない。ここに記載のモザイクナノ粒子の実施態様は、新たに発見された人獣共通コロナウイルスからのRBDsを提示するために使用することができた。
＜例２＞
模範的な材料および方法
ここに開示された実施態様の調製および実践において、以下の模範的な材料および方法を使用する。
（系統樹） コロナウイルスRBDドメインの配列アライメントは、Clustal Omega（クラスタルオメガ）を使用して作成した。このアミノ酸アライメントからPhyML 3.0を用いて系統樹を算定し、およびPRESTO（プレスト）を用いてこの樹の図を作成した（http://www. atgc-montpellier.fr/presto）。
（RBDおよびSタンパク質の発現） N末端ヒトIL-2またはMuホスファターゼシグナルペプチドを有するSARS-CoV-2（GenBank MN985325.1；Sタンパク質残基319-537；配列番号1）およびSARS-CoV S（GenBank AAP13441.1；残基318-510；配列番号9）のRBDsをコードする哺乳動物発現ベクターは、前に記載した。発現ベクターは、以下の他のサルベコウイルス株からのRBDsについて同様に構築した：RaTG13-CoV（GenBank QHR63300；Sタンパク質残基319-541；配列番号2）、SHC014-CoV（GenBank KC881005；残基307-524；配列番号3）、Rs4081-CoV（GenBank KY417143；Sタンパク質残基310-513；配列番号4）、pangolin17-CoV（GenBank QIA48632；残基317-539；配列番号5）、RmYN02-CoV（GSAID EPI_ISL_412977；残基298-501；配列番号6）、Rf1-CoV（GenBank DQ412042；残基310-513；配列番号7）、WIV1-CoV（GenBank KF367457；残基307-528；配列番号8）、Yun11-CoV（GenBank JX993988；残基310-513；配列番号10）、BM-4831-CoV（GenBank NC014470；残基310-528；配列番号11）、BtkY72-CoV（GenBank KY352407；残基309-530；配列番号12）。各RBD発現ベクターの2つのバージョンを作成した：C末端ヘキサヒスチジンタグ（G-HHHHH、配列番号13）およびSpyTag003（RGVPHIVMVDAYKRYK、配列番号14）を含むもの（SpyCatcher003-mi3にカップリング用）およびヘキサヒスチジンタグだけを有するもの（ELISAs用）である。ビオチン化SARS-CoV-2およびRs4081 RBDsは、Avi/Hisタグ付きRBD発現プラスミドとER指向BirA酵素をコードする発現プラスミドとの共トランスフェクションによって生産した（Michael Anaya（マイケル・アナヤ）、Caltech（カルテック）の厚意による贈り物）。RBDタンパク質は、一過性にトランスフェクトしたExpi293F細胞（Gibco（ギブコ））上清からニッケルアフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。RBDsに対応するピーク画分をSDS-PAGEによって識別し、および次いでプールして、および4℃にて貯蔵した。6P安定性変異（6P stabilizing mutations）を有する三量体SARS-CoV-2外部ドメインは、記述したように発現させ、および精製した。可溶性SARS-CoV-2 S三量体の正しい折り畳みは、免疫化について使用した三量体調製物と複合化した中和抗体の3.3Å cryo-EM（低温電子顕微鏡）構造によって検証した。フルオロクロムコンジュゲーションストレプトアビジン四量体化RBDsを調製するために、ビオチン化SARS-2およびRs4081 RBDsをそれぞれストレプトアビジン-APC（eBioscienceTM）およびストレプトアビジン-PE（ThermoFisher（サーモフィッシャー））と4℃にてRBDとストレプトアビジンサブユニットの1：1モル比で夜通しインキュベーションした。
（ヒト血しょうIgGsの調製） COVID-19回復期および健康なドナーから収集した血しょうサンプルは、Robbiani（ロッビアーニ）ら、Nature 584、437-442（2020）に記載される。ヒトIgGsは、5mLのHiTrap MabSelect SuRe（ハイトラップ・Mabセレクト・SuRe）カラム（GE Healthcare Life Sciences（GEヘルスケア・ライフ・サイエンシーズ））を用いて熱不活性化血しょうサンプルから記載通りに分離した。
（RBD-mi3ナノ粒子の調製） SpyCatcher003-mi3粒子は、Cohen（コーエン）AAら、2021、PLoS ONE 16(3): e0247963に記載のように、pET28a SpyCatcher003-mi3遺伝子（N末端6x-Hisタグを含む）により形質転換したBL21 (DE3)-RIPL E coli（E. コリ）（Agilent（アジレント））からの精製によって用意した。簡単には、形質転換された細菌からの細胞ペレットを2.0mM PMSF（Sigma（シグマ））の存在下に細胞粉砕器により溶解させた。溶解物を21,000xgにて30分間スピンし、0.2μmフィルターによりろ過し、およびプレパックHisTrapTM HPカラム（GE Healthcare（GEヘルスケア））を用いたNi-NTAクロマトグラフィーによってmi3粒子を分離した。溶出した粒子をAmicon Ultra（アミコン・ウルトラ）15 mL 30K 濃縮器（MilliporeSigma（ミリポアシグマ））を用いて濃縮し、および25 mM Tris-HCl（トリス塩酸）pH 8.0、150mM NaCl、0.02% NaN3（TBS）により平衡化したHiLoad(R)（ハイロード）16/600 Superdex(R)（スーパーデックス）200（GE Healthcare）カラムを用いてSECによって精製した。SpyCatcher-mi3粒子は4℃にて貯蔵し、および0.2μmフィルターによりろ過するか、または21,000xgにて10分間スピンした後、最大で1か月間コンジュゲーションのために使用した。
精製したSpyCatcher003-mi3は、3倍モル過剰（RBD対mi3サブユニット）の精製したSpyTagged RBD（同型SARS-CoV-2 RBD粒子を作るための単一RBD、またはモザイク粒子を作るための四または八のRBDsの等モル混合物のいずれでも）とTBSにおいて室温にて夜通しインキュベーションした。PBS（20mMリン酸ナトリウムpH7.5、150mM NaCl）により平衡化したSuperose 6（スーパーロース6）10/300カラム（GE Healthcare）上でのSECによってコンジュゲーテッドmi3粒子をフリーRBDsから分けた。コンジュゲーテッドmi3粒子に対応する画分を集め、およびSDS-PAGEによって分析した。コンジュゲーテッドmi3粒子の濃度はBio-Rad Protein Assay（バイオ-ラッド・プロテイン・アッセイ）を使用して決定した。
（免疫化） 動物に関する手順（Animal procedures）および実験は、IACUCによって承認されたプロトコルにしたがって実行した。実験は、4-6週齢の雌のBalb/cマウス（Charles River Laboratories（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ））を用いて行い、可溶性SARS-CoV-2 SまたはSpyCatcher003-mi3で免疫したコホートについては各5匹の動物、および残りのコホートについては各10匹の動物である（図３Ａ）。免疫化は、100μLの50% v/v AddaVaxTMアジュバント（Invivogen）において、5μgのコンジュゲーテッドRBD（SpyCatcher003-mi3へのコンジュゲーションの効率を100%と仮定して、RBDの質量として算出した）、5μgの可溶性SARS-CoV-2 S、または6μgの非共役SpyCatcher003-mi3の腹腔内（ip）注射により遂行した。動物はプライム後4週間にアジュバントにおいて同量の抗原を用いてブーストした。動物は、2週間ごとに尾静脈から採血し、および次いでプライム後8週間（56、57日目）に安楽死させ、および心臓穿刺を通して採血した。血液サンプルは、MiniCollect(R)（ミニコレクト）Serum and Plasma Tubes（血清および血しょうチューブ）（Greiner（グライナー））において室温で凝固させ、および血清を採取し、液体窒素において保存し、および使用するまで-80℃にて貯蔵した。
ELISAsのための血清は、14日目（Prime（プライム））および42日目（Boost（ブースト））にて収集した。中和アッセイのための血清は28日目（Prime）および56日目（Boost）にて収集した（図３Ａ－図３Ｆ、図７Ａ－図７Ｆ）。
（ELISAs） 0.1M NaHCO3 pH9.8における精製RBD（SpyTaggedではない）10μg/mlをNunc(R)（ヌンク）MaxiSorpTM（マキシソープ）384ウェルプレート（Sigma）上にコーティングし、および4℃にて夜通し貯蔵した。TBS-Tにおける3%ウシ血清アルブミン（BSA）により1時間室温でブロッキングした後、0.1%Tween 20（ツイーン20）（TBS-T）を有するTris緩衝化セーリーンによりプレートを洗浄した。マウス血清は、1:100に希釈し、および次いでTBS-T/3%BSAにより4倍にまで連続希釈し、およびプレートに室温で3時間加えた。室温で1時間洗浄後、二次HRPコンジュゲーテッドヤギ抗マウスIgG（Abcam（アブカム））の1：50,000希釈物を添加した。SuperSignalTM（スーパーシグナル）ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate（フェムト・マキシマム・センシティビティ・サブストレート）（ThermoFisher）を用いてプレートを現像し、および425nmにて読み取った。曲線をプロットし、およびGraphpad Prism 8.3（グラフパッド・プリズム8.3）を使用し曲線下面積（AUC）を得るために積分し、Hill coefficient（ヒル係数）を有するワンサイト結合モデルが仮定された（図３Ａ－図３Ｆ、図７Ａ－図７Ｆ）。EC50sおよび終点力価も計算し、それはELISA結合データについてプレートコントロール（一次血清を添加しない）の平均+2×標準偏差にて、またはそれ未満であった希釈度を使用して決定した（図７Ｅ－図７Ｆ）。AUC計算は、それらが最大結合における変化をより一層良好に捉えることができるように使用した。グループ間の力価差の統計的有意性は、Graphpad Prism 8.3を用いてTukey（チューキー）の多重比較検定を用いて計算した。
（中和アッセイ） HIVレンチウイルス粒子に基づくSARS-CoV-2、SARS、WIV1、およびSHC014偽ウイルスは、細胞質側末端におけるC末端残基を欠くSタンパク質配列をコードする遺伝子を用いて記載通りに用意した：SARS-CoV-2、WIV1、SHC014については21アミノ酸の欠失、およびSARS-CoVについては19アミノ酸の欠失である。この偽型の中和アッセイ法から導き出されるIC50値は、真正なSARS-CoV-2ウイルスを用いた中和アッセイからの結果と定量的に相関することが示された。偽ウイルス中和アッセイのため、免疫化マウスからの四倍連続希釈の血清を偽型のウイルスと37℃で1時間インキュベーションした。293TACE2標的細胞との37℃での48時間インキュベーション後、細胞をリン酸緩衝化セーリーン（PBS）で二回洗浄し、およびLuciferase Cell Culture Lysis（ルシフェラーゼ・セル・カルチャー・リーシス）5x試薬（Promega）により溶解させた。溶解物におけるNanoLuc Luciferase（ナノLucルシフェラーゼ）活性は、Nano-Glo Luciferase Assay System（ナノ-Gloルシフェラーゼアッセイ・システム）（Promega）を用いて測定した。相対発光単位（RLUs）は、血清不存在下で偽型ウイルスに感染した細胞から導き出される値に対して正規化した。最大半量の抑制希釈値（Half-maximal inhibitory dilutions）（ID50値）は、AntibodyDatabase（アンチボディーデータベース）において4パラメータ非線形回帰を使用して決定した。グループ間の力価差の統計的有意性は、Graphpad Prism 8.3を用いてlog10スケールに変換したID50sのTukeyの多重比較検定を用いて算出した。
（統計解析） ELISAsおよび中和アッセイについてのグループ間の比較は、Prism 9.0（プリズム9.0）（Graphpad）においてTukeyのpost-hoc test（ポスト-ホックテスト、事後検定）を用いた一元配置分散分析（ANOVA）により計算した。ELISAと中和力価との間の相関分析について、有意差（p）、スピアマン係数（rs）、および線形プロットは、Prism 9.0（Graphpad）を用いて計算した。p値が0.05未満であったとき、差は有意であると考えた。正確なp値は、各対応する線の近くの関連する図面にあり、アスタリスクは、有意水準を表す（*は0.01<p<0.05を表し、**は0.001<p<0.01を表し、***は0.0001<p<0.001を表し、および****はp<0.0001を表す）。
（フローサイトメトリー） フローサイトメトリーを用いるB細胞分析は記載されたように行った。簡単には、単一の細胞懸濁物は、機械的解離を用いてマウス脾臓から用意し、および赤血球は、ACK溶解緩衝剤（Gibco）を用いて除去した。白血球調製物は、マウスメモリーB細胞分離キット（Miltenyi（ミルテニー））におけるネガティブセレクションプロトコルを用いて、IgG+B細胞について豊富化した。豊富化した脾細胞を染色するために、以下の商業上の試薬を使用した：CD4-APC-eFluor（イーフルーア）780（クローン：RM4-5）、F4/80-APC-eFluor 780（クローン：BM8）、CD8a-APC-eFluor 780（クローン：53-6.7）、Ly-6G-APC-eFluor 780（クローン：RB6-8C5）、IgM-APC-eFluor 780（クローン：II/41）（Thermo Fisher Scientific（サーモ・フィッシャー・サイエンティッフィック））、CD19-FITC（クローン：6D5）（Biolegend（バイオレジェンド））、IgG1 BV421（クローン：X40）およびIgG2 BV421（クローン：R19-15）（BD Bioscience（BDバイオサイエンス））である。抗原特異的B細胞を識別するために、SARS-2 RBD-APCおよびRs4081 RBD-PEを使用した（for used）。細胞生存率は、Fixable Viability Stain（フィクサブル・バイアビリティ・ステイン）700（BD Bioscience）を用いて分析した。染色した細胞は、6つの蛍光色素を検出するように構成されたSY3200 Cell Sorter（SY3200セル・ソーター）（Sony（ソニー））で分析した。一サンプルあたり2,000,000事象を収集し、およびFlowJo（フロージョ）ソフトウェア（TreeStar（ツリースター））を介して解析した。
＜用語解説＞
先に説明した実施態様の少なくともいくらかにおいて、ある実施態様で使用される一以上の要素は、そのような置き換えが技術的に実行不可能でない限り、別の実施態様で互換的に使用することができる。請求される主題の範囲から離れることなく、上述した方法および構造に対して種々の他の省略、追加および変化がなされ得ることは、当技術において熟練する者によって認められるであろう。すべてのそのような修飾および変化は、添付の請求の範囲によって規定されるように、主題の範囲内に入ることが意図されている。
ここにおける実質任意の複数および／または単数の用語の使用に関して、当技術において熟練を有する者は、文脈および／または用途に適切であるように、複数から単数へ、および／または単数から複数へ変換することができる。種々の単数／複数の並べ替えは、明確化のためにここで明示的に記載され得る。この明細および添付の請求の範囲で使用するように、単数形「a（ある、不定冠詞）」、「an（ある、母音の前で用いる不定冠詞）」、および「the（その、定冠詞）」は、文脈が明確に別なふうに指示しない限り、複数の参照を含む。ここにおける「または」の任意の言及は、別なふうに述べられない限り、「および／または」を包含することを意図している。
ここで、および特に添付の請求の範囲（例は、添付の請求の範囲の本体）において使用される用語は、概して、「開放」用語として意図されることが当技術内の者によって理解されるであろう（例は、用語「including（含むこと、全体の一部・成分として含むこと）」は「含むが制限されないこと」と、用語「having（有すること）」は、「少なくとも有すること」と、用語「includes（含む）」は、「含むが制限されない」等と解釈すべきである）。導入されたクレーム復唱の特定の数が意図される場合、そのような意図はクレームにおいて明示的に復唱され、そのような復唱の不存在において、そのような意図は存在しないことが当技術内の者によってさらに理解されるであろう。例えば、理解への助けとして、以下の添付の請求の範囲は、クレーム復唱を導入するために導入句「少なくとも一つ」および「一またはそれよりも多く」の用法を含み得る。しかしながら、そのような句の使用は、不定冠詞「a」または「an」によるクレーム復唱の導入がそのような導入をしたクレーム復唱が含まれる任意の特定のクレームをそのような復唱が一つだけ含まれる実施態様に制限することを示唆するものと解釈してはならず、同じクレームが導入句「一またはそれよりも多く」または「少なくとも一つ」および不定冠詞、例えば、「a」または「an」などのようなものを含む場合（例は、「a」および／または「an」は「少なくとも一つ」または「一またはそれよりも多く」を意味すると解釈すべきであり）でもそうであり；クレーム復唱を導入するために用いられる定冠詞の使用についても同じことがあてはまる。加えて、導入されたクレーム復唱の特定の数が明示的に復唱されている場合でさえも、当技術において熟練する者は、そのような復唱が少なくとも復唱された数を意味すると解釈すべきであることを認識するであろう（例は、他の修飾を伴わない「二つの復唱」のありのままの復唱は、少なくとも二つの復唱、または二またはそれよりも多くの復唱を意味する）。さらに、「A、B、およびC、等の少なくとも一つ」に似ている慣習が使用されるそれらの事例において、概して、そのような構成は、当技術において熟練を有するものが慣習を理解する意味で意図される（例は、「A、B、およびCの少なくとも一つを有するシステム」は、制限されないが、A単独、B単独、C単独、AとBが一緒、AとCが一緒、BとCが一緒、および／またはA、B、およびCが一緒、等を有するシステムを含むであろう）。「A、B、またはC、等の少なくとも一つ」に似ている慣習が使用されるそれらの事例において、概して、そのような構成は、当技術において熟練を有する者が慣習を理解する意味で意図される（例は、「A、B、またはCの少なくとも一つを有するシステム」は、制限されないが、A単独、B単独、C単独、AとBが一緒、AとCが一緒、BとCが一緒、および／またはA、B、およびCが一緒、等を有するシステムを含むであろう）。さらに、説明、クレーム、または図面においてのいずれにせよ、二以上の代替的な用語を提示する事実上任意の分離的な単語および／または句は、用語の一方、用語のいずれでもか、または用語の双方を含む可能性を想定していると理解されるべきであることは、当技術内の者によって理解されるであろう。
加えて、本開示の特長または態様がMarkush（マーカッシュ）グループの観点から説明される場合、当技術において熟練する者は、本開示がそれによってMarkushグループのメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループの観点からも説明されることを認識するであろう。
当技術において熟練するものには理解されるであろうが、ありとあらゆる目的、例えば、書面による説明を提供する点からなどのようなもののために、ここに開示されるすべての範囲はまた、ありとあらゆる可能な部分的範囲（sub-ranges）およびその部分的範囲の組合せも包含する。任意のリストされた範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい半分、3分の1、4分の1、5分の1、10分の1、等に分解されることを十分に説明し、および可能にすることを容易に認識させることができる。非制限的な例として、ここで議論される各範囲は、下位3分の1、中位3分の1および上位3分の1、等に容易に分解することができる。また、当技術において熟練するものによって理解されるであろうが、「最大で」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、およびその他同種類のものなどのすべての言葉使いは、引用された数を含み、および上で議論したように部分的範囲にその後分解することができる範囲に言及する。最後に、当技術において熟練するものによって理解されるように、範囲には、各個別のメンバーが含まれる。このように例えば、1-3のものを有するグループは、1、2、または3のものを有するグループに言及する。同様に、1-5のものを有するグループは、1、2、3、4、または5のものを有するグループに言及する、などである。
ここでは種々の態様および実施態様を開示したが、他の態様および実施態様は当技術において熟練する者には明らかであろう。ここに開示された種々の態様および実施態様は、実例の目的のためのものであり、および制限することを意図しておらず、真の範囲および精神は、以下の請求の範囲によって指し示される。

Claims (54)

  1. 複数のコロナウイルス抗原と会合した多価担体を含むワクチン組成物であって、前記複数のコロナウイルス抗原が、第１のコロナウイルスの第１のコロナウイルス抗原と、前記第１のコロナウイルスとは異なる第２のコロナウイルスの第２のコロナウイルス抗原とを含む、ワクチン組成物。
  2. 前記複数のコロナウイルス抗原が、前記多価担体の表面上に提示される、請求項１に記載のワクチン組成物。
  3. 前記複数のコロナウイルス抗原が、前記多価担体中に部分的に埋め込まれている、請求項１に記載のワクチン組成物。
  4. 前記複数のコロナウイルス抗原が、コロナウイルススパイクタンパク質（Sタンパク質）もしくはその一部、コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質（Nタンパク質）もしくはその一部、コロナウイルスヘマグルチニン－エステラーゼタンパク質（HEタンパク質）もしくはその一部、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼもしくはその一部、コロナウイルス３CLプロテアーゼもしくはその一部、コロナウイルス膜タンパク質（Mタンパク質）もしくはその一部、またはその組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  5. 前記複数のコロナウイルス抗原が、同じタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  6. 前記複数のコロナウイルス抗原が、異なるタンパク質タイプのコロナウイルスタンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  7. 前記複数のコロナウイルス抗原が、コロナウイルスSタンパク質またはその一部を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  8. 前記複数のコロナウイルス抗原が、コロナウイルスSタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）またはその一部を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  9. 前記第１のコロナウイルス抗原、前記第２のコロナウイルス抗原、またはその両方が、コロナウイルスSタンパク質またはその一部を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  10. 前記第１のコロナウイルス抗原、前記第２のコロナウイルス抗原、またはその両方が、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  11. 前記複数のコロナウイルス抗原が、互いに約、少なくとも、または少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  12. 前記複数のコロナウイルス抗原がそれぞれ、コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分を含み、前記コロナウイルスSタンパク質RBDまたはその一部分が、互いに約、少なくとも、または少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  13. 前記複数のコロナウイルス抗原がそれぞれ、（１）配列番号１～１２および１５～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（２）配列番号１～１２および１５～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  14. 前記第１のコロナウイルス抗原が、（１）配列番号１～１２および１５～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（２）配列番号１～１２および１５～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  15. 前記第２のコロナウイルス抗原が、（１）配列番号１～１２および１５～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（２）配列番号１～１２および１５～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  16. 前記第１のコロナウイルス抗原分子の数および前記第２のコロナウイルス抗原分子の数が、１：１００～１００：１の比で請求項１～１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  17. 前記複数のコロナウイルス抗原が３つ、４つ、５つ、サイズ７つ、または８つのコロナウイルス抗原を含み、各コロナウイルスが互いに異なる、請求項１～１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  18. 前記複数のコロナウイルス抗原が第３のコロナウイルスの少なくとも第３のコロナウイルス抗原および第４のコロナウイルスの第４のコロナウイルス抗原をさらに含み、前記第１、第２、第３および第４のコロナウイルスが互いに異なる、請求項１～１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  19. 前記複数のコロナウイルス抗原が第３のコロナウイルスの第３のコロナウイルス抗原、第４のコロナウイルスの第４の抗原コロナウイルス、第５のコロナウイルスの第５のコロナウイルス抗原、第６のコロナウイルスの第６のコロナウイルス抗原、第７のコロナウイルスの第７のコロナウイルス抗原、および第８のコロナウイルスの第８のコロナウイルス抗原のうちの１つまたは複数をさらに含み、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８のコロナウイルスが互いに異なる、請求項１～１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  20. ３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのコロナウイルスSタンパク質RBDを含み、複数のコロナウイルスSタンパク質RBDの各々が互いに異なる、請求項１～１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  21. 前記複数のコロナウイルス抗原のうちの１つまたは複数がアルファ－コロナウイルスおよび／またはベータ－コロナウイルスの属におけるコロナウイルスであり、任意選択で、前記複数のコロナウイルス抗原の各々が、ベータ－コロナウイルスの属におけるコロナウイルスである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  22. 前記複数のコロナウイルス抗原が、サルベコウイルス亜属におけるコロナウイルスのものである、請求項１～２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  23. 前記第１のコロナウイルスおよび前記第２のコロナウイルスがβ－コロナウイルスの属にあり、任意選択で、サルベコウイルスの亜属にある、請求項１～２２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  24. 前記複数のコロナウイルス抗原が、SARS、SARS－２、WIV１、SHC０１４、Rf１、RmYN０２、pang１７、RaTG１３、およびRs４０８１からなる群から選択されるコロナウイルスである、請求項１～２３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  25. 前記第１のコロナウイルス、前記第２のコロナウイルス、または両方が、SARS、SARS－２、WIV１、SHC０１４、Rf１、RmYN０２、pang１７、RaTG１３、およびRs４０８１からなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  26. 前記複数のコロナウイルス抗原が前記多価担体に共有結合され、任意選択で、前記複数のコロナウイルス抗原が前記多価担体にコンジュゲートされる、請求項１～２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  27. 前記複数のコロナウイルス抗原が、クリックケミストリーを介して前記多価担体に結合している、請求項１～２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  28. 前記複数のコロナウイルス抗原が、前記多価担体に非共有結合的に付着している、請求項１～２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  29. 前記多価担体が、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノワイヤー、デンドリマー、リポソーム、エトソームおよびアクアソーム、ポリマーソームおよびニオソーム、発泡体、ハイドロゲル、立方体、量子ドット、エキソソーム、マクロファージ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～２８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  30. 前記多価担体が、脂質ベースのナノ粒子、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルジョン、ナノワイヤー、シリカナノ粒子、ウイルス様粒子、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子、脂質－ポリマー粒子、ナノリポタンパク質粒子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるナノ粒子を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  31. 前記多価担体がウイルス様粒子（VLP）を含み、任意選択で前記ウイルス様粒子がAp２０５ VLPである、請求項１～３０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  32. 前記多価担体が自己集合性ナノ粒子を含み、任意選択で、前記自己集合性ナノ粒子が、i３０１ナノ粒子もしくはその変異体、またはmi３ナノ粒子もしくはその変異体である、請求項１～３０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  33. 複数の粒子形成タンパク質を含み、任意選択で、複数の粒子形成タンパク質のうちの１つまたは複数が、２－デヒドロ－３－デオキシ－ホスホグルコン酸（KDPG）アルドラーゼまたはその変形例を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  34. 前記複数のコロナウイルス抗原のうちのコロナウイルス抗原が前記複数の粒子形成タンパク質のうちの粒子形成タンパク質に付着され、任意選択で、前記複数のコロナウイルス抗原のうちの前記コロナウイルス抗原がSpyタグ／SpyCatcher結合対を介して前記複数の粒子形成タンパク質のうちの前記粒子形成タンパク質に付着される、請求項３３に記載のワクチン組成物。
  35. 前記複数のコロナウイルス抗原の前記コロナウイルス抗原が前記コロナウイルス抗原のC末端にSpyタグを含み、前記複数の粒子形成タンパク質の前記粒子形成タンパク質が、前記粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherを含む、請求項３３～３４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  36. 前記複数のコロナウイルス抗原の前記コロナウイルス抗原がコロナウイルスSタンパク質RBDを含み、前記コロナウイルスSタンパク質RBDが前記コロナウイルスSタンパク質RBDのC末端にSpyタグを含み、前記複数の粒子形成タンパク質の前記粒子形成タンパク質が、前記粒子形成タンパク質のN末端にSpyCatcherを含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  37. アジュバントをさらに含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  38. 前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、アルヒドロゲル、AddaVax、MF５９、AS０３、フロイントアジュバント、モンタニドISA５１、CpG、ポリI：C、グルコピラノシルリピドA、フラジェリン、レシキモド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載のワクチン組成物。
  39. それを必要とする対象において免疫反応を刺激する方法であって、薬学的有効量の請求項１～３８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を対象に投与し、それによって対象における免疫反応を刺激することを含む、方法。
  40. それを必要とする対象においてコロナウイルス感染を治療または予防するための方法であって、対象に薬学的有効量の請求項１～３８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与し、それによって対象におけるコロナウイルス感染を治療または予防することを含む、方法。
  41. コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とする対象において治療または予防する方法であって、薬学的有効量の請求項１～３８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を対象に投与し、それによって対象におけるコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患または障害を治療または予防することを含む、方法。
  42. 前記ワクチン組成物が前記対象に２回以上投与される、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記第１のコロナウイルスおよび前記第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスに対する中和応答を誘導する、請求項３９および４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記複数のコロナウイルス抗原が、前記コロナウイルスとは異なるさらなるコロナウイルスに対する中和応答を誘導する、請求項３９および４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記複数のコロナウイルス抗原が、前記コロナウイルスに対する中和応答を誘導する、請求項３９および４２のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記第１のコロナウイルスおよび前記第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療または予防することをもたらす、請求項４０および４２のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記複数のコロナウイルス抗原が、前記コロナウイルスとは異なる追加のコロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療または予防することをもたらす、請求項４０および４２のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記複数のコロナウイルス抗原が原因である前記コロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療または予防することをもたらす、請求項４０および４２のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記第１のコロナウイルスおよび前記第２のコロナウイルスとは異なるコロナウイルスによって引き起こされる前記疾患または障害を治療または予防することをもたらす、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記複数のコロナウイルス抗原が有するコロナウイルスとは異なる追加のコロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害を治療または予防することをもたらす、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記複数のコロナウイルス抗原が、前記コロナウイルスによって引き起こされる疾患または障害の治療または予防することをもたらす、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ワクチン組成物を投与することが、前記対象に第１のワクチン組成物を投与することと、前記対象に第２のワクチン組成物を投与することとを含む、請求項３９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記第２のワクチン組成物を対象に投与することが、前記第１のワクチン組成物を対象に投与した約２、３、または４週間後に行われる、請求項５２に記載の方法。
  54. 請求項１～３８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を含むキット。
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