JP2022549791A - ジフテリア毒素交差反応物質（ｃｒｍ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子及びその使用 - Google Patents

ジフテリア毒素交差反応物質（ｃｒｍ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子及びその使用 Download PDF

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Abstract

細胞に由来するタンパク質粒子を投与する工程を含む、免疫反応を引き起こす方法及び／又はそれを調節する方法、治療方法並びに抗原送達方法であって、タンパク質粒子は、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含む、方法、治療方法及び抗原送達方法が開示される。細胞に由来するタンパク質粒子を使用する診断方法が含まれ、タンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む。本明細書に開示される方法は、抗原キャリア送達系として有用であり得る。

Description

分野
本発明は、概して、粒子状抗原キャリア系に関する。より具体的には、本発明は、免疫反応を引き起こす方法、治療方法、送達方法、検出方法及び／又は組成物における、非毒性の突然変異形態のジフテリア毒素、ＣＲＭに関する。
背景
好適な抗原キャリア及び送達系の開発は、部分的に、主要な病原体及び新興疾患、特にパンデミック時などの迅速な公衆衛生上の対応を必要とするものに対するワクチンの満たされていないニーズのため、進化過程に留まっている。細菌外毒素であるジフテリア毒素（ＤＴｘ又はＤＴ）は、ジフテリアの原因病原体であるジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）（ジフテリア菌（C. diphtheriae））によって産生される約５８．３５ｋＤａの分泌された分子である［１、２］。Uchida et al.［１２］は、１９７３年に、ジフテリア毒素のための遺伝子ｔｏｘを含有するコリネファージβ ＤＮＡのニトロソグアニジンによる突然変異によって得られる５つのジフテリア毒素関連タンパク質を記載した。ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の感染及び溶原化後、いくつかの突然変異したｔｏｘ遺伝子は、宿主細菌によって発現され、培養上清から精製される。これらの産物は、一般名「ＣＲＭ」を与えられた。ジフテリア毒素の様々な非毒性及び部分的に毒性の免疫学的に交差反応性の形態（ＣＲＭ又は交差反応物質）の単離は、ＣＲＭ１９７の発見をもたらした（Uchida et al., Journal of Biological Chemistry 248, 3845-3850, 1973；さらにGiannini et al. Nucleic Acids Res. 1984 May 25; 12 (10): 4063-9を参照されたい）。ＣＲＭの他の形態、例えばＣＲＭ４５も知られている。
ＣＲＭ１９７（「交差反応物質１９７」）は、５８．４１５ｋＤａのおよその分子量を有するジフテリア毒素の酵素的に不活性で非毒性の形態である。ＣＲＭ１９７は、ＤＴｘの触媒ドメイン中の残基５２におけるグリシンからグルタミン酸への単一のアミノ酸置換を有する［３］。この置換は、ＤＴｘの毒性作用をなくすが、ＤＴｘ及びその突然変異した非毒性の誘導体ＣＲＭ１９７の全体構造は、ほぼ同一である［３］。さらに、ＣＲＭ１９７の天然で非毒性の可溶形態は、可溶性ＣＲＭ１９７及び多糖抗原が共有結合された、いくつかの莢膜多糖抗原のためのキャリアタンパク質としてコンジュゲートワクチンにおけるヒト使用について認可されている［４、５］。可溶性活性形態ＣＲＭ１９７は、潜在的なワクチン候補及び従来のジフテリアトキソイドワクチンの潜在的な代替として、特にブースト抗原としても使用される［３～５］。従来のジフテリアトキソイドワクチンの代替を提供するにもかかわらず［３～５］、他のワクチン用途のための抗原キャリアとしての産業レベルにおけるＣＲＭ１９７の使用は、発現系におけるタンパク質の可溶形態の低い収率並びに可溶性ＣＲＭ１９７を得ることに関連する高いコスト及び信頼性問題に阻まれている。
製造するのにコスト効率が高くなり得る、代替的な抗原キャリア及び／又は送達系の開発が引き続き必要とされている。
概要
広い態様において、本発明は、部分的に、細胞に由来する粒子状タンパク質分子であって、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子及び任意選択的に１つ以上の他の免疫原を投与することを含む、対象における免疫反応を引き起こす方法、対象における免疫反応を調節する方法、治療方法及び／又は抗原送達方法に関する。好適には、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）に由来し得るか、又はジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）のジフテリア毒素ＣＲＭに対応するか若しくはそれである。本発明は、前記タンパク質粒子を用いた組成物及び／又は診断方法を含む。
第１の態様において、本発明は、作用物質に対する免疫反応を対象において引き起こす方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより作用物質に対する免疫反応を対象において引き起こす工程を含む方法を提供する。
第２の態様において、本発明は、疾患、障害又は病態に対して対象を免疫化する方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより疾患、障害又は病態に対して対象を免疫化する工程を含む方法を提供する。
第３の態様において、本発明は、対象における疾患、障害又は病態を治療又は予防する方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより対象における疾患、障害又は病態を治療又は予防する工程を含む方法を提供する。
第４の態様において、本発明は、対象における免疫反応を調節する方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより対象における免疫反応を調節する工程を含む方法を提供する。
第５の態様において、本発明は、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に送達する方法であって、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それによりタンパク質粒子を対象に送達する工程を含む方法を提供する。
第６の態様において、本発明は、試料中の標的を検出する方法であって、試料を、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子と接触させて、それにより試料中の標的を検出する工程を含む方法を提供する。
第７の態様において、本発明は、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子と、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤とを含む組成物を提供する。
第８の態様において、本発明は、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子又は第７の態様に記載の組成物の使用であって、（ｉ）作用物質に対する免疫反応を対象において引き起こすか；又は（ｉｉ）疾患、障害若しくは病態に対して対象を免疫化するか；又は（ｉｉｉ）対象における疾患、障害若しくは病態を治療若しくは予防するか；又は（ｉｖ）対象における免疫反応を調節するか；又は（ｖ）タンパク質粒子を対象に送達するための薬剤の製造における使用を提供する。
第９の態様において、本発明は、本明細書に記載される、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を含むキットを提供する。
ある実施形態において、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列から形成されるか、実質的に形成されるか、組み立てられるか又は産生され得る。他の実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列が細胞内で産生又は発現されるとき、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列から形成されるか又は実質的に形成され得る。
ある実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、タンパク質リフォールディング処理に供されたジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質（又はジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質の断片、変異体若しくは誘導体）に由来しない。特定の実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列がジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来しない場合、ＣＲＭ１９７タンパク質、ＣＲＭ４５タンパク質、ＣＲＭ１００１タンパク質、ＣＲＭ２２８タンパク質、ＣＲＭ１７６タンパク質及びＣＲＭ３０タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。好適には、ジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列がジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来しない場合、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。
ある実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、実質的に不溶性のタンパク質粒子であり得る。ある実施形態において、タンパク質粒子及び／又は実質的に不溶性のタンパク質粒子は、細胞の不溶性成分に由来し得る。ある実施形態において、細胞の不溶性成分は、タンパク質リフォールディング処理に供されていない場合がある。ある実施形態によれば、不溶性成分は、細胞において形成される封入体であり得る。ある実施形態において、封入体は、ＣＲＭアミノ酸配列が細胞内で発現又は産生されるときに形成される封入体であり得る。
ある実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質、ＣＲＭ４５タンパク質、ＣＲＭ１００１タンパク質、ＣＲＭ２２８タンパク質、ＣＲＭ１７６タンパク質及びＣＲＭ３０タンパク質からなる群から選択されるＣＲＭタンパク質又は上記のＣＲＭタンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれであり得る。
特定の実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体の又はそれに由来するアミノ酸配列に由来するか又はそれに対応し得る。特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７タンパク質の又はそれに由来するアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４９及び／又は配列番号５０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。ある実施形態において、ＣＲＭ１９７タンパク質の又はそれに由来するアミノ酸配列は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。
さらなる実施形態において、細胞は、組み換え技術において使用するのに好適な宿主細胞であり得る。ある実施形態において、細胞は、原核生物起源又は真核生物起源であり得る。ある実施形態において、原核細胞は、シュードモナス属（Pseudomonas）種、大腸菌（E. coli）、ラクトコッカス属（Lactococcus）及び／又はバチルス属（Bacillus）から選択され得る。ある実施形態において、シュードモナス属（Pseudomonas）は、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）であり得る。ある実施形態において、バチルス属（Bacillus）は、枯草菌（Bacillus subtilis）又はバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）であり得る。ある実施形態において、ラクトコッカス属（Lactococcus）は、乳酸連鎖球菌（Lactococcus lactis）であり得る。他の実施形態において、真核細胞は、酵母細胞であり得る。好適には、酵母細胞は、サッカロマイセス属（Saccharomyces）又はピキア属（Pichia）であり得る。ある実施形態において、サッカロマイセス属（Saccharomyces）は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり得る。ある実施形態において、ピキア属（Pichia）は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）であり得る。
ある実施形態において、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、組み換え技術によって産生され得る。特定の実施形態において、産生は、組み換えＤＮＡ技術によって行われ得る。
さらに他の実施形態において、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原をさらに含み得る。ある実施形態において、その又はそれぞれの免疫原は、病原体に由来し得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、同じ作用物質、供給源又は分子の又はそれに由来する１つ又は複数の免疫原を含み得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、複数の異なる作用物質、供給源又は分子の又はそれに由来する１つ又は複数の免疫原を含み得る。
ある実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外のその又はそれぞれの免疫原は、免疫原性アミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなり得るか又はそれである。特定の実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、病原体；病原体に由来するか若しくはそのタンパク質；癌抗原；自己抗原；移植抗原；及びアレルゲン（又は上記のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体）並びにそれらの任意の組合せの少なくとも１つに由来するか又はそれに対応し得る。
ある実施形態において、病原体は、ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、病原体は、ウイルスであり得る。
ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、非構造タンパク質、構造タンパク質、融合タンパク質及び表面タンパク質又は上記のウイルスタンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択されるウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する。
ある実施形態において、ウイルスは、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）ウイルス、フラビウイルス科（Flaviviridae）ウイルス、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルス、インフルエンザウイルス及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
ある実施形態において、フラビウイルス科（Flaviviridae）ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり得る。ＨＣＶに関連するある実施形態によれば、免疫原性アミノ酸配列は、コアタンパク質、ＮＳ３タンパク質、Ｅ１及びＥ２タンパク質からなる群から選択されるＨＣＶタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応し得る。
ＨＣＶに関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
特定の実施形態において、ＨＣＶコアタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８及び／又は配列番号４３に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれであり得る。
ある実施形態において、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２９及び／又は配列番号６９に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれであり得る。
さらに他の実施形態において、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号４５及び配列番号７０に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれであり得る。
ある実施形態において、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号４６、配列番号７１及び配列番号１０４に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれであり得る。
ある実施形態において、ＨＣＶタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号１０４に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである。
ある実施形態において、フラビウイルス科（Flaviviridae）ウイルスは、デングウイルスであり得る。ある実施形態において、デングウイルスは、デングウイルス１型、デングウイルス２型、デングウイルス３型及びデングウイルス４型並びにそれらの任意の組合せから選択され得る。ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、エンベロープタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体及び／又はカプシドタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体から選択され得るデングウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する。ある実施形態において、デングウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４７及び配列番号４８に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含み得る。
ある実施形態において、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスは、コロナウイルスであり得る。ある実施形態において、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスであり得る。あるさらなる実施形態において、ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳコロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）及び／又はＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であり得る。特定の実施形態において、ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり得る。
ある実施形態において、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスのウイルスタンパク質は、構造タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。ある実施形態において、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルス構造タンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。さらなる実施形態において、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルス構造タンパク質は、Ｎタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体及び／又はＳタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。ある実施形態において、コロナウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８、配列番号６４、配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。
ある実施形態において、病原体は、寄生生物であり得る。好適には、寄生生物は、住血吸虫及び／又はマラリア寄生生物であり得る。あるさらなる実施形態において、住血吸虫は、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）及びビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）並びにそれらの任意の組合せから選択され得る。ある実施形態において、マラリア寄生生物は、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）及び卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのプラスモジウム属（Plasmodium spp）であり得る。
ある実施形態において、病原体は、細菌であり得る。ある実施形態において、細菌は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）種、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種及び／又はコクシエラ属（Coxiella）種並びにそれらの任意の組合せから選択され得る。
好適には、ストレプトコッカス属（Streptococcus）種は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）であり得る。特定の実施形態において、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、病原性因子、好中球阻害剤、ペプチダーゼ及び／又はフィブロネクチン結合タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体のものであり得る。ある実施形態において、病原性因子は、Ｍ－タンパク質、その断片、変異体又は誘導体であり得る。特定の実施形態において、免疫原性断片に由来するＭ－タンパク質は、アミノ酸配列ＬＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫＮＱＶＥＲＡＬＥ（配列番号１７）を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。他の実施形態において、好中球因子は、プロテアーゼ又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。プロテアーゼは、ＩＬ－８プロテアーゼであり得る。特定の実施形態において、ＩＬ－８プロテアーゼは、ＳｐｙＣＥＰタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得、好ましくはＳｐｙＣＥＰタンパク質の線状Ｂ細胞エピトープであり得る。特定の実施形態において、ＳｐｙＣＥＰタンパク質断片は、アミノ酸配列ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。ある実施形態において、ペプチダーゼは、Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳｃｐＡ）又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。
ある実施形態において、複数のＧＡＳ由来免疫原性断片又は同じ若しくは異なるＧＡＳタンパク質に由来するアミノ酸配列が使用され得る。ある実施形態において、ＧＡＳ由来免疫原は、配列番号１７及び／又は配列番号１８に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。
ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）であり得る。特定の実施形態において、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質に由来するか又はそれに対応し得る。ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質は、早期抗原又はその断片、変異体若しくは誘導体である。ある実施形態において、早期抗原は、Ａｇ８５Ｂ抗原及び／又はＴＢ１０．４抗原又はその断片、変異体若しくは誘導体から選択され得る。ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質は、潜在関連抗原又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。ある実施形態において、潜在関連抗原は、ｒｖ２６６０ｃタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。あるさらなる実施形態は、任意選択的に、潜在関連抗原からのアミノ酸配列と組み合わせて、１つ以上の早期抗原に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含み得る。マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、Ａｇ８５Ｂ抗原及び／又はＴＢ１０．４抗原に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含み得、任意選択的にｒｖ２６６０ｃタンパク質に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列をさらに含み得る。
特定の実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、好適にはヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、及び／又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質に関連する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又はこれらの上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれであり得る。
ある実施形態において、コクシエラ属（Coxiella）種は、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）であり得る。ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、Ｃｏｍ１タンパク質、ＯｍｐＨタンパク質、ＹｂｇＦタンパク質、ＣＯＸタンパク質及びＧｒｏＥＫタンパク質からなる群から選択されるコクシエラ属（Coxiella）タンパク質又は上記のコクシエラ属（Coxiella）タンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応し得る。
コクシエラ属（Coxiella）に関連するある実施形態によれば、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号７２，配列番号７３及び配列番号７４～１００に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応するか、それを含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。
特定の実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列及びジフテリア毒素アミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、キメラ又はキメラ分子であり得る。ある実施形態において、キメラ又はキメラ分子は、キメラタンパク質を形成、産生、コードするか又はそれに対応し得る。好適には、キメラ、キメラ分子又はキメラタンパク質は、組み換え発現系において産生、生成、形成又は発現される。
さらに他の実施形態において、本明細書に記載されるジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、本明細書に記載されるキメラタンパク質から又はその発現から実質的に形成され得る。
ある実施形態において、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７アミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、自己集合によって形成され得、ある実施形態において細胞内の自己集合から形成され得る。ある実施形態において、細胞は、組み換えタンパク質発現に由来するか又はそれに好適であり得る。
ある実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７アミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、本明細書に記載される好適な宿主微生物において発現されるとき、好適な粒子に形成、生成、集合又は凝集し得る。
上記の態様のいずれか１つの特定の実施形態において、作用物質又は疾患、障害又は病態は、癌に関連し得、及び／又は病原体によって引き起こされ得る。したがって、病原体は、ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌並びにそれらの組合せからなる群から選択され得る。好適には、癌は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌及び黒色腫からなる群から選択され得る。
ある実施形態において、組成物は、医薬組成物であり得る。ある実施形態において、組成物又は医薬組成物は、免疫原性組成物であり得る。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、免疫治療用組成物であり得る。さらなる実施形態において、免疫原性組成物及び／又は免疫治療用組成物は、ワクチンであり得る。記載される組成物は、対象への投与に好適であり得る。組成物は、対象への投与に好適であり得る。ある実施形態において、組成物は、アジュバントをさらに含み得る。ある実施形態において、アジュバントは、アラム及び／又はジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドであり得る。
ある実施形態において、第７の態様の組成物は、上記の態様のいずれか１つの方法に係る使用のためのものであり得ると考えられる。
ある実施形態において、第６の態様の方法は、免疫反応又は免疫反応の１つ以上の要素を検出するための方法であり得る。したがって、ある実施形態において、免疫反応は、作用物質、病原体、病原体の若しくはそれに由来するタンパク質、癌抗原、自己抗原、移植抗原及びアレルゲンの１つ以上又は上記のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに対するものであるか又はそれらに関連し得る。ある実施形態において、病原体は、ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌並びにそれらの任意の組合せから選択され得る。第６の態様のある方法によれば、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、病原体の検出又は診断に使用するのに好適なアミノ酸配列をさらに含み得る。
第６の態様のある実施形態において、本方法は、試料におけるマイコバクテリウム属（Mycobacterium）感染及び／又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）特異的免疫反応を検出し得る。ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）であり得る。マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に関連するある実施形態によれば、試料は、皮膚部分及び／又は血液試料であり得る。マイコバクテリウム属（Mycobacterium）感染及び／又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）特異的免疫反応の検出に関連するある実施形態において、タンパク質粒子は、配列番号３２～４０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列及びそれらの任意の組合せをさらに含み得る。
第６の態様のある実施形態において、試料は、痰、血液、皮膚、上皮組織、鼻腔内組織若しくは細胞、口腔咽頭組織若しくは細胞又はそれらの成分に由来し得る。ある実施形態において、試料は、対象に由来し得る。
ある実施形態において、第６の態様の方法は、インビトロで行われ得る。
他の態様において、本発明は、本明細書に記載される、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を含むキットを提供する。キットは、特に、第１～第６の態様のいずれか１つ、好適には第６の態様に記載されるように本発明の方法のいずれか１つにおいて使用され得る。ある実施形態において、キットは、本明細書に記載されるタンパク質粒子を含む組成物を含み得る。ある実施形態において、キットは、免疫反応又は免疫反応の１つ以上の要素を検出し得る。免疫反応は、本明細書に記載される作用物質又はその成分（例えば病原体）に対する、それに抗する又はそれに応答するものであり得る。ある実施形態において、キットは、免疫診断キットであり得る。
上記の態様のいずれか１つのある実施形態において、対象は、哺乳動物であり得る。好ましくは、哺乳動物は、ヒトであり得る。
特定の実施形態において、上記の態様のいずれか１つの方法、組成物、使用又はキットは、防御免疫反応を引き起こすか、防御免疫反応であるか、それを検出するか又はそれを含み得る。
ある実施形態において、作用物質又は疾患、障害若しくは病態は、癌に関連し得、及び／又は病原体によって引き起こされ得る。ある実施形態において、病原体は、ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。ある実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌及び黒色腫並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
関連する態様において、本発明は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。本発明は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む前記単離タンパク質をコードする単離核酸、前記単離核酸を含む遺伝的構築物及び前記遺伝的構築物を含む宿主細胞をさらに提供する。他の関連する広い態様において、本発明は、前記単離タンパク質に由来するか又はそれを含むタンパク質粒子並びに前記単離タンパク質及び／又はタンパク質粒子を含む医薬組成物を提供する。治療方法及び免疫反応を引き起こすか又は対象を免疫化する方法も提供される。
「１つの（a）」及び「１つの（an）」という冠詞は、本明細書において、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用され、「１つ」又は「単一」の要素又は特徴を意味又は定義するものと解釈されるべきではない。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。本明細書において使用される際、単数形の使用は、特に記載されない限り、複数を含む（逆も同様である）。
本明細書全体を通して、特に示されない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」及び「含んでいる」（並びにそれらの変化形）又は「包含する」、「包含している」（及びそれらの変化形）などの関連用語は、排他的ではなく、包括的に使用されるため、記載される整数又は整数群は、１つ以上の他の記載されていない整数又は整数群を含み得る。
「からなる」とは、「からなる」という語句に続くいかなるものも含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在しなくてよいことを示す。
「から本質的になる」とは、この語句の後に列挙される任意の要素を含むこと及び列挙された要素について本開示に記載される活性又は作用を妨げないか又はそれに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素が任意選択的であり、列挙された要素の活性又は作用にそれらが影響を与えるか否かに応じて存在しても又はしなくてもよいことを示す。ある実施形態において、記載されるサブユニット配列（例えば、アミノ酸配列又は核酸配列）に関する「から本質的になる」という語句は、この配列が、少なくとも１つのさらなる上流のサブユニット（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又はそれを超える上流のサブユニット；例えばアミノ酸又はヌクレオチド）及び／又は少なくとも１つのさらなる下流のサブユニット（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又はそれを超える上流のサブユニット；例えばアミノ酸又はヌクレオチド）を含み得ることを示し、上流のサブユニットの数及び下流のサブユニットの数は、独立して選択可能である。
「及び／又は」、例えば「Ａ及び／又はＢ」という用語は、「Ａ及びＢ」又は「Ａ又はＢ」のいずれかを意味するものと理解されるべきであり、両方の意味又はいずれかの意味に明確な裏付けを与えるものと解釈されるべきである。
図面の簡単な説明
単なる例示として、本発明の実施形態は、添付の図面を参照して以下でさらに詳細に記載される。
ＣＲＭ１９７のみの粒子及び結核Ｈ４又はＨ２８抗原を示すＣＲＭ１９７粒子の形成のためのプラスミド構築。ＣＲＭ１９７遺伝子断片を、ＮｄｅＩを用いたＤＮＡ消化によってｐＵＣ５７－ＣＲＭ１９７から単離した。ＢａｍＨＩ制限部位を、ＰＣＲを用いてＣＲＭ１９７の３’末端に導入した。得られたＣＲＭ１９７を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる制限酵素消化によって生成されるｐＥＴ－１４ｂベクターにライゲートして、最終的なプラスミドｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７を形成した。ＢａｍＨＩ酵素消化を用いて、プラスミドｐＵＣ５７ Ｈ４又はｐＵＣ５７ Ｈ２８から調製された遺伝子断片Ｈ４又はＨ２８を、ＢａｍＨＩを用いて消化された線形化ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ４及びｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ２８を生成した。 ClearColi細胞において産生されるＣＲＭ１９７の溶解度分析。（Ａ）ＣＲＭ１９７を含有する全細胞溶解液のタンパク質プロファイルを、１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを用いて分析した。（Ｂ）８Ｍの尿素処理なしの粗細胞溶解液の上清分画のタンパク質プロファイルを超音波処理及び遠心分離後に分析した。（Ｃ）８Ｍの尿素で処理された粗細胞溶解液の上清分画のタンパク質プロファイルを超音波処理及び遠心分離後に分析した。レーン１、分子量マーカー（Mark 12；Invitrogen）；レーン２、ＣＲＭ１９７（５８．５４４ｋＤａ）。 マイクロフルイダイザーを用いた細胞破壊後、（Ａ）０．５倍溶解緩衝液、（Ｂ）２Ｍの尿素を含有する０．５倍溶解緩衝液及び洗浄緩衝液、及び（Ｃ）２Ｍの尿素及び５％のTriton X-100を含有する０．５倍溶解緩衝液及び洗浄緩衝液により精製されたＣＲＭ１９７粒子のタンパク質プロファイル。レーン１、分子量マーカー（Mark 12；Invitrogen）；レーン２、ＣＲＭ１９７（５８．５４４ｋＤａ）。 １０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを用いた、精製ＣＲＭ１９７タンパク質粒子及び可溶性抗原対照の分析。（Ａ）精製ＣＲＭ１９７粒子のタンパク質プロファイル。レーン１、分子量マーカー（Mark 12；Invitrogen）；レーン２、ＣＲＭ１９７（５８．５４４ｋＤａ）；レーン３、ＣＲＭ１９７－Ｈ４（９９．７０５ｋＤａ）；レーン４、ＣＲＭ１９７－Ｈ２８（１０７．２６９ｋＤａ）。（Ｂ）可溶性Ｈｉｓ６タグ化Ｈ４及びＨ２８マイコバクテリアペプチドの分析。レーン１、分子量マーカー（Mark 12；Invitrogen）；レーン２、Ｈｉｓ６－Ｈ４（４１．９８８ｋＤａ）；レーン３、Ｈｉｓ６－Ｈ２８（４９．５５３ｋＤａ）。 様々なプラスミドを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ａ～Ｃ）及び免疫原性ＴＢ断片を示す精製ＣＲＭ１９７タンパク質粒子（Ａ１～Ｃ１）の走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像。（Ａ及びＡ１）、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７；（Ｂ及びＢ１）、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ４；（Ｃ及びＣ１）、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ２８。 様々なプラスミドを有する大腸菌（Escherichia coli）（ClearColi菌株）細胞（Ａ～Ｃ）並びにＨ４及び／又はＨ２８免疫原を示す精製ＣＲＭ１９７タンパク質粒子（Ａ１～Ｃ１）の透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像。（Ａ及びＡ１）、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７；（Ｂ及びＢ１）、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ４；（Ｃ及びＣ１）、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ２８。 ＤＤＡにおける乳化前及び後のＣＲＭ１９７粒子試料のゼータ電位。各試料のゼータ電位をZetasizer Nano ZSによって３回測定した。各データ点は、平均＋標準誤差を表す。 ＤＤＡにおける乳化前及び後のＣＲＭ１９７粒子試料の粒径。粒子試料をサイズ分布測定前に超音波処理で処理した。粒径をMastersizer 3000によって３回連続的に測定し、標準偏差は、０．０１未満であった。 Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにおけるタンパク質プロファイルの濃度測定分析を用いた、ＣＲＭ１９７粒子試料（Ａ）並びに可溶性Ｈｉｓ６タグ化Ｈ４及びＨ２８抗原濃度（Ｂ）の測定。異なる量（５０ｎｇ、１００ｎｇ、３００ｎｇ及び５００ｎｇ）のＢＳＡ標準をＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルに充填して、抗原濃度を決定するために使用される標準曲線を作成した。画像をGel Doc system（BioRad Laboratories, Hercules, CA）によって撮影し、image Lab software（BioRad Laboratories, Hercules, CA）を用いて分析した。 様々なＴＢ抗原で免疫化されたマウスからのプール血清による、結核（ＴＢ）抗原を示すＣＲＭ１９７タンパク質の特異的認識。（Ａ）Ｈ４／Ｈ２８抗原を示すＣＲＭ１９７粒子、Ｈ４／Ｈ２８抗原及び可溶性Ｈ４／Ｈ２８抗原を示す精製ＣＲＭ１９７粒子を生成するClearColi細胞のタンパク質プロファイル。（Ｂ）精製ＣＲＭ１９７粒子（Ｃ粒子）で免疫化されたマウスのプール血清を使用することによる、ＣＲＭ１９７粒子プラットフォームの免疫原性分析。図１０Ｂにおける充填されるタンパク質の量は、図１０Ａに示されるＳＤＳ－ＰＡＧＥに充填されるタンパク質より５０倍少ない。（Ｃ）ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子（Ｃ－Ｈ４粒子）で免疫化されたマウスからのプール血清を用いた様々な抗原のウエスタンブロット分析。図１０Ｃにおける充填されるタンパク質の量は、図１０Ａに示されるＳＤＳ－ＰＡＧＥに充填されるタンパク質より１０～５０倍少ない。（Ｄ）ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子（Ｃ－Ｈ２８粒子）で免疫化されたマウスからのプール血清を用いた様々な試料のウエスタンブロット分析。図１０Ｅにおける充填されるタンパク質の量は、図１０Ａに示されるＳＤＳ－ＰＡＧＥに充填されるタンパク質より５０倍少ない。（Ｅ）Ｈ４で免疫化されたマウスからのプール血清を用いた様々な抗原のウエスタンブロット分析。図１０Ｅにおける充填されるタンパク質の量は、図１０Ａに示されるＳＤＳ－ＰＡＧＥに充填されるタンパク質より５０倍少ない。（Ｆ）Ｈ２８で免疫化されたマウスからのプール血清を用いた様々な抗原のウエスタンブロット分析。図１０Ｆにおける充填されるタンパク質の量は、図１０Ａに示されるＳＤＳ－ＰＡＧＥに充填されるタンパク質より５０倍少ない。レーン１、分子量マーカー（GangNam-Stainで予め染色されたタンパク質ラダー；iNtRon）；レーン２、ClearColi（ＤＥ３）／ｐＥＴ－１４ｂ；レーン３、ClearColi（ＤＥ３）／ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７、５８．５４４ｋＤａ；レーン４、ClearColi（ＤＥ３）／ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ４、９９．７０５ｋＤａ；レーン５、ClearColi（ＤＥ３）／ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ２８、１０７．２６９ｋＤａ；レーン６、ＣＲＭ１９７（５８．５４４ｋＤａ）；レーン７、ＣＲＭ１９７－Ｈ４（９９．７０５ｋＤａ）；レーン８、ＣＲＭ１９７－Ｈ２８（１０７．２６９ｋＤａ）；レーン９、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４（４１．９８８ｋＤａ）；レーン１０、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８（４９．５５３ｋＤａ）。 可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４（Ａ）及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８（Ｂ）に応答してＥＣ５０として提示される異なる抗原で免疫化されたマウスにおける抗体反応。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃアイソタイプの特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。各データ点は、６匹のマウスからの結果±標準誤差を表す（Minitab 17）。 可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８による刺激の２４時間（ｈ）後のマウス脾細胞によるサイトカイン放出。最後の接種の３週間後、脾細胞を可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８とともに２４時間培養した。サイトカインの放出をサイトメトリービーズアレイによって測定した。各データ点は、６匹のマウスの平均±標準誤差を表す（Minitab 17）。 可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８による刺激の６０時間後のマウス脾細胞によるサイトカイン放出。最後の接種の３週間後、脾細胞を可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８とともに２４時間培養した。サイトカインの放出をサイトメトリービーズアレイによって測定した。各データ点は、６匹のマウスの平均±標準誤差を表す（Minitab 17）。 ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７を有するClearColi、SHuffle及びOrigami細胞（Ａ～Ｃ、スケールバー＝５００ｎｍ）並びに精製ＣＲＭ１９７タンパク質粒子（Ａ１～Ｃ１、スケールバー＝２００ｎｍ）のＴＥＭ画像。 ＣＲＭタンパク質アミノ酸配列及びジフテリア毒素のアラインメント。ＣＲＭのシグナルペプチドとの配列のアラインメントであり；四角い枠で囲まれた配列は、シグナルペプチド配列を表す。配列は、以下のように同定される：ＣＲＭ１９７タンパク質（配列番号４９）；ＣＲＭ２２８タンパク質（配列番号２３）；ＣＲＭ１７６タンパク質（配列番号２４）；ＣＲＭ１００１タンパク質（配列番号２５）；ＣＲＭ４５タンパク質（配列番号２６）；及びジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）に由来するジフテリア毒素タンパク質（配列番号２７）。 ＣＲＭタンパク質アミノ酸配列及びジフテリア毒素のアラインメント。シグナルペプチドなしの配列のアラインメントである。配列は、以下のように同定される：ＣＲＭ１９７タンパク質（配列番号５０）；ＣＲＭ２２８タンパク質（配列番号５１）；ＣＲＭ１７６タンパク質（配列番号５２）；ＣＲＭ１００１タンパク質（配列番号５３）；ＣＲＭ４５タンパク質（配列番号５４）；及びジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）に由来するジフテリア毒素タンパク質（配列番号５５）。 ＣＲＭ１９７－ＴＢ粒子によって誘導される免疫反応に対するＤＤＡアジュバントの効果。ａ ０．１～１００μｇ／ｍＬの様々な濃度におけるＨ４又はＣ－Ｈ４（Ｈ４に融合されたＣＲＭ１９７タンパク質）に応答したＴ細胞増殖。ｂ Ｈ４刺激に応答した、ＤＤＡアジュバントを用いて及び／又は用いずに試験されたマウスからの脾細胞のIFNγ ELISpotアッセイ。ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ。様々な接種されたマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞をＨ４で刺激した。細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ Ｈ４刺激に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色アッセイ。細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。ｏ ＣＤ４＋Ｔ細胞の複数の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ。細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２及びＴＮＦ）を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。各データ点は、４匹のマウスからの結果±ＳＥＭを表す。統計的有意性を、テューキー又はダネットの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに１元配置ＡＮＯＶＡによって計算した。Ｃ－ＷＴ＝ＣＲＭ１９７粒子；ＤＤＡアジュバント中で乳化されたＣ－ＷＴ／ＤＤＡ＝ＣＲＭ１９７粒子；Ｃ－Ｈ４＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；ＤＤＡアジュバント中で乳化されたＣ－Ｈ４／ＤＤＡ＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；ＢＣＧ＝バシル・カルメット・ゲラン（Bacille Calmette-Guerin）として知られている弱毒生ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）。 Ｈ４、Ｈ２８、ＣＦＰ、ＣｏｎＡ又は培地刺激に応答した、様々なＣＲＭ１９７－ＴＢ抗原粒子を注入されたマウスからの脾細胞のIFNγ ELISpotアッセイ。各データ点は、４匹のマウスからの結果±ＳＥＭを表す。統計的有意性を、テューキーの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに１元配置ＡＮＯＶＡによって計算した。Ｃ－ＷＴ＝ＣＲＭ１９７粒子；Ｃ－Ｈ４＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；Ｃ－Ｈ２８＝ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子；ＣＦＰ＝ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からの培養ろ液タンパク質；ＢＣＧ＝バシル・カルメット・ゲラン（Bacille Calmette-Guerin）として知られている弱毒生ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）。 Ｈ４刺激によるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ 様々な接種されたマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞をＨ４で刺激した。細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ 細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。各データ点は、４匹のマウスからの結果±ＳＥＭを表す。統計的有意性を、テューキー又はダネットの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに１元配置ＡＮＯＶＡによって計算した。ＣＦＰ－ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からの培養ろ液タンパク質；Ｃ－ＷＴ＝ＣＲＭ１９７粒子；Ｃ－Ｈ４＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；Ｃ－Ｈ２８＝ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子；ＢＣＧ＝バシル・カルメット・ゲラン（Bacille Calmette-Guerin）として知られている弱毒生ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）。 Ｈ２８刺激によるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ 様々な試験マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞をＨ２８で刺激した。細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ 細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。各データ点は、４匹のマウスからの結果±ＳＥＭを表す。統計的有意性を、テューキー又はダネットの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに１元配置ＡＮＯＶＡによって計算した。ＣＦＰ＝ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からの培養ろ液タンパク質；Ｃ－ＷＴ＝ＣＲＭ１９７粒子；Ｃ－Ｈ４＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；Ｃ－Ｈ２８＝ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子；ＢＣＧ＝バシル・カルメット・ゲラン（Bacille Calmette-Guerin）として知られている弱毒生ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）。 ＴＢ１０．４刺激によるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ 様々な接種されたマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＢ１０．４で刺激した。細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ 細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって検出した。各データ点は、４匹のマウスからの結果±ＳＥＭを表す。統計的有意性を、テューキー又はダネットの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに１元配置ＡＮＯＶＡによって計算した。ＣＦＰ＝ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からの培養ろ液タンパク質；Ｃ－ＷＴ＝ＣＲＭ１９７粒子；Ｃ－Ｈ４＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；Ｃ－Ｈ２８＝ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子；ＢＣＧ＝バシル・カルメット・ゲラン（Bacille Calmette-Guerin）として知られている弱毒生ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）。 ＥＬＩＳＡを用いた抗体反応の分析。異なる試験試料に応答したＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃをＥＬＩＳＡによって分析した。各データ点は、４匹のマウスからの結果±ＳＥＭを表す。統計的有意性を、テューキーの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに１元配置ＡＮＯＶＡによって計算した。ＣＦＰ＝ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からの培養ろ液タンパク質；Ｃ－ＷＴ＝ＣＲＭ１９７粒子；Ｃ－Ｈ４＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；Ｃ－Ｈ２８＝ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子；ＢＣＧ＝バシル・カルメット・ゲラン（Bacille Calmette-Guerin）として知られている弱毒生ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）。 ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）中で産生されたＤＤＡアジュバント、ＢＣＧ、ＣＦＰ及びアジュバント可溶性又は粒子状ＴＢ試験試料を投与されたマウスの肺（ａ）及び脾臓ＣＦＵ（ｂ）。マウスを試験試料の最後の投与の６週間後にヒト型結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに感染させた。ヒト型結核菌（M. tuberculosis）による感染は、感染用量の約１００個の生存細菌を用いたMiddlebrook空気感染装置（Glas-Col）を用いてエアロゾル経路によって行った。エアロゾルヒト型結核菌（M. tuberculosis）感染の４週間後に死後分析を行った。各データ点は、８匹のマウスからの結果±ＳＥＭを表す。統計的有意性を、テューキー又はダネットの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに１元配置ＡＮＯＶＡによって計算した。アスタリスクは、ＢＣＧ、ＣＦＰ、Ｃ－ＷＴ、Ｈ４、Ｃ－Ｈ４及びＨ２８試験群と有意差があることを示す。「ｎｓ」は、「有意差なし」を指す。ＣＦＰ＝ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からの培養ろ液タンパク質、Ｃ－ＷＴ＝ＣＲＭ１９７粒子；Ｃ－Ｈ４＝ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子；Ｃ－Ｈ２８＝ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子；ＢＣＧ＝バシル・カルメット・ゲラン（Bacille Calmette-Guerin）として知られている弱毒生ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）。 大腸菌（E. coli）菌株ClearColi（商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）中での粒子生成のための（Ａ）ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７、（Ｂ）ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｓ２、及び（Ｃ）ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２のプラスミド構築。Ｐ＊１７／Ｓ２／Ｐ＊１７－Ｓ２遺伝子をコードするＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩを用いたＤＮＡ加水分解により、ｐＵＣ５７＿Ｐ＊１７／ｐＵＣ５７＿Ｓ２／ｐＵＣ５７＿Ｐ＊１７－Ｓ２から単離した。得られた個々の遺伝子を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて線形化ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭベクター（ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ酵素消化によって生成される）にライゲートして、最終的なプラスミド：ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７／ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｓ２／ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２を生成した。ＣＲＭへの言及は、ＣＲＭ１９７への言及である。ＣＲＭ＝ＣＲＭ１９７；ＣＲＭ－Ｐ＊１７＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７；ＣＲＭ－Ｓ２＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２。 組み換え大腸菌（E. coli）ClearColi ＢＬ２１（商標）（ＤＥ３）菌株中でＣＲＭ、ＣＲＭ－Ｐ＊１７、ＣＲＭ－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子を生成するための、融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の概略図。ＣＲＭ＝ＣＲＭ１９７；ＣＲＭ－Ｐ＊１７＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７；ＣＲＭ－Ｓ２＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２。 全細胞溶解液及びクマシーブルーで染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びゲルによって分離された粒子を含有する単離ＣＲＭ１９７（「ＣＲＭ」）のタンパク質プロファイル分析。ＣＲＭ（５８．５ｋＤａ）、ＣＲＭ－Ｐ＊１７（６６．７ｋＤａ）、ＣＲＭ－Ｓ２（６６．７ｋＤａ）及びＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２（７４．９ｋＤａ）融合タンパク質を、それぞれのプラスミドを含有する大腸菌（E. coli）菌株ClearColi（商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）から単離した。融合タンパク質を質量分析法によって確認した。ＣＲＭ＝ＣＲＭ１９７；ＣＲＭ－Ｐ＊１７＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７；ＣＲＭ－Ｓ２＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２。 粒子を含有する配合されたＣＲＭ１９７（「ＣＲＭ」）の粒径及びゼータ電位。（Ａ）アラムアジュバントとの混合前及び後のＣＲＭ粒子のサイズ。（Ｂ）アラムアジュバントとの混合前及び後の様々なＣＲＭ粒子のゼータ電位。各ＣＲＭ粒子調製物の粒径及びゼータ電位を、Zetasizer Nano ZSを用いて３回測定した。測定の各データ点は、平均±標準誤差を表す。ＣＲＭ粒子＝ＣＲＭ１９７粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７粒子；ＣＲＭ－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子。 マウスにおけるＳｔｒｅｐＡ粒子試験の実験計画。（１）様々なＳｔｒｅｐＡ粒子、ＣＲＭ１９７粒子、ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７粒子、ＣＲＭ１９７－Ｓ２粒子及びＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子をエンドトキシンフリー大腸菌（E. coli）菌株ClearColi（商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）から抽出した。（２）マウスに、抗体分析のための免疫原性試験のためにアラムとともに滅菌ＣＲＭ１９７粒子調製物を投与した。（３）アラムアジュバント中で乳化されたＳｔｒｅｐＡ抗原を有するＣＲＭ１９７粒子による最後の免疫化の２週間後、マウスを１０μＬの体積中の感染用量の約５×１０８個のｃｆｕ／ｍｌで化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に鼻腔内で感染させた。一次免疫（ＰＩ）。顎下腺放血（ＳＢ）。筋肉内（ＩＭ）。ＣＲＭ粒子＝ＣＲＭ１９７粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７粒子；ＣＲＭ－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子。 ＣＲＭ１９７含有粒子調製物によるワクチン接種に対するマウスにおける抗原特異的抗体反応。（Ａ）各群についてＥＬＩＳＡによって分析されるＰ＊１７及びＫ４Ｓ２可溶性タンパク質に応答した全ＩｇＧ力価。（Ｂ）ＩｇＧサブタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３力価。血清分析を、ＰＩの４２日後に行った。各データ点は、５匹のマウスからの結果±標準誤差を表す。統計的分析を、テューキーの事後検定を用いた群間のペアワイズ比較のアルファベットによる表示によって示される統計的有意性（ｐ＜０．０５）を用いた１元配置ＡＮＯＶＡによって行った。ＣＲＭ粒子＝ＣＲＭ１９７粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７粒子；ＣＲＭ－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子。 ＣＲＭ１９７含有粒子を投与されたマウスからのプール血清を用いた、ウエスタンブロット分析によって評価される誘導された抗体の抗原特異的認識。この試験においてマウスに使用される粒子がブロットの上に示され、アラムが陰性対照として及びＰ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴが陽性対照として示される。対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥが左側に示される。ＣＲＭ粒子＝ＣＲＭ１９７粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７粒子；ＣＲＭ－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子。 ＣＲＭ１９７含有粒子を注入されたマウスに対する３つの時点の抗原特異的抗体反応。各群についてＥＬＩＳＡによって分析される（Ａ）Ｐ＊１７及び（Ｂ）Ｋ４Ｓ２可溶性タンパク質に応答した全ＩｇＧ力価。１回目の放血を一次免疫（ＰＩ）の２０日後に行い；２回目の放血をＰＩの２７日後に行い；３回目の放血をＰＩの３５日後に行った。各データ点は、５匹のマウスからの結果±標準誤差を表す。統計的分析を、テューキーの事後検定を用いた群間のペアワイズ比較のアルファベットによる表示によって示される統計的有意性（ｐ＜０．０５）を用いた１元配置ＡＮＯＶＡによって行った。ＣＲＭ粒子＝ＣＲＭ１９７粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７粒子；ＣＲＭ－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｓ２粒子；ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子。 ＨＣＶ抗原を含むＣＲＭ１９７粒子の生成のための融合タンパク質をコードする組み換え遺伝子の概略図。 精製ＣＲＭ１９７－ＨＣＶ抗原粒子のタンパク質プロファイル。レーン１、分子量マーカー（GangNam-Stainで予め染色されたタンパク質ラダー；iNtRon）；レーン２、ＣＲＭ１９７、５８．５ｋＤａ；レーン３、ＣＲＭ１９７－キメラタンパク質、１０９．３ｋＤａ；レーン４、ＣＲＭ１９７－Ｅ１－Ｅ２－ＮＳ３、１１８．８９ｋＤａ；レーン５、ＣＲＭ１９７－ＨｅｐＣ、８０．０４ｋＤａ。 ＴＢ診断抗原を組み込むＣＲＭ１９７粒子の生成のための融合タンパク質をコードする組み換え遺伝子の概略図。 ＣＲＭ１９７ ＴＢ診断試薬の溶解度分析。（Ａ）ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７、５８．５ｋＤａ、（Ｂ）ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、８７．６ｋＤａ、（Ｃ）ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、９６．４ｋＤａ、又は（Ｄ）ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、１０４．１ｋＤａを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞のタンパク質プロファイル。ｋＤａ、分子量マーカー（GangNam-Stainで予め染色されたタンパク質ラダー；iNtRon）；レーン１、ＣＲＭ１９７ ＴＢ診断試薬を産生するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞；レーン２、超音波処理及び遠心分離後の、８Ｍの尿素処理なしの細胞懸濁液の上清分画；ランド３、超音波処理及び遠心分離後の、８Ｍの尿素処理を用いた細胞懸濁液の上清分画。 精製ＣＲＭ１９７粒子ベースのＴＢ診断試薬のタンパク質プロファイル。ｋＤａ、分子量マーカー（GangNam-Stainで予め染色されたタンパク質ラダー；iNtRon）；レーン１、ＣＲＭ１９７、５８．５ｋＤａ；レーン２、ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、８７．６ｋＤａ；レーン３、ＣＲＭ１９７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、９６．４ｋＤａ；レーン４、ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、１０４．１ｋＤａ。 ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）から生成される粒子状ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子の免疫原性分析。ａ ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子の生成のための融合タンパク質（粒子状ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ及び粒子状ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質）をコードするハイブリッド遺伝子の概略図。ｂ 様々な精製ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子のタンパク質プロファイル。ｋＤａ、分子量マーカー（GangNam-Stainで予め染色されたタンパク質ラダー；iNtRon）；レーン１、ＣＲＭ１９７、５８．５ｋＤａ；レーン２、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ、８２．２ｋＤａ；レーン３、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質、１０４．６ｋＤａ。ｃ、ｄ １回目の追加接種の１週間後の、様々なＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子を用いて試験されたマウスの抗体反応。ｅ、ｆ ２回目の追加接種の２週間後の、様々なＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子を用いて試験されたマウスの抗体反応。ＣＲＭ粒子＝ＣＲＭ１９７粒子；ＣＲＭ１９７－Ｎ ｐｒｏ粒子＝ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子；ＣＲＭ－ＲＢＤ粒子＝ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子。 ＣＲＭ１９７粒子に組み込まれる場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原機能的立体構造の決定。粒子を、ｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において生成し、ＣＲＭ１９７粒子におけるＳ１又はＲＢＤの構造的配置を、ＡＣＥ２結合を分析することによって評価した。高結合プレート（Greiner Bio-One, Germany）を、０．０５％（ｖ／ｖ）のTween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５（ＰＢＳＴ）で希釈された１００μＬの５μｇ ｍＬ－１の精製ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子で４℃において一晩被覆した。ＣＲＭ１９７粒子及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子が陰性対照である。グリコシル化可溶性Ｓ１（University of Queensland, Australia）が陽性対照として使用される。プレートを２５℃で１時間にわたって１／１０００の濃度において、ＰＢＳＴで希釈されたアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ２）（ヒト）Ｆｃ融合（ＨＥＫ２９３）（Aviscera Bioscience Inc, USA）とともにインキュベートした。ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、プレートを２５℃で１時間にわたってタンパク質Ａ－ＨＲＰとともにインキュベートした。ｏ－フェニレンジアミン基質（Abbott Diagnostics, IL, USA）をシグナル発色のためにプレートに加えた。結果を、ELx808iuウルトラマイクロタイタープレートリーダー（Bio-Tek Instruments Inc., USA）を用いて４９０ｎｍで測定した。ｂ ＥＬＩＳＡを用いて感染されたヒト血清試料を診断することによる、ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子性能の評価。この実験は、単純盲検として行われる。Ｈ、ＣＲＭ１９７粒子；Ｉ、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子；Ｊ、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子；Ｋ、ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子。Ｓ１－ＲＢＤが陽性対照である。簡潔に述べると、高結合プレートを一晩、４℃でカーボネートコーティングバッファー（ｐＨ９．６）中において１００μＬの１μｇ ｍＬ－１の抗原で被覆した。プレートを３７℃で９０分間にわたってＰＢＳＴ中５％の脱脂乳でブロックしてから、３７℃で９０分間にわたって１／２，０００の濃度で一次抗体（感染及び非感染ヒト血漿試料）を加えた。洗浄後、次にプレートを１／３，０００の濃度で二次ＩｇＧとともにインキュベートし、ＯＰＤをシグナル発色のための基質として使用した。結果を４９２ｎｍで測定した。 ｐＭＣＳ６９を有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）から生成されたＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子の免疫原性分析。Ａ：ＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ－２抗原粒子を組み込むＣＲＭ１９７粒子の生成のための融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の概略図。ａ．１：ＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ－２抗原を有するＣＲＭ１９７粒子の生成を媒介するタンパク質の概略的構造。Ｂ：精製ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子のタンパク質プロファイル。ｋＤａ、分子量マーカー（GangNam-Stainで予め染色されたタンパク質ラダー；iNtRon）；レーン１、ＣＲＭ１９７、５８．５ｋＤａ；レーン２、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質、１０４．６ｋＤａ；レーン３、ＣＲＭ１９７－Ｓ１、１３６．９ｋＤａ。ｃ、ｄ １回目の追加接種の１週間後の、様々なＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子を接種されたマウスの抗体反応。ＣＲＭ１９７－Ｎ ｐｒｏ＝ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子；ＣＲＭ－Ｓ１＝ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子。 ＣＲＭ１９７粒子ベースのＱ熱粒子のタンパク質プロファイル。レーン１：精製ＣＲＭ１９７－ＣＯＸ粒子（１０１．１ｋＤａ）；レーン２：精製野生型ＣＲＭ１９７（５８．５ｋＤａ）；レーン３：全細胞ＣＲＭ１９７－ＣＯＸ粒子；レーン４：全細胞野生型ＣＲＭ１９７。 ＣＲＭ１９７ベースのＱ熱診断試薬のタンパク質プロファイル。レーン１：全細胞ＣＲＭ１９７－ＣＯＭ１（８６．４ｋＤａ）；レーン２：全細胞ＣＲＭ９７－ＧｒｏＥＬ（８３．１ｋＤａ）；レーン３：全細胞ＣＲＭ１９７－ＯｍｐＨ（８１．５ｋＤａ）；レーン４：全細胞ＣＲＭ１９７－ＹｂｇＦ（９３．０ｋＤａ）；レーン５：精製ＣＲＭ１９７－ＣＯＭ１粒子；レーン６：精製ＣＲＭ１９７－ＧｒｏＥＬ粒子；レーン７：精製ＣＲＭ１９７－ＯｍｐＨ粒子；レーン８：精製ＣＲＭ１９７－ＹｂｇＦ粒子。 ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子配合物を用いた中和抗体の誘導。プール血清を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラーク減少アッセイを用いて分析した。ＣＲＭ＝ＣＲＭ１９７粒子；ＣＲＭ－Ｎ＝ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子；ＣＲＭ－ＲＢＤ＝ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子。 完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の概略図。Ｓ１、受容体結合サブユニット；ＲＢＤ、受容体結合ドメイン；Ｓ２、膜融合サブユニット。 ２回目の追加接種の２週間後の、様々なＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子を用いて試験されたマウスの抗体反応。ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子は、Ｓ１を有するＣＲＭ１９７粒子及びＮタンパク質を有するＣＲＭ１９７粒子である。抗原粒子を、３つの配合物、ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子なしのアラムアジュバントのみ、アラム中で混合及び配合された各抗原を有する２つの別個のＣＲＭ１９７粒子並びにアラム中で配合されたＳ１を有するＣＲＭ１９７粒子で投与した。ＣＲＭ－Ｎ ｐｒｏ＝ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子；ＣＲＭ－Ｓ１＝ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子。
いくつかの図は、カラーの表示又は実体を含み得る。カラーの図は、要求に応じて本出願人又は該当する特許庁から入手可能である。特許庁から入手する場合、料金が課され得る。
配列の簡単な説明
配列番号１ ＣＲＭ１９７コード配列の核酸配列
配列番号２ 表２に記載されるＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３ ＣＲＭ１９７＿ＮｄｅＩ＿Ｆｗｄオリゴヌクレオチド配列
配列番号４ ＣＲＭ１９７＿ＢａｍＨＩ＿Ｒｅｖオリゴヌクレオチド配列
配列番号５ ＣＲＭ１９７ｓｔｏｐ＿ＢａｍＨＩ＿Ｒｅｖオリゴヌクレオチド配列
配列番号６ 実施例１に記載される結核Ｈ４抗原（ＡＧ８５Ｂ－ＴＢ１０．４）のアミノ酸配列
配列番号７ 実施例１に記載される結核Ｈ２８抗原（ＡＧ８５Ｂ－ＴＢ１０．４－ｒｖ２６６０ｃ）のアミノ酸配列
配列番号８ SpyTagペプチドのアミノ酸配列
配列番号９ Isopeptagペプチドのアミノ酸配列
配列番号１０ SnoopTagペプチドのアミノ酸配列
配列番号１１ SnoopTagJrペプチドのアミノ酸配列
配列番号１２ DogTagペプチドのアミノ酸配列
配列番号１３ SdyTagペプチドのアミノ酸配列
配列番号１４ ＥＬＫ１６ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１５ 結核Ｈ４抗原（ＡＧ８５Ｂ－ＴＢ１０．４）の核酸配列
配列番号１６ 結核Ｈ２８抗原（ＡＧ８５Ｂ－ＴＢ１０．４－ｒｖ２６６０ｃ）の核酸配列
配列番号１７ 化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のＭ－タンパク質に由来するペプチド断片（「Ｐ＊１７ペプチド」と呼ばれる）のアミノ酸配列
配列番号１８ 化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のＳｐｙＣＥＰタンパク質に由来するペプチド断片（「Ｓ２ペプチド」と呼ばれる）のアミノ酸配列
配列番号１９ 表２に記載されるＣＲＭ１９７－Ａｇ８５Ｂ－ＴＢ１０．４（ＣＲＭ１９７－Ｈ４）キメラタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２０ 表２に記載されるＣＲＭ１９７－Ａｇ８５Ｂ－ＴＢ１０．４－Ｒｖ２６６０ｃ（ＣＲＭ１９７－Ｈ２８）キメラタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１ 表３に記載されるＨｉｓ６－Ａｇ８５Ｂ－ＴＢ１０．４（Ｈｉｓ６－Ｈ４）のアミノ酸配列
配列番号２２ 表３に記載されるＨｉｓ６－Ａｇ８５Ｂ－ＴＢ１０．４－Ｒｖ２６６０ｃ（Ｈｉｓ６－Ｈ２８）のアミノ酸配列
配列番号２３ 図１５Ａに記載されるＣＲＭ２２８タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４ 図１５Ａに記載されるＣＲＭ１７６タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５ 図１５Ａに記載されるＣＲＭ１００１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２６ 図１５Ａに記載されるＣＲＭ４５タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７ 図１５Ａに記載されるジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）に由来するジフテリア毒素タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２８ 実施例５に記載されるＨＣＶコアタンパク質断片のアミノ酸配列
配列番号２９ 実施例５に記載されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質断片のアミノ酸配列
配列番号３０ 実施例５に記載されるＨＣＶ Ｅ１タンパク質断片のアミノ酸配列
配列番号３１ 実施例５に記載されるＨＣＶ Ｅ２タンパク質断片のアミノ酸配列
配列番号３２ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するα－クリスタリン（ＨｓｐＸ）ポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３３ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来する初期分泌抗原標的６ｋＤＡ（ＥＳＡＴ６）ポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３４ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来する培養ろ液タンパク質１０ｋＤａ（ＣＦＰ１０）のアミノ酸配列
配列番号３５ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するＲｖ１５０９ポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３６ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するＲｖ２６５８ｃポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３７ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するＲｖ１５０８ｃポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３８ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するＴＢ７．７ポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３９ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するＲｖ３６１５ｃポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号４０ 表４に記載されるヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するＲｖ３０２０ｃポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号４１ 実施例７に記載されるデングウイルスエンベロープ断片のアミノ酸配列
配列番号４２ 実施例７に記載されるデングウイルスカプシドタンパク質断片のアミノ酸配列
配列番号４３ 実施例５に記載されるＨＣＶコアタンパク質断片のアミノ酸配列
配列番号４４ 実施例５に記載されるＨＣＶゲノムからのポリタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５ 実施例５に記載されるＨＣＶ Ｅ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４６ 実施例５に記載されるＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２ポリタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７ 実施例７に記載されるデングウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４８ 実施例７に記載されるデングウイルスカプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４９ 図１５Ａに記載されるＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５０ 図１５Ｂに記載されるＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５１ 図１５Ｂに記載されるＣＲＭ２２８タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５２ 図１５Ｂに記載されるＣＲＭ１７６タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５３ 図１５Ｂに記載されるＣＲＭ１００１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５４ 図１５Ｂに記載されるＣＲＭ４５タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５５ 図１５Ｂに記載される、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）に由来するジフテリア毒素タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５６ 実施例９に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ（ヌクレオカプシド）ポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号５７ 実施例９に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ドメインのアミノ酸配列
配列番号５８ 実施例１０に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ１ドメインのアミノ酸配列
配列番号５９ 実施例１１に記載されるＱ熱抗原－ＣＯＸのアミノ酸配列
配列番号６０ 実施例１２に記載されるＱ熱抗原－Ｃｏｍ１のアミノ酸配列
配列番号６１ 実施例１２に記載される、融合タンパク質としての、Ｑ熱抗原－ＯｍｐＨに由来する予測Ｂ及びＴ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号６２ 実施例１２に記載されるＱ熱抗原－ＹｂｇＦのアミノ酸配列
配列番号６３ 実施例１２に記載される融合タンパク質としての、Ｑ熱ペプチド抗原－ＧｒｏＥＬに由来する予測Ｂ及びＴ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号６４ 実施例９に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６５ 表６に記載されるＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７ペプチド融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６６ 表６に記載されるＣＲＭ１９７－Ｓ２ペプチド融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６７ 表６に記載されるＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２ペプチド融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６８ 表６に記載されるＣＲＭ１９７－Ｐ＊１７－Ｓ２ペプチド融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６９ 実施例５に記載されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列
配列番号７０ 実施例５に記載される、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質に由来するペプチドのアミノ酸配列
配列番号７１ 実施例５に記載される、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に由来するペプチドのアミノ酸配列
配列番号７２ 実施例１２に記載される野生型Ｑ熱抗原－ＯｍｐＨのアミノ酸配列
配列番号７３ 実施例１２に記載される野生型Ｑ熱抗原－ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列
配列番号７４ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号７５ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号７６ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号７７ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号７８ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号７９ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８０ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８１ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８２ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８３ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８４ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８５ 表７に記載される、ＯｍｐＨに由来するＴ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８６ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８７ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８８ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号８９ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９０ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９１ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９２ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９３ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９４ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９５ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９６ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９７ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９８ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号９９ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＢ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号１００ 表７に記載される、ＧｒｏＥＬに由来するＴ細胞エピトープのアミノ酸配列
配列番号１０１ 実施例１０に記載される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の選択されたＳタンパク質アミノ酸配列
配列番号１０２ 実施例１０に記載される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１／Ｓ２フリン切断部位のアミノ酸配列
配列番号１０３ 実施例１０に記載される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２ドメインのＮ末端のアミノ酸配列
配列番号１０４ 実施例５に記載される、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に由来するペプチドのアミノ酸配列。
詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、ＣＲＭタンパク質、特にＣＲＭ１９７の組み換え産生中のバイオ廃棄物と本来であれば考えられる材料が免疫原性作用物質、より具体的には免疫原キャリア／送達系として使用され得るという予想外の発見によって予想される。
典型的に、ＣＲＭ１９７の可溶性形態（「可溶性ＣＲＭ１９７」とも呼ばれる）は、キャリアタンパク質及び／又はＣＲＭ１９７タンパク質の使用が必要とされる免疫剤（例えば、ワクチンなどのコンジュゲート免疫原性組成物）などの用途において使用するための所望又は標的の作用物質であった。したがって、組み換え発現系における免疫原キャリア系（本明細書において、「免疫原キャリア系」という用語が「抗原キャリア系」と同義的に使用されることに留意されたい）としてのＣＲＭ１９７の産生が焦点を当てられ、可溶性ＣＲＭ１９７の産生に向けて推進された。当技術分野において公知であるように、組み換え系における可溶性ＣＲＭ１９７の産生は、細胞の可溶性画分又は可溶性成分若しくは部分（培養培地若しくは細胞周辺腔など、又は遠心分離後に細胞溶解液の上清中で回収される）中のタンパク質の発現により又は代わりに封入体などの不溶性細胞実体から可溶性ＣＲＭ１９７を回収、転化若しくは抽出することにより達成され得るが、それに限定されない。可溶性ＣＲＭ１９７の回収時、不溶性ＣＲＭ１９７を含む細胞部分又は成分（典型的には封入体）は、さらなる使用のために無視され、バイオ廃棄物として処理されている。さらに、組み換え発現からのＣＲＭ１９７タンパク質回収の改良は、可溶性ＣＲＭ１９７の収率の増加に焦点を当てられている。意外なことに、本発明者らは、組み換えＣＲＭ１９７発現中に産生されたＣＲＭ１９７の通常廃棄される不溶性形態又は画分が免疫原性作用物質及び／又は免疫原キャリア系として作用し得ることを見出した。特に、組み換え細胞内で産生された封入体からの単離及び精製ＣＲＭ１９７：標的免疫原キメラの形態である場合、標的免疫原に融合されたＣＲＭ１９７タンパク質を含むインビボで集合したタンパク質粒子は、免疫原性作用物質及び／又は免疫原キャリア系及び免疫診断剤として作用し得ることが見出されたが、本発明がこの発見に限定されないことが理解されるであろう。
さらに、本発明者らは、免疫原性タンパク質（特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質）がその同種ヒト受容体に結合することができるように、ある形態において、細胞の封入体、特に組み換え発現系の細胞に由来する、ＣＲＭ（特にＣＲＭ１９７）アミノ酸配列及び免疫原性アミノ酸配列を含むタンパク質粒子が粒子中の免疫原性タンパク質の立体構造を保持していたことを見出した。したがって、本発明は、ある実施形態において、免疫原性タンパク質、断片若しくはエピトープの立体構造又は適切なタンパク質フォールディングを保持することが望ましい場合に有用であり得る。本発明は、多様な供給源、作用物質又は分子からの１つ又は複数の免疫原とともに使用するために一般化可能であり得ることが理解されるであろう。本発明者らは、ある場合には、本発明のタンパク質粒子が高い密度で産生され得ることも見出した。タンパク質粒子が対象への投与のために高濃度の溶液中で配合され得ることも観察された。ある場合には、前記高濃度の配合物が実質的に透明な溶液であり、対象に注入又は投与するのが容易であることも観察された。したがって、大規模な免疫化プログラムが所望される場合、高用量が投与されることが可能であり得る。したがって、本発明は、限定はされないが、ワクチン組成物などの組成物の成分の製造中、限定はされないが、コスト、収率、スケーラビリティ、下流の処理（例えば、可溶性不純物を除去するための）など、可溶性ＣＲＭ１９７の産生に対する１つ以上の従来の障壁を克服し得る。
ある実施形態において、本発明は、対象とする免疫原のサイズの制限によって妨げられ得、及び／又は製造することが厄介若しくは困難であり得る他の免疫原キャリア系又は免疫原性作用物質の有用な代替例を提供し得る。このような例が、製造するのが高価である（例えば、ウイルス構造タンパク質を折り畳んでＶＬＰを組み立て得る専用の細胞培養系における製造を必要とすることが多い）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であると、免疫原の提示のための骨格ウイルス構造タンパク質の立体構造に依存し、及び／又はＶＬＰの構造的完全性を保つために特定のサイズの対象とする免疫原の挿入を許容するしかない。本発明者らは、本発明のタンパク質粒子が候補免疫原のサイズ制限の影響をあまり受けないことができ、したがって迅速で及びコスト効率の高い方法で多価タンパク質粒子を製造することが可能であり得ることを見出した。
したがって、広い態様において、本発明は、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子、前記タンパク質粒子を含む組成物、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列及び１つ以上の免疫原に由来するか、それに対応するか、又は１つ以上の免疫原の１つ以上の免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質の投与を含む方法及び検出方法などにおけるこのようなタンパク質粒子の他の使用に関し得る。したがって、本発明は、タンパク質粒子が、対象とする１つ以上の免疫原をさらに含み得る、本明細書に記載される方法にも関する。
本明細書において使用される際の「ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列」は、本明細書に記載されるようにジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）に由来する突然変異体ジフテリア毒素である、交差反応物質（ＣＲＭ）タンパク質のアミノ酸配列に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を指す。「ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列」という用語は、本明細書において「ＣＲＭアミノ酸配列」と同義的に使用され得る。さらに、「ジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質」という用語は、「ＣＲＭタンパク質」と同義的に使用され得る。「ジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質」、「ＣＲＭタンパク質」又は本明細書に記載される変形は、トキソイドと呼ばれ得ることが理解されるであろう。「ＣＲＭアミノ酸配列」は、ＣＲＭタンパク質の断片、変異体若しくは誘導体のアミノ酸配列を含むことが理解されるであろう。１つ以上のＣＲＭタンパク質及びＤＴの例示的なアミノ酸配列は、本明細書における図１５Ａ及び１５Ｂ中に見出され得る。
上述されるように、ジフテリア毒素のＣＲＭタンパク質は、当業者によって理解されるように、ジフテリア毒素と免疫学的に交差反応性であり、一般にジフテリア毒素と配列又は構造的類似性を共有し得るが、ジフテリア毒素と異なる実質的に非毒性の突然変異形態のジフテリア毒素に関する。ＣＲＭタンパク質は、天然又は野生型ジフテリア毒素アミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。ＣＲＭタンパク質は、天然又は野生型ジフテリア毒素アミノ酸配列と比較してアミノ酸配列の欠失を有し得ることが想定される。典型的には、限定はされないが、ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の突然変異したｔｏｘ遺伝子に由来し得る。ＣＲＭタンパク質は、連鎖停止突然変異を有し得る。ＣＲＭタンパク質は、ミスセンス突然変異を有し得る。好適には、ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素の突然変異形態である。ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素との１つ以上の抗原／免疫原性類似性のため、ジフテリア抗毒素と交差反応することが理解されるであろう。したがって、ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性の免疫学的に交差反応性の形態であり得るか、又はジフテリア毒素の少なくとも実質的に非毒性の免疫学的に交差反応性の形態であり得る。本明細書に記載されるＣＲＭタンパク質及び／又はＣＲＭアミノ酸配列は、免疫原性作用物質及び／又はキャリアタンパク質としての使用、特にワクチン製剤などの免疫原性組成物における使用に好適であることが想定されるが、それに限定されない。ある実施形態において、好適なＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素の１つ以上の有毒な性質を実質的に保持及び／又は表示しないことが理解されるであろう。ジフテリア毒素に関連する毒性は、当業者によって容易に解明可能又は認識可能であり、インビトロアッセイ（例えば、細胞ベースの若しくは無細胞の細胞毒性アッセイ）又はインビボアッセイ（例えば、好適な非ヒト動物モデルにおける致死量アッセイ若しくはＬＤ５０アッセイ）を含み得る。ある実施形態において、ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素において通常見られる活性若しくは特性（又はその複数）の一部、おそらく全てを喪失していることがある。ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ジスルフィド架橋によって一緒に連結されるＡ（活性）ドメイン及びＢ（結合）ドメインを含有する５３５アミノ酸の単一のポリペプチド鎖として合成されるジフテリア菌（Cornybacterium diphtheriae）の２成分外毒素である。ジフテリア毒素は、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）のｔｏｘ遺伝子によってコードされる。ジフテリア毒素は、当業者に公知である。ジフテリア毒素の例示的なアミノ酸配列は、GenBank受託番号ＡＡＶ７０４８６．１を参照することによって見出され得るが、それに限定されない。ジフテリア毒素のさらなる例示的な配列は、配列番号２７又は配列番号５５に記載されるアミノ酸配列に見出され得る。配列番号５５に記載されるＤＴのアミノ酸配列は、シグナルペプチド又は開始メチオニンを含まないＤＴの成熟した十分にプロセシングされた形態のアミノ酸配列である。本明細書全体を通して、ＤＴタンパク質におけるアミノ酸位置又は番号付けに言及される場合、このような番号付けは、配列番号５５に記載されるアミノ酸配列を参照して行われ、配列番号５５における第１のアミノ酸残基（グリシン残基）は、１位である。
参照により本明細書に援用されるHolmes, R. (2000), The Journal of Infectious Diseases, 181: S156-S167が参照され、これは、ＤＴ及びその特性の非限定的な説明を提供する。ＤＴは、２つの断片（Ａ及びＢ）を含むＡＤＰリボース化酵素である。断片Ａ（ＤＴのアミノ酸残基１～１９０）は、基質としてＮＡＤを使用し、これは、ニコチンアミド環とＮ－リボースとの間のＮ－グリコシド結合の切断を触媒し、延長因子ＥＦ－２の修飾ヒスチジン７１５（ジフタミド）へのＡＤＰ－リボース（ＡＤＰＲＴ活性）の共有結合転移を媒介する。この翻訳後ジフタミド修飾は、ＥＦ－２を不活性化し、タンパク質合成を停止させ、細胞死をもたらす。Ａ断片（Ｃドメインとも呼ばれる）は、触媒活性部位を有し、中毒の最終段階で必要とされる毒素の唯一の断片である。Ｂ断片上にあるＲドメイン（ＤＴのアミノ酸残基３８６～５３５にわたる）は、宿主細胞表面上の受容体への結合を媒介し、同様にＢ断片上にあるＴドメイン（ＤＴのアミノ酸残基２０１～３８４にわたる）は、細胞質への断片ＡのｐＨ依存性転移を促進する。アルギニンリッチジスルフィド連結ループは、断片Ａを断片Ｂに（又はドメインＣをドメインＴＲに）結合する。この鎖間ジスルフィド結合は、１８６位における鎖のタンパク分解切断後の２つの断片間の唯一の共有連結である。ジフテリア毒素は、ヘパリン結合上皮成長因子前駆体に結合する。活性又は特性は、断片Ａに関連するヌクレアーゼ活性、翻訳阻害活性又は受容体結合活性に関連し得るが、それに限定されないことが理解されるであろう。単なる例として、本明細書において使用される際のＣＲＭタンパク質は、ＮＡＤに結合する減少した能力を有し得、これは、したがって、ジフテリア毒素の有毒な性質を少なくとも部分的に減少させるか又は場合によりなくし得る。ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素との構造的類似性を示し得る。好適には、ＣＲＭタンパク質は、ジフテリア毒素の免疫刺激活性を保持し得る。ＣＲＭは、任意のサイズ及び組成物のものであり得、ＤＴの少なくとも一部を含有し得ることが想定される。
本発明において使用され得る、ジフテリア毒素と免疫学的に交差反応性であるＣＲＭタンパク質の非限定的な例としては、限定はされないが、ＣＲＭ１９７（本明細書に記載される）、ＣＲＭ４５（ＣＲＭ４５は、天然ジフテリア毒素の最後の１４９ Ｃ末端アミノ酸残基を欠いており；ＣＲＭ１９７及びＣＲＭ４５の例示的なアミノ酸配列は、参照により本明細書に援用されるGiannini et al., Nucleic Acids Res. (1984), 12(10): 4063に見出され得る）、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ２２８（ＣＲＭ２２８は、天然ジフテリア毒素と比較して置換された５つの残基：Ｇ７９Ｄ、Ｅ１６２Ｋ、Ｓ１９７Ｇ、Ｐ３７８Ｓ及びＧ４３１Ｓを含み、天然ジフテリア毒素の結合活性の約１５％～約２０％を示し、ＡＤＰＲＴ活性を示さないＣＲＭ２２８をもたらす）並びにＣＲＭ１７６（１２８におけるグリシンの、アスパラギン酸への置換；ＣＲＭ１７６の例示的なアミノ酸配列及び部分的な機能的特性評価は、参照により本明細書に援用されるMaxwell et al., (1987) Mol Cell Biol. 7: 1576に記載されている）が挙げられる。ＤＴの機能的な非毒性の突然変異体であるＣＲＭ１００１は、参照により本明細書に援用されるDavid M. Neville et al., (1986) Ann Rev Biochem. 55: 195-224によって記載されるように、単一の突然変異、Ｃ４７１Ｙを含む。本発明は、複数のジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含むジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列も想定している。参照により本明細書に援用される“The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins”, Eds Alouf et al., 2005, Third Edition, Academic Pressが参照され、これは、ジフテリア毒素ＣＲＭの概説を提供する。いくつかのＣＲＭタンパク質のアミノ酸配列アラインメントが図１５Ａ及び１５Ｂに示される。ある実施形態によれば、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質、ＣＲＭ４５タンパク質、ＣＲＭ１００１タンパク質、ＣＲＭ２２８タンパク質、ＣＲＭ１７６タンパク質及びＣＲＭ３０タンパク質からなる群から選択されるＣＲＭタンパク質並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれであり得、その断片、変異体及び誘導体を含み得る。したがって、ある実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、その断片、変異体又は誘導体を含む複数の異なるＣＲＭタンパク質に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含み得ることが想定される。ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、同じＣＲＭタンパク質（その断片、変異体又は誘導体を含む）の異なる部分又は領域に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含み得ることも想定される。
ある好ましい実施形態において、ＣＲＭタンパク質は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。本明細書において使用される際、「ＣＲＭ１９７」及び「ＣＲＭ１９７タンパク質」という用語（並びにその変化形）は、ジフテリア毒素の非毒性の突然変異体を指し、これは、野生型ジフテリア毒素の５２位におけるグリシン残基のグルタメートへの触媒ドメイン内のアミノ酸置換だけジフテリア毒素と異なる。何らかの特定の理論によって制約されることを望むものではないが、この突然変異は、ＣＲＭ１９７におけるＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ活性の喪失に関与するものと考えられる。ＣＲＭ１９７は、結合活性を保持する。Giannini et al (1984) Nucleic Acids Research, 12: 4063が参照され、これは、例示的なＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列を記載している。参照により本明細書に援用されるBroeker et al. (2011) Biologicals 39: 195が参照され、これは、ＣＲＭ１９７タンパク質の例示的な特性を記載している。本発明に関して、ＣＲＭ１９７タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２、４９及び／又は５０のいずれか１つに記載される。ある実施形態において、ＣＲＭ１９７タンパク質の又はＣＲＭ１９７タンパク質に由来するアミノ酸配列は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む。配列番号５０が特に参照され、これは、十分にプロセシングされたＣＲＭ１９７タンパク質（すなわちリーダー若しくはシグナルペプチド配列又は開始メチオニンを有さない）のアミノ酸配列である。本明細書全体を通して、ＣＲＭ１９７タンパク質におけるアミノ酸位置又は番号付けに言及される場合、このような番号付けは、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を参照して行われ、配列番号５０における第１のアミノ酸残基（グリシン残基）は、１位である。ＣＲＭ１９７タンパク質のさらなる例示的なアミノ酸配列は、Giannini et al（1984；上記を参照されたい）に記載される。
本発明に関して、ＣＲＭ２２８タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２３及び／又は配列番号５１に記載される。ＣＲＭ１７６タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は配列番号５２に記載される。ＣＲＭ１００１タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２５及び／又は配列番号５３に記載されることが理解されるであろう。本発明に関して、ＣＲＭ４５タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２６及び／又は配列番号５４に記載される。
ある実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。特定の実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれであり得る。
本発明は、本明細書に記載される完全長ＣＲＭタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応するＣＲＭアミノ酸配列を想定している。本発明は、天然であり得るか又はＣＲＭタンパク質の１つ以上の生物学的及び／又は物理的特性に影響を与えずにＣＲＭアミノ酸配列に人工的に導入される、突然変異又は変形（限定はされないが、置換、欠失及び／又は付加を含む）も想定していることが当業者によって理解されるであろう。本発明に関して、ＣＲＭタンパク質及び／又はＣＲＭアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号２３～２６及び／又は配列番号４９～５４のいずれか１つに記載されるポリペプチド並びにその天然若しくは人工的変異体を含む全てのこのようなタンパク質、ポリペプチド、断片、突然変異体及び変異体を包含することが理解され、変異体は、ＣＲＭタンパク質の１つ以上の生物学的及び／又は物理的特性、例えば細胞毒性がないか又はＤＴと比較して低下した細胞毒性、免疫原性（ただし、それに限定されない）を保持する。さらに、ＣＲＭタンパク質の断片は、限定はされないが、配列番号２、配列番号２３～２６及び／又は配列番号４９～５４のいずれか１つに記載される配列など、本明細書に記載されるタンパク質の断片だけでなく、タンパク質の天然又は人工的変異体の対応する断片も含む。
ある好ましい実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体の又はそれに由来するアミノ酸配列に由来するか又はそれに対応し得る。好ましくは、ＣＲＭ１９７タンパク質に由来するか若しくはそれに対応するＣＲＭ配列アミノ酸配列及び／又はアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４９及び／又は配列番号５０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれであり得る。ある好ましい実施形態において、ＣＲＭ１９７タンパク質に由来するか若しくはそれに対応するＣＲＭ配列及び／又はアミノ酸配列は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列であるか又はそれ含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれであり得る。理解されるように、本発明は、ＣＲＭ１９７タンパク質の断片、変異体又は誘導体、ある実施形態において配列番号２、配列番号４９及び／又は配列番号５０に記載されるＣＲＭ１９７タンパク質を想定している。
本明細書において一般に使用される際、「免疫学的」及び「免疫原性」は、対象への投与時に免疫反応を引き起こすための作用物質（例えば、タンパク質粒子、タンパク質、断片、組成物など）の能力又は特性を指す。
本明細書において使用される際の「免疫原」及び「対象とする免疫原」という用語は、免疫反応、より具体的には、限定はされないが、防御免疫反応、細胞媒介性反応、抗体（例えば、中和抗体）反応又は記憶免疫反応などの特異的又は所望の免疫反応を引き起こすことが可能な分子を指す。「免疫原」及び「対象とする免疫原」という用語は、本明細書において「抗原」又は「抗原性」と同義的に使用され得る。免疫原は、タンパク性分子であり得る。免疫原は、限定はされないが、多糖及び／又はグリカンなどの非タンパク性分子であり得ることも想定される。「免疫原性配列」、「免疫原性タンパク質」、「免疫原性断片」又は「免疫原性アミノ酸配列」という用語は、典型的に、タンパク質又は前記タンパク質の断片、変異体若しくは誘導体に由来するか、又はそれに対応するか、又はそれらの免疫原を包含する実施形態に関する。「エピトープ」という用語は、免疫原性タンパク質、配列、断片又はアミノ酸配列を表すためにも使用され得る。タンパク質由来の免疫原は、タンパク質の連続又は非連続配列アミノ酸を含み得、免疫原は、抗体又は他の抗原受容体など、免疫系の要素によって認識又は結合され得る。免疫原又は抗原は、後述され及び当業者に公知である、免疫学的反応を引き起こす１つ以上のエピトープ（例えば、線形、立体構造のいずれか又は両方）を含み得る。通常、免疫原性タンパク質に由来するＢ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含み得るが、３～４個のアミノ酸程度であり得る。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープなどの免疫原性タンパク質に由来するＴ細胞エピトープは、少なくとも約７～９個のアミノ酸を含み得、ヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２～２０個のアミノ酸を含み得る。多糖（限定はされないが）などの非タンパク質由来の免疫原は、本明細書に記載されるものなどの１つ以上のエピトープを含み得る。本発明は、当技術分野において公知であるように、エピトープの構造を模倣するミモトープの使用も想定している。本発明は、同じ又は異なる作用物質、分子又は供給源に由来する１つ又は複数の免疫原性断片又は配列を含み得る「ポリトープ」タンパク質も想定している。例えば、ポリトープにおける前記配列又は断片は、単独で又は反復として存在し得、これは、縦列反復の断片も含む。「ポリトープ」は、増幅した免疫反応が所望されるか、又は異なるタイプの免疫反応が所望される場合に有用であり得る。当業者は、意図される目的のために好適であり得る適切な長さのエピトープを容易に理解するか又は導くであろう。「免疫原」という用語は、例えば、免疫原が天然に関連する全生物と分離した及び異なる免疫原並びに殺滅された、弱毒化した又は不活性化された細菌、ウイルス、真菌、寄生生物又は他の微生物である両方のサブユニット免疫原を示し得る。多糖などの免疫原は、Ｔ細胞依存性反応を引き起こし得る。抗イディオタイプ抗体などの抗体又はその断片及び免疫原又は免疫原性決定因子を模倣し得る合成ペプチドミモトープも想定される。上記を考慮して、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、多様な標的抗原とともに使用するのに有用であり得ることが理解されるであろう。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原をさらに含む。本明細書に記載されるジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外のその又はそれぞれの免疫原は、免疫反応を引き起こし得るジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の任意の免疫原（ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列に由来するタンパク質又はポリペプチドを含む）であり得ることが理解されるであろう。特定の実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列（ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列に由来するタンパク質又はポリペプチドを含む）自体が対象への好適な投与時免疫反応を引き起こし得ることが理解されるであろう。
特定の実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外のその又はそれぞれの免疫原は、免疫原性アミノ酸配列を含む。ある実施形態において、１つ以上の免疫原は、ＣＲＭ１９７アミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原であり得る。
ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列、免疫原性配列、免疫原性タンパク質、免疫原性断片などは、本明細書に記載される１つ以上の実施例、表及び／又は図に記載される１つ以上のアミノ酸配列に由来するか又はそれに対応するか、それを含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれであることが考えられる。
本明細書全体を通して、「ポリペプチド」、「タンパク性分子」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマー並びにその変異体、断片、誘導体及び合成類似体を指すために本明細書において同義的に使用される。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の非天然アミノ酸、例えば対応する天然アミノ酸並びに天然アミノ酸ポリマーの化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用され得る。アミノ酸残基は、Ｄ－又はＬ－アミノ酸にも適用され得る。これらの用語は、修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを除外しない。
本発明に関して「に対応する」又は「に対応している」とは、別のアミノ酸配列又は核酸配列の一次配列特徴を共有するが、必ずしも前記別のアミノ酸配列又は前記核酸配列と同じ供給源に由来するか又は同じ供給源から得られるわけではないアミノ酸配列又は核酸配列を意味する。
「ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子が細胞に由来する」などは、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む粒子状構造を意味し、タンパク質粒子は、細胞に由来するか、細胞から得られるか又は他に細胞から調製される。「タンパク質粒子」という用語は、本明細書においてこの表現と同義的に使用され得る。ある実施形態において、細胞に由来するタンパク質粒子は、本明細書に記載される細胞から単離、精製及び／又は実質的に精製され得る。タンパク質粒子は、実質的に粒子状のタンパク質構造を有し得る。ある実施形態において、必ずしも全てではないが、大部分（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超える）が粒子状形態を有し得ることが想定される。ある実施形態において、タンパク質粒子は、粒子がそれから得られるか又は形成されるタンパク質分子以外の材料を含まないか又は実質的に含まなくてもよい。ある実施形態において、タンパク質粒子は、細胞から形成されるか又は組み立てられ得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、細胞内で発現され得る。好適には、ある実施形態において、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列が細胞内で発現される場合、特定の実施形態において、タンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列から形成されるか、実質的に形成されるか、それに由来するか、それから得られるか、組み立てられるか又は他に生成され得る。好適には、細胞は、組み換え発現のための宿主細胞であり得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、組み換え技術によって細胞内で生成されるか、形成されるか、組み立てられるか又は発現され得、この組み換え技術は、好適には、本明細書に記載される組み換えＤＮＡ技術であり得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含み、任意選択的にジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原をさらに含むアミノ酸配列の組み換え発現により、それに由来するか、それから得られるか、組み立てられるか、調製されるか、生成されるか又は形成され得る。これらの実施形態のいくつかによれば、その又はそれぞれの免疫原は、免疫原性アミノ酸配列を含み得る。ある好ましい実施形態によれば、タンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列及びジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原の免疫原性アミノ酸配列を含むアミノ酸配列の組み換え発現に由来するか、それから得られるか、それから単離されるか、それによって若しくはそれから生成されるか、組み立てられるか又は形成され得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、本明細書に記載される細胞の細胞内成分又は部分から得られるか、単離されるか又はそれに由来し得る。タンパク質粒子の１つ以上の成分は、任意の適切な結合型、例えば非共有結合、共有結合又はそれらの混合によって互いに連結され得ることが理解されるであろう。
タンパク質粒子は、任意の好適な形状であり得、球形、楕円、糸状、薄板状、円板状又は任意の他の形状であり得る。タンパク質粒子は、任意のサイズのものであり得る。ある実施形態において、タンパク質粒子又はそれを含む組成物若しくは配合物は、実質的に同じ平均粒径を有し得る（例えば、単分散である）ことが理解されるであろう。代わりに、不均一な粒径が望ましいことがある。本明細書に記載されるタンパク質粒子は、免疫系の１つ以上の細胞による取り込みを容易にするか又は促進するサイズ及び／又は形状を有し得る。例として、約０．０１μｍ～約１０μｍの平均粒径範囲を有するタンパク質粒子（又はそれを含む組成物若しくは配合物）は、ある実施形態において、抗原提示細胞による取り込みのために好適であり得る。抗原提示細胞によるタンパク質粒子の取り込みは、食作用によって行われ得るが、それに限定されない。別の例において、タンパク質粒子は、食作用によって抗原提示細胞によって取り込まれ得、これらの例によれば、約０．５μｍ～約１０μｍの平均粒径範囲を有するタンパク質粒子が好適であり得る。さらに別の例において、タンパク質粒子は、リンパ系の１つ以上の成分中への直接取り込み若しくは送達を容易にし、したがって免疫反応を引き起こすか又は刺激する平均サイズ及び／又は形状を有し得る。したがって、約５０ｎｍ以下の平均粒径を有するタンパク質粒子は、リンパ系の１つ以上の成分中への取り込みのために好適であり得る。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、約１ｎｍ～約８００μｍの平均粒径を有し得、約１００ｎｍ～約６００μｍの平均粒径を有し得、約３００ｎｍ～約５００μｍの平均粒径を有し得、約４００ｎｍ～約４００μｍの平均粒径を有し得、約８００ｎｍ～約２００μｍの平均粒径を有し得るか、又は約１μｍ～約１５０μｍの平均粒径を有し得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、約１００μｍ以下の平均粒径を有し得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、約３μｍ以下、約５μｍ以下、約１０μｍ以下、約２０μｍ以下、約３０μｍ以下、約５０μｍ以下、約７０μｍ以下又は約９０μｍ以下の平均粒径を有し得る。他の実施形態において、タンパク質粒子は、約５０ｎｍ以下の平均粒径を有し得る。他の実施形態において、タンパク質粒子は、約５００ｎｍ～約１０μｍの平均粒径を有し得る。
本明細書に記載されるタンパク質粒子は、単一のタンパク質（例えば、キメラタンパク質）から得られるか、組み立てられるか若しくは形成されるか又はそれを含み得る。代わりに、タンパク質粒子は、２つ以上の異なるタンパク質（例えば、キメラタンパク質）から得られるか、組み立てられるか、形成されるか又はそれを含み得る。タンパク質粒子は、タンパク質粒子の内部に免疫原を部分的に若しくは全体的に封入し得るか、又は代わりにタンパク質粒子の表面に免疫原を提示し得ることが想定される。タンパク質粒子は、免疫原を封入及び提示する組み合わされた形態を有し得ることも想定される。
本明細書に記載されるタンパク質粒子は、折り畳まれていない、異常に折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、及び／又は折り畳まれたタンパク質の混合物であり得ることが想定される。折り畳まれたタンパク質は、実質的に完全に折り畳まれたタンパク質であり得る。折り畳まれたタンパク質は、生物学的に活性であり得、及び／又は適切に折り畳まれ得る（例えば、立体構造エピトープを提示するように）。代わりに、タンパク質粒子は、折り畳まれていない、異常に折り畳まれた、折り畳まれたタンパク質及び／又は部分的に折り畳まれたタンパク質から実質的に形成され得る。タンパク質粒子は、異常に折り畳まれたタンパク質から実質的に形成され得ることも想定される。タンパク質の様々な状態又は形態の比率又は相対量は、発現レベル、発現系、対象とする免疫原などの要因に依存し得るが、それに限定されない。ある実施形態において、タンパク質粒子は、タンパク質分子の構造化集合によって形成され得、及び／又はそれは、凝集体構造（例えば、封入体から公知であるものなど）を形成し得るが、それに限定されない。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、規定の構造的幾何学形状を有するか若しくは有さない高次構造として又はそれに自己集合し得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、細胞の不溶性成分中で自己集合し得、ある実施形態において、不溶性成分は、封入体であり得る。ある実施形態において、不溶性成分及び／又は封入体は、細胞に由来するか、それから精製されるか、それから生成されるか、それから調製されるか、それから単離されるか又はそれから得られ得る。ある実施形態において、細胞は、本明細書に記載される組み換え発現のために好適であり得る。
「自己集合」という用語（及びその変化形）は、少なくとも部分的に、高次構造（例えば、タンパク質分子）の成分の互いに対する天然の吸引力に関与する、低次構造（例えば、単一のタンパク質分子又は複数のタンパク質分子を含むタンパク性分子）からの高次構造の自発的集合のプロセスを指す。典型的に、限定されず及び何らかの特定の理論によって制約されることを望むものではないが、自己集合は、サイズ、形状、組成及び／又は化学特性に基づいて、分子の不規則運動及び結合の形成によって起こる。本発明に係る粒子の自己集合性タンパク質成分は、好適な宿主において好適な方法で発現されるときに封入体（ＩＢ）を形成することが知られているペプチド／タンパク質であり得るか、又はそれは、所望の特徴を有する不溶性粒子を形成することが可能な特別に設計された配列であり得る。本発明に関して、自己集合は、粒子が好適な宿主において好適な方法で得られるタンパク質の増加した、高い若しくは過剰発現中及び／又はその結果として起こり得る。本発明は、高次構造への１つ又は複数のタンパク質分子の自己集合も包含し、特に、高次構造は、ＣＲＭアミノ酸配列及び任意選択的にＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ又は複数の免疫原又は免疫原性アミノ酸配列を含むタンパク質粒子であり得る。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、適切な宿主生物において発現されるときにタンパク質粒子に組み立てられるか、そのようなタンパク質粒子として生成されるか、又はそのようなタンパク質粒子に形成され得る。ある実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質に由来するアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
ある実施形態において、タンパク質粒子は、ＣＲＭアミノ酸配列、好ましくはＣＲＭ１９７アミノ酸配列から組み立てられるか、発現されるか、生成されるか若しくは形成され得るか又はそれを含み得る。好適には、タンパク質粒子は、ＣＲＭアミノ酸配列が宿主細胞内に発現されるとき、ＣＲＭアミノ酸配列から形成され、好ましくは、粒子は、ＣＲＭ１９７アミノ酸配列から形成される。
本明細書において使用される際の「実質的に」という用語は、一般に、大部分であるが、必ずしも全てではないことを意味する。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、細胞内で形成、生成又は発現され得る。他の実施形態において、タンパク質粒子は、細胞に由来するか、細胞内で形成されるか、生成されるか又は発現される実質的に不溶性のタンパク質粒子であり得る。したがって、タンパク質粒子（例えば、発現されたタンパク質に由来する）は、好ましくは、細胞内で発現されるとき、実質的に不溶性のタンパク質粒子を形成するか、それに折り畳まれるか又はそれに凝集し得る。ある実施形態において、本明細書に記載される実質的に不溶性のタンパク質粒子は、本明細書に記載されるタンパク質を含む粒子の形態の実質的に不溶性の実体を指し得る。実質的に不溶性のタンパク質粒子は、可溶性タンパク質の一部を含み得る。ある実施形態において、可溶性タンパク質の一部は、２０％未満、１５％、１０％、５％、１％未満の可溶性タンパク質であり得るか、又は可溶性タンパク質を本質的に含まなくてもよい。
ある実施形態において、タンパク質粒子及び／又は実質的に不溶性のタンパク質粒子は、細胞の不溶性（若しくは実質的に不溶性）成分、部分又は分画に由来するか、それから得られるか、生成されるか、それから調製されるか若しくは他にそれから単離又は除去され得るか、或いはそれらである。ある実施形態において、タンパク質粒子及び／又は実質的に不溶性のタンパク質粒子は、細胞内で形成される凝集体又は凝集体構造にも由来し得る。凝集体又は凝集体構造は、細胞の不溶性成分、部分又は分画の一部であるか又はそれに由来し得る。細胞の不溶性成分は、好適には、組み換え技術により、典型的には対象とするタンパク質の発現の結果として不溶性である１つ以上の特徴を示す細胞の任意の領域、部分又は分画であり得る。典型的に、不溶性成分は、対象とするタンパク質又はタンパク質粒子を含み、おそらく、限定的に、様々な立体配座状態（例えば、折り畳まれてない、異常に折り畳まれた、部分的に折り畳まれた又は折り畳まれてない及び適切に折り畳まれた形態）の対象とするタンパク質を含む。不溶性成分の対象とするタンパク質又はタンパク質粒子形成部分は、生物学的に活性であっても若しくはなくてもよいか、又は部分的に生物学的に活性であり得る。一般に、不溶性成分中の対象とするタンパク質は、実質的に折り畳まれてない若しくは異常に折り畳まれた形態であるか又は部分的に折り畳まれる。不溶性成分は、対象とするタンパク質以外の材料（例えば、他のタンパク質、脂質、小分子など）を実質的に含まなくてもよい。対象とするタンパク質又はタンパク質粒子を含む不溶性成分は、顕微鏡法及び他のイメージング方法によって視覚化されるものなどの高密度電子屈折性領域又は粒子であり得ることが理解されるであろう。不溶性成分は、当業者に公知の技術によってタンパク質可溶化に対して実質的に耐性であり得る。不溶性成分は、例えば、沈降場流動分画を用いたサイズ特性評価によっても特性評価又は決定され得る。不溶性成分は、上清及び細胞ペレット中への細胞溶解液の分離によっても特性評価され得、細胞ペレットは、不溶性成分を含む。このような分離方法は、典型的に、遠心分離による沈殿を含むが、それに限定されない。代わりに、不溶性成分は、当技術分野において公知であるように、変性剤（例えば尿素）中での可溶化、続いてゲル電気泳動による分離によって特性評価され得る。不溶性成分又は実質的に不溶性の成分は、細胞の核、細胞質及び／又は細胞周辺腔に見出され得る。不溶性成分又は実質的に不溶性の成分は、組み換え発現系における発現の結果として生じ得、特に当業者に公知であるように高レベルの組み換え発現から生じ得る。不溶性成分又は実質的に不溶性の成分は、膜によって囲まれ得る離散した物体であり得る。ある実施形態において、不溶性成分又は実質的に不溶性の成分は、封入体であり得る。ある実施形態において、封入体は、タンパク質粒子、凝集体及び／又は凝集体構造を含み得、凝集体及び／又は凝集体構造は、本明細書に記載されるタンパク質粒子であるか、それを含むか、それからなるか又はそれから本質的になる。
不溶性成分、凝集体、構造化粒子、封入体などの形成は、任意選択的に、好適なリンカーにより、タンパク質を凝集しやすいペプチドに連結することによって誘導され得ることが理解されるであろう。凝集しやすいペプチドの非限定的な例としては、ＥＬＫ１６ペプチド（ＬＥＬＥＬＫＬＫＬＥＬＥＬＫＬＫ；配列番号１４）などの自己集合性イオン性ペプチド又は参照により本明細書に援用されるZhou et al. (2012) Microb Cell Fact. 11: 10に記載されるものなどのペプチドのような界面活性剤が挙げられる。不溶性成分、好適には封入体への対象とするタンパク質の形成を誘導する他の好適な配列は、当業者に公知であろう。ある実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列は、本明細書に記載される凝集しやすいペプチドをさらに含み得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物など）と同等のサイズ及び／又は形状を有し得、これは、したがって、抗原提示細胞による取り込みを補助又は促進し得、したがって免疫原性を増大し得る。何らかの特定の理論によって制約されることを望むものではないが、病原体と同等であるか又は実質的にそれに対応するタンパク質粒子サイズは、自然免疫反応を刺激し得ることも理解されるが、それに限定されない。
いくつかの検出技術は、タンパク質がタンパク質粒子の立体構造に用いられているか若しくはタンパク質粒子に集合されていること又はサイズ、電荷分布及び機械的安定性などの他の粒子特徴を確認するために使用され得る。このような技術としては、電子顕微鏡法（例えば、ＳＥＭ、ＴＥＭ）を含む顕微鏡法、Ｘ線結晶構造解析、等温熱量測定、イメージフローサイトメトリー、動的光散乱、Ｘ線散乱、ゼータ電位測定又はＨＰＬＣ分析による間接的な方法などが挙げられる。例えば、低温電子顕微鏡法は、該当するタンパク質粒子調製物のガラス化した水性試料において行われ得、画像が適切な露光条件下で記録され得る。顕微鏡法などの検出方法は、サイズ分布を確認するのにも好適であり得る。サイズ分布試験又は分析は、限定はされないが、洗浄剤など、粒子の均質化又は分散を促進する作用物質の存在下又は非存在下で行われ得る。安定性試験は、当業者に公知であろう。例として、熱的又は溶媒安定性試験は、タンパク質粒子の安定性を確認又は理解するために用いられ得る。機械的安定性は、例えば、原子間力顕微鏡法に基づく単一分子方法を用いて理解され得る。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、他の方法によって作製された同等のタンパク質粒子と比較して強化、改善又は増大された機械的安定性を有する。タンパク質粒子、特に治療的用途に使用するためのタンパク質粒子を特性評価するための好適な方法の非限定的な例は、Probst et al. (2017)J Pharm Sci. 106 (8): 1952-1960；Analysis of Aggregates and Particles in Protein Pharmaceuticals, EDs: Hanns-Christian Mahler and Wim Jiskoot, John Wiley & Sons, Inc.に見出され、これらは、両方とも参照により本明細書に援用される。
タンパク質粒子の表面電荷は、測定又は分析され得ることが想定される。当業者によって公知であるように、粒子の表面電荷は、免疫系の１つ以上の細胞、例えば抗原提示細胞によって細胞取り込みに影響を与え得る。例として、樹状細胞によるタンパク質粒子の取り込みは、タンパク質粒子が正味の正荷電表面を有する場合、容易にされるか又は促進され得る。さらなる例として、負荷電粒子は、抗原提示細胞により、おそらく細胞膜内のカチオン性部位における負荷電粒子のオプソニン化又は吸着によって効果的に取り込まれ得るが、それに限定されない。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、負電荷又は正味の正電荷を有し得る。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子のある表面又はその表面は、正味の負電荷又は正味の正電荷を有し得る。本発明において使用するためのタンパク質粒子の好適な表面電荷は、当業者に公知であり、及び／又は容易に確認可能であろう。ゼータ電位は、例えば、ゼータ電位を測定するためのレーザードップラーマイクロ電気泳動技術（例えば、Malvern Panalytical製のZetasizer Nano ZSを用いて）を用いて測定される正味の電荷の決定のために有用であり得ることが想定される。このような技術では、電場が分子の溶液又は粒子の分散体に印加され、次に、それは、それらのゼータ電位に関連する速度で移動する。この速度は、電気泳動移動度を計算するために、光散乱などの好適な技術を用いて測定され得、これからゼータ電位及びゼータ電位分布が計算され得る。ある実施形態において、タンパク質粒子のゼータ電位測定は、約－１００ｍＶ～約１００ｍＶ、約－７０ｍＶ～約７０ｍＶ、約－５０ｍＶ～約５０ｍＶ、約－３０ｍＶ～約３０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約－５０ｍＶの範囲であり得るか、又は約－１０ｍＶ～約－３０ｍＶであり得ることが想定される。ある実施形態において、ゼータ電位は、約１００ｍＶ以下であり得、約５０ｍＶ以下であり得、約２０ｍＶ以下であり得、約１０ｍＶ以下であり得、約５ｍＶ以下であり得、約１ｍＶ以下であり得、約－１ｍＶ以下であり得、約－５ｍＶ以下であり得、約－１０ｍＶ以下であり得、約－１５ｍＶ以下であり得るか、又は約－２０ｍＶ以下であり得る。
本明細書に記載されるタンパク質粒子の形成及び特に自己集合プロセスによる形成は、ある実施形態において、アミノ酸配列が発現される１つ以上のパラメータの調節又は変更によって優先されるか若しくは選択的に促進されるか、増加されるか又は強化され得る。例として、細胞内の非常に高いレベルのタンパク質発現（例えば、バイオマス中の全タンパク質の５０％（ｗ／ｗ）、これは、全バイオマスの１００ｇの湿重量当たりの全タンパク質の５０ｇの湿重量に等しい）は、細胞の１つ以上のタンパク質折り畳み経路に過負荷をかけ得、これは、したがって、タンパク質粒子、好適には細胞の不溶性成分の形成又は集合を誘発し得る。何らかの特定の理論によって制約されることを望むものではないが、この誘発事象は、タンパク質間相互作用をもたらす、タンパク質産生の非常に速い速度に起因し得る。代わりに、細胞内部のＣＲＭアミノ酸配列、特にＣＲＭ１９７アミノ酸配列の過剰発現は、タンパク質の部分的な折り畳みをもたらし、これは、得られるタンパク質分子の表面における疎水性領域の増加をもたらし得る。次に、タンパク質間集合がこれらの疎水性領域を介してタンパク質分子間で起こり、一緒になってタンパク質粒子（好ましくは実質的に不溶性のタンパク質粒子）、超分子構造及び／又は細胞の不溶性成分を形成し得る。１つ以上のパラメータが変更されていない場合の発現レベル及び／又は収率と比べて、タンパク質発現レベル及び／又は収率を増加させるように変更され得る、タンパク質が発現される１つ以上のパラメータの非限定的な例は、培養条件（例えば、培養温度、発現宿主、誘導温度及び持続時間、バイオマス生産（グルコース（例えば、約１％ｗ／ｖのグルコースで）など）を促進するための添加剤の使用、精製タグ（６ｘＨＩＳなど）の非存在下における発現を含むか、又は他の融合パートナー配列は、少なくとも部分的に、可溶性タンパク質産生及び本明細書に記載されるコドン最適化などのタンパク質産生を増加させるための配列の包含を減少させ得る。このようなパラメータは、当業者に公知であるか又は確認可能であろう。
様々な方法は、免疫原が、本明細書に記載されるタンパク質粒子に好適に関連するか、それとともに形成されるか、折り畳まれるか又はその中若しくはその上に存在するかどうかを決定又は確認するために用いられ得ることが理解されるであろう。単なる例として、受容体結合アッセイが有用であり得る。代わりに、抗体結合アッセイが有用であり得るが、それに限定されない。当業者は、これらの実施形態に従って用いられる好適な方法を容易に確認するであろう。
ある好ましい実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、細胞の不溶性成分に由来するか、それから得られるか、それから単離されるか、その中で生成されるか、それから調製されるか若しくは他にそれから除去され得るか、又は細胞の不溶性成分である。ある実施形態において、不溶性成分は、細胞内で形成されるか、生成されるか、それに由来するか、それから得られるか、それから除去されるか、それから単離されるか又は発現される封入体であり得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、本明細書に記載される対象とするアミノ酸配列を任意選択的に含み得るＣＲＭアミノ酸配列に由来するか又はそれから形成され得る。したがって、タンパク質粒子は、細胞の不溶性成分に由来するか、それから得られるか又はそれから単離され得、ある好ましい実施形態において、不溶性成分は、細胞からの封入体若しくは細胞からの封入体調製物であり得るか、又は細胞から得られ、タンパク質粒子は、ＣＲＭアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から形成されるか又はそれに由来し得、より具体的には細胞内でのＣＲＭアミノ酸配列の発現から形成されるか又はそれに由来し得る。好適には、タンパク質粒子は、ＣＲＭアミノ酸配列が細胞内で発現されるとき、ＣＲＭアミノ酸配列から形成されるか又はそれに由来し得る。ある実施形態によれば、ＣＲＭアミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、細胞内でタンパク質粒子を形成するために組み換えタンパク質として発現され得、好ましくは実質的に不溶性のタンパク質粒子であり得、好ましくは、タンパク質粒子は、細胞の不溶性成分に由来するか、それから得られるか、それから単離されるか、生成されるか、調製されるか若しくは他にそれから除去され得るか、又は細胞の不溶性成分である。好適には、不溶性成分は、封入体であり得る。好ましくは、ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質に由来するアミノ酸配列（又は断片、変異体又は誘導体を含む）に由来するか又はそれに対応し得る。
ある実施形態における本発明の非限定的な利点は、方法及び組成物が、免疫原性作用物質又はキャリアタンパク質として、ＣＲＭタンパク質、特にＣＲＭ１９７の高度に精製された可溶性形態を使用する必要性を少なくとも部分的に回避するか又はなくし得ることを含み得る。当業者に公知であるように、細胞の不溶性成分、部分又は分画（封入体など）からの可溶性及び活性タンパク質の回収は、一般に、可溶化／変性、続いてタンパク質リフォールディングを必要とし、これは、典型的に、時間がかかり、高価であり、及び／又は面倒な工程であり、したがって洗浄剤及び／又はリフォールディング剤、例えば尿素及びグアニジン塩酸塩などの作用物質を除去するためにさらなる下流処理を必要とする。したがって、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、免疫原性作用物質として使用するための組み換え系における、可溶性ＣＲＭタンパク質（例えば、可溶性ＣＲＭ１９７タンパク質）の産生に典型的に付随する面倒な及び／又は高価な下流処理工程を最小限に抑え得るが、それに限定されない。
広い実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質粒子を想定し、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、タンパク質リフォールディング処理に供された、ジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質又はジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質の断片、変異体若しくは誘導体に由来していない。ある実施形態によれば、本発明は、ＣＲＭ１９７アミノ酸配列を含む、細胞に由来するタンパク質粒子を想定し、ＣＲＭ１９７アミノ酸配列は、タンパク質リフォールディング処理に供されたＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来していない。
本明細書において使用される際の「タンパク質リフォールディング処理」という用語は、可溶性タンパク性分子が不溶性タンパク性分子から形成されるか、又はそれから得られるか、単離されるか若しくはそれに由来する１つ以上の工程（連続的に実行されるか又は連続的に実行されない）を指す。理解されるように、不溶性タンパク質分子は、過剰発現、誤った折り畳み及び不溶性タンパク質形成が、細胞の可溶性成分若しくは分画中で又は細胞の可溶性成分若しくは分画としての形成より好ましい他の機構によって細胞内で形成され得る。不溶性タンパク性実体から可溶性タンパク質を形成するか又は得るためのタンパク質リフォールディングプロセスは、当業者によって理解されるであろう。タンパク質リフォールディング処理は、細胞内での発現（例えば、細胞成分中での可溶性発現）中又はタンパク質の発現が完了された後、細胞からのタンパク質粒子の回収中に行われ得る。例えば、不溶性タンパク性分子又は溶けずに形成されたタンパク性分子は、１つ以上の可溶化工程に曝された後、おそらく変性剤（使用される場合）の除去を含み得るリフォールディング工程が続き、それにより対象とするタンパク質の可溶性形態を得る又は生成し得る。可溶化工程は、不溶性形態を１つ以上の可溶化剤に曝露するか又は接触させて、不溶性形態を少なくとも部分的に変性することを含み得る。可溶化剤は、変性性、非変性性又は軽度の可溶化性であり得る。可溶化剤の非限定的な例としては、洗浄剤（例えば、非イオン性洗浄剤）又はカオトロピック剤（例えば、グアニジン塩酸塩若しくは尿素）が挙げられる。軽度の可溶化剤は、封入体中に存在する天然様のタンパク質構造を保持し、したがってリフォールディング工程を回避し得る。軽度の可溶化剤の非限定的な例としては、５％のｎ－プロパノールのような低濃度の有機溶媒及びＤＭＳＯ及び０．２％のＮ－ラウロイルサルコシンのような洗浄剤が挙げられる。可溶化剤及び／又はリフォールディング方法の組合せが想定される。適切な条件（例えば、限定はされないが、各作用物質の温度、ｐＨ及び濃度などの１つ以上のパラメータ）が当業者に理解され、確認可能であろう。リフォールディング工程が変性後に想定される場合、変性剤は、限定はされないが、透析、限外ろ過、マイクロ流体チップ技術、酵素媒介性リフォールディング（例えば、ウレアーゼ媒介性リフォールディング）、クロマトグラフィー（例えば、限定はされないが、ゲルろ過、液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどのオンカラムクロマトグラフィー）、希釈及び遠心分離などの任意の好適な技術により、可溶化された実体から除去され得る。収率を改善し、及び／又は凝集を少なくとも部分的に阻害し得る、フォールディングを促進するための１つ以上の添加剤の使用が想定される。好適な添加剤の非限定的な例としては、アミノ酸、糖、多価アルコール、低濃度のカオトロピック剤、スルホベタイン、置換ピリジン又はピロール及び酸置換アミノシクロヘキサンが挙げられる。Singh et al (2015) Microb Cell Fact. 14: 41は、好適なタンパク質リフォールディング技術の非限定的な例を説明しており、参照により本明細書に援用される。ある好ましい実施形態においてタンパク質リフォールディング処理は、発現が完了した後、細胞からのタンパク質粒子の回収中に行われ得る。
ある実施形態において、タンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されていない。好ましくは、不溶性成分（好適には封入体）に由来するタンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されていない。ある実施形態によれば、タンパク質粒子は、細胞に由来するか、細胞から単離されるか、除去されるか、調製されるか、生成されるか、得られるか又は他に除去され得、タンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されていない。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、溶解可能に発現されたか又は溶解可能に得られたＣＲＭアミノ酸配列から形成、調製、生成又は他に組み立てられていない。ある実施形態において、タンパク質粒子は、可溶性ＣＲＭタンパク質又は溶解可能に形成されたＣＲＭタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体を実質的に含まないか又は含まなくてもよい。他の実施形態において、タンパク質粒子は、タンパク質粒子の合成又は生成、好ましくは組み換え発現後にタンパク質リフォールディング処理に供された１つ以上のＣＲＭタンパク質又はＣＲＭアミノ酸配列によって形成又は組み立てられていない。好ましくは、ＣＲＭタンパク質又はＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列であり得る。溶解可能に発現されたタンパク質は、細胞の不溶性成分（例えば、封入体）中ではなく、細胞の可溶性成分、部分、分画中のタンパク質であり得る。溶解可能に得られたタンパク質は、タンパク質リフォールディング処理、より具体的にはタンパク質の発現後にタンパク質リフォールディング処理に供されたタンパク質であり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、タンパク質発現、好適には組み換えタンパク質発現後に行われるタンパク質リフォールディング処理によって得られず、調製されず、そのようなタンパク質リフォールディング処理に供されず、又はそれによって他に生成されない。ある実施形態において、本明細書に記載される細胞に由来するタンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されずに生成されるか、得られるか又は調製され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されていないか又は実質的に供されていない細胞の不溶性成分又は細胞の不溶性成分調製物から調製されるか、単離されるか、生成されるか、除去されるか、それに由来するか若しくは他にそれから得られ得るか又はそれである。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されていないか又は実質的に供されていない封入体又は封入体調製物から調製されるか、生成されるか、単離されるか、除去されるか、それに由来するか若しくは他にそれから得られ得るか又はそれである。ある実施形態において、タンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されていない封入体であり得る。
本明細書に記載されるタンパク質粒子は、単離タンパク質粒子であり得ることが理解されるであろう。本明細書に記載されるタンパク質は、単離タンパク質であり得ることが想定される。ある実施形態において、タンパク質粒子は、細胞又は本明細書に記載されるそれらの成分から単離され得る。タンパク質粒子は、当業者に公知であるように、及び本明細書に記載されるある実施形態に従って単離及び／又は精製され得る。
「単離」とは、自然状態から取り出された環境中で存在すること又は他に人の操作に供されたことを意味する。単離材料は、その自然状態で通常それに付随する成分を実質的に若しくは本質的に含まなくてもよいか、又はその自然状態で通常それに付随する成分を人工の状態で伴うように操作され得る。単離材料は、組み換え、化学合成、富化、精製及び／又は部分的に精製された形態であり得る。
本明細書において使用される際、「合成」とは、天然ではなく、人の技術的介入によって作製されることを意味する。合成タンパク質及び核酸に関して、これは、当技術分野において十分に理解されるような組み換え又は化学合成及び組合せ技術によって生成された分子を包含する。
本発明のある実施形態によれば、本明細書に記載されるタンパク質粒子及び／又は単離タンパク質が精製され得、特に細胞から精製され得ることが理解されるであろう。タンパク質粒子及び／又は単離タンパク質は、実質的に純粋であるか又は実質的に精製され得、ある実施形態において細胞から実質的に精製され得る。特定の実施形態において、細胞は、タンパク質粒子及び／又は単離タンパク質の組み換えタンパク質発現のための宿主細胞であり得る。本明細書に記載される精製された又は実質的に精製されたタンパク質粒子及び／又は単離タンパク質は、本発明の方法に従って組成物において使用するのに好適であり得る。
特に、タンパク質精製に関して、「精製する」、「精製された」及び「精製」とは、タンパク質又はタンパク質粒子、好ましくは組み換えタンパク質又は組み換えタンパク質粒子の相対存在量及び／又は比活性度が富化前のものと比較して増加されるような前記タンパク質又はタンパク質粒子、好ましくは組み換えタンパク質又は組み換えタンパク質粒子の富化を意味する。ある実施形態において、「純度」は、所望の分子の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９８％、９９％及び約１００％の純度に関連し得る。
本明細書において使用される際の「実質的に純粋」又は「実質的に精製された」という用語は、天然に又は通常それに付随する成分（汚染物質を含む）から分離された物質（限定はされないが、タンパク質粒子又は単離タンパク質などのタンパク性材料を含む）を表す。典型的に、全材料の少なくとも約６０％若しくは６５％、好ましくは少なくとも約７０％若しくは７５％、より好ましくは少なくとも約８０％若しくは８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％（体積、比活性度、湿重量若しくは乾燥重量又はモルパーセント若しくはモル分率基準で）が、対象とする材料である場合、物質は、実質的に純粋である。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子及び／又は実質的に不溶性のタンパク質粒子は、細胞の不溶性成分及び／又は実質的に不溶性の成分から得られるか、単離されるか、生成されるか、それに由来するか、それから精製されるか又は実質的に精製される。これらの実施形態のいくつかによれば、細胞の不溶性成分及び／又は実質的に不溶性の成分は、本明細書に記載される封入体であり得る。ある実施形態において、不溶性成分及び／又は実質的に不溶性の成分は、細胞内での組み換え発現及び細胞内での好適な組み換えタンパク質発現によって又はそれから形成されることが理解されるであろう。
本明細書に記載される標的タンパク質又は標的タンパク質粒子、例えばＣＲＭタンパク質又はタンパク質粒子の純度は、精製タンパク質粒子画分中の全タンパク質の濃度又はレベルとして表されるか又は決定され得ることが理解されるであろう。
物質の純度は、当業者に公知であるような任意の適用可能な方法によって決定又は評価され得る。例として、濃度測定方法が用いられ得、タンパク質純度を決定するのに特に有利であり得る。質量分析法は、別の好適な技術である。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度法又はブラッドフォードアッセイなどの比色分析などの他の分光法が好適であり得る。電気泳動又はクロマトグラフィー技術に基づくサイズ分析が想定される。ＨＰＬＣ流体技術（例えば、マイクロ流体拡散サイジング）又は動的光散乱は、用いられ得る他の技術である。純度、特にタンパク質純度を決定するための方法の組合せの使用も想定される。
上記を考慮して理解されるように、一般的な実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子、単離タンパク質粒子、単離タンパク質又は単離核酸は、組み換え技術によって調製され得る。
本明細書において使用される際の「組み換え」という用語は、自然界で通常見られない形態への操作から得られる分子を指す。
「組み換え」という用語は、核酸分子を表すために本明細書において使用され得、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これは、その起源又は操作によって、（１）自然状態で関連しているポリヌクレオチドの全て若しくは一部と関連していないか；及び／又は（２）自然状態で関連付けられるもの以外のポリヌクレオチドに関連付けられる。「組み換え」という用語は、その自然状態と比較して改変された量で又は改変された速度において、細胞により又は無細胞発現系中で生成される場合の分子（限定はされないが、タンパク質など）を含む。組み換えタンパク質は、細胞、組織又は対象中にある場合、例えばそれが発現される人工的な組み換え手段によって発現されるタンパク質も包含する。タンパク質（その断片、誘導体又は変異体を含む）に関連して使用される際の「組み換え」という用語は、組み換え系、好適には組み換えポリヌクレオチドにおける発現によって産生されるタンパク質（その断片、誘導体又は変異体を含む）を含む。典型的に、組み換え分子は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される。
組み換えタンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体は、例えば、参照により本明細書に援用されるSambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989)、特にSections 16 and 17；参照により本明細書に援用されるCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-2009)、特に第１０及び１６章；及び参照により本明細書に援用されるCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-2009)、特に第１、５及び６章に記載される標準的なプロトコルを用いて、当業者によって好都合に調製され得る。本明細書に記載されるタンパク質粒子、タンパク質又は断片を生成する際、組み換え分子生物学的技術は、所望の分子をコードするＤＮＡを産生するのに用いられ得る。所望のタンパク質をコードするＤＮＡを産生するのに必要とされる組み換え方法は、当技術分野において周知であり、日常的に実施される。
細菌、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞株、例えばヒト及びマウスなどの形質転換された宿主生物から単離されたリンパ芽球様細胞及び脾細胞並びに昆虫ベースの発現系など、任意の組み換えタンパク質発現系が本発明のために使用され得るが、それに限定されないことが容易に想定される。用いられる組み換えタンパク質発現系は、特定の特徴の発現の適合性、例えば下流の用途の適合性のためにタンパク質又は翻訳後修飾の発現レベル又は収率（例えば、翻訳後修飾のために真核細胞）に基づいて選択され得るが、それに限定されないことが理解されるであろう。ある一般的な実施形態において、タンパク質粒子の自己集合を促進、強化又は他に増大する組み換え発現系が望ましい。本発明において使用するための好適な発現菌株及び系の非限定的な例は、参照により本明細書に援用されるFerrer-Miralles and Villaverde (2013) Microb Cell Fact. 12: 113に見出され得る。
ある実施形態において、組み換えタンパク質発現は、原核生物起源の細胞内で行われる。組み換えタンパク質発現のための好適な宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）（大腸菌（E. coli））（特定の用途のために最適化されたＢＬ２１及びその様々な誘導株、例えばRosetta及びＤＥ３など；Ｋ－１２及びその様々な誘導体は、例えば、Origami及びSHuffle T7など、選択された用途のために最適化された）、シュードモナス属（Pseudomonas）（例えば、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）及び様々な誘導株及びバチルス属（Bacillus）菌株（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium））及び様々な誘導株並びにジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）及び様々な誘導株、ラクトコッカス属（Lactococcus）菌株（例えば、乳酸連鎖球菌（Lactococcus lactis））及び誘導株であるが、それに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（E. coli）のエンドトキシンフリー菌株である。より好ましくは、エンドトキシンフリー大腸菌（E. coli）菌株は、ＢＬ２１ ClearColi（ＤＥ３）である。
他の実施形態において、組み換え発現は、組み換え発現に適した昆虫細胞、例えばツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）に由来する細胞株、Ｓｆ９及びＳｆ２１内で行われる。
他の好ましい実施形態において、組み換え発現は、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp）（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）又はピキア属（Pichia sp）（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris））などの酵母細胞内で行われ得るが、それに限定されない。酵母は、グリコシル化などの翻訳後修飾によるタンパク質の発現のために特に好適であり得るが、それに限定されない。好ましくは、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。酵母発現系の非限定的な概説は、参照により本明細書に援用されるBaghban et al. (2019) Mol Biotechnol., 61 (5): 365-384に提供される。
連続細胞培養株における発現も想定される。このような細胞株は、哺乳動物宿主（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞）に由来し得、初代細胞株（例えば、肝細胞）又は不死化細胞株であり得る。当業者は、細胞株が特定の用途において好適である（例えば、翻訳後修飾が所望される場合）ことを理解するであろう。
特定の方法及び使用は、潜在毒性が減少されたか若しくは最小限に抑えられたタンパク質粒子若しくはタンパク質を必要とすることがあり、及び／又は他の特定の特性が少なくとも部分的に回避若しくは促進されることを理解するであろう。例えば、ヒトにおけるエンドトキシン反応を回避することが望ましいことがあり、したがって、エンドトキシン（リポ多糖とも呼ばれる）の包含は、特定の状況で望ましくないことがある。このような場合、タンパク質発現の高い収率も望ましいことがある。したがって、エンドトキシンフリーである細胞及び／又は菌株内における発現が使用され得る。非限定的な例としては、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）（Lucigen）が挙げられ、これは、ヒト細胞内におけるエンドトキシン反応を引き起こさず、特に能力及びタンパク質発現能力を依然として保持しながら、通常リポ多糖の一部であるエンドトキシンシグナルを無効にするが、大腸菌（E. coli）における高収率の利点が保持された、遺伝子組み換えリポ多糖を含む遺伝子組み換え大腸菌（E. coli）菌株である。これは、７つの遺伝子欠失（ΔｇｕｔＱ ΔｋｄｓＤ ΔｌｐｘＬ ΔｌｐｘＭ ΔｐａｇＰ ΔｌｐｘＰ ΔｅｐｔＡ）の組み込みによって前駆体脂質ＩＶＡからのＬＰＳの産生をブロックすることによって達成された。１つのさらなる補償的突然変異（ｍｓｂＡ１４８）は、脂質ＩＶＡの存在下で生存を可能にする。他の例示的な例において、タンパク質折り畳みを促進する宿主細胞が用いられ得、非限定的な例は、Shuffle T7又はOrigami大腸菌（E. coli）である。Origami及びSHuffle T7は、ジスルフィド結合、したがって生物学的に活性なタンパク質を形成する際に特に有利である。
組み換えタンパク質発現を促進するために、発現促進タグ又は精製タグアミノ酸配列がタンパク質又はアミノ酸配列とともに含まれ得る。すなわち、本発明の遺伝的構築物は、対象とする組み換えタンパク質が前記融合パートナーとともに融合タンパク質として発現されるように、融合パートナー（典型的にはベクター若しくは発現ベクターによって提供される発現促進タグ又は精製タグアミノ酸配列）も含み得る。融合パートナーの利点は、前記融合タンパク質の同定及び／又は精製を促進し得ることである。しかしながら、融合パートナーの選択が（限定はされないが）安定性及び収率などのタンパク質特性を補助し得ることも理解されるであろう。融合パートナーは、タンパク質若しくはアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端に付加され得るか、又はタンパク質若しくはアミノ酸配列の内部に付加され得る。末端における付加は、末端に直接隣接し得るか、又は融合パートナー配列と他のアミノ酸配列の開始との間にスペーサーが存在し得る。
「精製タグアミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチドなどの精製、特にクロマトグラフィー精製（より好適には親和性クロマトグラフィー）を促進するために第２のアミノ酸配列に特異的に融合又は結合された任意のアミノ酸配列である。この用語は、「精製タグ分子」とも呼ばれ得る。精製タグの非限定的な例としては、タンパク質Ａ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヘキサヒスチジン（ＨＩＳｅ）及びエピトープタグ、例えばＶ５、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン及びｃ－ｍｙｃタグが挙げられる。通常のタンパク質工学手法は、精製タグの除去のための方法を組み込む傾向があり得るため、このような配列に含まれるのは、他のパートナー配列からの融合パートナーの切断を特異的に可能にする配列である。「発現促進配列」は、タンパク質の組み換え発現を促進し、ＳＵＭＯタンパク質又はその断片を含む任意のアミノ酸配列である。
融合パートナー配列は、タンパク質精製及び／又は検出を可能にするために、親和性マトリックスへの融合タンパク質結合を促進し得る。親和性クロマトグラフィーによる融合ポリペプチド精製のために、親和性クロマトグラフィーのための関連するマトリックスは、それぞれ抗体、タンパク質Ａ又はＧ、グルタチオン、アミロース及びニッケル又はコバルトコンジュゲート樹脂である。多くのこのようなマトリックスは、（ＨＩＳｅ）融合パートナー及びPharmacia GST精製システムとともに有用なQIAexpress（商標）システム（Qiagen）などの「キット」形態で利用可能である。多くの場合、融合パートナーは、融合パートナーから対象とするタンパク質を放出するために、適切なプロテアーゼ又は化学試薬によって切断され得る。
ある実施形態において、不溶性成分中へのタンパク質の発現を推進、駆動又は促進するのが望ましいことがある。タンパク質中のＨＩＳ６（限定はされないが）などの精製タグは、タンパク質の可溶性を促進し得る。精製タグ又は発現促進タグの非存在は、細胞の不溶性成分中への発現を促進し得る。特定の実施形態において、組み換えにより産生されたタンパク質の可溶性を低下させ、したがって宿主細胞の不溶性区画（より好ましくは封入体）中でのタンパク質の発現を増加させることが望ましいことがある。ある実施形態によれば、本明細書に記載されるタンパク質の発現のためのアミノ酸配列への精製タグ及び／又は発現促進タグを含まないことが望ましいことがある。特定の実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質は、融合パートナー配列の非存在下、好ましくは精製タグアミノ酸配列及び／又は発現促進タグアミノ酸配列の非存在下で発現される。好ましくは、ＣＲＭアミノ酸配列又はその断片、変異体及び誘導体は、精製タグアミノ酸配列及び／又は発現促進タグアミノ酸配列を含まない。より好ましくは、ＣＲＭ１９７タンパク質に由来するか若しくはそれに対応するアミノ酸配列又はその断片、変異体及び誘導体は、精製タグアミノ酸配列及び／又は発現促進タグアミノ酸配列を含まない。ある実施形態において、タンパク質粒子中の融合パートナー配列の非存在は、限定はされないが、タンパク質サイズ及び／又は分子量、組み換えタンパク質の下流処理（例えば、発現されたタンパク質から融合パートナー配列を除去するための必要性をなくすこと）及び／又は融合パートナー配列から生じる潜在的な免疫原性問題（例えば、融合パートナー配列が好ましくない免疫反応を引き起こす可能性）など、１つ以上の他のパラメータ、機能又は効果のために望ましいことがあることも理解されるであろう。
タンパク質発現は、当技術分野において公知であるように、コドン最適化技術によって増強、改善又は増加され得る。コドン最適化は、コドン適応性、ｍＲＮＡ構造及び転写及び翻訳における様々なｃｉｓ－要素など、様々な段階のタンパク質発現に関与する様々な要因を考慮に入れ得るが、それに限定されない。コドン最適化は、対象とするタンパク質の強い発現を促進することが望ましい場合に用いられ得る。このような場合、それから得られるコドン最適化及び強い発現は、組み換え系における封入体形成に向けてバランスを変化させ得る。したがって、本発明は、コドン配列冗長性を利用することなどによって修飾された核酸も想定している。より具体的な例において、コドン使用は、特定の生物又は細胞型における核酸の発現を最適化するように調節され得る。例示的な例として、配列番号１に記載される核酸配列は、大腸菌（E. coli）におけるＣＲＭ１９７タンパク質の発現のためにコドン最適化されている。このような方法は、参照配列を用い得、特に、参照配列は、野生型又は天然配列であり得る。本発明は、本発明の核酸における修飾プリン（例えば、イノシン、メチルイノシン及びメチルアデノシン）及び修飾ピリミジン（例えば、チオウリジン及びメチルシトシン）の使用も想定している。
タンパク質粒子は、好適な方法で生成、形成、調製又は発現された単離タンパク質粒子、好ましくは組み換え系であり得る。ある実施形態において、タンパク質粒子は、細胞に由来する単離された組み換えタンパク質粒子であり得る。他の実施形態において、単離された組み換えタンパク質粒子又はタンパク質粒子は、実質的に精製されるか又は実質的に純粋であり得る。
上記を考慮して、本発明は、単離タンパク質又はその断片をコードする単離核酸を想定していることが容易に理解されるであろう。
本明細書において使用される際の「核酸」という用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む一本鎖又は二本鎖ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ及びＤＮＡを示す。核酸は、当技術分野において周知であるように、蛍光色素、酵素及びペプチドともコンジュゲートされ得る。
「遺伝子」という用語は、イントロン、エクソン、スプライス部位、オープンリーディングフレーム並びにポリアデニル化配列などの５’及び／又は３’非コード調節配列の１つ以上を含み得るゲノム内の個別の核酸遺伝子座、単位又は領域を表すために本明細書において使用される。
本明細書において使用される際、「野生型」、又は「天然（native）」、又は「天然（naturally occurring）」配列は、自然界に見出されるように本質的に配列をコードする核酸配列又はポリペプチドを指す。
本明細書において使用される際の「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合（又はその関連する構造的変異体若しくは合成類似体）を介して連結された複数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はその関連する構造的変異体若しくは合成類似体）から構成されるポリマーを指す。したがって、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、それらの間のヌクレオチド残基及び結合が天然であるヌクレオチドポリマーを指す一方、この用語は、限定はされないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボ核酸などを含む様々な類似体もその範囲内に含むことが理解されるであろう。分子の正確なサイズは、特定の用途に応じて変化し得る。オリゴヌクレオチドは、典型的に、長さが比較的短く、一般に約１０～３０ヌクレオチド残基であるが、この用語は、任意の長さの分子を指し得るが、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、典型的に、大きいオリゴヌクレオチドに使用される。
本発明の単離核酸は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons NY, 1995-2008)の第２章及び第３章に記載されるものなどの標準的なプロトコルを用いて、当業者によって好都合に調製され得ることが当業者によって十分に理解されるであろう。さらに、コドン最適化技術は、当技術分野において周知であり、限定はされないが、GenScript製のOptimumGeneなどのコンピュータアルゴリズムによっても行われ得る。これらのアルゴリズムは、コンピュータモデリングを組み込み得る。
特定の一実施形態において、本発明の単離核酸は、遺伝的構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に動作可能に連結される。当業者は、遺伝的構築物が、いくつかのヌクレオチド配列要素のいずれかを含む核酸であり、その機能が構築物の所望の使用に依存することを理解するであろう。使用範囲は、組み換えＤＮＡの一般的な操作及び伝播のためのベクターから、単離核酸の原核生物又は真核生物発現などのより複雑な用途まで及ぶ。典型的に、限定はされないが、遺伝的構築物は、２つ以上の用途のために設計される。単なる例として、意図された最終用途は、真核細胞系内での組み換えタンパク質発現である遺伝的構築物が、発現に必要とされる配列に加えて原核生物におけるクローニング及び伝播のような機能のためにヌクレオチド配列を組み込み得る。このような遺伝的構築物を設計及び調製するときの考慮事項は、意図される用途に必要とされるヌクレオチド配列である。上記を考慮して、遺伝的構築物は、いくつかの目的のいずれか１つに適合され得る多目的の手段であることが当業者に明らかである。前記遺伝的構築物の生成のための方法が当業者に周知である。
好ましい実施形態において、遺伝的構築物は、組み換え発現に好適である発現構築物である。好ましくは、発現構築物は、少なくともプロモータ及びさらに組み換えＤＮＡの操作、伝播及び発現に必要とされる１つ以上の他の調節ヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、本発明は、発現ベクター内で１つ以上の調節ヌクレオチド配列に動作可能に連結された単離核酸を含む発現構築物を想定している。当業者は、単離核酸が、例えば、参照により本明細書に援用されるSambrook et al., MOLECULAR CLONING, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載される標準的なプロトコルを用いて、様々な組み換え技術によって発現ベクターに挿入され得ることを理解するであろう。「発現ベクター」は、当技術分野において周知であるように、プラスミドなどの自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス及びフラビウイルスベクターなどのウイルス起源のベクターを含む）のいずれかであり得る。「動作可能に連結される」とは、前記調節ヌクレオチド配列が、転写及び／又は前記核酸の発現に関連する他のプロセスを開始、制御、調節又は他に指向するように、本発明の組み換え核酸に対して位置決めされることを意味する。好ましいベクターは、周知の原核生物発現ベクター、組み換えバキュロウイルス、ＣＯＳ細胞特異的ベクター、ワクシニア組み換え又は酵母特異的発現構築物のいずれかを含む。原核生物起源の細胞において使用するのに好ましい発現ベクターの中でも、Qiagenから入手可能なｐＱＥ６０、GE Life Sciencesから入手可能なベクターのｐＧＥＸシリーズ及びNovagenから入手可能なｐＥＴベクター系が挙げられる。
調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用するための宿主細胞のために適切なものであろう。様々な宿主細胞についての多くのタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列は、当技術分野において公知である。典型的に、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、限定はされないが、プロモータ配列、翻訳されたタンパク質の分泌のためのリーダー若しくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、スプライスドナー／アクセプター配列、エンハンサー若しくは活性化因子配列及び核酸パッケージングシグナルが挙げられる。好ましくは、前記プロモータは、原核細胞内で動作可能である。非限定的な例としては、Ｔ７プロモータ、ｔａｃプロモータ及びＴ５プロモータが挙げられる。誘導性／抑制性プロモータ（ｔｅｔ抑制性プロモータ及びＩＰＴＧ－、アルコール－、メタロチオネイン－又はエクジソン誘導性プロモータなど）は、当技術分野において周知であり、α－クリスタリンプロモータなどの組織特異的プロモータのように、本発明によって想定される。プロモータは、２つ以上のプロモータ（ＳＲαプロモータなど）の要素を組み合わせたハイブリッドプロモータであり得ることも理解されるであろう。
発現構築物は、本発明のタンパク質（又はその断片）が、本明細書において後述されるように、前記融合パートナーとともに融合タンパク質として発現されるように、融合パートナー（典型的には発現ベクターによって提供される）も含み得る。
ある実施形態において、本発明は、キメラタンパク質粒子又はキメラタンパク質を想定している。
「キメラ」又は「キメラ」遺伝子、核酸、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、通常、一緒に伴わない２つ以上の遺伝子、核酸、タンパク質、アミノ酸配列、断片又はポリペプチドを含む遺伝子、核酸、タンパク質、断片又はポリペプチドを意味する。「キメラ」は、断片間の融合をその範囲内に含み、本明細書において融合パートナーと呼ばれ得る。典型的に、限定はされないが、キメラは、関連しない配列間の融合であるが、配列は、相同であり得ることが容易に想定される。本発明の１つ以上の好ましい実施形態は、１つ以上の免疫原又は対象とするタンパク質に由来するか若しくはそれに対応するＣＲＭアミノ酸配列及び１つ以上の免疫原性アミノ酸配列を含むキメラタンパク質及び前記キメラを含むか又はそれから形成されるタンパク質粒子に関する。キメラにおけるその又はそれぞれの免疫原は、同じ又は異なる作用物質、タンパク質、分子又は供給源に由来し得る。単なる例として、本発明によって想定されるキメラにおける１つ以上の免疫原は、同じ病原体又は複数の異なる病原体に由来し得るが、それに限定されない。キメラタンパク質は、本明細書に記載される他のアミノ酸配列を含み得ることが理解されるであろう。特定の実施形態において、本明細書に記載されるキメラ（キメラタンパク質を含む）は、組み換えＤＮＡ技術から形成されるか又はそれによって産生され、組み換え発現に好適な宿主生物（例えば、限定はされないが、大腸菌（E. coli））において好適に発現され得る。
本明細書に記載されるキメラ又は融合は、それらが単一の単位として転写及び翻訳されて、単一のポリペプチドを産生するように結合されている別個の遺伝子によってコードされた少なくとも２つの対象とする配列を含むタンパク質であり得る。代わりに、発現は、対象とする各配列が異なる単一のポリペプチドとして発現されるキメラの形態であり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、キメラタンパク質から実質的に形成されるか、組み立てられるか、調製されるか、又はキメラタンパク質から形成されるか、組み立てられるか若しくは調製され得ることが想定される。ある実施形態において、キメラタンパク質から実質的に形成されるか又は形成される、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、本明細書に記載される実質的に不溶性のタンパク質粒子であり得る。ある実施形態において、キメラタンパク質に由来するか、それから得られるか又は生成される、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子及び／又は実質的に不溶性のタンパク質粒子は、細胞の不溶性成分に由来し得、細胞の不溶性成分は、タンパク質リフォールディング処理に供されていない。特定の実施形態において、不溶性成分は、細胞において形成される封入体である。
末端における付加が本明細書において想定される場合、このような付加は、末端に直接隣接し得る（すなわち末端配列の最後のヌクレオチドと付加される配列の第１のヌクレオチドとの間で隣接している）。代わりに、制限酵素部位によって生成されるスペーサー配列など、第１の配列（例えば、ＣＲＭ１９７アミノ酸配列）と第２の配列（例えば、免疫原性配列）との間にスペーサー配列が存在し得るが、それに限定されない。第３、第４、第５又はそれを超える配列がこのような配置で含まれ得、特に前記配列の２つ以上が同じ供給源又は異なる供給源に由来し得ることが想定されることが理解されるであろう。
ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の免疫原のアミノ酸配列又はその断片は、得られる分子が本明細書に記載されるタンパク質粒子を形成することができ、好ましくは所望の活性を誘導することができる限り、ＣＲＭアミノ酸配列との任意の関係で含まれ得ることが想定される。したがって、１つ以上の免疫原性アミノ酸配列は、ＣＲＭアミノ酸配列のＮ及び／又はＣ末端において、それに隣接して又はその近くに配置され得る。特定の好ましい実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、ＣＲＭアミノ酸配列のＣ末端において、それに隣接して又はその近くに配置され得る。ＣＲＭアミノ酸配列以外の免疫原のアミノ酸配列は、本明細書に記載される方法において使用するための好適なタンパク質粒子を生成するのに好適である場合、ＣＲＭアミノ酸配列内にあり得る。
マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に関連するある実施形態において、キメラ、融合又はキメラ分子は、配列番号１９及び／又は２０に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなり得るか又はそれである。
ストレプトコッカス属（Streptococcus）に関連するある実施形態において、キメラ、融合又はキメラ分子は、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７及び／又は配列番号６８のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなり得るか又はそれである。
コロナウイルスに関連するある実施形態において、キメラ、融合又はキメラ分子は、配列番号１０１に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなり得るか又はそれである。
ある実施形態において、タンパク質粒子は、１つ又は複数の免疫原を含む複数のキメラタンパク質に由来し得ることが想定される。
本明細書の説明を考慮して、本発明は、１つ以上の免疫原性アミノ酸配列（例えば、全タンパク質配列又は断片配列）を含む単離タンパク質及びタンパク質粒子も想定していることが理解され、前記配列又は断片は、単独で又は反復として存在し得、これは、縦列反復の配列又は断片も含む。「スペーサー」アミノ酸は、１つ又は複数の免疫原性配列又は断片間にも含まれ得る。このような配置は、免疫反応を引き起こすか、調節するか又は増強するのに好適であり得るが、それに限定されない。
「外来」、又は「外因性」、又は「異種」という用語は、実験操作によって宿主中に導入される任意の分子（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）を指し、導入された遺伝子が天然遺伝子と比べてある修飾（例えば、点突然変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在、組み換え部位の存在など）を含む限り、宿主に見出される遺伝子／核酸配列を含み得る。
代わりに、本発明に係るタンパク質粒子は、共発現する２つ以上の別個のキメラタンパク質（キメラタンパク質の１つは、対象とする第１の配列に連結された粒子形成成分を有し、１つは、対象とする第２の配列に連結された粒子形成成分を有する）並びに対象とする第３の配列に連結された粒子形成成分を有するさらなるキメラタンパク質などによって生成され得る。好適には、粒子形成成分は、ＣＲＭアミノ酸配列、好ましくはＣＲＭ１９７アミノ酸配列である。
理解されるように、本明細書に記載される方法及び組成物は、免疫原を含む本明細書に記載されるタンパク質粒子を使用し得、免疫原は、例えば、組み換え発現により、細胞内で粒子とともに形成される。代わりに、免疫原は、粒子が生成された後、タンパク質粒子に連結される。例えば、ＣＲＭ１９７アミノ酸配列を含むタンパク質粒子が好適な宿主から調製された後、タンパク質粒子は、標的免疫原にコンジュゲートされ得る。ＣＲＭアミノ酸配列以外の免疫原は、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかによってタンパク質粒子にコンジュゲートされ得る（例えば、Bioconjugate Techniques, Greg. T. Hermanson Ed., Academic Press, New York. 1996；Farkas and Bystricky (2010) Chemical Papers. 64 (6): 683-695；及びSpicer and Davis (2014) Nature Communications 5: 4740を参照されたく、これらは、それぞれ参照により本明細書に援用される）。例えば、タンパク質－タンパク質（すなわちＣＲＭ１９７以外のタンパク質粒子－免疫原）コンジュゲーションは、標準的なプロトコルを用いたコンジュゲーションのためにスルホ－ＳＭＣＣリンカー（スルホスクシンイミジルエステル）を使用することによって運ばれ得る。
本発明は、免疫原性アミノ酸配列を含むタンパク質粒子又はタンパク質の産生又は生成のためのタンパク質ライゲーション（「バイオコンジュゲーション」とも呼ばれ得る）技術を包含する。タンパク質ライゲーション技術は、共有結合的に安定化された融合分子を生成するために使用され得る。したがって、少なくとも１つの組み換えタンパク質及び所望のパートナー分子を結合するためのタンパク質ライゲーション技術が本発明によって想定される。タンパク質ライゲーションは、２つのタンパク質間の従来の直接の遺伝子融合で本来制限的であるか又は不可能であろう少なくとも２つの組み換えタンパク質との使用に特に適しているが、それに限定されない。
少なくとも２つのタンパク質又は少なくとも１つのタンパク質及び別の作用物質との間の不可逆的共有結合の自発的形成を促進するタンパク質ライゲーションシステムが想定される。例として、システムは、細菌ピリンの特徴及び親和性の形態の付着因子又は分子内イソペプチド結合の固有の形成を用いて、ペプチド相互作用を形成する。参照により本明細書に援用されるVeggiani et al., (2014) Trends Biotechnol. Oct; 32 (10): 506-12が参照され、これは、一般にこのような系及びその非限定的な例を説明する。
この技術に基づく好適なタンパク質ライゲーションシステムの非限定的な例は、SpyTag／SpyCatcherシステムであり、これは、同種１３－アミノ酸ペプチド（SpyTag；ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ；配列番号８）を天然に認識する化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）表面タンパク質（SpyCatcher）に由来する修飾ドメインを使用する。SpyCatcherタンパク質及びSpyTagタンパク質は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するフィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢのＣｎａＢ２ドメインに由来する。ＣｎａＢ２は、最初にペプチド及びタンパク質パートナーに分割され、表面が露出された疎水性残基が除去され、結合界面における相互作用が促進された。このプロセスは、最適化された１３－残基SpyTag及び１１６－残基SpyCatcher結合パートナーを生成した。認識後、SpyTag及びSpyCatcherは、SpyCatcher中のリジン及びSpyTag中のアスパルテートの側鎖間の共有イソペプチド結合を形成する。本発明に関して例として、第１のアミノ酸配列（例えば、ＣＲＭアミノ酸配列又はその断片）は、SpyCatcherタンパク質を含むように操作され得る一方、第２のアミノ酸配列（例えば、限定はされないが、酵母などの好適な発現においてグリコシル化形態で生成され得る免疫原（限定はされないが、ウイルスに由来する免疫原など）））は、SpyTagを含むように操作され得る。そのように修飾された第１及び第２のタンパク質の曝露時、タンパク質は、SpyCatcher及びSpyTag対合によって不可逆的共有結合を形成して、それにより自発的なタンパク質ライゲーション事象を形成する。この例は、例示的なものであるに過ぎない。Reddington and Howarth (2015) Current Opinion in Chemical Biology, 29: 94-99及びHatlem et al (2019) Int. J. Mol. Sci., 20:2129、国際公開第２０１１／０９８７７２号、国際公開第２０１６／１９３７４６号及び国際公開第２０１８／１９７８５４号は、それぞれSpyCatcher／SpyTagシステム及びその方法の非限定的な説明を提供し、これらは、それぞれ参照により本明細書に援用される。好適なタンパク質ライゲーションシステムのさらなる非限定的な例としては、Isopeptag、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のピリン－Ｃタンパク質に共有結合するペプチド（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ；配列番号９）；肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）ピリンから開発されたSnoopTag-SnoopCatcher、ここで、SnoopTag、SnoopCatcherタンパク質に共有結合するペプチド（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ；配列番号１０）；SnoopCatcherタンパク質又はDogTagタンパク質（SnoopLigaseによって媒介される）のいずれかに結合するSnoopTagJr（ＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫ；配列番号１１）；DogTag、SnoopLigaseによって媒介される、SnoopTagJrに共有結合するペプチド（ＤＩＰＡＴＹＥＦＴＤＧＫＨＹＩＴＮＥＰＩＰＰＫ；配列番号１２）；及びSdyTag、SdyCatcherタンパク質に共有結合するペプチド（ＤＰＩＶＭＩＤＮＤＫＰＩＴ；配列番号１３）が挙げられる。当業者は、本明細書に記載される複数のタンパク質ライゲーションシステムが、対象とするタンパク質を生成するために使用され得ることを理解するであろう。組み換えＤＮＡ技術によってこれらの配列を組み込むための方法が当業者に公知であり、当業者にとって日常的なものであろう。
断片、ペプチドを想定している実施形態において、前記断片、ペプチドは、固相及び溶液相合成を含む化学合成によって調製される断片、ペプチドの形態であり得る。このような方法は、当技術分野において周知であるが、SYNTHETIC VACCINES Ed. Nicholson (Blackwell Scientific Publications)の第９章及びCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2009)の第１５章に示される化学合成技術の例が参照される。これに関して、国際公開第９９／０２５５０号及び国際公開第９７／４５４４４号も参照される。
典型的に、タンパク質粒子が由来するタンパク質及び／又はアミノ酸配列（断片、変異体又は誘導体を含む）は、タンパク質粒子が、例えば、凝集体、封入体又は構造化集合として、宿主細胞内で形成されるか、生成されるか、組み立てられるか又は発現される条件下で（例えば、組み換え発現によって）発現され得る。低次のタンパク質粒子は、まず宿主細胞から単離され、高次のタンパク質粒子への自己集合を可能にする条件下でインキュベートされ得ることも想定される。
本発明のさらなる非限定的な利点は、免疫原性作用物質及び／又は担体剤として作用し得る本明細書に記載されるタンパク質粒子の細胞内での形成を含み得、少なくとも部分的に、細胞内での粒子の形成のため、粒子は、洗浄、遠心分離、クロマトグラフィー、沈殿及びろ過（並びにそれらの組合せ）などの従来の技術を用いて回収、単離又は調製され得るが、それに限定されない。したがって、細胞内タンパク質粒子形成が特に（限定はされないが）インビトロ粒子形成と比較した際、限定はされないが、タンパク質濃度、ｐＨ調整、温度、イオン強度及び特定の溶媒成分の添加などの１つ以上の下流処理工程／パラメータを回避し得る。ある実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体又は本明細書に記載される１つ以上の他のＣＲＭタンパク質に由来するか又はそれに対応する。
本明細書に記載されるタンパク質粒子、特に組み換えにより産生されたタンパク質粒子又は組み換えタンパク質の単離及び／又は精製は、限定はされないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分画、沈殿（例えば、遠心分離）、洗浄並びに親和性及び免疫親和性クロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知の方法によって行われ得ることが想定される。方法の組合せも想定される。
本発明のクロマトグラフィー工程などに関する「クロマトグラフィー」とは、典型的に、少なくとも２つの相：静止層及び静止層を通して移動する移動相を用いる複合混合物からの生体分子（例えば、タンパク質及び／又は核酸）の分離に使用される任意の技術を意味する。分子は、電荷、サイズ、親和性及び疎水性又はそれらの組合せなどの特定の物理化学的特性に基づいて分離され得る。
クロマトグラフィーは、例えば、参照により本明細書に援用されるCURRENT PROTOCOLS IN PRTOTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999)、特に第８及び９章に記載されるような標準的なプロトコルを用いて、当業者によって行われ得る。
当業者は、タンパク質粒子又はタンパク質単離及び／又は精製のための適切な方法を確認することができるであろう。例として、細胞内で産生されるタンパク質粒子は、調製された細胞溶解液から得られるか、それに由来するか、それから除去されるか、精製されるか又は単離され得る。細胞溶解液は、好適な技術（例えば、超音波処理によって細胞を溶解させるための機械的若しくは均質化破砕又は高圧処理）によって宿主細胞を破砕に供することによって調製され得る。当業者によって公知であるように、ある細胞は、細胞壁、例えば酵母細胞を破砕するためのさらなる作用物質又は処理を必要とし得る。破砕された細胞は、典型的に、遠心分離によって上清及びペレットに分離され得る。この例示的な実施形態によれば、タンパク質粒子の形態の標的分子は、ペレット中に存在する。上清は、可溶性タンパク質を含み、タンパク質粒子調製中に除去、無視又は廃棄され得る。次に、ペレット化されたタンパク質粒子は、適切な緩衝液で洗浄されて、汚染物質又は不純物を除去し得る。典型的な洗浄工程は、溶液（例えば、緩衝液）中のペレット化タンパク質粒子の再懸濁、続いて遠心分離によるペレット及び上清の分離を含み得る。ペレットは、洗浄緩衝液中で再懸濁工程にさらに供され得る。このプロセスは、タンパク質粒子を溶液中で分散させるために、各洗浄工程後にペレット化懸濁液の均質化処理を含み得る。均質化処理は、タンパク質粒子を溶液中で分散させるための手段を含み得る。均質化手段は、物理的処理（例えば、超音波処理、高圧均質化）又は化学処理（例えば、洗浄剤などの分散剤の使用）であり得るが、それに限定されない。洗浄による均質化処理の包含は、粒子懸濁液、特に均質な粒子懸濁液を得ることを促進し得る。複数の洗浄工程が想定される。最終的な洗浄工程（及び任意選択的に均質化処理）後、次にタンパク質粒子を含むペレット化材料が適切な溶液又は緩衝液中で再懸濁され得る。得られたタンパク質粒子調製物は、クロマトグラフィーなどのさらなる工程に供され得る。ある実施形態において、タンパク質粒子調製物は、１つ以上の洗浄工程を含み得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、単離及び／又は精製された（若しくは実質的に精製され得る）タンパク質粒子に由来するか、それから得られるか、生成されるか、調製されるか若しくは他に除去され得るか又はそれである。
ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、細胞の単離及び／又は精製された（若しくは実質的に精製され得る）不溶性成分、部分若しくは分画に由来するか、それから得られるか、生成されるか、調製されるか若しくは他に除去され得るか又はそれである。好適には、細胞の単離及び／又は精製された（若しくは実質的に精製される）不溶性成分、部分若しくは分画は、封入体であり得る。
本発明は、単離タンパク質の断片、変異体及び誘導体、免疫原性アミノ酸配列、免疫原、ＣＲＭタンパク質又はＣＲＭアミノ酸配列を含む。
本明細書において使用される際の「断片」は、全タンパク質又はペプチドの１００％未満であるが、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は９９％を占めるタンパク質又はペプチドのセグメント、ドメイン、部分又は領域（実施例、表及び図に記載される配列又は他の免疫原など）である。一例において、ＣＲＭタンパク質の断片が想定され、ＣＲＭタンパク質は、配列番号２、配列番号２３～２６及び／又は配列番号４９～５４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか又はそれから本質的になり得るが、それに限定されない。本発明は、配列番号６、７、１７～２２、２８～４８及び５６～１０４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む本明細書に開示される配列のいずれか１つの断片を包含するが、それに限定されない。断片は、単一の断片であり得るか、又は単独で若しくは他の断片とともに反復され得ることが理解されるであろう。したがって、複数の同じ又は異なる断片を含むより大きいペプチド及び単離タンパク質が想定されることも理解されるであろう。好適には、断片は、免疫原性断片である。
特定の実施形態において、タンパク質断片は、例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５１０、５２０又は５３０連続の、タンパク質のアミノ酸を含み得る。
ある実施形態において、ＣＲＭタンパク質の断片は、例えば、野生型又は天然ジフテリア毒素における対応する領域の触媒ドメインＣ（本明細書に記載されるか、又は配列番号５５に記載されるジフテリア毒素の断片Ａのアミノ酸１～１９０）、膜貫通ドメインＴ（アミノ酸２０１～３８４）及び／又は受容体結合ドメインＲ（アミノ酸３８６～５３５）に対応する領域を含み得る。例えば、ＣＲＭ１９７タンパク質に関連するある実施形態において、ＣＲＭ１９７の断片は、断片Ａのみ又は断片Ａ及び膜貫通ドメインＴに対応する領域を含み得るが、それに限定されない。あるさらなる例示的な実施形態において、ＣＲＭ１９７タンパク質の断片は、配列番号５０を参照するか若しくは配列番号５０に記載されるＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸残基１～１９０を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか若しくはそれであり、及び／又は配列番号５０を参照するか若しくは配列番号５０に記載されるＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸残基１～３８９を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか若しくはそれである。
タンパク質断片は、標準的な組み換え核酸技術の適用によって得られるか、又は本明細書に記載されるものなどの従来の液相若しくは固相合成技術を用いて合成され得る。代わりに、ペプチドは、ｅｎｄｏＬｙｓ－Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ－Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ－Ｃ及びブドウ球菌属（staphylococcus）Ｖ８－プロテアーゼなどのプロテアーゼを用いた、本発明の単離タンパク質の消化によって産生され得る。消化された断片は、当技術分野において周知であるように、例えば高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）技術によって精製され得る。
本発明は、タンパク質、アミノ酸配列又はタンパク質断片の変異体を包含する。
本明細書に関して、タンパク質「変異体」は、１つ以上のアミノ酸残基の欠失又は置換によって参照配列と区別される。参照アミノ酸配列は、本明細書における実施例、表及び／又は図のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列であり得る。ある実施形態において、参照アミノ酸配列は、例えば、配列番号２、配列番号６、配列番号７及び配列番号１７～１０４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列であり得るが、それに限定されない。「変異体」は、異なるアミノ酸によって欠失又は置換された参照アミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸を有し得る。「変異体」は、それらの範囲内において、例えば対立遺伝子多型、オルソログ及びホモログなどの天然変異体及び人工的に生成された突然変異体を含む。「突然変異体」という用語は、変異体を表すためにも使用され得る。一部のアミノ酸が、タンパク質又はその断片の活性を変化させずに置換又は欠失され得る（保存的置換）ことは、当業者によって十分に理解されるであろう。ある実施形態において、タンパク質変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、好ましくは少なくとも８０％若しくは８５％又はより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を共有し得る。
変異体は、参照ポリペプチドの１つ以上の特性又は活性を改変又は調節する１つ以上のアミノ酸残基の置換又は欠失を含み得る。例として、宿主細胞免疫を逃れるか又は回避するように進化され得る病原体エスケープ突然変異体に対応する免疫原の変異体を含むことが特定の実施形態において望ましいことがある。
それぞれのタンパク質及び核酸間の配列関係を表すために本明細書において一般に使用される用語は、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」及び「実質同一性」を含む。それぞれの核酸／タンパク質は、（１）核酸／タンパク質によって共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つ以上の部分のみ、及び（２）核酸／タンパク質間で異なる１つ以上の部分をそれぞれ含み得るため、配列比較は、典型的に、配列類似性の局部的な領域を同定及び比較するために「比較ウインドウ」上で配列を比較することによって行われる。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較される典型的に６、９又は１２の連続した残基の概念的セグメントを指す。比較ウインドウは、それぞれの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較ウインドウを整列するための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピュータ化された実装によって（Intelligenetics製のGeneworks program；GAP、BESTFIT、FAST A及びTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA、参照により本明細書に援用される）又は調査によって行われ得、最良のアラインメント（すなわち比較ウインドウにわたって最も高いパーセンテージの相同性をもたらす）は、選択された様々な方法のいずれかによって生成される。例えば、参照により本明細書に援用されるAltschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389によって開示されるプログラムのBLASTファミリーも参照され得る。配列分析の詳細な説明は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999)のユニット１９．３に見出され得る。
「配列同一性」という用語は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、配列が比較のウインドウにわたって同一である程度を考慮して、標準的なアルゴリズムを用いて、適切なアラインメントを考慮して正確なヌクレオチド又はアミノ酸一致の数を含む。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で除算し、結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。例えば、「配列同一性」は、DNASISコンピュータプログラム（Version 2.5 for windows；Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USAから入手可能）によって計算される「一致パーセンテージ」を意味することが理解され得る。
本明細書において使用される際、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的特質に悪影響を与えない又は変化させないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当技術分野において公知の標準的な技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば物理的又は機能的に対応するアミノ酸残基と類似した残基（類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学特性を有するなど）で置換される置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分枝側鎖を有するアミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシンなど）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)；Kobayashi et al., Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999)；及びBurks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)を参照されたい。
使用の状況によって必要とされる際、非保存的置換が本発明によって想定されることも理解されるであろう。一般に、タンパク質構造及び機能の最大の変化を生じる可能性の高い非保存的置換は、（ａ）親水性残基（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＶａｌ）の代わりに若しくはそれによって置換されたもの；（ｂ）システイン又はプロリンが任意の他の残基の代わりに若しくはそれによって置換されたもの；（ｃ）電気的陽性の側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ）が電気的陰性の残基（例えば、Ｇｌｕ又はＡｓｐ）の代わりに若しくはそれによって置換されたもの、又は（ｄ）嵩高の疎水性又は芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＴｒｐ）を有する残基がより小さい側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）若しくは側鎖を有さないもの（例えば、Ｇｌｙ）の代わりに若しくはそれによって置換されたものである。
タンパク質変異体、特に人工的に生成された突然変異体であるものに関して、これらは、タンパク質の突然変異を誘発することにより又はコード核酸の突然変異を誘発することにより、例えばランダム突然変異誘発若しくは部位特異的突然変異誘発によって生成され得る。核酸突然変異誘発方法の例は、参照により本明細書に援用されるCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al.（上記を参照されたい）の第９章に示されている。部位特異的突然変異誘発技術は、当技術分野において周知である。好適な市販のキットの非限定的な例としては、Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit（ThermoFisher Scientific）、QuikChange II（Agilent）及びQ5 Site-Directed Mutagenesis Kit（New England Biolabs）が挙げられる。
生物学的活性に寄与するアミノ酸残基の知識が入手可能である場合、部位特異的突然変異誘発が行われ得ることが当業者によって理解されるであろう。ある場合には、この情報は、入手可能でないか、又は例えば分子モデリング近似によってのみ推測され得る。
このような場合、ランダム突然変異誘発が想定される。ランダム突然変異誘発方法としては、ヒドロキシルアミンによるタンパク質の化学修飾（Ruan et al., 1997, Gene 188: 35）、核酸中へのｄＮＴＰ類似体の組み込み（Zaccofo et al., 1996, J. Mol. Biol. 255: 589）及びStemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747又はShafikhani et al., 1997, Biotechniques 23 304（これらは、それぞれ参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどのＰＣＲベースのランダム突然変異誘発が挙げられる。Diversify（商標）キット（Clontech）などのＰＣＲベースのランダム突然変異誘発キットが市販されていることも留意される。
タンパク質変異体に対する変化は、自発的に又は人による操作、化学エネルギー（例えば、Ｘ線）又は当技術分野において周知の他の形態の化学的突然変異誘発によって生じ得ることが理解されるであろう。
本発明は、タンパク性分子の誘導体を想定している。
本明細書において使用される際、「誘導体」は、例えば、当技術分野において理解されるように、他の化学部分との複合体形成により、翻訳後修飾（例えばリン酸化、アセチル化など）、グリコシル化の修飾（例えば、グリコシル化の付加、除去若しくは改変）、脂質化及び／又はさらなるアミノ酸配列の包含によって改変された、タンパク質、その断片又は変異体などの分子である。
さらなるアミノ酸配列は、本明細書に記載される融合タンパク質を生成する融合パートナーアミノ酸配列を含み得る。例として、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出及び／又は精製を促進し得る。非限定的な例としては、金属結合（例えば、ポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、タンパク質Ａ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンタグなどのエピトープタグが挙げられる。本発明によって想定される他の誘導体としては、限定はされないが、側鎖に対する修飾、ペプチド若しくはタンパク質酸産生中の非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の組み込み、官能基（例えば、カナバニン、ノルロイシン、ホモセリン、３－ホスホセリン、ｂ－シアノアラニン及び１－又は３－メチルヒスチジンなど）を有する変異体側鎖を有するアミノ酸類似体並びに本明細書に記載されるタンパク質、断片及び変異体における立体構造的制約を課す他の方法が挙げられる。当技術分野において理解されるように、タンパク質のペプチド模倣薬も想定される。これに関して、当業者は、タンパク質の修飾に関するより詳細な方法についてCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2008)の第１５章を参照する。
当業者によって理解されるように、断片、変異体又は誘導体は、免疫原性、副作用若しくは毒性プロフィール、薬力学及び／又は薬物動態などの対象とするタンパク質の１つ以上の特性を改善する目的で生成され得るが、それに限定されない。このような方法は、当業者によって容易に理解されるであろう。
一般的な実施形態において、断片、変異体又は誘導体は、所与のタンパク質又はコード核酸の生物学的、構造的及び／又は物理的活性を保持する「生物学的に活性な」断片、変異体又は誘導体である。ある実施形態において、生物学的に活性な断片、変異体又は誘導体は、親分子の所望の活性の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上を有する。このような活性は、一般にこのような活性を特定するのに有用であると、当技術分野の当業者によって認識可能な標準的な試験方法及びバイオアッセイを用いて評価され得ることが理解されるであろう。ある実施形態において、生物学的に活性な断片、変異体又は誘導体は、細胞内でタンパク質粒子を形成するか、又は宿主細胞の内部でタンパク質粒子に自己集合する機能又は能力を有し得る。生物学的に活性な断片は、細胞内でタンパク質粒子を形成することが可能であるか、又は細胞内で自己集合することが可能であるＣＲＭタンパク質の断片であり得る。
他の実施形態において、「生物学的に活性な」断片、変異体又は誘導体は、免疫原性断片、変異体又は誘導体である。本発明に関して、本明細書において使用される際の「免疫原性」という用語は、対象への免疫原性作用物質（タンパク質粒子、タンパク質、断片、変異体又は誘導体など）の投与時、作用物質（限定はされないが、病原体又はその分子成分など）に対する免疫反応を生成するか又は引き起こす能力又は可能性を示す。したがって、ある実施形態において、断片、変異体又は誘導体、特に免疫原性断片、変異体又は誘導体は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ及び／又は少なくとも１つのＢ－細胞エピトープを含み得る。好ましくは、免疫原性断片、変異体又は誘導体によって引き起こされる免疫反応は、本明細書に記載される防御免疫反応であり得る。
本明細書に記載されるタンパク質粒子は、以下の非限定的な例と組み合わせて、「骨格」又は「足場」としてのＣＲＭアミノ酸配列を含み得ることが理解されるであろう：（ａ）単一の供給源、作用物質若しくは分子に由来する単一の免疫原；（ｂ）同じ供給源、作用物質若しくは分子に由来する１つ又は複数の異なる免疫原；或いは（ｃ）複数の異なる供給源、作用物質若しくは分子のそれぞれの又はそれぞれに由来する１つ又は複数の免疫原。本発明は、タンパク質粒子の混合群の産生及び／又は投与にも容易に適用され、それにより例えば多価治療、免疫原性、免疫治療及び／又は抗原若しくは送達系又は組成物を生成する。単なる例として、第１のタンパク質粒子は、寄生生物及び／又は細菌に由来する免疫原に由来する１つ又は複数の免疫原性アミノ酸配列を含む第２、第３、第４又はそれを超えるタンパク質粒子と共投与される同じ又は異なるウイルス免疫原に由来するか又はそれに対応するＣＲＭ配列以外の複数の免疫原性アミノ酸配列を含み得る。さらなる例として、単一のタンパク質粒子は、ＣＲＭ配列以外の複数の免疫原性アミノ酸配列を含み得、その又はそれぞれの免疫原性アミノ酸配列は、同じ又は異なる作用物質（例えば、異なる病原体）に由来し得る。本発明は、１価抗原送達系又は組成物も想定している。１価タンパク質粒子は、免疫原性アミノ酸配列の１つ以上のコピーを含み得る。本発明は、細胞中への１つ以上の発現構築物の導入によるタンパク質粒子の混合群の産生も想定している。したがって、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、同じ又は異なる起源からの複数の標的又は候補免疫原に対して送達する、免疫化する方法などにおいて使用され得る。
したがって、本明細書に記載されるタンパク質粒子とともに形成される場合の免疫原のいずれか１つは、タンパク質粒子として投与されるとき、免疫反応を引き起こし得る。代わりに、これらの免疫原のいずれかに対する免疫反応は、それらがタンパク質粒子と共投与されるときに促進され得る。上述されるように、本明細書に記載されるタンパク質粒子の投与は、対象とする第２の抗原を含んでも又は含まなくてもよい。１つ以上の免疫原は、同じ又は異なる部位においてタンパク質粒子とは別々に投与され得ることが想定される。理解されるように、１つ以上の免疫原は、ＣＲＭアミノ酸配列、より好ましくはＣＲＭ１９７アミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原であり得る。
記載される細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、ジフテリア病原体に対する免疫反応（例えば、抗ＣＲＭ抗体）を引き起こすか又は誘発し得ることが理解されるであろう。ある実施形態において、ジフテリア病原体に対する免疫反応は、防御的であり得る。したがって、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、ジフテリア病原体に関連する免疫反応並びに標的化された疾患、障害又は病態に向けられた１つ以上の候補免疫原に対する反応を引き起こし得る。したがって、タンパク質粒子がＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原を含む場合のある実施形態によれば、タンパク質粒子は、ジフテリア並びに特異的に標的化された疾患、障害又は病態に対して少なくとも部分的に防御的であり得ることが想定される。
広い態様において、本発明は、作用物質に対する免疫反応を引き起こすか又は対象における免疫反応を調節する方法、対象の免疫化の方法、治療方法及び／又は１つ以上の免疫原を対象に送達する方法における、本明細書に記載されるタンパク質粒子の使用を包含する。何らかの特定の理論又は作用様式によって制約されるものではないが、ＣＲＭタンパク質粒子（ある実施形態においてＣＲＭ１９７タンパク質粒子）を伴う免疫原の送達又は投与は、促進された細胞、抗体及び／又は免疫反応、好ましくは両方（それに限定はされないが）を誘導し得ることが提案される。代わりに又は加えて、本明細書に記載されるタンパク質粒子からの免疫原の徐放又は持続放出は、複数回の投与の必要性を減少させ、及び／又はより高い力価／強度の細胞若しくは抗体反応を生成し得る。すなわち、ある実施形態において、何らかの特定の様式又は理論によって制約されるものではないが、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、少なくとも部分的に、粒子のゆっくりとした又は減速された分解のため、長期間の免疫原提示のためのデポーとしての役割を果たすことによって促進された免疫原性を促進し得ることが理解されるであろう。
ある広い態様は、本明細書に記載されるタンパク質粒子を投与することにより、作用物質に対する、対象における免疫反応を引き起こす方法を提供し得る。本発明の一態様は、作用物質に対する免疫反応を対象において引き起こす方法であって、有効量の、本明細書に記載される細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより作用物質に対する免疫反応を対象において引き起こす工程を含む方法を提供し得る。この態様のある実施形態によれば、免疫反応が生成され得る作用物質は、対象中に存在しても若しくはしなくてもよいか、又は対象は、作用物質に曝されていても若しくはされていなくてもよいことが理解されるであろう。例として、防御又は予防目的のために対象における免疫反応を引き起こす方法のある実施形態において、対象は、作用物質に曝されていなくてもよい。したがって、ある実施形態によれば、作用物質は、作用物質に対する免疫反応を引き起こすために、必ずしも対象中に存在していなくてもよい。
本発明の別の態様は、疾患、障害又は病態に対して対象を免疫化する方法であって、有効量の、本明細書に記載される細胞に由来するジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより疾患、障害又は病態に対して対象を免疫化する工程を含む方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、対象における疾患、障害又は病態を治療又は予防する方法であって、有効量の、本明細書に記載される細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより対象における疾患、障害又は病態を治療又は予防する工程を含む方法を提供する。
本発明のさらに他の態様は、対象における免疫反応を調節する方法であって、有効量の、本明細書に記載される細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それにより対象における免疫反応を調節する工程を含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に送達する方法であって、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に投与して、それによりタンパク質粒子を対象に送達する工程を含む方法を提供する。
「投与」又は「投与する」とは、選択された経路又はビヒクルによる、対象への規定された作用物質又は組成物（例えば、本明細書に記載される細胞に由来する１つ以上のタンパク質粒子を含む組成物）の導入を意味する。投与の経路は、経口、口腔、舌下、経鼻、経肛門、消化管、皮下、静脈内、鼻腔内、腹腔内、関節内、経皮、吸入、眼内、脳室内、筋肉内及び皮内投与経路を含む、局所、非経口及び腸内を含み得るが、それに限定されない。
本発明の方法は、対象とする異なる標的免疫原を伴う複数のタンパク質粒子の投与を含むことが理解されるであろう。タンパク質粒子、タンパク質又は組成物は、同時に（すなわち実質的に同時に若しくは望ましくは同じ組成物中で一緒に）又は別々に投与され得る（すなわち間隔を空けて、例えば数時間、数日～数週間若しくは数か月の間隔を空けて投与される）ことが想定される。タンパク質粒子、単離タンパク質又は組成物は、連続して投与され得る（すなわち順次、例えば間隔を空けて投与される）。タンパク質粒子、単離タンパク質又は組成物は、任意の順序で投与され得る。適切な場合、タンパク質粒子は、規則的な反復サイクルで投与され得る。
タンパク質粒子、タンパク質又は組成物は、さらなる作用物質、特にさらなる免疫原性若しくは治療剤（限定はされないが、アジュバント、鎮痛薬及び／又は第２の抗原など）前若しくはその後又はそれと同時に対象に共投与され得ることが理解されるであろう。本発明の方法は、（必ずしもではないが）限定はされないが、ブースター工程又はプライミング工程などの１つ以上のさらなる工程を含み得ることが理解されるであろう。本明細書に記載される方法は、対象が方法を必要とするかどうかを確認するために１つ以上の工程を含み得る。例として、本明細書に記載される方法は、必要に応じて、対象が感染症、又は癌、又は免疫関連疾患、障害若しくは病態を有するか又はそれらを発症するリスクがあるかどうかを確認することをさらに含み得る。本明細書に記載される方法のいずれか１つは、方法において有用であり得るさらなる作用物質を投与する１つ以上の工程も想定している。例として、抗生物質、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物又はコルチコステロイド（限定はされないが）は、本発明のタンパク質粒子の投与前、それと同時に又はその後に投与され得る。当業者は、さらなる作用物質が必要とされるかどうかを容易に理解するであろう。
本明細書において使用される際の「有効量」という用語は、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分である、規定される作用物質又は分子の量又は濃度である。単なる例として及び限定はされないが、本発明に関して、これは、投与されるとき病原体に対する免疫反応を引き起こすのに必要な病原体特異的抗原を含む本明細書に記載されるタンパク質粒子の量又は濃度であり得る。有効量は、１回以上の投与で又は一連の投与若しくは徐放系の一部として投与され得る。有効量は、対象の健康及び身体状態及び治療される個体の分類群、組成物の配合、医学的状況の評価、投与の様式並びに他の関連する要因に応じて変化するであろう。理想的には、作用物質の有効量は、対象における大きい悪影響又は好ましくない影響を引き起こさずに、所望の結果を誘導するのに十分な量である。好適な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。「有効量」は、治療有効量又は予防的に有効な量であり得るが、それに限定されない。
本明細書において同義的に使用される「対象」、「個体」、「患者」又は「宿主」という用語は、本発明の方法が適用され得る任意の対象、特に脊椎動物対象、好ましくは哺乳動物対象を指す。したがって、本明細書に開示される方法、作用物質、タンパク質粒子及び組成物は、ヒト及び／又は獣医学的用途を有し得る。「哺乳動物」という用語は、限定はされないが、ヒト、家畜及び農場動物並びに動物園の動物、スポーツ用動物又はペット動物、例えばごく数種の例示的な例を挙げると、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、カニクイザルなどの類人猿、海洋哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）などを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指すために本明細書において使用される。好ましい形態において、本明細書における哺乳動物は、ヒトであり得る。「対象」、「個体」、「患者」又は「宿主」という用語は、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、カナリア、セキセイインコなどのコンパニオンバード）、海洋哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、は虫類（例えば、ヘビ、カエル、トカゲ）、両生類及び魚類を含む。
ある実施形態において、「対象」は、「それを必要とする対象」を指し得る。「それを必要とする対象」は、必要に応じて、治療、処置又は免疫化を必要とすることが確認された対象を意味する。
「免疫反応を引き起こす」又は「免疫学的反応を引き起こす」とは、細胞免疫系、体液性免疫系及び／又は自然免疫系を含む免疫系の１つ以上の要素の産生又は活性を生成、上方制御、活性化、促進又は刺激することを意味する。好適には、免疫系の１つ以上の要素は、Ｂリンパ球、Ｔ－リンパ球、抗体、好中球、樹状細胞（ランゲルハンス細胞、形質細胞様細胞、リンパ球樹状細胞、間質樹状細胞、真皮樹状細胞、炎症性樹状細胞及び骨髄樹状細胞などであるが、それに限定されない）、記憶細胞、サイトカイン及び／又はケモカインを含むが、それに限定されない。免疫反応は、粘膜免疫反応であり得る。免疫反応は、免疫系の１つ又は複数の要素によって媒介され得ることが理解されるであろう。抗体又は感作Ｔリンパ球が、作用物質で対象を刺激した後に対象の免疫系において形成され得る特異的免疫反応が含まれる。ある実施形態において、免疫反応は、防御免疫反応であり得る。他の実施形態において、免疫反応は、防御免疫反応であり得、これは、ある実施形態において免疫学的記憶の誘発を含み得る。
本発明の趣旨では、「細胞免疫反応」は、Ｔ－リンパ球及び／又は他の白血球細胞によって媒介されるものである。細胞性免疫の一態様は、細胞溶解Ｔ細胞（「細胞傷害性Ｔ細胞」又は「ＣＴＬ」としても知られている）による抗原特異的反応を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、細胞の表面上で発現されるタンパク質に関連して提示されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内病原体の細胞内破壊又はこのような病原体に感染した細胞の溶解を誘導し、促進することを促進する。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的反応を含む。ヘルパーＴ細胞は、機能を刺激することを促進するように作用し、それらの表面上においてＭＨＣ分子に関連してペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に焦点を合わせる。「細胞免疫反応」は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む、活性化Ｔ細胞及び／又は他の白血球細胞によって産生されるサイトカイン、ケモカイン及び他のこのような分子又は作用物質の産生も指し得る。したがって、本明細書において使用される際の免疫反応は、ＣＴＬの産生及び／又はヘルパーＴ細胞の産生若しくは活性化を刺激するものであり得る。ある実施形態において、本明細書に記載される免疫反応は、Ｔ細胞媒介性免疫反応を含むか又はＴ細胞媒介性免疫反応である。
対象とする抗原又は免疫原は、抗体媒介性免疫反応も引き起こし得る。理解されるように、抗体分子によって媒介される免疫反応は、「体液性免疫反応」とも呼ばれ得る。抗体媒介性免疫反応に含まれるのは、中和抗体反応である。ある実施形態において、免疫反応は、抗体媒介性反応を含む。他の実施形態において、抗体媒介性反応は、中和抗体反応である。ある実施形態において、抗体反応は、限定はされないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどの免疫グロブリンクラス又はサブタイプを含むか又はそれらによって媒介され得る。
免疫反応を評価するためのアッセイは、当技術分野において及び本明細書における実施例に記載され、インビボアッセイ、例えば抗体反応、遅延型過敏性反応、抗体依存性細胞毒性を測定するためのアッセイ又は細胞媒介性免疫学的反応を刺激する特定の免疫原の能力を測定するためのアッセイを含み得、（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ又は感作された対象における免疫原にと特異的なＴ－リンパ球をアッセイすることによるものであるが、それに限定されない）などのいくつかのアッセイ、サイトカイン放出アッセイ及び中和抗体反応（例えば、ＥＬＩＳＡによる）によって決定され得る。このようなアッセイは、当業者に周知であり、例えば、限定はされないが、Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199；Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376を参照されたい。
好ましい実施形態において、免疫反応は、防御免疫反応であるか又は防御免疫反応を含む。
防御免疫反応は、病原体又はその分子成分の形態の作用物質に対するものであり得、それにより、病原体によるその後の感染は、少なくとも部分的に予防されるか又は最小限に抑えられる。防御免疫反応は、疾患、障害若しくは病態の症状を予防するか、又はその重症度を少なくとも低下させるのに十分な免疫反応を含み得る。防御免疫反応は、癌抗原に対する防御免疫を含み得る。
本明細書において一般に使用される際、「免疫化する」、「ワクチン接種する」及び「ワクチン」という用語は、防御免疫反応を引き起こすか又は増強する方法及び／又は組成物を指す。したがって、「ワクチン接種する」又は「免疫化する」とは、本発明のタンパク質粒子及び／又は前記粒子を含む組成物を対象に送達し、それにより対象における防御免疫反応を引き起こすか又は増強することを意味することが理解されるであろう。したがって、ある実施形態において、タンパク質粒子及び前記タンパク質粒子を含む組成物は、ワクチンであり得る。免疫化の方法又は免疫反応を引き起こす方法は、本明細書に記載される作用物質又は疾患、病態若しくは障害に対して免疫化することを含み得る。
本発明は、対象における免疫反応を調節するための、本明細書に記載されるタンパク質粒子及び組成物の投与を含む方法を想定している。
本明細書において使用される際の「調節する」、「調節」又は調節すること」という用語は、対象における免疫反応又は免疫を改変、調節又は変化させることを意味する。ある実施形態において、このような免疫反応は、作用物質又は免疫原に向けられ得る。ある実施形態において、「免疫反応を調節する」は、対象における免疫反応を促進、強化又は増大することを意味する。他の実施形態において、「免疫反応を調節する」は、対象における免疫反応を少なくとも部分的に抑制するか、阻害するか、弱めるか又は防ぐことを意味する。例として、本明細書に記載されるＣＲＭ１９７アミノ酸配列を含むタンパク質粒子及び限定はされないが、抗ＴＮＦα抗体又はその断片などのＴＮＦα誘導性免疫反応を標的にする作用物質の対象への投与により、関節リウマチ（限定はされないが）などの炎症性自己免疫疾患に罹患している対象における免疫反応を少なくとも部分的に弱めることが望ましいことがある。
本発明は、本明細書に記載されるタンパク質粒子を投与することにより、疾患、障害又は病態を治療及び／又は予防するための治療方法を想定している。
本明細書において使用される際、「治療すること」、「治療する」又は「治療」は、発症し始めた後、疾患、障害又は病態の症状又は病理学的兆候を少なくとも部分的に改善するか、なくすか又は低下させる治療的介入を指す。疾患、障害又は病態に関連する「改善する」という用語は、治療の任意の観察可能な有益な効果を指す。治療は、対象にとって絶対に有益である必要はない。有益な効果は、当業者に公知の任意の方法又は標準を用いて決定され得る。治療は、予防的に又は治療的に行われ得る。
特定の実施形態において、免疫反応は、対象を予防又は治療するのに好適であり得る。
本明細書において使用される際、「予防すること」（又は「予防する」若しくは「予防」）は、症状、局面若しくは特徴を予防するか又は減少させるために、疾患、障害又は病態の症状、局面又は特徴の発生前に開始される一連の行動（本明細書に記載されるタンパク質粒子及びそれを含む組成物を投与することなど）を指す。このような予防は、対象にとって絶対に有益である必要はないことが理解されるべきである。「予防的」処置は、疾患、障害若しくは病態の症状又は臨床的特徴若しくは転帰を発生するリスクを低下させるために、疾患、障害若しくは病態の兆候を示さないか、又は初期兆候を示すに過ぎない対象に施される処置である。
疾患、障害若しくは病態を治療若しくは予防するため、又は免疫反応を引き起こすため、又は免疫反応を調節するため、又は対象を免疫化するための薬剤の製造における、本明細書に記載されるタンパク質粒子の使用も、本明細書において想定される。
「作用物質」という用語は、病理学的反応又は疾患反応、特に免疫反応を引き起こすか又はその一部であり得る任意の分子又はその成分を広く指し得る。作用物質は、病原体又は非病原体生物であり得る。作用物質は、疾患に関連する免疫原（例えば、癌免疫原）であり得る。作用物質は、自己アレルゲン又は移植アレルゲンであり得るが、それに限定されない。疾患、障害又は病態は、作用物質によって引き起こされ得る。疾患、障害又は病態は、作用物質に関連し得る。
特定の好ましい実施形態において、免疫原は、対象とするタンパク質、標的免疫原又は候補免疫原に由来するか又はそれに対応する。
別の広い実施形態において、疾患、障害又は病態は、対象とするタンパク質、標的免疫原又は候補免疫原に関連し得る。
本明細書に記載されるように、本発明は、病原体に対する免疫反応を引き起こし、病原体に対する免疫を誘導し、及び／又は対象における病原体に関連する疾患、障害若しくは病態を予防若しくは治療するか、又は病原体によって引き起こされる感染症を予防若しくは治療するための方法及び／又は組成物を提供する。ある広い実施形態において、疾患、障害又は病態は、病原体によって引き起こされ得る。免疫原及びある実施形態において免疫原の免疫原性アミノ酸配列は、限定はされないが、以下により十分に記載される、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生生物及び真菌のいずれかなどの病原体に由来し得ることが本発明について想定される。ある実施形態において、免疫原は、病原体のタンパク性及び／又は非タンパク性成分分子（例えば、表面タンパク質、細胞表面タンパク質、免疫原性ペプチド又は「サブユニットワクチン」中などの他の成分、複数のＢ－及び／又はＴ－エピトープを含むポリトープ、ＶＬＰ、カプシド若しくはカプソメア）、不活性化病原体（例えば、不活性化ウイルス、弱毒化寄生生物感染ＲＢＣ若しくは弱毒化細菌）又は病原体に対する免疫反応を引き起こすことが可能な任意の他の分子であり得る。免疫反応を引き起こすことが可能な他の分子の非限定的な例としては、細菌の表面における炭水化物、特に莢膜多糖及び／又はリポ多糖の形態の炭水化物及び／又は細菌などの病原体の病原性に関与する他の病原性因子が挙げられる。したがって、本発明は、ある実施形態において、ジフテリアＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ又は複数の免疫原を想定し、その又はそれぞれの免疫原は、本明細書に記載されるタンパク質粒子において使用するためのタンパク性及び／又は非タンパク性免疫原であり得る。ある実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列以外のその又はそれぞれの免疫原は、病原体のものであるか、それに由来するか又はそれからのものである。
本明細書において使用される際の「病原体」という用語は、（限定はされないが）哺乳動物などの対象における疾患、障害又は病態を引き起こすことが可能な任意の生きた又は生きていない生物に関する。病原体は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌又は寄生生物（寄生虫など）であり得る。
１つ以上の免疫原は、ウイルスに由来するか又はそれに対応し得る。１つ以上の免疫原は、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか又はそれに対応し得る。
本明細書におけるウイルス又はウイルスタンパク質への言及は、限定はされないが、任意のウイルス科のウイルス又はタンパク質を含む。
本明細書において使用される際、ウイルスは、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスを含む。非エンベロープウイルスは、裸のウイルスとも呼ばれ得る。理解されるように、非エンベロープウイルスは、ウイルスゲノムを封入するカプシドのみを有するウイルスを指す。エンベロープウイルスは、典型的に、ウイルスエンベロープによって被覆されるウイルスゲノム及びカプシドを含む。典型的に、ウイルスエンベロープは、宿主細胞に由来する脂質及びタンパク質並びに１つ以上のウイルスタンパク質（例えば、糖タンパク質）を含み得る。ウイルスタンパク質は、ウイルス若しくはビリオン粒子（例えば、粒子の表面上で又はエンベロープ及び／又はカプシドの一部として）中若しくはその上に存在するか若しくはそれらに組み込まれるか、又はウイルスの複製若しくは宿主細胞相互作用の一部であるウイルスゲノムによってコードされる任意のタンパク質を指し得る。ウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、表面タンパク質（例えば、細胞との融合を促進するためにウイルス粒子表面上に存在する融合タンパク質）、構造タンパク質、調節タンパク質、アクセサリータンパク質及び／又は非構造タンパク質（又はそれらの組合せ）であり得る。典型的に、限定はされないが、非構造タンパク質は、ウイルスゲノムの複製に関与し、感染細胞内で発現され、一般にウイルス又はビリオン粒子に組み込まれない。ポリメラーゼタンパク質は、非構造タンパク質の非限定的な例である。構造タンパク質は、典型的に、ウイルスゲノムを封入する構造の一部としてウイルス又はビリオン粒子に組み込まれる。表面タンパク質は、受容体によって宿主細胞に結合し得る。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又は又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、（限定はされないが）マストアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス）及びアビアデノウイルス（例えば、トリアデノウイルス）を含むが、それに限定されないアデノウイルス科（Adenoviridae）の任意のメンバー；限定はされないが、単純ウイルス（例えば、ヒトヘルペスウイルス１）及び水痘状帯状疱疹ウイルス（varicellosus）（例えば、ヒトヘルペスウイルス３）などのアルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）を含むヘルペスウイルス科（Herpesviridae）の任意のメンバー；限定はされないが、サイトメガロウイルス（例えば、ヒトヘルペスウイルス５）、ムロメガロウイルス（例えば、マウスサイトメガロウイルス１）、ロゼオロウイルス（例えば、ヒトヘルペスウイルス６）などのベータヘルペスウイルス亜科（Betaherpesvirinae）；限定はされないが、リンフォクリプトウイルス（例えば、ヒトヘルペスウイルス４）、ラジノウイルス（例えば、クモザルヘルペスウイルス２）などのガンマヘルペスウイルス亜科（Gammaherpesvirinae）；パピローマウイルス、好ましくはヒトパピローマウイルス、好ましくはサブタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８及び５９を含むが、それに限定されないパピローマウイルス科（Papillomaviridae）の任意のメンバー；限定はされないがラナウイルス及び例えば、流行性造血器壊死ウイルスを含むイリドウイルス科（Iridoviridae）の任意のメンバー；ポリオーマウイルス、好ましくはマウスポリオーマウイルスを含むポリオーマウイルス科（Polyomaviridae）の任意のメンバー；オルソポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）、パラポックスウイルス（例えば、ｏｒｆウイルス）、鳥類ポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルス）、カプリポックスウイルス（例えば、羊痘ウイルス）、レポリポックスウイルス（例えば、粘液腫ウイルス）及びスイポックスウイルス（例えば、豚痘ウイルス）を含むポックスウイルス科（Poxviridae）の任意のメンバーを含む、ｄｓＤＮウイルス群の任意のメンバーを想定している。本発明のウイルスは、（限定はされないが）パルボウイルス（例えば、関節リウマチウイルス、Ｂ１９）を含むパルボウイルス科（Parvoviridae）の任意のメンバーを含む、ｓｓＤＮウイルス群の任意のメンバーをさらに想定している。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、（限定はされないが）アクアビルナウイルス（例えば、感染性膵臓壊死ウイルス）及びアビビルナウイルス（例えば、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）を含むビルナウイルス科（Birnaviridae）の任意のメンバー；オルソレオウイルス（例えば、レオウイルス３）、オルビウイルス（例えば、ブルータングウイルス１）、ロタウイルス、コルティウイルス（例えば、コロラドダニ熱ウイルス及びアクアレオウイルスを含むレオウイルス科（Reoviridae）の任意のメンバーを含む、ｄｓＲＮウイルス群の任意のメンバーをさらに想定している。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、（限定はされないが）アストロウイルス（例えば、ヒトアストロウイルス）及びアルテリウイルス（例えば、ウマ動脈炎ウイルス）を含むアストロウイルス科（Astroviridae）の任意のメンバー；ノーウォークウイルスを含むカリシウイルス科（Caliciviridae）の任意のメンバー；Ｅ型肝炎ウイルスを含むヘペウイルス科（Hepeviridae）の任意のメンバー；コロナウイルス及びＳＡＲＳコロナウイルス及びトロウイルスを含むコロナウイルス科（Coronaviridae）の任意のメンバー；限定はされないが、黄熱病ウイルス、デングウイルス及びウエストナイルウイルスなどのフラビウイルスを含むフラビウイルス科（Flaviviridae）の任意のメンバー；ペスチウイルス（例えば、ウシ下痢ウイルス）及びＣ型肝炎様ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）；エンテロウイルス、ライノウイルス（例えば、ヒトライノウイルス１Ａ）、ヘパトウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス（例えば脳心筋炎ウイルス）及びアフトウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス）を含むピコルナウイルス科（Picornaviridae）の任意のメンバー；アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス）及びルビウイルス（例えば、風疹ウイルス）を含むトガウイルス科（Togaviridae）の任意のメンバーを含む、（＋）センスＲＮウイルス群の任意のメンバーを想定している。
コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスを想定する実施形態において、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスは、コロナウイルス（「ＣｏＶ」）であり得る。コロナウイルスは、ヒトを感染させ得る。コロナウイルスは、哺乳動物、特にヒトの重症急性呼吸器症候群の原因病原体であるか又はそれに関連し得る。ある実施態において、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス及び／又は中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－ＣｏＶであり得る。ある実施形態において、ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／又はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のいずれかであり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶとも呼ばれる）は、２００３年の大流行に関連していることが理解される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年１２月に中国湖北省で最初に現れたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の大流行に関連する疾患用語であるＣＯＶＩＤ－１９の原因病原体であるか又はそれに関連する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、遺伝的に関連したさらに異なるウイルスである。ある実施形態において、ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり得る。
コロナウイルスに関連するある実施形態において、ウイルスタンパク質は、構造タンパク質であり得、好ましくは、構造タンパク質は、ウイルスエンベロープ上に位置する融合タンパク質又はカプシドタンパク質であり得る。特定の実施形態において、構造タンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される。上記の実施形態によれば、前記ウイルスタンパク質の断片、変異体又は誘導体が想定される。
ある実施形態は、スパイク（Ｓ）タンパク質（「スパイク糖タンパク質」とも呼ばれる）の形態であり得るコロナウイルスのウイルスタンパク質を想定している。特定の理論によって制約されることを望むものではないが、コロナウイルススパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）は、ウイルスエンベロープ上に三量体構造を形成し、結合及びウイルス侵入を促進する。典型的に、Ｓタンパク質は、Ｓ１ドメインを含み、これは、細胞表面上で受容体に結合する受容体結合ドメイン（「ＲＢＤ」）を含有する。
特に、Ｓタンパク質のＲＢＤは、典型的に、「臨界中和ドメイン」（「ＣＮＤ」）と呼ばれるドメインを含有し、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ菌株に対する非常に強力な中和抗体反応及び交差防御を誘導することが可能であり得る。コロナウイルスＳタンパク質は、典型的に、ウイルスエンベロープ上に三量体構造を形成し、結合及びウイルス侵入を促進する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、典型的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同じ侵入受容体、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を使用する。ＡＣＥ２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶの結合に関与する１つ以上のアミノ酸残基がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において保存される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の両方について行われた過去の研究は、中和抗体並びにＴ細胞反応が生存患者又はワクチン接種された動物においてＳタンパク質に対して生成されることを示した。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について同様である可能性が高い。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、中和抗体を誘導することが可能であり得、このタンパク質は、組成物、特に免疫原性組成物のための潜在的な候補抗原分子であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ（ヌクレオカプシド）タンパク質は、ウイルスコアに位置する構造タンパク質である。回復期患者は、このタンパク質に対する高い抗体力価を示し得る。Ｎタンパク質は、生存者におけるＴ細胞反応（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の分析に基づいて、いくつかのＴ細胞エピトープを含有し得る可能性が高い。何らかの特定の理論によって制約されることを望むものではないが、これらのＴ細胞エピトープのいくつかは、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ変異体において保存される。したがって、ある実施形態において、Ｎタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体は、任意選択的に、Ｓタンパク質（又は限定はされないが、Ｓ１ドメイン又はＲＢＤなどのその断片、変異体若しくは誘導体）と組み合わせて、ある実施形態において中和抗体及び／又はＴ細胞反応を誘導し得る好適な免疫原を構成し得る。したがって、ある実施形態において、このような免疫原は、コロナウイルス感染を防ぎ得る。Ｓタンパク質及びＮタンパク質のための例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６４及び配列番号５６に記載される。
ある実施形態において、コロナウイルスＳタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、Ｓタンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体のＳ１ドメインに由来するか又はそれに対応する。Ｓ１ドメインは、Ｓタンパク質のアミノ酸残基１～６８１（例えば、配列番号６４に記載されるＳタンパク質配列）にわたるか又はそれを含み得る。特定の実施形態において、Ｓ１ドメインの又はそれに由来する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５８に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
ある実施形態において、Ｓタンパク質のＳ１ドメインの断片は、ＲＢＤドメインを含み得る。ＲＢＤドメインは、Ｓタンパク質のアミノ酸残基３１９～５２９（例えば、配列番号６４に記載されるＳタンパク質配列）にわたり得る。さらなる実施形態において、ＲＢＤドメインは、配列番号５７に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
ある実施形態において、コロナウイルスＳタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、Ｓタンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体のＳ２ドメインに由来するか又はそれに対応する。Ｓ２ドメインは、Ｓタンパク質のアミノ酸残基６８６－１２７３（例えば、配列番号６４に記載されるＳタンパク質配列）にわたるか又はそれを含み得る。
本発明のある実施形態は、Ｎタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体の形態であり得るコロナウイルスタンパク質を想定している。コロナウイルスＮタンパク質は、いくつかの保存されたＴ細胞エピトープを含み得ることが理解されるであろう。ある実施形態において、コロナウイルスＮタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５６に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
特定の実施形態において、コロナウイルスのウイルスタンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体である。ある実施形態において、スパイクタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
ある実施形態において、Ｓタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質の断片、ペプチド、エピトープ若しくは一部に由来し得るか又はそのようなＳタンパク質である。好適には、コロナウイルスＳタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質であり得る。
Ｓタンパク質を包含するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、６４０位においてＳタンパク質のグリシン残基へのアスパラギン酸残基の置換（例えば、配列番号６４に記載されるＳタンパク質アミノ酸配列の置換）を含むＳタンパク質の変異体又はその断片若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
ある実施形態において、コロナウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６４、配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列（又はその断片、変異体若しくは誘導体）並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである。ある実施形態において、コロナウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号１０１に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体である。
ある実施形態において、コロナウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６４、配列番号１０１、配列番号１０２及び／又は配列番号１０３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列（又はその断片、変異体若しくは誘導体）並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである。
ある実施形態において、コロナウイルス免疫原性アミノ酸配列は、実施例９及び／又は１０（並びに関連する図及び／又は表）に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、（限定はされないが）フィロウイルス（例えば、マールブルグ・ウイルス、エボラウイルス）を含むフィロウイルス科（Filoviridae）の任意のメンバー；パラミクソウイルス（例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス１）、モルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、ヘンドラウイルス及びニパウイルスを含むパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）の任意のメンバー；ニューモウイルス（例えば、ヒト呼吸器合胞体ウイルス）を含むニューモウイルス科（Pneumovirinae）の任意のメンバー；ベジクロウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス、インドウイルス）、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）及びエフェメロウイルス（例えば、ウシ流行熱ウイルス）を含むラブドウイルス科（Rhabdoviridae）の任意のメンバー；アレナウイルス（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）などのアレナウイルス科（Arenaviridae）の任意のメンバーを含むアンビセンスＲＮウイルス群の任意のメンバー；ブニヤウイルス（例えば、ブニヤムウェラウイルス）及びハンタウイルス（例えば、ハンタウイルス）を含むブニヤウイルス科（Bunyaviridae）の任意のメンバー；Ａ型インフルエンザウイルス（インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルスなど）、Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｂ型インフルエンザウイルスなど）、Ｃ型インフルエンザウイルス（Ｃ型インフルエンザウイルスなど）及び「トゴト様ウイルス」（例えば、トゴトウイルス）を含むオルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）の任意のメンバーを含む、（－）マイナスセンスＲＮウイルス群の任意のメンバーを想定している。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物Ｂ型レトロウイルス（例えば、マウス乳癌ウイルス）、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス）、トリＣ型レトロウイルス（例えば、トリ白血病ウイルス）、Ｄ型レトロウイルス（例えば、メイソンファイザーサルウイルス）、ＢＬＶ－ＨＴＬＶレトロウイルス（例えば、ウシ白血病ウイルス）、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１）及びスピューマウイルス（例えば、ヒトスピューマウイルス）を含むレトロウイルス科（Retroviridae）の任意のメンバーを含むＲＮＡ逆転写ウイルス群の任意のメンバーを想定している。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、オルトヘパドナウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス）及びアビヘパドナウイルス（例えば、アヒルＢ型肝炎ウイルス）を含む、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）の任意のメンバーを含む、ＤＮＡ逆転写ウイルス群の任意のメンバーを想定するが、それに限定されない。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、サーコウイルス科（Circoviridae）の任意のメンバー；パルボウイルス科（Parvoviridae）の任意のメンバーを含む、ｓｓＤＮＡウイルス群の任意のメンバーを想定するが、それに限定されない。
ウイルス、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスタンパク質配列に由来するか若しくはそれに対応するウイルス及び／又は免疫原性アミノ酸配列又は免疫原を想定する好ましい実施形態において、本発明は、サテライト（例えば、タバコ壊死ウイルス）、ウイロイド（デルタ型肝炎ウイルス）及び海綿状脳症因子（例えば、プリオン、スクレイピー作用物質）などのサブウイルス作用物質の非分類群の任意のメンバーを想定している。
本発明は、フラビウイルス科（Flaviviridae）のメンバーに関連して特に有用であり得る。好ましい実施形態において、フラビウイルス科（Flaviviridae）のメンバーは、Ｃ型肝炎ウイルスである。例として、ＨＣＶゲノムは、コア抗原、Ｅ１（Ｅとしても知られている）及びＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても知られている）、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５などを含むいくつかのウイルスタンパク質をコードし、これは、本発明で利用される（Ｅ１及びＥ２を含むＨＣＶタンパク質の説明については、Houghton et al. Hepatology (1991) 14: 381-388を参照されたい）。特に好ましい実施形態において、本発明に係るＨＣＶウイルスタンパク質は、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質及びコア抗原タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。ＨＣＶタンパク質は、翻訳後に切断され得るポリタンパク質として発現されることが理解されるであろう。ＨＣＶゲノムに由来するポリタンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号４４に記載される。ある実施形態において、ＨＣＶタンパク質又はその免疫原性酸配列は、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列に由来するか又はそれに対応し得る。
ある実施形態において、本明細書において使用される際のＨＣＶコアタンパク質は、配列番号４３に記載されるアミノ酸配列を含み得る。ある実施形態において、ＨＣＶコアタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４３に記載されるアミノ酸配列を含むＨＣＶコアタンパク質の断片、ペプチド、エピトープ若しくは部分に由来し得るか、又はそのようなＨＣＶコアタンパク質であり得る。ある実施形態において、ＨＣＶコアタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８及び／又は配列番号４３に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
ある実施形態において、本明細書において使用される際のＨＣＶ ＮＳ３タンパク質は、配列番号６９に記載されるアミノ酸配列を含み得る。ある実施形態において、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６９に記載されるアミノ酸配列を有するＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の断片、ペプチド、エピトープ若しくは部分に由来し得るか、又はそのようなＨＣＶ ＮＳ３タンパク質である。ある実施形態において、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２９に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。ある実施形態において、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質は、配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。ある実施形態において、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４５に記載されるアミノ酸配列を有するＨＣＶ Ｅ１タンパク質の断片、ペプチド、エピトープ若しくは部分に由来し得るか、又はそのようなＨＣＶ Ｅ１タンパク質である。特定の実施形態において、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号３０及び／又は配列番号７０に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。ある実施形態において、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含み得る。ある実施形態において、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を有するＨＣＶ Ｅ２タンパク質の断片、ペプチド、エピトープ若しくは部分に由来し得るか、又はそのようなＨＣＶ Ｅ２タンパク質である。ある実施形態において、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号７１及び配列番号１０４に記載されるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
ある実施形態において、ＨＣＶ免疫原性アミノ酸配列は、実施例５及び／又は６（並びに任意の関連する図及び／又は表）に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号１０４に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれであるＨＣＶタンパク質に由来するか又はそれに対応し得る。
ＨＣＶに関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８、２９、３０、３１、７０及び／又は１０４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか又はそれから本質的になり得る。
ＨＣＶに関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８、２９、７０及び／又は１０４のいずれか１つ若しくはその中に記載されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか又はそれから本質的になり得る。
ＨＣＶに関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２９～３１のいずれか１つ若しくはその中に記載されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか又はそれから本質的になり得る。
ＨＣＶに関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それからなるか又はそれから本質的になり得る。
ある他の実施形態において、フラビウイルス科（Flaviviridae）のメンバーは、デングウイルスである。ある実施形態によれば、アミノ酸配列は、エンベロープタンパク質及び／又はカプシドタンパク質の形態のデングウイルスタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。ある実施形態において、デングウイルスエンベロープタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４７に記載されるアミノ酸配列を有するデングエンベロープタンパク質の断片、ペプチド、エピトープ若しくは部分に由来し得るか、又はそのようなデングエンベロープタンパク質である。ある実施形態において、デングウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号４１に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体又は誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。ある実施形態において、デングウイルスカプシドタンパク質免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を有するデングカプシドタンパク質の断片、ペプチド、エピトープ若しくは部分に由来し得るか、又はそのようなデングカプシドタンパク質である。他の実施形態において、デングウイルスカプシドタンパク質は、配列番号４２に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。これらの実施形態によれば、デングウイルスは、デング１型、デング２型、デング３型及びデング４型並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
ある実施形態において、デングウイルス免疫原性アミノ酸配列は、実施例７（並びに任意の関連する図及び／又は表）に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスのさらなる例である。好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスタンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質Ｍ１及び基質タンパク質Ｍ２並びにそれらの組合せからなる群から選択される。Ａ型インフルエンザのエンベロープ糖タンパク質ＨＡ及びＮＡは、免疫反応を生成するために特に興味深いことがある。ある実施形態において、インフルエンザウイルスに由来する免疫原は、ＨＡの超可変領域に対応する。他の実施形態において、インフルエンザウイルスに由来する免疫原は、Ｍ２及びより好ましくはＭ２ｅのドメインである。典型的に、限定はされないが、Ｍ２のドメインは、エクトドメインである。
対象のタンパク質粒子組成物において使用されるのに特に興味深い他の免疫原としては、Ｅ６及びＥ７を含む様々な初期タンパク質、ダニ媒介性脳炎ウイルス、限定はされないが、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇａｇ及びｐｏｌなどの分離株ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ）からの免疫原を含むＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られている）の１つ以上など、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来する免疫原及びポリペプチドが挙げられる。Mann and Ndungu (2015) Virol J., 12: 3.が参照され、これは、好適であり得るＨＩＶタンパク質及び／又は免疫原の非限定的な例を説明し、参照により本明細書に援用される。
アピコンプレクサ（apicomplexa）又は単細胞寄生生物、線虫、吸虫、条虫及び植物病原体又は細菌を含む、真菌、寄生生物を含む非ウイルス性の病原菌及び免疫原が想定される。
真菌の非限定的な例としては、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ブラストミセス・デルマティディス（Blastomyces dermatitidis）及びパラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）などの原発性全身性真菌病原体が挙げられる。免疫不全宿主に依存する傾向がある日和見真菌病原体としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ニューモシスチス・イロベチイ（Pneumocystis jiroveci）、カンジダ属（Candidasp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）及び接合菌綱（Zygomycetes）、トリコスポロン・ベイジェリイ（Trichosporon beigelii）、コクシジオイデス属（Coccidioides）種及びフザリウム属（Fusarium sp）が挙げられるが、それに限定されない。ある範囲の病原性真菌は、ＡＩＤＳを有する対象、化学療法による好中球減少症を有する対象又は特に造血幹細胞移植を受けている患者を含む免疫不全対象に関連している。
寄生生物の非限定的な例としては、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、サルマラリア原虫（P. knowlesii）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）及び三日熱マラリア原虫（P. vivax）などのプラスモジウム属（Plasmodium sp）を含むマラリア寄生生物などの原生動物が挙げられるが、それに限定されない。ある好ましい実施形態は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に関連している。他の寄生生物としては、住血吸虫属（Schistosoma sp）、赤痢アメーバ属（Amebiasis sp）、バベシア属（Babesiasp）、クリプトスポリジウム属（Cryptosporidium sp）、シクロスポリア属（Cyclosporia sp）、ジアルジア属（Giardia sp）、微胞子虫属（Microsporidia sp）、トキソプラズマ属（Toxoplasma sp）及びリーシュマニア属（Leishmania sp）を含むトリパノソーマ科（Trypanosomes）が挙げられるが、それに限定されない。回虫は、糸状虫属（filarial sp）、ストロンギロイディアル属（strongyloidial sp）、旋毛虫属（trichinellosis sp）及びトキソカラ属（toxocariasis sp.）を含む。吸虫は、肺吸虫属（Paragonimus sp）及び住血吸虫属（Schistosoma sp）を含むが、それに限定されない。条虫は、嚢虫属（Cysticercosis sp）及びエキノコックス属（Echinococcosis sp）を含むが、それに限定されない。
マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）及びビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）の１つ以上を含む住血吸虫症の原因病原体も想定される。住血吸虫属（Schistosoma）種に対する免疫原の非限定的な例は、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６／１７２７６２号に見出され得る。
本発明は、細菌に由来する免疫原の使用も包含し、特に細菌性病原体を含むグラム陽性及びグラム陰性菌は、ナイセリア属（Neisseria）、ボルデテラ属（Bordatella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、赤痢菌属（Shigella）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、クロストリジウム属（Clostridium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、ボレリア属（Borrelia）、エルシニア属（Yersinia）、レジオネラ属（Legionella）、ヘモフィルス属（Hemophilus）、リケッチア属（Rickettsia）、バークホルデリア属（Burkholderia）、リステリア属（Listeria）、ブルセラ属（Brucella）、コクシエラ属（Coxiella）、クラミドフィラ属（Chlamydophila）、ビブリオ属（Vibrio）及びトレポネーマ属（Treponema）などの属のものであり得、これは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、百日咳菌（Bordatella pertussis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diptheriae）、羊仮性結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、Ａ群又はＢ群連鎖球菌（group A or group B Streptococcus）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ミュータンス連鎖球菌（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguis）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、緑色連鎖球菌（Streptococcus viridans）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、インフルエンザ菌Ｂ型（Hemophilus influenzae type B）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasieurella multicida）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・アシアチクム（Mycobacterium asiaticum）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、マイコプラズマ肺炎菌（Mycoplasma pneumoniae）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、イヌ流産菌（Brucella canis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneuophila）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Treponema pertanue）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、トレポネーマ・カラテウム（Treponema carateum）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、チフス菌（Salmonella typhi）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）、コクシエラ菌（Coxiella burnetii）、肺炎クラミジア菌（Chlamydophila pneumoniae）及びペスト菌（Yersinia pestis）などの種を含むが、それに限定されない。
Ａ群連鎖球菌（group A streptococcus）（ＧＡＳ）細菌に関連する実施形態において、Ａ群連鎖球菌（group A streptococcus）細菌（例えば、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））に対する免疫反応を引き起こすのに用いられ得る、より具体的にはＡ群連鎖球菌（group A streptococcus）細菌に対して免疫化するために使用するための、例示的な免疫原性断片／ペプチドは、病原性因子に由来するか又はそれに対応し得、ある実施形態においてＭ－タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。Ｍタンパク質は、強い抗食作用性を有し、血清因子Ｈに結合して、Ｃ３－コンベルターゼを破壊し、Ｃ３ｂによるオプソニン化を防止する病原性因子である。特定の実施形態において、Ｍ－タンパク質に由来する免疫原性断片は、アミノ酸配列ＬＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫＮＱＶＥＲＡＬＥ（配列番号１７）を含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである。ＧＡＳ免疫原性断片は、好中球阻害剤タンパク質又はその断片に由来するか又はそれに対応し得る。好中球阻害剤は、プロテアーゼ又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。プロテアーゼは、ＩＬ－８プロテアーゼ又はその断片であり得る。プロテアーゼ／ＩＬ－８プロテアーゼは、ＳｐｙＣＥＰタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。ある実施形態において、ＳｐｙＣＥＰタンパク質断片は、線状Ｂ細胞エピトープであり得る。特定の実施形態において、ＳｐｙＣＥＰタンパク質断片は、アミノ酸配列ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）を含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである。ある実施形態において、ＧＡＳ免疫原性断片は、ペプチダーゼ又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。ペプチダーゼは、Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳｃｐＡ）であり得る。ＧＡＳ免疫原性断片は、フィブロネクチン結合タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体であり得る。ある実施形態において、同じ又は異なるＧＡＳタンパク質に由来する、複数のＧＡＳに由来する免疫原性断片が使用され得る。ある実施形態において、Ｍ－タンパク質に由来する免疫原性断片は、ＳｐｙＣＥＰタンパク質又はその断片に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列と共投与される。他の特定の実施形態において、ＧＡＳ免疫原性断片は、配列番号１７及び／又は１８に記載されるアミノ酸配列を含む。他の例示的なＧＡＳ免疫原性断片は、国際公開第２０１５／１５７８２０号又は国際公開第２０１９／０３６７６１号に見出され、これらは、それぞれ参照により本明細書に援用される。
ある実施形態において、ストレプトコッカス属（Streptococcus）免疫原性アミノ酸配列は、実施例４及び／又は表６（並びに任意の関連する図）に記載されるアミノ酸配列のいずれか又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
ある実施形態において、細菌は、コクシエラ属（Coxiella）種である。さらなる実施形態において、コクシエラ属（Coxiella）種は、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）である。コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）（Ｃ．バーネッティ（C. burnetti））は、人獣共通感染症Ｑ（「クエリ」）熱の病原因子である。それは、身体機能を奪うインフルエンザ様疾患として発現するグラム陰性細胞内細菌である。急性Ｑ熱は、多くの場合、自己限定性発熱疾患又は肺炎として現れる一方、慢性Ｑ熱は、治療不能である場合がある心内膜炎及び慢性肝炎を合併し得る。Ｃ．バーネッティ（C. burnetti）の候補免疫優勢抗原並びにこれらの抗原の特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エピトープの同定を、本明細書に記載されるバイオインフォマティクス分析によってマッピングした。ＣＯＸと呼ばれるこれらの抗原のエピトープは、１０１．１ｋＤａの総サイズを有し、これは、潜在的なＱ熱治療開発に利用され得る。ＣＯＸタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５９に記載される。
コクシエラ属（Coxiella）種に関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４～１００（表７に記載される）のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。コクシエラ属（Coxiella）種に関連するある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５９に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
Ｑ熱の臨床診断は、兆候が特徴的でないため困難であり、レプトスピラ症及びデング熱などの他の疾患と容易に混同され得る。実施例に記載されるＣｏｍ１、ＯｍｐＨ、ＹｂｇＦ及びＧｒｏＥＬを含む、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）抗原のいくつかの完全長配列は、Ｑ熱の診断マーカーとして使用され得、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４～１００（表７に記載される）のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか、それからなり得るか又はそれである。
ある実施形態において、コクシエラ属（Coxiella）アミノ酸配列又は免疫原性アミノ酸配列は、実施例１１及び／又は１２及び表７（並びに任意の関連する図）に記載されるアミノ酸配列のいずれか又はその断片、変異体若しくは誘導体．又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
結核に関連する他の一般的な実施形態において、好ましくは、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）である。ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種免疫原は、早期抗原及び／又は潜在関連抗原に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列であり得る。ある実施形態において、早期抗原は、Ａｇ８５Ｂ抗原及び／又はＴＢ１０．４抗原から選択される。ある実施形態において、潜在関連抗原は、Ｒｖ２６６０ｃタンパク質であり得る。ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、Ａｇ８５Ｂ抗原及びＴＢ１０．４抗原又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなり得る。このような組合せは、Ｈ４抗原として当技術分野において公知であり得る。ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、Ａｇ８５Ｂ抗原、ＴＢ１０．４抗原及びＲｖ２６６０ｃタンパク質に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列（その断片、変異体及び誘導体を含む）を含み得る。このような組合せは、Ｈ２８抗原として当技術分野において公知であり得る。Ｈ４及びＨ２８抗原の例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６及び７に記載される。
ある実施形態において、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである。
ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質に由来するか又はそれに対応する１つ以上の免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６及び／又は配列番号７に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。ある実施形態において、本明細書に記載されるマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に関連するタンパク質粒子は、配列番号１９、２０及び／又は配列番号３２～４０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列、好適には免疫原性アミノ酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になり得るか又はそれである。配列番号３２～４０のいずれか１つにおけるアミノ酸配列は、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に関連する検出の方法に関連し得るある実施形態において特に好適であり得る。
ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）免疫原性アミノ酸配列は、実施例１、表３及び／又は表４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応し得る。
特定の広い態様において、本発明は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。他の広い態様において、本発明は、ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質又はアミノ酸配列をコードする単離核酸を包含する。単離タンパク質は、キメラであり得る。さらなる広い態様において、本発明は、ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質又はアミノ酸配列をコードする単離核酸を含む遺伝的構築物を提供する。他の広い態様において、本発明は、遺伝的構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞から選択され得る。宿主細胞は、原核細胞であり得る。原核細胞は、大腸菌（E. coli）であり得る。さらに他の広い態様において、本発明は、ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む１つ以上の単離タンパク質を含むタンパク質粒子を提供する。広い態様において、本発明は、タンパク質粒子を産生する方法であって、単離核酸又は遺伝的構築物を宿主細胞中に導入する工程、単離核酸によってコードされる単離タンパク質の産生を促進する条件下で宿主細胞を培養する工程及び単離タンパク質からタンパク質粒子を形成する工程を含む方法を提供する。産生の方法は、任意選択的に、単離タンパク質を精製することを含み得る。本発明の他の広い態様は、この方法によって生成されるＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を含む。単離タンパク質又はタンパク質粒子は、組み換え技術によって産生され得る。タンパク質粒子は、細胞に由来し得る。タンパク質粒子は、特に、細胞内で形成又は発現されるとき、実質的に不溶性のタンパク質粒子であり得る。タンパク質粒子及び／又は実質的に不溶性のタンパク質粒子は、細胞の不溶性成分に由来し得る。不溶性成分は、封入体であり得る。特定の実施形態において、ＣＲＭアミノ酸配列は、タンパク質リフォールディング処理に供されたＣＲＭタンパク質又はその断片に由来しない。ある実施形態において、タンパク質粒子は、タンパク質リフォールディング処理に供されない。広い態様において、本発明は、ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質及び／又はＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤と一緒に含む組成物、好適な医薬組成物を提供する。医薬組成物は、免疫原性組成物であり得、免疫原性組成物は、免疫治療用組成物であり得、免疫治療用組成物は、ワクチンであり得る。さらに他の広い態様において、本発明は、対象におけるマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に対する免疫反応を引き起こす方法、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に対して対象を免疫化する方法及び対象におけるマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種感染を治療又は予防する方法を提供し、このような方法は、ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質及び／又はＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含むタンパク質粒子又はそれを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む。好適には、免疫反応は、防御免疫反応であるか、それを含むか又はそれを引き起こす。ある実施形態において、対象は、哺乳動物であり得る。好適には、哺乳動物は、ヒトであり得る。特定の実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）である。ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）早期抗原に由来するか又はそれに対応し得る。ある実施形態において、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）早期抗原は、Ａｇ８５Ｂ抗原及び／又はＴＢ１０．４抗原から選択され得る。ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）潜在関連抗原に由来するか又はそれに対応し得る。ある実施形態において、潜伏関連抗原は、Ｒｖ２６６０ｃタンパク質である。ある実施形態において、免疫原性アミノ酸配列は、Ａｇ８５Ｂ抗原、ＴＢ１０．４抗原及びＲｖ２６６０ｃタンパク質に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列、その断片、変異体及び誘導体を含む）を含み得る。このような組合せは、当技術分野においてＨ２８抗原として公知であり得る。例示的なＨ４及びＨ２８抗原のアミノ酸配列は、配列番号６及び７に記載される。より好ましくは、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質に由来するか又はそれに対応する１つ以上の免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６及び／又は配列番号７に記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、配列番号３２～４０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に由来するか又はそれに対応するアミノ酸配列をさらに含み得、ある実施形態において、アミノ酸配列は、免疫原性アミノ酸配列であり得る。これらの態様によれば、ＣＲＭアミノ酸配列及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に由来する免疫原性アミノ酸配列を含む単離タンパク質並びに単離核酸、宿主細胞、遺伝的構築物、タンパク質粒子に関連する方法及び他の特徴、その産生方法、組み換え発現、組成物（例えば、医薬組成物）及びそれに関連する治療方法は、一般に、上述され、相応して適用され得る。マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種に関連するこれらの特定の態様及び実施形態によれば、ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応する。好ましくは、ＣＲＭアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４９及び／又は配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＲＭ１９７タンパク質に由来するか又はそれに対応する。
他の医学的に関連する微生物は、文献において広範囲に記載されており、例えば全内容が参照により本明細書に援用されるC. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983を参照されたい。
本発明は、癌、神経疾患（より好ましくは変性性神経疾患）、アレルギー及び自己免疫疾患に関連するか又はその原因となるタンパク質に由来するか又はそれに対応する１つ以上の免疫原の使用も想定している。このようなタンパク質は、自己抗原であり得る。
別の広い実施形態において、疾患、障害若しくは病態は、癌である。本明細書において一般に使用される際、「癌」、「腫瘍」、「悪性の」及び「悪性」という用語は、腫瘍形成に関連する１つ以上の遺伝子突然変異若しくは他の遺伝子変化を含む異常な（aberrant）又は異常な（abnormal）分子表現型を伴うことが多い異常な（aberrant）又は異常な（abnormal）細胞増殖、分化及び／又は遊走、腫瘍マーカーの発現、腫瘍抑制遺伝子発現若しくは活性の喪失及び／又は異常な（aberrant）又は異常な（abnormal）細胞表面マーカー発現によって特徴付けられる、疾患若しくは病態又は疾患若しくは病態に関連する細胞若しくは組織を指す。癌及び腫瘍の非限定的な例としては、肉腫、癌腫、腺腫、白血病及びリンパ腫、肺癌、結腸癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、神経芽細胞腫、グリア芽腫及び他の神経癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、頭頸部癌、腎臓癌、前立腺癌及び黒色腫が挙げられる。
ある実施形態において、癌は、免疫療法の処置に適し得得るか又は免疫療法に応答し得る。したがって、ある実施形態において、免疫反応が求められる免疫原は、癌、特に腫瘍などの病態に関連するか又はその原因となる抗原、すなわち腫瘍抗原であり得る。
したがって、本発明は、胚細胞腫瘍、大腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌及び精巣癌などの泌尿生殖器癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄腫、白血病、造血器新生物、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌、腺癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、原発性若しくは転移性黒色腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、血管肉腫、血管内皮腫、頭頸部癌、甲状腺癌、軟組織肉腫、骨肉腫、子宮癌、子宮頸癌、消化管癌、胆道癌、絨毛腫、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内腫瘍、リンパ腫、肺癌（例えば、小細胞及び非小細胞）、神経芽細胞腫、口腔癌、直腸癌；皮膚癌並びに他の癌腫及び肉腫に見られるか又はそれらに関連する腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原（まとめて「癌抗原」と呼ばれ得る）を想定するが、それに限定されず、任意の他の癌は、現在知られているか又は後に特定される（例えば、全内容が参照により本明細書に援用されるRosenberg (1996) Ann. Rev. Med. 47: 481-491を参照されたい）。癌は、悪性又は非悪性癌であり得ることが理解されるであろう。
腫瘍及び／又は腫瘍関連抗原の非限定的な例は、αフェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、ｒａｓ、ｐ５３、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、乳癌のＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＢＲＣＡ１抗原、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐｌＯＯ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、｜３－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶ Ｅ７、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ及びｐ１５抗原、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリー、ＢＡＧＥファミリー（ＢＡＧＥ－１など）、ＤＡＧＥ／ＰＲＡＭＥファミリー（ＤＡＧＥ－１など）、ＧＡＧＥファミリー、ＲＡＧＥファミリー（ＲＡＧＥ－１など）、ＳＭＡＧＥファミリー、ＮＡＧ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１２５、ｐ２１ ｒａｓなどの突然変異癌原遺伝子、ｐ５３などの突然変異腫瘍抑制遺伝子、腫瘍関連ウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ７）、ＳＳＸファミリー、ＨＯＭ－ＭＥＬ－５５、ＮＹ－ＣＯＬ－２、ＨＯＭ－ＨＤ－３９７、ＨＯＭ－ＲＣＣ１．１４、ＨＯＭ－ＨＤ－２１、ＨＯＭ－ＮＳＣＬＣ－１１、ＨＯＭ－ＭＥＬ－２．４、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１１、ＲＣＣ－３．１．３、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＳＣＰファミリーのメンバーである。ＭＡＧＥファミリーのメンバーとしては、限定はされないが、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ４及びＭＡＧＥ－１１が挙げられる。ＧＡＧＥファミリーのメンバーとしては、限定はされないが、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－６が挙げられる。例えば、Van den Eynde and van der Bruggen (1997) in Curr. Opin. Immunol. 9:684-693、Sahin et al. (1997) in Cum Opin. Immunol. 9: 709-716及びShawler et al. (1997)による概説が参照され、これらの全内容は、癌抗原のそれらの教示について参照により本明細書に援用される。
癌抗原は、限定はされないが、ヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ－１；乳癌細胞及び膵臓癌細胞上に存在するＭｕｃ－１糖タンパク質の２０アミノ酸コアリピート）、ＭＵＣ－２、ＭＵＣ－３、ＭＵＣ－１８、Ｈａ－ｒａｓ癌遺伝子産物、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）、ｒａｆ癌遺伝子産物、ＣＡ－１２５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ｇｐ７５、ＥＢＶ－ＬＭＰ １＆２、ＨＰＶ－Ｆ４、６、７、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｃ０１７－１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、ｐ５３、ｒａｓ癌遺伝子産物、Ｉ３－ＨＣＧ、ｇｐ４３、ＨＳＰ－７０、ｐｉ ７ ｍｅｌ、ＨＳＰ７０、ｇｐ４３、ＨＭＷ、ＨＯＪ－１、黒色腫、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２抗原、ｐ２１ ｒａｓなどの突然変異癌原遺伝子、ｐ５３、エストロゲン受容体などの突然変異腫瘍抑制遺伝子、乳脂肪グロブリン、テロメラーゼ、核基質タンパク質、前立腺酸性ホスファターゼ、タンパク質ＭＺ２－Ｅ、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、切断上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、トムセン・フリードリッヒ（Ｔ）抗原、ＧＭ－２及びＧＤ－２、多形性上皮ムチン、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、膵臓癌胎児性抗原、癌抗原１５－３、１９－９、５４９、１９５、扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣＡ）、卵巣癌抗原（ＯＣＡ）、膵臓癌関連抗原（ＰａＡ）、突然変異体Ｋ－ｒａｓタンパク質、突然変異体ｐ５３及びキメラタンパク質ｐ２１０ＢＣＲ＿ＡＢＬ及び腫瘍関連ウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ７）でもあり得る。
癌抗原は、Ｂ細胞腫瘍（例えば、Ｂ細胞リンパ腫；Ｂ細胞白血病；骨髄腫；ヘアリー細胞白血病）によって産生される抗体、このような抗体の断片でもあり、これは、抗体のイディオタイプのエピトープ、悪性Ｂ細胞抗原受容体、悪性Ｂ細胞免疫グロブリンイディオタイプ、免疫グロブリンの可変領域、免疫グロブリンの超可変領域又は可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）、悪性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲの可変領域及び／又はＴＣＲの超可変領域を含む。一実施形態において、本発明の癌抗原は、連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得、これは、抗体の天然イディオタイプの立体構造及び特異的結合活性を保持する。本発明に従って使用され得る癌抗原は、本明細書に列挙される癌抗原に決して限定されない。他の癌抗原は、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第４，５１４，５０６号に開示されるものなど、当技術分野において公知の方法によって同定、単離及びクローニングされ得る。
他の態様において、疾患、障害又は病態は、移植抗原に関連している。移植抗原関連疾患、障害又は病態の非限定的な例は、移植片対宿主病である。ＭＨＣ分子、副組織適合抗原、ＡＢＯ血液型抗原及び単球／内皮細胞抗原を含む多様な移植抗原が記載されており、本発明で利用され得る。
対象とする免疫原は、関節リウマチ及び糖尿病などの自己免疫疾患に関連するか又はその原因となり、本発明において使用するのに特に適したものであり得る。関節リウマチに関連する好適な実施形態において、抗原は、関節炎を発症させる自己抗原に由来し得る。
対象とする免疫原は、さらに自己抗原であり得る（例えば、対象、例えば自己寛容障害の対象における自己抗原に対する自己寛容を促進するために）。例示的な自己抗原としては、限定はされないが、ミエリン塩基性タンパク質、膵島細胞抗原、インスリン、コラーゲン及びヒトコラーゲン糖タンパク質、筋肉アセチルコリン受容体及びその別個のポリペプチド鎖及びペプチドエピトープ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ及び筋肉特異的受容体チロシンキナーゼが挙げられる。
本発明は、アレルゲンである免疫原の使用にも関する。「アレルゲン」は、感受性対象におけるアレルギー又は喘息反応を誘発し得る物質を指す。「アレルギー」は、物質（アレルゲン）に対する獲得過敏性を指す。アレルギー疾患としては、限定はされないが、湿疹、アレルギー性鼻炎又は鼻風邪、結膜炎、花粉症、気管支喘息、じんましん（発疹）及び食物アレルギー及び他のアトピー性疾患が挙げられる。アレルギーは、一般に、無害のアレルゲンに対するＩｇＥ抗体産生によって引き起こされる。アレルゲンのリストは、膨大であり、花粉、昆虫毒、植物タンパク質、動物鱗屑粉塵、真菌胞子及び薬物（例えば、ペニシリン）を含み得る。天然の動物及び植物アレルゲンの例としては、限定はされないが、以下の属：イヌ（例えば、イヌ属（Canine）（カニス・ファミリアリス（Canis familiaris）））；デルマトファゴイデス属（Dermatophagoides）（例えば、コナヒョウダニ（Dermatophagoides farinae））；ネコ属（Felis）（例えば、フェリス・ドメスティクス（Felis domesticus））；ブタクサ属（Ambrosia）（例えば、ブタクサ（Ambrosia artemiisfolia））；ドクムギ属（Lolium）（例えば、ホソムギ（Lolium perenne））；スギ属（Cryptomeria）（例えば、スギ（Cryptomeria japonica））；アルテルナリア属（Alternaria）（例えば、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata））；ハンノキ類（Alder）、ハンノキ属（Alnus）（例えば、アルヌス・グルティノサ（Alnus gultinoasa））；カバノキ属（Betula）（例えば、ベツラ・ベルコサ（Betula verrucosa））；コナラ属（Quercus）（例えば、クエルカス・アルバ（Quercus alba））；オリーブ属（Olea）（例えば、オレア・エウロパ（Olea europa））；ヨモギ属（Artemisia）（例えば、アルテミシア・ブルガリス（Artemisia vulgaris））；オオバコ属（Plantago）（例えば、ヘラオオバコ（Plantago lanceolate））；ヒカゲミズ属（Panetaria）（例えば、パリエタリア・オフィシナリス（Parietaria officinalis）又はパリエタリア・ユダイカ（Panetaria judaica））；チャバネゴキブリ属（Blattella）（例えば、チャバネゴキブリ（Blattella genrianica））；ミツバチ属（Apis）（例えば、アピス・ムルティフロルム（Apis multiflorum））；イトスギ属（Cupressus）（例えば、クプレスス・センペルビレンス（Cupressus sempervirens）、クプレスス・アリゾニカ（Cupressus arizonica）及びクプレスス・マクロカルパ（Cupressus macrocarpa））；ビャクシン属（Juniperus）（例えば、ユニペルス・サビノイデス（Juniperussabinoides）、ユニペルス・ビルギニアナ（Juniperus virginiana）、ユニペルス・コンムニス（Juniperus communis）及びユニペルス・アスヘイ（Juniperus ashei））；クロベ属（Thuya）（例えば、コノテガシワ（Thuya orientalis））；ヒノキ属（Chamaecyparis）（例えば、ヒノキ（Chamaecyparis obtusa））；ゴキブリ属（Penplaneta）（例えば、ワモンゴキブリ（Pehplaneta amehcana））；カモジグサ属（Agropyron）（例えば、アグロピロン・レペンス（Agropyron repens））；ライムギ属（Secale）（例えば、ライムギ（Secale cereale））；コムギ属（Triticum）（例えば、コムギ（Triticum aestivum））；カモガヤ属（Dactylis）（例えば、カモガヤ（Dactylis glomerata））；ウシノケグサ属（Festuca）（例えば、ヒロハウシノケグサ（Festuca elatior））；イチゴツナギ属（Poa）（例えば、ナガハグサ（Poapratensis）又はポア・コンプレッサ（Poa compressa））；カラスムギ属（Avena）（例えば、エンバク（Avena sativa））；シラゲガヤ属（Holcus）（例えば、シラゲガヤ（Holcus lanatus））；ハルガヤ属（Anthoxanthum）（例えば、ハルガヤ（Anthoxanthum odoratum））；オオカニツリ属（Arrhenatherum）（例えば、オオカニツリ（Arrhenatherum elatius））；ヌカボ属（Agrostis）（例えば、コヌカグサ（Agrostis alba））；アワガエリ属（Phleum）（例えば、オオアワガエリ（Phleum pratense））；クサヨシ属（Phalaris）（例えば、クサヨシ（Phalaris arundinacea））；スズメノヒエ属（Paspalum）（例えば、パスパルム・ノタツム（Paspalum notatum））；モロコシ属（Sorghum）（例えば、ソルグム・ハレペンシス（Sorghum halepensis））；トウゴマ属（Ricinus）（例えば、トウゴマ（Ricinus communis）、より好ましくはリシンタンパク質）及びスズメノチャヒキ属（Bromus）（例えば、コスズメノチャヒキ（Bromus inermis））に特異的なタンパク質が挙げられる。
認知症に関連する変性性神経疾患に関連して、本発明は、アルツハイマー病及びレビー小体型認知症を想定するが、それに限定されない。アルツハイマー病の免疫原性タンパク質としては、（限定はされないが）アミロイドβ（Αβ又はＡベータ）が挙げられ、これは、アルツハイマー病の患者の脳に見られる沈着物であるアミロイド斑の主成分であるようである３６～４３アミノ酸のペプチドである）。
広い態様において、本発明は、本明細書に記載される方法において使用するための、医薬組成物を含む組成物に関する。特定の広い態様において、本発明は、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子及び任意選択的に本明細書に記載されるジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原及び薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を含む組成物を提供する。ある実施形態において、本発明は、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子及び任意選択的に本明細書に記載されるジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原及び薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供し得る。
ある実施形態において、上記の生物、タンパク質及び／又は作用物質に由来する免疫原の組合せは、単一の組成物、好ましくは医薬組成物、より好ましくは免疫原性組成物、さらにより好ましくは免疫治療用組成物、なおさらにより好ましくはワクチンにおける複数の病原体、タンパク質及び／又は作用物質に対する免疫又は免疫反応を引き起こすために好都合に使用され得る。
意図される使用が免疫反応を誘導することである、ある実施形態における組成物（医薬組成物を含む）は、免疫原性組成物と呼ばれ得る。
ある実施形態において、免疫原性組成物は、免疫治療用組成物であり得る。特に好ましい実施形態において、免疫治療用組成物は、ワクチンであり得る。本発明の免疫治療用組成物は、予防的に又は治療的に使用され得ることが理解されるであろう。
本明細書に記載される組成物は、防御的組成物（すなわち感染症又は癌などの病態を予防するために投与される組成物）及び治療用組成物（すなわち感染症又は癌などの病態を治療するために投与される組成物）を含むことが理解されるであろう。したがって、組成物は、予防、改善、緩和又は治療目的のためにレシピエントに投与され得る。
任意の好適な手順は、ワクチン組成物などの本明細書に記載される組成物を生成するために想定される。例示的な手順としては、例えば、参照により本明細書に援用されるNew Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong)に記載されるものが挙げられる。
組成物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。
「薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤」とは、一般に、対象への投与において安全に使用され得る固体又は液体充填剤、希釈剤、溶媒、ビヒクル又は封入物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当技術分野において周知の様々な担体が使用され得る。これらの担体は、糖、でんぷん、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水及び塩、例えば塩酸塩、臭化物及び硫酸塩を含む鉱酸塩、有機酸、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩及びマロン酸塩及び発熱性物質除去蒸留水を含む群から選択され得る。
担体、希釈剤及び賦形剤を説明する有用な一般的な参考文献は、参照により本明細書に援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)である。
特定の実施形態において、担体、希釈剤又は賦形剤は、免疫学的活性を有するか、又は免疫学的活性を促進する担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含み得る。例えば、これらとしては、チログロブリン；ヒト血清アルブミンなどのアルブミン；毒素、トキソイド又は破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Pseudomonas）、大腸菌（E. coli）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）及びストレプトコッカス属（Streptococcus）に由来する毒素の任意の突然変異体交差反応材料；ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスＶＰ１及びＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス組み換えワクチンなどが挙げられる。代わりに、キャリアタンパク質又は他の免疫原性タンパク質の断片又はエピトープが使用され得る。例えば、細菌毒素又はトキソイドなどのＴ細胞エピトープが使用され得る。これに関して、参照により本明細書に援用される米国特許第５，７８５，９７３号が参照され得る。
組成物は、当技術分野において周知であるように、アジュバントをさらに含み得る。本明細書に記載されるように、本発明のタンパク質粒子は、アジュバントと共投与され得る。
当技術分野において理解されるように、「アジュバント」は、ワクチンなどの組成物の免疫原性及び有効性を促進する１つ以上の物質であるか又はそれを含む。好適なアジュバントの非限定的な例としては、スクアラン及びスクアレン（又は植物若しくは動物起源の他の油）；ブロックコポリマー；Tween（登録商標）-80などの洗浄剤；Quil（登録商標）A、Drakeol又はMarcolなどの鉱油、ピーナッツ油などの植物油；コリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）などのコリネバクテリウム属（Corynebacterium）由来のアジュバント；プロピオニバクテイリウム・アクネ（Propionibacterium acne）などのプロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）由来のアジュバント；百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ－ジオクタデシル－Ｎ’、Ｎ’ビス（２－ヒドロキシエチル－プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール及びプルロニック（pluronic）ポリオールなどの表面活性物質；ピラン、デキストランサルフェート、ポリＩＣカルボポールなどのポリアミン；ムラミルジペプチド及び誘導体、ジメチルグリシン、タフトシンなどのペプチド；油乳剤；及びリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はアラムなどの鉱物ゲル；インターロイキン２及びインターロイキン１２などのインターロイキン；インターロイキン１などのモノカイン；腫瘍壊死因子；γインターフェロンなどのインターフェロン；サポニン－水酸化アルミニウム又はQuil-A水酸化アルミニウムなどの組合せ；リポソーム；ISCOM（登録商標）及びISCOMATRIX（登録商標）アジュバント；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ムラミルジペプチド又は他の誘導体などの合成糖ペプチド；Avridine；リピドＡ誘導体；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥ－デキストラン単独又はリン酸アルミニウムを伴う；Carbopol’EMAなどのカルボキシポリメチレン；Neocryl A640（例えば米国特許第５，０４７，２３８号）などのアクリルコポリマー乳剤；Montanide ISA 720などの油中水型乳化剤；ポリオウイルス、ワクシニア又は動物ポックスウイルスタンパク質；又はそれらの混合物並びにＣｐＧオリゴヌクレオチド及びＴｏｌｌ受容体作用薬などの免疫刺激ＤＮＡが挙げられる。ある実施形態において、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドであるか又はそれを含み得る。ある実施形態において、配合されるタンパク質粒子の１つ以上の特徴を促進、強化又は支援するアジュバントが使用され得ることが理解されるであろう。アジュバントの選択は、タンパク質粒子の配合又は活性（例えば、免疫原性）を促進し得るが、それに限定されない。ある実施形態において、アジュバントは、本明細書に記載されるタンパク質粒子の表面電荷を調節し得る。表面電荷の調節は、組成物の配合を促進又は強化するのに必要とされ得る。ある他の実施形態において、アジュバントは、本明細書に記載されるように、タンパク質粒子若しくは前記粒子を含有する組成物のサイズ及び／又はサイズ分布又は試料における粒径の不均一性に影響を与え得る。単なる例として、アジュバントは、粒径に関して不均一なタンパク質粒子試料又は集団を、均一な試料に変換するのに有用であり得る。
ある実施形態において、アジュバントは、アラム及び／又はジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドであり得る。
ある実施形態における本明細書に記載される組成物は、組成物の配合若しくは調製を促進するか、又は本明細書に記載されるタンパク質粒子についての所望の結果（例えば免疫原性、最小の副作用、粒度分布、粒子電荷）を達成することを促進するための１つ以上の補助的な作用物質を含み得ることが理解されるであろう。
上述されるように、本発明の免疫原性組成物及び／又はワクチンは、「免疫学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤」を含み得る。「免疫学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤」は、その範囲内に、水、重炭酸塩緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水又は生理食塩水及び／又は当技術分野において周知のアジュバントを含む。
任意の安全な投与経路が本発明の組成物を動物に提供するために用いられ得る。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口腔、静脈内、鼻腔内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内及び経皮投与が用いられ得る。筋肉内及び皮下注入は、例えば、免疫原性組成物及びワクチンの投与に特に適切であり得る。
剤形としては、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射、液剤、シロップ、トローチ、カプセル剤、鼻腔用スプレー、坐剤、エアロゾル、経皮パッチなどが挙げられる。これらの剤形は、この目的のために特別に設計された制御放出装置又はこの方法でさらに作用するように改変された他の形態のインプラントを注入又は移植することも含み得る。治療剤の制御放出は、例えば、アクリル樹脂を含む疎水性ポリマー、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及び特定のセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、治療剤を被覆することによって行われ得る。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを使用することによって行われ得る。
投与に好適な組成物は、個別の単位、例えばカプセル剤、カプレット、サシェ剤、機能性食品／飼料若しくは錠剤として、又は粉末若しくは顆粒として、又は水性液体、非水性液体、水中油型エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョン中の液剤若しくは懸濁剤として提示され得る。このような組成物は、経口又は非経口投与に特に好適であり得る。このような組成物は、調剤の方法のいずれかによって調製され得るが、全ての方法は、上述される１つ以上の作用物質を、１つ以上の必要な成分を構成する担体と組み合わせる工程を含む。一般に、組成物は、本発明の作用物質を、液体担体若しくは微粉化された固体担体又は両方と均一及び均質に混合し、次に必要に応じて生成物を所望の形状に成形することによって調製される。
組成物は、剤形と適合する方法及び免疫学的に有効であるような量で投与され得る。動物に投与される用量は、適切な期間にわたって動物に対する有益な反応をもたらすのに十分であるべきである。投与される作用物質の量は、動物の齢数、性別、体重及び全体的な健康状態を含む治療される動物、施術者の判断に左右されることになる要因に依存し得る。
理解されるように、本明細書に記載されるタンパク質粒子及び／又は組成物は、限定はされないが、本明細書に記載されるように、脊椎動物宿主を含む本明細書に記載される対象、より好ましくは家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ）を含む哺乳動物対象、競争用動物（例えば、競走馬、グレーハウンド）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット）及びヒトに投与される。したがって、本明細書に記載されるタンパク質粒子及びタンパク質粒子を含む組成物は、獣医学的用途を含め、ヒト及び非ヒト脊椎動物に投与可能であることが理解されるであろう。
ある実施形態において、本明細書に記載される組成物は、細胞の不溶性成分に由来するか、それから精製されるか、生成されるか、それから単離されるか又はそれから得られる実質的に不溶性のタンパク質粒子であり得る本明細書に記載されるタンパク質粒子を含み得る。ある実施形態において、不溶性成分は、細胞から得られるか、精製されるか又は生成され得る。特定の実施形態において、不溶性成分は、封入体であり得る。
ある実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、細胞から得られるか、単離されるか、それに由来するか、それから精製されるか又は生成される不溶性成分の形態の本明細書に記載されるタンパク質粒子を含み得る。特定の実施形態において、不溶性成分は、本明細書に記載される封入体であり得る。
本明細書に記載されるタンパク質粒子又は組成物は、試料中の標的を検出するための方法において使用され得ることが理解されるであろう。ある実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、免疫診断試薬であり得ることが想定される。本明細書に記載されるタンパク質粒子は、分析、スクリーニング及び／又は診断用途に使用され得ることが想定される。このような方法は、対象とする分子又は生物学的構造を分析、検出及び／又は定量する方法であり得ることが理解されるであろう。したがって、標的は、リガンド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、免疫グロブリン、ビオチン、阻害剤、補因子、酵素、受容体、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、毒素又は任意の他の分子、細胞若しくはその断片、細胞小器官、ウイルス、細菌、真菌、原生生物、寄生生物、動物、植物或いはそれらの任意の部分構造、断片又は組合せであり得る。
ある実施形態において、本発明の組成物は、本明細書に記載される検出方法において使用するのに好適であり得ることが想定される。このような組成物は、診断に好適であり得るか、又は本明細書に記載される免疫診断に好適であり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載される検出方法は、対象が作用物質又は病原体に曝されたかどうかを検出し得る。このような実施形態によれば、検出方法は、免疫反応又は免疫反応の１つ以上の要素を検出し得る。ある実施形態において、本明細書に記載される検出方法は、対象が疾患、病態及び／又は障害（例えば、病原体若しくは作用物質によって引き起こされる）に罹患しているかどうかを検出し得る。免疫反応のその又はそれぞれの要素は、任意の好適な要素、例えば抗体、免疫細胞、Ｔ細胞及び又はＢ細胞であり得、ある実施形態において、本明細書に記載される検出方法は、対象が病原体又は作用物質に対して免疫化されているかどうかを検出し得る。本発明の検出方法のために、ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、１つ以上のアミノ酸配列をさらに含み得ることが理解され、１つ以上のアミノ酸配列は、免疫原性アミノ酸配列であっても又は免疫原性アミノ酸配列でなくてもよい。それ自体で免疫原性でない１つ以上のアミノ酸配列をさらに含むタンパク質粒子を包含する実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸配列は、標的分子を認識することによる検出方法において使用するのに好適であり得る。
上記を考慮して理解されるように、検出方法又は決定方法におけるＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、診断抗原又はその断片、変異体及び誘導体を提示するための担体系として使用され得る。ある実施形態において、１つ以上の診断抗原は、診断抗原として及び／又は本発明の方法において使用するのに好適なアミノ酸配列を含むか、それからなるか又はそれから本質的になる。診断抗原として使用するのに好適なこのようなアミノ酸配列は、免疫反応を引き起こすことが可能であっても又はなくてもよく、ある実施形態において免疫反応又は免疫反応の１つ以上の要素（例えば抗体）を認識することが可能であり得る。記載されるＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、任意選択的に、このような１つ以上の「診断」アミノ酸配列を含み得る。ある実施形態において、１つ以上の「診断」アミノ酸配列を含むこのようなタンパク質粒子は、本明細書に記載される１つ以上の免疫原（例えば、免疫原は、免疫原性アミノ酸配列を含み得る）をさらに含み得ることが理解されるであろう。
検出又は診断方法に関連するある実施形態において、本明細書に記載されるジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、任意選択的に、配列番号１７～２２、２８～４８及び５６～１００のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せをさらに含み得る。
本発明に係るタンパク質粒子が、成分の混合物を含有する試料と接触されるとき、粒子は、標的分子又は生物学的実体に選択的に結合することが想定される。したがって、標的分子又は生物学的実体へのタンパク質粒子の結合、続いて非結合粒子の除去は、標的分子又は生物学的実体の検出（及びおそらく定量）を可能にし得る。
試料、試験試料は、血液、血清、細胞、組織、血漿、器官、培養物（例えば、ヒト、動物、植物）、生体液、呼吸器洗浄試料、洗浄試料、粘液試料、血漿試料、脳脊髄液、尿、皮膚若しくは他の組織又はそれらの分画であるか又はそれらを含む。試料の組合せが想定される。ある実施形態において、試料は、生体試料である。さらに他の実施形態において、試料、試験試料及び／又は生体試料は、対象から得られる。
ある実施形態において、試料は、鼻腔内組織若しくは細胞、口腔咽頭組織若しくは細胞を含み得るか又はそれらである。このような試料の使用は、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳコロナウイルス、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に有用であり得ることが理解されるであろう。コロナウイルスに関連するある実施形態において、試料からの好適な検体の非限定的な例は、鼻腔中鼻甲介ぬぐい液、前鼻孔（鼻腔ぬぐい液）検体、鼻咽頭洗浄液／吸引物及び／又は鼻腔洗浄液／吸引物検体を含み得る。
液体試料に対する多くの分析又は検出手順において、試料を固体表面に吸着することが有利であることがある。これは、試料の直接適用又は試料の電気泳動ゲル分画後の電気ブロッティング（例えば、ウエスタンブロット法）のいずれかにより、マイクロタイタープレート中のウェルに試料を加え、ニトロセルロース（ＮＣ）、ナイロン、ＰＶＤＦ又は任意の他の好適な材料などの材料から作製された膜に試料を付着させることを含むいくつかの方法で行われ得る。
好適な検出方法の非限定的な例としては、ＥＬＩＳＡ、マイクロ流体ベースの方法、受容体結合アッセイ、タンパク質定量ベースの方法、血清学的方法及び当業者に明らかな他の方法を含む比色分析ベースの方法が挙げられる。
ある実施形態において、検出方法は、免疫診断方法であり得る。ある実施形態において、免疫診断方法は、免疫反応を検出し得る。
したがって、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、従来の検出方法において通常使用される又は典型的に抗原若しくは他の被分析物の代わりに又はそれに加えて使用され得る。例として、本明細書に記載されるタンパク質粒子は、特に免疫反応が検出される場合、あらゆる形式のＥＬＩＳＡ（例えば、直接、間接的、捕捉、サンドイッチ）において使用され得る。
結核及び／又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に関連する感染症に関連するある実施形態において、検出方法は、本明細書に記載されるタンパク質粒子を試料と接触させることを含み得、試料は、皮膚部分である。このような実施形態において、本方法は、試験試料の皮膚部分を、１つ以上のマイコバクテリウム属（Mycobacterium）免疫原に由来するか又はそれに対応するＣＲＭアミノ酸配列及び１つ以上の免疫原性アミノ酸配列を含む本明細書に記載されるタンパク質粒子と接触させることを含み得る。結核皮膚試験は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）に曝されたか、又は結核に罹患している対象と、及び／又は例えばＢＣＧで、結核に対して免疫化された対象とを区別することが可能であり得ることが理解されるであろう。何らかの特定の理論によって制約されることを望むものではないが、本明細書に記載される１つ以上のマイコバクテリウム属（Mycobacterium）免疫原性アミノ酸配列を含むＣＲＭタンパク質粒子は、従来の方法より結核の検出のために特異的及び感受性皮膚反応を誘導するのにより効率的であり得る（抗原節約）ことが提案される。ある実施形態において、タンパク質粒子は、対象の皮膚部分に注入され得る。好適には、結核を検出するための皮膚ベースの試験方法は、遅延型過敏反応を測定又は検出し得る。好適な皮膚試験の一例は、当業者によって公知であるように、マントー試験及びツベルクリン皮膚である。遅延型過敏性反応を測定する陽性皮膚試験の非限定的な例は、以下のとおりである：（ｉ）ＳＩＣＣＴ（単一皮内比較子宮頸部検査）反応は、精製タンパク質誘導体Ｂ（ＰＰＤ－Ｂ）－精製タンパク質誘導体Ａ（ＰＰＤ－Ａ）についての（Δ）皮膚厚さの変化が＞４ｍｍ；又は（ｉｉ）＞２ｍｍであり得る場合（例えば、英国（United Kingdom）の試験）、陽性とみなされ；（ｉｉｉ）単一皮内検査（ＳＩＴ）反応は、ＰＰＤ－ＢについてのΔ皮膚厚さが≧４ｍｍであり得る場合、陽性とみなされ；（ｉｖ）本発明のＣＲＭ粒子に対する反応は、Δ皮膚厚さが≧１ｍｍであり得る場合、陽性とみなされる。例えば、本発明の診断試薬による、又は例えば１投与当たり存在する０．５μｇ未満の各抗原を含む診断試薬の皮膚部分への投与を含む方法を含む本発明の方法における陽性皮膚試験は、≧１ｍｍのΔ皮膚厚さであり得る。
結核に関連する他の実施形態において、血液試料、好ましくは全血試料が試験され得る。血液試料を想定するある実施形態において、本方法は、本明細書に記載される１つ以上のヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）免疫原に由来するか又はそれに対応するＣＲＭアミノ酸配列及び１つ以上の免疫原性アミノ酸配列を含むタンパク質粒子が、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に対する陽性結果を示すインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）放出を検出するために、血液由来の試験試料、好ましくは白血球細胞と接触される方法であり得る。ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のためのインターフェロン－γ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）は、当業者に公知である。ＩＧＲＡは、対象がヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）／ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）に感染しているかどうかを確認するために使用され得る血液試験である。ＩＧＲＡ試験は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）／ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）に対する身体の免疫反応を測定することによって機能する。ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に感染した大部分の対象からの白血球細胞は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来する抗原（免疫反応を生じさせ得る物質）と混合されたとき、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－ｇ）を放出するであろう。ＩＧＲＡ試験は、潜伏結核感染を診断するために使用され得る。本方法は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）若しくはウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）に曝されたか又は結核に罹患している対象と、例えばＢＣＧで、結核に対して免疫化された対象とを区別することが可能であり得る。本発明は、診断又は治療有効量を含み、これは、例えば、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約７ｎｇ／ｍＬ又は約３ｎｇ／ｍＬ～約６ｎｇ／ｍＬの、血液中のＩＦＮ－γの濃度など、免疫学的反応を引き起こすのに有効な量である。感染後又は長期の感染中を含むある状況において、上昇したＩＦＮ－γ血液濃度が観察され、このような上昇した濃度は、本発明のタンパク質粒子による有効な免疫学的反応の誘発が評価されるベースラインを評価する際に考慮されるべきである。何らかの特定の理論によって制約されることを望むものではないが、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来するか又はそれに対応する１つ以上の免疫原性アミノ酸配列を含むＣＲＭ粒子は、ＡＰＣによってより効率的に取り込まれ、これは、より感受性で及び特異的なＩＧＲＡをもたらし得ることが提案される。
上記を考慮して理解されるように、本明細書に記載されるＣＲＭアミノ酸配列を含むタンパク質粒子は、結核皮膚試験及び／又は血液試験試薬（例えば、ＩＧＲＡ）の開発のために１つ以上のマイコバクテリア診断抗原を提示する担体系として使用され得る。表３及び４は、本発明の診断若しくは検出方法又はキットにおいてタンパク質粒子中で使用され得る、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質に由来するか又はそれに対応する１つ以上のアミノ酸配列（その断片、変異体又は誘導体を含む）の非限定的な例を提供する。ある実施形態において、１つ以上のアミノ酸配列、診断アミノ酸配列又は１つ以上の免疫原性アミノ酸配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列（又は前記アミノ酸配列の断片）又は断片、変異体又は誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか又はそれからなり得る。配列番号３２～４０は、本明細書に記載される任意の他のマイコバクテリアアミノ酸配列及びある実施形態において配列番号６、７、１９及び／又は２０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を示し得る。
コクシエラ属（Coxiella）種、好ましくはコクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）の検出に関連するある実施形態によれば、１つ以上のアミノ酸配列、診断アミノ酸配列又は１つ以上の免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５９～６３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列（又は前記アミノ酸配列の断片）又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか又はそれからなり得る。あるさらなる実施形態において、配列は、配列番号６０～６３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せである。
コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスに関連し得るある実施形態によれば、１つ以上のアミノ酸配列、診断アミノ酸配列又は１つ以上の免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５６～５８のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列（又は前記アミノ酸配列の断片）又はその断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それから本質的になるか又はそれからなり得る。ある実施形態において、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスは、コロナウイルスであり得る。あるさらなる実施形態において、コロナウイルスは、ＳＡＲＳコロナウイルスである。さらに他の実施形態において、ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－１及び／又はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２であり得る。
本発明は、試料からの標的を検出又は定量するためのキットも提供し、キットは、本明細書に記載される本発明のタンパク質粒子及び方法の使用を容易にする。典型的に、分析又は診断試験を行うためのキットは、方法を行うのに必要とされる少なくともいくつかの試薬を含む。典型的に、本発明のキットは、例えば、粒子及び洗浄試薬を含む１つ以上の容器を含む。
本発明に関して、区分化されたキットは、粒子及び／又は試薬が別個のに含まれ、小さいガラス製の容器、プラスチック製の容器又はプラスチック若しくは紙の細片を含み得る任意のキットを含む。このような容器は、試料及び試薬の二次汚染を避けながら、１つの区画から別の区画に試薬を効率的に移すことを可能にし、各容器の作用物質又は溶液を、１つの区画から別の区画に定量的な方法で加えることを可能にし得る。このようなキットは、試験試料を受け入れる容器、アッセイにおいて使用される粒子を含む容器及び洗浄試薬（リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を含む容器も含み得る。
典型的に、本発明のキットは、適切な方法を行うためにキット構成要素を使用するための使用説明書も含むであろう。
本発明の方法及びキットは、試料からの成分を検出及び／又は定量することが望ましい任意の状況において利用される。
本発明が十分に理解され、実用的効果を実現し得るように、以下の非限定的な例が参照される。
実施例
実施例１
ＣＲＭ１９７－ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（ＴＢ）粒子の免疫原性試験
材料及び方法
菌株、プラスミド及びプライマー
この試験において使用される全ての菌株、プラスミド及びプライマーが表１に列挙される。XL1-Blueを、プラスミド構築のために使用し、３７℃でアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が補充されたLuriaブロス（ＬＢ；Thermo Fisher Scientific, USA）中で増殖させた。ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＣＲＭ１９７封入体（粒子）産生に使用した。
Ｈ４又はＨ２８抗原を提示するＣＲＭ１９７粒子及びＣＲＭ１９７粒子の形成のためのプラスミド構築
ＣＲＭ１９７タンパク質配列
Figure 2022549791000002
をコードする遺伝子断片
Figure 2022549791000003
を大腸菌（E. coli）細胞（GenScript, USA）についてコドン最低化した。ＣＲＭ１９７、ジフテリア菌（C. diphtheriae）によって産生されるＤＴｘの酵素的に不活性で非毒性の形態［１、２］及びこの試験において使用されるアミノ酸配列は、シグナルペプチドを含有せず、コードされたＤＮＡ配列を、GeneArt（商標）GeneOptimizer（商標）ソフトウェアを用いて大腸菌（E. coli）についてGenScriptによってコドン最低化した。ＣＲＭ１９７遺伝子配列を、ＮｄｅＩ（BioLabs, USA）により、制限酵素消化によってｐＵＣ５７ベクター（GenScript, USA）から切り取った後、SYBR safe菌株（Invitrogen, USA）によるアガロースゲル電気泳動を用いたＤＮＡ回収キット（Zymo Research, USA）を用いたＤＮＡ断片分離及び断片抽出を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＢａｍＨＩ制限部位を精製ＣＲＭ１９７遺伝子断片の３’末端に導入した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによりプラスミドｐＥＴ－１４ｂ ＣＦＰ１０－ＰｈａＣを消化することによって調製された線状ｐＥＴ－１４ｂベクターをＮｄｅＩ－ＣＲＭ１９７－ＢａｍＨＩ断片にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７を生成した。さらに、Ｈ４は、感染急性期中に分泌される早期抗原Ａｇ８５Ｂ及びＴＢ１０．４を含有する組み換えマイコバクテリア融合ペプチドである［３－５］。Ｈ４は、マウスにおける防御免疫を実証し［３、６、７］、南アフリカ人（South African）成人において安全な免疫原性ワクチンであった。［８］Ｈ２８は、Ｈ４抗原骨格及び潜在関連抗原Ｒｖ２６６０ｃを含有する。強い細胞及び体液性免疫反応を中国人潜伏ＴＢ感染集団においてＲｖ２６６０ｃによって誘導した［９］。Ｈ２８は、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）負荷からマウスを防御することが可能であった［７］。アミノ酸配列（Ｈ４：
Figure 2022549791000004
）を有するマイコバクテリア融合ペプチドＨ４及びアミノ酸配列（Ｈ２８：
Figure 2022549791000005
）を有するＨ２８をコードする遺伝子断片ｈ４（ｈ４：
Figure 2022549791000006
）及びｈ２８（ｈ２８：
Figure 2022549791000007
）を大腸菌（E. coli）菌株についてコドン最適化し、GenScript（USA）によって合成した。結核（ＴＢ）抗原Ｈ４及びＨ２８もＣＲＭ１９７の３’末端にクローニングした。簡潔に述べると、ｐＵＣ５７ Ｈ４又はｐＵＣ５７ Ｈ２８をＢａｍＨＩにより消化させて、Ｈ４又はＨ２８遺伝子断片を調製した。精製Ｈ４又はＨ２８挿入部をＢａｍＨＩ線形化ベクター、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７とライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ４及びｐＥＴ－１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｈ２８を生成した。クローニング手法を図１に示した。遊離可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及びＨｉｓ６－Ｈ２８タンパク質の調製のためのｐＥＴ－１４ｂプラスミドの分子クローニングが他の箇所に記載される［１０］。
大腸菌（E. coli）へのプラスミド形質転換
２００μｌの凍結コンピテント細胞を含む１．７ｍｌのエッペンドルフチューブを約４０分間にわたって氷上で解凍した。続いて、それらを３μｌの精製プラスミドＤＮＡ又は１０μｌのライゲーションミックスと十分に混合し、次に２０分間にわたって氷上でインキュベートして、プラスミドを細胞表面に吸着させた。吸着されたプラスミドＤＮＡの取り込みを促進するために、コンピテント細胞を穏やかに混合し、９０秒間にわたって４２℃で熱ショックを与え、次に直ちにさらに５分間にわたって氷上でインキュベートした。細胞を８００μｌの液体ＬＢ培地の添加によって再生し、３７℃で１時間インキュベートした。組み換えクローンを選択及び単離するために、１００μｌの細胞を、適切な抗生物質を含有する固体ＬＢ寒天の平板上に広げた。
ＣＲＭ１９７のみ及びＣＲＭ１９７：抗原キメラ粒子の過剰産生及び自己集合に必要とされる増殖条件
ＣＲＭ１９７単独及びＣＲＭ１９７：キメラ抗原をコードする遺伝子を強力なプロモータ、Ｔ７下で調節した。簡潔に述べると、これらの遺伝子を遺伝子操作し、強力なＴ７プロモータを含有するｐＥＴ－１４ｂ発現ベクターにクローニングした。ＣＲＭ１９７遺伝子を含有する組み換えｐＥＴプラスミドを大腸菌（E. coli）のエンドトキシンフリー突然変異体に形質転換した。１０～２０ｍｌの体積で一晩細胞培養物を調製し、これを用いて、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＣｌ、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグルコース及びアンピシリンが１００μｇ／ｍｌの最終濃度で補充された１リットルのLuriaブロスに接種した。培養物を２００ｒｐｍで約３時間にわたって３７℃でインキュベートし、ＯＤ６００が約０．５に達したとき、０．００１Ｍの最終濃度でＩＰＴＧによって誘導した。インキュベーションを２００ｒｐｍにおいて３７℃で４８時間にわたって続けた。
粒子単離及び精製
３７℃で４８時間の増殖後、細胞を２０分間にわたって６０００×ｇで遠心分離によって採取した。細胞を１００ｍｌの０．５倍溶解緩衝液（ｐＨ１１で２５ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０４％ｗ／ｖのＳＤＳ）中で再懸濁させ、次に２０，０００ｐｓｉでＭ－１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Microfluidics, USA）を用いて５回機械的に破壊した。細胞溶解液を４℃で２０分間にわたって８０００×ｇで遠心分離して、タンパク質粒子をペレット化し、次にそれを０．５倍溶解緩衝液、洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの尿素、５％ｖ／ｖのTriton X-100、ｐＨ７．５）及びＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）によって３回連続して洗浄した。効率的な均質化工程は、純粋な粒子懸濁液を得ることを促進する。したがって、粒子を再懸濁させ、各洗浄工程前に１分間超にわたって均質化した。精製タンパク質粒子をさらなる分析のために４℃で２０％のエタノールとともに１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５中で貯蔵した。
ＣＲＭ１９７を含む粒子の分析
精製タンパク質粒子を１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上で分離させた。濃度測定を用いて、Image Lab Software（Bio-Rad Laboratories, USA）を用いて粒子分画中の全タンパク質における融合タンパク質パーセンテージ／純度を決定した。融合タンパク質の量を、標準曲線として様々な量（５０ｎｇ、１００ｎｇ、３００ｎｇ及び５００ｎｇ）のＢＳＡを用いて計算した。タンパク質粒子の分子形態及びサイズをManawatu Microscopy & Imaging Centre（MMIC）（Massey University, Palmerston North, New Zealand）製のＴＥＭによって視覚化した。２０％のエタノールを含む最終的な貯蔵溶液、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５中のタンパク質粒子の凝集をMastersizer 3000（Malvern, UK）によって測定した。タンパク質粒子のゼータ電位及びそれらの可溶性形態もZetasizer Nano ZS（Malvern,UK）によって分析した。粒径及び変化の測定をRiddet Institute（Massey University, Palmerston North, New Zealand）において行った。Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上の標的タンパク質バンドを切り取り、タンパク質配列を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて同定した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いたタンパク質試料調製及び同定をCentre for Protein Research（Otago University, Dunedin, New Zealand）によって行った。
配合及び投与
免疫原性試験のための配合された組成物は、２００μＬの体積のＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中において、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）；１投与当たり２５０μｇ；Sigma-Aldrich, USA）で乳化された５μｇのＴＢ抗原／投与を含有していた。試験されるＴＢ抗原ＣＲＭ１９７粒子は、Ｈ４を提示するＣＲＭ１９７粒子、Ｈ２８、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８を提示するＣＲＭ１９７粒子である。全てのこれらの試料をエンドトキシンフリー宿主ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）中で産生した。単独のＤＤＡ（１投与当たり２５０μｇ）が陰性対照であった。アジュバント、ＤＤＡを滅菌Ｔｒｉｓ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。ＤＤＡ粉末を滅菌Ｔｒｉｓ緩衝液に加え、溶解するまで撹拌しながら８０℃の水浴中で加熱した。均質な白色のＤＤＡ溶液を室温（２５℃）で冷却した。試料を使用前に新たにＤＤＡ溶液と混合した。
全ての動物実験は、Otago University Animal Ethics Committee（Dunedin, New Zealand）によって承認されていた。この動物試験を、元々、Jackson Laboratories（Bar Harbor, Maine, USA）から購入され、Otago University動物施設で飼育された６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて行った。１群当たり６匹のマウスが存在していた。配合された試料を２００μＬの体積でマウスの脇腹に皮下注入した。マウスを、９日間隔を空けて３回免疫化した。免疫化動物実験をUniversity of Otago in Dunedin（New Zealand）において行った。
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）分析
ＥＬＩＳＡを用いて、血清抗体反応を分析した。高結合プレート（Greiner Bio-One, Germany）を、０．０５％（ｖ／ｖ）のTween 20、ｐＨ７．５（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈された１００μＬの５μｇ／ｍＬの精製可溶性ＴＢ抗原、Ｈｉｓ６－Ｈ４及び／又はＨｉｓ６－Ｈ２８で４℃において一晩被覆した。対照として、プレートはまた、１００μＬのＰＢＳＴで４℃において一晩被覆した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、２５℃で１時間にわたって３％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢＳＡでブロックした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、一次ポリクローナル抗体とともにインキュベートし、個々のマウスから採取された血清を２５℃で１時間にわたって１／４００～１／４０９６００の範囲の濃度においてＰＢＳＴで希釈した。ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、プレートを２５℃で１時間にわたって１／２００００の濃度において、ＰＢＳＴで希釈された二次ＨＲＰコンジュゲート抗体、抗マウスＩｇＧ１－又はＩｇＧ２ｃ－ＨＲＰ（Abcam, UK）とともにインキュベートした。洗浄後、ｏ－フェニレンジアミン基質（Abbott Diagnostics, IL, USA）をプレート上に加え、２５℃で１５分間インキュベートした。５０μＬの０．５ＮのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させ、結果をELx808iu ultramicrotitre plate reader（Bio-Tek Instruments Inc., USA）において４９０ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡをInstitute of Fundamental Science（Massey University, Palmerston North, New Zealand）において行った。
ウエスタンブロットアッセイ
ＩｇＧ反応の特異性を調べるために、異なる試験試料（ＣＲＭ１９７粒子、Ｈ４を提示するＣＲＭ１９７粒子、Ｈ２８、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８を提示するＣＲＭ１９７粒子）で免疫化されたマウスからのプール血清を２０００倍希釈し、それらをＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルからニトロセルロース膜（Life Technology, USA）に移した後、様々な試験粒子及び精製試験粒子を含有する全細胞溶解液に対するイムノブロッティングに使用した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ－コンジュゲート（Abcam, United Kingdom）を２００００倍希釈し、結合ＩｇＧ抗体の検出に使用した。膜をSuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution及びSuperSignal West Pico Luminol/Enhancer Solution（Thermo Scientific, USA）とともにインキュベートすることによってシグナルを発色させた。フィルムを、Ｘ線フィルム現像機を用いて現像した。ウエスタンブロットをInstitute of Fundamental Science（Massey University, Palmerston North, New Zealand）において行った。
単一の脾臓細胞懸濁液の調製
単一の細胞懸濁液を、７０×１０－６ｍのセルストレーナー（Corning, USA）に通して組織を引き裂くことによって脾臓から調製した。次に、細胞を、ペニシリン（１００Ｕ ｍＬ－１；Life Technologies, USA）及びストレプトマイシン（１００Ｕ ｍＬ－１；Life Technologies, USA）が補充された不完全ＲＰＭＩ培地（Life Technologies, USA）で２回洗浄した。赤血球を、赤血球溶解緩衝液（Sigma-Aldrich, USA）を用いて溶解させた。細胞を洗浄し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）及び５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ胎仔血清（Life Technologies, USA）が補充された完全ＲＰＭＩ（Life Technologies, USA）中で再懸濁させた。細胞をトリパンブルー（１：１００）で染色し、血球計算器を用いて計数した。これらのアッセイをUniversity of Otago in Dunedin（New Zealand）において行った。
脾細胞刺激及び上清中のサイトカインの測定
単一の脾臓細胞懸濁液を５×１０６個／ｍＬの濃度の細胞で完全ＲＰＭＩ培地中において調製し、そのうちの１００μＬをＵ底９６ウェルプレート（Life Technologies, USA）に加えた。細胞を１００μＬの完全ＲＰＭＩ培地単独又は４０μｇ／ｍＬの可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４又は可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８抗原で刺激した。培養物を２４時間又は６０時間にわたって５％のＣＯ２中３７℃でインキュベートした。上清中のサイトカイン放出を、製造業者の説明書に従い、Falcon Ｖ底プレート（Corning, USA）を用いて、ＢＤ ＣＢＡマウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（BD Biosciences, USA）を用いて測定した。データは、BD FACSDiva software（BD Biosciences, USA）とともにFACS Cantoを用いて得られた。これらのアッセイをUniversity of Otago in Dunedin（New Zealand）において行った。
統計的分析
サイトカイン及び抗体反応を、１元配置ＡＮＯＶＡを使用することによって分析した。各データ点は、６匹のマウスからの結果±標準誤差を表す。統計的有意性は、ｐ＜０．０５であるときに決定される。統計的分析を、Minitab 17を用いて行った。
結果及び説明
インビボでのタンパク質粒子の自己集合の形成に向けた、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１９７－Ｈ４及びＣＲＭ１９７－Ｈ２８の操作
一般に、ＣＲＭ１９７封入体の免疫原性及び抗原キャリア系の開発に向けたＣＲＭ１９７封入体の潜在的用途は、研究されていない。ＣＲＭ１９７製造に対する焦点は、ワクチンコンジュゲーション用途のための可溶性及び生物活性ＣＲＭ１９７の産生及び精製に当てられており、したがってこのタンパク質の可溶化及びリフォールディングが適用された［６～８］。
本研究の目的は、特に、様々な免疫原性調製物及び診断試薬開発のための、効率的な抗原／免疫原キャリアプラットフォームとしてのＣＲＭ１９７封入体／粒子の可能性を調べることであった。
過去の研究において、ＣＲＭ１９７封入体は、可溶性ＣＲＭ１９７を調製するプロセスにおいて細菌宿主中で形成された。しかしながら、過去の研究において、ＣＲＭ１９７封入体は、バイオ廃棄物として処理された。ＣＲＭ１９７封入体は、可溶性形態のＣＲＭ１９７を調製するときに形成されたが、封入体を形成するクローニング及び増殖条件は、本発明者らのものと異なる。例えば、それは、示された親和性であるか、又は精製タグがＣＲＭ１９７タンパク質の過剰産生及び最終的に封入体形成を刺激するのに必要とされる。Alessandra et al (2011)は、ＣＲＭ１９７の発現が大腸菌（E. coli）内のヒスチジンタグの非存在下で常に失敗したことを示した。しかしながら、ＣＲＭ１９７のＮ末端におけるヒスチジンタグの付加は、封入体形成に向けてタンパク質産生を著しく刺激した［８］。ヒスチジンタグ化ＣＲＭ１９７封入体は、Park et al (2018)によっても産生された［７］。本発明者らの研究において、ＣＲＭ１９７タンパク質配列に修飾はなされず、タンパク質は、封入体／粒子形成に向けて問題なく過剰産生された。本研究において設計され、ＣＲＭ１９７について最適化された増殖条件及びコドン使用は、１つ以上の組み換えタンパク質発現系、特に大腸菌（E. coli）細胞における強力な遺伝子発現のためにより好適である可能性が非常に高い。さらに、文献におけるＣＲＭ１９７封入体形成のための細菌菌株及び増殖条件は、本研究と異なる。例えば、Park et al (2018)における組み換えＣＲＭ１９７（Ｈｉｓ６－エンテロキナーゼ切断部位－ＣＲＭ１９７）をコードする合成遺伝子をｐＥＴ２８ａ＋にクローニングした。さらに、この試験は、ＣＲＭ１９７産生のための接種材料として一晩培養物を調製しなかった［７］。インキュベーション時間、増殖培地及び補充物を含む、Park et al (2018)における他の増殖条件パラメータは、本研究と異なる。
一般に、タンパク質粒子（封入体）の細胞内自己集合は、多くの場合、組み換え融合タンパク質が強力なプロモータ下で過剰産生され、細菌細胞修復系を圧倒したときに観察された［１１、１２］。この試験において、免疫原性キャリアＣＲＭ１９７をコードする遺伝子を大腸菌（E. coli）菌株についてコドン最適化し、強力なＴ７プロモータを含有するｐＥＴ－１４ｂ発現ベクターに遺伝的にクローニングした。さらに、マイコバクテリア融合ペプチドＨ４又はＨ２８をバイオエンジニアリングによりＣＲＭ１９７のＣ末端に作成した。モジュラー組成物及び分子クローニング手法が図１に詳述された。これらの組み換え遺伝子は、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において形質転換及び発現された。
ＣＲＭ１９７の溶解性を、８Ｍの尿素で処理されたか又は処理なしで、ＣＲＭ１９７を産生する細胞のタンパク質プロファイルを分析することによってまず決定した（図２）。Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルは、ＣＲＭ１９７の理論的分子量（ＭＷ）（５８．５４４ｋＤａ）を有するタンパク質に対応する優勢なタンパク質バンドが全細胞溶解液（図２Ａ）において観察されたことを示し、これは、ＣＲＭ１９７が大いに過剰産生されたことを示す。さらに、ＣＲＭ１９７を産生する細胞を８Ｍの尿素なし（図２Ｂ）又は８Ｍの尿素（図２Ｃ）で処理した。粗細胞溶解液の上清分画を、超音波処理及び遠心分離後、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを用いて分析した。ＣＲＭ１９７のＭＷ（５８．５４４ｋＤａ）を有する優勢なタンパク質バンドは、８Ｍの尿素処理なしで上清分画中に存在せず、８Ｍの尿素（図２Ｂ及び２Ｃ）で処理された上清分画のみにおいて見出され、これは、ＣＲＭ１９７が不溶性タンパク質として産生されたことを示唆している。
ＣＲＭ１９７粒子単離及び精製条件を最適化し、結果が図３に示され、複雑な大腸菌（E. coli）細胞混合物からの高度に純粋なＣＲＭ１９７粒子の問題なく抽出を実証している。実際に、ＣＲＭ１９７粒子を産生する大腸菌（E. coli）細胞を０．５倍溶解緩衝液中で再懸濁させ、Ｍ－１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Microfluidics, USA）を用いて機械的に破壊した。細胞破壊後、粗細胞溶解液中のＣＲＭ１９７粒子を、２回の提案される洗浄手順：ａ．０．５倍溶解緩衝液（図３Ｂ）及びｂ．０．５倍溶解緩衝液及び２Ｍの尿素及び５％のTriton X-100を含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（図３Ｃ）によって個々に精製した。細胞破壊後の０．５倍溶解緩衝液洗浄と対照的に、ＣＲＭ１９７粒子は、粒子を、０．５倍溶解緩衝液及び２Ｍの尿素及び５％のTriton X-100を含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（図３Ｂ及び３Ｃ）の両方で洗浄したとき、比較的高い純度を示した。特に、ＣＲＭ１９７タンパク質純度は、１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル及びImage Lab Software（Bio-Rad Laboratories, USA）を用いた濃度測定分析によって分析される、ＣＲＭ１９７粒子分画における全タンパク質の９５．６％である。最適化されたＣＲＭ１９７粒子単離及び精製条件が材料及び方法において詳述された。
精製ＣＲＭ１９７粒子及びマイコバクテリア融合ペプチドＨ４又はＨ２８を有する粒子のタンパク質プロファイルを図４におけるＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル電気泳動によって分析した。１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル及びImage Lab Softwareを用いた濃度測定分析は、ＣＲＭ１９７粒子及びＨ４又はＨ２８を提示する粒子が、それらの対応する粒子分画中の全タンパク質の９５．６％、８７．７％及び８２．１％を占めていたことを示した（図４Ａ）。さらに、Chen et al. (2018)は、Ｈｉｓ６タグ化Ｈ４及びＨ２８が過剰産生され、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）内で封入体を形成し得、遊離可溶性Ｈ４及びＨ２８ペプチドが、Ｈ４及びＨ２８抗原粒子を可溶化することによって調製され得ることを実証した［１３］。図４Ｂは、精製可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及びＨｉｓ６－Ｈ２８のタンパク質プロファイルを示し、これは、それらの可溶性タンパク質分画中８２．２％及び７２．４％を占めていた。ＣＲＭ１９７粒子試料及び可溶性マイコバクテリア抗原Ｈ４及びＨ２８の標的タンパク質配列をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって同定した（表２及び３）。
精製ＣＲＭ１９７粒子及びＨ４又はＨ２８マイコバクテリア抗原で被覆された粒子の特性評価
これらの細胞内ＣＲＭ１９７粒子及びＨ４又はＨ２８ペプチドを提示する粒子の存在がＳＥＭ（図５）及びＴＥＭ（図６）によって観察された。ＣＲＭ１９７粒子サイズは変化し、直径２００ｎｍ～８００ｎｍの範囲である（図６）。粒子は、表面の綿のような非晶質構造を有する楕円形状を示した（図６）。この非晶質構造は、疎水性相互作用によって相互に連結された折り畳まれていない及び／又は異常に折り畳まれたタンパク質を含有する緩いタンパク質網目構造であり、適切に折り畳まれたタンパク質は、網目構造の内部で停止される［１４、１５］。さらに、結果は、大腸菌（E. coli）細胞が２つ以上のタンパク質粒子を産生し得ることを実証した（図６）。しかしながら、細胞分裂中、全ての粒子が１つの細胞内に留まり、新たな粒子のタンパク質産生及び自己集合が他の細胞内で再開するであろう［１６］。
ＣＲＭ１９７粒子試料のゼータ電位をＤＤＡ中での乳化前及び後に分析した。全てのＣＲＭ１９７粒子試料及び可溶性Ｈｉｓ６タグ化抗原（Ｈ４又はＨ２８）を配合緩衝液、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５中で貯蔵し、これは負荷電であった（図７）。これらの試験試料は、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で負荷電表面を有していたが；それらは、ＤＤＡ溶液中での乳化後に強力に正荷電になった（図７）。粒子の表面電荷は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による細胞取り込みに影響を与え得る。樹状細胞による粒子の取り込みは、粒子が正荷電表面を有する場合、促進され得ることが知られている［１７］。しかしながら、いくつかの試験は、負荷電粒子がＡＰＣによって効率的に取り込まれ得ることを実証しており、これは、おそらく、オプソニン化［１８～２０］又は細胞膜中のカチオン性部位における負荷電粒子の吸着［１９、２１、２２］によって引き起こされ得る。
精製タンパク質粒子のサイズ分布もＤＤＡ中での乳化前及び後に分析した。ＣＲＭ１９７粒子及びＨ４又はＨ２８を提示する粒子は、単分散ではなく、それらのサイズは、０．５μｍ～４００μｍの範囲であり、これは、粒子凝集が起こることを示唆している（図８）。しかしながら、ＤＤＡとの配合後、全ての粒子は、単分散になり、サイズは、約１００μｍであり（図８）、これは、ＤＤＡが、純粋なＣＲＭ１９７粒子及びＴＢ抗原を提示する粒子の物理化学的特性に影響を与えたことを示唆している。ＤＤＡは、０．０１μｍ～０．８μｍの小さいサイズ範囲を有していた。しかしながら、ＤＤＡ中での可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４又はＨｉｓ６－Ｈ２８の乳化は、サイズ分布を１０μｍ～４００μｍで変化させた。一般に、０．５μｍ～１０μｍのサイズ範囲を有する粒子は、好ましくは、食作用によってＡＰＣによって取り込まれる［２０、２３］。それにもかかわらず、より小さい粒子並びに可溶性抗原は、多くの場合、エンドサイトーシスによって取り込まれる。食作用によるファゴソームへの粒子状抗原の細胞取り込みは、抗原交差提示をもたらし、最終的に、液性及び細胞媒介性免疫反応の両方を引き起こし得る［２４、２５］。
ＣＲＭ１９７粒子形成及びマウス免疫化
マイコバクテリア抗原濃度を、様々な量のＢＳＡ標準（５０ｎｇ、１００ｎｇ、３００ｎｇ及び５００ｎｇ）（図９）を使用することによって配合のためにまず決定し、Image Lab softwareを用いた濃度測定によって分析した。全ての試験試料をＬＰＳフリー大腸菌（E. coli）菌株から産生し、これは、遺伝的に突然変異された非毒性ＬＰＳのみを産生し、ヒト細胞におけるエンドトキシン反応を引き起こすことはできない［２６］。マウスに、１投与当たり５μｇのマイコバクテリア抗原を皮下投与し、２００μｌの体積で、ＤＤＡ（２５０μｇ／投与）中で乳化した。全てのマウスは、正常な効果を示し、有害作用及び異常行動は観察されなかった。マウスは全て、体重が増加し、実験全体を通して生存したままであった（データは示さず）。
免疫原性分析
抗体反応
液性及び細胞免疫反応は、両方とも細菌性病原体に対して役割を果たす。それにもかかわらず、細胞媒介性免疫反応は、細胞性免疫が細胞内病原体感染の予防と相関していたため、細胞内病原体の制御のためにより重要であると考えられる［２７～２９］。しかしながら、マイコバクテリア病原体は、一時的な細胞外期を有し、したがって、病原体は、抗体の抗菌効果に感受性であり得る［２７］。図１０中の免疫ブロット結果は、様々な試験試料で免疫化されたマウスからのプール血清のみが対応する標的タンパク質バンドを特異的に認識し、産生宿主大腸菌（E. coli）菌株からのバックグラウンドタンパク質と非特異的に相互作用しなかったことを実証し、これは、異なる試験試料で免疫化されたマウスからの血清抗体が非常に特異的であったことを示唆している（図１０）。Ｈ４又はＨ２８及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４又はＨｉｓ６－Ｈ２８を提示するＣＲＭ１９７粒子で免疫化されたマウスにおける、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４又はＨｉｓ６－Ｈ２８に対するＩｇＧ１反応の有意差はなかった（ｐ＞０．０５）（図１１）。しかしながら、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４に対するＩｇＧ２ｃ反応は、ＣＲＭ１９７粒子－Ｈ４で免疫化されたマウスより、可溶性Ｈｉｓ－Ｈ４で免疫化されたマウスにおいて有意に高かった（ｐ＝０．０４９）（図１１）。この有意差は、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８及びＣＲＭ１９７粒子－Ｈ２８で免疫化されたマウス間において、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８に対するＩｇＧ２ｃ反応でも観察された（ｐ＝０．０２１）（図１１）。
サイトカイン反応
様々な炎症性サイトカインを産生する多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、多くの場合、細胞内マイコバクテリア病原体に対する防御免疫反応と相関していた［３０～３３］。ＩＬ１７Ａ及びＩＦＮγは、細胞媒介性免疫反応の発生についてのバイオマーカーである［３４～３７］。特に、細胞媒介性免疫の発生を、脾細胞からのサイトカインの放出を測定することによって決定し、それを可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４及び可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８マイコバクテリア抗原によってインビトロで再刺激した。この特許では、サイトカイン放出を、培養中のサイトカイン放出及び消費を検出するために、初期（２４時間）及び後期（６０時間）の時点で分析した。
２４時間にわたる可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４によるインビトロでの再刺激により、Ｈ２８を提示するＣＲＭ１９７粒子で試験されるマウスからの脾細胞は、可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ２８で試験されるマウスと比較した際に有意に高いＩＬ１７Ａ分泌を示した（ｐ＝０．００８）（図１２）。可溶性Ｈｉｓ６－Ｈ４又はＨｉｓ６－Ｈ２８による６０時間の再刺激後、Ｈ４又はＨ２８を提示するＣＲＭ１９７粒子で免疫化されたマウスからの脾細胞によって産生されるＩＬ１７Ａの量は、それらの対応する可溶性同等物Ｈｉｓ６－Ｈ４（ｐ＝０．０３７）又はＨｉｓ６－Ｈ２８より有意に多かった（ｐ＝０．０１３）（図１３）。Ｈ４又はＨ２８及びそれらの可溶性抗原形態を提示するＣＲＭ１９７粒子で免疫化されたマウスからの脾細胞の間にＩＦＮγ分泌の統計学的差異はなかった（ｐ＞０．０５）（図１２及び１３）。ＩＬ１７Ａ及びＩＦＮγは、細胞媒介性免疫反応の発生についてのバイオマーカーであるが、ＩＬ１７Ａ及びＩＦＮγ分泌と防御免疫の強化との間に相関はない［３２、３８～４０］。
実施例２
様々な大腸菌（E. coli）菌株におけるＣＲＭ１９７粒子の産生
この実施例は、ＣＲＭ１９７粒子がShuffle及びOrigami大腸菌（E. coli）菌株において形成され得ることを実証している。ClearColi、SHuffle T7及びOrigamiにおいて産生されたＣＲＭ１９７粒子のＴＥＭ画像が図１４に示される。これらのＴＥＭ画像をＭＭＩＣ（Massey University, Palmerston North, New Zealand）によって行った。Shuffle及びOrigami菌株におけるＣＲＭ１９７粒子の過剰産生及び自己集合に必要とされる増殖条件は、ClearColi菌株における粒子形成に使用される方法と同様である。簡潔に述べると、ＣＲＭ１９７遺伝子を含有するｐＥＴプラスミドをそれぞれ大腸菌（E. coli）SHuffle T7及びOrigami菌株に形質転換した。３７℃で増殖された１０ｍｌの体積の一晩細胞培養物を調製し、これを用いて、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグルコース及びアンピシリンが１００μｇ／ｍｌの最終濃度で補充された１リットルのLuriaブロスに接種した。培養物を２００ｒｐｍで約３時間にわたって３７で増殖させ、ＯＤ６００が０．５に達したとき、０．００１Ｍの最終濃度でＩＰＴＧによって誘導した。２００ｒｐｍにおいて３７℃で４８時間にわたるインキュベーションがＣＲＭ１９７粒子形成に使用され得る。
これらの菌株は、タンパク質がジスルフィド結合を適切に形成するように促すことができるため、SHuffle T7又はOrigami菌株において産生されたＣＲＭ１９７は、適切に折り畳まれ、及び／又は生物学的に活性である可能性が高い。
実施例３
ＤＤＡアジュバントを用いた／用いないＣＲＭ１９７－ＴＢ粒子の自己アジュバント特性の評価及びその免疫反応の評価
実施例１において作製されたＣＲＭ－ＴＢ粒子をマウスにおいて試験して、ＣＲＭ粒子の自己アジュバント特性並びに防御免疫を誘導するそれらの能力を評価した。簡潔に述べると、５つの試験試料（ＣＲＭ１９７粒子、Ｈ４を提示するＣＲＭ１９７粒子、可溶性Ｈ４、ＢＣＧ及びプラセボ）並びに１群当たり１０匹のマウスが存在していた。マウスを、１０μｇのＴＢ抗原／投与を含有する試験試料を用いて、脇腹に、２週間の間隔を空けて３回、皮下で免疫化し、２００μｌの体積で、ＤＤＡ（２５０μｇ／投与）中で乳化した。第１の免疫化の時点で、１つの群のマウスを単回用量のＢＣＧ（５×１０５ＣＦＵ）で処理し、皮下注入した。最後の注入の３週間後、４匹のマウスを殺処分した。残りのマウスに、最後のワクチン接種の６週間後にヒト型結核菌（M. tuberculosis）負荷を与えた。ヒト型結核菌（M. tuberculosis）負荷の６週間後、マウスを殺処分した。免疫原性分析を、血清からのＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃ反応を測定すること、抗原特異的ＩＮＦγ分泌細胞を測定するためのELISpot並びに肺組織の細胞内サイトカイン（ＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ及びＩＬ１７）染色によって行った。さらに、細菌数を肺及び脾臓において測定して、防御を決定した。
材料及び方法
マウスの免疫化及び感染
雌Ｃ５７ＢＬ／６（６～８週齢）をAnimal Resources Centre（Perth, Australia）から購入し、特定の病原体のない条件下で飼育した。全ての実験を、関連する指針及び規制に従い、Sydney Local Health District Animal Welfare Committee（承認番号２０１６－０４４Ｄ）の承認により行った。防御実験のために、マウスに、５?×?１０５ＣＦＵのＢＣＧ Pasteur（ＰＢＳ中２００?μｌを１回又は１０ｍｇ／ｍＬのＤＤＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）と配合された１０μｇ／ｍＬのＨ４、Ｈ２８、Ｃ－Ｈ４、Ｃ－Ｈ２８又はＣＦＰを２週間の間隔を空けて３回、皮下（ｓ．ｃ．）注入した。ビヒクルのみを投与されたマウスを陰性対照として使用した。負荷実験のために、マウスを、感染用量の約１００個の生存細菌により、Middlebrook空気感染装置（Glas-Col）を用いて、エアロゾル経路を介した最後のワクチン接種の６週間後にヒト型結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに感染させた。免疫化動物実験をCentenary Institute at the University of Sydney（Australia）において行った。
IFNγ ELISpotアッセイ
脾細胞を、７０μｍのセルストレーナー（ＢＤ）に通過させることによって試験マウスから調製した。細胞を緩衝硫酸アンモニウム（ＡＣＫ緩衝液；０．１?ｍＭのＥＤＴＡ（Sigma）、１０?ｍＭのＫＨＣＯ３（Sigma）、１５０?ｍＭのＮＨ４Ｃｌ（Sigma）中で再懸濁させて、赤血球を溶解させ、次に洗浄し、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Scientifix, Cheltenham, Australia）、５０?μＭの２－メルカプトエタノール（Sigma）及び１００Ｕ ｍｌ－１のペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma）が補充されたＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中で再懸濁させた。
細胞を計数し、次に１０μｇ／ｍＬの最終濃度において、Ｈ４又はＨ２８の存在下で、１５μｇ／ｍＬの抗マウスＩＦＮ‐γモノクローナル抗体（クローンＡＮ１８）で予め被覆されたELISpotプレート中において、２×１０６個の細胞／ｍＬの密度で培養した。対照として、細胞を培地単独又は３μｇ／ｍＬのＣｏｎＡとともにインキュベートした。１８時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ／０．０１％のTween 20で十分に洗浄し、３７℃で少なくとも２時間にわたって最終濃度２．５μｇ／ｍＬでビオチン化抗マウスＩＦＮ‐γモノクローナル抗体（クローンＸＭＧ１．２）とともにインキュベートした。発色を、アビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ（Sigma）を伴うインキュベーション、続いてＡＰコンジュゲート基質（Biorad）の添加によって達成した。ウェル中のスポットの数を、AID ELISpot Readerを用いて決定した。これらのアッセイをCentenary Institute at the University of Sydney（Australia）において行った。
細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリー
細胞内サイトカイン染色のために、脾細胞をＨ４、Ｈ２８、ＴＢ１０．４又はＣＦＰ（１０?μｇ／ｍＬ）の存在下で３～４時間刺激し、次に最大で１２時間にわたってブレフェルジンＡ（１０?μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。２００万個の細胞を３０分間にわたってＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／２％のＦＣＳ／０．１％）中で１．２５?μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３２／ＣＤ１６（eBioscience, San Diego, CA）とともにインキュベートして、Ｆｃ受容体をブロックし、次に洗浄し、抗ＣＤ３－Alexafluor 700（クローン１７Ａ２、Biolegend）、抗ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ（クローンＲＭ４－５、Biolegend）、抗ＣＤ８ａ－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）－Ｃｙ７（クローン５３－６．７、Biolegend）又は抗ＣＤ４４－フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（クローンＩＭ７、ＢＤ）とともに３０?分間インキュベートした。Fixable Blue Dead Cell Stain（Life Technologies）を加えて、死細胞の区別を可能にした。次に、細胞を固定し、製造業者のプロトコルに従い、BD Cytofix/Cytoperm（商標）キットを用いて透過処理した。細胞内染色を、以下の抗体を用いて行った：抗ＩＦＮ－γ－フィコエリトリン（ＰＥ）－Ｃｙ７（クローンＸＭＧ１．２）、抗ＴＮＦ－ＡＰＣ（クローンＭＰ６－ＸＴ２２、Biolegend, San Diego, CA）、抗ＩＬ－２－ＰＥ（クローンＪＥＳ６－５Ｈ４）（ＢＤ）又は抗ＩＬ－１７Ａ－パシフィックブルー（クローンＴＣ１１－１８Ｈ１０、Biolegend）。全ての試料をBD LSR-Fortessaフローサイトメーター（ＢＤ）において取得し、FlowJo（商標）分析ソフトウェア（Treestar, Macintosh Version 9.8, Ashland, OR）を用いて分析した。これらのアッセイをCentenary Institute at the University of Sydney（Australia）において行った。
Ｔ細胞増殖アッセイ
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）からの骨髄細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Scientifix, Cheltenham, Australia）、５０?μＭの２－メルカプトエタノール（Sigma）及び１００Ｕ ｍｌ－１のペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma）が補充されたＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中の１０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＧＭ－ＣＳＦ（ProSpec, Israel）を伴うインキュベーションによってＣＤ１１ｃ＋骨髄由来樹状細胞に分化するように誘導した。新鮮な培地中での５日間の分化及び分裂後、非接着性骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を収集し、計数し、１×１０６個の細胞／ｍＬを播種し、次に３７℃で４時間にわたって０．１～１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、Ｈ４又はＣ－Ｈ４でパルスした。一方、雌ＲＡＧ－／－ｐ２５エピトープ特異的マウスからの脾臓細胞を、上述される単一の細胞懸濁液に処理し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者の指示に従い、EasySep（商標）Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit（Stemcell Technologies, VN, Canada）を用いて、９０～９５％の純度で単離した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーのためのCellTrace（商標）Violet Cell Proliferation Kit（Invitrogen, ThermoFisher Scientific, M A, USA）を用いて、製造業者の指示に従いCell-Trace Violet（ＣＴＶ）で染色した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を４×１０７個の細胞／ｍＬにおいて、パルスされたＢＭＤＣに加え、フローサイトメトリー分析前に３．５日間にわたって共培養して、Ｔ細胞増殖パーセンテージを決定した。細胞を３０?分間にわたってＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ／２％のＦＣＳ／０．１％）中の１．２５?μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３２／ＣＤ１６（eBioscience, San Diego, CA）とともにインキュベートして、Ｆｃ受容体をブロックし、次に洗浄し、抗ＣＤ３－Alexafluor 700（クローン１７Ａ２、Biolegend）、抗ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ（クローンＲＭ４－５、Biolegend）、抗ＣＤ８ａ－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）－Ｃｙ７（クローン５３－６．７、Biolegend）又は抗ＣＤ４４－フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（クローンＩＭ７、ＢＤ）とともに３０?分間インキュベートした。Fixable Blue Dead Cell Stain（Life Technologies）を加えて、死細胞の区別を可能にした。次に、細胞を固定し、製造業者のプロトコルに従い、BD Cytofix/Cytoperm（商標）キットを用いて透過処理した。増殖パーセンテージを、細胞をＣＴＶ低と特定することによって決定した。これらのアッセイをCentenary Institute at the University of Sydney（Australia）において行った。
細菌定量
エアロゾルヒト型結核菌（M. tuberculosis）感染の４週間後、肺及び脾臓を採取し、均質化し、１０％のオレイン酸‐アルブミン－デキストロース－カタラーゼが補充されたMiddlebrook ７Ｈ１０寒天プレート上で連続希釈後に平板培養した。プレートを３７℃でインキュベートし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を約３週間後に決定した。これらのアッセイをCentenary Institute at the University of Sydney（Australia）において行った。
統計的分析
実験群間の差の有意性を、テューキー又はダネットの事後検定（Prism）を用いて達成される多群データセットのペアワイズ比較とともに、一元又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した。この分析をCentenary Institute at the University of Sydney（Australia）においてそれらの施設において行った。
結果及び説明
ＣＲＭ１９７粒子の自己アジュバント特性を、ＤＤＡアジュバントの非存在下又は存在下において、ＣＲＭ１９７粒子又はＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子試験試料でマウスを免疫化することによってまず調べた。ELISpotアッセイ（図１６ｂ）は、ＤＤＡの非存在下で、ＣＲＭ１９７－ＴＢ粒子で免疫化されたマウスからのＩＦＮγ分泌がなかったことを示す。しかしながら、ＩＮＦｙ分泌は、ＤＤＡの存在下で、粒子状ＴＢ試料で免疫化されたマウスからの脾細胞において高かった。特に、ＣＲＭ１９７－Ｈ４／ＤＤＡで免疫化されたマウスは、可溶性Ｈ４／ＤＤＡで試験されるマウスと比較した際に比較的より多いＩＮＦｙ分泌を示した。ELISpot結果は、ＣＲＭ１９７粒子が自己アジュバント特性を有さないか又は低い自己アジュバント特性を有し得、ＤＤＡアジュバントが免疫反応の誘導に必要とされ得ることを示唆している。さらに、０．１～１００μｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度の可溶性Ｈ４及びＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子をＴ細胞増殖アッセイにおいて適用した（図１６ａ）。可溶性Ｈ４は、一般に、増加される濃度で細胞増殖を刺激した。しかしながら、高い濃度のＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子は、細胞増殖を阻害した。これは、ＣＲＭ１９７－Ｈ４が高い用量で悪影響を示し得ることを示すことがある。
異なる試験試料で免疫化されたマウスからのＣＤ４＋（図１６ｃ～ｈ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図１６ｉ～ｎ）のサイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用いて分析した。非アジュバントＴＢ試験試料を注入されたマウスからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方は、陰性対照、非アジュバントＣＲＭ１９７粒子と比較した際、可溶性Ｈ４刺激に応答したサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）産生を示さなかった。この結果は、ELISpotアッセイと一致する。しかしながら、ＤＤＡアジュバントＴＢ試験試料、可溶性Ｈ４及びＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子で免疫化されたマウスからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、可溶性Ｈ４で刺激されたとき、強力なサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ）産生を実証した。この結果は、ＣＲＭ１９７粒子がアジュバント特性を有さないことがあることを示唆し得る。しかしながら、ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子／ＤＤＡで免疫化されたマウスからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン産生は、可溶性Ｈ４に応答して、可溶性Ｈ４／ＤＤＡを投与されたマウスからのものより高い傾向がある。したがって、本発明者らは、免疫原性及び特に、組成物の製造に関して、粒子状ＣＲＭ１９７－ＴＢから依然として利益を得ることができる。
ＤＤＡアジュバントＣＲＭ１９７－ＴＢ粒子による防御免疫の誘導を評価する負荷試験
ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子及びＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子をＤＤＡアジュバントとともに配合した。アジュバントされたＣＲＭ１９７－ＴＢ粒子の免疫原性及び防御性を試験するために、配合された試験試料を用いて、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。
実施例１において作製されたＣＲＭ－ＴＢ粒子を負荷実験において試験した。全ての材料及び方法は、実施例１及び３に記載されている。簡潔に述べると、８つの試験試料（ＣＲＭ１９７粒子、Ｈ４を提示するＣＲＭ１９７粒子、Ｈ２８、可溶性Ｈ４、可溶性Ｈ２８、ＢＣＧ、ＣＦＰ及びプラセボを提示するＣＲＭ１９７粒子）並びに１群当たり１２匹のマウスが存在していた。マウスを、１０μｇのＴＢ抗原／投与を含有する試験試料で、脇腹に、２週間の間隔を空けて３回、皮下で免疫化し、２００μｌの体積で、ＤＤＡ（２５０μｇ／投与）中で乳化した。全てのマウスからの血清を抗体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃ）反応分析のために各注入の２週間後に収集した。第１のワクチン接種の時点で、１つの群のマウスを単回用量のＢＣＧ（５×１０５ＣＦＵ）で処理し、皮下注入した。最後のワクチン接種の３週間後、４匹のマウスを殺処分した。残りのマウスに、最後のワクチン接種の６週間後、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）負荷を与えた。ヒト型結核菌（M. tuberculosis）負荷の６週間後、マウスを殺処分した。以下の実験を行って、免疫原性を分析した：血清からのＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃ反応、抗原特異的ＩＮＦγ分泌細胞を測定するためのELISpot並びに肺組織の細胞内サイトカイン（ＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ及びＩＬ１７）染色。さらに、細菌数を肺及び脾臓において測定して、防御を決定した。
ELISpotアッセイは、可溶性Ｈ４免疫化マウスからの脾細胞が、ＣＲＭ１９７－Ｈ４免疫化マウスからの脾細胞と比較した際、可溶性Ｈ４又は可溶性Ｈ２８刺激に応答してより高いＩＦＮγ産生を有することを示した（図１７ａｂ）。しかしながら、可溶性Ｈ４又はＨ２８刺激に応答して、ＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子免疫化マウスからの脾細胞は、可溶性Ｈ２８免疫化マウスからの脾細胞と対照的に、比較的高いＩＦＮγ産生の傾向を有する（図１７ａｂ）。
可溶性Ｈ４刺激に応答して、様々なＴＢ免疫原で免疫化されたマウスからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン産生の有意差はない（図１８）。Ｈ２８刺激に応答して、ＣＲＭ１９７粒子で免疫化されたマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞は、可溶性Ｈ２８免疫化マウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞と対照的に、高いＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１７及びＴＮＦ産生を有する（図１９）。一般に、ＣＲＭ１９７－Ｈ４粒子又はＣＲＭ１９７－Ｈ２８粒子で免疫化されたマウスからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＢ７．７刺激に応答して、可溶性Ｈ４又はＨ２８免疫化マウスからの細胞と比較した際に高レベルのサイトカインを産生する（図２０）。
ＣＲＭ１９７ ＴＢ粒子によって免疫化されたマウスの肺及び脾臓ＣＦＵ
ＤＤＡアジュバントのみで免疫化されたマウスからの肺及び脾臓ＣＦＵ数は、ＢＣＧ及びＣＲＭ１９７ＴＢ粒子で免疫化されたマウスからの肺及び脾臓ＣＦＵ数より有意に高い（図２２）。これは、対照が予想されるように機能したことを示唆する。図２２は、可溶性抗原（Ｈ４及びＨ２８）で免疫化されたマウスからの肺及び脾臓がＢＣＧ免疫化マウスからの肺及び脾臓より低いＣＦＵを有することを示した。これは、可溶性Ｈ４及びＨ２８抗原が防御免疫を誘導することができ、この防御性が、生成される１つのＢＣＧより強力であることを示唆していた。この知見は、過去の試験と一致している［５、６、８、４１］。さらに、粒子試験試料（ＣＲＭ１９７－Ｈ４及びＣＲＭ１９７－Ｈ２８）で免疫化されたマウスからの肺及び脾臓は、可溶性抗原（Ｈ４又はＨ２８）で免疫化されたマウスからのものと同様又はそれより低いＣＦＵを示した。これは、粒子状ＣＲＭ１９７－Ｈ４及び／又はＣＲＭ１９７－Ｈ２８が、可溶性ＴＢ抗原、Ｈ４又はＨ２８によって生成される防御免疫と比較した際、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）に対する同等又はより良好な防御免疫を提供することが可能であり得ることを示し得る。
実施例４
ＣＲＭ１９７－Ａ群連鎖球菌（group A streptococcal）ペプチド粒子の免疫原性試験
Ａ群連鎖球菌（group A streptococcal）（ＧＡＳ）細菌に対する免疫反応を引き起こすように設計されたタンパク質粒子を含有するＣＲＭ１９７の能力を調べた。化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するＰ＊１７ペプチド（ＬＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫＮＱＶＥＲＡＬＥ；配列番号１７）ペプチド及び／又はＳ２ペプチド（ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ；配列番号１８）が用いられた。組み換え発現のための３つの遺伝的構築物を、日常的な技術を用いて構築した。プラスミド（１）ＣＲＭ－Ｐ＊１７；（２）ＣＲＭ－Ｓ２；及び（３）ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２。大腸菌（E. coli）ClearColi菌株を好適な条件下で組み換え発現に使用した。タンパク質は、キメラタンパク質である。ＣＲＭ１９７－ペプチド粒子を組み換え培養物から調製した。Ｐ＊１７及び／又はＳ２ペプチドを含むＣＲＭ１９７粒子を、免疫原性を試験するために動物への投与に使用した。Ｐ＊１７及び／又はＳ２ペプチドを含むＣＲＭ１９７粒子を、特異的免疫反応を引き起こすそれらの能力について試験した。
材料及び方法
菌株及び増殖条件
この試験において使用される菌株、プラスミド及びプライマーが表５に列挙される。大腸菌（Escherichia coli）を適切な抗生物質（アンピシリン（Ａｍｐ）、１００μｇ／ｍＬ）とともに３７℃でLuria Broth（ＬＢ）培地（Difco, Detroit, MI）中において増殖させた。浸透圧感受性大腸菌（E. coli）菌株ClearColi（商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Lucigen, USA）の増殖のために、ＬＢ培地に、１％のＮａＣｌを補充した。プライマーをIntegrated DNA Technologies（ＩＤＴ）によって合成した。
ＣＲＭ粒子の産生のためのプラスミド構築
クローニング技術を、既に記載されるように行った（Sambrook et al. 1989）。ＤＮＡ断片をBiomatik（Canada）から購入した。ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７、ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｓ２及びｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２のためのクローニング手法が図２３において実証される。断片をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによる酵素消化によってｐＵＣ５７ベクターから切り取った後、SYBR safe菌株（Invitrogen, USA）及びゲル精製（Qiagen, Thermo Fisher Scientific）を用いたアガロースゲル電気泳動を用いた断片分離を行った。最終的なプラスミドを、Griffith University DNA Sequencing Facility（Griffith University, Nathan Campus, Australia）によって確認されるように配列決定し、エンドトキシンフリー産生宿主、大腸菌（E. coli）菌株 ClearColi（商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Lucigen, USA）に形質転換した。
ＣＲＭ１９７粒子単離及び精製
それぞれのプラスミドを含有するClearColi（商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）産生宿主の一晩培養物を２０ｍＬの体積で接種した。一晩培養物を１％（ｗ／ｖ）のグルコース及びＡｍｐが補充されたより大きい培養物４ＬのＬＢ培地に使用し、約３時間にわたって２００ｒｐｍで、３７℃でインキュベートした。細胞培養物を、ＯＤ６００が０．５に達したとき、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧによって誘導し、３７℃で４８時間にわたってさらにインキュベートした。
細胞を４℃で２０分間にわたる８０００×ｇでの遠心分離によって採取し、０．５倍溶解緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、ｐＨ７）中で再懸濁させた。全細胞溶解液を、マイクロフルイダイザーＭ－１１０Ｐ（Microfluidics, USA）を用いて機械的に破壊した。細胞溶解液を４℃で２０分間にわたって８０００×ｇで遠心分離して、ＣＲＭ粒子をペレット化した。単離ＣＲＭ粒子を洗浄し、０．５倍溶解緩衝液によって３回精製した。精製ＣＲＭタンパク質粒子を１ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシンで滅菌し、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。滅菌ＣＲＭ粒子状試験試料をＴＢＳ中で貯蔵した。
タンパク質及び粒子分析
精製ＣＲＭ粒子を１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルにおいて分離させて、６２．５ｎｇ～５００ｎｇの範囲のＢＳＡ標準を用いた濃度測定を用いて、融合タンパク質パーセンテージを視覚化し、定量した。標的タンパク質バンドを切り取り、Ｑ－ＴＯＦ／ＭＳを用いたタンパク質の同定に供した。全ての標的タンパク質配列を同定し、表６に示した。画像を、Image Lab Software（Bio-Rad Laboratories, USA）を用いて捕捉した。粒径及びゼータ電位を、Queensland Micro Nanotechnology Centre（Griffith University, Queensland, Australia）においてZetasizer Nano ZS（Malvern, UK）を用いて測定した。Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにおける標的タンパク質バンドを、Clinical Research Center（The University of Queensland, Brisbane, Australia）において質量分析法（ＭＳ）を用いて、タンパク質同定及び確認のために切り取った。
配合及び免疫化
免疫原性試験のための配合された試験調製物は、室温で回転しながら１時間にわたって１００μＬの体積でAlhydrogel ２％（アラム）（２５μＬ／投与；InvivoGen, USA）と混合される５μｇのＳｔｒｅｐＡ抗原／投与を含有していた。ＴＢＳ中のアラムを陰性対照として使用した。可溶性Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴ（ＤＴ－ジフテリアトキソイド、毒性形態のＣＲＭ）を陽性対照として使用した。調製された配合物を注入前に新たにアラムと混合した。動物実験は、Griffith University Animal Ethics Committee（Gold Coast, Australia）によって承認された。動物実験を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて行った。１群当たり５匹のマウスが存在していた。配合された試験調製物を各大腿部に５０μＬ、１マウス当たり合計で１００μＬをマウスに筋肉内注入した。マウスを３回免疫化した（０、２１及び２８日目）。負荷実験が行われるであろう。動物実験をInstitute of Glycomics at Griffith University（Australia）において行った。
血清収集
血液を２０、２７及び３５日の時点で顎下腺の放血並びに４２日の時点で心穿刺によって収集した。血液を室温で凝固させ、続いて血液凝固を除去した。マウス血清を１０分間にわたって６６４×ｇでの遠心分離によって分離し、分析まで－８０℃で貯蔵した。
ＥＬＩＳＡ
血清抗体反応を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。高結合プレート（Greiner Bio-One, Germany）を、カーボネートコーティング緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中で希釈された１００μＬの５μｇ／ｍＬの可溶性タンパク質Ｐ＊１７及びＫ４Ｓ２で、４℃で一晩被覆した。翌日、プレートを３７℃で６０分間にわたってＰＢＳＴ中において、２００μＬの５％の脱脂乳でブロックした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ及び一次ポリクローナル抗体とともにインキュベートし、マウス血清を１／１００～１／３２７６８００の範囲の濃度において、３７℃で６０分間にわたってＰＢＳＴ中の０．５％の脱脂乳で希釈された個々のマウスから採取した。プレートを６０分間にわたって３７℃で１／５０００の濃度において、ＰＢＳＴで希釈された二次ＨＲＰコンジュゲート抗体抗マウスＩｇＧ又はＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Abcam, UK）を伴うインキュベーション前に３回洗浄した。３回洗浄した後、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）をプレート上に加え、室温で２０－２５分間インキュベートし、プレートリーダーにおいて４５０ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡをGriffith Institute for Drug Discovery（GRIDD）（Griffith University, Queensland, Australia）において行った。
ウエスタンブロット
ＩｇＧ反応の特異性を、ウエスタンブロット分析を用いて調べた。２０００倍希釈された免疫化マウスからのプール血清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後にＣＲＭ粒子に対して使用し、ニトロセルロース膜（Life Technology, USA）に移した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（Abcam, UK）を２００００倍希釈し、結合ＩｇＧ抗体検出に使用した。SuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution及びSuperSignal West Pico Luminol/Enhancer Solution（Thermo Scientific, USA）を用いて、シグナルを発色させた。ブロットを、Odyssey（登録商標）Fc Imaging System（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標））を用いてイメージングした。ウエスタンブロットをGRIDD（Griffith University, Queensland, Australia）において行った。
統計的分析
抗体反応を、テューキーの事後検定を用いた群間のペアワイズ比較のアルファベットによる表示によって示される統計的有意性（ｐ＜０．０５）を用いた１元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析した。各データ点は、５匹のマウスからの平均±標準誤差を表す。
結果及び説明
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）；ＧＡＳ）感染は、１０～３０％の範囲のヒトにおける高い死亡率を引き起こす主な問題であり続けており、世界では年間６００，０００人の死亡をもたらし、特にリソースの限られた地域で発生する［４２、４３］。ＧＡＳは、軽度の感染症から毒素性ショック症候群及び壊死性筋膜炎などの生命を脅かす疾患までの一連のヒト疾患並びに感染後の免疫関連疾患を引き起こす多目的のグラム陽性菌である。有効なＳｔｒｅｐＡワクチンは、特に治療が高価であるため、感染を予防し、死亡率及び罹患率を低下させるために望ましい。
この試験において、２つの標的タンパク質／抗原は、免疫を誘導し、侵襲性連鎖球菌感染症に対する防御を与えることが以前に実証された。Ｐ＊１７は、第１の抗原であり、免疫原性を強化するためにアミノ酸置換手法を用いて開発された［４５］ｐ１４５変異体（Ｍタンパク質の保存されたカルボキシル末端領域）［４４］である。Ｐ＊１７は、１回のみの免疫化において優れたレベルの抗体、より高い安定性及び連鎖球菌感染症からの１０，０００倍強化された防御を示した［４５］。Ｓ２は、第２の標的抗原であり、これは、非Ｍタンパク質及び連鎖球菌（streptococcal）ＩＬ－８プロテアーゼからの高度に保存された抗原であり、ＳｐｙＣＥＰは、ＤＴ及びＣＲＭの両方とともに実証されたＪ８抗原（ｐ１４５内に存在する１２ａａエピトープ）と組み合わせた全身及び局所ＧＡＳ負荷の有意な低下を示した［４６］。ヒト臨床試験のためのこれらのワクチンの現在の調製物は、ＣＲＭ（酵素的に活性及び非毒性形態のジフテリア毒素（ＤＴ））とコンジュゲートされた［４７］。しかしながら、ＣＲＭとコンジュゲートされたワクチンは高価であるため；この試験において、本発明者らは、コスト効率の高い方法を使用して、大腸菌（E. coli）を遺伝子組み換えして、本発明者らの標的抗原、Ｐ＊１７及びＳ２を提示するＣＲＭ粒子を産生した。
Ｐ＊１７及びＳ２抗原を提示するＣＲＭ粒子のインビボ自己集合に向けたバイオエンジニアリング
ハイブリッド遺伝子及びそれぞれのコードされた融合タンパク質のモジュラー組成物が図２４に示される。ＳｔｒｅｐＡ抗原、Ｐ＊１７及びＳ２をコードする様々なプラスミドを有する大腸菌（E. coli）ClearColi BL21（商標）（ＤＥ３）産生菌株を、組み換えタンパク質を提示するＣＲＭ粒子を産生する条件下で培養した。ハイブリッド遺伝子を構築するために、ＣＲＭをＰ＊１７及びＳ２遺伝子と一緒に遺伝子操作し、Ｔ７強力プロモータを含有するｐＥＴ１４ｂ発現ベクターにクローニングした［４８、４９］。４つのプラスミド構築物を、ＣＲＭ粒子産生のみのためにｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭを含むこの試験において使用し、ＣＲＭのＣ末端に融合されたＳｔｒｅｐＡ抗原：ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７、ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｓ２及びｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２を含有する３つのプラスミドを構築して、それぞれＣＲＭ－Ｐ＊１７、ＣＲＭ－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２粒子を生成した。ハイブリッド遺伝子がＴ７強力プロモータ下で過剰発現されるとき、ＣＲＭ粒子及びＣＲＭ＋抗原粒子のインビボ自己集合が観察された。さらに、それはまた、組み換えタンパク質、ＣＲＭ、ＣＲＭ－Ｐ＊１７、ＣＲＭ－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２（図２５）の産生をもたらし、これは、動物実験に使用された。
精製ＣＲＭ－ＳｔｒｅｐＡ粒子の特性評価
ＳｔｒｅｐＡ抗原を提示するＣＲＭ粒子を単離し、マイクロフルイダイザーを用いた機械的破壊を用いて細胞から放出した。全細胞溶解液（細胞破壊前）及び２０％（ｗ／ｖ）の懸濁液から５００倍希釈された精製ＣＲＭ粒子のタンパク質プロファイルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図２５）によって分析した。ＢＳＡ標準（６２．５～５００ｎｇ）を用いた濃度測定分析は、ＣＲＭ（４．５５０μｇ／ｕＬ）並びに抗原Ｐ＊１７－Ｓ２（０．７５０μｇ／ｕＬ）、Ｐ＊１７（０．４６７μｇ／ｕＬ）及びＳ２（０．２１１μｇ／ｕＬ）の量を示した。ＣＲＭ（５８．５ｋＤａ）、ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２（７４．９ｋＤａ）、ＣＲＭ－Ｐ＊１７（６６．７ｋＤａ）及びＣＲＭ－Ｓ２（６６．７ｋＤａ）の理論的ＭＷに対応する優勢なタンパク質バンドを切り取り、タンパク質配列を質量分析法（表６）によって確認した。
ＴＢＳ緩衝液中の様々なＣＲＭ粒子調製物のサイズ及び表面電荷へのアラムアジュバントの影響を調べるために、粒子の粒径及びゼータ電位をアラムとの混合前及び後に分析した（図２６）。エンドサイトーシスによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって通常取り込まれる可溶性抗原と対照的に、０．５μｍ～１０μｍの範囲のサイズを有する粒子が食作用によって取り込まれる［２３、５０］。食作用による粒子状抗原の取り込みは、液性及び細胞媒介性免疫反応の両方を最終的に誘導する抗原交差提示をもたらし得る［２４］。アラムコロイドのサイズは、様々なＣＲＭ粒子（０．９μｍ～１．６μｍ）と比較してより大きい（２．１μｍ）（図２６Ａ）。様々なＣＲＭ粒子へのアラムの付加は、２．２μｍから３．１μｍへのサイズの増加をもたらした。これらの凝集体は、おそらく、粒子及びアラム内並びに粒子及びアラム間の静電相互作用に起因していた。さらに、粒径と同様に、アラムは、陰性から陽性へのＣＲＭ粒子の表面電荷の変化にも影響を与えた（図２６Ｂ）。それにもかかわらず、インビボでのマウスへの注入後の粒子の表面電荷な不明である。正荷電粒子が樹状細胞によって次第に取り込まれることが知られているため、粒子の表面電荷は、細胞取り込みに影響を与え得る［１７］。さらに、細胞膜は、負荷電粒子に反発し得る陰性表面電荷が優勢である［５１、５２］。しかしながら、多くの試験は、負荷電粒子が、負荷電粒子の吸着を促進する［１９、５１、５２］か、又はオプソニン化を媒介する［１９、５０］、おそらく細胞膜のカチオン性部位のため、ＡＰＣによって効率的に取り込まれたことを実証した。
マウス免疫化及び免疫学的評価
ＣＲＭ１９７粒子及び動物試験の実験計画の概略図が図２７に示される。（１）様々な生物学的製剤と共精製され得［５３］、動物及びヒトの両方において広い範囲の病態生理学的作用を引き起こし得る［５３、５４］リポ多糖（ＬＰＳ）エンドトキシンの存在を回避するために；大腸菌（E. coli）ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株［５５］を産生宿主として使用して、エンドトキシンフリー産物を生成した。ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ、ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２、ｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｐ＊１７及びｐＥＴ１４ｂ＿ＣＲＭ－Ｓ２をコードするプラスミドを用いて、ClearColi（商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）産生菌株を形質転換した。（２）様々なプラスミドを有する菌株を４８時間にわたって３７℃において最適な条件下で増殖させて、融合タンパク質／抗原の過剰産生を媒介し、（３）その後のＣＲＭ粒子インビボ自己集合。（４）ＣＲＭ粒子を機械的破壊によって大腸菌（E. coli）細胞から単離し、溶解緩衝液洗浄を用いて３回精製した。（５）免疫原性試験のために、マウスに、１００μＬの総体積で２５μＬのアラムと混合された１投与当たり５μｇのＣＲＭ及びＳｔｒｅｐＡ抗原を筋肉内注入した。アラムを陰性対照として用い、Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴ（６．２５μｇ）を陽性対照として用いた。ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２は、２つの抗原が１つの方法のプロセスで産生されるという利点を有する一方、ＣＲＭ－Ｐ＊１７及びＣＲＭ－Ｓ２の物理的組合せは、別々に産生される必要がある２つの異なる粒子であるため；より多くの時間及びコストがかかる。免疫化後、全てのマウスは健康に見え、体重が増加し、試験全体を通して生存したままであった。顎下腺放血（ＳＢ）を用いて、一次免疫（ＰＩ）後２０、２７及び３５日の時点でマウスの血清を収集した。心穿刺を４２日の時点で行って、マウスを選び出し、血清を収集した。顕著な異常行動及び有害作用は観察されなかった（データは示さず）。（６）細菌性病原体によるマウス負荷は進行中である。
ＣＲＭ含有粒子によるマウスワクチン接種は、抗原特異的免疫反応を誘導する
陽性対照コンジュゲートＰ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴ及び陰性対照アラムと一緒に、ＣＲＭ、ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２粒子の免疫原性をマウスモデルにおいて評価した。血清試料を規定の時点で収集し、ＥＬＩＳＡを行って、抗体力価を決定した。特に、全ＩｇＧ及びＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３）をこの試験において測定して、抗原関連体液性免疫反応を特性評価した（図２８）。Ｐ＊１７特異的総ＩｇＧ反応（図２８Ａ）において、陽性対照Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴは、ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２の物理的組合せと比較して有意に高かった。しかしながら、Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴは、５μｇのＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２粒子を比較して、６．２５μｇのより高い用量を有していた。低下されたＩｇＧ反応は、Ｐ＊１７が粒子内に埋め込まれ及び表面が露出していないことにも起因し得る。一方、Ｓ２特異的総ＩｇＧ反応（図２８Ａ）において、Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴコンジュゲート及びＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２粒子の間で有意差はなかった。したがって、より低い投与量のＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２にもかかわらず、それらは、陽性対照と比較してＩｇＧ反応に関して同様に機能した。陰性対照アラム及びＣＲＭにおいて検出されるＰ＊１７及びＳ２特異的抗体力価はなかった。過去の試験は、陽性対照Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴよりわずかに高いＰ＊１７特異的ＩｇＧ力価を示し、３０μｇの抗原を使用した［４５］。一方、Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴ、ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２粒子のＳ２特異的ＩｇＧ力価は、３０μｇのＳ２抗原を注入した過去の試験と同等であった［４６］。ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２は、投与量を１００μｇ超に増加させる余地があり、抗原特異的抗体力価を増加させる可能性を有する。同様のパターン及びレベルがＰ＊１７－及びＳ２特異的ＩｇＧ１抗体力価において観察された（図２８Ｂ）。より少ないサブタイプ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３は様々であり、検出可能なＳ２特異的ＩｇＧ２ａ力価がなかったことが特に注目される。これらの結果は、高いＩｇＧ１抗体力価によって特性評価される強力なＴｈ２免疫の誘導を示唆していた。一部のＴｈ１免疫反応は、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの存在によって特性評価した際にも刺激されていた。
抗体反応の特異性を試験するために、免疫化マウスからのプール血清を様々な試験配合物の成分に対するウエスタンブロット分析において使用した（図２９）。ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２及びＣＲＭ－Ｐ＊１７＋ＣＲＭ－Ｓ２を注入されたマウスからのプール血清は、ＣＲＭ（５８．５ｋＤａ）、ＣＲＭ－Ｐ＊１７－Ｓ２（７４．９ｋＤａ）、ＣＲＭ－Ｐ＊１７（６６．７ｋＤａ）及びＣＲＭ－Ｓ２（６６．７ｋＤａ）の理論的ＭＷに対応するタンパク質バンドを特異的に認識した。さらに、Ｐ＊１７－ＤＴ＋Ｋ４Ｓ２－ＤＴ免疫化マウスからのプール血清は、ＣＲＭを除く全てのタンパク質バンドを特異的に認識した。アラム及びＣＲＭを注入されたマウスからのプール血清においてバンドは検出されなかった。
実施例５
ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生されたＣＲＭ１９７－ＨＣＶ粒子
１つ以上のＨＣＶ免疫原性配列を含むＣＲＭ１９７タンパク質粒子をキメラタンパク質として調製し、その免疫原性を試験する。使用されることになる１つ以上のＨＣＶ免疫原性配列は、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質及びコアタンパク質並びにそれらの組合せからなる群から選択されるＨＣＶウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列である。以下及び図３１に記載されるＨＣＶの免疫原性アミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７のＣ末端に翻訳的に融合された。ＨＣＶ含有粒子（ＣＲＭ１９７－Ｅ１－Ｅ２－ＮＳ３、ＣＲＭ１９７－キメラタンパク質及びＣＲＭ１９７－ＨｅｐＣ）で被覆されたＣＲＭ１９７粒子の産生のための融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の概略的な設計が図３１に示される。特に、Ｅ１－Ｅ２－ＮＳ３、キメラタンパク質及びＨｅｐＣ抗原を含む各組み換えＨＣＶ抗原は、ＣＲＭ１９７のＣ末端に翻訳的に融合された。ＣＲＭ１９７－Ｅ１－Ｅ２－ＮＳ３、ＣＲＭ１９７－キメラタンパク質及びＣＲＭ１９７－ＨｅｐＣを含む得られた組み換えタンパク質は、それぞれ過剰発現され、エンドトキシンフリー大腸菌（E. coli）菌株、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）中に示されるＨＣＶ融合（Ｅ１－Ｅ２－ＮＳ３、キメラタンパク質又はＨｅｐＣ）を有するＣＲＭ１９７タンパク質粒子に自己集合する。したがって、各組み換えＨＣＶ融合がＣＲＭ１９７粒子の表面に提示され、及び／又はＣＲＭ１９７粒子に組み込まれた。
「ｐｅｐ１－５０」とも呼ばれるペプチド１～５０の形態のコアタンパク質アミノ酸配列（図３１を参照されたい）をこの試験において試験した。ペプチド１～５０が由来する野生型ＨＣＶコアタンパク質アミノ酸配列の又はそれに由来するアミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2022549791000008
（GenBank受託番号ＢＡＣ２０４６６．１；配列番号４３；「ｐｅｐ１－１９１」とも呼ばれる）。Ｐｅｐ１－１９１は、ＨＣＶコアタンパク質に由来する１９１アミノ酸配列である。
この試験において使用される上に記載される野生型ＨＣＶコアタンパク質ペプチドのアミノ酸残基１～５０（ｐｅｐ１－１９１；配列番号４３）に対応する５０アミノ酸残基ペプチド（ｐｅｐ１－５０；配列番号２８）の形態のＨＣＶコアタンパク質断片のアミノ酸配列は、以下のとおりである：ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲ（配列番号２８）
全ＨＣＶゲノムのＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸配列は、以下のように示される：
Figure 2022549791000009
Figure 2022549791000010
（GenBank受託番号ＡＦ００９６０６．１；配列番号４４）。
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2022549791000011
（ＰＤＢ受託番号１ＣＵ１＿Ａ；配列番号６９）。
この試験において使用される配列番号６９の残基２１８～４２１にわたるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質断片のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2022549791000012
このペプチドは、図３１において「ｐｅｐ２１８－４２１」と呼ばれる。
この試験において使用されるＥ１ペプチドは、以下のような野生型ＨＣＶ Ｅ１タンパク質アミノ酸配列に由来する：
Figure 2022549791000013
（GenBank受託番号ＡＤＶ９２２０３．１；配列番号４５）。
配列番号４５に記載され、この試験において使用される野生型ＨＣＶ Ｅ１タンパク質アミノ酸配列の残基１９０～３２６にわたるＥ１タンパク質断片のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2022549791000014
このペプチドは、図３１において「ｐｅｐ１９０－３２６」と呼ばれる。
この試験において使用される野生型ＨＣＶ Ｅ１タンパク質アミノ酸配列（配列番号４５）の残基１９０～２２３にわたるＨＣＶ Ｅ１タンパク質ペプチド（図３１において「ｐｅｐ１９０－２２３」と呼ばれる）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：ＳＡＹＥＶＲＮＡＳＧＶＹＨＶＴＮＤＣＳＮＳＳＩＶＹＥＡＤＤＭＩＭ（ｐｅｐ１９０－２２３；配列番号７０）。
ＨＣＶのＥ２タンパク質からのペプチドをこの試験において試験した。ＨＣＶ Ｅ１及びＥ２タンパク質は、Ｅ１及びＥ２に翻訳後に切断された１つのポリタンパク質として最初に産生される。ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２ポリタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４６：
Figure 2022549791000015
（GenBank受託番号ＡＢＸ５４６９７．１；配列番号４６）に記載される。
配列番号４６に記載される野生型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質アミノ酸配列の残基４０９～６２０にわたる、この試験において使用されるＨＣＶ Ｅ２タンパク質断片のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2022549791000016
このペプチドは、図３１において「ｐｅｐ４０９－６２０」と呼ばれる。
ＨＣＶキメラタンパク質開発のための使用される野生型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質アミノ酸配列（配列番号４６）のＨＣＶ Ｅ２アミノ酸配列（ｐｅｐ４０９－５６１；配列番号１０４）が以下に示される。
Figure 2022549791000017
このペプチドは、図３１において「ｐｅｐ４０９－５６１」と呼ばれる。前の段落において簡単に記載されるように、配列番号１０４は、配列番号４６のｐｅｐ４０９－５６１領域（ＨＣＶ Ｅ２タンパク質アミノ酸配列の野生型）にわたる。
タンパク質粒子において使用され得るＨＣＶ Ｅ２タンパク質ペプチドのアミノ酸配列は、以下のように配列番号４６に記載される野生型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質アミノ酸配列の残基１０８～５５９にわたることも想定される。
Figure 2022549791000018
図３１に記載されるＣＲＭ１９７－ＨＣＶ粒子がClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において過剰産生され、精製粒子を１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（図３２）において分析し、これは、ＣＲＭ１９７－ＨＣＶ粒子を産生及び単離することが可能であることを実証する。少なくとも１つ粒子が免疫原性について試験される。
材料及び方法
大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０及びClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれ分子クローニング及びＣＲＭ粒子産生のために使用した。細菌増殖条件、プラスミド形質転換、ＣＲＭ粒子産生及びＣＲＭ粒子単離及び精製の詳細な説明が実施例１に記載された。
ＨＣＶ抗原を提示するＣＲＭ１９７の形成のためのプラスミド構築
図３１に記載される非ＣＲＭ１９７領域を包含するＥ１／Ｅ２／ＮＳ３、ＮＳ３／Ｅ２／Ｅ１／コアキメラタンパク質及びコア抗原（ＨｅｐＣ）をコードする組み換え遺伝子断片を大腸菌（E. coli）細胞についてコドン最適化し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（BioLabs, USA）による酵素消化、続いてGelRed溶液（Biotium, USA）を用いたアガロースゲル電気泳動及びゲル精製（BioLabs, USA）を用いたＤＮＡ断片分離により、ｐＵＣ５７ベクター（Biomatik, Canada）から切り取った。一方、ベクタープラスミドｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。その後の線形化ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７ベクターを、Ｅ１Ｅ２ＮＳ３、キメラタンパク質又はｈｅｐＣをコードするＨＣＶ ＤＮＡ断片にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｅ１Ｅ２ＮＳ３、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－キメラタンパク質及びｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ｈｅｐＣを生成した。最終的なプラスミドＤＮＡ配列は全て、Griffith University genome sequencing centre（Griffith University, Australia）によって確認した。
結果及び説明
本明細書に記載されるＨＣＶの免疫原性アミノ酸配列をＣＲＭ１９７のＣ末端に翻訳的に融合した。ＨＣＶ抗原（ＣＲＭ１９７－Ｅ１－Ｅ２－ＮＳ３、ＣＲＭ１９７－キメラタンパク質及びＣＲＭ１９７－ＨｅｐＣ）で被覆されたＣＲＭ１９７粒子の産生のための融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の概略的な設計が図３１に示される。ＣＲＭ１９７－ＨＣＶ粒子がClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において過剰産生され、精製粒子を１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（図３２）において分析し、これは、ＣＲＭ１９７ ＨＣＶ粒子を産生及び単離することが可能であることを実証する。
実施例６
spyCatcher／spyTag化学を用いてピキア・パストリス（Pichia pastoris）において産生された立体配座的に折り畳まれたグリコシル化されたＨＣＶ抗原を提示するＣＲＭ１９７粒子
ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質に由来するか又はそれに対応する免疫原性アミノ酸配列は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又は翻訳後修飾を促進する別の系におけるＨＣＶタンパク質の産生後にグリコシル化タンパク質として組み換えにより発現されたＣＲＭ１９７タンパク質粒子に組み込まれるであろう。
Ｅ１及び／又はＥ２グリコシル化免疫原性配列は、細胞に由来するＣＲＭ１９７タンパク質粒子に化学的にコンジュゲートされるであろう。
さらに、産生されたＥ１及び／又はＥ２グリコシル化免疫原性アミノ酸配列タンパク質は、spyCatcher／spyTag化学を用いてＣＲＭ１９７タンパク質粒子にライゲートされるであろう。spyCatcherタンパク質は、組み換え発現によってキメラとしてＣＲＭ１９７に融合されるであろう。ＣＲＭ１９７タンパク質粒子は、spyCatcherを提示するであろう。上述されるspyTag化ＨＣＶ免疫原は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）の糖鎖改変菌株による分泌及びグリコシル化を用いて産生されるであろう。ＣＲＭ１９７－spyCatcher粒子は、自発的なライゲーションのためにspytag化グリコシル化ＨＣＶタンパク質とともにインキュベートされるであろう。これらの粒子の免疫原性は、参照により本明細書に援用されるMartinez-Donato et al., (2016) Clin. Vaccine Immunol. 23 (4): 370-378［４１］に記載されるように試験されるであろう。ＨＣＶ抗原を含むＣＲＭ１９７粒子は、成長特異的抗体反応のためにマウスに注入されるであろう。マウス血清が収集され、抗体中和アッセイが行われて、ＣＲＭ１９７粒子ベースのＨＣＶ免疫原性組成物の免疫原性及び有効性が評価されるであろう。
実施例７
ＣＲＭ１９７－免疫原としてのデング熱タンパク質粒子
本明細書に記載されるＣＲＭ１９７粒子は、望ましい粒子状免疫原性組成物、特にデングウイルスに対するワクチンの開発のために、免疫原性デング熱抗原を提示するキャリア系として試験されるであろう。個々に又は組み合わせてＣＲＭ１９７粒子において提示されるか又はそれに組み込まれるデング熱抗原の免疫原性配列が以下に記載される。
野生型デングウイルスエンベロープタンパク質アミノ酸配列（配列番号４７；GenBank受託番号ＡＡＡ７８９１９．１）のペプチド２８６～４２６（ｐｅｐ２８６－４２６；配列番号４１）の形態のエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2022549791000019
野生型デングウイルスエンベロープタンパク質アミノ酸配列のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2022549791000020
（GenBank受託番号ＡＡＡ７８９１９．１；配列番号４７）。
野生型デングウイルスカプシドタンパク質アミノ酸配列（配列番号４８；GenBank受託番号ＡＢＤ１５３１０．１）のペプチド１～９９（ｐｅｐ１－９９；配列番号４２）の形態のカプシドタンパク質のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＮＮＱＲＫＫＡＲＳＴＰＦＮＭＬＫＲＥＲＮＲＶＳＴＶＱＱＬＴＫＲＦＳＬＧＭＬＱＧＲＧＰＬＫＬＦＭＡＬＶＡＦＬＲＦＬＴＩＰＰＴＡＧＩＬＫＲＷＧＴＩＫＫＳＫＡＩＮＶＬＲＧＦＲＫＥＩＧＲＭＬＮＩＬＮＲＲＲＲ（配列番号４２）。
野生型デングウイルスカプシドタンパク質アミノ酸配列のアミノ酸配列は、以下に示される：
Figure 2022549791000021
（GenBank受託番号ＡＢＤ１５３１０．１；配列番号４８）。
１つ以上のデング熱抗原配列は、本明細書に記載される１つ以上の方法を用いてＣＲＭ１９７粒子に組み込まれるであろう。免疫反応を引き起こす得られる粒子の能力が試験されるであろう。
実施例８
診断試薬としての粒子状ＣＲＭ１９７－ＴＢ
ＣＲＭ１９７粒子は、特異的及び感受性粒子状ＣＲＭ１９７粒子ベースのＴＢ診断試薬の開発のための免疫原性ＴＢ診断抗原（ＴＢ７．７、配列番号３８；ＨｓｐＸ、配列番号３２；ＥＳＡＴ６、配列番号３３；ＣＦＰ１０、配列番号３４；表４を参照されたい）を提示するキャリア系として試験された。診断抗原の免疫原性配列は、ＣＲＭ１９７粒子において提示されるか又はそれに組み込まれる。
材料及び方法
大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０及びClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれ分子クローニング及びＣＲＭ粒子産生のために使用した。細菌増殖条件、プラスミド形質転換、ＣＲＭ粒子産生及びＣＲＭ粒子単離及び精製の詳細な説明が実施例１に記載された。
ＴＢ診断抗原を提示するＣＲＭ１９７の形成のためのプラスミド構築
ＴＢ診断抗原をコードする全てのＤＮＡ断片をＣＲＭ１９７の３’末端にクローニングした。ＴＢ診断抗原を提示するＣＲＭ１９７粒子の産生のための融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子（図３３）が以下に示される。
・ＴＢ７．７－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０（表４を参照されたい）
・ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０（表４を参照されたい）
・ＴＢ７．７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０（表４を参照されたい）
特に、ＴＢ７．７－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０及びＴＢ７．７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０をコードする組み換え遺伝子断片を大腸菌（E. coli）細胞についてコドン最適化し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（BioLabs, USA）による酵素消化、続いてGelRed溶液（Biotium, USA）を用いたアガロースゲル電気泳動及びゲル精製（BioLabs, USA）を用いたＤＮＡ断片分離により、ｐＵＣ５７ベクター（Biomatik, Canada）から切り取った。一方、ベクタープラスミドｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。その後の線形化ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７ベクターをＴＢ診断抗原、ＴＢ７．７－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０又はＴＢ７．７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０をコードするＤＮＡ断片にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０及びｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０を生成した。最終的なプラスミドＤＮＡ配列は全て、Griffith University genome sequencing centre（Griffith University, Australia）によって確認した。
ＴＢ血液アッセイ
血液を１０回逆さにして穏やかに混合し、次に１ｍｌの適切に混合された新鮮な血液（採取後＜６時間）を滅菌４８ウェルプレートに加えた。続いて、異なる量のＴＢ抗原、２ｎｇ、１０ｎｇ及び５０ｎｇを含有する５０μｌのＴＢ診断試薬をプレートに加えた。ＰＢＳ緩衝液、ｄＨ２Ｏ、ＰＰＤＡ及びＰＰＤＢは対照である。プレートを、加湿された環境中で２０時間にわたって３７℃でインキュベートした。血漿をインキュベーション後に遠心分離によって収集した。ＥＬＩＳＡを行って、分泌されたＩＦＮγのレベルを測定した［５６］。
結果及び説明
上記のＤＮＡ構築物、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０及びｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＴＢ７．７－ＨｓｐＸ－ＥＳＡＴ６－ＣＦＰ１０がClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において過剰発現された。８Ｍの尿素で処理された及び／又は処理されないＴＢ診断試薬を産生する全細胞を１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにおいて分析した（図３４）。タンパク質プロファイルは、ＣＲＭ１９７－ＴＢ診断抗原が優勢なバンドであることを示した。遠心分離後、これらの優勢なバンドは、８Ｍの尿素処理なしの透明な細胞溶解液において見られず、これは、不溶性ＣＲＭ粒子が形成されたことを示唆している。しかしながら、重タンパク質バンドが８Ｍの尿素処理後の粗細胞溶解液の上清分画中に観察され、これは、８Ｍの尿素がＣＲＭ粒子を可溶化し、すなわちそれらをその成分に分解できることを示唆している。これらの結果は、ＣＲＭ１９７－ＴＢ診断抗原がタンパク質粒子において過剰産生され得ることを示唆する。さらに、精製ＣＲＭ１９７－ＴＢ診断試薬は、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルでも分析され、高い純度を示した（図３５）。
実施例９
ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生されたＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ヒトにおける重症呼吸器疾患を引き起こし、患者の死亡をもたらし得る。コロナウイルスのこの菌株は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こし、ＣＯＶＩＤ１９の世界的大流行をもたらした。大流行を制御する手段にもかかわらず、ＷＨＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態であると宣言した。ワクチン接種は、さらなる拡散を防ぎ、ＣＯＶＩＤ１９が深刻な世界的大流行の危機になることを防ぐことが可能であり得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス科（Coronaviridae）のメンバーである。コロナウイルススパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）は、ウイルスエンベロープ上に三量体構造を形成し、結合及びウイルス侵入を促進する（図４２を参照されたい）。Ｓタンパク質は、Ｓ１ドメインを含み、これは、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ、以下に記載される配列）を含み、細胞表面上で受容体に結合する。Ｓ１タンパク質アミノ酸配列は、以下に記載される、試験された第２の抗原は、Ｎタンパク質（以下に記載される配列）である。このタンパク質は、強い抗体反応の誘導をもたらさないことがあるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質は、いくつかの保存されたＴ細胞エピトープを含む。
材料及び方法
ＣＲＭ１９７粒子は、Ｎタンパク質からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤを提示するためのキャリア系として試験された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を提示するＣＲＭ１９７の形成のためのプラスミド構築
大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０及びClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれ分子クローニング及びＣＲＭ粒子産生のために使用した。細菌増殖条件、プラスミド形質転換、ＣＲＭ粒子産生及びＣＲＭ粒子単離及び精製の詳細な説明が実施例１に記載された。
後述されるようにこの試験において試験されるＣＲＭ１９７のＣ末端融合として組み込まれるＮタンパク質アミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2022549791000022
（配列番号５６；ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿００９７２４３９７．２に由来する）。
後述されるようにこの試験においてＣＲＭ１９７のＣ末端融合に組み込まれる野生型（完全長）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列（配列番号６４；GenBank受託番号ＱＨＤ４３４１６．１）のＲＢＤアミノ酸配列（配列番号５７）は、以下のとおりである。
Figure 2022549791000023
このＲＢＤ配列（ｐｅｐ３１９－５２９）は、完全長Ｓタンパク質（以下を参照されたい；配列番号６４とも呼ばれる）に由来し、Ｓタンパク質のアミノ酸残基３１９～５２９にわたる。特に、ＲＢＤドメインを包含するＳタンパク質の概略図が図４２に示される。
完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2022549791000024
（GenBank受託番号ＱＨＤ４３４１６．１；配列番号６４）。
上記の配列を有するスパイクタンパク質のＮタンパク質及びＲＢＤ領域をそれぞれＣＲＭ１９７のＣ末端に組み換えにより融合した。ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子及び粒子状ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子の産生のための融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子が図３６ａに示される。簡潔に述べると、上に記載されるＲＢＤ及びＮタンパク質をコードする組み換え遺伝子断片を大腸菌（E. coli）細胞についてコドン最適化し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（BioLabs, USA）による酵素消化、続いてGelRed溶液（Biotium, USA）を用いたアガロースゲル電気泳動及びゲル精製（BioLabs, USA）を用いたＤＮＡ断片分離により、ｐＵＣ５７ベクター（Biomatik, Canada）から切り取った。一方、ベクタープラスミドｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。その後の線形化ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７ベクターを、ＲＢＤ及びＮタンパク質をコードするＤＮＡ断片にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ及びｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質を生成した。最終的なプラスミドＤＮＡ配列は全て、Griffith University genome sequencing centre（Griffith University, Australia）によって確認した。
ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするこれらのプラスミドを、上述される粒子産生のために、エンドトキシンフリー宿主、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。精製ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子のタンパク質プロファイルが図３６ｂに示される。ＣＲＭ１９７（５８．５ｋＤａ）、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ（８２．２ｋＤａ）及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質（１０４ｋＤａ）の理論的分子量を有するタンパク質に対応する高い純度を有する優勢なタンパク質バンドが存在し、これはＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質が非常に産生されることを示唆している。ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２粒子を以下の配合物中でアラムアジュバントと配合した。
・プラセボ：アラム単独
・ＣＲＭ１９７粒子及びアラム（この配合物は、抗原なしで単独のＣＲＭ１９７粒子を含有する）
・ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子＋ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子＋アラム（この配合物は、各抗原を有する２つの別個のＣＲＭ１９７粒子を含有する）
マウス免疫化
動物実験は、Griffith University Animal Ethics Committee（Australia）によって承認された。動物実験を、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて行った。１群当たり１０匹のマウスが存在していた。ＣＲＭ１９７－ＣＯＶＩＤ１９粒子を以下の配合物中でAlhydrogel ２％（アラム）（InvivoGen, USA）と配合した。
・プラセボ：アラム単独
・ＣＲＭ１９７粒子及びアラム（上述される）
・ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子＋ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子＋アラム（上述される）
１００μｌ中に２０μｇ／投与のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及び２５μｌ／投与のアラムを含有する配合された試験試料。全ての配合された試験試料を各大腿部に５０μＬ、１マウス当たり合計で１００μＬをマウスに筋肉内注入した。マウスを３回免疫化した（０、１４及び２８日目）。放血前、中間及び最終血清試料を収集した（０、２１、４２日目）。マウス免疫化をGRIDD（Griffith University, Queensland, Australia）において行った。
ＥＬＩＳＡを用いた抗体反応分析
ＥＬＩＳＡを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を有するＣＲＭ１９７粒子によって誘導されるマウスの抗体反応を分析した。実験手順は、実施例１において上述された。ＥＬＩＳＡをGRIDD（Griffith University, Queensland, Australia）において行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラーク減少アッセイ
血清を５６℃で３０分間にわたって熱不活性化し（アッセイ前の日）、ｇ処理当日まで－２０℃で貯蔵し、Ｖｅｒｏ細胞を含む９６ウェルプレートを、約９５単層コンフルエンスを確実にするまで培養する。
血清の連続希釈（ＭＥＭ中１：２０～１：１０，２４０）を９６ウェルプレート中で調製した。実際に、約９５％コンフルエントなＶｅｒｏ細胞単層の９６ウェルプレートを確認し、増殖培地を除去した。プレートを感染培地（ＭＥＭ＋抗生物質、ＦＢＳなし）で洗浄し、次に１μｇ／ｍｌのＴＰＣＫトリプシンを含有する１５０μｌの感染培地をプレートに加えた。全ての上記の実験手順をＰＣ２ ｌａｂにおいて行った。
以下の実験室作業をＰＣ３ ｌａｂにおいて行った。まず、５０μｌ当たり１００ ＴＣＩＤ５０＝１０３．３ ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、０．５％のＢＳＡを含有する感染培地中で調製した。次に、ウイルスを、予め調製された血清希釈物の各希釈に１：１で加え、時折揺すりながら、室温で１時間インキュベートした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／血清試料を４連でＶｅｒｏ細胞に加えた。各プレートは、対照として一連のウイルスのみ及び細胞のみ（すなわち血清又はウイルスなし）を含む。元の接種材料中に存在するウイルスの量を評価し、逆滴定を行うことによって確認した。次に、プレートを５％のＣＯ２で３７℃においてインキュベートし、次に手順後最大４日まで細胞変性効果（ＣＰＥ）について毎日顕微鏡で監視した。プラークのかなりの減少が観察され得る血清希釈物を中和抗体力価として報告した。このアッセイをPeter Doherty Institute for Infection and Immunity at the University of Melbourne（Australia）において行った。
結果及び説明
粒子状ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ及び粒子状ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質の産生のための融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子が図３６ａに示される。ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするこれらのプラスミを粒子産生のためにエンドトキシンフリー宿主、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。精製ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子のタンパク質プロファイルが図３６ｂに示される。ＣＲＭ１９７（５８．５ｋＤａ）、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ（８２．２ｋＤａ）及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質（１０４ｋＤａ）の理論的分子量を有するタンパク質に対応する高い純度を有する優勢なタンパク質バンドが存在し、これは、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質が非常に産生されることを示唆している。
配合された粒子試料の免疫原性を雌Ｃ５７ＢＬ／６において試験した。図３６ｃ及び３６ｅは、アジュバントされたＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質及びＣＲＭ１９７－ＲＢＤで免疫化されたマウスからのアジュバントされた血清試料がＮタンパク質被覆プレート上で高い総ＩｇＧ及びＩｇＧ１力価を有することを示し、これは、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質及びＣＲＭ１９７－ＲＢＤが強い総ＩｇＧ及びＩｇＧ１反応を誘導したことを示唆している。抗体反応がＳ１被覆プレートにおいて観察され（図３６ｄ及び３６ｆ）、これは、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生されたＲＢＤを含有するＣＲＭ１９７粒子が免疫反応を引き起こし得ることを示唆している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラーク減少アッセイにおいて、中和抗体力価の誘導がＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質／ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ配合物について得られた一方、アラム、ＣＲＭのみ及びワクチン接種前血清は、検出可能な中和抗体を示さなかった（図４１）。
実施例１０
ｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生された粒子状ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ－２粒子
本発明者らは、異なる産生菌株バックグラウンドを使用し、促進された機能的免疫反応の誘導のためのＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２含有粒子を再設計した。この手法は、延長された及び立体構造抗原をＣＲＭ粒子に含むことを目的とする。ＲＢＤのみの代わりにＳ１サブユニットを使用することは、中和抗体及びＴ細胞反応の誘導のためのエピトープの強化されたレパートリーを提供する。抗原構造の保持は、ウイルス中和に重要であると考えられる立体構造エピトープを認識する抗体の誘導を可能にする。この実験は、実施例９の延長試験である。しかしながら、本発明者らは、産生宿主を、ClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）からｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）に変更し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をＲＢＤからＳ１タンパク質に変更し、抗原用量を２０μｇ／投与から５０～１００μｇ／投与に増加させた。
スパイクタンパク質ＳのＳ１サブユニットは、ＲＢＤ並びに回復期患者に見られる抗体によって認識されるさらなる複数のＢ及びＴ細胞エピトープを含む。エピトープは、細胞へのウイルス侵入をブロックする中和抗体によっても認識され、したがって、Ｓ１をワクチン抗原候補とみなすことによってこのような抗体を誘発することは、ワクチン製剤の性能を高め得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、独特なＳ１／Ｓ２フリン切断部位（ＲＲＡＲ、ｐｅｐ６８２－６８５）を含有する。フリン切断部位は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及び他のＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶｓ）には存在せず、これは、そのゲノム配列の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列に対する９６％の同一性を示す。フリン切断部位がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染のために宿主細胞に容易に侵入させ、したがって高い感染性及び伝染性に関与すると考えられる。図４２に示されるとうに、本発明者らが選択したＳタンパク質アミノ酸配列（ｐｅｐ１－６９７；配列番号１０１）は、Ｓ１サブユニットの完全長（ｐｅｐ１－６８１；配列番号５８）、フリン切断部位（ｐｅｐ６８２－６８５；配列番号１０２）及びＳ２の短鎖Ｎ末端配列（ｐｅｐ６８６－６９７；配列番号１０３）を含有する。Ｓ２のＮ末端配列（配列番号１０３）は、効率的なＳ１／Ｓ２フリン切断を確実にするためのものである。
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列（配列番号６４）の選択されたＳタンパク質アミノ酸配列（ｐｅｐ１－６９７；配列番号１０１）を以下のようにこの試験において使用した。
Figure 2022549791000025
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列（配列番号６４；GenBank受託番号ＱＨＤ４３４１６．１）のＳ１サブユニットアミノ酸配列（ｐｅｐ１－６８１；配列番号５８）を以下のようにこの試験において使用した。
Figure 2022549791000026
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列（配列番号６４）のフリン切断部位タンパク質アミノ酸配列（ｐｅｐ６８２－６８５；配列番号１０２）を以下のようにこの試験において使用した：ＲＲＡＲ（配列番号１０２）。
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列（配列番号６４）のＳ２（ｐｅｐ６８６－６９７；配列番号１０３）の短鎖Ｎ末端タンパク質アミノ酸配列を以下のようにこの試験において使用した：ＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭ（配列番号１０３）。
選択されたＳタンパク質アミノ酸配列（配列番号１０１）をＣＲＭ１９７のＣ末端に翻訳的に融合した（図３８ａ）。簡潔に述べると、Ｓ１をコードする組み換え遺伝子断片を大腸菌（E. coli）細胞についてコドン最適化し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（BioLabs, USA）による酵素消化、続いてGelRed溶液（Biotium, USA）を用いたアガロースゲル電気泳動及びゲル精製（BioLabs, USA）を用いたＤＮＡ断片分離により、ｐＵＣ５７ベクター（Biomatik, Canada）から切り取った。ベクタープラスミドｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。その後の線形化ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７ベクターを、Ｓ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｓ１を生成した。最終的なプラスミドＤＮＡ配列をGriffith University genome sequencing centre（Griffith University, Australia）によって確認した。
ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子ビーズ及びＡＣＥ２結合アッセイ
高結合プレート（Greiner Bio-One, Germany）を、０．０５％（ｖ／ｖ）のTween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５（ＰＢＳＴ）で希釈された１００μＬの５μｇ ｍＬ－１の精製ＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子で、４℃で一晩被覆した。陽性及び陰性対照も、一晩、プレート上で被覆した。特に、ＣＲＭ１９７粒子及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子が陰性対照である。グリコシル化可溶性Ｓ１（University of Queensland, Australia）が陽性対照として使用される。プレートを２５℃で１時間にわたって１／１０００の濃度において、ＰＢＳＴで希釈されたアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ２）（ヒト）Ｆｃ融合（ＨＥＫ２９３）（Aviscera Bioscience Inc, USA）とともにインキュベートした。ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、プレートを２５℃で１時間にわたってタンパク質Ａ－ＨＲＰとともにインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ｏ－フェニレンジアミン基質（Abbott Diagnostics, IL, USA）をシグナル発色のためにプレートに加えた。結果を、ELx808iuウルトラマイクロタイタープレートリーダー（Bio-Tek Instruments Inc., USA）を用いて４９０ｎｍで測定した。ＡＣＥ２結合アッセイは、GRIDD（Griffith University, Queensland, Australia）において行われる。
感染されたヒト血清試料を用いたＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子ビーズＥＬＩＳＡ
この実験を単純盲検として行った。ＣＲＭ１９７粒子、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子及びＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子は、それぞれ試料Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫと示される。（ＣＲＭ１９７粒子は、ＣＲＭ１９７のみの粒子又はＣＲＭ粒子を指し得、逆も同様である。ＲＢＤ粒子は、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子又はＣＲＭ－ＲＢＤ粒子を指し得、逆も同様である。Ｎタンパク質粒子は、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子又はＣＲＭ－Ｎ ｐｒｏ粒子を指し得、逆も同様である。Ｓ１粒子は、ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子又はＣＲＭ－Ｓ１粒子を指し得、逆も同様である）Ｓ１－ＲＢＤを陽性対照として使用した。簡潔に述べると、高結合プレートを一晩、４℃でカーボネートコーティングバッファー（ｐＨ９．６）中において１００μＬの１μｇ ｍＬ－１の抗原で被覆した。プレートを３７℃で９０分間にわたってＰＢＳＴ中５％の脱脂乳でブロックしてから、３７℃で９０分間にわたって１／２，０００の濃度で一次抗体（感染及び非感染ヒト血漿試料）を加えた。洗浄後、次にプレートを１／３，０００の濃度で二次ＩｇＧとともにインキュベートし、ＯＰＤをシグナル発色のための基質として使用した。結果を４９２ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡをInstitute of Glycomics（Griffith University, Queensland, Australia）において行った。
マウス免疫化
動物実験の詳細な説明が実施例９に記載された。再設計されたＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子を以下の配合物中でAlhydrogel ２％（アラム）（InvivoGen, USA）と配合した。
・プラセボ：アラム単独
・ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子＋ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子＋アラム（この配合物は、各抗原を有する別個のＣＲＭ１９７粒子を含有する）
・ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子＋アラム
１００μｌ中に５０～１００μｇ／投与のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及び２５μｌ／投与のアラムを含有する配合された試験調製物。全ての試料を各大腿部に５０μＬ、１マウス当たり合計で１００μＬをマウスに筋肉内注入した。マウスを３回免疫化した（０、１４及び２８日目）。放血前、中間及び最終血清試料を収集した（０、２１、４２日目）。マウス免疫化をGRIDD（Griffith University, Queensland, Australia）において行った。
抗体反応
様々なＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子で免疫化されたマウスの抗体反応を、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。実験手順を実施例１に示した。ＥＬＩＳＡをGRIDD（Griffith University, Queensland, Australia）において行った。
結果及び説明
エンドトキシンフリーClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ジスルフィド結合形成のための適切な環境ではない。本明細書において、本発明者らは、ＣＲＭ１９７－ＣＯＶＩＤ１９ワクチン産生のための産生宿主としてｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用した。プラスミドｐＭＣＳ６９Ｅは、酵母スルフヒドリルオキシダーゼＥｒｖ１ｐを含有し、これは、細胞質におけるジスルフィド結合されたタンパク質の産生を改善することができる。ｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生された粒子状ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質及びＣＲＭ１９７－Ｓ１を単離し、精製粒子のタンパク質プロファイルを１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにおいて分析した（図３８ｂ）。
Ｓ１は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有し、これは、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の宿主受容体、ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）に直接結合し得る。したがって、ＡＣＥ２－Ｓ１結合は、動物実験前に粒子状ＣＲＭ１９７－Ｓ１の一部としてＳ１の機能性を分析するために行われた。結合結果（図３７）は、ＲＢＤドメインを含有する粒子が、陰性対照、ＣＲＭ１９７粒子及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質と比較した際、より高いＡＣＥ２結合を示すことを実証した。これは、ｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生されたＲＢＤドメインを含有する粒子状ＣＲＭ１９７粒子が適切に折り畳まれる可能性が高いことを示した。Ｓ１タンパク質は、ＲＢＤドメインを含む。
さらに、本発明者らは、ｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生されたＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子が感染及び非感染ヒト血清試料を正確に区別するための診断試薬として機能することができたかどうかも評価した。この実験を単純盲検として行った。Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫは、それぞれＣＲＭ１９７粒子、ＣＲＭ１９７－ＲＢＤ粒子、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子及びＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子を指す。結果は、陽性対照、Ｓ１－ＲＢＤが感染ヒト血清試料と非感染ヒト血清試料とを正確に区別することができるが、陰性対照、ＣＲＭ１９７粒子は、できないことを示した。これは、全ての対照が適切に機能したことを示唆する。選択されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含有するＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、感染されたヒト血清試料を問題なく特定することもできた。全体的に、このＥＬＩＳＡ結果は、ｐＭＣＳ６９Ｅを有するClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生されたＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原粒子がＣＯＶＩＤ１９診断試薬として機能することが可能であり得ることを示した。
配合された粒子調製物の免疫原性を雌Ｃ５７ＢＬ／６において試験した。１群当たり１０匹のマウスが存在していた。５０～１００μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含有する配合された調製物を、各大腿部に５０μＬ、１マウス当たり合計で１００μＬをマウスに筋肉内注入した。このような高い用量は、免疫反応の欠如が低過ぎる用量に起因しないことを確実にするために選択された。この動物実験は、依然として進行中である。様々なＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子で免疫化されたマウスの中間血清試料を分析した（図３８ｃ及び３８ｄ）。結果は、粒子状ＣＲＭ１９７－Ｓ１単独及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質及びＣＲＭ１９７－Ｓ１で免疫化されたマウスからの血清試料が、プラセボ対照又はワクチン接種前血清と比較した際、ＥＬＩＳＡにおいてＮタンパク質又はＳ１に対する総ＩｇＧ及びＩｇＧ１の高い力価を示したことを示す。
様々なＣＲＭ１９７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子で免疫化されたマウスの最終血清試料を分析した（図４３ａ及び４３ｂ）。一般に、最終血清中の総ＩｇＧ及びＩｇＧ１レベル（第３の免疫化後）は、中間血清試料中のもの（第２の免疫化後）より高かった一方、ＩｇＧ２ｃレベルは、最終及び血清試料の間で同様のままであった（図４３、図３８ｃ及び図３８ｄ）。抗Ｎタンパク質抗体の誘導にもかかわらず、ＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質及びＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子の両方で免疫化されたマウスからの最終血清試料中の総ＩｇＧ及びＩｇＧ１レベルは、同じワクチン製剤で免疫化されたマウスから得られた中間血清試料中の総ＩｇＧ及びＩｇＧ１より約３倍高かった（図４３ａ及び図３８ｃ）。興味深いことに、Ｎタンパク質被覆プレートに対するＩｇＧ１の力価は、ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子で免疫化されたマウスからの中間血清試料中のＩｇＧ１レベルと比較した際、ＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子で免疫化されたマウスからの最終血清試料中で低下された（図４３ａ及び図３８ｃ）。これは、Ｎタンパク質エピトープと交差反応性である１回目の追加接種後にＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子で免疫化されたマウスにおいて生成された抗Ｓ１抗体に起因し得る。非特異的抗Ｓ１抗体のレベルは、特異的抗Ｓ１抗体の親和性成熟／セロコンバージョンのため、２回目の追加接種後に低下された。図４３ｂ及び図３８ｄは、混合ＣＲＭ１９７－Ｓ１及びＣＲＭ１９７－Ｎタンパク質粒子又はＣＲＭ１９７－Ｓ１粒子単独で免疫化されたマウスからの血清試料中の総ＩｇＧ及びＩｇＧ１レベルが、中間血清試料から得られる総ＩｇＧ及びＩｇＧ１レベルより約３～５倍高かったことを示す。
実施例１１
ＣＲＭ１９７－Ｑ熱粒子
コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）（Ｃ．バーネッティ（C. burnetti））は、人獣共通感染症Ｑ（「クエリ」）熱の病原因子である。それは、２段階を有する身体機能を奪うインフルエンザ様疾患として発現するグラム陰性細胞内細菌である。急性Ｑ熱は、多くの場合、自己限定性発熱疾患又は肺炎として現れる一方、慢性Ｑ熱は、治療不能である場合がある心内膜炎及び慢性肝炎を合併し得る。伝染は、通常、感染された家畜によって生成された汚染されたエアロゾルを介する。乾燥及び環境委因子に対するその高い安定性及び耐性のため、それは、長期間にわたって環境中で感染性を保ち、カテゴリーＢバイオテロ作用物質とみなされる。
予防は、現在入手可能なワクチン「Q vax」により、これは、Australiaのみで使用が認可されたホルマリン不活性化全細胞ワクチンである。有効及び免疫原性であることが分かっているが、それには、制限及び欠点が付随する。このワクチンは、以前に感作された個体に投与することができず、これは、それが、全細胞調製物中のＬＰＳ成分のため、注射部位における深刻な局部及び全身反応を誘導するためである。結果として、個体は、投与前にコクシエラ属（Coxiella）特異的抗体についてスクリーニングされなければならない。これは、ワクチン接種前スクリーニングの必要なく個体に投与され得る、反応源性が低いが同等に有効なワクチンの必要性を強調する。
Ｃ．バーネッティ（C. burnetti）の細胞内性質のため、Ｔ細胞媒介性免疫は、同種Ｔ細胞によって増幅されるＢ細胞体液性反応とともに病原体をなくすのに主に必要とされる。Ｃ．バーネッティ（C. burnetti）感染の制御におけるＴ細胞の重要な役割は、同種抗原を処理又は提示して、細胞媒介性反応を開始させる、樹状細胞などのＡＰＣの役割とともに、マウスモデルにおいて実証されている。したがって、Ｔ細胞媒介性反応を標的とする免疫優勢エピトープを用いた手法は、Q vaxで現在観察される悪影響を生じるＬＰＳ期変異体を含む全細胞ワクチンの代わりに、トリガーとして使用される病原体の成分とともに、潜在的な免疫原性組成物、特に候補ワクチンとして機能し得る。
Ｃ．バーネッティ（C. burnetti）の免疫優勢抗原を同定し、バイオインフォマティクス分析（Tools for prediction of peptide binding NetMHCcons and NetMHCIIpan; (Andreatta and Nielsen,Bioinformatics Tools for the Prediction of T-Cell Epitopes, Epitope Mapping Protocols, 2018, Volume 1785, ISBN: 978-1-4939-7839-7)）によってマッピングされたこれらの抗原の特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エピトープを潜在的な候補を設計する際に選択した。免疫原性エピトープを含有する
Figure 2022549791000027
のアミノ酸配列を有するＣＯＸと呼ばれる組み換えペプチドは、１０１．１ｋＤａの総サイズを有し、ＣＲＭ１９７プラットフォームに提示されるか又は組み込まれた。
材料及び方法
大腸菌（E. coli)Ｔｏｐ１０及びClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれ分子クローニング及びＣＲＭ粒子産生のために使用した。細菌増殖条件、プラスミド形質転換、ＣＲＭ粒子産生及びＣＲＭ粒子単離及び精製の詳細な説明は、実施例１に記載された。
Ｑ熱抗原ＣＯＸを提示するＣＲＭ１９７の形成のためのプラスミド構築
ＣＯＸをコードする組み換え遺伝子断片を大腸菌（E. coli）細胞についてコドン最適化し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（BioLabs, USA）による酵素消化、続いてGelRed溶液（Biotium, USA）を用いたアガロースゲル電気泳動及びゲル精製（BioLabs, USA）を用いたＤＮＡ断片分離により、ｐＵＣ５７ベクター（Biomatik, Canada）から切り取った。ベクタープラスミドｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。その後の線形化ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７ベクターを、ＣＯＸタンパク質をコードするＤＮＡ断片にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＣＯＸを生成した。最終的なプラスミドＤＮＡ配列をGriffith University genome sequencing centre（Griffith University, Australia）によって確認した。
上に記載されるＱ熱粒子の免疫原性は、Griffith Institute for Drug Discoveryにおいて２０１９年１０月にモルモットにおいて試験される。
結果及び説明
ＣＲＭ１９７粒子ベースのＱ熱粒子を精製し、タンパク質プロファイルを、図３９に示される１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにおいて分析した。ＣＲＭ１９７－ＣＯＸ（１０１．１ｋＤａ）の理論的分子量を有するタンパク質に対応する優勢なタンパク質バンドが存在し、これは、ＣＲＭ１９７－ＣＯＸが非常に産生されたことを示唆している。この結果は、Ｑ熱抗原を提示するためのキャリアプラットフォームとしてのＣＲＭ１９７粒子が産生され得ることを実証した。
実施例１２
粒子状ＣＲＭ１９７－Ｑ熱診断試薬
Ｑ熱の臨床診断は、兆候が特徴的でないため困難であり、レプトスピラ症及びデング熱などの他の疾患と容易に混同され得る。現在の診断プラットフォームは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）及び免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）などの技術を用いた、Ｃ．バーネッティ（C. burnetti）の分子検出及びコクシエラ属（Coxiella）特異的抗体の血清学的検出を含む。
血清学的試験に使用される抗原は、環境由来細菌のものと類似の抗原を含むため、あまり特異的でないことが多い。さらに、市販のキットは、不十分な感度を提供し、実験室間で一貫性が変化する。分子試験は、試薬汚染、偽陽性及びＱ熱の急性期のみでの信頼性という欠点がある。したがって、１つ以上の従来のＱ熱診断方法の代替法を提供する方法が必要とされている。
４つの免疫優勢抗原、すなわち以下に記載されるアミノ酸配列を有するＣｏｍ１、ＯｍｐＨ、ＹｂｇＦ及びＧｒｏＥＬの完全長配列は、ＣＲＭ１９７粒子プラットフォームに個々に提示されるか又は組み込まれた：
Ｃｏｍ１：この試験において使用される野生型Ｃｏｍ１のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2022549791000028
（配列番号６０；ＮＣＢＩ参照配列受託番号ＷＰ＿０１０９５８５３０．１）；
ＯｍｐＨ：野生型ＯｍｐＨタンパク質アミノ酸配列（配列番号７２）に由来する予測免疫優勢Ｂ及びＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を再配列し、この試験において以下のように使用する。
Figure 2022549791000029
配列番号６１における各エピトープ間に五重のグリシンリンカー（ＧＧＧＧＧ）がある。個々のエピトープの配列は、表７に記載される。
アミノ酸配列を有する野生型ＯｍｐＨのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2022549791000030
（配列番号７２；ＮＣＢＩ参照配列受託番号ＮＰ＿８１９６４２．１）。
ＹｂｇＦ：この試験において使用される野生型ＹｂｇＦのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2022549791000031
（配列番号６２；ＮＣＢＩ参照配列受託番号ＷＰ＿０１０９５７３７３．１）
ＧｒｏＥＬ：野生型ＧｒｏＥＬタンパク質アミノ酸配列（配列番号７３）に由来する予測免疫優勢Ｂ及びＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を再配列し、この試験において以下のように使用する。
Figure 2022549791000032
配列番号６３における各エピトープ間に五重のグリシンリンカー（ＧＧＧＧＧ）がある。個々のエピトープの配列は、表７に記載される。
アミノ酸配列を有する野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
Figure 2022549791000033
（配列番号７３；UniProtKB／Swiss-Prot受託番号Ｐ１９４２１．１）。
材料方法
大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０及びClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれ分子クローニング及びＣＲＭ粒子産生のために使用した。細菌増殖条件、プラスミド形質転換、ＣＲＭ粒子産生及びＣＲＭ粒子単離及び精製の詳細な説明は、実施例１に記載された。
Ｑ熱診断抗原を提示するＣＲＭ１９７の形成のためのプラスミド構築
Ｃｏｍ１、ＯｍｐＨ、ＹｂｇＦ及びＧｒｏＥＬをコードする組み換え遺伝子断片を大腸菌（E. coli）細胞についてコドン最適化し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（BioLabs, USA）による酵素消化、続いてGelRed溶液（Biotium, USA）を用いたアガロースゲル電気泳動及びゲル精製（BioLabs, USA）を用いたＤＮＡ断片分離により、ｐＵＣ５７ベクター（Biomatik, Canada）から切り取った。ベクタープラスミドｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。その後の線形化ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７ベクターを、Ｃｏｍ１、ＯｍｐＨ、ＹｂｇＦ及びＧｒｏＥＬタンパク質をコードするＤＮＡ断片にライゲートして、最終的なプラスミド、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－Ｃｏｍ１、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＯｍｐＨ、ｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＹｂｇＦ及びｐＥＴ１４ｂ ＣＲＭ１９７－ＧｒｏＥＬを生成した。最終的なプラスミドＤＮＡ配列をGriffith University genome sequencing centre（Griffith University, Australia）によって確認した。
結果及び説明
ＣＲＭ１９７キャリアＱ熱診断抗原をClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）において産生した。精製Ｑ熱診断試薬のタンパク質プロファイルを１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにおいて分析した（図４０）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＣＲＭ１９７－Ｃｏｍ１（８６．４ｋＤａ）、ＣＲＭ１９７－ＧｒｏＥＬ（８３．１ｋＤａ）、ＣＲＭ１９７－ＯｍｐＨ（８１．５ｋＤａ）及びＣＲＭ１９７－ＹｂｇＦ（９３．０ｋＤａ）の理論的ＭＷを有するタンパク質に対応する高い純度を有する優勢なタンパク質バンドを示した。この結果は、ＣＲＭ１９７粒子ベースのＱ熱診断抗原がClearColi ＢＬ２１（ＤＥ３）によって問題なく産生され得ることを実証した。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が記載される。
本明細書における任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
本明細書全体を通して、いずれか１つの実施形態又は特定の一群の特徴に本発明を限定せずに、本発明の好ましい実施形態を説明することが意図されている。したがって、当業者は、本開示を考慮して、例示される特定の実施形態に対する様々な変更形態及び変形形態が、本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることを理解するであろう。全てのこのような変更形態及び変形形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書に引用される全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許文献、科学文献は、全体が参照により援用される。
本明細書に記載される各実施形態は、特に規定されない限り、あらゆる実施形態に準用されるものとする。
任意の数値又は範囲が本明細書に記載される場合、特に明記されない限り、その数値又は範囲は、概算値である。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に特に示されない限り、その範囲内に含まれる各別個の値を個々に参照する簡単な方法として用いられることが意図され、このような別個の値によって規定される各別個の値及び各別個の部分範囲は、本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
意味が明らかに矛盾しない限り、本明細書に記載される全ての範囲は、端点を含むものとみなされる。
本明細書全体を通して、任意の利点、有望さ、目的などへの言及は、累積的、複合的及び／又は集合的であるとみなされるべきではなく、認めるものとして記載されるのでなく、好ましい又は望ましいものとみなされるべきである。
添付の特許請求の範囲は、上記の明細書に組み込まれるものとみなされるものとする。
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Claims (78)

  1. 作用物質に対する免疫反応を対象において引き起こす方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を前記対象に投与して、それにより前記作用物質に対する前記免疫反応を前記対象において引き起こす工程を含む方法。
  2. 疾患、障害又は病態に対して対象を免疫化する方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を前記対象に投与して、それにより前記疾患、障害又は病態に対して前記対象を免疫化する工程を含む方法。
  3. 対象における疾患、障害又は病態を治療又は予防する方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を前記対象に投与して、それにより前記対象における前記疾患、障害又は病態を治療又は予防する工程を含む方法。
  4. 対象における免疫反応を調節する方法であって、有効量の、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を前記対象に投与して、それにより前記対象における前記免疫反応を調節する工程を含む方法。
  5. 細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を対象に送達する方法であって、細胞に由来する、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子を前記対象に投与して、それにより前記タンパク質粒子を前記対象に送達する工程を含む方法。
  6. 試料中の標的を検出する方法であって、前記試料を、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子と接触させて、それにより前記試料中の前記標的を検出する工程を含む方法。
  7. 細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子と、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤とを含む組成物。
  8. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子は、前記ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列から実質的に形成される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法又は請求項７に記載の組成物。
  9. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子は、前記ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列が前記細胞内で発現されるときに形成される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  10. 前記ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、タンパク質リフォールディング処理に供されたジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来しない、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  11. 前記ジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体である、請求項１０に記載の方法又は組成物。
  12. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子は、実質的に不溶性のタンパク質粒子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  13. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子及び／又は前記実質的に不溶性のタンパク質粒子は、前記細胞の不溶性成分に由来し、前記細胞の前記不溶性成分は、タンパク質リフォールディング処理に供されていない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  14. 前記不溶性成分は、前記細胞において形成される封入体である、請求項１３に記載の方法又は組成物。
  15. 前記ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列は、ＣＲＭ１９７タンパク質、ＣＲＭ４５タンパク質、ＣＲＭ１００１タンパク質、ＣＲＭ２２８タンパク質、ＣＲＭ１７６タンパク質及びＣＲＭ３０タンパク質からなる群から選択されるジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質の若しくはそれに由来するアミノ酸配列又は上記の前記ＣＲＭタンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  16. 前記ジフテリア毒素ＣＲＭタンパク質は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体である、請求項１５に記載の方法又は組成物。
  17. 前記ＣＲＭ１９７タンパク質は、配列番号２、配列番号４９及び／又は配列番号５０のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである、請求項１１又は１６に記載の方法又は組成物。
  18. 配列番号５０である、請求項１７に記載の方法又は組成物。
  19. 前記細胞は、原核細胞又は真核細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  20. 前記細胞は、原核細胞である、請求項１９に記載の方法又は組成物。
  21. 前記原核細胞は、シュードモナス属（Pseudomonas sp）、大腸菌（E. coli）、バチルス属（Bacillus sp）及びラクトコッカス属（Lactococcus sp）並びにそれらの任意の組合せから選択される、請求項１９又は２０に記載の方法又は組成物。
  22. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  23. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子は、ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原をさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  24. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の前記又はそれぞれの免疫原は、免疫原性アミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法又は組成物。
  25. 前記免疫原性アミノ酸配列は、病原体、病原体、癌抗原、自己抗原、移植抗原及びアレルゲンの若しくはそれに由来するタンパク質又は上記のもののいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せの少なくとも１つに由来するか又はそれに対応する、請求項２４に記載の方法又は組成物。
  26. 前記病原体は、ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法又は組成物。
  27. 前記病原体は、ウイルスである、請求項２５又は２６に記載の方法又は組成物。
  28. 前記免疫原性アミノ酸配列は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、非構造タンパク質、構造タンパク質、融合タンパク質及び表面タンパク質からなる群から選択されるウイルスタンパク質又は上記の前記ウイルスタンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応する、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  29. 前記ウイルスは、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）ウイルス、フラビウイルス科（Flaviviridae）ウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルス及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  30. 前記フラビウイルス科（Flaviviridae）ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及び／又はデングウイルスである、請求項２９に記載の方法又は組成物。
  31. 前記免疫原性アミノ酸配列は、コアタンパク質、ＮＳ３タンパク質、Ｅ１及びＥ２タンパク質からなる群から選択されるＨＣＶタンパク質又は上記の前記ＨＣＶタンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応する、請求項３０に記載の方法又は組成物。
  32. ＨＣＶタンパク質に由来するか又はそれに対応する前記免疫原性アミノ酸配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号１０４に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の前記配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである、請求項３０又は３１に記載の方法又は組成物。
  33. 前記免疫原性アミノ酸配列は、エンベロープタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体及び／又はカプシドタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体から選択されるデングウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する、請求項３０に記載の方法又は組成物。
  34. デングウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する前記免疫原性アミノ酸配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４７及び配列番号４８に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の前記配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである、請求項３０又は３３に記載の方法又は組成物。
  35. 前記コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスは、コロナウイルスである、請求項２９に記載の方法又は組成物。
  36. 前記コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスである、請求項３５に記載の方法又は組成物。
  37. 前記ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳコロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）及び／又はＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項３６に記載の方法又は組成物。
  38. 前記ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項３７に記載の方法又は組成物。
  39. コロナウイルス科（Coronaviridae）ウイルスの又はそれに由来する前記免疫原性アミノ酸配列は、構造タンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体に由来するか又はそれに対応する、請求項２９又は３５～３８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  40. 前記構造タンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質又は上記の前記構造タンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法又は組成物。
  41. 前記構造タンパク質は、Ｎタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体及び／又はＳタンパク質又はその断片、変異体若しくは誘導体である、請求項４０に記載の方法又は組成物。
  42. コロナウイルスタンパク質に由来するか又はそれに対応する前記免疫原性アミノ酸配列は、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６４、配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の前記配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  43. 前記病原体は、寄生生物である、請求項２５又は２６に記載の方法又は組成物。
  44. 前記寄生生物は、住血吸虫及び／又はマラリア寄生生物である、請求項４３に記載の方法又は組成物。
  45. 前記住血吸虫は、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）及びビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）並びにそれらの任意の組合せから選択される、請求項４４に記載の方法又は組成物。
  46. 前記マラリア寄生生物は、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）及び卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのプラスモジウム属（Plasmodium spp）である、請求項４４に記載の方法又は組成物。
  47. 前記病原体は、細菌である、請求項２５又は２６に記載の方法又は組成物。
  48. 前記細菌は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）種、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種及び／又はコクシエラ属（Coxiella）種並びにそれらの任意の組合せから選択される、請求項４７に記載の方法又は組成物。
  49. 前記ストレプトコッカス属（Streptococcus）種は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）である、請求項４８に記載の方法又は組成物。
  50. ストレプトコッカス属（Streptococcus）に由来するか又はそれに対応する前記免疫原性酸配列は、Ｍ－タンパク質及び／又は好中球阻害剤タンパク質、又は前記Ｍ－タンパク質若しくは前記好中球阻害剤タンパク質の断片、変異体若しくは誘導体のものであるか又はそれに由来する、請求項４８又は４９に記載の方法又は組成物。
  51. 前記免疫原性酸は、配列番号１７及び／又は配列番号１８に記載されるアミノ酸配列又は上記の前記配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである、請求項５０に記載の方法又は組成物。
  52. 前記マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）である、請求項４８に記載の方法又は組成物。
  53. ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）タンパク質に由来するか又はそれに対応する前記免疫原性アミノ酸配列は、Ａｇ８５Ｂ抗原、ＴＢ１０．４抗原及び／又はｒｖ２６６０ｃタンパク質からなる群から選択されるマイコバクテリウム属（Mycobacterium）タンパク質又は上記の前記ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）タンパク質のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せに由来するか又はそれに対応する、請求項５２に記載の方法又は組成物。
  54. ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び／又はウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）に由来するか又はそれに対応する前記免疫原性アミノ酸配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の前記配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである、請求項５２又は５３に記載の方法又は組成物。
  55. 前記コクシエラ属（Coxiella）種は、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）である、請求項４８に記載の方法又は組成物。
  56. コクシエラ属（Coxiella）種に由来するか又はそれに対応する前記免疫原性酸配列は、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４～１００に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記の前記配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体並びにそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、それから本質的になるか又はそれである、請求項４８又は５５に記載の方法又は組成物。
  57. 前記ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列及びジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列以外の１つ以上の免疫原の又はそれに由来する前記免疫原性アミノ酸配列は、キメラタンパク質に対応するキメラである、請求項２４～５６のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  58. 前記キメラは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及び配列番号１０１のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列又は上記の前記配列のいずれか１つの断片、変異体若しくは誘導体を含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなり得るか又はそれである、請求項５７に記載の方法又は組成物。
  59. ジフテリア毒素ＣＲＭアミノ酸配列を含む前記タンパク質粒子は、前記キメラタンパク質から又はその発現から実質的に形成される、請求項５７又は５８に記載の方法又は組成物。
  60. タンパク質粒子は、自己集合によって形成される、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  61. 免疫反応又は免疫反応の１つ以上の要素を検出するためのものである、請求項６又は８～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記免疫反応は、病原体に対するものであるか又はそれに関連する、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記試料は、痰、血液、皮膚、血漿、血清、唾液、上皮組織、鼻腔内組織若しくは細胞、口腔咽頭組織若しくは細胞又はそれらの成分に由来する試験試料であるか又はそれを含む、請求項６又は８～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. インビトロで行われる、請求項６又は８～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 医薬組成物である、請求項７～６０のいずれか一項に記載の組成物。
  66. 免疫原性組成物である、請求項７～６０又は６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. 前記免疫原性組成物は、免疫治療用組成物である、請求項６６に記載の組成物。
  68. ワクチンである、請求項６７に記載の組成物。
  69. 請求項１～６又は８～６４のいずれか一項に記載の方法に従って使用するためのものである、請求項７～６０又は６５～６８のいずれか一項に記載の組成物。
  70. 細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子又は請求項７～６０若しくは６５～６９のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、（ｉ）作用物質に対する免疫反応を対象において引き起こすか；又は（ｉｉ）疾患、障害若しくは病態に対して対象を免疫化するか；又は（ｉｉｉ）対象における疾患、障害若しくは病態を治療若しくは予防するか；又は（ｉｖ）対象における免疫反応を調節するか；又は（ｖ）前記タンパク質粒子を対象に送達するための薬剤の製造における使用。
  71. 防御免疫反応を引き起こすか又は防御免疫反応である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法若しくは組成物又は請求項７０に記載の使用。
  72. 前記対象は、哺乳動物である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法若しくは組成物又は請求項７０若しくは７１に記載の使用。
  73. 前記哺乳動物は、ヒトである、請求項７２に記載の方法又は組成物。
  74. 前記作用物質又は前記疾患、障害若しくは病態は、癌に関連し、及び／又は病原体によって引き起こされる、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法、又は組成物、又は使用。
  75. 前記病原体は、ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌並びにそれらの組合せからなる群から選択され得る、請求項７４に記載の方法、又は組成物、又は使用。
  76. 前記癌は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌及び黒色腫からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法、又は組成物、又は使用。
  77. 請求項１～６０のいずれか一項に記載の、細胞に由来する、ジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ）アミノ酸配列を含むタンパク質粒子を含むキット。
  78. 請求項６、８～６４又は７１～７６のいずれか一項に記載の方法に従って使用するためのものである、請求項７７に記載のキット。
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