JP2023539460A - 薬剤と野生型膜透過ペプチド誘導体の組成物 - Google Patents

薬剤と野生型膜透過ペプチド誘導体の組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2023539460A
JP2023539460A JP2023512007A JP2023512007A JP2023539460A JP 2023539460 A JP2023539460 A JP 2023539460A JP 2023512007 A JP2023512007 A JP 2023512007A JP 2023512007 A JP2023512007 A JP 2023512007A JP 2023539460 A JP2023539460 A JP 2023539460A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
composition
ranibizumab
drug
eye diseases
wild
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023512007A
Other languages
English (en)
Inventor
ガン ウェイ
クァン ジャン
ベンジャミン タク クウォン リー
ヤンフェン ワン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Original Assignee
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University filed Critical Fudan University
Publication of JP2023539460A publication Critical patent/JP2023539460A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43577—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies
    • C07K14/43581—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies from Drosophila
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Figure 2023539460000001
本発明は製薬分野に属し、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤とを含む組成物に関するものである。前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎを用いて設計した親油性誘導体であり、生理ｐＨ条件下で分子全体が正電荷を有する。本発明の前記組成物は眼部投与システムとして、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤を点眼という方式により吸収して眼後段に到達させる。これにより、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤の眼部送達を実現するための新たな方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は薬剤調製分野に属し、眼部疾病治療用組成物に関するものであり、より具体的には、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤とを含む組成物に関するものである。
膜透過ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰｓ）は生理ｐＨ条件下で正電荷を有する短いペプチドであり、それを通じて、共有結合または非共有結合によって接続された分子または投与システム（例えば、リポソーム、ナノ粒子、ミセル等）が細胞に入ることができる（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１９，３０９： １０６－１２４）。
野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は、生理ｐＨ条件下で正電荷を有するという野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの特性が残されているため、従来技術では、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は静電相互作用を通じて生理ｐＨ条件下で負電荷を有する薬剤と結合し、眼内送達を実現すると考えられている。即ち、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は、生理ｐＨ条件下で負電荷を有する遺伝子、ポリペプチドや蛋白質等の生体高分子薬剤と静電相互作用を通じて自己組織化によりナノ複合物を形成する、またはポリマーが存在する状態で生理ｐＨ条件下で負電荷を有する遺伝子、ポリペプチドや蛋白質等の生体高分子薬剤と自己組織化によりナノ複合物を形成することができ、上述生物高分子薬剤の眼内送達を実現する。例えば中国特許出願ＣＮ１０８９７６２８８（Ａ）を参照されたい。
しかし、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤は野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と同様に正電荷を有するため、上述のような方式で眼内薬剤の送達を行うことはできないと一般に考えられている。従って、従来技術では、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤の眼内吸収を如何にして促進し、前記薬剤の眼内送達を実現するかという課題を早急に解決する必要がある。
本発明の目的は、人工的に改造された膜透過ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰｓ）と薬剤の組成物を提供することである。
そのために、本発明は眼部疾病治療用組成物を提供する。当該組成物は、
（ｉ）生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤と
（ｉｉ）野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と
を含み、
前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は下記アミノ酸配列を有し、
ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ
ただし、Ｘ１、Ｘ２とＸ３は疎水性アミノ酸を表し、天然由来のアミノ酸であるアラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）、イソロイシン（ｌｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）、非天然由来のアミノ酸であるα－アミノ酪酸（α－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノ吉草酸（α－ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノカプロン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノヘプタン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、およびそれらの組合せから選択する。
本発明に記載の前記眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記組成物が溶液または懸濁液である。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは、Ｘ１、Ｘ２とＸ３が疎水性アミノ酸を表し、Ｘ１、Ｘ２とＸ３のうち少なくとも２つは、天然由来のアミノ酸であるアラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）、イソロイシン（ｌｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）、非天然由来のアミノ酸であるα－アミノ酪酸（α－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノ吉草酸（α－ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノカプロン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノヘプタン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、およびそれらの組合せから選択する。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくはＸ１、Ｘ２またはＸ３がトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）である。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくはＸ１、Ｘ２またはＸ３のうち少なくとも２つがトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）である。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体のアミノ酸配列が以下の通りである。
ＲＷＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ
ＲＱＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫ
ＲＱＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫ
ＲＷＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫ
ＲＷＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫ
ＲＱＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ
ＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体のアミノ酸配列が以下の通りである。
ＲＷＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫＫ
ＲＷＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫＫ
ＲＱＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫＫ
ＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記薬剤がポリペプチドまたは蛋白類薬剤である。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記薬剤が、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、オクリプラスミン（Ｏｃｒｉｐｌａｓｍｉｎ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ＮＩＳＴモノクローナル抗体（ＮＩＳＴｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）のうちの１つまたは複数から選択される。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記薬剤が、ナノ抗体、ラニビズマブ、アフリベルセプト、オクリプラスミン、ベバシズマブとセツキシマブのうちの１つまたは複数から選択される。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記薬剤が、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ベバシズマブのうちの１つまたは複数から選択される。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは前記ナノ抗体が、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ボルバリビズマブ（Ｖｏｂａｒｉｌｉｚｕｍａｂ）のうちの１つまたは複数から選択される。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、好ましくは野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率がモル比で０．１：１～５０：１である。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、より好ましくは野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率がモル比で０．５：１～３５：１である。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、より好ましくは野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率がモル比で１：１～２０：１である。
本発明に記載の眼部疾病治療用組成物は、最も好ましくは野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率がモル比で３：１～１５：１である。
本発明は必要な被験者のために眼部疾病を治療する方法をさらに提供し、前記方法は、治療有効量の本発明に記載の眼部疾病治療用組成物を投与することを含む。
本発明に記載の方法に関して、前記方法は、治療有効量の本発明に記載の組成物を患者に点眼投与することを含むことが好ましい。
本発明は、眼部疾病治療用薬剤を調製するための前記組成物の使用をさらに提供する。
合成したポリペプチドの質量スペクトルと液相スペクトラムを示す。 ２８ＷＰがナノ抗体の人角膜上皮細胞での摂取を促進するフローサイトメトリースペクトル（左）および平均蛍光強度比較（右）を示す。 異なる比率の８９ＷＰ／ナノ抗体組成物の人網膜色素上皮細胞における摂取を示す。 異なるモル比の条件下で、２９ＷＰはオクリプラスミンの人網膜色素上皮細胞での摂取を促進する。 異なるモル比の条件下で、２８９ＷＰはセツキシマブの人角膜上皮細胞での摂取を促進する。 異なるモル比の条件下でのポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞摂取定量評価を示す。 異なるモル比の条件下でのポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞摂取定量評価を示す。 異なるポリペプチドが調製するポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞摂取定量評価を示す。 ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の人角膜上皮細胞での同時摂取行為を示す。 ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の人網膜色素上皮細胞での同時摂取行為を示す。 ポリペプチド／ラニビズマブ組成物点眼液の細胞摂取メカニズムを示す。 ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の点眼投与１ｈ後のウサギ体内各組織（血漿、房水、ガラス体、網膜）のラニビズマブ濃度を示す。 ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の点眼投与後のラニビズマブウサギ体内濃度分布の変化を示す。 ポリペプチド／アフリベルセプト組成物の点眼投与後のアフリベルセプトのウサギ体内濃度の分布を示す。
一般的な点眼剤は結膜嚢内の滞留時間が短いうえ吸収効果が悪く、特に遺伝子、ポリペプチドや蛋白質等の生体高分子薬剤は、局所的な点眼投与をしても眼部の生物利用度が極めて低く、ほぼ眼の後段に到達できない。眼内注射剤や眼内インプラントは生物利用度が高いが、患者の順応性が悪く、重い合併症を引き起こしやすい。
従来技術における上記欠点を解決するために、本発明は、人工的に改造した膜透過ペプチドを眼部吸収促進剤とする。これは非外傷性経路を通じて点眼投与が可能であり、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤を非共有結合を通じて眼内に送達することができる。前記膜透過ペプチドは生理ｐＨ条件下で正電荷を有する短いペプチドであり、前記薬剤も生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤である。前記生理ｐＨ条件下で正電荷を有する膜透過ペプチド及び前記生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤の組成物が細胞の摂取を顕著に促進できることを出願人は意外にも発見した。生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤のみを使用する場合との比較において、前記組成物は細胞摂取を顕著に増加させる。
本発明は、（ｉ）生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤と、（ｉｉ）野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体とを含む眼部疾病治療用組成物を提供する。前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は、天然由来の膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎに基づきアミノ酸突然変異の方法を用い、眼組織透過性が良く生物安全性が高い一連のポリペプチド誘導体を設計、調製し、非外傷性経路によりこれと混合した生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤を眼内へ送達できる。本発明の組成物によれば、前記生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤に眼部の吸収障壁を効率的に透過させることができ、薬剤が眼内に入って眼の後段部位に到達するように促し、ひいては生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤の眼部生物利用度を向上させることができる。
前記野生型ポリペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ
野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの眼組織への透過能力は分子の疎水性の向上にしたがって改善される。したがって、本発明に記載のｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体は、野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの基本的なアミノ酸配列を変えずに保持する前提において、アミノ酸突然変異技術を使用して疎水性アミノ酸をその分子に導入することで、得られたｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体の眼組織透過能力を向上させるというものである。
具体的に言えば、本発明は野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎを基に、元来のアルカリ性アミノ酸であるアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｒ）、リジン（ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）および元来の疎水性アミノ酸であるイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）の配列を変えずに保持し、ポリペプチド固相合成技術を用いてｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ分子における親水性アミノ酸であるグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）とアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）を疎水性アミノ酸に置き換えることにより、一連のポリペプチド誘導体を得るものである。
前記ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体は野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの異なる親水性アミノ酸（グルタミンとアスパラギン）部位を異なる疎水性アミノ酸で置き換えることを特徴とする。前記疎水性アミノ酸は天然由来のアミノ酸であるアラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）、イソロイシン（ｌｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）、非天然由来のアミノ酸であるα－アミノ酪酸（α－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノ吉草酸（α－ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノカプロン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノヘプタン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）等、およびそれらの組成物から選択する。
野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎを基に構造を改造して得たポリペプチド誘導体のアミノ酸配列は、表１の通りである。ここで変異したアミノ酸は下線で示した。なお、この表は非天然アミノ酸突然変異の実例を示しておらず、異なる疎水性アミノ酸の組み合わせ変異に関しては代表的な実例を示すにとどめた。
ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体は、眼組織に対する透過能力が疎水性（親油性）と相関性を持ち、疎水性（親油性）が強いほどｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体の眼組織に対する透過能力も強くなるため、他の疎水性アミノ酸を用いて調製したｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体も高い眼部吸収促進効果を得るはずである。
本発明に記載のｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体を安全性の観点から眼部における応用が極めて少ない小分子吸収促進剤と比較すると、このようなポリペプチド類の吸収促進剤は分解しやすく生物安全性が高いと言える。また、ポリペプチド類の吸収促進剤は異なる応用目標を実現するための修飾や改造がしやすい。それに加え、本発明に記載のｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体は天然由来の野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎよりも強い眼部吸収促進能力を有する。
Figure 2023539460000002
本分野において、等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ，ｐＩ）とは蛋白質やポリペプチドといった分子の実効電荷がゼロとなるｐＨ値を指す。例えば、文献Ｋｅｎｔａｒｏ Ｔｏｍｉｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１９，２： ２８－３３．（ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－８０９６３３－８．２０２６６－５）を参照されたい。両性イオンが有する電荷は溶液のｐＨ値が異なれば変わるため、両性イオンの正負電荷値が等しいとき、溶液のｐＨ値がその等電点となる。本発明において、生理的ｐＨ条件下で正電荷を有する前記薬剤とは等電点が７．４５を超える薬剤であり、例えばポリペプチドや蛋白質薬剤である。
本分野において、生理ｐＨ条件とは、生理状態において人体のｐＨ範囲が７．３５～７．４５であり、平均値が７．４０であるということを指す。人体における血液のｐＨ値は７．４±０．０３という狭い範囲に維持されている。例えば、文献Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｅ，Ｓｈａｒｍａ Ｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｃｉｄ Ｂａｓｅ Ｂａｌａｎｃｅ．Ｉｎ： ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ； Ｔｒｅａｓｕｒｅ Ｉｓｌａｎｄ （ＦＬ）： Ｊｕｎ １６，２０１９．ＰＭＩＤ： ２９９３９５８４およびＭｅｌｖｉｎ Ｅ．Ｌａｓｋｉ，Ｎｅｉｌ Ａ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ．Ａｃｉｄ－ｂａｓｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｄｉｓｅａｓｅ－ａ－Ｍｏｎｔｈ．１９９６，４２（２）： ５９－１２５を参照されたい。本発明における薬剤の等電点は生理状態における人体のｐＨ範囲より高いため、前記生理ｐＨ条件下で前記薬剤は正電荷を有する。
Figure 2023539460000003
本発明組成物は以下の方法で得られる。
即ち、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と生理ｐＨ条件下で正電荷を有するポリペプチドまたは蛋白質薬剤を物理的に混合して調製するという方法である。
本発明者は、物理的混合により得られる本発明の組成物が眼内での蛋白質薬剤の吸収を促進することを見出した。本発明者は細胞摂取実験により、本発明の組成物の体外での細胞摂取促進効果を比較した。その結果、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体と生理ｐＨ条件下で正電荷を有する蛋白質薬剤のモル比が０．１：１～５０の範囲内である組成物は、眼内において蛋白質薬剤の良好な吸収が得られるということが示されている。またｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体では、二重変異（２８ＷＰ、２９ＷＰ、８９ＷＰ）及び三重変異（２８９ＷＰ）の誘導体の吸収促進効果がより良い。
前記生理ｐＨ条件下で正電荷を有する蛋白薬剤はラニビズマブ（等電点８．８）、ベバシズマブ（等電点８．８）、アフリベルセプト（等電点８．２）を含む。前記組成物は特にモル比５：１～３５：１の範囲に最良の吸収促進効果を有する。
ナノ抗体は新しくユニークな抗原結合フラグメントであり、アルパカ血清に天然に存在する重鎖抗体から取得する。ナノ抗体はアルパカの重鎖抗体に由来する、組み換えられた単一ドメインの可変フラグメントであり、特定の抗原と選択的に結合することができる。文献Ｊｏｖcｅｖｓｋａ Ｉ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０２０，３４：１１－２６；Ｒｕｂｅｌ Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，Ｓｈｒｅｙａ Ｇｏｅｌ，Ｗｅｉｂｏ Ｃａｉ．Ｎａｎｏｂｏｄｙ： Ｔｈｅ “Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ” ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ？ Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０１４； ４（４）： ３８６－３９８を参照されたい。
汎用のナノ抗体としては、Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ（一般名ＡＬＸ ０６８１またはＡＬＸ－００８１、商品名Ｃａｂｌｉｖｉ、分子量２８ｋＤａ、等電点９．２）、Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ（一般名ＡＴＮ－１０３、分子量３８ｋＤａ、等電点８．８）、Ｖｏｂａｒｉｌｉｚｕｍａｂ（一般名ＡＬＸ－００６１、分子量２６ｋＤａ、等電点８．７）がある。
本発明は、前記組成物を点眼投与することにより、ナノ抗体を眼内（眼の前段の角膜と眼の後段の網膜を含む）に送達できることがマウス体内で証明されている。ナノ抗体を単独で使用した場合、ほぼ吸収されない。
具体的には、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体８９ＷＰを含まずナノ抗体のみを含む薬物との比較において、８９ＷＰとナノ抗体を含み、かつ両者のモル比が５：１～５０：１である組成物の細胞摂取は顕著に増加し、同モル比が１０：１～１５：１である場合に最適な摂取促進効果が得られる。図３に示したように、８９ＷＰとナノ抗体の比率（８９ＷＰ：ナノ抗体）がそれぞれ５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１である組成物を比較したところ、８９ＷＰ：ナノ抗体がそれぞれ１０：１と１５：１である組成物が最も多くの細胞摂取を得た。
同様に、８９ＷＰ及びラニビズマブを含む組成物を飼育ウサギに点眼投与することにより、前記組成物を介してウサギ体内でラニビズマブを眼内（眼の後段の網膜及びガラス体を含む）に送達できることも証明されている。効果は対照Ｒ８より顕著に優れている。
ここでＲ８は８ポリアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｒ）の略称であり、従来に用いられる人工合成膜透過ペプチドである。ある文献では、Ｒ８の同族体である６ポリアルギニン（Ｒ６）を用いて、ラニビズマブとベバシズマブを点眼投与によりマウス眼内に送達することが掲載されている。例えばＩｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１７； ５８（５）： ２５７８－２５９０．ｄｏｉ： １０．１１６７／ｉｏｖｓ．１６－２００７２を参照されたい。また、Ｒ８はＲ６よりも高い吸収促進効果があると掲載する文献もある。例えばＪ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７；１１８（２）： １７７－８４．ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２００６．１２．０２２を参照されたい。
本発明において発明者は、Ｒ８を対照として本発明の効果がＲ８より優れていることを証明し、即ち、本発明が文献中のＲ６より優れた技術効果を得ていることを証明する。８９ＷＰを加えなければ吸収されない。
具体的には、細胞摂取実験を用いて体外で野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体（Ｒ６（６ポリアルギニン）、野生型Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、２ＷＰ、８ＷＰ、９ＷＰ、２８ＷＰ、２９ＷＰ、８９ＷＰ、２８９ＷＰ）とラニビズマブの組成物をスクリーニングし、モル比を１０：１に設定し、２種類の異なる細胞を使用した。その結果、２９ＷＰ、２８９ＷＰの効果が最も優れ、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体を含まずラニビズマブのみを含む組成物との比較において細胞摂取が顕著に増加していた。
文献記載（例えばＩｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１７； ５８（５）： ２５７８－２５９０．ｄｏｉ： １０．１１６７／ｉｏｖｓ．１６－２００７２を参照。点眼投薬を通し、６ポリアルギニン（Ｒ６）がラニビズマブとベバシズマブをマウス眼内へ送達する）における吸収促進作用を有するポリペプチドＲ６とラニビズマブを含む組成物（Ｒ６：ラニビズマブの比率と野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体：ラニビズマブの比率は同一）との比較や、野生型Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎとラニビズマブを含む組成物（野生型Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ：ラニビズマブの比率と野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体：ラニビズマブの比率は同一）との比較において、細胞摂取が顕著に増加している。図６に示したように、細胞摂取はそれぞれ１３．５、１４．７倍増加した。
また、細胞摂取実験を用いて体外で８９ＷＰとラニビズマブを含む組成物をスクリーニングし、３種類の異なる細胞を使用し、両者のモル比変化範囲を５：１～１８：１としたところ、８９ＷＰを含まずラニビズマブのみを含む組成物との比較において、細胞摂取は顕著に増加した。文献記載における吸収促進作用のあるポリペプチドＲ８とラニビズマブを含む組成物（Ｒ８：ラニビズマブの比率は５：１～３０：１で、８９ＷＰ：ラニビズマブの比率より高い）との比較においても、細胞摂取は顕著に増加した。図４及び図５に示したように細胞摂取は２．２～６．７倍増加した。
さらに、細胞摂取実験を用いて体外で２８９ＷＰとラニビズマブを含む組成物をスクリーニングし、２種類の異なる細胞を使用したところ、２８９ＷＰとラニビズマブが組成物（モル比１０：１）になった後、両者は同時に細胞に摂取されたことが明らかになった。
このほか、細胞摂取実験を用いて体外で２９ＷＰ、２８９ＷＰとラニビズマブを含む組成物をスクリーニングし、それぞれ２９ＷＰ、２８９ＷＰを用いてラニビズマブとの複合体（モル比１０：１）を形成したところ、飼育ウサギの体内で点眼投与によりラニビズマブを眼内（眼前段の房水、眼後段の網膜とガラス体を含む）に送達できた。野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体を加えなければ、ラニビズマブはほぼ吸収されない。このように、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は生理ｐＨ条件下で正電荷を有するラニビズマブとの間で相互作用を生み、また野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体はラニビズマブを眼内に持ち込むことができるということを発明者は意外にも発見した。また、細胞摂取実験を用いて体内で２８９ＷＰとアフリベルセプトを含む組成物をスクリーニングし、２８９ＷＰを用いてアフリベルセプトとの組成物（モル比１０：１）を形成したところ、点眼投与によりアフリベルセプトを眼内（眼前段の房水、眼後段の網膜とガラス体を含む）に送達できることが飼育ウサギの体内で証明された。野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体を加えなければ、アフリベルセプトはほぼ吸収されない。
本発明の組成物によれば予測外の技術効果が得られる。具体的に言えば、本発明の組成物におけるｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体は、生理ｐＨ条件下で正電荷を有するという野生型ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの特性を保持しており、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤と非共有結合で組成物を形成させたところ、上記薬剤のより好ましい眼内送達を思いがけず実現した。
例えば、マウス体内に前記組成物を投与することで、本発明は点眼投与によりナノ抗体等の薬剤を眼内（眼前段の角膜と眼後段の網膜を含む）に送達できることを証明した。またウサギ体内に前記組成物を投与することにより、本発明は点眼投与によりラニビズマブやアフリベルセプト等の薬剤を眼内（眼前段と眼後段の網膜を含む）に送達できることを証明した。当該薬剤のみを投与し、前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体を含まない場合、このような送達効果を得ることはできない。
以下では本発明の具体的な実施例に基づき本発明について説明するが、これはその請求の範囲を制限するものではない。
実施例１．野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体の合成、精製及び特性評価
固相合成技術を用いてポリペプチド合成を行う。ポリペプチド配列は表３の通りである。
調製液を凍結乾燥した後の粗物を精製する。Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ ＢＥＨ１３０ Ｐｒｅｐ Ｃ１８カラム（１９×２５０ｍｍ，１０μｍ）を使用した。凍結乾燥後、引き続いて純度及び分子量の測定を行う。
Figure 2023539460000004
高速液体クロマトグラフィを用いてポリペプチドの純度を考察した。クロマトグラムの条件は以下の通りである。
カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａカラム（４．６×１５０ｍｍ，５μｍ）
カラム温度：２０℃
流動相：Ａ相は純水（０．１％ＴＦＡを含む）、Ｂ相はアセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）、野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体の溶出モードは５～６５％Ｂ，３０ｍｉｎ、ポリペプチドＲ６の溶出モードは２～３２％Ｂ，３０ｍｉｎ。
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２１４ｎｍ
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を用いてポリペプチドの分子量を考察した。測定条件は以下の通り。
流動相：メタノール：純水：ギ酸＝８０：１９．９：０．１
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
キャピラリー電圧：３０００Ｖ
乾燥気体温度及び流速：３５０℃、１２Ｌ／ｍｉｎ
ポリペプチドの純度及び分子量は表４、具体的なスペクトル情報は図１を参照されたい。ポリペプチド液相の純度はすべて９５％以上であり、分子量も正確であるため、後続の実験に用いることができる。
Figure 2023539460000005
実施例２．ポリペプチドによる眼部細胞へのナノ抗体の摂取促進
適量のナノ抗体（等電点９．６、分子量１３ｋＤ）を１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３溶液に溶解し、蛍光標識試薬Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５－ＮＨＳを加え、４℃条件下で撹拌して一晩反応させ、４℃の純水で透析したのち凍結乾燥させることにより、蛍光プローブＣｙ５で標識されたナノ抗体を得た。
ポリペプチド２８ＷＰとＣｙ５で標識されたナノ抗体をそれぞれリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、濃度１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に溶解し、２８ＷＰ溶液とＣｙ５で標識されたナノ抗体溶液をモル比５：１で混合し、室温条件下で２４ｈ放置し、２８ＷＰとナノ抗体の組成物を得た。
成長状態が良好である人角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）を採取し、１×１０４細胞／ウェルを２４ウェルプレートに敷いて２４ｈ培養後、培養液を捨て、２８ＷＰとナノ抗体の組成物（Ｃｙ５で標識されたナノ抗体の濃度は１μＭ）を加え、３７℃で２ｈ培養し、薬液を捨て、１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含む）で３回洗浄し、細胞を収集し、１０ｍＭ ＰＢＳに再び懸濁させ、フローサイトメトリーで検査を行った。
図２から見て取れるように、遊離のナノ抗体自体は人角膜上皮細胞に摂取されにくいが、ポリペプチド２８ＷＰとナノ抗体で形成された組成物は細胞培養後、ナノ抗体の細胞摂取が顕著に改善され、遊離のナノ抗体の細胞摂取に比較して１９．４倍に増加している。
実施例３．異なる比率のポリペプチド／ナノ抗体の組成物の細胞摂取
表５のような比率で８９ＷＰ／ナノ抗体の点眼液を調製し、４℃で一晩培養し、実験用とした。
Figure 2023539460000006
ＡＲＰＥ－１９細胞を２４ウェルプレートに敷き、２４ｈ以上培養した。培養液を捨て、ウェルごとに２００μＬの薬液及び３００μＬの無血清培養液を加え、２ｈ培養した後、薬液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞を消化させてＰＢＳに再び懸濁させ、Ｃｙ５蛍光信号（Ｅｘ ６４５ｎｍ、Ｅｍ ６６５ｎｍ）をフローサイトメトリーで測定した。
８９ＷＰとナノ抗体のモル比５：１～５０：１条件での細胞摂取は図３の通りである。
図３は、異なる比率の８９ＷＰ／ナノ抗体の組成物のＡＲＰＥ－１９細胞における摂取を示している。ここで、８９ＷＰとナノ抗体のモル比はそれぞれ５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１である。
結果によれば、この比率の範囲で８９ＷＰはナノ抗体の細胞摂取を顕著に促進することができ、モル比１０：１～３０：１の範囲での摂取促進効果が比較的に良い。従って、８９ＷＰとナノ抗体のモル比は好ましく５：１～３５：１であり、さらに好ましくは１０：１～３０：１である。
実施例４．ポリペプチドによる眼部細胞へのオクリプラスミンの摂取促進
ポリペプチド２９ＷＰとＣｙ５で標記されたオクリプラスミン（Ｏｃｒｉｐｌａｓｍｉｎ、等電点７．７、分子量２７ｋＤ）をクエン酸緩衝液（濃度０．５３ｍｇ／ｍＬ）にそれぞれ溶解し、２９ＷＰ溶液とＣｙ５で標識されたオクリプラスミン溶液をそれぞれモル比０．１：１、０．３：１、０．５：１、０．７：１、０．９：１、１：１で混合し、室温条件下で２４ｈ放置し、２９ＷＰとオクリプラスミンの組成物を得た。
そして、成長状態が良好である人網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）を採取し、１×１０４細胞／ウェルを２４ウェルプレートに敷いて２４ｈ培養した後、培養液を捨て、異なるモル比の２９ＷＰとオクリプラスミンを含む組成物（Ｃｙ５で標識されたオクリプラスミンの濃度は１μＭ）を加え、３７℃で２ｈ培養し、薬液を捨て、１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含む）で３回洗浄し、細胞を収集し、１０ｍＭ ＰＢＳに再び懸濁させ、フローサイトメトリーで検出を行った。
図４から見て取れるように、モル比０．１：１～１：１の条件下でポリペプチド２９ＷＰとオクリプラスミンにより形成された組成物は、人網膜色素上皮細胞へのオクリプラスミンの摂取を７～２１倍増加させることができた。
実施例５．ポリペプチドによる眼部細胞へのセツキシマブの摂取促進
ポリペプチド２８９ＷＰとＣｙ５で標記されたセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、等電点８．８、分子量１５２ｋＤ）をそれぞれリン酸緩衝液（ＰＢＳ、濃度１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に溶解し、２８９ＷＰ溶液とＣｙ５で標記されたセツキシマブ溶液をそれぞれモル比０．５：１、０．７：１、１：１、３：１、５：１、７：１、１０：１で混合し、室温条件下で２４ｈ放置し、２８９ＷＰとセツキシマブの組成物を得た。
そして、成長状態が良好である人角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）を採取し、１×１０４細胞／ウェルを２４ウェルプレートに敷いて２４ｈ培養した後、培養液を捨て、異なるモル比の２８９ＷＰとセツキシマブを含む組成物（Ｃｙ５で標識されたセツキシマブの濃度は１μＭ）を加え、３７℃で２ｈ培養し、薬液を捨て、１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含む）で３回洗浄し、細胞を収集し、１０ｍＭ ＰＢＳに再び懸濁させ、フローサイトメトリーで検出を行った。
図５から分かるように、モル比０．５：１～１０：１の条件下でポリペプチド２８９ＷＰとセツキシマブによって形成された組成物は、人角膜上皮細胞へのセツキシマブの摂取を１２～３２倍増加させることができた。
実施例６．異なる比率のポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞摂取
まず、ラニビズマブに対して蛍光標識を行う。一定量のラニビズマブ注射液を採取し、４℃の純水で３日間透析して脱塩し（分画分子量１０ｋＤ）、凍結乾燥後５ｍｇを取り、１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３溶液に再溶解し、０．１２ｍｇの蛍光標識試薬Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５－ＮＨＳを加え、４℃条件下で撹拌して一晩反応させ、４℃純水の中で３日間透析した後に凍結乾燥させることにより、蛍光で標識されたラニビズマブ（Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）を得た。
次いで、ポリペプチド／ラニビズマブの組成物を調製した。適量のポリペプチドを秤量し、一定体積の市販ラニビズマブ注射剤で溶解し、さらに等体積の市販ラニビズマブ注射液溶剤を加え、４℃で保存して実験用とした。
そして、異なるポリペプチド／ラニビズマブ組成物の摂取効果を評価した。成長状態が良好であるＨＣＥＣ、ＡＲＰＥ－１９及びＨＵＶＥＣ細胞を採取し、１×１０４細胞／ウェルでそれぞれ２４ウェルプレートに敷いて２４ｈ培養した後、培養液を捨て、異なるポリペプチド／Ｃｙ５－Ｒａｎｉ組成物の混合物溶液（いずれもＣｙ５－Ｒａｎｉ １ μＭを含む）を加え、３７℃で２ｈ培養し、薬液を捨て、１０ｍＭ ＰＢＳ（ヘパリンナトリウム０．０２ｍｇ／ｍＬを含む）で３回洗浄し、細胞を収集し、１０ ｍＭ ＰＢＳに再び懸濁させ、フローサイトメトリーで陽性細胞率と平均蛍光強度を測定した。測定チャンネルの励起波長は６３８ｎｍ、放射波長は６６０ｎｍとした。
異なるモル比条件下でポリペプチドを介して抗体細胞の摂取結果は以下の通りである。眼部透過能が強いポリペプチド８９ＷＰとＣｙ５で標識されたポリペプチド（Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）を異なるモル比で混合した後、細胞摂取行為を考察すると、図６、７のような結果が得られた。
図６は異なるモル比条件下でポリペプチドを介してラニビズマブ細胞摂取の定量評価である。具体的に、一定量のポリペプチドを採取し、異なるモル比（８９ＷＰ／Ｒａｎｉは１：１，３：１，５：１，７：１，１０：１； Ｒ８／Ｒａｎｉは５：１，１５：１，３０：１）でＣｙ５で標識されたラニビズマブ１μＭと混合し、４℃で２４ｈ培養し、そして、異なる細胞と共に３７℃の条件下で２ｈ培養した。それに対し、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定により有意性分析を行い、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定で補正した（ｎ＝３，ｎｓｐ＞０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１、遊離のラニビズマブと比較する）。
図７は異なるモル比条件下でポリペプチドを介してラニビズマブ細胞摂取の定量評価である。具体的に、一定量のポリペプチド８９ＷＰを採取し、異なるモル比（５：１，７：１，１０：１，１２：１，１５：１，１８：１）でＣｙ５で標記されたラニビズマブ１μＭと混合し、４℃で２４ｈ培養し、そして、異なる細胞と共に３７℃の条件下で２ｈ培養した。それに対し、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定により有意性分析を行い、Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定で補正した（ｎ＝３，ｎｓｐ＞０．０５，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
結果として、モル比１：１～１０：１の条件下でポリペプチドによってラニビズマブ細胞の摂取は上昇傾向を示した。初歩的なスクリーニングの結果に基づいて８９ＷＰとラニビズマブのモル比をさらに最適化すると、５：１～１８：１の条件下で、遊離抗体との比較において、ポリペプチド８９ＷＰによって抗体の３種類の細胞への摂取量は２．２～６．７倍に増加した（ｐ＜０．００１）。ポリペプチドの使用量が増加すれば抗体細胞の摂取量は全体的に上昇傾向を示し、ＨＣＥＣ細胞におけるモル比１０：１条件下での抗体細胞の摂取量はモル比７：１及び１２：１との比較において有意差がなかった（ｐ＞０．０５）が、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるモル比１０：１条件下での抗体細胞の摂取量はモル比７：１の混合物より顕著に高く（ｐ＜０．００１）、モル比１２：１の混合物より低く（ｐ＜０．０１）、ＨＵＶＥＣ細胞におけるモル比１０：１条件下での抗体細胞摂取量はモル比７：１混合物より顕著に高く（ｐ＜０．００１）、モル比１２：１混合物との比較において有意差がなく（ｐ＞０．０５）、モル比１５：１の混合物よりやや低かった（ｐ＜０．０５）。全体的に、モル比１０：１の条件下でポリペプチドによって抗体細胞の摂取量は低いモル比の組成物よりも顕著に増加するが、その後引き続きポリペプチドの使用量を増加すると、抗体細胞の摂取量の増加速度は緩やかになる。ポリペプチドの利用率を高めるためには、モル比１０：１が最適な組成物処方であることを最終的に確定した。
実施例７．異なるポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞摂取
モル比１０：１の条件下で異なるポリペプチドとラニビズマブの組成物を調製し、ＨＣＥＣとＡＲＰＥ－１９細胞におけるその摂取行為を考察した。結果は図６の通りである。
図８は、異なるポリペプチドによってラニビズマブ細胞摂取の定量評価である。異なるポリペプチド１０μＭを採取して１μＭのＣｙ５－Ｒａｎｉと混合し、４℃で２４ｈ培養して組成物溶液を得て、組成物溶液と異なる細胞を３７℃で２ｈ培養した後に検出した。又は、組成物溶液を４℃で７日間保存した後に細胞と培養し、細胞の平均蛍光強度値（Ｅｘ ６３８ｎｍ／Ｅｍ ６６０ｎｍ）をフローサイトメトリーで測定した。
結果は次の通りであった。２つの細胞モデルにおいて、野生型Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎによるラニビズマブの細胞摂取量はいずれも疎水性誘導ペプチドを含む組成物溶液の細胞摂取量よりも低く、誘導ペプチドの親油性は高く、それによるラニビズマブ細胞摂取量は上昇傾向にあった。ＨＣＥＣ細胞においては、ポリペプチド２９ＷＰ、２８９ＷＰによるラニビズマブ細胞の摂取能力が最も強く、遊離抗体との比較において平均蛍光強度がそれぞれ１３．５、１４．７倍増加していた。ＡＲＰＥ－１９細胞においても同じ結果であり、ポリペプチド２９ＷＰ、２８９ＷＰに基づく組成物溶液群の細胞平均蛍光強度がそれぞれ１１．１、１１．３倍増加した。調製した組成物溶液を４℃条件下で７日間保存した後その細胞摂取行為を考察したところ、新鮮調製混合物との比較において、全体的に大部分の組成物溶液の細胞摂取は低下したが、２つの細胞において２９ＷＰ、２８９ＷＰに基づく組成物溶液群の細胞平均蛍光強度が依然として最高だった（２８９ＷＰの効果のほうが２９ＷＰよりやや優れていた）。従って、好ましい眼部吸収促進剤としてポリペプチド２９ＷＰ、２８９ＷＰを選択して市販ラニビズマブ注射液と組み合わせ、引き続き体内薬物動態の評価を行う。
実施例８．ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞摂取メカニズム
本実施例ではポリペプチドとラニビズマブの同時細胞摂取行為について検討する。
モル比１０：１条件下で、カルボキシフルオレセインで標記されたポリペプチド２８９ＷＰ（２８９ＷＰ－ＦＡＭ）とＣｙ５で標記されたラニビズマブ（Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）の組成物を調製し、両者のＨＣＥＣとＡＲＰＥ－１９細胞での同時摂取行為を考察した。結果は、図９、１０の通りである。
図９はポリペプチド／抗体のＨＣＥＣ細胞における同時摂取行為である。Ａはカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標記されたポリペプチド２８９ＷＰ（２８９ＷＰ－ＦＡＭ）の細胞摂取平均蛍光強度であり、ＢはＣｙ５で標記されたラニビズマブ（Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）の細胞摂取平均蛍光強度であり、Ｃは２８９ＷＰ－ＦＡＭとＣｙ５－Ｒａｎｉの同時細胞摂取のフローサイトメトリー図である。各組成物はいずれも２８９ＷＰ－ＦＡＭ １０μＭとＣｙ５－Ｒａｎｉ １μＭを含んでいる。それらを市販のラニビズマブ注射液溶媒に溶解し、いずれも細胞と共に３７℃で培養した（２８９ＷＰ－ＦＡＭ／Ｃｙ５－Ｒａｎｉ群は両者を混合して４℃で２４ｈ培養した後、細胞と共に１．５ｈ培養した。２８９ＷＰ－ＦＡＭ、Ｃｙ５－Ｒａｎｉ群は２８９ＷＰ－ＦＡＭを細胞と共に１．５ｈ培養して捨て、Ｃｙ５－Ｒａｎｉを引き続き細胞と共に１．５ｈ培養した。２８９ＷＰ－ＦＡＭ＋Ｃｙ５－Ｒａｎｉ群は両者を混合した後、直ちに細胞と共に１．５ｈ培養）後、フローサイトメトリーを行った（ＦＡＭ、Ｅｘ ４８８ｎｍ／Ｅｍ ５２０ｎｍ；Ｃｙ５、Ｅｘ ６３８ｎｍ／Ｅｍ ６６０ｎｍ）。また、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定により有意性分析を行い、Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定で補正した（ｎ＝３，ｎｓｐ＞０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
図１０はポリペプチド／抗体のＡＲＰＥ－１９細胞における同時摂取行為である。ＡはＦＡＭで標記されたポリペプチド２８９ＷＰ（２８９ＷＰ－ＦＡＭ）の細胞摂取平均蛍光強度であり、ＢはＣｙ５で標記されたラニビズマブ（Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）の細胞摂取平均蛍光強度であり、Ｃは２８９ＷＰ－ＦＡＭとＣｙ５－Ｒａｎｉの同時細胞摂取のフローサイトメトリー図である。各組成物はいずれも２８９ＷＰ－ＦＡＭ １０μＭとＣｙ５－Ｒａｎｉ １μＭを含んでいる。それらを市販のラニビズマブ注射液溶媒に溶解し、いずれも細胞と共に３７℃で培養した（２８９ＷＰ－ＦＡＭ／Ｃｙ５－Ｒａｎｉ群は両者を混合して４℃で２４ｈ培養した後、細胞と共に１．５ｈ培養した。２８９ＷＰ－ＦＡＭ、Ｃｙ５－Ｒａｎｉ群は２８９ＷＰ－ＦＡＭを細胞と共に１．５ｈ培養して捨て、Ｃｙ５－Ｒａｎｉを引き続き細胞と共に１．５ｈ培養した。２８９ＷＰ－ＦＡＭ＋Ｃｙ５－Ｒａｎｉ群は両者を混合した後、直ちに細胞と共に１．５ｈ培養）後、フローサイトメトリーを行った（ＦＡＭ、Ｅｘ ４８８ｎｍ／Ｅｍ ５２０ｎｍ；Ｃｙ５、Ｅｘ ６３８ｎｍ／Ｅｍ ６６０ｎｍ）。また、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定を用いて有意性分析を行い、Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定で補正した（ｎ＝３，ｎｓｐ＞０．０５，＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
結果は次の通りであった。ポリペプチド（２８９ＷＰ－ＦＡＭ）の細胞摂取に関して、ＨＣＥＣ細胞においては各群の細胞平均蛍光強度値には有意差がない。ＡＲＰＥ－１９細胞においては、２８９ＷＰ－ＦＡＭ細胞摂取について組成物溶液群の平均蛍光強度は遊離ポリペプチドの９／１０であり、その他の群は遊離ポリペプチドと有意差がない。これは、ポリペプチドを単独で投与、または抗体と組み合わせて投与した場合、２種類の細胞におけるポリペプチド２８９ＷＰ－ＦＡＭの摂取は大きな変化が生じず、抗体はポリペプチドの細胞摂取に対してほぼ影響がないということを示している。一方、遊離抗体との比較においては、組成物溶液群（２８９Ｗ－ＦＡＭ／Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）、段階的摂取群（２８９ＷＰ－ＦＡＭ、Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）、新鮮混合群（２８９ＷＰ－ＦＡＭ＋Ｃｙ５－Ｒａｎｉ）のＨＣＥＣ細胞における摂取平均蛍光強度はそれぞれ２３．２倍、１２．６倍、２１．３倍である（ｐ＜０．００１）。ＡＲＰＥ－１９細胞においては、混合溶液群、段階的摂取群、新鮮混合群の平均蛍光強度値はそれぞれ遊離抗体の７．４倍、５．３倍、６．２倍である（ｐ＜０．００１）。これは、ポリペプチドと抗体の同時投与、あるいは先にポリペプチドで細胞を処理してからの抗体投与はいずれも抗体細胞の摂取効果を大幅に改善できる（ｐ＜０．００１）が、同時投与のほうが段階的投与より優れる（ｐ＜０．００１）ということを示している。
実施例９．ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞エンドサイトーシスのメカニズム
異なる温度またはエンドサイトーシス抑制剤添加の条件下で、フローサイトメトリー法を用いてポリペプチド２８９ＷＰとラニビズマブ組成物の細胞エンドサイトーシスのメカニズムを考察した。結果は図１１の通りである。
図１１はポリペプチド／ラニビズマブ組成物の細胞摂取メカニズムである。ここでＡとＢはそれぞれ、組成物中のポリペプチドとラニビズマブのＨＣＥＣ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞への摂取に対して温度とエンドサイトーシス抑制剤の影響を示している。非抑制条件下での２８９ＷＰ－ＦＡＭまたは組成物（Ｍｉｘｔｕｒｅ）におけるＣｙ５－Ｒａｎｉの摂取量を対照とした（１００％）。Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより有意差を分析し、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定で補正を行った（試料数３、ｎｓｐ＞０．０５，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
結果は次の通りであった。組成物中の２８９ＷＰ－ＦＡＭの細胞摂取に関し、対照群（２８９ＷＰ－ＦＡＭ、細胞摂取率は１００％）との比較において、ＨＣＥＣ細胞において、４℃または抑制剤としてのクロルプロマジン、高浸透蔗糖、Ｄｙｎａｓｏｒｅ（動力蛋白（ｄｙｎｅｉｎ）を抑制するＧＴＰ酵素活性）を添加した条件下で２８９ＷＰ－ＦＡＭ細胞摂取の降下幅は明らかであり、細胞摂取率はそれぞれ２３．３％、５３．２％、５４．４％、４９．４％だった。ＡＲＰＥ－１９においても類似した結果となり、細胞摂取率はそれぞれ３４．３％、５５．８％、７０．１％、４７．８％だった。これは、この２種類の細胞において、２８９ＷＰは主にエネルギー依存とクラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）によるエンドサイトーシス経路とを通じて細胞に入るということを示している。ラニビズマブの細胞摂取に関してはＨＣＥＣ細胞で、対照群（Ｍｉｘｔｕｒｅ、細胞摂取率は１００％）との比較において、４℃または抑制剤としてのクロロプロピラジン、高浸透蔗糖、Ｄｙｎａｓｏｒｅを添加した条件下でＣｙ５－Ｒａｎｉ細胞摂取率が顕著に低下し、細胞摂取率はそれぞれ４０．６％、３７．８％、３５．２％、２４．４％だった。ＡＲＰＥ－１９細胞でも類似した結果となり、細胞摂取率はそれぞれ７９．６％、６３．０％、７５．７％、３１．４％であった。
実施例１０．ポリペプチドによるナノ抗体の非侵襲式眼内送達
まず、ナノ抗体に対して蛍光標識を行った。１ｍｇの脱塩ナノ抗体（等電点９．６、分子量１３ｋＤ）を６００μＬの炭酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）に溶解し、４℃で予冷した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）溶液（０．５３ｍｇのＦＩＴＣを５３μＬのＤＭＳＯに溶解）を滴下し、４℃で２４ｈ反応させ、反応終了後４℃で透析（ＭＷＣＯ ２ｋＤ）して過剰なＦＩＴＣと無機塩を除去し、凍結乾燥して、ＦＩＴＣで標識されたナノ抗体を得た。
その後、以下の方法でポリペプチド／ナノ抗体組成物のマウス眼内における分布を検討した。ＦＩＴＣで標識されたナノ抗体１．０ｍｇを精密秤量し、１２０μＬの生理食塩水に溶解し、６０μＬを取り出して０．５ｍｇの膜透過ペプチド８９ＷＰと混和し、４℃で２４ｈ放置した後にポリペプチド／ナノ抗体組成物として使用した。残りの６０μＬは遊離ナノ抗体点眼液とした。
続いてマウスの右眼に対し５ｍｉｎ毎に５μＬ、計３回を投与した。ここで、遊離ナノ抗体（Ｎｂ）溶液のＦＩＴＣで標識されたナノ抗体（緑色）の含有濃度は８．３３μｇ／μＬ、ポリペプチド／ナノ抗体混合溶液のポリペプチド８９ＷＰの濃度とＦＩＴＣで標識されたナノ抗体の濃度はいずれも８．３３μｇ／μＬとした。最後の投与終了の１時間後にマウスを殺処分し、４０ｍＬの生理食塩水を心臓灌流して、眼球を摘出し、生理食塩水で洗浄し、ＦＡＳ眼球固定液内で２４ｈ固定し、１５％、３０％蔗糖溶液の勾配脱水を行い、眼球断面凍結切片を作成し、ＤＡＰＩ染色し、レーザ共焦点顕微鏡下で蛍光信号分布を観察した。
点眼後のナノ抗体の各眼組織における分布の半定量分析の結果は以下の通りである。表６、７、８は点眼投与後のナノ抗体のマウス角膜、角強膜輪部、網膜部位における分布量の比較である。
表６は点眼後のナノ抗体の眼角膜分布である。遊離抗体点眼群とポリペプチド／ナノ抗体溶液点眼群の投与量はいずれも１２５μｇ蛍光標識ナノ抗体／眼とした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて角膜領域の平均緑色蛍光強度値（ＦＩＴＣで標識されたナノ抗体は緑色蛍光を呈する）を計算した結果、遊離ナノ抗体との比較において、８９ＷＰ／ナノ抗体組成物を点眼投与することで、角膜部位におけるナノ抗体の分布量が３．１倍増加したことが示されている。
Figure 2023539460000007
表７は点眼後のナノ抗体の角強膜輪部分布である。遊離抗体点眼群とポリペプチド／ナノ抗体溶液点眼群の投与量はいずれも、１２５μｇ蛍光で標識されたナノ抗体／眼とした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて角強膜輪部領域の平均緑色蛍光強度値（ＦＩＴＣで標識されたナノ抗体は緑色蛍光を呈する）を計算した結果、遊離ナノ抗体との比較において、８９ＷＰ／ナノ抗体組成物を点眼投与することで、角強膜輪部部位におけるナノ抗体の分布量が３．５倍増加したことが示されている。
Figure 2023539460000008
表８は点眼後ナノ抗体の網膜分布である。遊離抗体点眼群とポリペプチド／ナノ抗体溶液点眼群の投与量はいずれも、１２５μｇ蛍光で標記されたナノ抗体／眼とした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて網膜領域の平均緑色蛍光強度値（ＦＩＴＣで標識されたナノ抗体は緑色蛍光を呈する）を計算した結果、遊離ナノ抗体との比較において、８９ＷＰ／ナノ抗体組成物を点眼投与することにより、網膜部位におけるナノ抗体の分布量が４．１倍増加したことが示されている。
Figure 2023539460000009
上述した眼組織の緑色蛍光信号を半定量分析した結果、点眼投与の１ｈ後に、角膜、角強膜輪部に隣接した網膜、眼底網膜領域において、ポリペプチド／ナノ抗体溶液点眼群の緑色蛍光信号強度はいずれも遊離抗体点眼群より顕著に強く（ｐ＜０．０１）、ナノ抗体溶液にポリペプチド８９ＷＰを加えることにより点眼投与後のナノ抗体の眼内吸収が顕著に増加することが示された。特に眼底網膜分布において顕著に増加している。
実施例１１．ポリペプチド／ラニビズマブ組成物点眼投与後のウサギ眼内での分布
まず、ポリペプチド／ラニビズマブ（Ｒａｎｉ）溶液を調製した。一定量の市販ラニビズマブ注射液（１０ｍｇ／ｍＬ）を採取し、市販品溶媒を用いて等体積で５ｍｇ／ｍＬまでに希釈し、得た溶液で４．０ｍｇ／ｍＬまでＲ８を溶解してＲ８／Ｒａｎｉ混合溶液を得るか、または８９ＷＰを７．４ｍｇ／ｍＬまで溶解して８９ＷＰ／Ｒａｎｉ混合溶液を得て、４℃で保存して実験用とした。使用前に少なくとも４℃で２４ｈ培養し、室温で１ｈ静置した。
市販のラニビズマブ注射液溶媒の処方組成は、１０ｍＭヒスチジン塩酸塩、１０％ α，α－トレハロース、０．０１％ツィン２０、ｐＨ５．５である。
その後、投与及び組織試料採取案を確定した。
１ｋｇ程の健康な雄ウサギを選択し、実験前に眼科検査を行い眼が正常であることを確認した。実験過程は実験動物倫理規範に従った。ウサギの各眼にラニビズマブ１５０μｇ／眼を含んだ薬液３０μＬを点眼し、投与後１ｈで組織試料を採取した。
採取時にはウサギを安楽死処分し、直ちに心臓から１ｍＬ程度を採血し、それを１．５ｍＬ抗凝固管に加え、４℃、２５００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を採取し、－２０℃で保存して実験用とした。また、房水とガラス体をそれぞれＥＰ管内へ採取し、－２０℃で保存して実験用とした。さらに網膜組織を分離し、４℃、２５００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を捨てて１０ｍＭ ＰＢＳで２回洗浄し、秤量し、総蛋白抽出キットを用いて組織総蛋白を１０ｍＭ ＰＢＳ内に抽出し、－２０℃で保存して実験用とした。
次のステップに基づいてＥＬＩＳＡ検出方法を確立した。
１）抗原コーティング：コーティング液（０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）を用いてｈＶＥＧＦ－Ａ１６５を１μｇ／ｍＬに希釈し、希釈した抗原コーティング液を酵素標識プレートの各孔に１００μＬ加え、プレートを閉じた後、４℃でコーティングして一晩置く。
２）プレート洗浄：抗原コーティング液を捨て、洗浄液（０．０２Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、０．０５％ツィン２０を含む）ですべての孔を充填し、３０ｓ静置した後、倒置乾燥する。これを６回繰り返す。
３）密封：酵素標識プレートの各ウェルに２５０μＬの密封液を加え、４℃で一晩培養する。
４）密封液を捨てる。プレートを洗うステップは同上。
５）一次抗体（ラニビズマブを含有する試料）培養：試料を各１００μＬ採取し、酵素標識プレートの孔に加え、プレートを密封した後、３７℃で１ｈ培養する。
６）一次抗体溶液を捨てる。プレートを洗うステップは同上。
７）二次抗体培養：各ウェルに希釈倍数１：４００のＨＲＰ標識二次抗体（Ｆ（ａｂ’）２－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰ）１００μＬを加え、プレートを密封した後３７℃で１ｈ培養する。
８）二次抗体溶液を捨てる。プレートを洗うステップは同上。
９）発色：ＴＭＢ溶液２００μＬを各ウェルに加え、プレートを密封した後、３７℃遮光発色３ｍｉｎを行い、各ウェルに終止液（２Ｍ硫酸溶液）５０μＬを加える。
１０）検出：終了後１０ｍｉｎ以内にマイクロプレートリーダーで各ウェルのＯＤ４５０ｎｍ値を測定し、試料濃度を横軸、ＯＤ４５０ｎｍ値を縦軸として標準曲線を作り、これに基づいて各試料のラニビズマブ含有濃度を計算する。
その後、ラニビズマブの組織濃度を測定した。コーティングした抗原（ｈＶＥＧＦ－Ａ１６５）ＥＬＩＳＡプレートと抽出組織（血漿、房水、ガラス体、網膜総蛋白質抽出液）を準備し、上記ステップ５）～ステップ１０）を繰り返しながら試料随行検出標準曲線を作成し、ラニビズマブ組織濃度を計算した。
ＥＬＩＳＡ法によって検出したラニビズマブの組織濃度検出結果は以下の通りである。試料濃度を吸光度値に対して標準曲線を作成する。所定の濃度範囲内（５～１２０ｎｇ／ｍＬ）において、ＥＬＩＳＡによって検出されたＯＤ４５０ｎｍ値は試料濃度との線形関係がよく（Ｒ２＞０．９８）、当該濃度範囲内でＥＬＩＳＡ法によってラニビズマブ濃度を検出する方法は実行可能である。
ラニビズマブの眼組織における分布は以下の通りである。点眼投与の１ｈ後、ウサギ眼の各組織のラニビズマブ濃度は図１２の通りだった。
図１２は点眼投与の１ｈ後のウサギ体内の各組織（血漿、房水、ガラス体、網膜）のラニビズマブ濃度であり、影をつけた部分が文献に記載のラニビズマブ半数有効濃度（ＥＣ５０）である。Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより有意差を分析し、Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定を用いて補正を行った（ｎｓｐ＞０．０５，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１、Ｒａｎｉ群と比較）。
結果は次の通りであった。遊離ラニビズマブ点眼群（Ｒａｎｉ）に関して、投与１ｈ後にウサギの眼房水、ガラス体、網膜における薬剤濃度はほぼ測定できず、文献に記載のラニビズマブ半数有効濃度（ＥＣ５０）よりはるかに低かった。Ｒ８／Ｒａｎｉ溶液群に関しては、点眼投与を経ても房水内では有効治療濃度に達しなかったが、ガラス体で有効治療濃度下限に達し、網膜組織においては有効治療濃度に達しており、遊離ラニビズマブ群より優れていた（ｐ＝０．０３７７）。８９Ｗ／Ｒａｎｉ複合物群に関しては、点眼投与を経ても房水では有効治療濃度に達しなかったが、ガラス体と網膜組織で有効治療濃度に達しており、遊離ラニビズマブ群より顕著に優れていた（ｐ＝０．００２５）。
実施例１２．ポリペプチド／ラニビズマブ組成物点眼投与後のウサギ体内の薬物動態
まず、点眼液を調製した。ポリペプチド／ラニビズマブ組成物を作成し、一定量の市販ラニビズマブ注射剤（１０ｍｇ／ｍＬ）を採取し、市販品溶剤を用いて等体積で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、得た溶液で２９ＷＰを２．４８ｍｇ／ｍＬまで溶解して組成物２９ＷＰ／Ｒａｎｉを得るか、または２８９ＷＰを２．５４ｍｇ／ｍＬまで溶解して組成物２８９ＷＰ／Ｒａｎｉを得て、４℃で保存して実験用とした。使用前に少なくとも４℃で２４ｈ培養し、室温で１ｈ静置した。
その後、投与及び試料採取案を確定した。１ｋｇ程の健康な雄ウサギを選択し、実験前に眼科検査を行い眼が正常であることを確認した。実験過程は実験動物倫理規範に従った。ウサギの各眼にラニビズマブ１５０μｇ／眼を含んだ異なる組成物溶液３０μＬを点眼し、投与後１ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈにそれぞれ眼組織試料を採取した。
次に、ラニビズマブの組織濃度を測定した。コーティングした抗原（ｈＶＥＧＦ－Ａ１６５）ＥＬＩＳＡプレートと抽出組織（血漿、房水、ガラス体、網膜総蛋白質抽出液）を準備し、実施例１１に記載のＥＬＩＳＡ検出確立方法のステップ５）～ステップ１０）を繰り返しながら試料随行検出標準曲線を作成し、ラニビズマブ組織濃度を計算した。
結果は以下の通りである。所定の濃度範囲内（５～１２０ｎｇ／ｍＬ）において、ＥＬＩＳＡによって検出されたＯＤ４５０ｎｍ値はラニビズマブ試料濃度との線形関係がよく（Ｒ２＞０．９８）、当該濃度範囲内でＥＬＩＳＡ法によりラニビズマブ濃度を検出する方法は実行可能である。
ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の点眼後のウサギ体内の薬物動態行為に関し、ＥＬＩＳＡ法を用いて点眼投与後にポリペプチドによるラニビズマブのウサギ体内の各組織分布を測定した。結果は図１３、表９の通りである。
図１３は点眼投与後にポリペプチド／ラニビズマブ組成物のウサギ体内の濃度分布変化である。投与量は以下の通りである。２８９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群は２８９ＷＰ ７６．２μｇ／眼、ラニビズマブ１５０μｇ／眼を含む。２９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群は２９ＷＰ ７４．４μｇ／眼、ラニビズマブ１５０μｇ／眼を含む。Ｒａｎｉ群はラニビズマブ１５０μｇ／眼を含む。投与後１ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈのラニビズマブ組織濃度を測定した。影をつけた部分が文献に記載のラニビズマブ半数有効濃度（ＥＣ５０）である。Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより有意差を分析し、Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定を用いて補正を行った（ｎｓｐ＞０．０５，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１、Ｒａｎｉ群と比較）。
Figure 2023539460000010
結果は次の通りであった。薬剤は眼表を通じて滴下した後に全身吸収する可能性があることから、血漿中のラニビズマブ濃度でラニビズマブ全身分布行為を表す。投与の１ｈ後、２８９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群のラニビズマブ血漿濃度は１７．２±１．４ｎｇ／ｍＬ、２９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群は２１．７±９．２ｎｇ／ｍＬとなり、文献に記載のラニビズマブの半数有効濃度（ＥＣ５０）に達した。一方、Ｒａｎｉ群は点眼投与の１ｈ後に血液中でラニビズマブが検出されず、投与の４ｈ後に２８９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群と２９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群の血漿濃度がそれぞれ０．９±０．９ｎｇ／ｍＬ、１４．０±５．０ｎｇ／ｍＬに低下し、投与の８ｈ後に各群のラニビズマブ血漿濃度はほぼ０になった。これは、点眼投与後、ポリペプチドによってラニビズマブには一定の全身吸収が生じたが、投与の４ｈ後にラニビズマブの血漿濃度は大幅に低下し、８ｈ後にほぼ除去完了したということが示されている。房水中のラニビズマブ含有量に関して、投与の１ｈ後と４ｈ後に、２８９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群と２９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群のラニビズマブ濃度は文献に記載のラニビズマブ半数有効濃度（ＥＣ５０）の範囲内（９．０～２８．８ｎｇ／ｍＬ）であり、前者がやや高かった。一方、Ｒａｎｉ群は投与１ｈ後に房水中のラニビズマブ濃度が１．７ｎｇ／ｍＬに過ぎず、ラニビズマブは単独点眼後房水内で有効治療濃度に達することが困難であることが示された。ガラス体内のラニビズマブ濃度に関しては、２８９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群のみが点眼１ｈ後に文献記載のラニビズマブ半数有効濃度（ＥＣ５０）（２７．０±７．８ｎｇ／ｍＬ）に達した。網膜におけるラニビズマブ濃度は抗体の病巣部位への分布を表す。投与の１ｈ後、４ｈ後、８ｈ後に、２８９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物群のラニビズマブ網膜濃度はそれぞれ１０７．１±５５．４ｎｇ／ｇ、６３．４±４３．６ｎｇ／ｇ、２１．９±４．４ｎｇ／ｇ、平均値はそれぞれ遊離抗体群の２０．６、１２．２、４．２倍（ｐ＜０．０５）であり、文献に記載のラニビズマブ半数有効濃度（ＥＣ５０）の範囲内か、またはこれより高かった。これは、一回の点眼投与から８ｈ後までの間、２８９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物は網膜中のラニビズマブを有効濃度範囲内に維持させることができ、２９ＷＰ／Ｒａｎｉ組成物は点眼投与の１ｈから８ｈまでの間、網膜濃度が１３．７－３５．８ｎｇ／ｇであり、文献に記載のラニビズマブの半数有効濃度（ＥＣ５０）にも達するが、濃度が低く持続時間も短い。これは、２９ＷＰのラニビズマブ眼内送達効果が２８９ＷＰに及ばないということが示されている。なお、ポリペプチド／ラニビズマブ組成物の点眼投与後、ラニビズマブ網膜濃度＞ガラス体または房水内の濃度となることを考慮すると、ポリペプチドによってラニビズマブが網膜に到達するにあたっては、結膜→強膜→脈絡膜→網膜という経路を通じて吸収されている可能性があると思われる。
実施例１３．ポリペプチド／アフリベルセプト組成物点眼投与後のウサギ体内の薬物動態
まず、点眼液を調製した。ポリペプチド／アフリベルセプト組成物を作成し、市販のアフリベルセプト注射液溶媒を用いてアフリベルセプト（４０ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍｇ／ｍＬまで希釈し、この溶液を用いてポリペプチド２８９ＷＰを６．１６ｍｇ／ｍＬまで溶解し、４℃で保存して実験用とした。使用前に少なくとも４℃で２４ｈ培養し、室温で１ｈ静置した。
市販のアフリベルセプト注射液溶媒の処方組成は、１０ｍＭリン酸塩緩衝液、４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％ツィン２０、５％蔗糖、ｐＨ６．２である。
次に、投与及び試料採取案を確定した。１ｋｇ程の健康な雄ウサギを選択し、実験前に眼科検査を行い眼が正常であることを確認した。実験過程は実験動物倫理規範に従った。ウサギの各眼にアフリベルセプト６００μｇ／眼を含んだ異なる組成物溶液３０μＬを点眼し、投与後１ｈで眼組織試料を採取した。
その後、アフリベルセプトの組織濃度を測定した。コーティングした抗原（ｈＶＥＧＦ－Ａ１６５）ＥＬＩＳＡプレートと抽出組織（血漿、房水、ガラス体、網膜総蛋白質抽出液）を準備し、実施例１１に記載のＥＬＩＳＡ検出確立方法のステップ５）～ステップ１０）を繰り返しながら試料随行検査曲線を作成し、アフリベルセプト組織濃度を計算した。
結果は以下の通りである。所定の濃度範囲（０－１５６．２５ｎｇ／ｍＬ）において、ＥＬＩＳＡによって検出されたＯＤ４５０ｎｍ値はアフリベルセプト試料濃度との線形関係がよく（Ｒ２＞０．９８）、当該濃度範囲でＥＬＩＳＡ法によりアアフリベルセプト濃度を検出する方法は実行可能である。
よってＥＬＩＳＡ法を用い、点眼投与後にポリペプチドによるアフリベルセプトのウサギ体内の各組織分布を測定した。結果は図１４の通りである。
図１４は、点眼投与後におけるポリペプチド／アフリベルセプト溶液のウサギ体内の濃度分布である。投与量は以下の通りである。Ａｆｌｉ群はアフリベルセプト６００μｇ／眼を含み、２８９ＷＰ／Ａｆｌｉ組成物群は２８９ＷＰ １８４．８μｇ／眼、アフリベルセプト６００μｇ／眼を含む。投与１ｈ後のアフリベルセプト組織濃度を測定した。Ｏｎｅ－Ｗａｙアンペアｔ検定により有意差（ｎｓｐ＞０．０５，＊ｐ＜０．０５）について分析した。
結果は次の通りであった。投与１ｈ後、遊離アフリベルセプト群と２８９ＷＰ／Ａｆｌｉ組成物群の血漿からはアフリベルセプトを検出できなかった。Ａｆｌｉ群との比較において、２８９ＷＰ／Ａｆｌｉ組成物は点眼後、房水（ｐ＜０．０５）とガラス体におけるアフリベルセプト濃度がやや高く、網膜濃度は２３７．６±１６２．２ｎｇ／ｇに達し、Ａｆｌｉ群より顕著に高い（ｐ＜０．０５）。これは、ポリペプチド２８９ＷＰがアフリベルセプトの眼部吸収を顕著に改善できることが示されている。ポリペプチド／ラニビズマブ点眼液と同様に、アフリベルセプトも結膜→強膜→脈絡膜→網膜という経路で吸収される可能性がある。
上記実験により、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤のみを使用する場合との比較において、前記組成物は細胞摂取を顕著に増加させるということが証明された。本発明の組成物によれば、前記生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤を眼部の吸収障壁を効率的に透過させ、薬剤の眼内への進入と眼後段への到達を促進し、さらには生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤の眼部生物利用度を高め、生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤の細胞摂取を顕著に促進することができる。

Claims (19)

  1. 眼部疾病治療用組成物であって、当該組成物は、
    （ｉ）生理ｐＨ条件下で正電荷を有する薬剤と、
    （ｉｉ）野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と
    を含み、
    前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体は下記アミノ酸配列を有し、
    ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ
    ただし、Ｘ１、Ｘ２とＸ３は疎水性アミノ酸を表し、天然由来のアミノ酸であるアラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）、非天然由来のアミノ酸であるα－アミノ酪酸（α－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノ吉草酸（α－ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノカプロン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノヘプタン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、およびそれらの組み合せから選択する
    眼部疾病治療用組成物。
  2. 前記組成物は溶液または懸濁液である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  3. Ｘ１、Ｘ２とＸ３が疎水性アミノ酸を表し、Ｘ１、Ｘ２とＸ３のうち少なくとも２つは、天然由来のアミノ酸であるアラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）、イソロイシン（ｌｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）、非天然由来のアミノ酸であるα－アミノ酪酸（α－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノ吉草酸（α－ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノカプロン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノヘプタン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、およびそれらの組み合せから選択する
    ことを特徴とする請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  4. Ｘ１、Ｘ２またはＸ３はトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）であることを特徴とする請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  5. Ｘ１、Ｘ２またはＸ３のうち少なくとも２つはトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）であることを特徴とする請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  6. 前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体のアミノ酸配列は、
    ＲＷＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ
    ＲＱＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫ
    ＲＱＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫ
    ＲＷＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫ
    ＲＷＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫ
    ＲＱＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ
    ＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ
    であることを特徴とする請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  7. 前記野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体のアミノ酸配列は、
    ＲＷＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫＫ
    ＲＷＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫＫ
    ＲＱＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫＫ
    ＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ
    であることを特徴とする請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  8. 前記薬剤は、ポリペプチドまたは蛋白質類薬剤である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  9. 前記薬剤は、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、オクリプラスミン（Ｏｃｒｉｐｌａｓｍｉｎ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ＮＩＳＴモノクローナル抗体（ＮＩＳＴｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）から選択される１つまたは複数である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  10. 前記薬剤は、ナノ抗体、ラニビズマブ、アフリベルセプト、オクリプラスミン、ベバシズマブ、セツキシマブから選択される１つまたは複数である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  11. 前記薬剤は、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ベバシズマブから選択される１つまたは複数である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  12. 前記ナノ抗体は、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ボルバリビズマブ（Ｖｏｂａｒｉｌｉｚｕｍａｂ）から選択される１つまたは複数である請求項９に記載の眼部疾病治療用組成物。
  13. 野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率はモル比で０．１：１～５０：１である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  14. 野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率はモル比で０．５：１～３５：１である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  15. 野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率はモル比で１：１～２０：１である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  16. 野生型膜透過ペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体と前記薬剤の比率はモル比で３：１～１５：１である請求項１に記載の眼部疾病治療用組成物。
  17. 必要な被験者のために眼部疾病を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の眼部疾病治療用組成物を使用することを含む眼部疾病の治療方法。
  18. 治療有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物を患者に点眼投与することを含む請求項１７に記載の方法。
  19. 眼部疾病治療用薬剤を調製するための、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
JP2023512007A 2020-08-17 2021-08-16 薬剤と野生型膜透過ペプチド誘導体の組成物 Pending JP2023539460A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010825480.0 2020-08-17
CN202010825480.0A CN114073774A (zh) 2020-08-17 2020-08-17 药物和野生型穿膜肽衍生物的组合物
PCT/CN2021/112687 WO2022037514A1 (zh) 2020-08-17 2021-08-16 药物和野生型穿膜肽衍生物的组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023539460A true JP2023539460A (ja) 2023-09-14

Family

ID=80281153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023512007A Pending JP2023539460A (ja) 2020-08-17 2021-08-16 薬剤と野生型膜透過ペプチド誘導体の組成物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230357334A1 (ja)
EP (1) EP4197558A1 (ja)
JP (1) JP2023539460A (ja)
CN (1) CN114073774A (ja)
CA (1) CA3192067A1 (ja)
TW (1) TW202227137A (ja)
WO (1) WO2022037514A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116270974B (zh) * 2023-03-09 2024-03-12 湖南大学 一种组合物、阿柏西普递送系统和制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107638405A (zh) * 2016-07-15 2018-01-30 复旦大学 一种眼内递药组合物及其制备方法
CN108976288B (zh) 2017-06-05 2021-09-21 复旦大学 基于野生型穿膜肽penetratin的亲脂性衍生物
CN112996486A (zh) * 2017-07-17 2021-06-18 K·罗伊兹曼 包含细胞穿透肽的治疗剂的局部递送用于治疗年龄相关性黄斑变性及其它眼病
CN109420178A (zh) * 2017-09-04 2019-03-05 复旦大学 多价穿膜肽类生物大分子递送载体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114073774A (zh) 2022-02-22
CA3192067A1 (en) 2022-02-24
WO2022037514A1 (zh) 2022-02-24
EP4197558A1 (en) 2023-06-21
US20230357334A1 (en) 2023-11-09
TW202227137A (zh) 2022-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11826431B2 (en) Polypeptide-based ocular absorption enhancer and application thereof
US11738064B2 (en) Pharmaceutical composition for preventing and treating eye diseases, containing as active ingredient, fusion protein in which tissue-penetrating peptide and anti-vascular endothelial growth factor preparation are fused
WO2022037063A1 (zh) 一种可穿透角膜并靶向视网膜的眼用脂质体及其制备方法和应用
JP2020526574A5 (ja)
Chen et al. Anti-angiogenesis through noninvasive to minimally invasive intraocular delivery of the peptide CC12 identified by in vivo-directed evolution
US20130210747A1 (en) Methods and Therapeutics Comprising Ligand-Targeted ELPs
ES2967128T3 (es) Preparación farmacéutica de conjugado de anticuerpo anti-Her2 y fármaco
JP2023539460A (ja) 薬剤と野生型膜透過ペプチド誘導体の組成物
EP3672641B1 (en) Composition comprising vegf antagonists and a cationic peptide and uses thereof
CN107629114A (zh) 多肽、其衍生物及其在制备抗肺纤维化的药物中的应用
US11541098B2 (en) Peptide composition for treating excitatory neurotoxicity related injuries
EP2108698A1 (en) Vascular endothelial cell-binding peptide
RU2669787C2 (ru) Средство для лечения заболевания, сопровождающегося отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A
US20240052005A1 (en) Improved cell-penetrating peptides and fusion proteins
EP4260871A1 (en) Optical nerve protecting agent containing anti-lrp1 antibody
JPWO2020214846A5 (ja)
JP2023521146A (ja) 網膜障害の処置のための二重特異性アプタマー組成物
JP2021138629A (ja) 薬物デリバリーキャリアおよびこれを用いる医薬組成物
CN117801134A (zh) 一种改性高分子聚合物及制备方法、在眼用制剂制备中的应用