CN117801134A - 一种改性高分子聚合物及制备方法、在眼用制剂制备中的应用 - Google Patents

一种改性高分子聚合物及制备方法、在眼用制剂制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种用于滴眼制剂促渗的改性壳聚糖及其制备方法。与传统适用于小分子活性成分的促渗剂相比，本申请所述的改性壳聚糖可以与多种生物大分子活性成分(如分子量较大的的治疗性蛋白活性成分等)产生结合作用，并将这些大分子活性成分高效递送穿透眼部屏障宏观生物屏障，从而改变大分子活性成分的给药途径，且具有普适性。并且由改性壳聚糖和活性成分分子形成的复合物，其透过生物屏障的方式是非侵入性的，能够临时打开细胞间隙，安全性更高，制备方法简便，便于转化应用。

Description

一种改性高分子聚合物及制备方法、在眼用制剂制备中的 应用
技术领域
本发明涉及生物大分子活性成分递送领域，尤其涉及一种改性高分子聚合物及制备方法、在眼用制剂制备中的应用。
背景技术
眼睛是人类最敏感的器官，具有极其精密的功能结构，精密的眼部构造一方面能够帮助眼睛排除外界异物，另一方面，也为眼部疾病的诊疗带来阻碍。眼部疾病高达500余种，其中黄斑病变、视网膜病变等疾病是致盲性极高的眼部疾病，对患者的生活造成极大的干扰。
但是，治疗眼部疾病可以通过全身给药、局部给药两大类给药方式进行，由于眼部的化学屏障作用，全身给药很难在眼组织内达到有效的活性成分浓度，局部给药方式细分为局部滴眼、眼周注射、眼球内注射几种方式，其中眼前区病变多采用局部滴眼给药。由于角膜上皮对活性成分吸收的屏障以及血-眼屏障，眼后区疾病则多采用眼周注射或眼球内注射的方式。尽管目前开发了部分缓释制剂用于眼后区疾病的治疗，但仍然是局部侵入式的给药，患者依从性较差。
治疗眼后区疾病的活性成分主要是大分子物质，大分子物质很难通过血-眼屏障，并且血-眼屏障受损会导致视力受损。如何将大分子物质递送到眼后区，突破眼部屏障，是解决眼部疾病给药方式的重要问题。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供了一种促生物大分子活性成分透眼部屏障的改性壳聚糖及其制备方法。与传统小分子促渗剂相比，本申请所述的改性壳聚糖的活性成分装载量可控性好，促渗效率高，与多种生物大分子活性成分能够产生结合作用，更具有普适性。并且由改性壳聚糖和活性成分分子或生物大分子形成的复合物，其透过生物屏障的方式是非侵入性的，能够临时打开细胞间隙，不会破坏细胞屏障和粘膜系统，安全性更高，制备方法简便，便于转化应用。为生物大分子透生物屏障的应用提供了新载体。
本发明的第一个目的在于，提供一种改性壳聚糖，由壳聚糖或壳聚糖的衍生物与修饰分子反应生成的产物，改性壳聚糖具有通式Ⅰ：CS-X1-R1，所述CS为壳聚糖或壳聚糖的衍生物，所述X1选自酰胺键、磺酰胺键、席夫碱基、仲胺、烷基胺、氨基甲酸酯、酯键、醚、磷酸酯、磺酸酯、脲、磷酰胺、脒键中的任意一种，所述R1来自于所述修饰分子。
或所述X1选自-NH-CO-、-NH-SO2-、-N＝C-、-NH-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH(OH)-、-NH-CO-O-、-O-CO-、-O-CH2-O-CH2-、-O-PO-(OR1)2、-O-SO2-、-NH-CO-NH-、-NH-PO-(OR1)2、-NH-C(＝NH2+)-中的任意一种。
具体地，所述壳聚糖或壳聚糖的衍生物的分子量范围在1000-5000000，脱乙酰度不低于55％。
具体地，所述壳聚糖或壳聚糖的衍生物选自壳聚糖、壳寡糖、甲壳素、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、三甲基铵乙二醇壳聚糖碘化物、壳聚糖季铵盐、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖硝酸盐、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖壬二酸盐中的一种或多种。
具体地，所述R1来自于所述修饰分子，所述修饰分子选自脂肪族化合物。
具体地，所述脂肪族化合物选自脂肪酸、脂肪醛、脂肪酰卤、脂肪酸酐、脂肪族聚酯。
进一步地，所述脂肪族化合物含有n个碳原子的脂肪链，其中4≤n≤22.
进一步地，所述所n＝7，n＝8，n＝12，n＝16。
进一步地，通式Ⅰ中，所述X1是酰胺键，所述R1是含有6个碳原子的脂肪链、含有7个碳原子的脂肪链、含有11个碳原子的脂肪链、含有15个碳原子的脂肪链中的任意一种。
进一步地，所述改性壳聚糖上修饰分子的取代度不超过40％。
本发明的第二个目的在于，提供一种改性壳聚糖，所述改性壳聚糖具有通式Ⅱ：
CS-X1-R2-R3；
所述CS为壳聚糖或壳聚糖的衍生物；
所述X1选自酰胺键、磺酰胺键、席夫碱基、仲胺、烷基胺、氨基甲酸酯、酯键、醚、磷酸酯、磺酸酯、脲、磷酰胺、脒键中的任意一种。
或所述X1选自-NH-CO-、-NH-SO2-、-N＝C-、-NH-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH(OH)-、-NH-CO-O-、-O-CO-、-O-CH2-O-CH2-、-O-PO-(OR)2、-O-SO2-、-NH-CO-NH-、-NH-PO-(OR2)2、-NH-C(＝NH2+)-中的任意一种。
所述R2为含有n个碳原子的脂肪链，其中2≤n≤20；
所述R3含有酚羟基或其衍生物、邻苯二酚基团或其衍生物、邻苯三酚基或其衍生物中的任一种；
所述R3通过连接基团与R2相连接。
所述连接基团选自酰胺键、磺酰胺键、席夫碱基、仲胺、烷基胺、氨基甲酸酯、酯键、醚、磷酸酯、磺酸酯、脲、磷酰胺、脒键中的任意一种。
具体地，所述壳聚糖的分子量范围在1000-5000000，脱乙酰度不低于55％。
进一步地，所述酚羟基与壳聚糖的摩尔比不超过20％。
进一步地，所述酚羟基与壳聚糖的摩尔比为8％～18％。
进一步地，所述改性壳聚糖上修饰分子的取代度不超过20％。
进一步地，所述CS-X1-R2-R3可以通过中间体与壳聚糖或其衍生物反应得到，所述中间体选自以下结构：
具体地，所述中间体与壳聚糖的摩尔比不大于20％。
进一步地，所述中间体与壳聚糖的投料比为1％～18％。
进一步地，所述中间体与壳聚糖的投料比不小于10％，不大于20％。
所述壳聚糖或壳聚糖的衍生物的分子量范围在1000-5000000，脱乙酰度不低于55％。本发明的第三个目的在于，提供一种改性壳聚糖CS-X1-R1的制备方法，其特征在于，通过修饰分子与壳聚糖或壳聚糖的衍生物反应。
所述修饰分子含有能与壳聚糖伯氨基反应的活性基团。
所述修饰分子含有以下活性基团：羧酸基团、磺酸基团、酸酐、碳酸盐、酰卤基团、磺酰氯、酰氯、NHS酯、亚氨酸酯、五氟苯酯、醛基、异氰酸酯、异氰酸盐、环氧基团、双键、炔基、羟甲基膦、羧酸根。
具体地，所述修饰分子与壳聚糖的摩尔比不大于40％。
进一步地，所述修饰分子与壳聚糖的投料比为1％～40％。
进一步地，所述修饰分子与壳聚糖的投料比不小于10％，不大于40％。
本发明的第四个目的在于，提供一种透生物屏障的复合物，包括改性壳聚糖和活性成分。
进一步地，所述改性壳聚糖和活性成分以物理或化学方式结合形成所述透生物屏障的复合物。
进一步地，所述改性壳聚糖和活性成分的质量比为1：0.1～10。
进一步地，所述改性壳聚糖和活性成分的质量比为1：0.2～5。
进一步地，所述活性成分选自小分子活性成分和/或大分子活性成分。
具体地，所述生物大分子活性成分选自蛋白类活性成分、其他多肽类活性成分、激素类活性成分、抗体类活性成分、生长因子、核酸物质、抗氧化剂、眼部治疗活性成分中的一种或多种。
具体地，所述蛋白类活性成分选自抗体、单特异性抗体、双特异性抗体、血管内皮生长因子抗体、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶中的一种或多种。
具体地，所述眼病治疗活性成分选自雷珠单抗、贝伐珠单抗、VEGF抗体、 MP0112、ARC1905、FCFD4514S、康柏西普、阿柏西普、补体途径抑制剂、视觉周期抑制剂、雷帕霉素靶点抑制剂、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂、LIM激酶抑制剂、非甾体类EP2受体激动剂中的一种或多种。
具体地，生长因子选自血小板类生长因子、表皮生长因子类、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因子、白细胞介素类生长因子、红细胞生长素、集落刺激因子、纤维母细胞生长因子、肝细胞生长因子、类胰岛素生长因子、生长激素释放抑制因子中的一种或几种。
具体地，核酸物质选自siRNA、mRNA、shRNA、lnc RNA、pDNA、poly IC、CpG或环状二核苷酸中的一种或几种。
进一步地，所述活性成分的分子量不超过260kD。
进一步地，所述活性成分的分子量约为5kD、10kD、20kD、40kD、60kD、140kD、180kD、200kD、240kD、260kD。
进一步地，所述生物屏障包括眼部屏障、泪液屏障、角膜/结膜屏障、血房水屏障、血视网膜屏障中的任意一种。
进一步地，所述活性成分选自生物药或化学药。
具体地，所述小分子活性成分选抗生素活性成分、免疫调节剂、抗感染活性成分、眼病治疗活性成分、靶向抑制剂中的一种或多种。
具体地，所述免疫调节剂选自免疫抑制类活性成分如抗体、氨苯砜、甲氨蝶呤、霉酚酸酯或环磷酰胺。
发明的第五个目的在于，提供一种改性壳聚糖或透生物屏障的复合物在眼部疾病治疗活性成分制备中的应用。
进一步地，所述眼部疾病为眼后区疾病。
进一步地，所述眼部疾病为眼底疾病，视网膜相关疾病、各种因素引起的视网膜病变、视网膜血管炎、血管增生性眼部疾病、息肉状脉络膜血管病变、特发性脉络膜新生血管、早产儿视网膜病变、外层渗出性视网膜病变、视网膜色素变性、老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、白内障、葡萄膜炎、角膜炎、视网膜母细胞瘤、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉阻塞、原发性视网膜色素变性、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、视网膜静脉周围炎、视网膜动脉阻塞、和青光眼。
本发明的第六个目的在于，提供一种滴眼制剂，包括改性壳聚糖或透生物屏障的复合物。
进一步地，所述滴眼制剂还包括分散剂、赋形剂、增稠剂、保湿成分中的一种或多种。
根据本发明提供的改性壳聚糖与现有技术相比，有如下有益效果：
1)改性壳聚糖具有原料易得、制备简便，能够根据需求得到合适取代度的产物进一步用于生物大分子活性成分的透眼部屏障递送。
2)该改性壳聚糖能够高效地装载生物大分子活性成分，实现生物大分子活性成分透眼部屏障，从而实现多种活性成分通过滴眼方式治疗眼部疾病，大大增加临床使用便利性。同时，由于该改性壳聚糖具有较高的促渗效率，有助于提高活性成分的利用率。
3)改性壳聚糖打开生物屏障具有非破坏性的特点，与现有技术相比，提高了应用安全性和舒适性。
4)提供了一种平台技术，由于其水溶性好、稳定性好等特点，如非剂型特殊需要，不需要添加过多辅料助剂，适用于多种大分子量的蛋白、多肽以及小分子活性成分的透生物屏障递送，普适性更好，制剂组分更简单，制备方法更简捷，化学试剂的引入更少，有助于提高生产效率和安全性，增加使用便利性，具有更大的剂量使用空间。
附图说明
图1是实施例C1中经不同滴眼处理后蛋白渗透至小鼠眼球视网膜部位的荧光信号分布；
图2是实施例C6中小鼠脉络膜新生血管成像，通过进入血液的荧光素钠荧光信号显示血管位置，显示小鼠脉络膜新生血管模型经过不同手段治疗后的新生血管生长情况；
图3是实施例D1中小鼠眼部造影成像图；
图4是实施例D1中小鼠眼脉络膜的相对病变面积统计图。
具体实施方式
实施例A1：一种改性壳聚糖，具有CS-X1-R1的结构，其中CS是壳聚糖，X1是酰胺键，由庚酸的羧基和壳聚糖上的游离氨基反应得到，R1是含有6个碳原子的脂肪链，将此结构改性壳聚糖命名为CCS-7。
以分子量为50KDa，脱乙酰度>90％的壳聚糖为原料，选择庚酸作为脂肪酸的修饰分子，通过化学偶联反应合成系列庚酸改性的壳聚糖(CCS-7)。记录所得壳聚糖衍生物的水溶性(定义为：以1mg/mL的浓度溶解于pH＝5-7的去离子水中)，并采用茚三酮法测定所得壳聚糖衍生物的氨基取代度，以计算疏水脂肪链的接枝率(或取代度)。
庚酸改性的壳聚糖(CCS-7)的合成：
以碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为耦合剂，通过壳聚糖上的氨基与庚酸的羧基之间的缩合反应，制备系列庚酸改性的壳聚糖衍生物。具体的合成方法为：准确称取1g壳聚糖，溶于100mL 0.1M盐酸溶液中，以1M氢氧化钠水溶液调节pH至5-7之间，加入0.005-0.0125mol的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另分别称取0.001-0.0025mol的庚酸溶于20mL的无水二甲基亚砜，加入0.005-0.0125mol的碳二亚胺(EDC)(羧基与EDC、NHS的摩尔比为1:5:5)，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳聚糖的反应液与庚酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。反应结束，向终反应液加入大量无水乙醇，低温沉降得到絮状产物，抽滤后，真空干燥，得到系列庚酸改性的壳聚糖衍生物(CCS-7)。
庚酸改性的壳聚糖(CCS-7)的合成路线图：
茚三酮法测定CCS-7氨基取代度：
取不同量的壳聚糖(0.5-4mg)，精密称量，分别溶于2mL的醋酸/醋酸钠缓冲液(0.2M,pH＝5.4)中，加入0.30wt％茚三酮的乙二醇甲醚溶液1mL和1.7wt％还原茚三酮的乙二醇甲醚溶液1mL，于100℃孵育10min。冷却后加入2mL 60％的乙醇溶液，摇匀，测定570nm波长处的吸收值，制备标准曲线。取上述庚酸改性的壳聚糖衍生物2mg溶于醋酸/醋酸钠缓冲液，相同操作，测定570nm波长处的吸收值，按标准曲线计算庚酸改性的壳聚糖衍生物的氨基取代度。
实验结果如表1所示，按照上述制备步骤得到的CCS-7的实际氨基取代度随着庚酸投料比的增加而增加，且产物均可以很好的溶解于偏酸性的水溶液中(1mg/mL,pH＝5-7)，但是，当投料比增加到一定程度时，CCS-7(庚酸投料比增加至50％)的产物出现了在水相中溶解不完全的现象，不能进一步用于实际组合物制备的应用中。投料比在10％～40％时，能够实现修饰，并且产物可溶，投料比在40％时，其取代度不小于36％。
在实验设计的投料比下，CCS-7的氨基取代度(即碳氢链的接枝率)从最低的9.1％增加到最高的36.4％。两亲性聚合物载体的疏水链段所占比例对其与天然大分子活性成分的组装效率以及组装稳定性有因果关系，因此，CCS-7具有较宽的碳氢链接枝效率的调整空间，可以为后续应用提供更多的选择。
表1：不同投料比的烷基化壳聚糖对应取代度统计表
实施例 投料比(％) 取代度(％) 水溶性
实施例A1.1 10 9.1 可溶
实施例A1.2 20 18.1 可溶
实施例A1.3 30 26.7 可溶
实施例A1.4 40 36.4 可溶
实施例A1.5 50 NA 不溶
(投料比是指制备时投入的脂肪酸的羧基占壳聚糖的氨基摩尔百分比)
经过多次实验，发现该方法制备得到的产物具有较好的均一性，同样投料比制备得到的改性壳聚糖，取代度接近，投料比为40％时，取代度约为36～38％，一方面说明制备方法具有可重复性，另一方面，具备反应效率高，产率高的特点。
实施例A2：一种复合物(CCS-7/BSA)，包括改性壳聚糖和蛋白质，所述改性壳聚糖是实施例A1得到的CCS-7，所述蛋白质是牛血清白蛋白(简称BSA)，用于说明改性壳聚糖和蛋白质能够形成复合物，并且具有明显的促渗效果。
选择实施例A1.1至实施例A1.4中得到的CCS-7的水溶性产物作为载体，与牛血清白蛋白(BSA)制备改性壳聚糖和蛋白质的复合物，然后通过体外黏膜促渗实验以及体外透皮促渗实验进行促渗效果验证。
改性壳聚糖和蛋白质的复合物的制备方法：
称取一定质量的实施例A1.1至实施例A1.4中得到的CCS-7以及BSA粉末分别溶于去离子水，制备载体母液与蛋白母液，然后按照质量比为1:1的比例将各取代度的CCS-7分别与BSA混合均匀之后，再加入与混合液等体积的磷酸缓冲液(PB,0.01M,pH＝7)调节体系的pH值，该过程中BSA与CCS-7之间通过静电作用以及疏水相互作用相互结合，可得到CCS-7/BSA的复合物。
实施例A3：一种改性壳聚糖，具有CS-X1-R1的结构，其中CS是壳聚糖，X1是酰胺键，由不同碳链长度的修饰分子和壳聚糖上的游离氨基反应得到。由含有8个碳原子的脂肪链与壳聚糖氨基反应，共价修饰得到的改性壳聚糖，R1是含有7个碳原子的脂肪链，将此改性壳聚糖命名为CCS-8；由含有12个碳原子的脂肪链与壳聚糖氨基反应，共价修饰得到的改性壳聚糖，R1是含有11个碳原子的脂肪链，将此结构改性壳聚糖命名为CCS-12；由含有16个碳原子的脂肪链与壳聚糖氨基反应，共价修饰得到的改性壳聚糖，R1是含有15个碳原子的脂肪链，将此结构改性壳聚糖命名为CCS-16。
CCS-8、CCS-12、CCS-16制备方法与实施例A1相同，区别在于使用不同的修饰分子。
使用实施例A1中茚三酮法测定CCS-8、CCS-12、CCS-16的氨基取代度。结果如表2所示。
表2：不同长度的脂肪链修饰壳聚糖的产物性质及黏膜促渗效果统计表。
结果显示，不同碳原子数的脂肪链均能够修饰壳聚糖得到改性壳聚糖，并且通过调节投料比能够得到不同取代度的改性壳聚糖，其中投料比是指原料中修饰分子与壳聚糖的摩尔比。综合实施例A1和A3，经过多次重复实验，不同长度的脂肪链作为修饰分子，与壳聚糖反应得到的改性壳聚糖，其取代度不超过40％。产物溶解性良好，能够进一步用于复合物的制备。
实施例A4：一种复合物，包括实施例A3所述的改性壳聚糖和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(BSA-FITC)。制备方法与实施例A2相似，区别在于将原料CCS-7替换为实施例A3得到的CCS-8、CCS-12或CCS-16。
实施例B1：一种改性壳聚糖，具有CS-X1-R2-R3的结构，将此结构改性壳聚糖命名为CS-S08。
以分子量为50KDa，脱乙酰度>90％的壳聚糖为原料，选取8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠(以下简称SNAC)为修饰分子中间体，通过壳聚糖上的氨基与修饰分子的羧基基团之间的酰化反应，合成具有CS-X1-R2-R3结构的壳聚糖衍生物。
具体的合成方法为：准确称取1g壳聚糖，溶于100mL 0.1M盐酸溶液中，以1M氢氧化钠水溶液调节pH至5-7之间；另分别称取0.001-0.0025mol的SNAC溶于20mL的无水二甲基亚砜，依次加入0.005-0.0125mol的碳二亚胺(EDC)和0.005-0.0125mol的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(羧基与EDC、NHS的摩尔比为1:5:5)，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时，反应过程中维持pH在5-7之间。随后，将壳聚糖溶液与活化后的中间体的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。反应结束，终反应液经无水乙醇沉降过滤后，真空干燥，即可得到具有CS-X1-R2-R3结构的改性壳聚糖(CS-S08)。
其中X1为酰胺键，由SNAC上的酰氧基与壳聚糖上的游离氨基反应得到，R2为含有7个碳原子的脂肪链，R3为与脂肪链相连的2-羟基苯甲酰胺基，SNAC的投入量不同，得到的产物中壳聚糖的氨基取代度不同。CS-S08的改性示意及具体结构式如下：
实施例B2：一种复合物，包括实施例B1制备得到的具有CS-X1-R2-R3结构的改性壳聚糖和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(BSA-FITC)，制备方法具体为：
称取一定质量的实施例B1中得到的CS-S08以及BSA-FITC粉末分别溶于去离子水，制备载体母液与蛋白母液，然后按照质量比为1:1的比例将CS-S08分别与BSA-FITC混合均匀之后，再加入与混合液等体积的磷酸缓冲液(PB，0.01M,pH＝7)调节体系的pH值，该过程中BSA-FITC与CS-S08之间通过静电作用以及疏水相互作用相互结合，可得到复合物。
实施例C：改性壳聚糖(烷基链修饰的壳聚糖)和蛋白复合物在透眼部屏障的应用
实施例C1：按照实施例A2的方法制备改性壳聚糖(实施例A3.2、实施例A3.6、实施例A3.10)和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(BSA-FITC)的复合物，改性壳聚糖与蛋白的比例为4：1，与滴眼液基质磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)混合备用，BSA-FITC浓度为1mg/mL。
将小鼠麻醉，然后给每只眼睛定量给药5μL，在避光条件下饲养小鼠，6小时后牺牲小鼠，用PBS中性缓冲液冲洗眼球，摘取眼球以制作切片样品，然后使用共聚焦显微镜拍摄眼球中央纵切面样本，观察小鼠眼球视网膜部位的荧光信号分布及强度，结果如图1和表3所示。
图1中荧光标记的信号代表蛋白活性成分在眼后段组织中的分布情况，信号距离眼表越远，说明蛋白的渗透越充分，荧光信号越强，说明渗透的量越高，细胞核的标记主要显示出视网膜，脉络膜以及巩膜等组织的位置，便于辨别荧光信号是组织切片中的信号而非未渗透组织的无效分布。从图1中可以看出，实施例C1.1中仅有很小一部分蛋白在巩膜表面，说明游离的蛋白很难透过眼表屏障；实施例C1.2中的蛋白能够更多的穿透眼表屏障，如角膜，结膜屏障，其视网膜部位的荧光信号分布的面积更大，但是更强的荧光信号停留在眼部屏障表面；实施例C1.3、实施例C1.4、实施例C1.5中，不同长度的脂肪链改性的壳聚糖，与蛋白复合后，能够帮助蛋白更好的渗透眼部屏障到达眼底并累积在视网膜和脉络膜部位，并且这三组样品的蛋白渗透量随着脂肪链的增加而增加，软脂酸改性的壳聚糖的荧光信号最强。将游离的蛋白作为对照，计算各组样品中蛋白标记的相对荧光信号强度，表3结果显示，软脂酸(十六烷酸)改性的壳聚糖，其促进蛋白透过的效率是游离蛋白的26倍以上。
该实施例的结果表明，一定取代度和多种脂肪链长度修饰的阳离子聚合物均能有效促进蛋白分子透过眼部屏障，具有进一步应用于生物大分子活性成分滴眼递送的潜力。
表3：滴眼给药后6小时，小鼠眼球切片样品视网膜与脉络膜处蛋白标记的荧光信号强度统计表。
实施例C2：定量检测改性壳聚糖促进蛋白渗透眼部屏障
按照实施例A2的方法制备改性壳聚糖(CCS-8、CCS-12、CCS-16)和人源免疫球蛋白(IgG)的复合物，与滴眼液基质磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)混合备用，IgG浓度为2mg/mL。
同时制备壳聚糖和人源免疫球蛋白的复合物，与滴眼液基质磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)混合备用，IgG浓度为2mg/mL。
另制备人源免疫球蛋白与滴眼液基质磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)混合溶液，IgG浓度为2mg/mL。
将小鼠麻醉，然后给每只小鼠的每只眼球定量给药5μL(IgG浓度为2mg/mL)，6小时后牺牲小鼠，用中性PBS溶液冲洗眼球表面，摘取眼球，去除眼表多余的组织，称量每个眼球重量并记录，将眼球样品在液氮环境下冷冻研磨得到组织粉末，并使用WB及IP细胞裂解液分散组织粉末，并在4℃条件下处理过夜，高速离心后取上清液，用ELISA检测试剂盒检测上清液中IgG的浓度，结果如表4所示。
由于未渗透眼部屏障进入眼部的蛋白会在解剖前经PBS冲洗后除去，因此样品中检测得到的蛋白浓度越高，说明渗透眼部屏障并进入眼球内部的样品越多，即该组别中的渗透促进剂效果越好。随着改性壳聚糖的脂肪链长度的增加，促进蛋白渗透的效率提高，有更多的蛋白透过角膜进入眼部。通过计算相较于游离蛋白的透过率，结果显示软脂酸改性的壳聚糖，其促进蛋白渗透的效率达到游离蛋白的16倍以上，说明改性壳聚糖能够大大提高蛋白渗透眼部屏障的效率。
表4：不同组别中小鼠眼球中IgG含量统计表
样品名称 人源IgG含量(ng/g) 相对含量
实施例C2.1 游离IgG滴眼液 29.0 1
实施例C2.2 CCS-8/IgG滴眼液 204.5 7.05
实施例C2.3 CCS-12/IgG滴眼液 342.6 11.8
实施例C2.4 CCS-16/IgG滴眼液 491.5 16.9
实施例C1的结果直观的表明了活性成分渗透过眼部屏障后在眼睛部位的分布，实施例C2的结果定量地分析了壳聚糖载体材料促进蛋白渗透的效率，综合实施例C1和实施例C2的活体促眼部屏障渗透实验，说明脂肪链修饰的阳离子聚合物具有有效促进蛋白分子透过眼部屏障的效果，有极好的作为渗透促进剂应用于眼部给药的潜力。
实施例C3：按照实施例C2的方法，区别在于用兔取代小鼠，通过解剖分离兔眼不同结构层，定量检测不同部位中的IgG含量，从而评估软脂酸改性的壳聚糖(CCS-16)促进IgG渗透的能力。
按照房水、角膜、晶状体、玻璃体、视网膜的顺序分离各组织，称量各组织重量后冷冻研磨各个样品后用WB及IP细胞裂解液裂解各眼部组织，高速离心后取上清液，施用ELISA试剂盒检测样品中IgG的浓度，表5是兔眼不同组织结构中的IgG含量统计表。
结果显示，五个主要结构中，实施例C3.2中蛋白在各个结构层均有更高的分布量，说明CCS-16能够有效的促进蛋白的渗透，在眼中各个部位，有CCS-16作为渗透促进剂的组别，均有更高的蛋白含量。并且，更多的活性成分富集在视网膜部位，是大多数眼后端疾病治疗的靶部位，进一步验证了这种由烷基链修饰的壳聚糖作为渗透促进剂的组合物在治疗眼后段疾病的潜力。
表5：兔眼不同部位的IgG含量统计表
实施例C4：使用人工泪液基质，探究传统滴眼剂型助剂对改性壳聚糖和蛋白复合物滴眼渗透的影响。
人工泪液基质成分：聚维酮(20g/L)、聚乙烯醇(14g/L)、羟丙甲纤维素(10g/L)、葡聚糖(2g/L)和羟丙甲纤维素(10g/L)。
将实施例C3.2中的复合物与不同人工泪液基质成分分别混合，得到五种不同的滴眼制剂，按照实施例C2的实验方法定量评价不同组别兔眼视网膜组织中的IgG含量，表6为不同组别兔眼视网膜组织中的IgG含量。
结果显示，相比较实施例C4.1，除了聚维酮之外，聚乙烯醇、羟丙甲纤维素以及葡聚糖和羟丙甲纤维素的组合物均对烷基化壳聚糖的滴眼促渗具有促进作用，尤其以葡聚糖和羟丙甲纤维素的复方人工泪眼效果最佳，视网膜组织中的IgG含量提高了3倍以上。而聚维酮对滴眼促渗表现出抑制作用，促渗效率降低，可能是因为聚维酮具有促进上皮细胞间紧密结合修复，恢复上皮屏障，降低通透性的作用，因此影响了改性壳聚糖的促渗作用。
这些人工泪液基质成分均为市售滴眼制剂中常用的辅料，用于增加活性成分在眼部停留的时间从而增加透过眼部屏障的活性成分量，这些辅料本身不具有促进生物大分子活性成分透过生物屏障的能力，对于最终制剂的制备有帮助。
表6：实施例C4中不同组别兔眼视网膜组织中的IgG含量
实施例C5：改性壳聚糖在滴眼应用中的安全性
以眼部状态变化作为观测指标，记录实验中兔子眼部是否出现眼角膜浑浊、虹膜纹理不清晰、结膜充血、水肿、异常分泌物等情况，在给药后短期及长期观测中，如无前述异常情况出现，说明该组别的复合物安全性良好。
制备葡聚糖和羟丙甲纤维素的组合物作为滴眼基质，和实施例C2.2、实施例C2.3、实施例C2.4的复合物混合制备眼药水，然后对兔子眼表进行滴眼给药，IgG浓度为2mg/mL，每只眼睛给药200μL，每天给药两次，持续四周，观察每次滴眼后，兔子眼部是否出现异常，并观察四周之后兔子眼部状态，结果发现，兔子眼部均未出现前述异常情况，说明改性壳聚糖不具有短期和长期的眼部刺激性，安全性较好。
实施例C6：使用改性壳聚糖和anti-VEGFA的复合物对黄斑病变的治疗实验。
黄斑区是位于视网膜的一个重要区域，位于眼后段，主要与精细视觉、色觉功能等视功能有关，黄斑区的病变会引起视力下降、眼前黑影、视物变形等症状，影响患者视觉功能。黄斑病变的诱因多样，遗传、年老、炎症等均可能导致黄斑病变。黄斑病变患者的晚期病征是因眼球内的血管异常增生，突破了脉络膜甚至是视网膜，异常的血管壁脆弱，易出现血管渗漏，加重病人视力模糊感，并加重黄斑病变病情。及时在该阶段实施有效的临床治疗，能够降低失明的几率。临床用于治疗黄斑病变的活性成分主要是血管生成因子抗体如雷珠单抗，康柏西普，阿柏西普等，这些生物大分子抗体活性成分在临床试验中具有较好的短期疗效。
建立激光诱导的小鼠脉络膜新生血管模型，模拟黄斑病变疾病。患有脉络膜新生血管的小鼠被随机分为四组：
实施例C6.1：施用无活性成分的PBS(浓度0.01M，pH＝7.0)
实施例C6.2：滴眼给药方式，使用PBS(浓度0.01M，pH＝7.0)溶解anti-VEGFA得到滴眼液，anti-VEGFA浓度为2mg/mL，每天进行滴眼治疗一次，给药体积为5μL；
实施例C6.3：滴眼给药方式，使用PBS(浓度0.01M，pH＝7.0)溶解实施例A3.11制备得到的CCS-16和anti-VEGFA的复合物得到滴眼液，使用人工泪液溶解，anti-VEGFA的浓度为2mg/mL，每天进行滴眼治疗一次，给药体积为5μL，载体和蛋白的质量比为5：1；
实施例C6.4：玻璃体腔注射anti-VEGFA的PBS溶液，浓度10mg/mL注射体积5μL，作为阳性对照
经过两周的治疗，利用光学相干断层扫描以及眼底荧光造影技术对给药前后患有脉络膜新生血管的小鼠进行脉络膜新生血管严重程度的评价，图2是小鼠光学相干断层扫描以及眼底荧光造影图像。脉络膜新生血管面积增加说明病情加重，反之说明好转，即活性成分起效。从图中可以看出，经过CCS-16/anti-VEGFA滴眼液以及作为阳性对照的游离anti-VEGFA玻璃体腔注射的两周治疗后，脉络膜新生血管渗漏明显减少。此外，对脉络膜新生血管面积统计，并计算脉络膜新生血管面积％(表7)发现，实施例C6.1和实施例C6.2对脉络膜新生血管渗漏面积无改善，脉络膜新生血管面积增加，而实施例C6.3以及作为阳性对照的实施例C6.4的小鼠在治疗后有效抑制脉络膜新生血管渗漏面积，约为治疗前的40％。说明改性壳聚糖和抗体活性成分的复合物能够促进滴眼方式给药的活性成分渗透率，并且活性成分能够有效发挥作用，从而达到和玻璃腔体注射类似的治疗效果，而玻璃体注射给药是目前临床上必要的治疗手段，因其侵入性导致患者依从性差，如果能够通过滴眼的方式实现治疗，将具有重要意义。
表7：脉络膜新生血管面积变化统计表
实施例C7：改性壳聚糖的滴眼促渗效果研究
实施例B1的改性壳聚糖和蛋白的复合物滴眼渗透效果实验。
按照实施例A2的方法制备改性壳聚糖(实施例A10.2、实施例A11.2、实施例A13.2)和人源免疫球蛋白(IgG)的复合物，载体和蛋白的比质量比为2：1，与滴眼液基质磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)混合备用，IgG浓度为2mg/mL。
同时制备单独的IgG与滴眼基质酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)混合溶液，IgG浓度为2mg/mL。将小鼠麻醉，然后使用定量给药器给每只小鼠的每只眼球定量给药5μL，饲养小鼠6小时，然后牺牲小鼠，用中性PBS溶液冲洗眼球表面，摘取眼球，去除眼表多余的组织，称量每个眼球重量后将眼球样品在液氮环境下冷冻研磨得到组织粉末，并使用WB及IP细胞裂解液分散组织粉末，并在4℃条件下处理过夜，高速离心后取上清液，用ELISA检测试剂盒检测上清液中IgG的浓度。结果显示，几种改性壳聚糖均能够促进IgG渗透眼部屏障，进入眼球，预期可实现分子量与IgG接近或更小的活性成分的渗透。
实施例D：
实施例D1：实施例B1所述改性壳聚糖(CS-S08)和蛋白大分子活性成分复合物用于小鼠湿性年龄相关黄斑变性的治疗。
湿性年龄相关黄斑变性的特点是眼底形成异常新生血管，是危害视力、致盲的主要原因，目前临床可使用玻璃体腔内注射阿柏西普进行治疗，阿柏西普是一种全人类的重组融合蛋白，能够抑制血管内皮生长因子和胎盘生长因子，阿柏西普的蛋白质分子量约96kD，糖基化后分子量约115kD。
本实施例中使用改性壳聚糖CS-S08和阿柏西普形成复合物，通过滴眼的给药方式进行有效成分的递送，用于湿性年龄相关黄斑变性的治疗。
具体地，采用激光光凝术构建小鼠黄斑变性模型，建模当天记为第0天，第7天起，进行分组治疗，实验分组及实验方法如下：
实施例D1.1：不进行任何治疗；
实施例D1.2：玻璃体内注射阿柏西普溶液，以阿柏西普质量计算，剂量为80μg/眼，仅给药一次；
实施例D1.3：人工泪液溶解的阿柏西普，以阿柏西普质量计算，剂量为10μg/天/眼，连续给药28天；
实施例D1.4：人工泪液溶解的复合物，所属复合物按照实施例A2的方法制备得到，改性壳聚糖为CS-S08，蛋白大分子活性成分为阿柏西普，改性壳聚糖CS-S08和阿柏西普的质量比为2：1，以阿柏西普质量计算，剂量为10μg/天/眼，连续给药28天。
在第7天通过荧光素眼底血管造影术验证小鼠黄斑变性模型的成功建立并分组给药治疗，在第14天、第21天、第28天、第35天通过荧光素眼底血管造影术进行疗效评价，并通过ImageJ对光斑渗漏面积进行测量和统计，具体公式如下：
相对病变面积＝第X天的光斑渗漏面积/第7天光斑渗漏面积。
图3是实施例D1.1～1.4小鼠眼部造影成像图，图4是实施例D1.1～1.4小鼠眼脉络膜的相对病变面积统计图。
结果显示，第14天，实施例D1.2中通过玻璃体内注射阿柏西普已表现出抑制新生血管生成的效果，说明阿柏西普的现有给药方式能够达到治疗效果。同时，根据统计数据，实施例D1.3用人工泪液直接溶解阿柏西普进行滴眼，不能有效控制新生血管生成，说明大分子活性成分在没有载体帮助时直接通过滴眼递送不能透过眼部屏障，到达病变部位，发挥疗效。而实施例D1.4中，用改性壳聚糖与阿柏西普形成复合物，再使用人工泪液分散后滴眼，能够抑制新生血管生成，且随着治疗时间的增加，最终治疗效果接近玻璃体一次性注射给药的实施例D1.2的治疗效果。
综合来看，改性壳聚糖能够帮助大分子活性成分透过眼部屏障，并发挥疗效，对眼后区疾病进行治疗，具备制备滴眼制剂的潜力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。
尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本申请实施例实质和范围的修正和等价组合。
同理，应当注意的是，为了简化本申请披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本申请实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本申请对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。
最后，应当理解的是，本申请中所述实施例仅用以说明本申请实施例的原则。其他的变形也可能属于本申请的范围。因此，作为示例而非限制，本申请实施例的替代配置可视为与本申请的教导一致。相应地，本申请的实施例不仅限于本申请明确介绍和描述的实施例。

Claims (15)

1.一种改性壳聚糖，其特征在于，
所述改性壳聚糖具有通式Ⅰ：CS-X1-R1
所述CS为壳聚糖或壳聚糖的衍生物，所述壳聚的分子量范围在1000-5000000，脱乙酰度不低于55％；
所述X1选自酰胺键、磺酰胺键、席夫碱基、仲胺、烷基胺、氨基甲酸酯、酯键、醚、磷酸酯、磺酸酯、脲、磷酰胺、脒键中的任意一种；
所述R1来自于所述修饰分子；
所述修饰分子选自脂肪族化合物。
2.根据权利要求1所述的改性壳聚糖，其特征在于，所述脂肪族化合物选自脂肪酸、脂肪醛、脂肪酰卤、脂肪酸酐、脂肪族聚酯。
3.根据权利要求1所述的改性壳聚糖，其特征在于，所述X1是酰胺键，所述R1是含有6个碳原子的脂肪链、含有7个碳原子的脂肪链、含有11个碳原子的脂肪链、含有15个碳原子的脂肪链中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的改性壳聚糖，其特征在于，所述改性壳聚糖的取代度不超过40％。
5.一种改性壳聚糖，其特征在于，所述改性壳聚糖具有通式Ⅱ：
CS-X1-R2-R3；
所述CS为壳聚糖或壳聚糖的衍生物，所述壳聚糖的分子量范围在1000-5000000，脱乙酰度不低于55％；
所述X1选自酰胺键、磺酰胺键、席夫碱基、仲胺、烷基胺、氨基甲酸酯、酯键、醚、磷酸酯、磺酸酯、脲、磷酰胺、脒键中的任意一种；
所述R2为含有n个碳原子的脂肪链，其中2≤n≤20；
所述R3含有酚羟基或其衍生物、邻苯二酚基团或其衍生物、邻苯三酚基团或其衍生物中的任一种。
6.根据权利要求5所述的改性壳聚糖，其特征在于，所述X1是酰胺键，R2为含有7个碳原子的脂肪链，R3为2-羟基苯甲酰胺基。
7.根据权利要求5所述的改性壳聚糖，其特征在于，所述改性壳聚糖的取代度不超过20％。
8.一种权利要求1所述的改性壳聚糖的制备方法，其特征在于，通过修饰分子与壳聚糖或壳聚糖的衍生物反应；
所述修饰分子含有以下活性基团中的一种或多种：羧酸基团、磺酸基团、酸酐、酰卤基团、磺酰氯、酰氯、NHS酯、亚氨酸酯、五氟苯酯、醛基、异氰酸酯、环氧基团、双键、炔基、羟甲基膦。
9.一种透生物屏障的复合物，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的改性壳聚糖和被所述改性壳聚糖装载递送的活性成分；
所述改性壳聚糖和所述活性成分以物理或化学方式结合；
所述活性成分选自小分子活性成分和/或生物大分子活性成分。
10.根据权利要求9所述的透生物屏障的复合物，其特征在于，所述生物屏障包括眼部屏障、泪液屏障、角膜/结膜屏障、血房水屏障、血视网膜屏障中的任意一种。
11.根据权利要求9所述的透生物屏障的复合物，其特征在于，所述活性成分分子量不超过240kD。
12.据权利要求9所述的透生物屏障的复合物，其特征在于，所述生物大分子活性成分为蛋白质、多肽、核酸中的一种或多种。
13.一种滴眼制剂，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的改性壳聚糖或权利要求9-11任一项所述的透生物屏障的复合物。
14.根据权利要求13所述的滴眼制剂，其特征在于，所述滴眼制剂还包括赋形剂、增稠剂、保湿成分。
15.根据权利要求1-7任一项所述的改性壳聚糖或权利要求9-12任一项所述的透生物屏障的复合物在制备眼部疾病治疗活性成分中的应用。
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