JP2023521146A - 網膜障害の処置のための二重特異性アプタマー組成物 - Google Patents

網膜障害の処置のための二重特異性アプタマー組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書では、複数のリガンド、特にＶＥＧＦ、ＩＬ８及びＡｎｇ２に対して親和性を有する二重特異性アプタマー、並びにそれを含む医薬組成物が開示される。網膜疾患又は障害の処置のためにいくつかの二重特異性アプタマーを用いる方法、並びにそのような二重特異性アプタマー及び組成物を製造する方法も開示される。【選択図】なし

Description

（関連出願のクロスリファレンス）
本願は、２０２０年４月６日に出願された仮米国出願第６３／００５６２９号に関し、その利益を主張する。この仮出願の全体は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
本明細書に開示されるのは、二重特異性アプタマー、それを含む医薬組成物、並びに二重特異性アプタマー及び医薬組成物を用いて網膜障害を処置する方法である。また、このような二重特異性アプタマー及び医薬組成物の製造方法も開示される。
滲出型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）は、１７０万人以上の米国人が罹患しており、毎年約２０万人が新たに滲出型ＡＭＤと診断されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。抗ＶＥＧＦ療法（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））は、標準的な治療法であり、一般的に大きな視力回復が得られる。残念ながら、全ての患者が完全に反応するわけではなく、治療した患者の２５～７５％が網膜液を持続させる（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２３， １３５１－１３５９ （２０１６）； Ｇｒｏｕｐ， Ｃ．Ｒ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６４， １８９７－１９０８ （２０１１）； Ｈｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１９， ２５３７－２５４８ （２０１２））。網膜液の持続は、乾燥／正常網膜の患者と比較して、より悪い長期の視覚的アウトカムに関連する（Ｓｈａｒｍａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２３， ８６５－８７５ （２０１６）； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｔｉｎａ ３３， ２３－３４ （２０１３））。反応が良好な患者に対しては、視力回復又は維持のために、所定の投与間隔（薬剤によってｑ４ｗ、ｑ８ｗ又はｑ１２ｗ）又は「必要に応じて」治療を行うことができる。反応が不十分な患者には、毎月の投与が必要である。例えば、ＨＡＲＢＯＲ試験における患者の約３分の１は、視力において５文字以上の低下、網膜内液、網膜下液又は網膜下色素上皮液の結果、ほぼ毎月の投与を必要とした（Ｈｏ ｅｔ ａｌ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２１， ２１８１－２１９２ （２０１４））。完全に反応しない（例えば液体を維持する等）患者に対しては、現在、抗ＶＥＧＦ療法（通常はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）から開始）を代替療法（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）又はＥｙｌｅａ（登録商標））のいずれかに切り替えることが標準的な治療法となっている。場合によっては、治療薬の投与量を処方されている量よりも増やすこともある。しかしながら、切り替えによって得られる改善は通常わずかであり、ほとんどが逸話的なものである（Ｓｈａｈ， Ｃ．Ｐ． Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ （２０１８）； Ｙｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｔｉｎａ （Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．） ３８， １１５６ （２０１８））。
糖尿病網膜症（ＤＲ）の一種である糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、７５万人以上の米国人に発症し、糖尿病患者の視力低下の主要原因となっている（Ｖａｒｍａ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． ＪＡＭＡ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １３２， １３３４－１３４０ （２０１４））。抗ＶＥＧＦ療法は、３０％～４０％までの患者にのみ効果を示す。例えば、ＤＲＣネットワークのプロトコルＩのデータ分析では、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）の３回投与後１２週目までに最高矯正視力（ＢＣＶＡ）（１０文字以上）の改善を示したのは４０％の眼に過ぎなかった。毎月の投与を１年間続けても、ほとんどの患者において最初の１２週間で観察された以上の視力改善は観察されなかった（Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｖ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １７２， ７２－７９ （２０１６））。血管及び組織の炎症は、ＤＭＥに寄与し、これは、ＤＭＥ患者の硝子体及び房水における高レベルのサイトカインを創刊させる研究によって裏付けられている（Ｒｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１６， ８０－８６ （２００９）； Ｆｕｎｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｔｉｎａ ３０， １４１２－１４１９ （２０１０）； Ｆｅｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８ （２０１８）； Ｊｏｎａｓ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｔｉｎａ ３２， ２１５０－２１５７ （２０１２））。ステロイド（Ｏｚｕｒｄｅｘ（登録商標）及びＩｌｕｖｉｅｎ（登録商標））は、単独又は抗ＶＥＧＦ療法との併用で第二選択薬として承認されている。しかしながら、これらの薬剤の幅広い作用機序により、多くの異なるサイトカイン、ケモカイン、成長因子が部分的にダウンレギュレートされる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ （Ａｕｃｋｌａｎｄ， ＮＺ） １０， １７２３ （２０１６）； Ｒｅｇｉｌｌｏ， Ｃ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｌａｓｅｒｓ ａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｎａ ４８， ２９１－３０１ （２０１７））。
Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）は月１回投与、Ｅｙｌｅａ（登録商標）は３か月に１回投与後に２か月に１回の投与が当初の重要なランダム化比較試験で支持された。ｗＡＭＤ及びＤＭＥの治療負担を軽減するために、これらの薬剤の最適な投与方法の研究に注目が集まっている。抗ＶＥＧＦ療法は、硝子体内注射を繰り返すことによる負担、リスク及びコストを軽減するために、一定の間隔で投与する「連続投与」、又は投与間隔を変える「非連続投与」が行われてきた。これらの非連続的な投与には、滲出物の所見に基づく「ｐｒｏ ｒｅ ｎａｔａ」（ＰＲＮ）アプローチ、又は滲出物が制御された後に評価及び治療の間隔を徐々に広げる「ｔｒｅａｔ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄ」（Ｔ＆Ｅ）アプローチ等が含まれる。しかしながら、最近の実際のデータでは、年間の注射の回数が少ない患者は、重要な臨床試験における患者よりも有意に悪い視力結果を得ることが示されている。
抗ＶＥＧＦ療法は有効であり、網膜疾患の治療方法に革命をもたらしたが、現在の治療法の注射負担のために治療に応じない、又は治療が不十分であり、炎症、網膜液及び浮腫を残す患者がかなりの割合で存在する。有効性を高め、治療負担を軽減し、患者のケアを向上させるための新たなアプローチが求められている。
本明細書では、２つ以上の標的分子（例えばＶＥＧＦ、ＩＬ８、Ａｎｇ２及びそれらの組み合わせ）に特異的に結合する二重特異性アプタマー（例えばＲＮＡアプタマー）、及びそのような二重特異性アプタマーを含む医薬組成物が開示される。また、眼疾患及び障害（例えば網膜疾患及び障害）の処置のために、そのような二重特異性アプタマー及び医薬組成物を使用する方法、並びにそのような二重特異性アプタマー及び医薬組成物を製造する方法が開示される。
一態様において、二重特異性アプタマーは、式Ｉを含み：
Ｘ１－（アプタマー１）－Ｘ２－（リンカー）－Ｙ１－（アプタマー２）－Ｙ２－ｉｎｖｄＴ（式Ｉ）
前記二重特異性アプタマーは、表Ａに示される少なくとも１つのヌクレオチド配列、又は表Ａに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、アプタマー１及びアプタマー２は、表１に示される配列番号から選択されるヌクレオチド配列及びそのような配列番号に対して少なくとも約７０％の同一性を有する配列をそれぞれ含む。
特定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約９～約１５ｎｍ、より具体的には約１３．５ｎｍの流体力学半径を有する。
特定の実施形態において、アプタマー１は、配列番号１～５４から選択されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、アプタマー２は、配列番号１～５４から選択されるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、アプタマー１及びアプタマー２は、約３０～約４０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、逆位デオキシチミジン（ｉｎｖｄＴ）は、式Ｉの二重特異性アプタマーの３’末端に組み込まれ、３’エキソヌクレアーゼによる分解及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長の両方を阻害する３’－３’結合の形成を引き起こす。
他の実施形態において、二重特異性アプタマーは、ＶＥＧＦ又はそのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ－Ａ）及びＩＬ８に特異的に結合し、その機能の約９０％～約１００％、より具体的には約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％を阻害する。
特定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約２５０ｐＭ～約２０ｐＭ、約５００ｎ～約１０ｐＭ、又は約７５０ｎＭ～約１ｐＭの結合親和性で、ＶＥＧＦ又はそのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ－Ａ）及びＩＬ８に結合する。所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９５０ｎＭ、又は約１ｐＭの結合親和性を有する。一実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約２０ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、又は約１ｐＭ未満の結合親和性を有する。
他の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦ又はそのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ－Ａ）及びＡｎｇ２に特異的に結合し、その機能の約９０％～約１００％、より具体的には約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％を阻害する。
特定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約２５０ｐＭ～約１０ｐＭの結合親和性で、ＶＥＧＦ又はそのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ－Ａ）及びＡｎｇ２に結合する。所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約５００ｎＭ～約５ｐＭ、又は約７５０ｎＭ～約１ｐＭの結合親和性を有する。所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９５０ｎＭ、又は約１ｐＭの結合親和性を有する。一実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、又は約１０ｐＭ未満の結合親和性を有する。
更なる実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＩＬ８及びＡｎｇ２に特異的に結合し、その機能の約９０％～約１００％、より具体的には約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％を阻害する。
特定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、約２０ｐＭ～約１０ｐＭの結合親和性で、ＩＬ８及びＡｎｇ２に結合する。一実施形態において、二重特異性アプタマーは、約２０ｐＭ、約１８ｐＭ、約１５ｐＭ、約１３ｐＭ、約１０ｐＭ、約８ｐＭ、約５ｐＭ、約３ｐＭ、又は約１ｐＭの結合親和性を有する。
所定の実施形態において、Ｘ１は０～５ヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドはＸ２のヌクレオチドに対して相補的である。
所定の実施形態において、Ｙ１は０～５ヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドはＹ２のヌクレオチドに対して相補的である。
一実施形態において、リンカーは、０～２０ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、１つ以上の２’ＯＭｅウリジン残基を含むヌクレオチドリンカーである。
所定の実施形態において、ヌクレオチドリンカーはＵＵＵＵＵを含み、Ｕは２’ＯＭｅである。
所定の実施形態において、ヌクレオチドリンカーは、ＧＣＣＧＵＧＵＵＵＵＣＡＣＧＧＣを含み、Ｕ、Ｇ、Ｃ及びＡは２’ＯＭｅである。
特定の実施形態において、リンカーは１つ以上の１つ以上の５ｍＵ残基を含むヌクレオチドリンカーである。
所定の実施形態において、リンカーは表Ｂに示される非ヌクレオチドリンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、チオール反応性部分（例えばマレイミド）及びアミン反応性部分を含むヘテロ二官能性リンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、１，３－プロパンジオール、１，６ヘキサンジオール、１，１２ドデシルジオール、トリエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールからなる群から選択される非ヌクレオチドリンカーである。
一実施形態において、アプタマーＡ及びアプタマーＢはハイブリダイゼーションにより結合される。
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、ポリエチレングリコールにより修飾される。
所定の実施形態において、ポリエチレングリコールは二重特異性アプタマーに結合される。
所定の実施形態において、ポリエチレングリコールは第２リンカーに結合され、第２リンカーは二重特異性アプタマーに結合される。
一実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、１つ以上の追加の治療剤により修飾される。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、化学修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、１つ以上の化学修飾されたヌクレオチドは、２’Ｆグアノシン、２’ＯＭｅグアノシン、２’ＯＭｅアデノシン、２’ＯＭｅシトシン、２’ＯＭｅウリジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
所定の実施形態において、１つ以上の化学修飾は、非修飾ヌクレオチドを有する同一の二重特異性ＲＮＡアプタマーと比較して、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／又は改善された輸送特性からなる群から選択される１つ以上の改善された特性をもたらす。
一実施形態において、１つ以上の化学修飾は、インビボ安定性の改善をもたらし、具体的には非ペグ化二重特異性ＲＮＡアプタマーの半減期を１０時間以上、より具体的には２０時間以上とする。
所定の実施形態において、非ペグ化二重特異性ＲＮＡアプタマーの半減期は、約１０～約１００時間であり、より具体的には約３００～約７００時間である。
所定の実施形態において、非ペグ化二重特異性アプタマーの半減期は、約４００～約７００時間であり、より具体的には約５００～約６００時間、さらに具体的には約５００、約５２５、約５５０、約５７５又は約６００時間である。
特定の実施形態において、１つ以上の修飾は、非修飾ヌクレオチドを含む結合成分を有する二重特異性アプタマーと比較して、標的に対する結合成分の親和性及び特異性を増強する。
特定の実施形態において、１つ以上の化学修飾は、二重特異性アプタマーに追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用及び官能性を提供する。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、アプタマー２８５、アプタマー４８１及びアプタマー６２８からなる群から選択されるＶＥＧＦアプタマー、並びにアプタマー２６９及びアプタマー２４８からなる群から選択されるＩＬ８アプタマー、並びにそれらの組み合わせを含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー２８５及びＩＬ８アプタマー２６９を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー２８５を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー４８１を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２６９を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー４８１を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー６２８を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２６９を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー６２８を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、アプタマー２８５、アプタマー４８１及びアプタマー６２８からなる群から選択されるＶＥＧＦアプタマー、並びにアプタマー２６９、アプタマー２４８及びハイブリダイゼーションにより結合されたそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩＬ８アプタマーを含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、アプタマー２８５、アプタマー４８１及びアプタマー６２８からなる群から選択されるＶＥＧＦアプタマー、並びにアプタマー２６９、アプタマー２４８及び非ヌクレオチドリンカーにより結合されたそれらの組み合わせからなる群から選択されるＩＬ８アプタマーを含む。
所定の実施形態において、二重特異性アプタマーは、非ヌクレオチドリンカーにより結合されたアプタマー２８５及びアプタマー２６９を含む。
特定の実施形態において、二重特異性アプタマーは、ハイブリダイゼーションにより結合されたアプタマー２８５及びアプタマー２６９を含む。
一実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、１つ以上の追加の分子と結合し、その結合は共有結合又は非共有結合であってもよい。所定の実施形態において、その結合はリンカーを含む。
特定の実施形態において、１つ以上の追加の分子は、抗体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、酵素、ポリマー、薬物、小分子、金ナノ粒子、放射標識、蛍光標識、ダイ、ハプテン、他のアプタマー又は核酸からなる群から選択される。
特定の実施形態において、１つ以上の追加の分子は、ポリエチレングリコールである。
第３の態様において、医薬組成物は、本明細書に開示された二重特異性ＲＮＡアプタマーと、医薬的に許容可能なキャリアとを含むことが開示される。
特定の実施形態において、医薬組成物は、硝子体内投与用に製剤化される。
第４の態様において注射器が開示され、当該注射器は、本明細書に開示された医薬組成物が事前に充填されている。
第５の態様において、少なくとも１つの標的分子の機能を変更する（例えば阻害する）方法が開示され、それは本明細書に開示された二重特異性アプタマーと標的分子とを接触させることを含む。
特定の実施形態において、標的分子は、ＶＥＧＦ、ＩＬ８、Ａｎｇ２又はそれらの組み合わせから選択される。
第６の態様において、網膜疾患又は障害を処置する方法が開示され、それは本明細書に開示された二重特異性アプタマーの有効量を、それを必要とする対象に投与することにより網膜疾患又は障害を処置することを含む。
特定の実施形態において、網膜疾患又は障害は、滲出型の加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）である。
特定の実施形態において、網膜疾患又は障害は、糖尿病網膜症である。
特定の実施形態において、糖尿病網膜症は、糖尿病黄斑浮腫である。
特定の実施形態において、網膜疾患は、網膜静脈閉塞症である。
特定の実施形態において、網膜静脈閉塞症は、網膜静脈分枝閉塞症である。
特定の実施形態において、網膜静脈閉塞症は、網膜中心静脈閉塞症である。
特定の実施形態において、網膜疾患は、未熟児の網膜症である。
特定の実施形態において、網膜疾患は、放射線網膜症である。
一実施形態において、それを必要とする対象は、網膜疾患又は障害と診断されている。
特定の実施形態において、それを必要とする対象は、他の抗ＶＥＧＦ剤により事前に処置されているが、そのような処置に対して最適以下の反応を示している。
他の実施形態において、それを必要とする対象は、網膜疾患又は障害のリスクがある。
一実施形態において、投与は眼球内投与である。
特定の実施形態において、投与は硝子体内注射によりなされる。
特定の実施形態において、硝子体内注射は、二重特異性組成物が事前に充填された注射器を含むキットでなされる。
特定の実施形態において、処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも３文字、少なくとも４文字、少なくとも５文字、少なくとも６文字、少なくとも７文字、少なくとも８文字、少なくとも９文字、少なくとも１０文字、少なくとも１１文字、少なくとも１２文字、少なくとも１３文字、少なくとも１４文字、少なくとも１５文字、少なくとも１６文字、少なくとも１７文字、少なくとも１８文字、少なくとも１９文字、少なくとも２０文字、又は２０文字以上の、糖尿病網膜症早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）チャートにおいて測定される全体的な最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の増大をもたらす。
一実施形態において、処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の基準値からＢＣＶＡにおいて１５文字以上増大する患者の割合をもたらす。
一実施形態において、処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の基準値からＢＣＶＡにおいて１０文字以上増大する患者の割合をもたらす。
一実施形態において、処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の基準値からＢＣＶＡにおいて５文字以上増大する患者の割合をもたらす。
特定の実施形態において、処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の、蛍光眼底造影（ＦＡ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定された網膜液の低減をもたらす。
特定の実施形態において、処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の、蛍光眼底造影（ＦＡ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定された網膜厚の低減をもたらす。
特定の実施形態において、処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の、蛍光眼底造影（ＦＡ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定された脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）病変の総面積の低減をもたらす。一実施形態において、当該方法は、例えば少なくとも１つの追加の治療剤等の少なくとも１つの追加の治療成分を、それを必要とする対象に同時投与することをさらに含む。
特定の実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、Ｉｌｌｕｖｉｅｎ及びＯｚｕｒｄｅｘ（登録商標）から選択される。
第７の態様において、それを必要とする対象の群を処置する方法が提供され、それはそのような対象に、本明細書に開示された二重特異性アプタマーの有効量を投与することを含む。
一実施形態において、その方法は、処置された対象の３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上に有効な処置をもたらす。特定の実施形態において、有効な処置は、糖尿病網膜症早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）チャートにおいて測定される全体的な最高矯正視力（ＢＣＶＡ）により測定される。
一実施形態において、その方法は、持続する網膜液が維持されるそのような対象を３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満又は１０％未満にする。
第８の態様において、本明細書に開示された二重特異性ＲＮＡアプタマーを製造する方法であり、それは、直接的な化学合成、酵素的合成、化学合成後のドメイン化学的結合、及び／又はドメインハイブリダイゼーションを含む。
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、直接的な化学合成により合成される。
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、酵素的合成により合成される。
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、化学合成後のドメイン化学的結合により合成される。
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、ドメインハイブリダイゼーションにより合成される。
図１Ａは、実験的に得られる構造と一致するｍｆｏｌｄで折り畳まれたアプタマー２８５の構造を示す。 図１Ｂは、実験的に得られる構造と一致するｍｆｏｌｄで折り畳まれたアプタマー２６９の構造を示す。 図１Ｃは、ｍｆｏｌｄで折り畳まれたアプタマー２８５とアプタマー２６９とで構成された二重特異性アプタマーの構造を示す。アプタマードメインの構造は、実験的に得られた構造に一致しない。 図１Ｄは、ｍｆｏｌｄで折り畳まれた２塩基対伸長されたアプタマー２８５のバリアント（アプタマー２８５ｅｘ）とアプタマー２６９とで構成された二重特異性アプタマーの構造を示す。アプタマードメインの構造は、実験的に得られた構造に一致する。ボックス領域は追加の塩基対を強調する。 図１Ｅは、ｍｆｏｌｄで折り畳まれたアプタマー２８５と２塩基対伸長されたアプタマー２６９のバリアント（アプタマー２６９ｅｘ）で構成された二重特異性アプタマーの構造を示す。アプタマードメインの構造は、実験的に得られた構造に一致する。ボックス領域は追加の塩基対を強調する。 図２は、流体力学半径と硝子体内半減期との間の実験的に得られた関連性のプロットを示す。二重特異性アプタマーの標的範囲が示される。 図３は、直接的な化学合成による二重特異性アプタマーの合成、脱保護、ＰＥＧ化及び精製を含むステップを説明するフローチャートを示す。 図４は、ヌクレオチドリンカーＮ（ｎ）により２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。２つの異なるアプタマードメインは、ヌクレオチドで構成されたリンカーにより結合され得る。リンカーの長さは０～５０ヌクレオチド長の範囲で変更され得る。リンカーは構造不定又は構造化され得る（例えばステムループを形成するように設計される）。ステムループを形成するように設計される場合、ステムの長さは２～１０ヌクレオチドの間で変更され、ループの長さは３～１０の間で変更され得る。構造化されたステムリンカーは、０～１５ヌクレオチド長であるヌクレオチドリンカー（Ｘ（ｎ）及びＹ（ｎ））に隣接され得る。 図５Ａは、非ヌクレオチドリンカーにより２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。アプタマードメインは、第２アプタマーの５’末端に接続された第１アプタマーの３’末端に結合され得る。 図５Ｂは、非ヌクレオチドリンカーにより２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。アプタマードメインは、第２アプタマーの３’末端に接続された第１アプタマーの３’末端に結合され得る。 図５Ｃは、非ヌクレオチドリンカーにより２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。アプタマードメインは、第２アプタマーの３’末端に接続された第１アプタマーの５’末端に結合され得る。 図５Ｄは、非ヌクレオチドリンカーにより２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。アプタマードメインは、第２アプタマーの５’末端に接続された第１アプタマーの５’末端に結合され得る。 図６は、直接的な化学合成により生成された５つのｍＵ残基で構成されたヌクレオチド結合により結合されたアプタマー２８５とアプタマー２６９で構成された例示的二重特異性アプタマーを示す。ｍＡ、ｍＣ、ｍＵ及びｍＧは２’ＯＭｅＲＮＡであり、ｆＧは２’ＦＲＮＡであり、ｓｐ３は１，３プロパンジオールリンカーである。 図７は、合成後化学的コンジュゲートにより生成されたアプタマー２８５とアプタマー２６９で構成された例示的二重特異性アプタマーを示す。ここで示されるアプタマー２８５及び２６９は別々に合成される。その後、アプタマー２６９はＰＥＧ化される。ＰＥＧ化後に、アプタマーはＰＥＧリンカーを用いて化学的にコンジュゲートされる。ｍＡ、ｍＣ、ｍＵ及びｍＧは２’ＯＭｅＲＮＡであり、ｆＧは２’ＦＲＮＡであり、ｓｐ３は１，３プロパンジオールリンカーである。 図８Ａは、ハイブリダイゼーションにより２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。アプタマードメインは、第１アプタマーの３’末端が伸長され、ハイブリダイズされるように設計され、第２アプタマーにおける３’伸長で二本鎖を形成するようなハイブリダイゼーションにより結合され得る。又は、アプタマードメインは、第１アプタマーの５’末端が伸長され、ハイブリダイズされるように設計され、第２アプタマーにおける５’伸長で二本鎖を形成するようなハイブリダイゼーションにより結合され得る。二本鎖長（ＤＬ）は、３～３５ヌクレオチドの間で変更され得る。二本鎖は、０～２５ヌクレオチド長のヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーによりアプタマーから分離され得る。 図８Ｂは、ハイブリダイゼーションにより２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。アプタマードメインは、第１アプタマーの３’末端が伸長され、ハイブリダイズされるように設計され、第２アプタマーにおける５’伸長で二本鎖を形成するようなハイブリダイゼーションにより結合され得る。二本鎖長（ＤＬ）は、３～３５ヌクレオチドの間で変更され得る。二本鎖は、０～２５ヌクレオチド長のヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーによりアプタマーから分離され得る。 図８Ｃは、ハイブリダイゼーションにより２つのアプタマーを結合するための例、アプローチ及びパラメーターを示す。アプタマードメインは、第１アプタマーの５’末端が伸長され、ハイブリダイズされるように設計され、第２アプタマーにおける３’伸長で二本鎖を形成するようなハイブリダイゼーションにより結合され得る。二本鎖長（ＤＬ）は、３～３５ヌクレオチドの間で変更され得る。二本鎖は、０～２５ヌクレオチド長のヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーによりアプタマーから分離され得る。 図９は、ハイブリダイゼーションにより結合されたアプタマー２８５とアプタマー２６９で構成された例示的二重特異性アプタマーを示す。ここで示されるアプタマー２８５及び２６９は、短い８ヌクレオチドの相補的な伸長を生じるように別々に合成される。伸長は、ヘキサエチレングリコールリンカー（Ｓ１８）により３’末端で各アプタマーに結合される。アプタマー２６９の５’末端はＰＥＧ化されている。ｍＡ、ｍＣ、ｍＵ及びｍＧは２’ＯＭｅＲＮＡであり、ｆＧは２’ＦＲＮＡであり、ｓｐ３は１，３プロパンジオールリンカーである。
Ｉ．定義
本明細書で用いられる「約」の用語は、当業者であれば指定された値に合理的に類似すると考える、指定された値を含む値の範囲を意味する。実施形態において、「約」の用語は、本技術分野で一般に許容される測定を用いた標準偏差の範囲内であることを意味する。実施形態において、「約」とは、指定された値の±１０％に及ぶ範囲を意味する。実施形態において、「約」とは、指定された値を意味する。
本明細書で用いられる「投与する」又は「投与」の用語は、一般に、対象の身体上又は身体内の所望の部位又は位置、例えば眼内の部位又は位置に治療剤、組成物、製剤等を導入することを意味する。投与は、例えば医療従事者によって行われ得る。便宜上、本明細書では、一般に眼科医に言及する。しかしながら、本発明の方法及び他の方法（例えば、網膜障害の診断及び／又はモニタリングのための方法）の両方を含む本明細書に記載の方法は、任意の資格を有する医療従事者によって実施され得る。
本明細書で用いられる「親和性」の用語は、分子（例えばアプタマー）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強さを意味する。本明細書で用いられる「結合親和性」は、別途指示しない限り、結合ペア（例えば抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する内在性結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。本明細書で用いられる「高親和性」の用語は、５００ｍＭ未満を意味する。
本明細書で用いられる「抗原」の用語は、抗原結合アプタマーによって認識される結合部位又はエピトープを意味する。本明細書で用いられる「アプタマー」の用語は、高い親和性及び特異性で特定の分子に結合できるペプチド、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡ等の核酸分子を意味する。アプタマーに結合する例示的なリガンドは、以下に限定されないが、薬物、代謝物、中間体、補因子、遷移状態アナログ、イオン金属、核酸、及びエンドトキシン等の毒素等の小分子を含む。アプタマーは、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、細胞壁及び細胞膜等の細胞表面等を含む天然ポリマー及び合成ポリマーと結合し得る。リガンドとアプタマーとの結合は、エフェクタードメインのコンフォメーションの変化を引き起こし、標的分子との相互作用するための能力を変更する。アプタマーは、通常、標的分子との結合をインビトロで選択することにより得られる。しかしながら、アプタマーをインビボで選択することも可能である。アプタマーは、標的分子と複合体を形成することができる特定の結合領域を有し、同一の環境にある他の物質は核酸と複合体化しない。結合の特異性は、アプタマーのリガンドに対する解離定数（Ｋｄ）と、環境中の他の物質又は無関係な分子一般に対するアプタマーの解離定数との比較で定義される。リガンドとは、アプタマーと無関係の物質よりも大きな親和性で結合するものである。典型的に、アプタマーのリガンドに関するＫｄは、アプタマーと無関係の物質又は環境中の付随する物質とのＫｄよりも少なくとも約１０倍小さくなる。さらに好ましくは、Ｋｄは、少なくとも約５０倍小さく、より好ましくは少なくとも約１００倍小さく、最も好ましくは少なくとも約２００倍小さくなるであろう。アプタマーは、典型的には、約１０～約３００ヌクレオチド長であろう。より一般的には、アプタマーは、約３０～約１００ヌクレオチド長であろう。
本明細書で用いられる「アプタマードメイン」の用語は、核酸配列又はポリヌクレオチド配列内の核酸要素又はドメインを意味し、生物物理的に有効な量において、１つ又は複数の標的分子に結合する、又は親和性を有する。
本明細書で用いられる「二重特異性アプタマー」の用語は、２つの異なる抗原又は同一の抗原内の２つの異なるエピトープに結合するアプタマーを意味する。二重特異性アプタマーは、他の関連抗原、例えば他の種の同一の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。
本明細書で用いられる「キャリア」の用語は、化合物又は組成物と組み合わせたときに、意図された使用又は目的に対する化合物又は組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性又は他の特徴を補助又は促進する化合物、組成物、物質又は構造物を意味する。例えば、活性成分の分解を最小限に抑え、対象における副作用を最小限に抑えるためにキャリアが選択され得る。
本明細書で用いられる「同時投与」の用語は、本明細書に記載された二重特異性アプタマーを、１つ以上の追加の治療剤と同時に又は連続して対象に投与することを意味する。特定の実施形態において、１つ以上の追加の治療剤は、Ｉｌｌｕｖｉｅｎ及びＯｚｕｒｄｅｘ（登録商標）等のステロイドを含む。特定の実施形態において、１つ以上の追加の治療剤は、地図状萎縮及び進行性黄斑変性のドライ型の治療のための補体第３因子（Ｃ３）又は補体第５因子（Ｃ５）阻害剤を含む。一実施形態において、Ｃ３阻害剤は、ＡＰＬ－２（Ａｐｅｌｌｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。一実施形態において、Ｃ５阻害剤は、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）（Ｉｖｅｒｉｃ Ｂｉｏ）である。
「相補的」又は「相補性」の用語は、ポリヌクレオチド中の核酸が第２のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成する能力を意味する。例えば、配列Ａ－Ｇ－Ｔは配列Ｔ－Ｃ－Ａと相補的である。相補性は、核酸の一部のみが塩基対形成により一致する部分的なものと、全ての核酸が塩基対形成により一致する完全なものとがある。
本明細書で用いられる「コンジュゲート」の用語は、２つ以上の化合物を１つ以上の化学結合又はリンカーにより結合することによって形成される化学的化合物を意味する。本明細書で開示される一実施形態において、二重特異性アプタマーは、脂質若しくは高分子量の化合物（例えばＰＥＧ）、及び／又は他の治療剤にコンジュゲートされる。
「ＤＮＡ」の用語は、デオキシリボ核酸を意味する。
「有効量」及び「治療的有効量」の用語は、本明細書において互換的に用いられ、処置される疾患又は状態の１つ以上の症状をある程度緩和するために投与される十分な量の薬剤、組成物又はそれらの組み合わせを意味する。結果は、疾患の兆候、症状若しくは原因の減少及び／若しくは変更、又は生物学的システムの任意の他の所望の変化であり得る。例えば、治療のための「有効量」は、疾患症状の臨床的に有意な減少を提供するのに必要な本明細書に開示されるような組成物の量である。任意の個々のケースにおける適切な「有効」量は、用量漸増試験等の技術を用いて決定され得る。用量は、１回又は複数回投与で投与され得る。しかしながら、何が有効量とみなされるかの正確な決定は、患者の年齢、サイズ、疾患の種類又は程度、疾患の段階、投与経路、用いられる補助療法の種類又は程度、進行中の疾患プロセス及び所望の処置の種類（例えば積極的処置対従来の処置）を含むが、これらに限定されない各患者に個別の要因に基づいて行われ得る。
本明細書で用いられる「エピトープ」の用語は、抗体によって特異的に認識される抗原（例えば免疫系を刺激して抗体を生成させる物質）の部分を意味する。所定の実施形態において、抗原は、タンパク質又はペプチドであり、エピトープは、抗体によって認識され、結合されるタンパク質又はペプチドの特定の領域である。
本明細書で用いられる「流体力学半径」又は「Ｒｈ」の用語は、観察中の分子と同一の速度で拡散する等価な硬球の半径を意味する。所定の実施形態において、本明細書に開示された二重特異性アプタマーは、本技術分野において周知のアプタマーよりも約５０％大きい流体力学半径を有し、より具体的には、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４又は約１５のＲｈを有する。所定の実施形態において、約１２～約１４、より具体的には約１３、約１３．５又は約１４Ｒｈの流体力学半径を有する二重特異性アプタマーが開示される。所定の実施形態において、このＲｈは、二重特異性アプタマーのＰＥＧ化前に測定され、ＰＥＧ化は、例えば非ペグ化二重特異性アプタマーよりも約１、約２、約３、約４若しくは約５Ｒｈ、又はそれ以上、流体力学半径をさらに増加させるであろう。
「同一」又は「同一性」割合の用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、後述のデフォルトパラメーターを用いたＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズム、又は手動のアライメント及び目視検査（例えばＮＣＢＩウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等を参照）を用いて測定した場合に、同一又はアミノ酸残基若しくはヌクレオチドが特定の割合で同一である（すなわち、比較ウインドウ又は指定領域にわたって最大限に一致するように比較及びアライメントしたとき、特定の領域にわたって約６０％同一、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である）２つ以上の配列又はサブ配列を意味する。そのような配列は、その後、「実質的に同一」と言われる。この定義は、試験配列の相補性についても言及され又は適用され得る。また、この定義には、置換を有する配列と同様に、欠失及び／又は不可を有する配列にも含まれる。後述するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を考慮することができる。好ましくは、長さが少なくとも約２５アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって同一性が存在し、より好ましくは長さが５０～１００アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって同一性が存在する。
核酸又はタンパク質に関して本明細書で用いられる「単離された」の用語は、核酸、タンパク質又はペプチドが、自然の状態で関連している他の細胞成分から本質的に遊離されていることを意味する。それは、例えば均質な状態であることができ、乾燥状態又は水溶液のいずれかであってもよい。純度又は均質性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質又はペプチドは、実質的に精製されている。
本明細書で用いられる「リンカー」の用語は、２つの部分間に配置された分子を意味する。典型的に、リンカーは二官能性であり、すなわちリンカーは各末端に官能基を含み、官能基はリンカーを２つの部分に結合させるために用いられる。
本明細書で用いられる「核酸」の用語は、１本鎖、２本鎖若しくは多本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、それらのポリマー、又はそれらの相補体を意味する。「ポリヌクレオチド」の用語は、ヌクレオチドの直鎖配列を意味する。「ヌクレオチド」の用語は、典型的には、ポリヌクレオチドの単一ユニット、すなわちモノマーを意味する。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はそれらの改変体であってもよい。本明細書で考えられるポリヌクレオチドの例は、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、並びに１本鎖及び２本鎖ＤＮＡとＲＮＡとの混合物を有するハイブリッド分子を含む。核酸は、直鎖状又は分枝上であってもよい。例えば、核酸は、ヌクレオチドの直鎖であってもよく、又は核酸は、例えば核酸がヌクレオチドの１つ以上のアーム又は枝を含むような分枝状であってもよい。任意に、分枝状の核酸は、デンドリマー等の高次構造を形成するために反復的に分岐される。
本明細書で用いられる「ヌクレオチドリンカー」の用語は、アプタマーと別のアプタマーとを接続するオリゴヌクレオチドを意味する。対照的に「非ヌクレオチドリンカー」は、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含まないリンカーを意味する。以下に限定されないが、ヌクレオチドリンカーは、１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチドであってよく、例えば第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖を含むリンカーであってもよく、第１鎖及び第２鎖は互いに十分に相補的である。さらに、ヌクレオチドリンカーは、本明細書に記載される１つ以上のヌクレオチド修飾を含み得る。ヌクレオチドリンカーは、任意の長さ、例えば４～３０ヌクレオチド長であってもよい。
本明細書で用いられる「ＰＥＧ化化合物」は、１つ以上のポリエチレングリコール部分を有する化合物（例えばアプタマー）を意味する。本明細書に開示される所定の実施形態において、アプタマー又は二重特異性アプタマーは、ＰＥＧ化化合物である。
「ペプチド」及び「タンパク質」の用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味するために互換的に用いられる。ポリペプチドは、タンパク質、ペプチド、タンパク質断片又はその成分であり得る。ポリペプチドは、天然のタンパク質であってもよく、又は天然で通常見られないタンパク質であってもよい。ポリペプチドは、タンパク質を構成する標準の２０種のアミノ酸から大部分を構成することができ、又は非標準的なアミノ酸を組み込むように修飾することができる。ポリペプチドは、例えばリン酸化、アセチル化、アシル化、ホルミル化、アルキル化、メチル化、脂質付加（例えばパルミトイル化、ミリストイル化、プレニル化等）、及び糖質付加（例えば、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化等）等の任意の数の生化学的官能基を加えることによって、通常は宿主細胞によって修飾され得る。ポリペプチドは、宿主細胞内でジスルフィド架橋の形成又はタンパク質分解切断等の構造変化を受け得る。本明細書に記載のペプチドは、例えば、疾患の処置のために用いられる治療用ペプチドであってもよい。
本明細書で用いられる「医薬組成物」の用語は、開示された１種以上の量（例えば単位投与量）の二重特異性アプタマーを、キャリア、希釈剤、及び／又はアジュバントを含む１つ以上の非毒性の医薬的に許容可能な添加剤、並びに任意に他の生物学的活性成分と共に含む組成物を意味する。
本明細書で用いられる「医薬的に許容可能」の用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は妥当な利益／リスク比に見合った他の問題若しくは合併症が無くヒト及び動物の組織と接触して用いるのに適する化合物、材料、組成物及び／又は剤形を意味する。
本明細書で用いられる「精製された」の用語は、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせるペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも５０％、任意に少なくとも６５％、任意に少なくとも７５％、任意に少なくとも８５％、任意に少なくとも９５％、及び任意に少なくとも９９％純粋である。
「低減する」又は「阻害する」の用語は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも１００％以上の負の変化を意味するように本明細書で交換可能に用いられる。
「網膜疾患」及び「網膜障害」の用語は、本明細書において互換的に用いられ、複数の種々の病因により網膜が冒される疾患又は障害を意味する。
「ＲＮＡ」の用語は、リボ核酸を意味する。
本明細書で用いられる「ＳＥＬＥＸ」の用語は、試験管内進化法を意味し、それは、（１）標的分子と望ましい形態で相互作用する、例えばタンパク質と高い親和性で結合する、アプタマーの選択と、（２）それらの選択された核酸の増幅との組み合わせである。ＳＥＬＥＸプロセスは、特定の標的又はバイオマーカーに高い親和性を有するアプタマーを同定するために用いられ得る。
本明細書で用いられる「特異的結合」の用語は、少なくとも約１μＭ～１ｐＭのＫｄで抗原に結合する、及び／又は非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で抗原に結合するアプタマーの能力を意味する。しかしながら、本明細書に開示される二重特異性アプタマーは、配列が関連する２つ以上の抗原に特異的に結合できることが理解される。例えば、本明細書に開示された二重特異性アプタマーは、ヒト抗原とその抗原の非ヒトオルソログの両方に特異的に結合できる。
「対象」及び「患者」の用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味するために互換的に用いられる。哺乳動物は、以下に限定されないが、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用の動物及びペットを含む。また、インビボで得られた又はインビトロで培養された生物体の組織、細胞及びそれらの子孫も含まれる。
２つ以上のオリゴヌクレオチド、核酸又はアプタマーの文脈における「実質的に相同」又は「実質的に同一」の用語は、一般に、配列比較アルゴリズムを用いて、又は目視検査によって測定されるように、最大の対応関係で比較及びアライメントした場合に、少なくとも４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチドの同一性を有する２つ以上の配列又はサブ配列を意味する。
本明細書で用いられる「単位剤形」の用語は、治療される対象（例えば単眼）に対する単位用量として適する物理的に離散した単位を意味し、各単位は、所望の治療効果をもたらすように選択された所定量の活性剤を含み、任意に、所定量で提供され得る医薬的に許容可能なキャリアを共に含む。単位投与形態は、例えば、所定量の治療剤を含む一容量の液体（例えば医薬的に許容可能なキャリア）、所定量の固体形態の治療剤、所定量の治療剤を含む眼球インプラント、所定量の治療剤を集合的に含む複数のナノ粒子又はマイクロ粒子等であってもよい。単位剤形は、治療剤に加えて種々の成分を含んでもよいことが理解されるであろう。例えば、医薬的に許容可能なキャリア、希釈剤、安定剤、緩衝剤、防腐剤等が含まれていてもよい。所定の実施形態において、本明細書に開示されたアプタマー又は二重特異性アプタマーは、単位剤形で提供される。
「標的分子」又は「標的」の用語は、関心対象の分子を意味するために互換的に用いられる。この用語は、例えばタンパク質の場合、アミノ酸配列のマイナーなバリエーション、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標的分子とのコンジュゲート等の他の操作又は修飾等、分子の同一性を実質的に変更しない特定の分子のマイナーなバリエーションを含む。「標的分子」、「標的」又は「分析物」は、１種の若しくは複数種の分子、又は多分子構造のコピーの集合を意味する。「標的分子」、「標的」及び「分析物」は、１種以上若しくは複数種の分子又は多分子構造を意味する。例示的な標的分子は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝物、遷移状態アナログ、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織及び上記のいずれかの断片又は一部を含む。いくつかの実施形態において、標的分子はタンパク質であり、この場合、標的分子は「標的タンパク質」と呼ばれ得る。
本明細書で用いられる「処置又は治療」の用語は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益な又は所望の臨床結果は、以下に含まれないが、１つ以上の症状又は状態の緩和又は改善、疾患の範囲の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の拡大の防止、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び検出可能又は検出不可能にかかわらず寛解（部分的又は全体的）を含み得る。
ペプチドに関して本明細書で用いられる「バリアント」の用語は、参照ペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸残基で挿入、欠失、付加及び／又は置換が生じたペプチドを意味する。バリアントは、アプタマー又はアプタマードメインの約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％の配列であり得る。
本明細書で用いられる「血管内皮増幅因子」及び「ＶＥＧＦ」の用語は、そのアイソフォーム及びバリアントを含む、天然に存在するＶＥＧＦを意味する。本明細書で用いられる場合、ＶＥＧＦは、以下に限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、霊長類、ウマ及びウシのＶＥＧＦを含む全ての哺乳動物種のＶＥＧＦを含む。
ＩＩ．二重特異性アプタマー組成物
一態様において、式Ａを含む二重特異性アプタマーが開示される。
［式Ａ］
（アプタマー１）－（リンカー）－（アプタマー２）
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、ＤＮＡアプタマーである。他の実施形態において、二重特異性アプタマーは、ＲＮＡアプタマーである。
特定の実施形態において、二重特異性アプタマーはＲＮＡアプタマーであり、（アプタマー１）及び（アプタマー２）の配列同一性は表１に示される。
所定の実施形態において、（アプタマー１）及び（アプタマー２）の配置は、交換され得る。
所定の実施形態において、リンカーは、０～２０ヌクレオチドを有するヌクレオチドリンカーである。
所定の実施形態において、リンカーは、１，３－プロパンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，１２－ドデシルジオール、トリエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールからなる群より選択される非ヌクレオチドリンカーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号１～４６からなる群から選択される血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号４７～４８からなる群から選択されるインターロイキン８（ＩＬ８）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号４９～５０からなる群から選択されるアンジオポエチン２（ＡＮＧ２）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５１を含む補因子５（Ｃ５）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５２を含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５３を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５４を含む因子Ｄに結合するアプタマーである。
一態様において、式ＩＩを含む二重特異性アプタマーが開示される。
［式ＩＩ］
Ｘ１－（アプタマー１）－Ｘ２－（リンカー）－Ｙ１－（アプタマー２）－Ｙ２－ｉｎｖｄＴ
所定の実施形態において、（アプタマー１）及び（アプタマー２）の配列同一性は、表１に示される。
所定の実施形態において、（アプタマー１）及び（アプタマー２）の配置は、交換可能であり得る。
所定の実施形態において、Ｘ１はＸ２領域と塩基対になるように設計された０～５ヌクレオチド長である。
所定の実施形態において、Ｙ１はＹ２領域と塩基対になるように設計された０～５ヌクレオチド長である。
所定の実施形態において、リンカーは、０～２０ヌクレオチドを有するヌクレオチドリンカーである。
所定の実施形態において、リンカーは、１，３－プロパンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，１２－ドデシルジオール、トリエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールからなる群より選択される非ヌクレオチドリンカーである。
一実施形態において、逆位デオキシチミジン（ｉｎｖｄＴ）は式Ｉの二重特異性アプタマーの３’末端に組み込まれ、３’－３’結合の形成をもたらし、３’エキソヌクレアーゼによる分解及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長の両方を阻害する。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号１～４６からなる群から選択される血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号４７～４８からなる群から選択されるインターロイキン８（ＩＬ８）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号４９～５０からなる群から選択されるアンジオポエチン２（ＡＮＧ２）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５１を含む補因子５（Ｃ５）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５２を含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５３を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５４を含む因子Ｄに結合するアプタマーである。
他の態様において、式ＩＩＩを含む二重特異性アプタマーが開示されており、式ＩＩＩにおいて、Ｈｙｂ１及びＨｙｂ２は相補的である。
［式ＩＩＩ］
５’－Ｘ１－（アプタマー１）－Ｘ２－（リンカー）－（Ｈｙｂ１）
（Ｈｙｂ２）－（リンカー）－Ｙ２－（アプタマー２）－Ｙ１－５’
所定の実施形態において、（アプタマー１）及び（アプタマー２）の配列同一性は、表１に示される。
所定の実施形態において、（アプタマー１）及び（アプタマー２）の配置は、交換可能であり得る。
所定の実施形態において、Ｘ１はＸ２領域と塩基対になるように設計された０～５ヌクレオチド長である。
所定の実施形態において、Ｙ１はＹ２領域と塩基対になるように設計された０～５ヌクレオチド長である。
所定の実施形態において、リンカーは、０～２０ヌクレオチドを有するヌクレオチドリンカーである。
所定の実施形態において、リンカーは、１，３－プロパンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，１２－ドデシルジオール、トリエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールからなる群より選択される非ヌクレオチドリンカーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号１～４６からなる群から選択される血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号４７～４８からなる群から選択されるインターロイキン８（ＩＬ８）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号４９～５０からなる群から選択されるアンジオポエチン２（ＡＮＧ２）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５１を含む補因子５（Ｃ５）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５２を含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５３を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、アプタマー１又はアプタマー２は、配列番号５４を含む因子Ｄに結合するアプタマーである。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、アプタマー２８５、アプタマー４８１及びアプタマー６２８からなる群から選択されるＶＥＧＦアプタマーと、アプタマー２６９及びアプタマー２４８からなる群から選択されるＩＬ８アプタマーと、それらの組み合わせとを含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー２８５及びＩＬ８アプタマー２６９を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーはＶＥＧＦアプタマー２８５を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーはＶＥＧＦアプタマー４８１を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２６９を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーはＶＥＧＦアプタマー４８１を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーはＶＥＧＦアプタマー６２８を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２６９を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーはＶＥＧＦアプタマー６２８を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、アプタマー２８５、アプタマー４８１及びアプタマー６２８からなる群から選択されるＶＥＧＦアプタマーと、アプタマー２６９及びアプタマー２４８からなる群から選択されるＩＬ８アプタマーと、ハイブリダイゼーションにより結合されたそれらの組み合わせとを含む。
所定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、アプタマー２８５、アプタマー４８１及びアプタマー６２８からなる群から選択されるＶＥＧＦアプタマーと、アプタマー２６９及びアプタマー２４８からなる群から選択されるＩＬ８アプタマーと、非ヌクレオチドリンカーにより結合されたそれらの組み合わせとを含む。
式ＩＩＩの特定の実施形態において、二重特異性ＲＮＡアプタマーは、第１及び第２アプタマーがハイブリダイズできる相補的配列を有する３～２５ヌクレオチドをさらに含む。一実施形態において、相補的配列は、リンカーによりアプタマーから分離される。
一態様において、二重特異性アプタマーは、約９以上、約１０以上のＲｈ、約１１以上のＲｈ、約１２以上のＲｈ、約１３以上のＲｈ、約１４以上のＲｈ、又は約１５以上のＲｈの流体力学半径を有し、ＶＥＧＦ若しくはそのアイソフォーム、ＩＬ８又はＡｎｇ２からなる群から選択される標的分子に結合できる。任意に、二重特異性アプタマーは、本明細書の表１に開示された少なくとも１つの配列を有するＲＮＡアプタマーである。
Figure 2023521146000001
Figure 2023521146000002
表１のアプタマーは、０、１、３、５、１０、１５又は２０ヌクレオチドで構成されたリンカーを含む種々の異なるリンカーを用いて互いに結合され得る。ヌクレオチドの種は様々であり、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴを含む。ヌクレオチドにおける糖の種も様々で、２’Ｈデオキシリボース、２’Ｆデオキシリボース、２’ＯＭｅリボース又は２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで構成され得る。また、リンカー配列は、ＬＮＡ（ロック核酸）又はｃＥｔ（拘束エチル）ヌクレオチドアナログ糖の架橋糖で構成され得る。さらに、リンカーは、１，３－プロパンジオール、１，６ヘキサンジオール、１，１２ドデシルジオール、トリエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールを含む非ヌクレオチド部分で構成され得る（表２）。これらの分子は、２つのアプタマー間において、０～５回加えることで分子間の距離を変化させ得る。さらに、アプタマードメインの順序を変更することができ、アプタマーをリンカーの５’又は３’プライマーに配置できる。
Figure 2023521146000003
二重特異性アプタマー組成物の非限定的な例は、種々の構成におけるＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン及びＩＬ８結合ドメインを含む表３～２６に示されている。
表３に示すように、抗ＶＥＧＦアプタマーである逆位Ｔを含むアプタマー２８５（配列番号５５）及び抗ＩＬ８アプタマーである逆位Ｔを含むアプタマー２６９（配列番号５６）は、リンカーが無しで（配列番号５７）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号５８及び３９１）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号５９及び３９２）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号６０）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号６１）結合される。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号６２～６６及び３９３～３９７）。
Figure 2023521146000004
計算機解析（ｍｆｏｌｄ）を用いて、我々は、各アプタマードメインは単独では実験的に得られたアプタマー構造に一致する予測構造に折り畳まれることを観察したが（図１Ａ及び１Ｂ）、この方法でアプタマーを結合すると、ネイティブでない構造を形成することが確認された（図１Ｃ）。（アプタマー間領域を１本鎖にすることでシミュレーションした）非ヌクレオチドリンカー又はヌクレオチドリンカーを用いてドメイン間の距離を長くしても、アプタマーはネイティブな構造をとることはできなかった。しかしながら、二重特異性構築物内のアプタマー２８５の末端ステム（配列番号６７）、又はアプタマー２６９の末端ステム（配列番号７８）に２塩基対を加えることは、ｍｆｏｌｄによって予測される二重特異性の文脈で両方のアプタマーのネイティブ構造を安定化するのに十分である（図１Ｄ及び１Ｅ）。
表４に示すように、逆位Ｔを有する２８５の伸長版の２８５ｅｘ（配列番号６７）は、リンカーが無しで（配列番号６８）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号６９及び３９８）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号７０及び３９９）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号７１）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号７２）、逆位Ｔを有するアプタマー２６９（配列番号５６）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号７３～７７及び４００～４０４）。
Figure 2023521146000005
図５に示すように、逆位Ｔを有する２６９の伸長版の２６９ｅｘ（配列番号７８）は、リンカーが無しで（配列番号７９）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号８０及び４０５）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号８１及び４０６）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号８２）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号８３）、逆位Ｔを有するアプタマー２８５（配列番号５５）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号８４～８８及び４０７～４１１）。
Figure 2023521146000006
図６に示すように、逆位Ｔを有する２８５の伸長版（配列番号６７）は、リンカーが無しで（配列番号８９）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号９０及び４１２）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号９１及び４１３）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号９２）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号９３）、逆位Ｔを有するアプタマー２６９の伸長版（配列番号７８）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号９４～９８及び４１４～４１８）。
Figure 2023521146000007
二重特異性アプタマーの設計は、アプタマー２８５のループ４がランダム化される際に同定された他のバリアントを含むように伸長された。図７には、抗ＶＥＧＦアプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー４８１（配列番号９９）と、抗ＩＬ８アプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー２６９（配列番号５６）とが、リンカーが無しで（配列番号１００）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１０１及び４１９）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１０２及び４２０）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１０３）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１０４）で結合された二重特異性アプタマー配列の例が示されている。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１０５～１０９及び４２１～４２２）。
Figure 2023521146000008
表８に示すように、閉鎖ステムを安定化する２つの追加の塩基対を含み、逆位Ｔを有する４８１の伸長版の４８１ｅｘ（配列番号１１０）は、リンカーが無しで（配列番号１１１）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１１２及び４２３）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１１３及び４２４）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１１４）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１１５）、逆位Ｔを有するアプタマー２６９（配列番号５６）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１１６～１２０及び４２５～４２６）。
Figure 2023521146000009
表９に示すように、逆位Ｔを有する２６９の伸長版の２６９ｅｘ（配列番号７８）は、リンカーが無しで（配列番号１２１）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１２２及び４２７）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１２３及び４２８）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１２４）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１２５）、逆位Ｔを有するアプタマー４８１（配列番号９９）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される。
Figure 2023521146000010
表１０に示すように、４８１の伸長版（配列番号９９）は、リンカーが無しで（配列番号１３１）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１３２及び４３１）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１３３及び４３２）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１３４）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１３５）、アプタマー２６９（配列番号７８）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１３６～１４０）。
Figure 2023521146000011
アプタマー６２８（配列番号１４１）は、アプタマー４８１の開始点から５番目の位置においてＵがＺの非ヌクレオチドリンカーに置換されたアプタマー４８１のバリアントである。表１１は、抗ＶＥＧＦアプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー６２８（配列番号１４１）と、抗ＩＬ８アプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー２６９（配列番号５６）とが、リンカーが無しで（配列番号１４２）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１４３及び４３３）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１４４及び４３４）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１４５）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１４６）結合されて生成された二重特異性アプタマーの例を示す。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１４７～１５１及び４３５～４３８）。
Figure 2023521146000012
表１２に示すように、閉鎖ステムを安定化するための２つの追加の塩基対を含み、逆位Ｔを有するアプタマー６２８の伸長版である６２８ｅｘ（配列番号１５２）は、リンカーが無しで（配列番号４３９）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１６３及び３９１）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１６４及び４２４）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号４４０）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号４４１）、逆位Ｔを有するアプタマー２６９（配列番号５６）と組み合わせられる。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号７３、７４、７６、７７、３０２）。
Figure 2023521146000013
表１３に示すように、逆位Ｔを有するアプタマー２６９の伸長版である２６９ｅｘ（配列番号７８）は、リンカーが無しで（配列番号１５２）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１５３及び３０３）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１５４及び３０４）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１５５）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１５６）、逆位Ｔを有するアプタマー６２８（配列番号１４１）と組み合わせられる。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１５７～１６１及び３０５～３０９）。
Figure 2023521146000014
表１４に示すように、逆位Ｔを有するアプタマー６２８の伸長版である６２８ｅｘ（配列番号１５２）は、リンカーが無しで（配列番号１６２）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１６３及び３１０）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１６４及び３１１）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１６５及び３１２）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１６６）、逆位Ｔを有するアプタマー２６９の伸長版である２６９ｅｘ（配列番号７８）と組み合わせられる。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１６７～１７１及び３１３～３１７）。
Figure 2023521146000015
表１５には、抗ＶＥＧＦアプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー２８５（配列番号５５）と、抗ＩＬ８アプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー２４８（配列番号１７２）とを用いて生成された二重特異性アプタマーが、リンカーが無しで（配列番号１７３）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１７４及び３１８）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１７５及び３１９）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１７６）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１７７）結合されていることが示されている。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１７８～１８２及び３２０～３２４）。
Figure 2023521146000016
表１６に示されるように、逆位Ｔを有するアプタマー２８５の伸長版である２８５ｅｘ（配列番号６７）は、リンカーが無しで（配列番号１８３）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１８４及び３２５）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１８５及び３２６）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１８６）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１８７）、逆位Ｔを有するアプタマー２４８（配列番号１７２）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１８８～１９２及び３２７～３３１）。
Figure 2023521146000017
表１７に示されるように、逆位Ｔを有するアプタマー２４８の伸長版である２４８ｅｘ（配列番号１９３）は、リンカーが無しで（配列番号１９４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１９５及び３３２）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号１９６及び３３３）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１９７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号１９８）、逆位Ｔを有するアプタマー２８５（配列番号５５）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号１９９～２０３及び３３４～３３８）。
Figure 2023521146000018
表１８に示されるように、逆位Ｔを有するアプタマー２８５の伸長版である２８５ｅｘ（配列番号６７）は、リンカーが無しで（配列番号２０４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２０５及び３３９）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２０６及び３４０）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２０７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２０８）、逆位Ｔを有するアプタマー２４８の伸長版である２４８ｅｘ（配列番号１９３）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２０９～２１３及び３４１～３４５）。
Figure 2023521146000019
アプタマー２８５のループ４がランダム化される過程で同定された他のバリアントを含むように、二重特異性アプタマーの設計が拡張された。表１９は、抗ＶＥＧＦアプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー４８１（配列番号９９）と、抗ＩＬ８アプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー２４８（配列番号１７２）とが、リンカーが無しで（配列番号２１４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２１５及び３４６）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２１６及び３４７）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２１７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２１８）結合されて生成された二重特異性アプタマーの例を示す。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２１９～２２３及び３４８～３５０）。
Figure 2023521146000020
表２０に示すように、閉鎖ステムの安定化のための追加の２塩基対を含む逆位Ｔを有するアプタマー４８１の伸長版である４８１ｅｘ（配列番号１１０）は、リンカーが無しで（配列番号２２４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２２５及び３５１）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２２６及び３５２）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２２７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２２８）、アプタマー２４８（配列番号１７２）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２２９～２３３及び３５３～３５４）。
Figure 2023521146000021
表２１に示されるように、逆位Ｔを有するアプタマー２４８の伸長版である２４８ｅｘ（配列番号１９３）は、リンカーが無しで（配列番号２３４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２３５及び３５５）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２３６及び３５６）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２３７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２３８）、逆位Ｔを有するアプタマー４８１（配列番号９９）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２３９～２４３及び３５７～３５８）。
Figure 2023521146000022
表２２に示されるように、逆位Ｔを有するアプタマー４８１の伸長版である４８１ｅｘ（配列番号１１０）は、リンカーが無しで（配列番号２４４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２４５及び３５９）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２４６及び３６０）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２４７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２４８）、逆位Ｔを有するアプタマー２４８の伸長版（配列番号１９３）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２４９～２５３）。
Figure 2023521146000023
アプタマー６２８（配列番号１４１）は、アプタマー２８５の開始点から５番目の位置においてＵがＺの非ヌクレオチドリンカーに置換されたアプタマー４８１のバリアントである。表２３は、抗ＶＥＧＦアプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー６２８（配列番号１４１）と、抗ＩＬ８アプタマーである逆位Ｔを有するアプタマー２４８（配列番号１７２）とが、リンカーが無しで（配列番号２５４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２５５及び３６２）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２５６及び３６３）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２５７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２５８）結合されて生成された二重特異性アプタマーの例を示す。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２５９～２６３及び３６４～３６８）。
Figure 2023521146000024
表２４に示すように、閉鎖ステムの安定化のための追加の２塩基対を含む逆位Ｔを有するアプタマー６２８の伸長版である６２８ｅｘ（配列番号１５２）は、リンカーが無しで（配列番号２６４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２６５及び３６９）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２６６及び３７０）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２６７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２６８）、逆位Ｔを有するアプタマー２４８（配列番号１７２）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２６９～２７３及び３７１～３７５）。
Figure 2023521146000025
表２５に示されるように、逆位Ｔを有するアプタマー２４８の伸長版である２４８ｅｘ（配列番号１９３）は、リンカーが無しで（配列番号２７４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２７５及び３７６）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２７６及び３７７）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２７７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２７８）、逆位Ｔを有するアプタマー６２８（配列番号１４１）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２７９～２８３及び３７８～３８２）。
Figure 2023521146000026
表２６に示されるように、逆位Ｔを有するアプタマー６２８の伸長版である６２８ｅｘ（配列番号１５２）は、リンカーが無しで（配列番号２８４）、３－炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサ（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２８５及び３８３）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカーで（配列番号２８６及び３８４）、５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２８７）、又は１０個の２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（１０Ｕ）を含むヌクレオチドリンカーで（配列番号２８８）、逆位Ｔを有するアプタマー２４８の伸長版である２４８ｅｘ（配列番号１９３）と組み合わせられ得る。また、アプタマードメインの順序も変更される（配列番号２８９～２９３及び３８５～３８９）。
Figure 2023521146000027
ＩＩＩ．標的分子
本明細書に開示されたアプタマー及び二重特異性アプタマーは、１つ以上の標的分子を特異的に結合できる。
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、第１結合部分及び第２結合部分を有し、第１及び第２結合部分は、異なる標的分子又は抗原に結合することが開示されている。所定の実施形態において、標的分子はタンパク質であり、より具体的には、ＶＥＧＦ、ＩＬ８及びＡｎｇ－２からなる群から選択される。
Ａ．血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）
ＶＥＧＦ－Ａは、ＶＥＧＦファミリーの中で最も重要な血管新生制御因子と考えられている。ＶＥＧＦ－Ａは、血管内皮細胞の成長を促進し、毛細血管様構造の形成につながり、新たに形成された血管の生存に必要であると考えられる。血管内皮細胞は、ＶＥＧＦシグナルの主要なエフェクターであると考えられている。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞も、ＶＥＧＦ受容体を発現する可能性があり、ＶＥＧＦに曝露されると増殖し、遊走することが示されている。さらに、ＶＥＧＦは、血管系以外の役割も担っていると考えられている。例えば、ＶＥＧＦは、以下に限定されないが、骨形成、造血、創傷治癒及び発生を含む通常の生理的機能において役割を果たし得る。種々の態様において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、ＶＥＧＦ－Ａに結合し、それにより例えば血管内皮細胞、網膜色素上皮細胞又はそれら両方の増殖を阻害又は防止することにより、血管新生を阻害又は抑制するアプタマーを含む。所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、ＶＥＧＦ－Ａと、血管内皮細胞、網膜色素上皮細胞又はその両方に発現するＶＥＧＦ受容体（例えばＦｌｔ－１、ＫＤＲ、Ｎｒｐ－１）との結合又は関連を防止又は抑制させ得る。
ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆ、及び胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）を含む。本明細書に開示される二重特異性アプタマー内のアプタマーは、主にＶＥＧＦ－Ａのバリアント及びアイソフォームに結合する。所定の実施形態において、そのようなアプタマーは、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆ、及びＰｌＧＦの１つ以上に結合し得る。ＶＥＧＦのｍＲＮＡの転写は、低酸素条件下においてアップレギュレートされ得る。さらに、種々の成長因子及びサイトカインは、ＶＥＧＦのｍＲＮＡをアップレギュレートすることが示されており、それは、以下に限られないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン１α（ＩＬ－１－α）、インターロイキン６（ＩＬ－６）及びインターロイキン８（ＩＬ８）などが挙げられる。ＶＥＧＦ－Ａは、以下に限定されないが、糖尿病網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑浮腫、血管新生（またはウェット）、加齢黄斑変性症（ｎＡＭＤ又はｗＡＭＤ）、近視性脈絡膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、点状内膜症、推定眼ヒストプラズマ症、家族性滲出型網膜硝子病及び網膜芽細胞腫等の種々の眼疾患及び障害において役割を果たすと考えられている。
所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、以下に限定されないが、低酸素状態；ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＫＧＦ、ＩＧＦ－１、ＦＧＦ又はＰＤＧＦ等の成長因子；並びにＩＬ－１－α、ＩＬ６及びＩＬ８等のサイトカインを含むＶＥＧＦ－Ａの発現及び／又は活性をアップレギュレートする１つ以上の因子が関連する眼疾患又は障害を処置するために用いられ得る。所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、糖尿病網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑浮腫、血管新生（またはウェット）、加齢黄斑変性症（ｎＡＭＤ又はｗＡＭＤ）、近視性脈絡膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、点状内膜症、推定眼ヒストプラズマ症、家族性滲出型網膜硝子病及び網膜芽細胞腫からなる群から選択される眼疾患又は障害を処置するために用いられ得る。ヒトＶＥＧＦ－Ａ遺伝子は、８つのエクソンを含み、少なくとも１６のアイソフォームをコードする。別のスプライシング機構により生成される最も一般的なアイソフォームは、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６である。これらのうち、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６は、それぞれＣ末端にヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含む。一方、ＶＥＧＦ－Ａ１２１は、ヘパリン結合ドメインを欠いている。さらに、プラスミン活性化は、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６のタンパク質分解切断をもたらし、その結果、可溶性ＶＥＧＦ－Ａ１１０バリアントが放出され、それもヘパリン結合ドメインを欠いている。種々の態様において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、１つ以上のＶＥＧＦ－Ａアイソフォーム又はバリアントに関連する機能に結合又は阻害する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。例えば、本明細書で提供されるアプタマーは、ＶＥＧＦ－Ａ１１０、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６の１つ以上に関連する結合及び阻害し得る。所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、汎バリアント特異的アプタマーである少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。所定の実施形態において、汎バリアント特異的アプタマー又はアプタマードメインは、ＶＥＧＦ－Ａ１１０、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６のそれぞれに結合することが開示されている。所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、ＶＥＧＦ－Ａ１１０、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６のそれぞれに共通する構造的特徴に結合する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。例えば本明細書で提供されるアプタマーは、ＶＥＧＦ－Ａ１１０、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６のそれぞれの受容体結合面又はその一部に結合し得る。所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、ＶＥＧＦ－Ａ１１０、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６のそれぞれの受容体結合ドメイン又はその一部に結合する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成は、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６で見られるヘパリン結合ドメイン以外のＶＥＧＦ－Ａの構造的特徴に結合する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。
ＶＥＧＦ－Ａは、受容体チロシンキナーゼであるＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ－１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ又はＦｌｋ－１としても知られている）、及びニューロピリン（Ｎｒｐ－１）と相互作用することが知られている。Ｎｒｐ－１は、ＫＤＲの共受容体であると考えられている。ＶＥＧＦ受容体は、内皮細胞、マクロファージ、造血細胞及び平滑筋細胞で発現することが示されている。ＫＤＲは、クラスＩＶチロシンキナーゼであり、ＶＥＧＦ－Ａ二量体と２：１で結合する。Ｆｌｔ－１は、ＶＥＧＦ－ＡにＫＤＲの３～１０倍高い親和性で結合する受容体チロシンキナーゼであり、ＶＥＧＦ－Ｂ及びＰｌＧＦにも結合することが示されている。Ｆｌｔ－１の発現は、低酸素によりアップレギュレートされ、ＶＥＧＦ－Ａとの親和性が高く、デコイ受容体として作用することによりＫＤＲによるシグナルの負の制御因子として働くことが提示されている。Ｆｌｔの別のスプライシングバリアントは、受容体の可溶性バリアント（ｓＦｌｔ－１）となり、ＶＥＧＦ－Ａの血管新生阻害剤として機能することが示唆されています。ＶＥＧＦ－Ａ１６５とＫＤＲとの結合は、ヘパリン結合ドメインと共受容体Ｎｒｐ－１との相互作用により増強され、それはＫＤＲの下流シグナルを増強し得る。また、Ｎｒｐ－１は、Ｆｌｔ－１に対して強い親和性を有し、Ｎｒｐ－１とＶＥＧＦ－Ａ１６５との結合を妨げ、ＶＥＧＦ－Ａによる血管新生の二次制御機構となり得る。
所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、ＶＥＧＦ－Ａの１つ以上のアイソフォーム又はバリアントに結合し、ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ受容体との結合又は関連を防止又は抑制し得る少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。例えば、本明細書で提供される二重特異性組成物は、Ｆｌｔ－１、ＫＤＲ、Ｎｒｐ－１又はそれらの組み合わせとＶＥＧＦ－Ａの１つ以上のアイソフォーム又はバリアントとの結合を防止又は抑制し得る。所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性アプタマーは、ＶＥＧＦ－Ａ１１０、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６の１つ以上によるＦｌｔ－１、ＫＤＲ及びＮｒｐ－１の１つ以上の結合を防止又は抑制し得る少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。特定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、ＶＥＧＦ－Ａの１つ以上のアイソフォーム又はバリアントのＫＤＲへの結合を防止又は抑制し得る少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物は、ＶＥＧＦ－Ａ１１０、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９及びＶＥＧＦ－Ａ２０６のそれぞれに結合し、Ｆｌｔ－１、ＫＤＲ及びＮｒｐ－１の１つ以上との結合又は関連を防止又は抑制し得る汎バリアント特異的アプタマーである少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る。
一実施形態において、ヒトＶＥＧＦ－Ａ２０６のアミノ酸配列は、以下の配列を含み得る：ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥＫＫＳＶＲＧＫＧＫＧＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＹＶＧＡＲＣＣＬＭＰＷＳＬＰＧＰＨＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号２９４）。
一実施形態において、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１８９のアミノ酸配列は、以下の配列を含み得る：ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥＫＫＳＶＲＧＫＧＫＧＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号２９５）。
一実施形態において、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５のアミノ酸配列は、以下の配列を含み得る：ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号２９６）。
一実施形態において、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１のアミノ酸配列は、以下の配列を含み得る：ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥＫＣＤＫＰＲＲ（配列番号２９７）。
一実施形態において、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１１０のアミノ酸配列は、以下の配列を含み得る：ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲ（配列番号２９８）。
本明細書に開示されるアプタマー、二重特異性アプタマー又は組成物は、ＶＥＧＦの機能を阻害しする場合、その阻害は完全であっても又は部分的であってもよい。所定の実施形態において、阻害は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％である。
Ｂ．インターロイキン－（ＩＬ８）
インターロイキン－８（ＩＬ８；ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＸＣＬ８）としても知られている）は、急性及び慢性炎症並びに種々のヒト悪性腫瘍に関与し得るケモカインである。ＩＬ８は、細胞外空間に分泌され、膜結合受容体に結合することに因って機能し得る；そのため、本開示の組成物及び方法は、ＩＬ８の膜結合受容体への結合を防止又は抑制し得る。ＩＬ８は、以下に限定されないが、単球、マクロファージ、好中球、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、メラノサイト及び肝細胞を含む多くの異なる細胞型により分泌され得る。眼において、ＩＬ８は、例えば網膜色素上皮細胞、ミュラー細胞、角膜上皮細胞、角膜線維芽細胞、結膜上皮細胞及びブドウ膜メラノサイトによって分泌され得る。ＩＬ８は、組織損傷、並びに低酸素、酸化ストレス、終末糖化産物、高グルコース及び補体を含む多くの他の刺激に反応してアップレギュレートされる。ＩＬ８及びその受容体は、手術によって誘導された増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）モデルでもアップレギュレートされ得る。従って、本開示の少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成される二重特異性アプタマー組成物は、種々の細胞型によって分泌された後のＩＬ８と結合し得る。
ＩＬ８は、ケモカインのＣＸＣファミリーのメンバーであり、ＧＲＯ－α（ＣＸＣＬ１としても知られている）及びＧＲＯ－β（ＣＸＣＬ２としても知られている）に密接に関連し得る。所定の実施形態において、二重特異性アプタマーは、ＩＬ８に選択的に結合する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成される。所定の実施形態において、アプタマーは、ＧＲＯ－α、ＧＲＯ－β又はその両方に対してほとんど結合親和性を有さない場合がある。他の場合において、そのような抗ＩＬ８アプタマーは、ＧＲＯ－α、ＧＲＯ－β又はその両方に結合し得る。ＩＬ８は、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸＣＲ１）及びＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）の両方を通じてシグナル伝達でき、そのため、本明細書に開示される組成物及び方法は、ＩＬ８がＣＸＣＲ１、ＣＸＣＬＲ又はその両方を通じたシグナル伝達能を防止又は抑制し得る。ＩＬ８には、ＩＬ８７２及びＩＬ８７７という２つの主要なアイソフォームがあると考えられている。ＩＬ８７７は、受容体結合に対する親和性が低下している可能性がある。所定の実施形態において、本開示の少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成された二重特異性アプタマーの組成物は、ＩＬ８のアイソフォームに結合する抗ＩＬ８アプタマーを含み得る。例えば、組成物は、ＩＬ８７２に結合する抗ＩＬ８アプタマーを含み得る。加えて又は代替的に、組成物は、ＩＬ８７７に結合する抗ＩＬ８アプタマーを含み得る。加えて又は代替的に、組成物は、ＩＬ８７２及びＩＬ８７７の両方に結合する抗ＩＬ８アプタマーを含み得る。さらに、ＩＬ８は、単量体及び二量体の両方として存在してもよく、その両方は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２又はその両方に結合し得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物は、ＩＬ８の単量体に結合する抗ＩＬ８アプタマーを含み得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物は、ＩＬ８の二量体に結合する抗ＩＬ８アプタマーを含み得る。
ＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２は、細胞内Ｇタンパク質を介してシグナル伝達をするＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む７回膜貫通型ドメインである。Ｇタンパク質サブユニットは、細胞内で放出されると、ｃＡＭＰ又はホスホリパーゼが増大し、ＭＡＰＫシグナル伝達を活性化し得る。ＩＬ８が結合すると、３，４，５－イノシトール三リン酸が増加し、遊離カルシウムが急速に増加し、その後、好中球の脱顆粒が起こり得る。好中球の脱顆粒は、最近のクリアランスを可能にする浸潤プロセスの重要なステップとなり得る。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、特にヘパリンは、ＩＬ８のＣ末端に結合し、そのような結合は好中球の表面への結合を可能にすることによって、ＩＬ８の活性を増加させると考えられている。所定の実施形態において、本開示の抗ＩＬ８組成物は、ＩＬ８のＧＡＧ（例えばヘパリン）への結合を防止又は抑制し得る。所定の実施形態において、抗ＩＬ８組成物は、ＩＬ８の好中球表面への結合を防止又は抑制し得る。好中球の遊走におけるＩＬ８の役割に加えて、ＩＬ８は、新生血管形成及び血管新生に影響を及ぼし、従って、本開示の抗ＩＬ８組成物は、新生血管形成、血管新生又はその両方に影響を及ぼし得る。これに関して、ＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２との相互作用に加えて、ＩＬ８は、ＶＥＧＦ受容体であるＶＥＧＦＲ２と相互作用し、受容体のリン酸化、経路の活性化をもたらすことも報告されている。所定の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２又はＶＥＧＦＲ２を介したＩＬ８シグナル伝達と関連するシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。所定の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２又はその両方を介したＩＬ８シグナル伝達と関連するシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。所定の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、ＣＸＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２又はその両方を介したＩＬ８シグナル伝達と関連するシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。所定の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、ＣＸＣＲ２、ＶＥＧＦＲ２又はその両方を介したＩＬ８シグナル伝達と関連するシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。例えば、本開示の二重特異性アプタマーは、ＩＬ８誘導Ｇタンパク質シグナル伝達を防止又は抑制し得る少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成され得る；理論に拘束されることを望まないが、そのようなアプタマーは、細胞内ｃＡＭＰ又はホスホリパーゼの増加を防ぎ、それによりＩＬ８誘導ＭＡＰＫシグナル伝達を防止又は抑制し得る。いくつかの例において、本開示の二重特異性組成物は、３，４，５－イノシトール三リン酸及び細胞内遊離カルシウムのＩＬ８誘導性の増加を防止又は抑制し得る。所定の実施形態において、本開示の二重特異性組成物は、ＩＬ８誘導性の好中球の脱顆粒を防止又は抑制し得る。
一実施形態において、ヒトＩＬ８７８のアミノ酸配列は、以下の配列を含む：ＡＶＬＰＲＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲＶＩＥＳＧＰＨＣＡＮＴＥＩＩＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳ（配列番号２９９）。
一実施形態において、ヒトＩＬ８７２のアミノ酸配列は、以下の配列を含み得る：ＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲＶＩＥＳＧＰＨＣＡＮＴＥＩＩＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳ（配列番号３００）。
本明細書に開示されるアプタマー、二重特異性アプタマー又は組成物は、ＩＬ８の機能を阻害しする場合、その阻害は完全であっても又は部分的であってもよい。所定の実施形態において、阻害は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％である。
Ｃ．アンジオポエチン（Ａｎｇ２）
ＶＥＧＦファミリーに加えて、アンジオポエチンは、血管の発生及び血管新生に関与すると考えられている。特にアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は、３つの哺乳動物血管系の発生及び維持に重要であると考えられている。そのようなものとして、本明細書で提供される組成物及び方法は、血管系の発生及び維持に影響を与え得る。好ましい実施形態において、本明細書で提供される方法及び組成物は、血管新生を標的とし、一般に、抗血管新生特性を有し得る。
Ａｎｇ２は、分泌型糖タンパク質であるアンジオポエチンファミリーの４つのメンバーのうちの１つである。このファミリーの他のメンバーには、アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）、アンジオポエチン－３（Ａｎｇ３）及びアンジオポエチン－４（Ａｎｇ４）が含まれる。Ａｎｇ１は、Ｉｇ及び上皮成長因子相同ドメイン受容体を有する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＴｉｅ２のアゴニストであると思われる。Ａｎｇ２は、脊椎動物の、受容体チロシンキナーゼアンタゴニストであり、ある特定の条件下ではＴｉｅ２アゴニストとしても作用し得る。Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２上の同一の受容体結合部位において競合することにより、Ａｎｇ１によるＴｉｅ２のリン酸化を阻害していると思われる。
ヒトのＡｎｇ１とＡｎｇ２との間の配列相同性は約６４％である。構造的には、アンジオポエチンは非常に類似しており、注目すべきＮ末端のシグナルペプチド（Ａｎｇ１ではＭｅｔ１－Ｔｈｒ１５、Ａｎｇ２ではＭｅｔ１－Ａｌａ１８）及び超集積コイルドコイルモチーフ（Ａｎｇ１ではＰｈｅ７８－Ｌｅｕ２６１、Ａｎｇ２ではＡｓｐ７５－Ｇｌｎ２４８）、並びにＡｎｇ２の受容体結合ドメインを含むＣ末端のフィブリノーゲン様結合ドメイン（Ａｎｇ１ではＡｒｇ２７７－Ｐｈｅ４９８、Ａｎｇ２ではＬｙｓ２７５－Ｐｈｅ４９６）が共通する。本明細書で提供される抗Ａｎｇ２組成物は、Ａｎｇ２に特異的に結合するように設計されてもよく、一般にＡｎｇ１、Ａｎｇ３又はＡｎｇ４との結合をほとんど示さなくてもよい。
本明細書で開示されるのは、Ａｎｇ２に結合し、Ａｎｇ２に関連する機能に拮抗する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成される二重特異性アプタマーである。一般に、本明細書に記載されたアプタマーは、Ａｎｇ２の特定の領域に結合するように設計されてもよく、アプタマーが結合する場所によって、Ａｎｇ２の機能を阻害するメカニズムが異なり得る。
一実施形態において、二重特異性組成物は、Ａｎｇ２の受容体結合ドメイン又はフィブリノーゲン様結合ドメインに結合する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成される。Ａｎｇ２のＣ末端ドメイン（フィブリノーゲン様結合ドメインを含む）は、Ｔｉｅ２の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインと結合する役割を担い得る。従って、Ａｎｇ２の受容体結合ドメイン又はフィブリノーゲン様結合ドメインを標的とする少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成された二重特異性組成物は、Ａｎｇ２のＴｉｅ２への結合を防止又は抑制し得る。
一実施形態において、二重特異性組成物は、Ａｎｇ２のコイルドコイルモチーフに結合する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成される。理論に束縛されることは望まないが、コイルドコイルモチーフは、アンジオポエチンのホモ及びヘテロ二量体を媒介するために重要となり得る。所定の実施形態において、アンジオポエチンのホモ及びヘテロ二量体は、Ｔｉｅ２の活性及びそれが制御する顆粒のシグナル伝達プロセスに影響を与えるために重要となり得る。所定の実施形態において、Ａｎｇ２は、溶液中で４量体、６量体及び高次のオリゴマーとして見出される。従って、所定の実施形態において、二重特異性組成物は、Ａｎｇ２のコイルドコイルモチーフに結合し得る。所定の実施形態において、そのような二重特異性組成物は、Ａｎｇ２のホモ及びヘテロ二量体化を防止し得る。所定の実施形態において、そのような二重特異性組成物は、Ａｎｇ２の４量体、６量体又は高次のオリゴマーの形成を防止又は抑制し得る。
所定の実施形態において、特定の細胞表面共受容体への結合に関与するＡｎｇ２の領域に結合する少なくとも１つのアプタマー又はアプタマードメインで構成される二重特異性組成物が開示される。内皮細胞は、Ｔｉｅ２ホモログ、Ｔｉｅ１又はインテグリンのような固有のＴｉｅ２結合共受容体を含む場合があり、それは、アンジオポエチンを互いに識別する手段を提供し得る。Ｔｉｅ２は、アンジオポエチンの主要な受容体であると考えられるが、αｖβ３、αｖβ５及びα５β１インテグリン等のインテグリンも低親和性であるがＡｎｇ２と結合することができ、Ｔｉｅ２依存的及びＴｉｅ２非依存的にこれらのタンパク質の活性を調節する役割を担っている可能性が考えられる。このように、Ａｎｇ２に対する支配的な細胞応答は、Ｔｉｅ２との直接的な相互作用から生じていると考えられるが、共受容体の相互作用も関与し得る。代替的に、Ａｎｇ２に対する細胞応答は、インテグリン自体との直接的な相互作用によって生じ得る。従って、所定の実施形態において、本明細書で提供される二重特異性組成物は、Ａｎｇ２とＴｉｅ１、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン及び／又はα５β１インテグリンとの結合を防止するＡｎｇ２の領域に結合し得る。
一実施形態において、ヒトＡｎｇ２のアミノ酸配列は以下の配列を含む：ＹＮＮＦＲＫＳＭＤＳＩＧＫＫＱＹＱＶＱＨＧＳＣＳＹＴＦＬＬＰＥＭＤＮＣＲＳＳＳＳＰＹＶＳＮＡＶＱＲＤＡＰＬＥＹＤＤＳＶＱＲＬＱＶＬＥＮＩＭＥＮＮＴＱＷＬＭＫＬＥＮＹＩＱＤＮＭＫＫＥＭＶＥＩＱＱＮＡＶＱＮＱＴＡＶＭＩＥＩＧＴＮＬＬＮＱＴＡＥＱＴＲＫＬＴＤＶＥＡＱＶＬＮＱＴＴＲＬＥＬＱＬＬＥＨＳＬＳＴＮＫＬＥＫＱＩＬＤＱＴＳＥＩＮＫＬＱＤＫＮＳＦＬＥＫＫＶＬＡＭＥＤＫＨＩＩＱＬＱＳＩＫＥＥＫＤＱＬＱＶＬＶＳＫＱＮＳＩＩＥＥＬＥＫＫＩＶＴＡＴＶＮＮＳＶＬＱＫＱＱＨＤＬＭＥＴＶＮＮＬＬＴＭＭＳＴＳＮＳＡＫＤＰＴＶＡＫＥＥＱＩＳＦＲＤＣＡＥＶＦＫＳＧＨＴＴＮＧＩＹＴＬＴＦＰＮＳＴＥＥＩＫＡＹＣＤＭＥＡＧＧＧＧＷＴＩＩＱＲＲＥＤＧＳＶＤＦＱＲＴＷＫＥＹＫＶＧＦＧＮＰＳＧＥＹＷＬＧＮＥＦＶＳＱＬＴＮＱＱＲＹＶＬＫＩＨＬＫＤＷＥＧＮＥＡＹＳＬＹＥＨＦＹＬＳＳＥＥＬＮＹＲＩＨＬＫＧＬＴＧＴＡＧＫＩＳＳＩＳＱＰＧＮＤＦＳＴＫＤＧＤＮＤＫＣＩＣＫＣＳＱＭＬＴＧＧＷＷＦＤＡＣＧＰＳＮＬＮＧＭＹＹＰＱＲＱＮＴＮＫＦＮＧＩＫＷＹＹＷＫＧＳＧＹＳＬＫＡＴＴＭＭＩＲＰＡＤＦ（配列番号３０１）。
本明細書に開示されるアプタマー、二重特異性アプタマー又は組成物は、Ａｎｇ２の機能を阻害する場合、その阻害は完全でも部分的でもよい。所定の実施形態において、阻害は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％である。
ＩＶ．使用方法
本明細書に開示されるアプタマー、二重特異性アプタマー又は組成物を利用する眼疾患又は障害の処置方法が本明細書に開示される。
一般に、本明細書に開示される方法は、それを必要とする対象への二重特異性アプタマーの投与を含み、特に、処置の方法は、、それを必要とする対象への二重特異性アプタマー又はそれを含む医薬組成物の投与を含む。
対象は、以前に眼疾患（例えば網膜疾患又は障害）と診断されたことがある、又は例えば年齢、肥満、糖尿病、喫煙、眼障害又は家族歴等の１つ以上の要因によって眼疾患又は障害（例えば網膜疾患又は障害）を発症するリスクがあり得る。
所定の実施形態において、方法は、例えば眼疾患又は障害の処置のための、抗ＩＬ８アプタマードメインに連結された抗ＶＥＧＦアプタマードメインで構成された二重特異性アプタマーの使用を含む。所定の実施形態において、方法は、抗ＩＬ８アプタマードメインに連結された汎特異的抗ＶＥＧＦアプタマードメインで構成された二重特異性アプタマーの使用を含む。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、加齢黄斑変性症であってもよい。特定の実施形態において、黄斑変性症は、加齢黄斑変性症の滲出型（ｗＡＭＤ）であってもよい。特定の実施形態において、黄斑変性症は、加齢黄斑変性症のドライ型（ｄＡＭＤ）であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、増殖性糖尿病網膜症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、糖尿病網膜症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、糖尿病黄斑浮腫であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、非動脈炎性前部虚血性視神経症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、ブドウ膜炎であってもよい。ブドウ膜炎は、例えば感染性ブドウ膜炎又は非感染性ブドウ膜炎であってもよい。ブドウ膜炎は、例えば虹彩炎（前部ブドウ膜炎）、毛様体炎（中間部ブドウ膜炎）、脈絡膜炎及び網膜炎（後部ブドウ膜炎）、及び／又は拡散性ブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎）であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、ベーチェット病であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、コート病であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、未熟児網膜症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、ドライアイであってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、アレルギー性結膜炎であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、翼状片であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、網膜静脈分枝閉塞症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、網膜中心静脈閉塞症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、アデノウイルス角膜炎であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、角膜潰瘍であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、春季角結膜炎であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、スティーブンスジョンソン症候群であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、角膜ヘルペス性角膜炎であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、裂孔原性網膜剥離であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、偽剥離症候群であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、増殖性硝子体網膜症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、感染性結膜炎であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、地図上萎縮であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、スターガート病であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、網膜色素変性症であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、コンタクトレンズ誘発性急性充血（ＣＬＡＲＥ）であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、結膜炎であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、遺伝性網膜疾患であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害は、網膜変性疾患であってもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害を有する対象は、ＶＥＧＦレベルの上昇を示してもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害を有する対象は、ＩＬ８のレベルの上昇を示してもよい。所定の実施形態において、眼疾患又は障害を有する対象は、ＶＥＧＦ及びＩＬ８の上昇したレベルを示し得る。所定の実施形態において、眼疾患又は障害を有する対象は、例えばＮ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）等のビスレチノイドの上昇を示し得る。所定の実施形態において、方法は、抗ＶＥＧＦ処置単独に反応しない又は完全な反応を示さない上記疾患のいずれか（例えばＶＥＧＦ非応答者）の処置のために、抗ＩＬ８アプタマードメインに連結された汎特異的抗ＶＥＧＦアプタマーで構成された二重特異性アプタマーの使用を含み得る。
所定の実施形態において、方法は、ＩＬ８と関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２又はその両方へのＩＬ８結合を防止又は抑制することを含む。所定の実施形態において、方法は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＶＥＧＦＲ２又はそれらの任意の組み合わせへのＩＬ８結合を防止又は抑制することを含み得る。所定の実施形態において、方法は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２又はその両方に関連する下流シグナル伝達を防止又は抑制することを含み得る。所定の実施形態において、方法は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＶＥＧＦＲ２又はそれらの任意の組み合わせに関連する下流シグナル伝達を防止又は抑制することを含み得る。所定の実施形態において、方法は、眼疾患又は障害の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。本開示のいくつかの態様において、方法は、ＩＬ８に関連する機能の部分的又は完全な阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、眼疾患の処置のためのＩＬ８に関連する機能の部分的又は完全な阻害を含み得る。加えて又は代替的に、方法は、眼疾患又は障害の処置のために、ＶＥＧＦに関連する機能の部分的又は完全な阻害と組み合わせて、ＩＬ８に関連する機能の部分的又は完全な阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、滲出型加齢黄斑変性の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、ドライ型加齢黄斑変性の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、地図状萎縮の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、増殖性糖尿病網膜症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、網膜静脈閉塞症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、網膜中心静脈閉塞症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、糖尿病網膜症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、糖尿病黄斑浮腫の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、非動脈炎性前部虚血性視神経症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、ブドウ膜炎の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。ブドウ膜炎は、例えば感染性ブドウ膜炎又は非感染性ブドウ膜炎であってもよい。ブドウ膜炎は、例えば虹彩炎（前部ブドウ膜炎）、毛様体炎（中間部ブドウ膜炎）、脈絡膜炎及び網膜炎（後部ブドウ膜炎）、及び／又は拡散性ブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎）であってもよい。所定の実施形態において、方法は、ベーチェット病の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、コート病の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、未熟児網膜症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、ドライアイの処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、アレルギー性結膜炎の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、翼状片の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、網膜静脈分枝閉塞症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、網膜中心静脈閉塞症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、アデノウイルス角膜炎の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、角膜潰瘍の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、春季角結膜炎の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、スティーブンスジョンソン症候群の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、角膜ヘルペス性角膜炎の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、裂孔原性網膜剥離の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、偽剥離症候群の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、増殖性硝子体網膜の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法及び組成物は、感染性結膜炎の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、スターガート病の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、網膜色素変性症の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、コンタクトレンズ誘発性急性充血（ＣＬＡＲＥ）の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、結膜炎に関連する症状の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、遺伝性網膜疾患の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、網膜変性疾患の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、ＩＬ８の上昇したレベルを示す眼疾患又は障害の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、例えばＮ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）等のビスレチノイドの上昇したレベルを示す眼疾患又は障害の処置のためのＩＬ８に関連する機能の阻害を含み得る。
所定の実施形態において、方法は、ＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、１つ以上のＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦ－Ａの結合又は相互作用の防止又は抑制を含み得る。例えば、方法は、Ｆｌｔ－１、ＫＤＲ、Ｎｒｐ－１又はそれらの任意の組み合わせに対するＶＥＧＦ－Ａの結合又は相互作用を防止又は抑制することを含み得る。所定の実施形態において、方法は、Ｆｌｔ－１、ＫＤＲ、Ｎｒｐ－１又はそれらの任意の組み合わせに関連する下流シグナル伝達を防止又は抑制することを含み得る。所定の実施形態において、方法は、眼疾患又は障害の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、糖尿病網膜症の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、未熟児網膜症の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法及び組成物は、網膜中心静脈閉塞症の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、黄斑浮腫の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、脈絡膜新生血管の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、新生血管性（又は滲出型）加齢黄斑変性の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、近視性脈絡膜新生血管の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法及び組成物は、点状内脈絡膜症の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法及び組成物は、推定眼ヒストプラスマシス症候群の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、家族性滲出型硝子体網膜症の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、網膜芽細胞腫の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。所定の実施形態において、方法は、ＶＥＧＦ－Ａの１つ以上のアイソフォーム又はバリアントの上昇したレベルを示す眼疾患又は障害の処置のためのＶＥＧＦ－Ａに関連する機能の阻害を含み得る。
さらに又は代替的に、方法は、以下のいずれか１つの処置のために、ＶＥＧＦに関連する機能の阻害と組み合わせて、ＩＬ８に関連する機能の阻害を含んでもよい：滲出型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性、地図状萎縮、増殖性糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、中心漿液性脈絡網膜症、Ｘリンク性網膜色素変性、Ｘリンク性網膜症、非動脈硬化前脳虚血性視神経症、ブドウ膜炎（感染性ブドウ膜症、非感染性ブドウ膜炎、虹彩炎（前部ブドウ膜炎）、環状炎（中間部ブドウ膜炎）、脈絡膜炎及び網膜炎（後部ブドウ膜炎）、びまん性ブドウ膜炎（全羽根膜炎）を含む）、強膜炎、視神経炎、多発性硬化症に伴う視神経炎、黄斑パッカー、ベーチェット病、コート病、未熟児網膜症、開放隅角緑内障、新生血管緑内障、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、翼状片、網膜静脈分枝閉塞症、アデノウィルス角膜炎、角膜潰瘍、春季角結膜炎、眼瞼炎、上皮性基底膜ジストロフィー、スティーブンスジョンソン症候群、色覚異常、角膜ヘルペス性角膜炎、円錐角膜、裂孔原性網膜剥離、偽剥離症候群、増殖性硝子体網膜症、感染性結膜炎、スターガルト病、網膜色素変性症、コンタクトレンズ誘発性急性充血（ＣＬＡＲＥ）、結膜カラシス、遺伝性網膜疾患、網膜変性疾患、ＩＬ８レベルの上昇を示す眼疾患又は障害、及び例えばＮ－レジニリデン－Ｎ－レジニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）等のビスレチノイドのレベルを上昇させる眼疾患又は障害等。
さらに又は代替的に、方法及び組成物は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＩＬ８、Ａｎｇ２、Ｃ５、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ及び因子Ｄからなる群から選択される２つの標的の組み合わせに関連する阻害を含み得る。
本明細書に開示される方法が機能の阻害又は症状等の軽減をもたらす場合、阻害又は軽減は、部分的であっても完全であってもよい。所定の実施形態において、阻害又は軽減は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％である。
所定の実施形態において、処置の結果は、視覚機能的アウトカム尺度、構造的アウトカム尺度又は患者の自己報告によるアウトカム尺度を用いて測定される。一実施形態において、処置の結果は、視力、暗所視及び薄明視マイクロペリメトリー感度、低輝度視力、消失視標視力、低輝度欠陥等に関して（ベースラインと比較して）測定される。
特定の実施形態において、処置により、早期治療糖尿病網膜症（ＥＴＤＲＳ）チャートで測定される全体的な最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、少なくとも３文字、少なくとも４文字、少なくとも５文字、少なくとも６文字、少なくとも７文字、少なくとも８文字、少なくとも９文字、少なくとも１０文字、少なくとも１１文字、少なくとも１２文字、少なくとも１３文字、少なくとも１４文字、少なくとも１５文字、少なくとも１６文字、少なくとも１７文字、少なくとも１８文字、少なくとも１９文字、少なくとも２０文字、又は２０文字以上向上する。
一実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、ベースラインからＢＣＶＡで１５文字以上獲得する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
一実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、ベースラインからＢＣＶＡで１０文字以上獲得する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
一実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、ベースラインからＢＣＶＡで５文字以上獲得する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
一実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、ベースラインからＢＣＶＡで１５文字以上の損失を回避する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
一実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、ベースラインからＢＣＶＡで１０文字以上の損失を回避する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
一実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、ベースラインからＢＣＶＡで５文字以上の損失を回避する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
一実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、ベースラインからＢＣＶＡで０文字以上の損失を回避する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
特定の実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、フルオレセイン血管造影（ＦＡ）及び光コヒーレンス・トモグラフィー（ＯＣＴ）によって測定される網膜液の減少が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
特定の実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、フルオレセイン血管造影（ＦＡ）及び光コヒーレンス・トモグラフィー（ＯＣＴ）によって測定される網膜厚の減少が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
特定の実施形態において、処置により、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、フルオレセイン血管造影（ＦＡ）及び光コヒーレンス・トモグラフィー（ＯＣＴ）によって測定される脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）病変の総面積の減少が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である。
特定の実施形態において、有効量の二重特異性アプタマー又はそれを含む医薬組成物は、本明細書に開示された有効量の二重特異性アプタマー又は医薬組成物を意味し、それは、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、未処置対照群の対象と比較して、全視力、視野を少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上低減する。
また、キットも提供される。そのようなキットは、本明細書に記載される二重特異性アプタマー、及び特定の実施形態では投与のための説明書を含み得る。そのようなキットは、本明細書に記載される方法の実施を容易にすることができる。キットとして供給される場合、本明細書に開示される組成物の異なる成分は、別々の容器に包装され、使用前に直ちに混合され得る。一実施形態において、二重特異性組成物は、プレフィルドシリンジとして製剤化される。
Ｖ．アプタマー
所定の実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、眼疾患の処置のために二重特異性アプタマーを用いる。所定の実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、１つ以上の抗ＶＥＧＦアプタマー、１つ以上の抗ＩＬ８アプタマー、又は１つ以上の抗Ａｎｇ２アプタマーを用い得る。所定の実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物は、ＶＥＧＦ、ＩＬ８又はＡｎｇ２に関連する活性を阻害するための１つ以上のアプタマーを用いる。
本明細書に記載されるアプタマー及び二重特異性アプタマーは、アプタマーの機能又は親和性に影響を与え得る任意の数の修飾を含み得る。例えば、アプタマーは、非修飾であってもよく、安定性、ヌクレアーゼ耐性又は送達特性を改善するために修飾ヌクレオチドを含み得る。そのような修飾の例は、例えばリボースの２’位、ピリミジンの５位、プリンの８位といった糖及び／又はリン酸及び／又は塩基位置での化学的置換を含み得る。２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）及び／又は２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）置換基の修飾を含む種々の２’－修飾ピリミジン及びプリンが周知である。所定の実施形態において、本明細書に記載されるアプタマーは、インビボ安定性を向上するために、２’－ＯＭｅ及び／又は２’Ｆ修飾を含む。所定の実施形態において、本明細書に記載されるアプタマーは、標的に対するアプタマーの親和性及び特異性を改善するために、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドの例は、グアニジン、インドール、アミン、フェノール、ヒドロキシメチル又はボロン酸で修飾されたものを含む。他の場合、ピリミジンヌクレオチド三リン酸アナログ又はＣＥ－ホスホラミダイトは、５位で修飾されて、例えば５－ベンジルアミノカルボニル－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－［Ｎ－（フェニル－３－プロピル）カルボシアミド］－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－（１－ナフチルメチル）カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－イソブチルアミノカルボニル－２’－デオキシウリジン（ＩｂｄＵ）、５－（Ｎ－トリチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルアミノカルボニル－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２'－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－フェネチルカルボキシアミド）－２’デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５－（イミジゾリルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ｉｍｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－Ｒ－スレオニルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５－（Ｎ－トリプトアミノカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－トリプトアミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンクロライド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－［Ｎ－（１－モルホリノ－２－エチル）カルボキシアミド］－２’－デオキシウリジン（ＭＯＥｄｕ）、Ｒ－テトラヒドロフラニルメチル－２’－デオキシウリジン（ＲＴＭｄＵ）、３－メトキシベンジル－２’－デオキシウリジン（３ＭＢｎｄＵ）、４－メトキシベンジル－２’－デオキシウリジン（４ＭＢｎｄＵ）、３，４－ジメトキシベンジル－２’－デオキシウリジン（３，４ＤＭＢｄＵ）、Ｓ－テトラヒドロフラニルメチル－２’－デオキシウリジン（ＳＴＭｄＵ）、３，４－メチレンジオキシフェニル－２－エチル－２’－デオキシウリジン（ＭＰＥｄＵ）、４－ピリジニルメチル－２’－デオキシウリジン（ＰｙｒｄＵ）、１－ベンジミダゾール－２－エチル－２’－デオキシウリジン（ＢｉｄＵ）、５－（アミノ－１－プロぺニル）－２’－デオキシウリジン、５－（インドール－３－アセトアミド－１－プロぺニル）－２’－デオキシウリジン、又は５－（４－ピバロイルベンズアミド－１－プロぺニル）－２’－デオキシウリジンを生成し得る。
本開示で企図されるアプタマー及び二重特異性アプタマーの修飾は、以下に限定されないが、核酸アプタマーの塩基又は核酸アプタマー全体に対して、追加の電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用及び機能性を組み込む他の化学基を提供するものがある。ヌクレアーゼに対して耐性であるオリゴヌクレオチド群を生成するための修飾は、１つ以上の置換ヌクレオチド間の連結、改変糖、改変塩基又はそれらの組み合わせも含み得る。このような修飾は、以下に限定されないが、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、外環アミンでの修飾、４－チオウリジンの置換、５－ブロモ又は５－ヨード－ウラシルの置換、バックボーン修飾、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はアルキルリン酸修飾、メチル化及びイソ塩基のイソシチジン及びイソグアノシン等の通常でない塩基ペアリング結合を含む。修飾は、例えばエキソヌクレアーゼ耐性を増強するための３'－３’－ｄＴキャップの付加等の３’及び５’修飾も含み得る。
本開示のアプタマー及び二重特異性アプタマーは、一般にβ－Ｄ－リボフラノース配座にリボースを有するヌクレオチドを含み得る。所定の実施形態において、アプタマーに含まれるヌクレオチドの１００％が、β－Ｄ－リボフラノース配座にリボースを有する。所定の実施形態において、アプタマーに含まれるヌクレオチドの少なくとも５０％が、β－Ｄ－リボフラノース配座にリボースを有する。所定の実施形態において、アプタマーに含まれるヌクレオチドの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％がβ－Ｄ－リボフラノース配座にリボースを有する。
二重特異性アプタマー内のアプタマー又はアプタマードメインの長さは、可変であり得る。所定の実施形態において、長さは１００ヌクレオチド未満である。所定の実施形態において、長さは１０ヌクレオチドよりも長い。所定の実施形態において、長さは１０～９０ヌクレオチドの間である。二重特異性アプタマーのアプタマードメインを含むアプタマーは、以下に限定されないが、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５又は約９０ヌクレオチド長であり得る。
一実施形態において、二重特異性アプタマーは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ヌクレオチド長である。
所定の実施形態において、二重特異性組成物のＶＥＧＦ－Ａアプタマードメインの核酸配列は、配列番号１～４６のうちの１つに対して、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の少なくとも１つの１次配列同一性の程度を有し得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物のＩＬ８アプタマードメインの核酸配列は、配列番号４７～４８のうちの１つに対して、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の少なくとも１つの１次配列同一性の程度を有し得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物のＡｎｇ２アプタマードメインの核酸配列は、配列番号４９～５０のうちの１つに対して、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の少なくとも１つの１次配列同一性の程度を有し得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物のＣ５アプタマードメインの核酸配列は、配列番号５１に対して、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の少なくとも１つの１次配列同一性の程度を有し得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物のＰＤＧＦアプタマードメインの核酸配列は、配列番号５２に対して、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の少なくとも１つの１次配列同一性の程度を有し得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物のＦＧＦ２アプタマードメインの核酸配列は、配列番号５３に対して、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の少なくとも１つの１次配列同一性の程度を有し得る。所定の実施形態において、二重特異性組成物の因子Ｄアプタマードメインの核酸配列は、配列番号５４のうちの１つに対して、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の少なくとも１つの１次配列同一性の程度を有し得る。いくつかの例において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖は、アプタマー又は二重特異性アプタマーに共有結合されており、本明細書ではＰＥＧ化として言及されている。理論に拘束されることを望むことなく、ＰＥＧ化は、生理学的条件下でのアプタマーの半減期及び安定性を向上し得る。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、アプタマー又は二重特異性アプタマーの５’末端に共有結合される。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、アプタマー又は二重特異性アプタマーの３’末端に共有結合される。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、アプタマー又は二重特異性アプタマーの５’末端及び３’末端の両方に共有結合される。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、ピリミジンの５位又はプリンの８位を含むアプタマー内の核酸塩基上の特定の部位に共有結合される。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、アプタマー又は二重特異性アプタマー内の塩基性部位に共有結合される。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、二重特異性アプタマー内の第１のアプタマードメインに共有結合される。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、二重特異性アプタマー内の第２のアプタマードメインに共有結合される。所定の実施形態において、ＰＥＧポリマーは、二重特異性アプタマー内の両方のアプタマードメインに共有結合される。
ポリエチレングリコール
所定の実施形態において、本明細書に記載されるアプタマー又は二重特異性アプタマーは、一般式Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨを有するＰＥＧにコンジュゲートされ得る。所定の実施形態において、本明細書に記載されるアプタマー又は二重特異性アプタマーは、一般式ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＨのメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）にコンジュゲートされ得る。所定の実施形態において、アプタマー又は二重特異性アプタマーは、直鎖状ＰＥＧ又はｍＰＥＧにコンジュゲートされ得る。直鎖ＰＥＧ又はｍＰＥＧは、約３０ｋＤまでの平均分子量を有し得る。複数の直鎖ＰＥＧ又はｍＰＥＧは、共通の反応性基に連結して多アーム又は分枝ＰＥＧ又はｍＰＥＧを形成し得る。例えば、複数のＰＥＧ又はｍＰＥＧは、アミノ酸リンカー（例えばリジン）又はグリセリン等の他のリンカーを介して一緒に連結され得る。所定の実施形態において、アプタマー又は二重特異性アプタマーは、分枝ＰＥＧ又は分枝ｍＰＥＧにコンジュゲートされる。分枝ＰＥＧ又はｍＰＥＧは、それらの総質量によって言及され得る（例えば２つの連結した２０ｋＤのｍＰＥＧは、４０ｋＤの総分子量を有する）。分枝ＰＥＧ又はｍＰＥＧは、２つ以上のアームを有し得る。多アームの分枝ＰＥＧ又はｍＰＥＧは、それらの総質量によって言及され得る（例えば４つの連結した１０ｋＤのｍＰＥＧは、４０ｋＤの総分子量を有する）。所定の実施形態において、本開示のアプタマー又は二重特異性アプタマーは、約５ｋＤ～約２００ｋＤの総分子量を有するＰＥＧポリマーにコンジュゲートされ、例えば約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、約８０ｋＤ、約９０ｋＤ、約１００ｋＤ、約１１０ｋＤ、約１２０ｋＤ、約１３０ｋＤ、約１４０ｋＤ、約１５０ｋＤ、約１６０ｋＤ、約１７０ｋＤ、約１８０ｋＤ、約１９０ｋＤ又は約２００ｋＤである。非限定的な一例において、アプタマー又は二重特異性アプタマーは、約４０ｋＤの総分子量を有するＰＥＧにコンジュゲートされる。
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられ得る試薬は、２０ｋＤ、４０ｋＤ又は６０ｋＤの総分子量を有し（例えば各ｍＰＥＧが約１０ｋＤ、２０ｋＤ又は約３０ｋＤである）、下記一般式を有する分枝ＰＥＧ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ－ＮＨＳ）である。
Figure 2023521146000028
 上記のように、分枝ＰＥＧはアミノ酸（例えばリジン又はグリシン残基）等の適当な試薬を介して連結され得る。
非限定的な一例において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、下記式を有する［Ｎ２－（モノメトキシ２０Ｋポリエチレングリコールカルバモイル）－Ｎ６－（モノメトキシ２０Ｋポリエチレングリコールカルバモイル）］－リジンＮ－ヒドロキシスクシンイミドである。
Figure 2023521146000029
さらに他の非限定的な例において、ＰＥＧ化アプタマー又は二重特異性アプタマーを生成するために用いられる試薬は下記式を有する。
Figure 2023521146000030
 上記式において、ＸはＮ－ヒドロキシスクシンイミドであり、ＰＥＧアームはほぼ同等の分子量である。そのようなＰＥＧ構造は、２本アーム又は１本アームの直鎖ＰＥＧにコンジュゲートされた同様のアプタマーと比較して、粘度が減少した化合物を提供し得る。
いくつかの例において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は下記式を有する。
Figure 2023521146000031
 上記式において、ＸはＮ－ヒドロキシスクシンイミドであり、ＰＥＧアームは異なる分子量であり、例えば４０ｋＤのＰＥＧは５ｋＤの２本のアームと７．５ｋＤの４本のアームで構成され得る。そのようなＰＥＧ構造は、２本アームのＰＥＧ又は１本アームの直鎖状ＰＥＧに結合した同様のアプタマーと比較して、粘度が低減された化合物を提供し得る。
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられ得る試薬は、下記一般式を有する非分枝ｍＰＥＧ－スクシンイミジル・プロピオネート（ｍＰＥＧ－ＳＰＡ）である：
Figure 2023521146000032
 上記式において、ｍＰＥＧは約２０ｋＤ又は約３０ｋＤである。一例において、反応性エステルは、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ２－ＮＨＳであり得る。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられ得る試薬は、グリセロールを介して連結された分枝ＰＥＧ、例えば日本の日油株式会社からのＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）シリーズ等を含み得る。これらの非限定的な例は、以下を含む。
Figure 2023521146000033
他の実施形態において、試薬は、下記一般式を有する非分枝ｍＰＥＧスクシンイミジルα－メチルブタノエート（ｍＰＥＧ－ＳＭＢ）を含み得る：
Figure 2023521146000034
 ｍＰＥＧは１０～３０ｋＤの間である。一例において、反応性エステルは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ）３－ＣＯ２－ＮＨＳであり得る。
所定の実施形態において、ＰＥＧ試薬は、下記一般式を有するニトロフェニルカーボネート結合ＰＥＧを含み得る。
Figure 2023521146000035
ニトロフェニルカーボネートを含む化合物は、一級アミン含有リンカーにコンジュゲートされ得る。
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、チオール修飾リンカーと共に用いることができるチオール反応性基を有するＰＥＧを含み得る。非限定的な一例は、下記一般構造を有する試薬を含み得る：
Figure 2023521146000036
 上記式において、ｍＰＥＧは約１０ｋＤ、約２０ｋＤ又は約３０ｋＤである。
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、下記構造を有する試薬を含み得る：
Figure 2023521146000037
 ｍＰＥＧはそれぞれ約１０ｋＤ、約２０ｋＤ又は約３０ｋＤであり、総分子量はそれぞれ約２０ｋＤ、約４０ｋＤ又は約６０ｋＤである。上記のようなチオール修飾リンカーと共に用いられ得るチオール反応性基を有する分枝ＰＥＧは、分枝ＰＥＧが約４０ｋＤ又は約６０ｋＤの総分子量（例えば各ｍＰＥＧが約２０ｋＤ又は約３０ｋＤである）を有する試薬を含み得る。
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、下記構造を有する試薬を含み得る。
Figure 2023521146000038
所定の実施形態において、ＰＥＧをアプタマーにコンジュゲートする反応は、約ｐＨ６～１０の間、又は約ｐＨ７～９の間、又は約ｐＨ８で実施される。
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマー又は二重特異性アプタマーを生成するために用いられる試薬は、下記構造を有する試薬を含み得る。
Figure 2023521146000039
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、以下の構造を有する試薬を含み得る。
Figure 2023521146000040
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、以下の構造を有する試薬を含み得る。
Figure 2023521146000041
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、下記構造を有する試薬を含み得る。
Figure 2023521146000042
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、下記構造を有する試薬を含み得る。
Figure 2023521146000043
所定の実施形態において、ＰＥＧ化アプタマーを生成するために用いられる試薬は、下記構造を有する試薬を含み得る。
Figure 2023521146000044
所定の実施形態において、アプタマーは、単一のＰＥＧ分子と結合される。他の場合において、アプタマー又は二重特異性アプタマーは、２つ以上のＰＥＧ分子と結合される。
所定の実施形態において、本明細書に記載されるアプタマー又は二重特異性アプタマーは、所望の生物学的特性を有する１つ以上の分子に結合又はコンジュゲートされ得る。任意の数の分子がアプタマーに結合又はコンジュゲートでき、非限定的な例として、抗体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、酵素、ポリマー、薬剤、低分子、金ナノ粒子、放射性標識、蛍光標識、色素、ハプテン（例えばビオチン）、他のアプタマー又は核酸（例えばｓｉＲＮＡ）を含む。所定の実施形態において、アプタマーは、アプタマーの安定性、溶解性又は生物学的利用能を向上させる分子にコンジュゲートされ得る。非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、炭水化物及び脂肪酸を含む。所定の実施形態において、アプタマーの輸送又は送達を改善する分子、例えば細胞透過性ペプチド等が用いられ得る。細胞透過性ペプチドの非限定的な例は、Ｔａｔ、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチドＡｒｇ８配列、トランスポーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＶＰ２２タンパク質、ブフォリンＩ及びＳｙｎＢ等の抗菌ペプチド、ポリプロリンスイートアローペプチド分子、Ｐｅｐ－１及びＭＰＧに由来するペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、アプタマーは、コレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール等の親油性化合物、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非免疫原性高分子化合物若しくはポリマー、又は以下に限定されないがポリアミノアミン（ＰＡＭＡＭ）及びデキストラン等の多糖若しくはポリオキサゾリン（ＰＯＺ）等の他の水溶性の医薬的に許容可能なポリマー等にコンジュゲートされる。
コンジュゲートされる分子は、目的のアプタマーと共有結合でき、又は非共有結合的相互作用を介して結合できる。一例において、コンジュゲートされる分子は、アプタマー又は二重特異性アプタマーに共有結合される。共有結合は、アプタマー上の種々の位置、例えば塩基上の外環式アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸の水酸基、又は５’若しくは３’末端の水酸基若しくは他の基に生じ得る。一例において、共有結合は、アプタマーの５’又は３’ヒドロキシル基に対するものである。
流体力学半径
二重特異性アプタマーが共投与又は共配合よりも優れている点は、流体力学半径が大きくなることである。分子サイズは、眼からの拡散を低下させるための重要な属性である。分子サイズは、分子量と流体力学半径（Ｒｈ）の２つの方法で測定され得る。流体力学半径が大きい分子では、眼球内における分子の物理的サイズとクリアランス率との間に大きな相関がある。
図２に示されたアプタマーは全て、薬物動態学的（ＰＫ）拡張のためにＰＥＧキャリアにコンジュゲートされた単一のアプタマーである。ＰＥＧを付加する前に第２のアプタマードメインを付加することによりアプタマー部分をより大きくすることができれば、いくつかの利点が得られる。Ｓｈａｒｔｚ ｅｔ ａｌ． は、Ｒｈを大きくするとウサギでの半減期が長くなることを示した。そして、ウサギにおけるこの長い半減期は、ヒトにおけるより長い半減期に確実に変換される。二重特異性アプタマー組成物は、Ｒｈが大きいことと溶解性が高いこととから、現在の抗体及び抗体断片製品よりも優位性がある。必要に応じてＰＥＧ分子とコンジュゲートさせることができるため、持続時間をさらに長くすることができる。
リンカー
所定の実施形態において、アプタマー又は二重特異性アプタマーは、直接に、又はスペーサー若しくはリンカーを用いて他の分子に結合され得る。例えば、親油性化合物又は非免疫原性高分子化合物は、リンカー又はスペーサーを用いてアプタマーに結合され得る。種々のリンカー及び結合性化学物質は、本技術分野において周知である。非限定的な例において、６－（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノール（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホルアミダイトは、合成したアプタマーの５’末端にヘキシルアミノリンカーを付加するのに用いられ得る。このリンカーは、本明細書で提供される他のアミノリンカーと同様に、アミンを保護する基が除去されると、ＰＥＧ－ＮＨＳエステルと反応させて、共有結合したＰＥＧ－アプタマーを生成し得る。リンカーホスホルアミダイトの他の非限定的な例は、以下を含む。
下記構造を有するＴＦＡ－アミノＣ４ＣＥＤホスホルアミダイト：
Figure 2023521146000045
 下記構造を有する５’－アミノモディファイアＣ３ＴＦＡ：
Figure 2023521146000046
 下記構造を有するＭＭＴアミノモディファイアＣ６ＣＥＤホスホルアミダイト：
Figure 2023521146000047
 下記構造を有する５’－アミノモディファイア５：
Figure 2023521146000048
 下記構造を有する５’－アミノモディファイアＣ１２：
Figure 2023521146000049
 下記構造を有する５’チオールモディファイアＣ６：
Figure 2023521146000050
 下記構造を有する５’チオールモディファイアＣ６：
Figure 2023521146000051
 及び下記構造を有する５’チオールモディファイアＣ６：
Figure 2023521146000052
５’－チオール修飾リンカーは、例えばＰＥＧ－マレイミド、ＰＥＧ－ビニルスルホン、ＰＥＧ－ヨードアセトアミド及びＰＥＧ－オルトピリジルジスルフィドと共に用いられ得る。一例において、アプタマーは、マレイミド又はビニルスルホン官能基を介して５’－チオールに結合され得る。
所定の実施形態において、本開示に従って製剤化されたアプタマー又は二重特異性アプタマーは、リポソーム内にカプセル化すること又はリポソームの表面上に表示することによっても修飾され得る。他の場合において、本開示に従って製剤化されたアプタマーは、ミセル内にカプセル化すること又はミセルの表面上に表示することによっても修飾され得る。リポソーム及びミセルは、任意の脂質で構成されてもよく、所定の実施形態において、脂質はホスファチジルコリンを含むリン脂質であってもよい。また、リポソーム及びミセルは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）のＰＥＧコンジュゲートを含む他のポリマー及び両親媒性分子の一部又は全部を含む又はそれらで構成され得る。
ＶＩ．医薬組成物及び製剤
また、医薬組成物として調製されたアプタマー又は二重特異性アプタマーも開示される。本明細書に記載されるような組成物は、液体製剤、固体製剤又はそれらの組み合わせを含み得る。製剤の非限定的な例は、錠剤、カプセル、ゲル、ペースト、液剤、及びクリームを含み得る。本開示の組成物は、任意の数の賦形剤をさらに含み得る。賦形剤は、溶媒、コーティング、香料、着色料、滑沢剤、崩壊剤、保存料、甘味料、結合剤、希釈剤、及びビヒクル（又はキャリア）の何れか及び全てを含み得る。一般に、賦形剤は、本開示の治療用組成物と適合性がある。また、医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、並びに例えば酢酸ナトリウム及びトリエタノールアミンオレエートのような他の物質等の非毒性補助物質を少量含み得る。
本明細書に開示される製剤の治療用量は、それを必要とする対象に投与され得る。所定の実施形態において、製剤は、例えばｗｅｔＡＭＤ、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、網膜分岐静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、未熟児網膜症、放射線網膜症、ドライＡＭＤ、又は地図状萎縮を処置するために対象の眼に投与される。眼への投与は、ａ）局所投与、ｂ）眼局所投与、又はｃ）全身投与とすることができる。局所製剤は、眼に直接（例えば、目薬、製剤を装填したコンタクトレンズ）、又はまぶたに（例えば、クリーム、ローション、ゲル）適用され得る。所定の実施形態において、局所投与は、眼から離れた部位、例えば四肢の皮膚へ投与され得る。この投与形態は、眼によって直接生成されない標的に適し得る。所定の実施形態において、本開示の製剤は、局所的な眼球送達により投与される。眼局所投与の非限定的な例は、硝子体内（ＩＶＴ）、カマレル内、結膜下、テノン下、脈絡膜上、後球腺、後十字膜、及び球腺周囲を含む。所定の実施形態において、本開示の製剤は、硝子体内投与（ＩＶＴ）によって送達される。眼局所送達は、一般に、液体製剤の注射を含み得る。他の場合において、本開示の製剤は、全身投与される。全身投与は、経口投与を含み得る。所定の実施形態において、全身投与は、静脈内投与、皮下投与、注入、移植等とすることができる。
本明細書に記載の医薬組成物の送達に適した他の製剤は、眼疾患の処置中に移植される生分解性マイクロサイズポリマーシステム、例えば、マイクロデバイス、マイクロ粒子、又はスポンジ、又は他の徐放性経強膜デバイスの外科的移植による、又は眼送達デバイス、例えばポリマー製コンタクトレンズ持続送達デバイスによる持続放出ゲル又はポリマー製剤を含み得る。所定の実施形態において、製剤は、ポリマーゲル、自己組織化ゲル、耐久性インプラント、溶出性インプラント、生分解性マトリクス、又は生分解性ポリマーである。所定の実施形態において、製剤は、組成物を眼の表面から後方に送るために電流を用いるイオントフォレーシスによって投与され得る。所定の実施形態において、製剤は、硝子体内リザーバ、硝子体外リザーバ、又はそれらの組み合わせを有する外科的に埋め込まれたポートによって投与され得る。移植可能な眼球デバイスの例は、以下に限定されないが、Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂが開発したＤｕｒａｓｅｒｔ技術、Ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが開発したＯＤＴｘデバイス、ＦｏｒＳｉｇｈｔ ＶＩＳＩＯＮ４が開発したＰｏｒｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ、及びＲｅｐｌｅｎｉｓｈ，Ｉｎｃが開発したＭｉｃｒｏＰｕｍｐシステムを含み得る。
所定の実施形態において、ナノスフィア、ナノ粒子、ナノカプセル、リポソーム、ナノセル、及びデンドリマーを含む医薬組成物を送達するために、ナノテクノロジーが使用され得る。
本明細書に開示される組成物は、毎日１回以上投与され得る。所定の実施形態において、組成物は、単回投与（すなわち、１回限りの使用）として投与される。この例において、単回投与は治癒的であり得る。他の場合において、組成物は、連続的に投与され得る（例えば、処置レジメンの期間中に休まずに毎日服用される）。所定の実施形態において、処置レジメンは、１週間未満、１週間、２週間、３週間、１か月、又は１か月以上とすることができる。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも１２週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも１６週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも２０週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも２４週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも２８週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも３２週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも３６週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも４０週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも４４週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも４８週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、少なくとも５２週間の期間にわたって１回投与される。所定の実施形態において、組成物は、４週間ごとに１回の注射を３か月行うローディング用量として投与される。
本明細書に記載されるような二重特異性アプタマーは、治療用薬物の眼内濃度をより長い期間維持できるため、より頻繁な投与を必要とせず、現行のアプローチよりも特に有利であり得る。例えば、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体又はＦａｂは、４週間ごと（ｑ４ｗ）に投与された場合には１０ｍｇで滲出型加齢黄斑変性の治療のための臨床効果を示すが、８週間ごと（ｑ８ｗ）には投与されない場合がある。本明細書に記載される二重特異性アプタマーは、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体又はＦａｂ及び他の抗体療法よりも長い眼内半減期を有し、及び／又はより長い期間、薬物の治療眼内濃度を維持し、従って、投与頻度を少なくし得る。所定の実施形態において、二重特異性アプタマーは、少なくとも４週間ごと（ｑ４ｗ）、５週間ごと（ｑ５ｗ）、６週間ごと（ｑ６ｗ）、７週間ごと（ｑ７ｗ）、８週間ごと（ｑ８ｗ）、９週間ごと（ｑ９ｗ）、１０週間ごと（ｑ１０ｗ）、１１週間ごと（ｑ１１ｗ）、１２週間ごと（ｑ１２ｗ）、１３週間ごと（ｑ１３ｗ）、１４週間ごと（ｑ１４ｗ）、１５週間ごと（ｑ１５ｗ）、１６週間ごと（ｑ１６ｗ）、１７週間ごと（ｑ１７ｗ）、１８週間ごと（ｑ１８ｗ）、１９週間ごと（ｑ１９ｗ）、２０週間ごと（ｑ２０ｗ）、２１週間ごと（ｑ２１ｗ）、２２週間ごと（ｑ２２ｗ）、２３週間ごと（ｑ２３ｗ）、２４週間ごと（ｑ２４ｗ）、又はｑ２４ｗよりも大きく投与される。
本明細書における組成物は、眼疾患又は障害の処置のための任意の数の医薬組成物、及び本明細書で提供されるＰＥＧ化二重特異性アプタマー組成物を含む任意のタイプの製剤を含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載される組成物（例えば、ＰＥＧ試薬にコンジュゲートされた治療用二重特異性アプタマー）の治療的有効量を含み得る。所定の実施形態において、本明細書で提供される製剤又は医薬組成物は、本明細書で提供されるＰＥＧ化二重特異性アプタマー、及び液体又は緩衝剤等の本明細書で提供される他の物質又は成分を含む。
所定の実施形態において、医薬組成物又は製剤は、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーのみで構成される。他の場合において、製剤又は医薬組成物は、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーで実質的に構成される（例えば、約７０％よりも多い、約８０％よりも多い、約９０％よりも多い、約９５％よりも多いＰＥＧ化二重特異性アプタマーで構成される）。他の場合において、製剤又は医薬組成物は、ほとんどがＰＥＧ化二重特異性アプタマーで構成される（例えば約５０％よりも多いＰＥＧ化二重特異性アプタマー）。所定の実施形態において、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、医薬製剤のマイナーな構成要素である。所定の実施形態において、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、医薬製剤又は組成物の約２０％未満、約１０％未満、又は約５％未満を構成する。所定の実施形態において、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、医薬製剤又は組成物の約３％～約５％を構成する。
製剤又は医薬組成物は、任意の数の賦形剤、ビヒクル又はキャリアをさらに含み得る。例えば、医薬組成物は、治療的有効量の二重特異性組成物を単独で、又は１つ以上のビヒクル（例えば医薬的に許容可能な組成物又は医薬的に許容可能なキャリア）と組み合わせて含み得る。賦形剤は、緩衝剤、溶媒、潤滑剤、防腐剤、希釈剤及びビヒクル（又はキャリア）の何れか及び全て含み得る。一般に、賦形剤は、本明細書に記載される組成物と適合性を有する。医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、並びに例えば酢酸ナトリウム及びトリエタノールアミンオレエート等の他の物質等の非毒性補助物質を少量含み得る。
所定の実施形態において、治療的有効量の二重特異性組成物は、対象に投与される。「治療的有効量」の用語は、対象において治療的又は所望の反応を誘導する組成物の量を意味する。所定の実施形態において、治療的又は所望の反応は、疾患又は障害に関連する１つ以上の症状の緩和又は軽減である。所定の実施形態において、治療的又は所望の反応は、疾患又は障害の予防的処置である。組成物の治療的有効量は、投与経路に依存し得る。全身投与の場合において、治療的有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇであり得る。所定の実施形態において、治療的有効量は、全身投与の場合、約１０μｇ／ｋｇ～約１０００μｇ／ｋｇであり得る。眼球内投与の場合、治療的有効量は、１眼当たり約２５μｌ～約１００μｌの注射容量中で約０．０１ｍｇ～約１５０ｍｇとすることができる。
医薬組成物は、対象に治療上の利益をもたらすのに十分な用量又は治療上の反応を引き起こすのに十分な用量で投与され得る。用量は、二重特異性アプタマー及び使用のために選択されたＰＥＧ試薬を含む種々の因子に依存して変化し得る。所定の実施形態において、本開示のＰＥＧ化二重特異性アプタマー（例えば、２、３又はそれ以上のアームを有するＰＥＧに結合した二重特異性アプタマー）の治療的有効量は、比較的少量で対象に投与され得る。所定の実施形態において、２つ以上のアームを有するＰＥＧ試薬に結合した二重特異性アプタマーの治療的有効量は、２つ未満のアームを有するＰＥＧ試薬に結合した二重特異性アプタマーよりも小さい容量で対象に投与され得る。所定の実施形態において、３つ以上のアームを有するＰＥＧ試薬に結合した二重特異性アプタマーの治療的有効量は、３つ未満のアームを有するＰＥＧ試薬に結合した二重特異性アプタマーよりも小さい容量で対象に投与され得る。例えば、３つ以上のアームを有するＰＥＧ試薬を用いることの驚くべき利点は（例えば、より小さい粘度、より高い注射可能性等）のために、本開示のＰＥＧ化二重特異性アプタマーを含む製剤は、より濃縮され得る（従ってより小さい投与量を必要とし得る）。所定の実施形態において、治療的組成物／製剤は、単一の投与、例えば単一の注射、単一の眼窩内注射において、治療的有効量を対象に送達することを可能にし得る。所定の実施形態において、治療的組成物／製剤は、治療的有効量を１回の投与、例えば１回の注射、１回の硝子体内注射で対象に送達することを可能にする粘度を有し得る。
所定の実施形態において、３つ以上のアーム（例えば、３つ以上のアーム、４つ以上のアーム等）を有するＰＥＧ試薬に結合したアプタマーの治療的有効量は、２つ以下のアームを有するＰＥＧ試薬に結合した二重特異性アプタマーの治療的有効量よりも少なくなり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、体内保持時間の増大が、治療反応を達成するために必要なＰＥＧ化二重特異性アプタマーの量を減少させ得るからである。
本明細書における医薬組成物は、一般に、硝子体への注射によって投与され得る（すなわち、硝子体内（ＩＶＴ）投与）。ＩＶＴ投与は、片眼のみが眼疾患に罹患している場合は片眼に、両眼が罹患している場合は両眼にそれぞれ行うことができる。本明細書における医薬組成物は、眼窩内投与に適した製剤であってもよい。例えば、医薬組成物は、硝子体内への注入のために液体製剤で調製されてもよい。
本明細書で提供される液体製剤は、低粘度、例えば眼窩内注射に適した粘度を有してもよく、且つ比較的高濃度のＰＥＧ化二重特異性アプタマー（例えば約２５ｍｇ／ｍｌ～約６０ｍｇ／ｍｌ）を含み得る。所定の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも約６０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ化二重特異性アプタマー濃度を含み得る。特定の例において、本明細書で提供される液体製剤は、硝子体内投与のために製剤化される場合、約２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい又は約３０ｍｇ／ｍｌよりも大きいＰＥＧ化二重特異性アプタマーのアプタマー濃度を有し得る。他の特定の例において、本明細書で提供される液体製剤は、硝子体内投与のために製剤化される場合、約３５ｍｇ／ｍｌよりも大きいＰＥＧ化二重特異性アプタマーのアプタマー濃度を有し得る。他の特定の例において、本明細書で提供される液体製剤は、硝子体内投与のために製剤化される場合、約４０ｍｇ／ｍｌよりも大きいＰＥＧ化二重特異性アプタマーのアプタマー濃度を有し得る。
所定の実施形態において、本明細書で提供される液体製剤は、プレフィルドシリンジで製剤化され得る。所定の実施形態において、液体製剤は、約１０μＬ、約２０μＬ、約３０μＬ、約４０μＬ、約５０μＬ、約６０μＬ、約７０μＬ、約８０μＬ、約９０μＬ、約１００μＬ、又は約１００μｌよりも大きい容量で製剤化され得る。また、本明細書に記載されるＰＥＧ化二重特異性アプタマーのいずれかを含む組成物を含むプレフィルドシリンジも提供される。
本明細書で用いられる「多分散性指数」は、与えられたポリマーサンプルにおける分子量の分布の指標を意味する。従って、多分散性指数は、サンプル中の均一性のレベルを反映する。溶液の多分散性指数（ＰＤＩ）は、以下の式で算出され得る：ＰＤＩ＝Ｍｗ／Ｍｎ、ここでＭｗは重量平均分子量であり、Ｍｎは数平均分子量である。従って、溶液のＰＤＩが大きいほど、サンプル中の分子量の分布がより広い。所定の実施形態において、本明細書で提供される治療的組成物は、１．０５未満のＰＤＩを有し得る。すなわち、本開示の治療用組成物中に存在するＰＥＧ化二重特異性アプタマーの分子量は、比較的均一であり得る。所定の実施形態において、治療的二重特異性アプタマーのＰＤＩは、約１．０５未満、約１．０４未満、約１．０３未満、約１．０２未満、約１．０１未満、又は約１．００未満であり得る。
本明細書に記載される組成物は、１つ以上の追加の治療剤と共に投与され得る。１つ以上の追加の治療剤は、本明細書に記載されるようなPＥＧｓ意訳にコンジュゲートされてもよく、コンジュゲートされていなくてもよい。１つ以上の追加の治療剤は、本明細書で提供される組成物との組み合わせで相乗的に増強又は作用する。
ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、眼球送達によって対象に投与され得る。一実施形態において、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、眼窩内注射によって投与される。一実施形態において、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、眼窩周囲注射によって投与される。一実施形態におおいて、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、脈絡膜上注射によって投与される。一実施形態において、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、網膜下注射によって投与される。
一実施形態において、二重特異性アプタマー組成物は、プレフィルドシリンジで製剤化され得る。一実施形態において、プレフィルドシリンジは、５０～１００μＬを送達するように設計され得る。一実施形態において、プレフィルドシリンジは、５００μＬの最終総容量を有し得る。一実施形態において、プレフィルドシリンジは、充填前に末端滅菌され得る。一実施形態において、シリンジのバレルは、印刷が無いホウケイ酸ガラスタイプＩである。一実施形態において、針サイズは３１Ｇであり得る。一実施形態において、針サイズは３０Ｇであり得る。一実施形態において、針サイズは２９Ｇであり得る。一実施形態において、針サイズは２８Ｇであり得る。一実施形態において、針サイズは２７Ｇであり得る。一実施形態において、針ゲージは、１２Ｎ未満の注入破断力を生成するのに十分な大きさとなり得る。一実施形態において、針の長さは、約１２～１３ｍｍとなり得る。一実施形態において、プレフィルドシリンジは、注射の際にストッパーの滑らかな滑りを確保するためにシリコン化され得る。
ＶＩＩ．一般的な調製方法
オリゴヌクレオチド合成は、オリゴヌクレオチド鎖の固相化学合成、粗製オリゴヌクレオチドの切断及び脱保護、分取陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製、脱塩に続くＰＥＧ化、未ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの不純物を除去するための分取陰イオン交換クロマトグラフィーによるＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの精製、脱塩のための限外ろ過、最終製品の濃縮及び凍結乾燥を含む多段階のプロセスである。全プロセスは、図３のプロセスフロー図に模式的に示される。
化学合成
ホスホルアミダイト化学によるオリゴヌクレオチドの化学合成は、活性化モノマーを伸長ポリマーに順次カップリングし、その一端を固体支持マトリクスに共有結合させる。固相アプローチは、合成の各ステップにおいて、固相の簡単な溶媒洗浄で反応生成物を容易に精製できる。オリゴヌクレオチドは、支持体結合分子の５’末端を脱保護し、支持体結合分子を、入ってくるテトラゾール活性化ホスホロアミダイトモノマーと反応させ、得られた亜リン酸トリエステルを酸化してリン酸トリエステルとし、次に来るモノマーと連続して結合しないようにアセチル化して（キャッピング）未反応の水酸基をブロックして「欠損配列」とし、３’末端から５’末端に向かう順に組み上げられる。この一連のステップは、全長のオリゴヌクレオチドが合成されるまで、その後のカップリング反応でも繰り返される。３’末端に３’－３’結合、５’末端にＰＥＧ化のためのＣ－６リンカーが存在するため、合成は最初と最後のステップでこれらの変更に対応するように修正される。
切断及び脱保護
合成終了後、固体支持体と関連するオリゴヌクレオチドをフィルター漏斗に移し、真空下で乾燥させ、反応容器に移す。水酸化アルミニウム（２８～３０％）及びメチルアミン（水中で４０％）を１：１溶液として固体支持体に加え（ＡＭＡ）、混合物を約４５～６０℃に約３０分間加熱して固体支持体からの開裂、シアノエチルリン酸保護基の除去、外環アミノ保護基の脱保護、及びリンカーからのトリフルオロアセチル基の除去に影響を与える。サンプルを－２０℃で３０分間冷却し、粗オリゴヌクレオチドを得る。混合物を真空下でろ過し、廃棄固体支持体を除去する。反応を氷酢酸でクエンチし、粗生成物のｐＨ中性の溶液を提供する。
陰イオン交換精製１
粗製オリゴヌクレオチドは、分取陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。精製は、バッファーＢの割合を増大させることにより、バッファーシステム中の臭化ナトリウム濃度を制御しながら、カラムから生成物を溶出させることにより達成される。分画を回収し、ＵＶ及びＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣで分析する。分画は、目的の純度の製品プールを得るために組み合わせられ、限外ろ過によって脱塩され、濃縮される。濃縮された製品は、ラベル付けされ、２～８℃で保存される。
精製されたオリゴヌクレオチド中間体は、ＰＥＧ化工程に進む前に、ＥＳ－ＭＳによるＭＷ、ＵＶによるオリゴヌクレオチド含有量、ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣによる純度分析が行われる。
ＰＥＧ化
上記から精製及び濃縮されたオリゴヌクレオチド中間体を、０．１～０．２Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（～ｐＨ８．８～９．８）、ＤＭＳＯ、アセトニトリル中、２５℃で４０Ｋ ＰＥＧと６０～９０分反応させる。
陰イオン交換精製２
粗生成物を分取陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、ＰＥＧ化されていないオリゴマーの不純物を除去する。精製は、バッファーＢの割合を増大させることにより、バッファーシステム中の臭化ナトリウムを制御しながら、カラムから生成物を溶出させることにより達成される。選択された分画は、目的の純度の生成物プールを得るために組み合わせられる。
脱塩及び濃縮
プールされた分画は限外ろ過により脱塩され、濃縮される。濃縮物にはラベルが貼られ、２～８℃で保存される。
凍結乾燥
ＡＰＩは分注され、凍結乾燥され、オフホワイトからわずかに黄色の乾燥粉末となる。
ＡＰＩの保存
凍結乾燥ＡＰＩは、－１５℃～－２５℃で保存される。
実施例１：ＶＥＧＦ及びＩＬ８を標的とする二重特異性アプタマーの直接化学合成による生成
ＶＥＧＦを標的とするアプタマードメインと、ＩＬ８を標的とするアプタマードメインとは、固相化学合成中に直接に連結され得る（図４～６）。これを達成するために、抗ＶＥＧＦアプタマー（アプタマー２８５（配列番号１）；ＣＸＡＣＺＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＸＵＵＵＣＡＵＡＡＵＣＣＣＧＵＵＵＸＵＣＸ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧであり、Ｘは２’ＯＭｅＧであり、Ｚは３－炭素非ヌクレオチド１，３プロパンジオールスペーサである）は、５つの２’ＯＭｅウリジン残基（ＵＵＵＵＵ；Ｕは２’ＯＭｅＵである）で構成された短いヌクレオチドリンカーの５’末端で連結され、これは抗ＩＬ８アプタマー（アプタマー２６９（配列番号４８）；ＸＸＣＸＡＣＸＸＵＡＸＡＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＡＣＣＸＣＸＣＣ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧであり、Ｘは２’ＯＭｅＧである）の５’末端に連結されている。得られた二重特異性アプタマー配列（ＣＸＡＣＺＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＸＵＵＵＣＡＵＡＡＵＣＣＣＧＵＵＵＸＵＣＸＵＵＵＵＵ ＸＸＣＸＡＣＸＸＵＡＸＡＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＡＣＣＸＣＸＣＣ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧであり、Ｘは２’ＯＭｅＧであり、Ｚは３－炭素非ヌクレオチド１，３プロパンジオールスペーサである）は、３’逆位デオキシチミジンＣＰＧ支持体上の市販の２’－フルオロ－Ｇ及び２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）Ａ／Ｃ／Ｕ／Ｇ修飾ホスホルアミダイトを組み合わせて合成され得る。アプタマーの５’末端は、活性化ＰＥＧ部位とのコンジュゲートを容易にするため、５’Ｃ６網の修飾で修飾される。
合成後、二重特異性アプタマーは、リン酸保護基の除去、塩基保護基の除去、及び支持体からの分子の切断が可能な適切な溶媒及び試薬を用いて脱保護される。例えば二重特異性アプタマーは、アセトニトリル中のジエチルアミンで処置した後、３０％の水酸化アンモニウム水溶液、又は３０％の水酸化アンモニウム水溶液と４０％の水酸化メチルアンモニウムの５０／５０混合物で処理され得る。脱保護された二重特異性アプタマーは、脱塩され、追加の精製無しに直接にＰＥＧコンジュゲートに用いられる。
４０ｋＤａの分枝ＰＥＧへのコンジュゲートは、５’アミンで修飾された二重特異性アプタマーを、ｐＨ８．５で０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファーに含まれた１．５～５倍モル量のＮＨＳ活性化ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＬ２－４００ＧＳ２を用いてインキュベートすることにより達成される。インキュベートの後（通常２～２０時間）、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、陰イオン交換クロマトグラフィー又はイオン対逆相クロマトグラフィーで精製する。ＰＥＧ化された二重特異性アプタマーは、その後、脱塩された後に用いられる。
いくつかの例において、脱保護された二重特異性アプタマーは、ＰＥＧコンジュゲーションの前に陰イオン交換クロマトグラフィー又はイオン対逆相クロマトグラフィーにより精製される。精製後、二重特異性アプタマーを水中で脱塩し、１．５～５倍モル量のＮＨＳ活性化ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＬ２－４００ＧＳ２と組み合わせられる。インキュベートの後（通常２～２０時間）、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーは、陰イオン交換クロマトグラフィー又はイオン対逆相クロマトグラフィーで精製する。ＰＥＧ化された二重特異性アプタマーは、その後、脱塩された後に用いられる。
このアプローチの多くのバリエーションが、同一又は類似の最終製品を得るために用いられ得る。例えば、アプタマーの向きを逆にすることができる。すなわち、二重特異性アプタマーは、５’抗ＶＥＧＦドメインと３’抗ＩＬ８ドメイン、又は５’抗ＩＬ８ドメインと３’抗ＶＥＧＦドメインを有するように構築され得る。同様に、ヌクレオチドリンカーの長さ又はリンカーの配列も変更でき、アプタマードメイン間の距離及び／又は形状に変化を与えることができる。
このアプローチを用いて生成された二重特異性アプタマーは、非ヌクレオチジルリンカーで連結され得る。多くの非ヌクレオチジルリンカーが、ホスホルアミダイトとして市販されている。他の類似のリンカーは、標準的な化学的アプローチを用いて容易に合成され得る。ヌクレオチジルリンカーは１，３－プロパンジオール等の３炭素非ヌクレオチジルスペーサ、１，６－ヘキサンジオール等の６炭素非ヌクレオチジルスペーサ、トリエチレングリコール等の９原子スペーサー、又はヘキサエチレングリコール等の１８原子スペーサーであり得る。
このアプローチは、特に表２７にあるようなアプタマーの組み合わせに適用され得る。
Figure 2023521146000053
Figure 2023521146000054
実施例２：アプタマー２８５ｅｘ及びアプタマー２６９ｅｘを用いた二重特異性アプタマー組成物の合成
このアプローチを用いて、逆位Ｔを含む抗ＶＥＧＦアプタマー２８５の伸長版であるアプタマー２８５ｅｘ（配列番号６７）と逆位Ｔを含む抗ＩＬ８アプタマー２６９（配列番号５６）とを結合したものを用いて二重特異性アプタマーを合成した。二重特異性アプタマーは、３炭素非ヌクレオチジル１，３－プロパンジオールスペーサー（Ｚ）を含む非ヌクレオチドリンカー（配列番号６９及び３９８）、ヘキサエチレングリコールスペーサー（Ｓ１８）を含む非ヌクレオチドリンカー（配列番号７０及び３９９）、又は５つの２’ＯＭｅデオキシウリジン残基（５Ｕ）を含むヌクレオチドリンカー（配列番号７１）を用いて生成した。アプタマードメインの順序を変更させた；アプタマー２６９の５’側に連結したアプタマー２８５を有するコンストラクト、及びアプタマー２６９の３’側に連結したアプタマー２８５を有するコンストラクトを作製した。全ての場合において、アプタマーは、５’と３’逆位デオキシチミジンを有するように生成された（表２８）。
Figure 2023521146000055
実施例３：ＶＥＧＦ及びＩＬ８を標的とする二重特異性アプタマーの酵素合成による生成
ＶＥＧＦ及びＩＬ８の両方を標的とする二重特異性アプタマーは、ＶＥＧＦを標的とするアプタマードメインとＩＬ８を標的とするアプタマードメインとを連結することにより、酵素的に生成され得る。これを達成するために、抗ＶＥＧＦアプタマー（アプタマー２６（配列番号２）；ＡＧＧＣＣＧＣＣＵＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＵＣＡＵＵＡＵＣＣＣＧＵＵＵＧＧＣＧＧＣＵＵ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧである）は５つの２’ＯＭｅウリジン残基（ＵＵＵＵＵ；Ｕは２’ＯＭｅＵである）で構成された短いヌクレオチドリンカーの５’末端に連結され、これは、順に抗ＩＬ８アプタマー（アプタマー２６９（配列番号４８）；ＧＧＣＧＡＣＧＧＵＡＧＡＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＡＣＣＧＣＧＣＣ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧである）の５’末端に連結される。得られた二重特異性アプタマー配列であるＡＧＧＣＣＧＣＣＵＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＵＣＡＵＵＡＵＣＣＣＧＵＵＵＧＧＣＧＧＣＵＵ ＵＵＵＵＵＧＧＣＧＡＣＧＧＵＡＧＡＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＡＣＣＧＣＧＣＣ（Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧである）は、ｄｓＤＮＡファージポリメラーゼプロモーターの３’末端に直ちに結合した二本鎖ＤＮＡ中にコードされ得る。そのようなテンプレートは、適切なプライマーを用いて１本鎖ＤＮＡテンプレートからＰＣＲによって生成され得る。そして、二本鎖ＤＮＡテンプレートは、適切な変異ファージポリメラーゼ及びヌクレオチド混合物（例えば２’ＦＧＴＰ、２’ＦＯＭｅＡＴＰ、２’ＯＭｅＣＴＰ、２’ＯＭｅＵＴＰ）を用いて修飾ＲＮＡに転写し、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ又は他の適する方法により精製され得る。
このアプローチに対する多くのバリエーションは、同一又は類似の最終製品を得るために用いられ得る。当業者であれば、ドメインの方向は固定されておらず、二重特異性アプタマーは、５’抗ＶＥＧＦドメインと３’抗ＩＬ８ドメイン、又は５’抗ＩＬ８ドメインと３’抗ＶＥＧＦドメインを有するように構築され得ることを認識するであろう。同様に、ヌクレオチドリンカーの長さ又はリンカーの配列を変更でき、アプタマードメイン間の距離及び／又は形状に変化を与えることができる。このアプローチは、特に表２７にあるアプタマーの組み合わせに適用され得る。
実施例４：ＶＥＧＦ及びＩＬ８を標的とする二重特異性アプタマーの化学合成及びドメイン化学的コンジュゲートによる生成
ＶＥＧＦを標的とするアプタマードメイン及びＩＬ８を標的とするアプタマードメインは、固相化学合成を用いて別々に合成し、脱保護及び／又は精製後に化学的に結合され得る（図７）。
これを達成するために、抗ＶＥＧＦアプタマー（アプタマー２８５（配列番号１）；ＣＸＡＣＺＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＸＵＵＵＣＡＵＡＡＵＣＣＣＧＵＵＵＸＵＣＸ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧ、Ｚは３炭素非ヌクレオチジルスペーサの１，３－プロパンジオールである）は、コンジュゲーションを容易にするために５’Ｃ６アミノ修飾を有する３’逆位デオキシチミジンＣＰＧ支持体上の市販の２’－フルオロ－Ｇ及び２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）Ａ／Ｃ／Ｕ／Ｇ修飾ホスホルアミダイトの組み合わせを用いて合成される。同様に、抗ＩＬ８アプタマー（アプタマー２６９（配列番号４８）；ＸＸＣＸＡＣＸＸＵＡＸＡＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＡＣＣＸＣＸＣＣ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧである）は、３’アミンＣ７ＣＰＧ支持体上で市販の２’－フルオロ－Ｇ及び２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）Ａ／Ｃ／Ｕ／Ｇ修飾ホスホルアミダイトを組み合わせて合成される。アプタマーの５’末端は、活性化ＰＥＧ部位とのコンジュゲーションを容易にするために、５’Ｃ６ＳＳチオールで修飾される。
合成後、それぞれのアプタマーは、リン酸保護基の除去、塩基保護基の除去、及び支持体からの分枝の切断が可能な適切な溶媒及び試薬を用いて脱保護される。例えば、アプタマーをアセトニトリル中のジエチルアミンで処理した後、３０％水酸化アンモニウム水溶液、又は３０％水酸化アンモニウム水溶液と４０％水酸化メチルアンモニウムとの５０／５０混合物で処理され得る。脱保護されたアプタマーは、その後の使用に先立ち脱塩される。
アプタマードメインを結合させるために、５’プライムアミンを有する抗ＶＥＧＦアプタマーは、まず１．５～５倍モル量のヘテロ二官能性ＰＥＧリンカー、ＳＭ（ＰＥＧ）２４を含むｐＨ８．５の０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファーでインキュベートされる。インキュベーション後、通常２～２０時間の後、得られたマレイミド活性化アプタマーコンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー又はイオン対逆相クロマトグラフィーで精製する。
その後、５’Ｃ６ＳＳチオール修飾を有する抗ＩＬ８アプタマーを１００ｍＭのＴＣＥＰを含む０．１ＭのＴＥＡＡで処理し、７０℃で５分間加熱して還元する。還元されたアプタマーを脱塩し、遊離チオールと還元剤を除去し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中でマレイミド活性化抗ＶＥＧＦアプタマーコンジュゲートと１：１でインキュベートする。インキュベーション後、通常は２～２０時間後に、得られたアプタマーコンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー又はイオン対逆相クロマトグラフィーで精製する。
最後に、二重特異性アプタマーの３’末端のＰＥＧ化は、二重特異性アプタマーコンジュゲートと、１．５～５倍モル量のＮＨＳ活性化ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＬ２－４００ＧＳ２をｐＨ８．５の０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファー中で結合することにより達成される。インキュベーション後、通常は２～２０時間後に、得られたアプタマーコンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー又はイオン対逆相クロマトグラフィーで精製する。ＰＥＧ化された二重特異性アプタマーは、その後、脱塩された後に用いられる。
このアプローチの多くのバリエーションは、同一又は類似の最終製品を得るために用いられ得る。そのようなアプローチは、本技術分野で周知の種々の緩衝液、溶液又は試薬の使用で行われ得る。さらに、コンジュゲーションの順序、及び／又は精製の必要性若しくは方法は、種々の代替案で変化及び／又は置換され得る。同様に、アプタマー（５’及び３’）の方向、並びに本明細書で記載したコンジュゲーションに採用した化学基（５’及び３’）の同一性及び位置（アミン及びチオール）は、同様の最終製品を得るために任意の数の異なるリンカー化学（アミン、チオール、アルキン、アジド等）に対して変更又は置換され得る。このアプローチは、特に表２７にあるアプタマーの組み合わせに適用され得る。
実施例５：ドメインハイブリダイゼーションによるＶＥＧＦ及びＩＬ８を標的とする二重特異性アプタマー
ＶＥＧＦを標的とするアプタマードメイン及びＩＬ８アプタマードメインは、別々に固相化学合成を用いて合成でき、その後、ハイブリダイゼーションにより連結した脱保護及び／又は精製を行う（図８～図９）。
抗ＶＥＧＦアプタマー（アプタマー２８５（配列番号１）；ＣＸＡＣＺＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＸＵＵＵＣＡＵＡＡＵＣＣＣＧＵＵＵＸＵＣＸ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧであり、Ｚは３炭素非ヌクレオチジルスペーサの１，３－プロパンジオールである）は、短いハイブリダイゼーションドメイン、Ｓ１８－ＣＵＣＵＣＵＸＡ（Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧであり、Ｓ１８はヘキサエチレングリコール非ヌクレオチジルスペーサである）の５’末端に連結されて、最終配列、ＣＸＡＣＺＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＸＵＵＵＣＡＵＡＡＵＣＣＣＧＵＵＵＸＵＣＸ－Ｓ１８－ＣＵＣＵＣＵＸＡ（Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧであり、Ｚは３炭素非ヌクレオチジルスペーサの１，３－プロパンジオールであり、Ｓ１８はヘキサエチレングリコール非ヌクレオチジルスペーサである）を得る。
抗ＩＬ８アプタマー（アプタマー２６９（配列番号４８）；ＸＸＣＸＡＣＸＸＵＡＸＡＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＡＣＣＸＣＸＣＣ、Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧである）は、短い相補的なハイブリダイゼーションドメイン、Ｓ１８－ＵＣＡＸＡＸＡＸ（Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｘは２’ＯＭｅＧであり、Ｓ１８はヘキサエチレングリコール非ヌクレオチジルスペーサである）に同様に連結されて、最終配列、ＸＸＣＸＡＣＸＸＵＡＸＡＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＡＣＣＸＣＸＣＣ－Ｓ１８－ＵＣＡＸＡＸＡＸ（Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧ、Ｘは２’ＯＭｅＧであり、Ｓ１８はヘキサエチレングリコール非ヌクレオチジルスペーサである）を得る。
化学合成は、３’逆位デオキシチミジンＣＰＧ支持体上で、市販の２’－フルオロ－Ｇ及び２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）Ａ／Ｃ／Ｕ／Ｇ修飾ホスホルアミダイト及びヘキサエチレングリコールホスホルアミダイトを組み合わせて用いて行われる。抗ＩＬ８アプタマーコンストラクトの５’末端には、ＰＥＧコンジュゲーションを促進するために５’Ｃ６アミノモディファイアが付加される。
合成後、個々のアプタマーは、リン酸保護基の除去、塩基保護基の除去、及び支持体からの分枝の切断が可能な適切な溶媒及び試薬を用いて脱保護される。例えば、アプタマーをアセトニトリル中のジエチルアミンで処理した後、３０％水酸化アンモニウム水溶液、又は３０％水酸化アンモニウム水溶液と４０％水酸化メチルアンモニウムの５０／５０混合物で処理され得る。脱保護されたアプタマーは、その後に精製される。
アプタマードメインを連結するために、抗ＶＥＧＦ及び抗ＩＬ８分子のハイブリダイゼーションテールをＰＢＳ中で１：１の割合でインキュベートし、その後に７０℃まで５分間加熱し、室温まで冷却させる。このアニーリングステップの後、二重特異性アプタマーを０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５にバッファー交換し、１．５～５倍モル量のＮＨＳ活性化ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＬ２－４００ＧＳ２とインキュベートする。インキュベーション後、通常２～２０時間後、ＰＥＧ化二重特異性アプタマーを陰イオン交換クロマトグラフィー又はイオン対逆相クロマトグラフィーで精製する。ＰＥＧ化された二重特異性アプタマーは、その後、脱塩された後に用いられる。
このアプローチの多くのバリエーションは、同一又は類似の最終製品を得るために用いられ得る。そのようなアプローチでは、本技術分野で周知の異なる緩衝剤、溶液又は試薬を用いられ得る。さらに、ハイブリダイゼーション、ＰＥＧコンジュゲーションの順序、及び／又は精製の必要性若しくは方法は、種々の代替案で変更及び置換可能である。同様に、アプタマーの方向、及び本明細書で記載されたコンジュゲーションに採用した化学基（アミン及びチオール）の同一性は、同様の最終製品を得るために、任意の数の異なるリンカー化学物質（アミン、チオール、アルキン、アジド等）に置換可能である。さらに、アプタマー及びハイブリダイゼーションドメインを分離するリンカーの長さ及び同一性は、変更され得る。例えば、ヘキサエチレングリコール非ヌクレオチジルスペーサであるＳ１８は、より短い１，３－プロパンジオール非ヌクレオチジルスペーサと置換可能である。また、スペーサをヌクレオチドで構成し、例えば２’ＯＭｅウリジン残基の列（例えばＵＵＵＵＵ；Ｕは２’ＯＭｅ）を挿入し、ヌクレオチドの数を変えることによってアプタマードメインの距離を変化させることを可能にし得る。
ヌクレオチドで構成されたリンカーの使用は、選択されたアプタマードメインが他の非ヌクレオチドリンカーを含まず、インビトロ転写に逆らわないヌクレオチドを含むことを条件に、酵素合成により個々のアプタマードメインを生成することを可能にし得る。例えば、抗ＶＥＧＦアプタマーであるアプタマー２６（配列番号２）、（ＡＧＧＣＣＧＣＣＵＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＵＣＡＵＵＡＵＣＣＣＧＵＵＵＧＧＣＧＧＣＵＵ）は、短い相補的ハイブリダイゼーションドメイン、ＵＵＵＵＵＵＣＡＧＡＧＡＧ（Ａ、Ｃ及びＵは２’ＯＭｅであり、Ｇは２’ＦＧであり、リンカードメインに下線が引かれている）の５’末端に連結されて、最終配列（ＡＧＧＣＣＧＣＣＵＣＣＧＣＧＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＵＣＡＵＵＡＵＣＣＣＧＵＵＵＧＧＣＧＧＣＵＵＵＵＵＵＵＵＣＡＧＡＧＡＧ）が得られ得る。続いて、この配列をｄｓＤＮＡファージポリメラーゼプロモーターの３’末端に直ぐ隣接する２本鎖ＤＮＡにコードし、適切な変異ファージポリメラーゼとヌクレオチド混合物（例えば、２’ＦＧＴＰ、２’ＯＭｅＡＴＰ、２’ＯＭｅＣＴＰ、２’ＯＭｅＵＴＰ）を用いて修飾ＲＮＡに転写できる。精製後、修飾アプタマーは、適切な相補的ハイブリダイゼーションドメインを有する第２アプタマードメイン（化学的又は酵素的合成のいずれかによって生成）とハイブリダイゼーションすることによって結合され得る。このアプローチは、特に表２７のアプタマーの組み合わせに適用され得る。
実施例６：競合ＴＲ－ＦＲＥＴによる見かけの結合定数の決定
このアッセイは、二重特異性組成物のＩＬ８成分のＩＬ８結合親和性と、結合定数が既知の単特異性ＩＬ８アプタマーの結合親和性を比較するために用いられる。このアッセイでは、標識タンパク質（市販のＨｉｓタグＩＬ８）、及びこのタンパク質標的に結合してＴＲ―ＦＲＥＴシグナルを発生することが知られている標識対照化合物（抗ＩＬ８アプタマー）を用いる。標識された対照化合物は、結合において競合する高濃度の非標識の試験用二重特異性化合物と混合され得る。ＩＣ５０を決定するために、５～７濃度の範囲でアッセイを行う。つまり、５ｎＭのＨｉｓタグＩＬ８を２．５ｎＭの抗Ｈｉｓ－Ｅｕコンジュゲートと混合し、１５分間インキュベートする。単特異的な抗ＩＬ８アプタマーが合成され、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ６４７で標識する。標識された３０ｎＭの単特異的アプタマーと二重特異性化合物を０～３μＭで混合した混合物を加え、２時間インキュベートした後、Ｂｉｏｔｅｋ ＣＹＴＡＴＩＯＮ５プレートリーダーでプレートを読み取る。サンプルは、３３０ｎｍで励起され、蛍光値は６６５ｎｍで収集される。インキュベーション後、二重特異性アプタマーの濃度増加により観察される蛍光シグナルの損失は、各二重特異性コンストラクトのＩＣ５０値を決定し、非標識の単特異的抗ＩＬ８アプタマーを用いた対照滴定と比較するために用いられる。
同様のアッセイフォーマットは、二重特異性組成物のＶＥＧＦ成分のＶＥＧＦ結合親和性を、結合定数が既知の単特異的ＶＥＧＦアプタマーの結合親和性と比較するのに用いられ得る。
このアッセイでは、糖鎖ビオチン化ＶＥＧＦ１６５（ＶＥＧＦ１６５、過ヨウ素酸ナトリウムで緩やかに参加した後にアミノオキシビオチンを用いてビオチン化される）と、このタンパク質標的と結合することが知られている標識対照化合物（抗ＶＥＧＦアプタマー）を用いて、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを発生される。標識された対照化合物は、結合において競合する高濃度の非標識の試験用二重特異性化合物と混合され得る。ＩＣ５０を決定するために、５～７濃度の範囲でアッセイを行う。つまり、１ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦ１６５を０．５ｎＭのストレプトアビジン－Ｅｕコンジュゲートと混合し、１５分間インキュベートする。単特異的な抗ＶＥＧＦアプタマーが合成され、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ６４７で標識する。５ｎＭのアプタマーと二重特異性化合物を０～１μＭで混合した混合物を加え、２時間インキュベートする。Ｂｉｏｔｅｋ ＣＹＴＡＴＩＯＮ５プレートリーダーでプレートを読み取る。サンプルは、３３０ｎｍで励起され、蛍光値は６６５ｎｍで収集される。インキュベーション後、二重特異性アプタマーの濃度増加により観察される蛍光シグナルの損失は、各二重特異性コンストラクトのＩＣ５０値を決定し、非標識の単特異的抗ＶＥＧＦアプタマーを用いた対照滴定と比較するために用いられる。
実施例７：競合ＥＬＩＳＡによる抗ＶＥＧＦ活性の決定
このアッセイは、二重特異性アプタマーコンストラクトの抗ＶＥＧＦ部分の阻害活性を評価するのに用いられる。それらは、既知の活性を有する単特異的抗ＶＥＧＦアプタマーの阻害特性と比較される。このアッセイは、ＶＥＧＦ－Ａ：ＫＤＲ相互作用に干渉する能力を直接に見るためにＥＬＩＳＡを用いる。
簡単に説明すると、１０ｎＭのＫＤＲ－Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＰＢＳは９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｂ）中において４℃で一晩中インキュベートし固定化される。固定化後、溶液を除去し、プレートを２００μｌのブロッキングバッファー（２０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳＴバッファー）で、室温で２時間ブロッキングし、その後、プレートを２００μｌのＰＢＳＴで３度洗浄する。３００ｐＭの糖鎖ビオチン化ＶＥＧＦ１６５と０～５０ｎＭの濃度の試験化合物をプレインキュベートした混合物を各ウェルに添加する。さらに２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中で５０μｌの１：５０００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と共に室温で１時間インキュベートする。プレートに結合されたビオチン化ＶＥＧＦ１６５の量、従って阻害の程度は、１００μｌのＴＭＢｕｌｔｒａに続いて１００μｌの２Ｎ硫酸を用いて決定し、各コンストラクトの阻害割合を以下の式で算出した：
阻害率（％）＝１－（サンプル－低コントロール）／（高コントロール－低コントロール）×１００
値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ７．０において４パラメータ非線形フィットを用いて適合される。
実施例８：ＫＤＲリン酸化ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）によるＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達の阻害の特性評価
ＶＥＧＦ－Ａの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が受容体ＫＤＲに結合すると、受容体は二量体化し、トランス自己リン酸化が起こり、ＶＥＧＦ－Ａシグナルが活性化される。二重特異性アプタマーが細胞上のＶＥＧＦ－Ａ活性を阻害できるか否かを決定するために、二重特異性アプタマーをＶＥＧＦ－Ａ１６５又はＶＥＧＦ－Ａ１２１のいずれかによって誘導されるＫＤＲリン酸化を阻害する能力について試験し、活性が知られている単特的抗ＶＥＧＦ又は抗ＶＥＧＦ抗体の活性と比較され得る。
簡単に説明すると、ＫＤＲを安定的に過剰発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞を、コラーゲンコーティングされた９６ウェルプレート上に５０ｋ細胞／ウェルで一晩中置いた。ＳＢ１＋（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中のアプタマーを３分間９０℃に加熱し、最低１０分間室温で冷却させる。ＶＥＧＦ－Ａ１２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＶＥＧＦ－Ａ１６５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＤＭＥＭ＋０．８％ＦＢＳで１２．５ｎＭに調製され、反応のための２０倍ストックとする。１５μｌのＶＥＧＦ－Ａがポリプロピレンプレート中の１５μｌの滴定アプタマーに加えられ、ＴＳバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２）で３００μｌに希釈した。アプタマー／ＶＥＧＦ－Ａ混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、１００μｌを３７℃、５％ＣＯ２で５分間細胞に添加する。処理物を細胞から吸引し、１００μｌの冷溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．５ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（新たに調製）、１ｍＭのＰＭＳＦ（新たに調製）、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（新たに調製））で、１０分間氷上で溶解させる。プレートを４０００×ｇで１０分間遠心し、分析のために細胞溶解物をＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイプレートに移す。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイを行うために、１０μｌの細胞溶解物を白色の少量３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に移す。１．２５ｎＭの抗ｈＶＥＧＦＲ２ポリクローナルヤギＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μｇ／ｍｌのＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）抗ヤギＩｇＧアクセプタービーズ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、１．２５ｎＭのＰ－チロシンビオチン化マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び１０μｇ／ｍｌのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンドナービーズ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）をこの順に混合し、混合物を作製する。１０μｌのこの試薬混合物を、１０μｌの細胞溶解物を含むアッセイプレートに加える。アッセイプレートは密閉し、暗所で約２時間インキュベートした後、Ｂｉｏｔｅｋ ＣｙＴＡＴＩＯＮ５プレートリーダーでＡｌｐｈａ３８４ウェルｏｐｔｉｃａｌ ｃｕｂｅを用いて読み取る。阻害率は、各値からＴＳバッファーのバックグラウンドを差し引き、ＶＥＧＦ－Ａのみの対照で正規化することにより算出される。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ７．０の４パラメータ非線形フィットを用いて適合され得る。
実施例９：ＩＬ８を介する好中球の遊走の阻害
このアッセイは、ＩＬ８とその受容体であるＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２との相互作用を阻害し、ＩＬ８によって誘導される好中球の動員を阻害する二重特異性アプタマーの抗ＩＬ８部分の能力を評価するために用いられる。このアッセイは、好中球を上のチャンバに入れ、ＩＬ８と濃度が増加する二重特異性アプタマーを下のチャンバに加えるボイデンチャンバを用いて行う。比較対象として活性が既知の単特異的抗ＩＬ８アプタマーが用いられる。
簡単に説明すると、新鮮なヒト全血からＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ Ｓｈｉｅｌｄ）を用いて分離された初代ヒト好中球を、アッセイバッファー（ＲＰＭＩ＋０．１％ヒト血清アルブミン）に１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。５μｍのトランスウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、プレートには２００μｌのアッセイバッファー、トランスウェルの上のチャンバには１００μｌのアッセイバッファーで、３７℃で活性化される。３ｎＭのＩＬ８と濃度が増加する二重特異性アプタマー（０～１μＭ）又は対照の単特異的アプタマーを１時間インキュベートし、このアプタマー／ＩＬ８ミックスを各ウェルに２００μｌ添加する。１００μｌのアッセイバッファー中の好中球をトランスウェルの上のチャンバに添加する。３７℃で４５分後、各ウェルから１００μｌを、５０μｌの溶解バッファーが入った白色９６ウェルプレートに移す。ＡＴＰＬＩＴＥ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、上のチャンバから下のウェルへ移動した細胞数を定量する。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ７．０を用いたデータのベストフィットにより決定され得る。
実施例１０：内皮の透過性の阻害
このアッセイは、内皮細胞の透過性に対するＶＥＧＦ及びＩＬ８の効果を阻害する二重特異性アプタマーの能力を評価するものである。このアッセイは、細胞（ＨＵＶＥＣ又はＲＭＥＣ）を上のチャンバに入れ、制限された色素漏れ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）漏れ又は経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）により決定して、コンフルエントの単層を形成させるボイデンチャンバを用いて行われる。トランスウェルにＶＥＧＦ、ＩＬ８又はこれらのタンパク質の混合物を添加する。これらのタンパク質は、内皮の透過性を増大し、挿入物に加えられ得るＨＲＰの拡散により測定され得る。この実験モデルは、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｖｏｌｕｍｅ ２５， Ｉｓｓｕｅ ３， Ｍａｒｃｈ ２０１０， Ｐａｇｅｓ ７５７-７６７に記載されている。
ＶＥＧＦ及びＩＬ８を用いた最初の滴定試験を行い、１時間のインキュベーション後に細胞層全体へのＨＲＰの漏出によって決定される透過性を誘発するために必要な最小限のタンパク質濃度を特定する。その後、これらのコントロール滴定から特定された濃度を用いて、このシステムで試験化合物の阻害効果を評価することができる。単特異的抗ＩＬ８アプタマー、又は活性が既知の抗ＶＥＧＦアプタマーが比較対象として用いられる。
簡単に説明すると、１時間のインキュベーション後に透過性を誘導するのに十分な濃度のＩＬ８とＶＥＧＦとの混合物を、０から１μＭの範囲で５から８の濃度の二重特異性アプタマー、単特異的抗ＩＬ８アプタマー、又は抗ＶＥＧＦアプタマーとインキュベートする。この混合物を３７℃で１時間プレインキュベーションした後、コンフルエントな単層細胞にＨＲＰ（タイプＩＶ－Ａ、４４ｋＤａ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に０．１２６μＭの濃度で添加する。さらに、１時間インキュベートした後、下のウェルの培地を回収し、光度グアイアコール基質アッセイ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてＨＲＰ酵素活性についてアッセイする。検出反応を室温で１５分間進行させ、４５０ｎｍで吸光度を測定する。
実施例１１：慢性網膜新生血管のウサギモデルにおける二重特異性組成物
ここでは、持続的な網膜新生血管形成（ＲＮＶ）、及び漏出のモデルである、ウサギのＤＬ－ａ－アミノアジピン酸（ＡＡＡ）モデルについて詳細に説明する。これは、化合物が病的な漏出を阻害する能力を測定するモデルである。簡単に説明すると、ウサギにＡＡＡを単回ＩＶＴ注射し、毎週、眼底写真、蛍光血管造影（ＦＡ）及び光干渉断層計（ＯＣＴ）を用いて追跡調査を行う。１０週間後、それらに二重特異性組成物又はコントロールの注射を１回行う。ＲＮＶ漏出は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いた画像解析によりＦＡから定量される。いくつかの眼は、組織学的分析のために採取される。
このモデルは、その安定性及び持続性においてヒトの慢性疾患を模倣しており、二重特異性組成物の抗漏出作用は、用量依存的な持続時間で完全に可逆的なはずである。従って、この大型眼球モデルは、網膜血管疾患に対する新規製剤及び薬物療法の有効性及び持続時間の調査、並びに網膜血管新生の基礎的な病理生理学の研究に、極めて適している。このモデルには、平均週齢８～１０週、体重２～２．５ｋｇの雄のニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷ）が用いられる。全ての動物実験は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠する。
ＡＡＡ溶液は、１２０ｍｇのＡＡＡを１ｍｌの塩酸（１Ｎ）に溶解して調製される。ＡＡＡ原液を０．９％の滅菌生理食塩水で８０ｍＭに希釈し、溶液のｐＨを７．４に調整した。最終溶液は、孔径０．２２μｍの使い捨てＭｉｌｌｅｘ－ＧＰシリンジフィルタユニットに通し、潜在的な微粒子を除去する。溶液は、使用直前に調製し、注射時まで室温で保存すべきである。
ＲＮＶを導入する前に生存中の最初のベースラインの眼科評価を行う。ウサギは、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）で麻酔される。心拍数、呼吸数、粘膜の色、体温及びパルスオキシメトリーは、各動物で麻酔の全期間、１５分毎にモニターされる。角膜は、塩酸プロパラカインの０．５％点眼液でさらに麻酔する。瞳孔は、トロピカミドの１％点眼液で拡張される。角膜の水分補給を助けるために、ＧｅｎＴｅａｌ潤滑アイジェルをさらに１滴点眼する。その後、子供の開瞼器で瞼を開き、眼内撮影を行う。
眼科評価では、キヤノンのＰｏｗｅｒＳｈｏｔデジタルカメラを用いて眼球写真を撮影して、肉眼的炎症を評価し、Ｔｏｎｏ－Ｐｅｎによる眼圧測定（ＩＯＰ）を行った後、瞳孔を拡張する。瞳孔拡張の約５分後、ＷｅｌｃｈＡｌｌｙｎ ＰａｎＯｐｔｉｃ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｅを用いた眼底検査、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ＨＲＡ＋ＯＣＴシステムを用いたレッドフリー撮影、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓイメージングシステムを用いた早期（０～３分）及び後期（１０～１３分）のフルオレセイン眼底造影（ＦＡ）、並びにＳｐｅｃｔｒａｌｉｓシステムによる複数の６１スキャンＰ極光干渉断層造影（ＯＣＴ）を各眼に対して行われる。
生存中のベースラインの眼科評価後、雄のＮＺＷウサギに８０ｍＭのＡＡＡ溶液（上述）を８０μｌのＩＶＴ注射を行い、注射部位は右眼（ＯＤ）が１０時の部位、左眼（ＯＳ）が２時の部位とする。１０分後、２回目の眼圧測定を行い、注入量による急性の圧力変化を評価する。さらに、注入時の潜在的な損傷を確認するために、検眼鏡による観察を行う。観察後すぐに、０．５％エリスロマイシン眼軟膏を適用する。
動物は、ＡＡＡ注入後０週から６５週の間に、ベースライン時と同様の追跡検査を受け、病気の進行を評価するために用いられる。処置に関連した又は深刻な網膜障害による重度の網膜剥離がある眼、血管漏れがない眼（１０％～２０％）は、試験から除外される。
処置前のベースラインにおける疾患進行を定量化するために、ＮＺＷウサギは、ＤＬ－ＡＡＡの後、２８日目及び３２日目に、１０ｍｃｇ／５０ｍｃｌのＢｒｄＵを２回ＩＶＴ注射される。１０週目に、ウサギを安楽死させ、１％パラホルムアルデヒドで希釈したフルオレセインＣｏｎＡで灌流し、眼杯を１％ＰＦＡで４８℃にてさらに一晩固定する。固定後、網膜を剥離し、透過処理し、０．５％のＢＳＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中で３７℃にて一晩ブロッキングする。翌日、網膜をＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳで洗浄し、２ＮのＨＣｌで、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで再度洗浄し、マウス抗ＢｒｄＵを用いて３７℃で一晩インキュベートする。一次抗体とのインキュベート後、網膜を再度洗浄し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７と３７℃で３時間インキュベートし、ＰｒｏＬｏｎｇ褪色防止剤でマウントする。
投与群及び対照群について、ＡＡＡ投与後１０週目に網膜新生血管の漏出が安定した時点で、上述の検査と同様に治療時の眼科検査を行う。ウサギは処置群及び対照群に分けられ、麻酔された動物は検査後直ちにＩＶＴ処置の準備がなされる。二重特異性組成物の静脈内投与（ＩＶＴ）が所定の用量の範囲でなされる。対照群には、緩衝液又はヒトＦｃが投与される。全てのＩＶＴ注射は、二重特異性組成物の投与量に関係なく、５０μｌの量である。処置注射の１０分後に２回目の眼圧測定を行う。２回目の眼圧測定（ＩＯＰ）直後に０．５％エリスロマイシン眼軟膏を適用する。別のコホートにおいて、ＡＡＡ導入後１０週目に二重特異性組成物のＩＶＴ投与を繰り返し、病理学的漏出が完全に再発した後に、後続の投与が行われ得る。
二重特異性組成物の注射後１週目から２０週目まで、さらなる眼科のフォローアップ検査が行われる。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇソフトウェアからレッドフリー画像及び初期段階のＦＡ画像をエクスポートし、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＣにインポートする。片眼ごとに複数の画像を重ね合わせ、眼底のモザイクに合成する。ＦＡ画像では、硝子体中のフルオレセインクラウドの上を絵筆ツールでなぞり、覆われた画素数を算出することにより漏出面積を定量化する。漏出面積は、視神経乳頭の面積を用いて毎週標準化される。データは、二重特異性組成物による処置前のベースライン漏出面積と比較した場合の漏出面積の割合として記録される。各時点で、漏出面積の割合は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による１因子ＡＮＯＶＡを用いて処置間で比較される。全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて行われる。データは、特に断らない限り、平均値＋／－ＳＥＭとして示される。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であるとみなされる。
正常眼球とＤＬ－ＡＡＡ処置眼球から硝子体を分離し、１００００ｇで１０分間遠心分離を行う。上相を採取し、分注し、ＶＥＧＦレベルが評価されるまで－８０℃で保存する。ＶＥＧＦレベルは、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ社のＭｉｌｌｉｐｌｅｘアッセイを用いて製造者の説明書に従って測定される。
眼球は核出され、１０％ホルマリン又はＤａｖｉｄｓｏｎの固定液に４８時間浸漬される。固定後、右眼を切り離し、パラフィン包埋を行うまで７０％エタノール中に置く。各眼の連続切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色する。免疫染色のために処理された左眼はＯＣＴ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋに包埋して切片を作製し、－８０℃で保存する。ＯＣＴをＰＢＳで洗浄する前に、眼球は５０℃～６０℃のオーブンに１５分間入れておく。ＯＣＴの除去後、組織を０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１５分間透過処理し、１％のＢＳＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ及び５％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳで１時間ブロッキングを行う。マウス抗Ｂ－チューブリンＡｌｅｘａ４８８をブロッキングバッファーに１：２００で添加し、切片を４８℃で一晩インキュベートする。翌日、切片をＰＢＳで洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色剤でマウントする。画像は、Ｎｉｋｏｎ ８０ｉ Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡で得る。
実施例１２：ブタのレーザＣＮＶモデルを用いた二重特異性組成物の有効性評価
ブタは、ヒトと目の大きさ及び網膜の構造が類似するため、後眼部増殖性疾患における試験薬の有効性を評価するためのモデル動物として好まれている。ウサギは多くの眼科研究で一般的に用いられているが、その網膜構造はヒトとは大きく異なるため、ブタを用いることは優れた代替手段となる。そこで、ブタを用いたレーザＣＮＶモデルで有効性を評価する。
より詳細には、０日目に、レーザ処置の少なくとも１５分前に局所散瞳剤（１．０％トロピカミドＨＣｌ）を各動物に適用する。ブタには、０．０１～０．０３ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを筋肉内投与（ＩＭ）し、ケタミン／デクスメデトミジンＩＭ（それぞれ１ｍｇ及び０．０１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、ＩＭ）で麻酔する。ワイヤー式眼瞼鏡を配置し、局所洗眼薬で角膜を湿潤に保つ。間接検眼鏡から照射される８１０ｎｍのダイオードレーザを用いて、網膜静脈の間に約６個の単一レーザスポットを形成する。ブタに鎮静剤を投与し、試験化合物を注射する。結膜をコリブリ鉗子で軽く把持し、上縁から２～３ｍｍ後方（扁平部を通って）に注射（２７～３０Ｇ）を行うが、水晶体に接触しないように針を直接に少し後方へ向ける。注射を行い、ゆっくりと針を引き抜く。注射の後、眼表面に抗生物質点眼液を１滴点眼する。
眼科検査のための散瞳は、１％トロピカミドＨＣｌ外用薬を用いて行う（検査の１５分前に片眼に１滴ずつ）。細隙灯生体顕微鏡及び間接検眼鏡を用いた完全眼科検査（改変Ｈａｃｋｅｔｔ及びＭｃＤｏｎａｌｄ）を行い、眼表面形態、前眼部及び後眼部の炎症、白内障形成、網膜変化を投与後７日目及び１４日目に評価する。
フルオレセイン血管造影（ＦＡ）は、投与後７日目及び１４日目に麻酔をかけた動物（ケタミン／デクスメデトミジン（ＩＭ）で行われる。ＦＡを行うための散瞳は、局所的なトロピカミドＨＣｌを用いて行う（検査の１５分前に各眼に１滴ずつ滴下）。フルオレセインナトリウム１２ｍｇ ｋｇ－１）静脈内注射後１～３分後にフルＦＡを行う。得られたマスク画像は、訓練された読影医が解析する。各病変について、ＩｍａｇｅＪを用いて最大フルオレセイン漏出面積を測定する。
実験終了時に、ＰＫ／ＰＤ解析の材料とするため、終末回収（房水、硝子体、網膜及び血漿）が行われるであろう。
実施例１３：霊長類におけるＤＬ－α－アミノアジピン酸（ｄｌＡＡＡ）慢性血管漏出モデルを用いた二重特異性組成物の有効性の評価
ヒト以外の霊長類の疾患モデルでの試験は、有効性を実証するためのゴールドスタンダードであり、ヒトへの移植の成功を最も強力に後押しするものである。この目的のために、我々はミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｅｕｓ）又はカニクイザルのＤＬ－α－アミノアジピン酸（ＤＬＡＡＡ）慢性血管漏出モデルにおいて、二重特異性組成物の有効性を評価する。
０日目に登録した全てのサルに、５ｍｇのＤＬＡＡＡを両眼にＩＶＴ注射する。ＤＬＡＡＡは、１Ｍの塩酸に溶解して１００ｍｇ／ｍｌの原液とし、リン酸緩衝生理食塩水で希釈してｐｈ７．４に調整し、０．２ミクロンフィルタでろ過する。ＤＬＡＡＡ投与液のアリコート（２５ｍｇ／ｍｌ）は、投与日前に調製し、－８０℃で保存する。ＩＶＴ投与時には、必要量の凍結ＤＬＡＡＡ溶液アリコートを冷凍庫から取り出し、投与シリンジに装填する前に室温まで融解される。全てのアリコートは、ＤＬＡＡＡの単一バッチから調製される。ＩＶＴ投与に先立ち、１％アトロピン局所投与で瞳孔が完全に拡張される。眼表面は、０．５％プロパラカイン１～２滴で麻酔し、５％ベタジン、その後の滅菌０．９％生理食塩水で無菌的に準備される。２７ゲージ針に取り付けられた１ｍｌシリンジで硝子体タップを行い、１００μｌの硝子体液を取り出し、－８０℃で保存する。眼圧の上昇を抑えるために、ＤＬＡＡＡ投与前に硝子体タップを行う。ＤＬＡＡＡ溶液（５ｍｇ／２００μｌ）を、０．３ｃｃのインスリンシリンジ及び３１Ｇの０．５インチ針を用いて、下側頭４分円の辺縁から３ｍｍ後方の硝子体中央部に送達する。注射後、直ちに３種の抗生物質軟膏及び１％アトロピン軟膏を局所投与する。
ＤＬＡＡＡ投与後８週目又は９週目の眼科検査後、マスクされた評価者がフルオレセイン血管造影（ＦＡ）画像を採点し、標準的な漏出スコアリングを参照してＤＬＡＡＡによる網膜新生血管漏出の重症度を評価する。両眼の累積スコアに基づいて動物を層別化し、ベースラインのＤＬＡＡＡ誘発病変の重症度が均衡するように、処置群に割り当てる。ＦＡ画像は、処置前１０週目に、動物の割り当てを確認し、ベースラインＦＡ画像を撮影するために繰り返される。二重特異性組成物のＩＶＴ投与前に、眼表面は０．５％のプロパラカインを１～２滴垂らして麻酔し、５％ベタジン及び無菌の０．９％食塩水で無菌的に準備される。３１Ｇ ５／１６針が予め取り付けられた滅菌０．３ｍｌインスリン注射器を用いて、二重特異性組成物処置をサルにＩＶＴ送達する。針は、下側頭四分円の辺縁から２ｍｍ後方に、中央の硝子体を標的として配置される。ビヒクル（０．９％生理食塩水、５０μｌ）、アフリベルセプト（４０ｍｇ／ｍｌ溶液３５μｌ；Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）又は二重特異性組成物を単回ＩＶＴ注射する。試験薬の投与量は、アフリカミドリザルの相対的な硝子体体積（約２．７ｍｌ）及びヒトの比較的硝子体体積（４．４ｍｌ）に基づいて選択される。全ての反対側の眼には、同一の処置が行われる。注射の後、ネオマイシン／ポリミキシンＢ硫酸塩／バシトラシン抗生物質軟膏を局所投与する。投与は、２日前にわたって行われ、追跡検査のスケジュールは試験期間中維持される。
眼球は、ＤＬＡＡＡ投与後隔週、且つ、介入後試験終了まで毎週、ベールラインで細隙灯生体顕微鏡で検査され、眼表面の完全性、眼球の健康全般、ＤＬＡＡＡ投与に対する幅広い眼反応、並びに散瞳剤及び１％塩酸シクロペントレートに対する正常反応が確認される。眼科所見は、Ｈａｃｋｅｔｔ－ＭｃＤｏｎａｌｄスコアリングシステムを改変したものを用いて評定される。
ＤＬＡＡＡ投与後隔週、且つ、介入後試験終了まで毎週、ベースラインでＴｏｐｃｏｎ ＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラとキヤノン６Ｄデジタル画像ハードウェア及びＮｅｗ Ｖｉｓｉｏｎ Ｆｕｎｄｕｓ画像解析システムソフトウェアを用いて窩を中心とした５０°視野の網膜カラー眼底画像を得る。
蛍光血管造影（ＦＡ）は、１０％フルオレセインナトリウム０．１ｍｇ／ｋｇの静脈内注射後、Ｔｏｐｃｏｎ ＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラ又はＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＨＲＡ＋ＯＣＴを用い、固定ゲインとフラッシュ強度で高解像度撮影を行う。画像は、フルオレセイン投与後６分まで収集される。一連の血管像で血管漏れを示す網膜領域を評価し、段階的採点システムを用いて採点し、１分間の生の血管像の漏出領域内の総蛍光強度をＩｍａｇｅＪの半自動マルチＲＯＩツールを用いて定量化する（１０週目から試験終了まで）。
治療後、動物は、毎週画像診断を受ける。２０週目終了時に、ＰＫ／ＰＤ解析の材料とするため、終末回収（房水、硝子体、網膜及び血漿）を行う。
実施例１４：レーザＣＮＶモデルを用いた非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における二重特異性組成物の有効性評価
二重特異性組成物の有効性は、レーザＣＮＶモデルを用いてＮＨＰで評価することも可能である。簡単に説明すると、動物は、５：１のケタミン：キシラジン混合物（１００ｍｇ／ｍｌのケタミン及び２０ｍｇ／ｍｌのキシラジンの０．２ｍｌ／ｋｇ）の筋肉内注射で全ての処置において麻酔をかける。０日目に、全ての動物でレーザ光凝固を行う。Ｉｒｉｄｅｘ Ｏｃｕｌｉｇｈｔ ＴＸ５３２ｎｍレーザ（レーザ時間１００ｍｓ、スポットサイズ５０μｍ、出力７５０ｍＷ）を用い、眼科医が各眼の窩子から約１～１．５視標距離の黄斑周囲領域に６つのレーザスポットを対称に配置する。レーザ処置後すぐにカラー眼底写真を撮影し、レーザ病変を記録する。レーザ照射直後に重篤な網膜／網膜下出血を示し、追跡検査までに治癒しないスポットは解析対象から除外する。出血が網膜中心部の全ての標的病変部に及んだ場合、その動物は別のスクリーニングされたサルと交換され、全ての治療群にわたって最大４匹のサルが処置への割り当てのバランスを保証するための措置を講じる。追跡撮影に必要な時間を考慮し、サルを２つのコホートに分けてＣＮＶのレーザ誘導を行い、投与及び撮影を連日行い、各処置群の動物を各コホートで均等に配置され得る。
全ての動物がレーザ照射後９日目にＯＣＴ撮影を受ける。各レーザ病変のＣＮＶ複合体面積は、ＯＣＴ画像から測定され、各動物の病変の平均サイズが算出される。その後、動物を動物ごとの平均病変等級に基づいて処置群に割り当て、さらに処置群間で平均病変等級がほぼ同等になるように、群を性別でバランスさせる（処置群ごとで１：１）。
試験薬投与（ＩＶＴ注射）は、１１日目に全群の両眼（ＯＵ）において、処置割り当てに従って行われる。注射を容易にするために、開瞼器を眼に配置し、塩酸プロパラカイン０．５％及び５％ベタジン溶液を滴下し、滅菌生理食塩水ですすぐ。中心硝子体へのＩＶＴ注射は、３１ゲージで０．３７５インチ針を用いて、辺縁から２．５ｍｍ後方の鋸状縁のレベルで内側に挿入して行われる。両方のＩＶＴ注射の後、３種の抗生物質であるネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン眼軟膏（又は同等品）を局所投与する。
指定された時点で、ＴｏｎｏＶｅｔ（ｉＣａｒｅ、フィンランド）眼圧計を用いて犬（ｄ）の較正設定に設定して、眼圧（ＩＯＰ）測定を行う。動物には仰臥位をとらせて測定する。各時点で各眼から３回測定し、平均眼圧を定義する。
指定された時点で、眼内炎症を細隙灯生体顕微鏡で検査する。検査項目から臨床的なスコアを算出する霊長類眼科検査スコアリングシステムを用いて、定性的な臨床眼科所見にスコアリングを適用する。
指定された時間で、Ｔｏｐｃｏｎ ＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラとキヤノンデジタル画像ハードウェア及びＮｅｗ Ｖｉｓｉｏｎ Ｆｕｎｄｕｓ画像解析システムソフトウェアを用いて、窩洞を中心とした両側カラー眼底画像を撮影する。フルオレセイン血管造影（ＦＡ）は、１０％フルオレセインナトリウム０．１ｍｌ／ｋｇを静脈内投与し、３０秒から６分まで連続撮影を行う。ＯＤ ＦＡは、ＯＳ血管造影に２時間以上先行し、血管造影画像間のフルオレセインのウオッシュアウトを可能にする。ＣＮＶ病変の血管造影におけるフルオレセイン漏出は、画像強度を均一に調整した後に作成された合成画像を評価して等級付けされる。後期の生の血管像の画像系高濃度分析も、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行われる。
指定された時点で、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴ Ｐｌｕｓと、アイトラッキング及びＨＥＹＥＸ画像取り込み・解析ソフトウェアを用いてＯＣＴが行われる。網膜後部を包含する全体的なボリュームスキャンが行われる。ベースライン検査では、網膜断面表示画像を取得する。レーザ照射後の検査では、各病変を中心とした片眼ごとに６回の星形スキャンと、６回のレーザスポットを含む黄斑全体のオーバーオールボリュームスキャンを高密度スキャン間隔で行う。各レーザ病巣の各星形スキャン内の最大ＣＮＶ複合体形成の主軸を定義し、ＩｍａｇｅＪ内のフリーハンドツールを用いてＣＮＶ複合体面積を測定し、ＣＮＶ複合体の境界を確定し、平方ミクロン（μｍ２）単位の最大複合体面積を算出する。
試験終了時には、ＰＫ／ＰＤ解析の材料として、終末回収（房水、硝子体、網膜及び血漿）を行う。

Claims (92)

  1. 式Ｉを含む二重特異性リボ核酸（ＲＮＡ）アプタマーであって、
    ［式Ｉ］Ｘ１－（アプタマー１）－Ｘ２－（リンカー）－Ｙ１－（アプタマー２）－Ｙ２－ｉｎｖｄＴ
    表１に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列、又は表１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  2. アプタマー１及びアプタマー２のそれぞれは、表１に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列、又は表１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  3. 約１０ｎｍよりも大きい流体力学半径を有する、請求項１又は２に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  4. アプタマー１は配列番号１～５４から選択されるヌクレオチド配列を含み、アプタマー２はアプタマーとは別の配列番号１～５４から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  5. アプタマー１及びアプタマー２のそれぞれは、約３０～約４０ヌクレオチドの長さである、請求項１～４のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  6. 血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（又はそのアイソフォーム）及びインターロイキン（ＩＬ８）に特異的に結合する、請求項１に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  7. ＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＩＬ８の機能を約９０％～約１００％阻害する、請求項６に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  8. ＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＩＬ８の機能を約９５％以上阻害する、請求項７に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  9. 約２５０ｐＭ～約２０ｐＭの結合親和性でＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＩＬ８に結合する、請求項１に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  10. 約５００ｎＭ～約１０ｐＭの結合親和性でＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＩＬ８に結合する、請求項９に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  11. 約７５０ｎＭ～約１ｐＭの結合親和性でＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＩＬ８に結合する、請求項９に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  12. 約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９５０ｎＭ、又は約１ｐＭから選択される結合親和性を有する、請求項９に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  13. ＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）に特異的に結合する、請求項１に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  14. ＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＡｎｇ２の機能を約９０％～約１００％阻害する、請求項１３に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  15. ＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＡｎｇ２の機能を約９５％以上阻害する、請求項１３に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  16. 約２５０ｐＭ～約１０ｐＭの結合親和性でＶＥＧＦ（又はそのアイソフォーム）及びＡｎｇ２に結合する、請求項１３に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  17. 約５００ｎＭ～約５ｐＭの結合親和性を有する、請求項１６に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  18. 約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９５０ｎＭ、又は約１ｐＭから選択される結合親和性を有し、一実施形態において、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、又は約１ｐＭ未満の結合親和性を有する、請求項１６に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  19. ＩＬ８及びＡｎｇ２に特異的に結合する、請求項１に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  20. ＩＬ８及びＡｎｇ２の機能を約９０％～約１００％阻害する、請求項１９に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  21. ＩＬ８及びＡｎｇ２の機能を約９５％以上阻害する、請求項１９に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  22. 約１０ｐＭよりも大きい結合親和性を有する、請求項１９に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  23. ０～５ヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドはＸ２のヌクレオチドに対して相補的である、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  24. ０～５ヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドはＹ２のヌクレオチドに対して相補的である、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  25. 前記リンカーは、０～２０ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーである、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  26. 前記ヌクレオチドリンカーは、１つ以上の２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ウリジン（Ｕ）残基を含む、請求項２５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  27. 前記ヌクレオチドリンカーは、５つ以上の２’Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ウリジン（Ｕ）残基を含む、請求項２５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  28. 前記リンカーは、表２に示される非ヌクレオチドリンカーである、請求項１～５のいずれかに記載のＲＮＡアプタマー。
  29. 前記リンカーは、チオール反応性部分（例えばマレイミド）及びアミン反応性部分を含むヘテロ二官能性リンカーである、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  30. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された、請求項１～２９のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  31. 前記ポリエチレングリコールは、前記二重特異性ＲＮＡアプタマーに結合されている、請求項３０に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  32. 前記ポリエチレングリコールは第２リンカーに結合され、前記第２リンカーは前記二重特異性ＲＮＡアプタマーに結合されている、請求項３０に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  33. 逆位デオキシチミジン（ｉｎｖｄＴ）は、前記二重特異性ＲＮＡアプタマーの３’末端に組み込まれている、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  34. １つ以上の追加の治療剤で修飾された、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  35. 前記二重特異性ＲＮＡアプタマーの１つ以上のヌクレオチドは、化学的に修飾されている、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  36. １つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’フルオロ（２’Ｆ）グアノシン、２’ＯＭｅグアノシン、２’ＯＭｅアデノシン、２’ＯＭｅシトシン、２’ＯＭｅウリジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  37. １つ以上の化学修飾は、非修飾ヌクレオチドを有する同一の二重特異性ＲＮＡアプタマーと比較して、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／又は改善された輸送特性からなる群から選択される１つ以上の改善された特性をもたらす、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  38. １つ以上の化学修飾は、インビボ安定性の改善をもたらし、非ペグ化二重特異性ＲＮＡアプタマーの半減期は１０時間以上である、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  39. １つ以上の化学修飾は、インビボ安定性の改善をもたらし、非ペグ化二重特異性ＲＮＡアプタマーの半減期は約１０～約１００時間である、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  40. １つ以上の化学修飾は、インビボ安定性の改善をもたらし、非ペグ化二重特異性アプタマーの半減期は、約３００～約７００時間である、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  41. １つ以上の化学修飾は、インビボ安定性の改善をもたらし、非ペグ化二重特異性アプタマーの半減期は、約４００～約７００時間である、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  42. １つ以上の化学修飾は、非修飾ヌクレオチドを含む結合成分を有する二重特異性ＲＮＡアプタマーと比較して、標的分子に対する結合成分の親和性及び特異性を増強する、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  43. １つ以上の化学修飾は、二重特異性アプタマーに追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用及び官能性を提供する、請求項３５に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  44. アプタマー１はＶＥＧＦアプタマー２８５を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２６９を含む、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  45. アプタマー１はＶＥＧＦアプタマー２８５を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  46. アプタマー１はＶＥＧＦアプタマー４８１を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２６９を含む、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  47. アプタマー１はＶＥＧＦアプタマー４８１を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  48. アプタマー１はＶＥＧＦアプタマー６２８を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２６９を含む、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  49. アプタマー１はＶＥＧＦアプタマー６２８を含み、アプタマー２はＩＬ８アプタマー２４８を含む、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  50. 前記リンカーは、非ヌクレオチドリンカーである、請求項４４～４９のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  51. 抗体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、酵素、ポリマー、薬物、小分子、金ナノ粒子、放射標識、蛍光標識、ダイ、ハプテン、他のアプタマー又は核酸からなる群から選択される１つ以上の追加の分子に結合されている、請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  52. 前記１つ以上の追加の分子は、ポリエチレングリコールである、請求項５１に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  53. 前記ポリエチレングリコールは、前記二重特異性ＲＮＡアプタマーに直接に接続され、又は第２リンカーを介して前記二重特異性ＲＮＡアプタマーに接続されている、請求項５２に記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー。
  54. 請求項１～５３の二重特異性ＲＮＡアプタマー及び医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
  55. 硝子体内投与用に製剤化された、請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. 請求項５４又は５５に記載の医薬組成物を含むプレフィルドシリンジ。
  57. 標的分子を、請求項１～５３のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー又は請求項５４若しくは５５に記載の医薬組成物に接触させることを含む、少なくとも１つの標的分子の機能を阻害する方法。
  58. 前記標的分子は、ＶＥＧＦ、ＩＬ８、Ａｎｇ２又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 請求項１～５３のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー又は請求項５４若しくは５５に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することにより網膜疾患又は障害を処置することを含む、網膜疾患又は障害を処置する方法。
  60. 前記網膜疾患又は障害は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記網膜疾患又は障害は、糖尿病網膜症である、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記糖尿病網膜症は、糖尿病黄斑浮腫である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記網膜疾患又は障害は、網膜静脈閉塞症である、請求項５９に記載の方法。
  64. 前記網膜静脈閉塞症は、網膜静脈分枝閉塞症である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記網膜静脈閉塞症は、網膜中心静脈閉塞症である、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記網膜疾患又は障害は、未熟児網膜症である、請求項５９に記載の方法。
  67. 前記網膜疾患又は障害は、放射線網膜症である、請求項５９に記載の方法。
  68. 前記それを必要とする対象は、前記網膜疾患又は障害と診断されている、請求項５９～６７のいずれかに記載の方法。
  69. 前記それを必要とする対象は、以前に１つ以上の抗ＶＥＧＦ剤で処置されたが、該処置に対して乏しい反応を示した対象である、請求項５９～６８のいずれかに記載の方法。
  70. 前記それを必要とする対象は、網膜疾患又は障害のリスクがある、請求項５９～６７のいずれかに記載の方法。
  71. 前記投与は、眼内投与を含む、請求項５９～７０のいずれかに記載の方法。
  72. 前記投与は、硝子体内注射を含む、請求項５９～７０のいずれかに記載の方法。
  73. 前記二重特異性ＲＮＡアプタマー又は前記医薬組成物が事前に充填されたシリンジを含むキットを準備することをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも３文字、少なくとも４文字、少なくとも５文字、少なくとも６文字、少なくとも７文字、少なくとも８文字、少なくとも９文字、少なくとも１０文字、少なくとも１１文字、少なくとも１２文字、少なくとも１３文字、少なくとも１４文字、少なくとも１５文字、少なくとも１６文字、少なくとも１７文字、少なくとも１８文字、少なくとも１９文字、少なくとも２０文字、又は２０文字以上の、糖尿病網膜症早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）チャートにおいて測定される全体的な最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の増大をもたらす、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  75. 前記処置により、未処置のコントロール群の対象と比較して、少なくとも２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、ベースラインからＢＣＶＡで１５文字以上獲得する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  76. 前記処置により、未処置のコントロール群の対象と比較して、少なくとも２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、ベースラインからＢＣＶＡで１０文字以上獲得する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  77. 前記処置により、未処置のコントロール群の対象と比較して、少なくとも２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年又は５年のうちの少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって、ベースラインからＢＣＶＡで５文字以上獲得する患者の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上である、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  78. 前記処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の、蛍光眼底造影（ＦＡ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定された網膜液の低減をもたらす、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  79. 前記処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の、蛍光眼底造影（ＦＡ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定された網膜厚の低減をもたらす、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  80. 前記処置は、未処置のコントロールの対象と比較して、少なくとも２週間、１月、２月、３月、６月、１年、２年又は５年の少なくとも１つから選択される所定の期間にわたって少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の、蛍光眼底造影（ＦＡ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定された脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）病変の総面積の低減をもたらす、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  81. 前記それを必要とする対象に、少なくとも１つの追加の治療成分を同時投与することをさらに含む、請求項５９～７３のいずれかに記載の方法。
  82. 前記少なくとも１つの追加の治療成分は、治療剤である、請求項８１に記載の方法。
  83. 少なくとも１つの追加の前記治療剤は、Ｉｌｌｕｖｉｅｎ及びＯｚｕｒｄｅｘ（登録商標）から選択される、請求項８２に記載の方法。
  84. それを必要とする対象群を処置する方法であって、請求項１～５３のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマー又は請求項５４若しくは５５に記載の医薬組成物の有効量を、前記対象群に投与することを含む、方法。
  85. 処置された対象の３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、３０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上に有効な処置となる、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記有効な処置は、糖尿病網膜症早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）チャートにおいて測定される全体的な最高矯正視力（ＢＣＶＡ）により測定される、請求項８５に記載の方法。
  87. 持続する網膜液が維持されるそのような対象を３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満又は１０％未満にする、請求項８４に記載の方法。
  88. 請求項１～５３のいずれかに記載の二重特異性ＲＮＡアプタマーを製造する方法であって、直接的な化学合成、酵素的合成、化学合成後のドメイン化学的結合、及び／又はドメインハイブリダイゼーションを行うことを含む、方法。
  89. 直接的な化学合成を行うことを含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 酵素的合成を行うことを含む、請求項８８に記載の方法。
  91. 化学合成後のドメイン化学的結合を行うことを含む、請求項８８に記載の方法。
  92. ドメインハイブリダイゼーションによる合成を行うことを含む、請求項８８に記載の方法。
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