TW202227137A - 藥物和野生型穿膜肽衍生物的組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明屬藥物製劑領域，涉及一種包括野生型穿膜肽penetratin的衍生物和生理pH條件下帶正電荷的藥物的組合物。所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物是一類利用野生型穿膜肽penetratin設計的親脂性衍生物，在生理pH條件下分子整體帶正電荷。本發明所述組合物作為眼部給藥系統，可使得生理pH條件下帶正電荷的藥物通過滴眼的方式吸收到達眼後段，從而為實現生理pH條件下帶正電荷的藥物的眼部遞送提供新途徑。

Description

藥物和野生型穿膜肽衍生物的組合物
本發明屬藥物製劑領域，涉及用於治療眼部疾病的組合物，更具體是涉及一種包括野生型穿膜肽penetratin的衍生物和生理pH條件下帶正電荷的藥物的組合物。
穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一種生理pH條件下帶正電荷的短肽，可以介導共價或非共價連接的分子或給藥系統(如、脂質體、納米粒、膠束等)進入細胞(J.Controlled Release,2019,309：106-124)。
由於野生型穿膜肽penetratin的衍生物保留了野生型penetratin在生理pH條件下帶正電荷的特性，從而現有技術中認為，野生型穿膜肽penetratin的衍生物通過靜電相互作用與生理pH條件下帶負電荷的藥物結合並實現眼內遞送。即，野生型穿膜肽penetratin的衍生物通過靜電相互作用可以與生理pH條件下帶負電荷的基因、多肽和蛋白質等生物大分子藥物自組裝形成納米複合物，或者在聚合物存在的情況下與生理pH條件下帶負電荷的基因、多肽和蛋白質等生物大分子藥物自組裝形成納米複合物，實現上述生物大分子藥物的眼內遞送。例如參見中國專利申請CN108976288(A)。
然而，對於生理pH條件下帶正電荷的藥物，因為其與野生型穿膜肽penetratin的衍生物同樣均帶有正電荷，一般認為無法通過上述這種方式進行眼內遞送給藥。因此，現有技術中亟需解決如何促進生理pH條件下帶正電的藥物在眼內的吸收以及實現所述藥物的眼內遞送問題。
本發明的目的是提供一類人工改造的穿膜肽(cel-penetrating peptides,CPPs)與藥物的組合物。
為此，本發明提供了一種用於治療眼部疾病的組合物，該組合物包括：
(i)生理pH條件下帶正電荷的藥物，和
(ii)野生型穿膜肽penetratin的衍生物，所述野生型穿膜肽penetratin的衍生 物具有下述氨基酸序列：
RX1IKIWFX2X3RRMKWKK
其中，X1、X2和X3代表疏水性氨基酸，選自天然來源的氨基酸丙氨酸(alanine，A)、纈氨酸(valine，V)、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、脯氨酸(proline，P)、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、色氨酸(tryptophan，W)、甲硫氨酸(methionine，M)和非天然來源的氨基酸α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)、α-氨基戊酸(α-aminopentanoic acid)、α-氨基己酸(α-aminohexanoic acid)、α-氨基庚酸(α-aminoheptanoic acid)，以及它們的組合。
本發明所述用於治療眼部疾病的組合物，優選所述組合物是溶液或混懸液。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，優選X1、X2和X3代表疏水性氨基酸，X1、X2和X3中的至少兩個選自天然來源的氨基酸丙氨酸(alanine，A)、纈氨酸(valine，V)、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、脯氨酸(proline，P)、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、色氨酸(tryptophan，W)、甲硫氨酸(methionine，M)和非天然來源的氨基酸α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)、α-氨基戊酸(α-aminopentanoic acid)、α-氨基己酸(α-aminohexanoic acid)、α-氨基庚酸(α-aminoheptanoic acid)，以及它們的組合。
本發明所述用於治療眼部疾病的組合物，優選X1、X2或X3為色氨酸(tryptophan，W)。
本發明所述用於治療眼部疾病的組合物，優選X1、X2或X3中的至少兩個為色氨酸(tryptophan，W)。
本發明所述用於治療眼部疾病的組合物，優選所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物的氨基酸序列為：
RWIKIWFQNRRMKWKK
RQIKIWFWNRRMKWKK
RQIKIWFQWRRMKWKK
RWIKIWFWNRRMKWKK
RWIKIWFQWRRMKWKK
RQIKIWFWWRRMKWKK
RWIKIWFWWRRMKWKK。
本發明所述用於治療眼部疾病的組合物，優選所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物的氨基酸序列為：
RWIKIWFWNRRMKWKKK
RWTKIWFQWRRMKWKKK
RQIKIWFWWRRMKWKKK
RWIKIWFWWRRMKWKK。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，優選所述藥物為多肽或蛋白類藥物。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中優選所述藥物選自以下的一種或多種：納米抗體(Nanobody)、雷珠單抗(Ranibizumab)、阿柏西普(Aflibercept)、奧克纖溶酶(Ocriplasmin)、貝伐單抗(Bevacizumab)、阿達木單抗(Adalimumab)、阿特珠單抗(Atezolizumab)、貝利木單抗(Belimumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、達洛珠單抗(Dalotuzumab)、地諾單抗(Denosumab)、埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)、英夫利昔單抗(Infliximab)、伊匹單抗(Ipilimumab)、伊奇珠單抗(Ixekizumab)、那他珠單抗(Natalizumab)、NIST單抗(NISTmab)、納武單抗(Nivolumab)、奧濱尤妥珠單抗(Obinutuzumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、帕利珠單抗(Palivizumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、利妥昔單抗(Rituximab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)和內皮抑素(Endostatin)。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，優選所述藥物選自以下的一種或多種：納米抗體、雷珠單抗、阿柏西普、奧克纖溶酶、貝伐單抗和西妥昔單抗。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，優選所述藥物選自以下的一種或多種：雷珠單抗、阿柏西普和貝伐單抗。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，優選所述納米抗體選自以下的一種或多種：卡帕珠單抗(Caplacizumab)、奧索拉珠單抗(Ozoralizumab)和伏巴厘珠單抗(Vobarilizumab)。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，優選野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為0.1：1-50：1。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，更優選野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為0.5：1-35：1。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，更優選野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為1：1-20：1。
本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物，最優選野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為3：1-15：1。
本發明還提供了一種為需要的受試者治療眼部疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的根據本發明所述的用於治療眼部疾病的組合物。
本發明所述的方法，其中所述方法優選包括將治療有效量的根據本發明所述的組合物給患者滴眼給藥。
本發明還提供了所述的組合物在製備用於治療眼部疾病的藥物中的用途。
圖1：合成多肽質譜及液相圖譜。
圖2：28WP促進納米抗體在人角膜上皮細胞中攝取的流式圖(左)及平均螢光強度對比(右)。
圖3：不同比例的89WP/納米抗體組合物在人視網膜色素上皮細胞中的攝取。
圖4：不同摩爾比條件下，29WP促進奧克纖溶酶在人視網膜色素上皮細胞中的攝取。
圖5：不同摩爾比條件下，289WP促進西妥昔單抗在人角膜上皮細胞中的攝取。
圖6：不同摩爾比條件下多肽/雷珠單抗組合物細胞攝取定量評價。
圖7：不同摩爾比條件下多肽/雷珠單抗組合物細胞攝取定量評價。
圖8：不同多肽製備的多肽/雷珠單抗組合物細胞攝取定量評價。
圖9：多肽/雷珠單抗組合物在人角膜上皮細胞中同步攝取行為。
圖10：多肽/雷珠單抗組合物在人視網膜色素上皮細胞中同步攝取行為。
圖11：多肽/雷珠單抗組合物滴眼液細胞攝取機制。
圖12：多肽/雷珠單抗組合物滴眼給藥1h後兔體內各組織(血漿、房水、玻璃體、視網膜)雷珠單抗濃度。
圖13：多肽/雷珠單抗組合物滴眼給藥後雷珠單抗在兔體內濃度分佈變化。
圖14：多肽/阿柏西普組合物滴眼給藥後阿柏西普在兔體內濃度分佈。
普通滴眼劑在結膜囊內滯留時間短，吸收效果差，特別是基因、多肽和蛋白質等生物大分子藥物經局部滴眼給藥後，眼部生物利用度極低，並且幾乎不能到達眼後段；眼內注射劑和眼內植入劑生物利用度雖高，但患者順應性差，且容易導致嚴重的併發症。
為了解決現有技術中的上述缺陷，本發明將經人工改造的穿膜肽作為眼部吸收促進劑，可通過非創傷途徑滴眼給藥，通過非共價連接將在生理pH條件下帶正電荷的藥物遞送至眼內。所述穿膜肽是一種生理pH條件下帶正電 荷的短肽，而所述藥物為在生理pH條件下帶正電荷的藥物。申請人意想不到地發現，所述生理pH條件下帶正電荷的穿膜肽和所述生理pH條件下帶正電荷的藥物的組合物可以顯著促進細胞的攝取。與僅使用所述生理pH條件下帶正電荷的藥物的情況比較，所述組合物使得細胞攝取顯著增加。
本發明提供了一種用於治療眼部疾病的組合物，該組合物包括：(i)生理pH條件下帶正電荷的藥物，和(ii)野生型穿膜肽penetratin的衍生物。所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物為基於天然來源的穿膜肽penetratin，採用氨基酸突變的方法，設計並製備的一系列對眼組織穿透性好、生物安全性高的多肽衍生物，可通過非創傷途徑將與其混合的生理pH條件下帶正電荷的藥物遞送至眼內。通過本發明的組合物，能夠介導所述生理pH條件下帶正電荷的藥物高效地透過眼部的吸收屏障，促進藥物進入眼內並到達眼後段，進而提高生理pH條件下帶正電荷的藥物的眼部生物利用度。
所述野生型多肽penetratin的氨基酸序列如下：
RQIKIWFQNRRMKWKK
野生型penetratin對眼組織的穿透能力隨著分子的疏水性增強而得到改善。因此，本發明所述penetratin衍生物在保持野生型penetratin基本氨基酸序列不變的前提下，利用氨基酸突變技術，在其分子中引入疏水性氨基酸，進而增強所得到的penetratin衍生物的眼組織穿透能力。
具體地說，本發明是在野生型penetratin的基礎之上，保持其原有鹼性氨基酸精氨酸(arginine，R)、賴氨酸(lysine，K)以及原有疏水氨基酸異亮氨酸(isoleucine，I)、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、色氨酸(tryptophan， W)、甲硫氨酸(methionine，M)的序列不變，利用多肽固相合成技術，以疏水性氨基酸取代penetratin分子中的親水性氨基酸穀氨醯胺(glutamine，Q)和天冬醯胺(asparagine，N)，進而得到一系列多肽衍生物。
所述penetratin衍生物的特徵在於對野生型penetratin不同親水性氨基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)位點用不同的疏水性氨基酸進行取代。所述疏水性氨基酸選自天然來源的氨基酸丙氨酸(alanine，A)、纈氨酸(valine，V)、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、脯氨酸(proline，P)、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、色氨酸(tryptophan，W)、甲硫氨酸(methionine，M)和非天然來源的氨基酸α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)、α-氨基戊酸(α-aminopentanoic acid)、α-氨基己酸(α-aminohexanoic acid)、α-氨基庚酸(α-aminoheptanoic acid)等，以及它們的組合。
在野生型penetratin基礎之上進行結構改造得到的多肽衍生物，其氨基酸序列如表1所示，其中，突變的氨基酸用底線標示。該表格中未給出非天然氨基酸突變的實例，不同疏水氨基酸的組合突變僅給出代表性實例。
penetratin衍生物對眼組織的穿透能力與其疏水性(親脂性)相關，疏水性(親脂性)越強，penetratin衍生物對眼組織的穿透能力也越強。因此，利用其它疏水性氨基酸製備的penetratin衍生物也將獲得增強的眼部吸收促進效果。
本發明中所述penetratin衍生物相對於因安全性問題極少在眼部應用的小分子吸收促進劑，這種多肽類吸收促進劑易於降解，因而生物安全性更好。另一方面，多肽類吸收促進劑易於修飾和改造，以實現不同的應用目標， 而且本發明所述的penetratin衍生物較天然來源的野生型penetratin具有更強的眼部吸收促進能力。
表1. 野生型penetratin經結構改造後得到的penetratin衍生物
Figure 110130085-A0101-12-0009-1
Figure 110130085-A0101-12-0010-3
在本領域中，等電點(isoelectric point,pI)是指分子如蛋白質或多肽的淨電荷為零的pH值。例如參見文獻：Kentaro Tomii.Protein Properties.Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology.2019,2：28-33.(doi：10.1016/B978-0-12-809633-8.20266-5)。由於兩性離子所帶電荷因溶液的pH值不同而改變，當兩性離子正負電荷數值相等時，溶液的pH值即其等電點。本發明中所述在生理pH條件下帶正電荷的藥物，即等電點高於7.45的藥物，如多肽或蛋白藥物。
在本領域中，生理pH條件是指：在生理狀態下，人體的pH範圍介於7.35至7.45，平均值為7.40。人體中血液的pH值維持在7.4±0.03很窄的範圍。例如參見文獻：Hopkins E,Sharma S.Physiology,Acid Base Balance.In：StatPearls[Internet].StatPearls Publishing；Treasure Island(FL)：Jun 16,2019.PMID：29939584；以及Melvin E.Laski,Neil A.Kurtzman.Acid-base disorders in medicine.Disease-a-Month.1996,42(2)：59-125。由於本發明中藥物的等電點高於生理狀態下人體的pH範圍，因此在所述生理pH條件下所述藥物帶正電荷。
表2. 在生理pH條件下帶正電荷的藥物
Figure 110130085-A0101-12-0011-4
Figure 110130085-A0101-12-0012-5
本發明組合物可以通過以下方式獲得：
將野生型穿膜肽penetratin的衍生物與生理pH條件下帶正電荷的多肽或蛋白質藥物通過物理混合製備而成。
發明人發現，通過物理混合獲得的本發明組合物可以促進蛋白藥物在眼內的吸收。發明人通過細胞攝取實驗，對本發明的組合物在體外促進細胞攝取的效果進行了比較。結果顯示，penetratin衍生物與在生理pH條件下帶正電的蛋白藥物的摩爾比在0.1：1-50範圍內的組合物可以獲得蛋白藥物在眼內的良好吸收。並且在penetratin衍生物中，雙突變(28WP、29WP、89WP)和三突變(289WP)衍生物促進吸收效果更好。
所述生理pH條件下帶正電的蛋白藥物包括雷珠單抗，等電點8.8；貝伐單抗，等電點8.8；和阿柏西普，等電點8.2。所述組合物特別在摩爾比介於5：1至35：1時具有最佳的促進吸收效果。
納米抗體是一類新穎而獨特的抗原結合片段，來自于天然存在於羊駝血清中的重鏈抗體。納米抗體是重組的、單一結構域的可變片段，來源於羊駝的重鏈抗體，可選擇性地與特定抗原結合。例如參見文獻：Jov
Figure 110130085-A0101-12-0012-28
evska I,Muyldermans S.The Therapeutic Potential of Nanobodies.BioDrugs.2020,34：11-26；Rubel Chakravarty,Shreya Goel,Weibo Cai.Nanobody：The“Magic Bullet”for Molecular Imaging？Theranostics 2014；4(4)：386-398。
常見的納米抗體包括：Caplacizumab(通用名ALX 0681或ALX-0081，商品名Cablivi)，分子量28kDa，等電點9.2；Ozoralizumab(通用名ATN-103)，分子量38kDa，等電點8.8；Vobarilizumab(通用名ALX-0061)，分子量26kDa，等電點8.7。
本發明已經在小鼠體內證實，通過滴眼給藥所述組合物，可以將納米抗體遞送到眼內(包括眼前段的角膜和眼後段的視網膜)。在單獨使用納米抗體的情況下，則幾乎不產生吸收。
具體地，與不含野生型穿膜肽penetratin的衍生物89WP只含有納米抗體的藥物比較，包括89WP與納米抗體且二者的摩爾比範圍為5：1~50：1的組合物的細胞攝取顯著增加。當89WP與納米抗體的摩爾比為10：1-15：1時，獲得了最佳的促進攝取效果。如圖3所示，通過對89WP與納米抗體二者的比例(89WP：納米抗體)分別為5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1和50：1的組合物進行比較。結果顯示，89WP：納米抗體為10：1和15：1的兩組組合物獲得了最多的細胞攝取。
同樣，通過將包括89WP和雷珠單抗的組合物滴眼給藥給家兔，證明了在家兔體內可以通過所述組合物將雷珠單抗遞送到眼內(包括眼後段的視網膜和玻璃體)。效果顯著優於對照R8。
其中，R8為8聚精氨酸(arginine，R)的縮寫，是一種經典的人工合成穿膜肽。有文獻報導用R8的同系物6聚精氨酸(R6)將雷珠單抗和貝伐單抗通過滴眼給藥遞送到小鼠眼內。例如參見：Invest Ophthalmol Vis Sci.2017；58(5)：2578-2590.doi：10.1167/iovs.16-20072.。還有文獻報導，R8比R6有更好的 促進吸收效果。例如參見：J Control Release.2007；118(2)：177-84.doi：10.1016/j.jconrel.2006.12.022。
在本發明中，發明人用R8做對照，證明本發明的效果優於R8，從而證明本發明獲得了優於文獻報導中的R6的技術效果。如果不加89WP則不產生吸收。
具體地，利用細胞攝取實驗在體外篩選野生型穿膜肽penetratin的衍生物(R6(6聚精氨酸)、野生型Penetratin、2WP、8WP、9WP、28WP、29WP、89WP、289WP)與雷珠單抗的組合物，摩爾比設定為10：1，選用了2種不同的細胞，其中29WP、289WP效果最好，與不含野生型穿膜肽penetratin的衍生物只含有雷珠單抗的組合物比較，細胞攝取顯著增加。
與含有文獻報導(例如參見：Invest Ophthalmol Vis Sci.2017；58(5)：2578-2590.doi：10.1167/iovs.16-20072.，其中6聚精氨酸(R6)將雷珠單抗和貝伐單抗通過滴眼給藥遞送到小鼠眼內)具有吸收促進作用的多肽R6和雷珠單抗的組合物比較(R6：雷珠單抗的比例與野生型穿膜肽penetratin的衍生物：雷珠單抗的比例相同)，以及與含有野生型Penetratin和雷珠單抗的組合物比較(野生型Penetratin：雷珠單抗的比例與野生型穿膜肽penetratin的衍生物：雷珠單抗的比例相同)，細胞攝取顯著增加。如圖6所示，細胞攝取分別增加13.5、14.7倍。
利用細胞攝取實驗在體外篩選89WP與雷珠單抗的組合物，選用了3種不同的細胞，二者摩爾比變化範圍5：1~18：1，與不含89WP只含有雷珠單抗的組合物比較，細胞攝取顯著增加。與含有文獻報導具有吸收促進作用的多肽R8和雷珠單抗的組合物比較(R8：雷珠單抗的比例介於5：1-30：1，高於89WP：雷珠單抗的比例)，細胞攝取顯著增加。如圖4和圖5所示，細胞攝取增加了2.2-6.7 倍。
利用細胞攝取實驗在體外篩選289WP與雷珠單抗的組合物，選用了2種不同的細胞，證實289WP與雷珠單抗形成組合物(摩爾比10：1)後，二者同步被細胞攝取。
利用細胞攝取實驗在體外篩選29WP和289WP與雷珠單抗的組合物，分別利用29WP和289WP與雷珠單抗形成複合物(摩爾比10：1)，在家兔體內證實通過滴眼給藥可以將雷珠單抗遞送到眼內(包括眼前段的房水，眼後段的視網膜和玻璃體)。如果不加野生型穿膜肽penetratin的衍生物，雷珠單抗幾乎不吸收。在這種情況下，發明人意想不到地發現，野生型穿膜肽penetratin的衍生物能夠與在生理pH條件下帶正電荷的雷珠單抗產生相互作用，並且野生型穿膜肽penetratin的衍生物能夠將雷珠單抗帶入到眼內。利用細胞攝取實驗在體外篩選289WP與阿柏西普的組合物。其中，利用289WP與阿柏西普形成組合物(摩爾比10：1)，在家兔體內證實通過滴眼給藥可以將阿柏西普遞送到眼內(包括眼前段的房水，眼後段的視網膜和玻璃體)。如果不加野生型穿膜肽penetratin的衍生物，阿柏西普幾乎不吸收。
通過本發明的組合物，獲得了意想不到的技術效果。具體地，本發明組合物中的penetratin衍生物保留了野生型penetratin在生理pH條件下帶正電荷的特性，通過與生理pH條件下帶正電荷的藥物通過非共價方式形成組合物，意想不到地實現了上述藥物的更好的眼內遞送。
例如，通過在小鼠體內施用所述組合物，本發明證實了通過滴眼給藥，所述組合物可以將藥物如納米抗體遞送到眼內，包括將藥物如納米抗體遞送到眼前段的角膜和眼後段的視網膜。通過在兔體內施用所述組合物，本發 明證實了通過滴眼給藥，所述組合物可以將藥物如雷珠單抗和阿柏西普遞送到眼內，包括將藥物如雷珠單抗和阿柏西普遞送到眼前段的角膜和眼後段的視網膜。在僅施用該藥物而不包括所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物的情況下，無法獲得該遞送效果。
實施例
以下結合本發明的具體實施例進一步闡明本發明，但並不限制其保護範圍。
實施例1. 野生型穿膜肽penetratin衍生物的合成、純化及表徵
採用固相合成技術進行多狀合成，多肽序列如表3所示。
採用製備液相對凍幹後粗品進行純化，製備柱為Waters XBridgeTM BEH130 Prep C18柱(19×250mm，10μm)，凍幹後進行後續純度及分子量表徵。
表3 多肽序列資訊
Figure 110130085-A0101-12-0016-6
*：採用PeptideMass計算工具求得多肽的理論平均分子量，https：//web.expasy.org/peptide_mass/
採用高效液相色譜法考察多肽純度，色譜條件如下，
色譜柱：YMC-Pack ODS-A柱(4.6×150mm,5μm)；
柱溫：20℃；
流動相：A相為純水(含0.1% TFA)，B相為乙腈(含0.1% TFA)，野生型穿膜肽penetratin的衍生物流動相方法為5-65% B，30min，多肽R6則為2-32% B，30min；
流速：0.7mL/min；
檢測波長：214nm。
採用電噴霧電離質譜(ESI-MS)考察多肽分子量，檢測條件如下，
流動相：甲醇：純水：甲酸=80：19.9：0.1；
流速：0.3mL/min；
毛細管電壓：3000V；
乾燥氣體溫度及流速：350℃，12L/min。
多肽純度及分子量見表4，具體譜圖資訊詳見圖1。所有多肽液相純度均在95%以上，分子量正確，可用於後續實驗。
表4 多肽液相純度及分子量
Figure 110130085-A0101-12-0017-7
實施例2. 多肽促進納米抗體被眼部細胞攝取
取適量納米抗體(等電點9.6，分子量13kD)溶於100mM Na2CO3溶液，加入螢光標記試劑Sulfo-Cy5-NHS，4℃條件下攪拌反應過夜，體系於4℃純水中透析後凍幹，即得螢光探針Cy5標記的納米抗體。
多肽28WP與Cy5標記的納米抗體分別溶解於磷酸緩衝溶液(PBS，濃度10mM，pH7.4)中，將28WP溶液與Cy5標記的納米抗體溶液按摩爾比5：1混合，室溫條件下放置24h，得到28WP與納米抗體組合物。
取生長狀態良好的人角膜上皮細胞(HCEC)，按1×104細胞/孔鋪于24孔板，培養24h後，棄去培液，加入28WP與納米抗體組合物(含Cy5標記的納米抗體濃度為1μM)，37℃孵育2h，棄去藥液，用10mM PBS(含0.02mg/mL肝素鈉)洗3次，收集細胞，重懸於10mM PBS，流式細胞儀進行檢測。
由圖2可見，游離納米抗體自身很難被人角膜上皮細胞攝取。多肽28WP與納米抗體形成的組合物與細胞孵育後，納米抗體的細胞攝取顯著改善，較游離納米抗體的細胞攝取增加至19.4倍。
實施例3. 不同比例多肽/納米抗體組合物的細胞攝取
按照表5中比例配製89WP/納米抗體滴眼液，4℃孵育過夜，備用。
表5. 89WP/納米抗體滴眼液組合物
Figure 110130085-A0101-12-0018-8
Figure 110130085-A0101-12-0019-9
將ARPE-19細胞鋪于24孔板，培養24h以上。棄去培液，每孔加入200μL藥液及300μL無血清培液，孵育2h後，棄去藥液，PBS洗3次，將細胞消化並重懸於PBS中，流式檢測Cy5螢光信號(Ex 645nm，Em 665nm)。
89WP與納米抗體摩爾比從5：1至50：1條件下的細胞攝取見圖3。
圖3 為不同比例的89WP/納米抗體組合物在ARPE-19細胞中的攝取。其中，89WP與納米抗體的摩爾比分別為5：1,10：1,15：1,20：1,25：1,30：1,35：1,40：1,45：1,50：1。
結果表明，在該比例範圍內，89WP可以顯著促進納米抗體的細胞攝取，在摩爾比10：1-30：1範圍內促進攝取效果較好。因此，優選的89WP與納米抗體摩爾比範圍為5：1至35：1，更進一步優選10：1至30：1。
實施例4. 多肽促進奧克纖溶酶被眼部細胞攝取
多肽29WP與Cy5標記的奧克纖溶酶(Ocriplasmin，等電點7.7，分子量27kD)分別溶解於檸檬酸緩衝溶液(濃度0.53mg/mL)中，將29WP溶液與Cy5標記的奧克纖溶酶溶液按摩爾比0.1：1、0.3：1、0.5：1、0.7：1、0.9：1和1：1混合，室溫條件下放置24h，得到29WP與奧克纖溶酶組合物。
取生長狀態良好的人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)，按1×104細胞/孔鋪于24孔板，培養24h後，棄去培液，加入含有不同29WP與奧克纖溶酶摩爾比的組合物(含Cy5標記的奧克纖溶酶濃度為1μM)，37℃孵育2h，棄去 藥液，用10mM PBS(含0.02mg/mL肝素鈉)洗3次，收集細胞，重懸於10mM PBS，流式細胞儀進行檢測。
由圖4可見，在摩爾比0.1：1至1：1條件下，多肽29WP與奧克纖溶酶形成的組合物可以使奧克纖溶酶在人視網膜色素上皮細胞中的攝取增加7至21倍。
實施例5. 多肽促進西妥昔單抗被眼部細胞攝取
多肽289WP與Cy5標記的西妥昔單抗(Cetuximab，等電點8.8，分子量152kD)分別溶解於磷酸緩衝溶液(PBS，濃度10mM，pH7.4)中，將289WP溶液與Cy5標記的西妥昔單抗溶液按摩爾比0.5：1、0.7：1、1：1、3：1、5：1、7：1和10：1混合，室溫條件下放置24h，得到289WP與西妥昔單抗組合物。
取生長狀態良好的人角膜上皮細胞(HCEC)，按1×104細胞/孔鋪于24孔板，培養24h後，棄去培液，加入含有不同289WP與西妥昔單抗摩爾比的組合物(含Cy5標記的西妥昔單抗濃度為1μM)，37℃孵育2h，棄去藥液，用10mM PBS(含0.02mg/mL肝素鈉)洗3次，收集細胞，重懸於10mM PBS，流式細胞儀進行檢測。
由圖5可見，在摩爾比0.5：1至10：1條件下，多肽289WP與西妥昔單抗形成的組合物可以使西妥昔單抗在人角膜上皮細胞中的攝取增加12至32倍。
實施例6. 不同比例多肽/雷珠單抗組合物的細胞攝取
首先，對雷珠單抗進行螢光標記。取一定量雷珠單抗注射液，4℃純水中透析3d脫鹽(截留分子量10kD)，凍幹後取5mg複溶於100mM Na2CO3溶液中，加入0.12mg螢光標記試劑Sulfo-Cy5-NHS，4℃條件下攪拌反應過夜，體系於4℃純水中透析3d後凍幹，即得螢光標記雷珠單抗(Cy5-Rani)。
隨後製備多肽/雷珠單抗組合物。稱取適量多肽，用一定體積市售雷珠單抗注射劑溶解，再加入等體積市售雷珠單抗注射液溶劑，4℃保存，備用。
對不同的多肽/雷珠單抗組合物攝取效果進行評價。取生長狀態良好的HCEC、ARPE-19和HUVEC細胞，按1×104細胞/孔分別鋪于24孔板，培養24h後，棄去培液，加入不同組合物多肽/Cy5-Rani混合物溶液(均含Cy5-Rani 1μM)，37℃孵育2h，棄去藥液，用10mM PBS(含0.02mg/mL肝素鈉)洗3次，收集細胞，重懸於10mM PBS，流式檢測陽性細胞率和平均螢光強度，檢測通道激發波長638nm，發射波長660nm。
不同摩爾比條件下多肽介導的抗體細胞攝取結果如下。以眼部滲透能力較強的多肽89WP與Cy5標記雷珠單抗(Cy5-Rani)按不同摩爾比混合後，考察其細胞攝取行為，結果如圖6、圖7所示。
圖6為不同摩爾比條件下多肽介導雷珠單抗細胞攝取定量評價。其中，取一定量多肽按不同摩爾比(89WP/Rani,1：1,3：1,5：1,7：1,10：1；R8/Rani,5：1,15：1,30：1)與Cy5標記雷珠單抗1μM混合，4℃孵育24h，然後與不同細胞在37℃條件下共孵育2h。採用One-Way ANOVA檢驗進行顯著性分析，以Dunnett’s檢驗校正(n=3,ns p>0.05,***p<0.001，與游離雷珠單抗比較)。
圖7為不同摩爾比條件下多肽介導雷珠單抗細胞攝取的定量評價。其中，取一定量多肽89WP按不同摩爾比(5：1,7：1,10：1,12：1,15：1,18：1)與Cy5標記雷珠單抗1μM混合，4℃孵育24h，然後與不同細胞在37℃條件下共孵育2h。採用One-Way ANOVA檢驗進行顯著性分析，以Tukey’s檢驗校正(n=3,ns p>0.05,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
結果表明，在摩爾比1：1至10：1條件下，多肽介導雷珠單抗細胞攝取呈上升趨勢。根據初步篩選結果進一步優化89WP與雷珠單抗的摩爾比，在5：1至18：1條件下，與游離抗體相比，多肽89WP介導抗體在3種細胞中攝取量增加2.2-6.7倍(p<0.001)；隨多肽用量增加，抗體細胞攝取量總體呈上升趨勢，在HCEC細胞中，摩爾比10：1條件下抗體細胞攝取量與摩爾比7：1、12：1無顯著性差異(p>0.05)，在ARPE-19細胞中，摩爾比10：1條件下抗體細胞攝取量顯著高於摩爾比7：1混合物(p<0.001)，較低於摩爾比12：1混合物(p<0.01)，在HUVEC細胞中，摩爾比10：1條件下抗體細胞攝取量顯著高於摩爾比7：1混合物(p<0.001)，與摩爾比12：1混合物無顯著性差異(p>0.05)，略低於摩爾比15：1混合物(p<0.05)。總體上摩爾比10：1條件下多肽介導抗體細胞攝取量較低摩爾比組合物顯著增加，此後繼續增加多肽用量，抗體細胞攝取量增速趨緩，為提高多肽利用率，最終確定摩爾比10：1為最優組合物處方。
實施例7. 不同多肽/雷珠單抗組合物的細胞攝取
在摩爾比10：1條件下製備不同多肽和雷珠單抗組合物，考察其在HCEC和ARPE-19細胞中攝取行為，結果如圖6所示。
圖8為不同多肽介導雷珠單抗細胞攝取的定量評價。其中，取不同多肽10μM與1μM Cy5-Rani混合，4℃孵育24h得到組合物溶液，將組合物溶液與不同細胞在37℃孵育2h後檢測，或將組合物溶液在4℃保存7天后與細胞孵育，流式檢測細胞平均螢光強度值(Ex 638nm/Em 660nm)。
結果表明，在2種細胞模型中，野生型Penetratin介導雷珠單抗細胞攝取量均低於其含疏水衍生肽組合物溶液的細胞攝取量，並且衍生肽親脂性增強，介導雷珠單抗細胞攝取量呈上升趨勢。在HCEC細胞中，多肽29WP、289WP 介導雷珠單抗細胞攝取能力最強，相比於游離抗體，平均螢光強度分別增加13.5、14.7倍，在ARPE-19細胞中有相同結果，基於多肽29WP、289WP的組合物溶液組細胞平均螢光強度分別增加11.1、11.3倍。將所製備組合物溶液於4℃條件下保存7d後考察其細胞攝取行為，與新鮮製備混合物相比，總體上大部分組合物溶液細胞攝取有所下降，但在2種細胞中基於29WP、289WP組合物溶液組細胞平均螢光強度仍為最高(289WP效果略優於29WP)，因此選擇多肽29WP、289WP為優選眼部吸收促進劑與市售雷珠單抗注射液組合，進行後續體內藥動學評價。
實施例8. 多肽/雷珠單抗組合物的細胞攝取機制
在本實施例中對多肽與雷珠單抗的同步細胞攝取行為進行研究。
在摩爾比10：1條件下製備羧基螢光素標記的多肽289WP(289WP-FAM)和Cy5標記的雷珠單抗(Cy5-Rani)組合物，考察二者在HCEC和ARPE-19細胞中同步攝取行為，結果如圖9、圖10所示。
圖9為多肽/抗體在HCEC細胞中的同步攝取行為。A為羧基螢光素(FAM)標記多肽289WP(289WP-FAM)的細胞攝取平均螢光強度。B為Cy5標記雷珠單抗(Cy5-Rani)的細胞攝取平均螢光強度。C為289WP-FAM和Cy5-Rani細胞同步攝取流式圖。各組合物均含289WP-FAM 10μM、Cy5-Rani 1μM，溶于市售雷珠單抗注射液溶劑中，均與細胞37℃共孵育後(289WP-FAM/Cy5-Rani組，兩者混合4℃孵育24h後與細胞共孵育1.5h；289WP-FAM,Cy5-Rani組，289WP-FAM與細胞共孵育1.5h，棄去，Cy5-Rani繼續與細胞共孵育1.5h；289WP-FAM+Cy5-Rani組，兩者混合後立即與細胞共孵育1.5h)進行流式檢測(FAM，Ex 488nm/Em 520nm；Cy5，Ex 638nm/Em 660 nm)。採用One-Way ANOVA檢驗進行顯著性分析，以Tukey’s檢驗校正(n=3,ns p>0.05,***p<0.001)。
圖10為多肽/抗體在ARPE-19細胞中同步攝取行為。其中，A為FAM標記多肽289WP(289WP-FAM)的細胞攝取平均螢光強度。B為Cy5標記雷珠單抗(Cy5-Rani)的細胞攝取平均螢光強度。C為289WP-FAM和Cy5-Rani的細胞同步攝取流式圖。各組合物均含289WP-FAM 10μM、Cy5-Rani 1μM，溶于市售雷珠單抗注射液溶劑中，均與細胞37℃共孵育後(289WP-FAM/Cy5-Rani組，兩者混合4℃孵育24h後與細胞共孵育1.5h；289WP-FAM,Cy5-Rani組，289WP-FAM與細胞共孵育1.5h，棄去，Cy5-Rani繼續與細胞共孵育1.5h；289WP-FAM+Cy5-Rani組，兩者混合後立即與細胞共孵育1.5h)進行流式檢測(FAM，Ex 488nm/Em 520nm；Cy5，Ex 638nm/Em 660nm)。採用One-Way ANOVA檢驗進行顯著性分析，以Tukey’s檢驗校正(n=3,ns p>0.05,*p<0.05,***p<0.001)。
結果表明，對於多肽(289WP-FAM)細胞攝取，在HCEC細胞中，各組細胞平均螢光強度值無顯著性差異，而在ARPE-19細胞中，對於289WP-FAM細胞攝取，組合物溶液組平均螢光強度是游離多肽的9/10，其餘組則與游離多肽無顯著性差異，表明單獨給以多肽或將多肽與抗體組合後給藥，兩種細胞對於多肽289WP-FAM攝取均變化不大，抗體對多肽細胞攝取基本無影響。而與游離抗體相比，組合物溶液組(289W-FAM/Cy5-Rani)、分步攝取組(289WP-FAM,Cy5-Rani)、新鮮混合組(289WP-FAM+Cy5-Rani)在HCEC細胞中攝取平均螢光強度分別是其23.2倍、12.6倍、21.3倍(p<0.001)，而對於ARPE-19細胞，混合溶液組、分步攝取組、新鮮混合組平均螢光強度值分別是游離抗體的7.4倍、 5.3倍、6.2倍(p<0.001)，表明多肽與抗體同步給藥，或先以多肽處理細胞，繼之給以抗體，均可大幅改善抗體細胞攝取效果(p<0.001)，但同步給藥優於分步給藥(p<0.001)。
實施例9. 多肽/雷珠單抗組合物的細胞內吞機制
在不同溫度或添加內吞抑制劑條件下，採用流式細胞術考察多肽289WP與雷珠單抗組合物的細胞內吞機制，結果如圖11所示。
圖11為多肽/雷珠單抗組合物的細胞攝取機制。其中，A和B分別為溫度和內吞抑制劑對組合物中多肽和雷珠單抗在HCEC細胞、ARPE-19細胞中攝取的影響。無抑制條件下289WP-FAM或組合物(Mixture)中Cy5-Rani攝取量作為對照(100%)。採用單尾ANOVA分析顯著性差異，Dunnett’s檢驗做校正(樣本數3，ns p>0.05,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
結果表明，對於組合物中289WP-FAM的細胞攝取，與對照組相比(289WP-FAM，細胞攝取率為100%)，在HCEC細胞中，4℃或添加抑制劑氯丙嗪、高滲蔗糖、Dynasore(抑制動力蛋白的GTP酶活性)條件下289WP-FAM細胞攝取降幅明顯，細胞攝取率分別為23.3%、53.2%、54.4%、49.4%，在ARPE-19中也有類似結果，對應細胞攝取率分別為34.3%、55.8%、70.1%、47.8%，表明在兩種細胞中，289WP主要是通過能量依賴、網格蛋白介導的內吞途徑進入細胞。而對於雷珠單抗細胞攝取，與對照組相比(Mixture，細胞攝取率為100%)，在HCEC細胞中，4℃或添加抑制劑氯丙嗪、高滲蔗糖、Dynasore條件下Cy5-Rani細胞攝取率顯著下降，細胞攝取率分別為40.6%、37.8%、35.2%、24.4%，在ARPE-19細胞中也有類似結果，對應細胞攝取率分別為79.6%、63.0%、75.7%、31.4%。
實施例10. 多肽介導納米抗體的無創眼內遞送
首先，對納米抗體進行螢光標記。取1mg脫鹽納米抗體(等電點9.6，分子量13kD)溶於600μL碳酸緩衝溶液(10mM，pH9.0)，於4℃預冷，然後滴入異硫氰酸螢光素(FITC)溶液(0.53mg FITC溶於53μL DMSO)，4℃反應24h，反應結束後4℃透析(MWCO 2kD)除去過量FITC及無機鹽，凍幹得FITC標記納米抗體。
隨後，通過如下方法研究多肽/納米抗體組合物在小鼠眼內的分佈。精密稱取FITC標記納米抗體1.0mg溶於120μL生理鹽水，取出60μL與0.5mg穿膜肽89WP混勻，4℃放置24h後使用，作為多肽/納米抗體組合物，剩餘60μL作為游離納米抗體滴眼液。
小鼠右眼給藥，每5min給一次藥，共3次，每次給藥5μL。其中，游離納米抗體(Nb)溶液含FITC標記納米抗體(綠色)濃度為8.33μg/μL，多肽/納米抗體混合溶液含多肽89WP、FITC標記納米抗體濃度均為8.33μg/μL。最後一次給藥結束後1h處死小鼠，用40mL生理鹽水做心臟灌流，摘取眼球，生理鹽水沖洗，FAS眼球固定液中固定24h，15%、30%蔗糖溶液梯度脫水，做眼球橫截面冰凍切片，採用DAPI染色，在鐳射共聚焦顯微鏡下觀察螢光信號分佈。
滴眼後納米抗體在各眼組織中分佈的半定量分析的結果如下。表6、表7和表8為滴眼給藥後納米抗體在小鼠角膜、角鞏膜緣、視網膜部位分佈量的比較。
表6為滴眼後納米抗體的眼角膜分佈。游離抗體滴眼組或多肽/納米抗體溶液滴眼組給藥劑量均為125μg螢光標記納米抗體/眼。採用ImageJ軟體計算角膜區域平均綠色螢光強度值(FITC標記的納米抗體呈綠色螢光)。結果 顯示，與游離納米抗體比較，89WP/納米抗體組合物滴眼給藥，使納米抗體在角膜部位的分佈量增加了3.1倍。
表6 滴眼給藥後納米抗體在小鼠眼角膜分佈螢光信號強度比較
Figure 110130085-A0101-12-0027-10
*與游離抗體滴眼組相比，平均螢光強度增加的倍數。
表7為滴眼後納米抗體的角鞏膜緣分布。游離抗體滴眼組或多肽/納米抗體溶液滴眼組給藥劑量均為125μg螢光標記納米抗體/眼。採用ImageJ軟體計算角鞏膜緣區域平均綠色螢光強度值(FITC標記的納米抗體呈綠色螢光)。結果顯示，與游離納米抗體比較，89WP/納米抗體組合物滴眼給藥，使納米抗體在角鞏膜緣部位的分佈量增加了3.5倍。
表7 滴眼給藥後納米抗體在小鼠角-鞏膜緣分布螢光信號強度比較
Figure 110130085-A0101-12-0027-11
*與游離抗體滴眼組相比，平均螢光強度增加的倍數。
表8為滴眼後納米抗體的視網膜分佈。游離抗體滴眼組或多肽/納米抗體溶液滴眼組給藥劑量均為125μg螢光標記納米抗體/眼。採用ImageJ軟體計算視網膜區域平均綠色螢光強度值(FITC標記的納米抗體呈綠色螢光)。結果顯示，與游離納米抗體比較，89WP/納米抗體組合物滴眼給藥，使納米抗體在視網膜部位的分佈量增加了4.1倍。
表8 滴眼後納米抗體小鼠視網膜分佈螢光信號強度比較
Figure 110130085-A0101-12-0028-12
*與游離抗體滴眼組相比，平均螢光強度增加的倍數。
上述眼組織的綠色螢光信號半定量分析結果表明，滴眼給藥後1h，在角膜、角鞏膜緣鄰接視網膜、眼底視網膜區域，多肽/納米抗體溶液滴眼組綠色螢光信號強度均顯著強於游離抗體滴眼組(p<0.01)，表明納米抗體溶液中加入多肽89WP，可以顯著增加滴眼給藥後納米抗體眼內吸收，特別在眼底視網膜分佈顯著增加。
實施例11. 多肽/雷珠單抗組合物滴眼給藥後在家兔眼內的分佈
首先，製備多肽/雷珠單抗(Rani)溶液。取一定量市售雷珠單抗注射液(10mg/mL)，用市售產品溶劑等體積稀釋至5mg/mL，用所得溶液溶解R8至4.0mg/mL得R8/Rani混合溶液，或溶解89WP至7.4mg/mL得89WP/Rani混合溶液，4℃儲存備用，使用前至少於4℃孵育24h，並在室溫靜置1h。
市售雷珠單抗注射液溶劑處方組成：10mM組氨酸鹽酸鹽，10% α,α-海藻糖，0.01%吐溫20，pH5.5。
隨後，確定給藥及取組織樣本方案。
選擇1kg左右健康雄性家兔，實驗前進行眼科檢查確保眼睛正常，實驗過程遵循實驗動物倫理規範。家兔每隻眼滴入30μL藥液，含雷珠單抗150μg/眼。給藥後1h取組織樣本。
取樣時，採用安樂死處死家兔，立即由心臟取血1mL左右，加到1.5mL抗凝管中，4℃、2500g離心15min，取上清，-20℃保存備用；分別抽取房水、玻璃體于EP管中，-20℃保存備用；分離視網膜組織，4℃、2500g離心10min，棄上清，10mM PBS洗2次，稱重，採用總蛋白提取試劑盒抽提組織總蛋白於10mM PBS中，-20℃保存備用。
基於如下步驟建立ELISA檢測方法。
1)抗原包被：用包被液(0.05M碳酸鹽緩衝液，pH9.6)將hVEGF-A165稀釋至1μg/mL，將稀釋好的抗原包被液於每個酶標板孔中加入100μL，封板後置於4℃包被過夜。
2)洗板：棄去抗原包被液，用洗滌液(0.02M磷酸鹽緩衝液，pH7.4，含0.05%吐溫20)加滿所有包被孔，靜置30s後扣幹，重複6次。
3)封閉：在酶標板每孔加入250μL封閉液，封板後4℃孵育過夜。
4)棄去封閉液，洗板同上。
5)孵育一抗(含雷珠單抗樣品)：取樣品各100μL加入酶標孔，封板後37℃孵育1h。
6)棄去一抗溶液，洗板同上。
7)孵育二抗：各孔加入稀釋倍數為1：400的HRP標記二抗(F(ab')2-Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,HRP)100μL，封板後37℃孵育1h。
8)棄去二抗溶液，洗板同上。
9)顯色：每孔加入TMB溶液200μL，封板後37℃避光顯色3min，每孔加終止液(2M硫酸溶液)50μL。
10)檢測：終止後10min內於酶標儀測定各孔OD450nm值，以樣品濃度為橫坐標，以OD450nm值為縱坐標做標準曲線，據此計算各樣品含雷珠單抗濃度。
隨後測定雷珠單抗的組織濃度。準備已包被抗原(hVEGF-A165)ELISA板及提取組織(血漿、房水、玻璃體、視網膜總蛋白提取液)，重複上述步驟5)至步驟10)，同時做樣品隨行檢測標曲，計算雷珠單抗組織濃度。
通過ELISA法檢測雷珠單抗的組織濃度的結果如下。以樣品濃度對應吸光度值做標準曲線。給定濃度範圍內(5-120ng/mL)，ELISA檢測OD450nm值與樣品濃度線性關係較好(R2>0.98)，在該濃度範圍內，採用ELISA法檢測雷珠單抗濃度方法可行。
雷珠單抗在眼組織中的分佈如下。滴眼給藥後1h，兔眼各組織雷珠單抗濃度如圖12所示。
圖12為滴眼給藥1h後兔體內各組織(血漿、房水、玻璃體、視網膜)雷珠單抗濃度。陰影區域為文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)。採用單尾ANOVA分析顯著性差異，Tukey’s檢驗做校正(ns p>0.05,*p<0.05,**p<0.01，與Rani組相比)。
結果表明，對於游離雷珠單抗滴眼組(Rani)，給藥後1h，兔眼房水、玻璃體、視網膜藥物濃度幾乎測不出，遠低於文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)；對於R8/Rani溶液組，經滴眼給藥，在房水中未達到有效治療濃度，在玻璃體達到有效治療濃度下限，在視網膜組織濃度可達到有效治療濃度，優於游離雷珠單抗組(p=0.0377)；對於89W/Rani複合物組，經滴眼給藥，在房水未達到有效治療濃度，在玻璃體和視網膜組織可達到有效治療濃度，顯著優於游離雷珠單抗組(p=0.0025)。
實施例12. 多肽/雷珠單抗組合物滴眼給藥後在家兔體內的藥動學
首先，製備滴眼液。製備多肽/雷珠單抗組合物，取一定量市售雷珠單抗注射劑(10mg/mL)，用市售產品溶劑等體積稀釋至5mg/mL，用所得溶液溶解29WP至2.48mg/mL得組合物29WP/Rani，或溶解289WP至2.54mg/mL得組合物289WP/Rani，4℃儲存備用，使用前至少於4℃孵育24h，並在室溫靜置1h。
隨後，確定給藥及取樣方案。選擇1kg左右健康雄性家兔，實驗前進行眼科檢查確保眼睛正常，實驗過程遵循實驗動物倫理規範。家兔每隻眼滴入30μL不同組合物溶液，含雷珠單抗150μg/眼。給藥後1h、4h、8h、12h、24h分別取眼組織樣品。
接著，測定雷珠單抗的組織濃度。準備已包被抗原(hVEGF-A165)ELISA板及提取組織(血漿、房水、玻璃體、視網膜總蛋白提取液)，重複實施例11中的建立ELISA檢測方法中的步驟5)至步驟10)，同時做樣品隨行檢測標曲，計算雷珠單抗組織濃度。
結果如下：給定濃度範圍內(5-120ng/mL)，ELISA檢測OD450nm值與雷珠單抗樣品濃度線性關係較好(R2>0.98)，在該濃度範圍內，採用ELISA法檢測雷珠單抗濃度方法可行。
多肽/雷珠單抗組合物滴眼後兔體內藥動學行為。採用ELISA法檢測滴眼給藥後多肽介導雷珠單抗在兔體內各組織分佈，結果如圖13、表9所示。
圖13為滴眼給藥後多肽/雷珠單抗組合物在兔體內的濃度分佈變化。其中，給藥劑量：289WP/Rani組合物組含289WP 76.2μg/眼、雷珠單抗150μg/眼；29WP/Rani組合物組含29WP 74.4μg/眼、雷珠單抗150μg/眼；Rani組含雷珠單抗150μg/眼。檢測給藥後1h、4h、8h、12h、24h雷珠單抗組織濃度。陰影區域為文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)。採用單尾ANOVA分析顯著性差異，Tukey’s檢驗做校正(ns p>0.05,*p<0.05,**p<0.01，與Rani組相比)。
表9 滴眼給藥後多肽介導雷珠單抗兔體內濃度分佈(ng/mL or ng/g)。
Figure 110130085-A0101-12-0032-13
結果表明，藥物經眼表滴入後可能存在全身吸收，以血漿中雷珠單抗濃度表徵雷珠單抗全身分佈行為，給藥後1h，289WP/Rani組合物組雷珠單抗血漿濃度為17.2±1.4ng/mL，29WP/Rani組合物組為21.7±9.2ng/mL，達到文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)，而Rani組滴眼給藥1h後在血液中未檢出雷珠單抗，給藥後4h，289WP/Rani組合物組及29WP/Rani組合物組血漿濃度降至0.9±0.9ng/mL、14.0±5.0ng/mL，給藥後8h，各組雷珠單抗血漿濃度基本為0，表明滴眼給藥後，多肽介導雷珠單抗存在一定全身吸收，但給藥後4h雷珠單抗血漿濃度大幅下降，8h後基本清除完畢。對於房水中雷珠單抗含量，給藥後1h和4h，289WP/Rani組合物組及29WP/Rani組合物組雷珠單抗濃度處於文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)範圍內(9.0-28.8ng/mL)，前者略高，而Rani組給藥後1h房水中雷珠單抗濃度僅為1.7ng/mL，表明雷珠單抗單獨滴眼後難以在房水中達到有效治療濃度。對於玻璃體內雷珠單抗濃度，僅289WP/Rani組合物組滴眼後1h可達到文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)(27.0±7.8ng/mL)。以視網膜中雷珠單抗濃度表徵抗體向病灶部位分佈，給藥後1h、4h及8h，289WP/Rani組合物組雷珠單抗視網膜濃度分別為107.1±55.4ng/g、63.4±43.6ng/g、21.9±4.4ng/g，均值分別為游離抗體組的20.6、12.2、4.2倍(p<0.05)，並且高於或處於文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)濃度範圍內，表明單次滴眼給藥後8h內，289WP/Rani組合物可維持視網膜中的雷珠單抗處於有效濃度範圍內，而29WP/Rani組合物滴眼給藥後1-8h，視網膜濃度在13.7-35.8ng/g，也可達到文獻報導的雷珠單抗半數有效濃度(EC50)，但濃度偏低，持續時間較短，表明29WP眼內遞送雷珠單抗效果不如289WP。同時考慮到多肽/雷珠單抗組 合物滴眼給藥後，雷珠單抗視網膜濃度>玻璃體或房水中濃度，因此推斷多肽介導雷珠單抗到達視網膜可能是通過結膜→鞏膜→脈絡膜→視網膜途徑吸收。
實施例13. 多肽/阿柏西普組合物滴眼給藥後在家兔體內的藥動學
首先，製備滴眼液。製備多肽/阿柏西普組合物，採用市售阿柏西普注射液溶劑稀釋阿柏西普(40mg/mL)至20mg/mL，取此溶液溶解多肽289WP至6.16mg/mL，4℃儲存備用，使用前至少於4℃孵育24h，並在室溫靜置1h。
市售阿柏西普注射液溶劑處方組成：10mM磷酸鹽緩衝溶液，40mM氯化鈉，0.03%吐溫20，5%蔗糖，pH6.2。
其次，確定給藥及取樣方案。選擇1kg左右健康雄性家兔，實驗前進行眼科檢查確保眼睛正常，實驗過程遵循實驗動物倫理規範。家兔每隻眼滴入30μL不同組合物溶液，含阿柏西普600μg/眼。給藥後1h取眼組織樣品。
隨後，測定阿柏西普組織濃度。準備已包被抗原(hVEGF-A165)ELISA板及提取組織(血漿、房水、玻璃體、視網膜總蛋白提取液)，重複實施例11中的建立ELISA檢測方法中的步驟5)至步驟10)，同時做樣品隨行檢測標曲，計算阿柏西普組織濃度。
結果如下：給定濃度範圍內(0-156.25ng/mL)，ELISA檢測OD450nm值與阿柏西普樣品濃度線性關係較好(R2>0.98)，在該濃度範圍內，採用ELISA法檢測阿柏西普濃度方法可行。
採用ELISA法檢測滴眼給藥後多肽介導阿柏西普在兔體內各組織分佈，結果如圖14所示。
圖14為滴眼給藥後多肽/阿柏西普溶液在兔體內的濃度分佈。其中，給藥劑量：Afli組含阿柏西普600μg/眼；289WP/Afli組合物組含289WP 184.8 μg/眼、阿柏西普600μg/眼。檢測給藥後1h阿柏西普組織濃度。採用雙尾非配對t檢驗分析顯著性差異(ns p>0.05,*p<0.05)。
結果表明，給藥後1h，游離阿柏西普組或289WP/Afli組合物組血漿中均未檢出阿柏西普。與Afli組相比，289WP/Afli組合物滴眼後房水(p<0.05)、玻璃體中阿柏西普濃度略高，而視網膜濃度達到237.6±162.2ng/g，顯著高於Afli組(p<0.05)，表明多肽289WP可顯著改善阿柏西普的眼部吸收。與多肽/雷珠單抗滴眼液類似，阿柏西普可能經結膜→鞏膜→脈絡膜→視網膜途徑吸收。
上述實驗證明，與僅使用所述生理pH條件下帶正電荷的藥物的情況比較，所述組合物使得細胞攝取顯著增加。通過本發明的組合物，能夠介導所述生理pH條件下帶正電荷的藥物高效地透過眼部的吸收屏障，促進藥物進入眼內並到達眼後段，進而提高生理pH條件下帶正電荷的藥物的眼部生物利用度，顯著促進了生理pH條件下帶正電荷的藥物的細胞攝取。

Claims (19)

  1. 一種用於治療眼部疾病的組合物，該組合物包括：
    (i)生理pH條件下帶正電荷的藥物，和
    (ii)野生型穿膜肽penetratin的衍生物，所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物具有下述氨基酸序列：
    RX1IKIWFX2X3RRMKWKK
    其中，X1、X2和X3代表疏水性氨基酸，選自天然來源的氨基酸丙氨酸(alanine，A)、纈氨酸(valine，V)、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、脯氨酸(proline，P)、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、色氨酸(tryptophan，W)、甲硫氨酸(methionine，M)和非天然來源的氨基酸α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)、α-氨基戊酸(α-aminopentanoic acid)、α-氨基己酸(α-aminohexanoic acid)、α-氨基庚酸(α-aminoheptanoic acid)，以及它們的組合。
  2. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中所述組合物是溶液或混懸液。
  3. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其特徵在於，其中，X1、X2和X3代表疏水性氨基酸，X1、X2和X3中的至少兩個選自天然來源的氨基酸丙氨酸(alanine，A)、纈氨酸(valine，V)、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、脯氨酸(proline，P)、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、色氨酸(tryptophan，W)、甲硫氨酸(methionine，M)和非天然來源的氨基酸α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)、α-氨基戊酸(α-aminopentanoic acid)、 α-氨基己酸(α-aminohexanoic acid)、α-氨基庚酸(α-aminoheptanoic acid)，以及它們的組合。
  4. 根據請求項1用於治療眼部疾病的組合物，其特徵在於，X1、X2或X3為色氨酸(tryptophan，W)。
  5. 根據請求項1用於治療眼部疾病的組合物，其特徵在於，X1、X2或X3中的至少兩個為色氨酸(tryptophan，W)。
  6. 根據請求項1用於治療眼部疾病的組合物，其特徵在於，所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物的氨基酸序列為：
    RWIKIWFQNRRMKWKK
    RQIKIWFWNRRMKWKK
    RQIKIWFQWRRMKWKK
    RWIKIWFWNRRMKWKK
    RWIKIWFQWRRMKWKK
    RQIKIWFWWRRMKWKK
    RWIKIWFWWRRMKWKK。
  7. 根據請求項1用於治療眼部疾病的組合物，其特徵在於，所述野生型穿膜肽penetratin的衍生物的氨基酸序列為：
    RWIKIWFWNRRMKWKKK
    RWIKIWFQWRRMKWKKK
    RQIKIWFWWRRMKWKKK
    RWIKIWFWWRRMKWKK。
  8. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中所述藥物為多肽或蛋白類藥物。
  9. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中所述藥物選自以下的一種或多種：納米抗體(Nanobody)、雷珠單抗(Ranibizumab)、阿柏西普(Aflibercept)、奧克纖溶酶(Ocriplasmin)、貝伐單抗(Bevacizumab)、阿達木單抗(Adalimumab)、阿特珠單抗(Atezolizumab)、貝利木單抗(Belimumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、達洛珠單抗(Dalotuzumab)、地諾單抗(Denosumab)、埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)、英夫利昔單抗(Infliximab)、伊匹單抗(Ipilimumab)、伊奇珠單抗(Ixekizumab)、那他珠單抗(Natalizumab)、NIST單抗(NISTmab)、納武單抗(Nivolumab)、奧濱尤妥珠單抗(Obinutuzumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、帕利珠單抗(Palivizumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、利妥昔單抗(Rituximab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)和內皮抑素(Endostatin)。
  10. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中所述藥物選自以下的一種或多種：納米抗體、雷珠單抗、阿柏西普、奧克纖溶酶、貝伐單抗和西妥昔單抗。
  11. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中所述藥物選自以下的一種或多種：雷珠單抗、阿柏西普和貝伐單抗。
  12. 根據請求項9所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中所述納米抗體選自以下的一種或多種：卡帕珠單抗(Caplacizumab)、奧索拉珠單抗(Ozoralizumab)和伏巴厘珠單抗(Vobarilizumab)。
  13. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為0.1：1-50：1。
  14. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為0.5：1-35：1。
  15. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為1：1-20：1。
  16. 根據請求項1所述的用於治療眼部疾病的組合物，其中野生型穿膜肽penetratin的衍生物與所述藥物的比例為摩爾比為3：1-15：1。
  17. 一種為需要的受試者治療眼部疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的根據請求項1-16中任一項所述的用於治療眼部疾病的組合物。
  18. 根據請求項2所述的方法，其中所述方法包括將治療有效量的根據請求項1-16中任一項所述的組合物給患者滴眼給藥。
  19. 根據請求項1-16中任一項所述的組合物在製備用於治療眼部疾病的藥物中的用途。
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