JP2023536132A - 特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド及びそれらを含む医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、９～１０個つながったアミノ酸から合成された特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドであって、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）からなるアミノ酸配列を含む。それにより、本発明の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、特発性肺線維症により線維化が進行した肺組織を根本的に治療して肺機能性を正常なレベルに回復させ、さらに特発性肺線維症の発症を遅らせたり防いだりすることができる。【選択図】図１
Description
本発明は、特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド及びそれらを含む医薬組成物に関する。
特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、肺間質組織に原因不明の炎症が繰り返し発生し、永久的な瘢痕化や組織線維化をもたらし、肺組織の構造的変化を誘発することで、肺機能が低下し、死亡につながる致命的な疾患である。
このような特発性肺線維症は、原因不明の稀な疾患であり、運動時の呼吸困難が主な症状で、症状が進行するにつれて呼吸困難が悪化し、肺の炎症と線維化が、気道と肺を刺激し、頻繁な空咳につながる。
やはり呼吸困難がひどくなると、低酸素症になるだけでなく、指先が丸くなるばち指（クラビング）症状が現れることもある。
現在、特発性肺線維症に有効性が証明され、直接治療薬として承認された薬剤はないが、ピルフェニドンやニンテダニブなどの薬剤が使用されており、これらの薬は、疾患の進行を遅らせる効果があることが証明されているものの、完治には至らないという限界がある。
この他に、特発性肺線維症の治療用医薬組成物の従来技術に対応する先行文献には、大韓民国登録特許第１０－１８４５８６２号公報の「特発性肺線維症の治療または予防のための医薬組成物」（以下、「従来技術」という）がある。
しかし、従来技術を含む既存の特発性肺線維症の治療のために調製された医薬組成物の場合、部分的な治療効果しか得られなかったり、効果が得られる程度が微々たるもので有意性がなかったりして、肺線維症の発症や進行を遅らせたり治療したりする根本的効果が得られないという問題があった。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、特発性肺線維症により線維化が進行した肺組織を根本的に治療して肺機能性を正常なレベルに回復させ、さらに特発性肺線維症の発症を遅らせたり防いだりできる特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドを提供することである。
上記目的を達成するために、本発明に係る特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、９～１０個つながったアミノ酸から合成された特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドであって、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、 Ｓｅｒｉｎｅ ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）からなるアミノ酸配列を含む。
ここで、前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－システイン（Ｃ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第２ポリペプチド、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第３ポリペプチド、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕｃｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第４ポリペプチド、及びアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－リジン（Ｋ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第５ポリペプチド、のうちの１つであってもよい。
また、前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、１０３５～１２００Ｄａの分子量を有し、前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の末端にあるアミノ酸は、カルボキシル基－ＣＯＯＨが－ＣＯＮＨ２に変換された形態を有していてもよい。
さらに、前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、予防または治療対象の肺組織内のコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）及びα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ：α－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）の少なくとも１つの発現を減少させ得る。
さらにまた、前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、病変内投与または気道内投与用に製剤化されてもよい。
一方、上記目的を達成するために、本発明に係る特発性肺線維症の予防または治療用医薬組成物は、前述の特徴を有する特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドを有効成分として含有する。
また、上記目的を達成するために、本発明は、別の態様として、前述の特徴を有する特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を提供する。
本発明によれば、次のような効果がある。
第一に、特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドにより、特発性肺線維症に作用する線維化の指標を低下させる効果を示すことにより、特発性肺線維症の改善効果を提供することができる。
第二に、特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドにより、特発性肺線維症の治療対象となる肺組織における線維化の指標であるコラーゲン及びα－ＳＭＡ（α－平滑筋アクチン）の発現を、著しく低下させることができる。
第三に、生体適合性に優れ、副作用の少ないだけでなく、大量生産及び品質管理が容易な特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド及びそれらを含む医薬組成物を提供することができる。
第四に、特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドにより、肺線維症はもとより、肝線維症や腎臓線維症などの類似疾患を予防または治療するためにも使用することができる。
以下、添付図面を参照して本発明の好適な実施形態についてより具体的に説明するが、説明を簡潔にするために、既に周知の技術的部分については省略または簡略化する。
１．特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドについての説明
本発明に係る特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドの合成が行われる過程及び合成されたペプチドの構造的特徴について詳細に説明する。
本発明に係る特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドの合成が行われる過程及び合成されたペプチドの構造的特徴について詳細に説明する。
本発明に係る特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、実施形態により、９個つながったアミノ酸から合成されたポリペプチド、または１０個つながったアミノ酸から合成されたポリペプチドの形態である。
各実施形態によれば、９～１０個つながったアミノ酸から合成されたポリペプチド配列構造は、基本的に、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ）ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）からなるアミノ酸配列を含む必要がある。
言い換えれば、「ＲＧＤＶＦＰＳＹＴ」のアミノ酸配列を基にし、ＲＧＤモチーフ（ｍｏｔｉｆ）を活性部位に持ち、当該配列そのものに加えて、一番末端にあるトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）のアミノ酸の後ろにも１つのアミノ酸がさらに付加される形をとることもある。
具体的には、第１ポリペプチド形態から第５ポリペプチド形態まで、全５つの実施形態で得られ、各ペプチドを構成するアミノ酸配列の形態には多少の違いはあるものの、それによって得られる特発性肺線維症の予防または治療効果の程度はすべて十分に有意な結果を示している。
まず、第１ポリペプチドは、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－システイン（Ｃ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる「ＲＧＤＶＦＰＳＹＴＣ」構造のペプチドであり、１１４３Ｄａ～１１４４Ｄａ（最も好ましくは１１４３．４Ｄａ）の分子量を有する形態で得られる。
次に、第２ポリペプチドは、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる「ＲＧＤＶＦＰＳＹＴ」構造のペプチドであり、１１３９Ｄａ～１１４０Ｄａ（最も好ましくは１１３９．９Ｄａ）の分子量を有する形態で得られる。
また、第３ポリペプチドは、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる「ＲＧＤＶＦＰＳＹＴＲ」構造のペプチドであり、１１９５Ｄａ～１１９７Ｄａ（最も好ましくは１１９６Ｄａ）の分子量を有する形態で得られる。
また、第４ポリペプチドは、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕｃｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる「ＲＧＤＶＦＰＳＹＴＬ」構造のペプチドであり、１１５２Ｄａ～１１５４Ｄａ（最も好ましくは１１５３Ｄａ）の分子量を有する形態で得られる。
最後に、第５ポリペプチドは、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－リシン（Ｋ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓｉｎｅ）アミノ酸配列からなる「ＲＧＤＶＦＰＳＹＴＫ」構造のペプチドであり、１１６８Ｄａ～１１６９Ｄａ（最も好ましくは１１６８．２Ｄａ）の分子量を有する形態で得られる。
ここで、第１ポリペプチド～第５ポリペプチドのうちの１つの実施形態で得られる特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いて設定された配列に合わせて合成して９０％以上の純度を示すように得られる。
このように９０％以上の純度を示すように精製された第１ポリペプチド～第５ポリペプチドのうちの１つの実施形態で得られる特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、質量分析法（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による分子量が１０３５～１２００Ｄａであることを確認する。
さらに、第１ポリペプチド～第５ポリペプチドのうちの１つの実施形態で得られる特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、吸収率を高めるために、アミノ酸配列の末端にあるアミノ酸のカルボキシル基「－ＣＯＯＨ」を「－ＣＯＮＨ２」に変換した。
例えば、第１ポリペプチドは「Ｃ」、第２ポリペプチドは「Ｔ」、第３ポリペプチドは「Ｒ」、第４ポリペプチドは「Ｌ」、第５ポリペプチドは「Ｋ」に該当するアミノ酸のカルボキシル基「－ＣＯＯＨ」を「－ＣＯＮＨ２」に変換することで吸収率を向上させた。
このような本発明の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、特発性肺線維症の予防または治療に用いられる医薬組成物の主な有効成分として使用することができる。
また、本発明の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド及びそれを主な有効成分として含む医薬組成物は、病変内投与、気道内投与、静脈内投与、または特定の組織（肺組織）内への投与のために製剤化されてもよい。
２．特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドの効果検証試験結果についての説明
本発明の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドに関連して、当該ペプチドに起因する特発性肺線維症の予防または治療の効果レベルの検証を試験により確認し、当該試験は、当業界における技術者にとって自明な手段による性質などを定義する目的で下記の実験方法が用いられた。
本発明の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドに関連して、当該ペプチドに起因する特発性肺線維症の予防または治療の効果レベルの検証を試験により確認し、当該試験は、当業界における技術者にとって自明な手段による性質などを定義する目的で下記の実験方法が用いられた。
（１）特発性肺線維症動物モデルの作製及び実験設計
まず、１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）を気管内に点滴注入して急性特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）誘導動物モデルを作製する。
まず、１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）を気管内に点滴注入して急性特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）誘導動物モデルを作製する。
具体的には、１０週目のＣ５７ＢＬ／６マウスに２％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて機械的人工換気 （Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ）で麻酔させた後、麻酔したマウスの口を開け、視野内の気道を確保するために舌を可能な限り前方に伸ばした後、肺線維症誘導物質であるブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）を、２ｍｇ／ｋｇを基準に気道に投与した（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１７；１６２７：２７－４２）。
その後、図１に示すように、１週間経過した時点で急性特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）誘導動物モデルマウスをランダムに選別してＰＢＳ注入群（ｎ＝６）及びペプチド注入群（ｎ＝６、１００μｇ／ｋｇ）に分類し、急性特発性肺線維症の誘発が進行していない１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）の動物モデルは、正常対照群として溶媒（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のみを投与されたＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎ＝６））に分類された。
ここで、ＰＢＳ注入群（ｎ＝６）及びペプチド注入群（ｎ＝６、１００μｇ／ｋｇ）は、それぞれＰＢＳ及びペプチドを１００μｇ／ｋｇの濃度基準でそれぞれ気道投与（Ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ）を用いて動物に投与した（Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００１ Ｊｕｎ；１６３（７）：１６６０－８）。
また、注入されたペプチドは、前述の第１ポリペプチド形態から第５ポリペプチド形態まで別々に注入されることで、各実施形態別試験結果を比較することができる。
具体的には、ペプチド注入群のうち、第１ポリペプチドを注入した場合を「ＮＰＴ－００２１」、第２ポリペプチドを注入した場合を「ＮＰＴ－００２２」、第３ポリペプチドを注入した場合を「ＮＰＴ－００２３」、第４ポリペプチドを注入した場合を「ＮＰＴ－００２４」、第５ポリペプチドを注入した場合を「ＮＰＴ－００２５」とそれぞれ称する。
次に、物質注入時点から３日目に、図１に示すように肺組織を摘出し、下記の組織化学的分析を行い、後述する評価及び試験方法による結果は、平均±標準誤差（ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ）で表した。統計学的有意性のためには一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を使用し、事後検定としてはシェッフェ（Ｓｃｈｅｆｆｅ）の方法を採用した。
（２）特発性肺線維症動物モデルのアシュクロフトスコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ Ｓｃｏｒｅ）評価
前述のように３つの試験群に分けて評価を行い、ペプチド注入群は、第１ポリペプチド形態から第５ポリペプチド形態までの全ての形態を分類して個別に評価結果を導き出した。
前述のように３つの試験群に分けて評価を行い、ペプチド注入群は、第１ポリペプチド形態から第５ポリペプチド形態までの全ての形態を分類して個別に評価結果を導き出した。
各試験群の動物モデルを麻酔させた後、肺組織を摘出し、全５個葉の肺組織のうち、左葉１個を摘出後すぐにタンパク質抽出のために液体窒素中に保存し、残りの４個葉は４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ：ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液で１日間冷蔵保存した。その後、パラフィンブロックを作製し、切片機（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて厚さ２０μｍに切り出し、スライド（シランコートスライド：ｓｉｌａｎｅ ｃｏａｔｅｄ ｓｌｉｄｅ）に貼り付けた。
このようにして得られた各試験群の肺組織切片をキシレン（Ｘｙｌｅｎｅ）で脱パラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、脱水（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）後、Ｈ＆Ｅ染色を行った。これに用いた染色試薬は、Ｈ＆Ｅ染色キット（ヘマトキシリンおよびエオシン：Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ）（ａｂ２４５８８０）である。
その後、マウンティング溶液を用いてカバースリップで封入した。染色された組織スライドは、顕微鏡下で図２のような結果画像（ｉｍａｇｅ）を得、肺組織における炎症反応と肺胞細胞の形態学的特徴及び構造的様相を評価するために、免疫組織化学分析を行うためのアシュクロフトスコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ Ｓｃｏｒｅ）を測定して図３のような結果を導き出した。
まず、図２を参照する。特発性肺線維症誘導後、ＰＢＳを気道投与した群（ＩＰＦ対照群）とペプチド注入群（ＮＰＴ－００２１～ＮＰＴ－００２５）を気道注入し、線維化の程度を比較した。
結果として、図２から、特発性肺線維症誘導後の全てのペプチド注入群（ＮＰＴ－００２１～ＮＰＴ－００２５）は、統計学的に有意な程度まで線維化の程度が改善されたことが確認できた。
これを数値的に裏付けるために実施したアシュクロフトスコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ Ｓｃｏｒｅ）評価の結果である図３を見ると、やはりＰＢＳ注入群（ｎ＝６）とは異なり、すべてのペプチド注入群（ＮＰＴ－００２１～ＮＰＴ－００２５）のアシュクロフトスコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ Ｓｃｏｒｅ）が相対的に低く、肺線維化の程度が改善していることが確認できた（＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊Ｐ＜０．０５）
（３）特発性肺線維症動物モデルのコラーゲン及びα－ＳＭＡ発現検査
次に、各試験群の動物モデルを麻酔させた後、肺組織を摘出し、全５個葉の肺組織のうちタンパク質抽出のために液体窒素中に保存された１つの左葉を切り取り、溶解（ｌｙｓｉｓ）してウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行った。その結果は図４～図６に示す通りである。
次に、各試験群の動物モデルを麻酔させた後、肺組織を摘出し、全５個葉の肺組織のうちタンパク質抽出のために液体窒素中に保存された１つの左葉を切り取り、溶解（ｌｙｓｉｓ）してウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行った。その結果は図４～図６に示す通りである。
具体的には、特発性肺線維症誘導後、ＰＢＳを気道投与した群（ＩＰＦ対照群）とペプチド注入群（ＮＰＴ－００２１～ＮＰＴ－００２５）を気道注入した各個体における肺の左葉から、組織溶解緩衝液（ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてタンパク質を抽出することにより、線維症誘導中に増加する代表マーカーであるα－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）のレベル（程度）を確認する実験を行った。
実際には、図４～図６に示すように、ＰＢＳを気道投与した群（ＩＰＦ対照群）では、αＳＭＡの発現量が陰性対照群（ＮＣ（ｎ＝６））よりも多く、全てのペプチド注入群（ＮＰＴ－００２１～ＮＰＴ－００２５）では、αＳＭＡの発現量が相対的に減少していることが確認できた。
また、各試験群の動物モデルを麻酔させた後、肺組織を摘出し、全５個葉の肺組織のうち、タンパク質抽出のために液体窒素中に保存した左葉１個を除く残りの４個葉は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液で１日間冷蔵保存した。その後、パラフィンブロックを作製し、切片機（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて厚さ２０μｍに切り出し、スライド（シランコートスライド）に貼り付け、脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）過程後、抗原賦活化（Ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）過程により免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行い、コラーゲンの発現量を確認した。その結果は、図７に示すとおりである。
さらに、各試験群の動物モデル肺の４つの葉をスライドさせて、コラーゲン抗体を付着させることによって線維症誘導時に増加する代表的なマーカーの一つであるコラーゲンのレベル（程度）を確認できるように数値化した。その結果のグラフは、図８に示す通りである。
結果として、図７及び図８に示すように、ＰＢＳ気道投与群（ＩＰＦ対照群）では、コラーゲンの発現が陰性対照群（ＮＣ（ｎ＝６））よりも多く、全てのペプチド注入群（ＮＰＴ－００２１～ＮＰＴ－００２５）では、むしろコラーゲンの発現が減少していることが確認できた。
本発明に係る特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、第１ポリペプチド～第５ポリペプチドのうちの１つの実施形態で得られるので、特発性肺線維症に作用する線維化の指標としてアッシュクロフトスコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ Ｓｃｏｒｅ））の減少と肺組織の線維化の指標であるコラーゲン及びα－ＳＭＡ（α－平滑筋アクチン）の発現を著しく低下させることができ、特発性肺線維症により線維化が進行した肺組織を根本的に治療して肺機能性を正常なレベルに回復させ、さらに特発性肺線維症の発症を遅らせたり防いだりすることができる。
本発明に開示された実施形態は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく、単に説明するためのものであり、このような実施形態によって本発明の技術思想の範囲が限定されるわけではない。本発明の保護範囲は、下記の請求範囲によって解釈されるべきであり、それと同等な範囲内にあるあらゆる技術思想は、本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (8)
- ９～１０個つながったアミノ酸から合成された特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドであって、
アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）からなるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、
特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド。 - 前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－システイン（Ｃ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第２ポリペプチド、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第３ポリペプチド、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕｃｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第４ポリペプチド、及びアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ）－グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙｃｉｎｅ）－アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ、Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－バリン（Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａｌｉｎｅ）－フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）－プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏｌｉｎｅ）－セリン（Ｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒｉｎｅ）－チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）－トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）－リジン（Ｋ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓｉｎｅ）のアミノ酸配列からなる第５ポリペプチド、のうちの一つであることを特徴とする、請求項１に記載の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド。
- 前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、１０３５～１２００Ｄａの分子量を有することを特徴とする、請求項２に記載の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド。
- 前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の末端にあるアミノ酸は、カルボキシル基－ＣＯＯＨが－ＣＯＮＨ２に変換された形態を有することを特徴とする、請求項３に記載の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド。
- 前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、予防または治療対象の肺組織内のコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）及びα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ：α－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）の少なくとも１つの発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド。
- 前記特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドは、病変内投与、気道内投与または静脈内投与用に製剤化されることを特徴とする、請求項１に記載の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチド。
- 請求項１～６のいずれか一項に記載の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドを有効成分として含む、
医薬組成物。 - 請求項１～６のいずれか一項に記載の特発性肺線維症の予防または治療用ポリペプチドをコードする、
遺伝子。
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