JP2023533704A - 高濃度タンパク質製剤用の粘度低減賦形剤及びそれらの組み合わせ - Google Patents

Abstract

本発明は、低減された粘度及び／又は向上した安定性を有するタンパク質を含む液体組成物及び製剤に関するものである。さらに、本発明は、タンパク質溶液の粘度を低減させ、及び／又は安定性を向上させる方法に関する。

Description

本発明は、低減された粘度及び／又は向上した安定性を有するタンパク質を含む液体組成物及び製剤に関するものである。さらに、本発明は、タンパク質溶液の粘度を低減させ、及び／又は安定性を向上させる方法に関する。

ＦＤＡが１９８２年に最初のバイオ医薬品を認可して以来、他の多くの生物学的製剤がこれに続いている。これらのほとんどは、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）、又は、二重特異的抗体又は抗体フラグメントのような関連フォーマットである。これらの医薬品は有効性の点でユニークな機会を提供する一方で、その構造と大きさは様々な課題を提起する。

抗体及び他のタンパク質治療薬は、通常、例えば静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）又は皮下（ｓｃ）経路により非経口的に投与される。
皮下注射は、患者への投与を簡単にし（速く、少量の注射）、治療コストを削減する（より短い医療援助）可能性があるため、タンパク質治療薬の送達に特に人気が高い。
患者のコンプライアンスを確保するためには、皮下注射剤型は等張であり、少量（注射部位あたり２．０ｍｌ未満）で注入できることが望ましい。
注入量を減らすために、蛋白質はしばしば１ｍｇ／ｍｌ～１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で投与される。
同時に、ｍＡｂに基づく治療は通常数ｍｇ／ｋｇの投与を必要とする。
このように、高治療量と低注入量の組み合わせは、治療用抗体の高濃度製剤の必要性につながる。しかし、抗体は大きなタンパク質であり、複雑な三次元構造に加えて多数の官能基をもっている。このため、特に高濃度が必要な場合には、それらの製剤化が困難になる。

高濃度蛋白質溶液の主な問題の１つは粘度である。高濃度では、蛋白質は主に非本来の自己会合（non-native self-association）により高粘性溶液を形成する傾向がある。さらに、タンパク質は、このような高濃度で凝集及び粒子形成の速度が増加することを示す。

これらの問題は、製造プロセス及び患者への投与の両方に関するものである。
製造プロセスにおいて、高粘度である高濃縮タンパク質製剤は、限外ろ過及び滅菌ろ過が特に困難である。

また、タンジェンシャルフローろ過は、緩衝液の交換やタンパク質濃度の上昇のために使用されることが多い。しかしながら、粘性溶液は、注入及びろ過の間、増加した背圧及びせん断応力を示すので、治療用タンパク質は、潜在的に不安定化され、及び／又はプロセス時間が延長される。せん断応力の増加は、しばしば生成物の損失をもたらす。
どちらの側面もプロセス経済性に悪影響を及ぼす。

同時に、高粘度は、タンパク質の注入性を著しく制限するので、投与に関しては許容できない。

これらの問題を解決し、及び／又は溶液の安定性を改善するために、ショ糖及び塩化ナトリウムのような添加剤及び賦形剤を、通常、より高濃度でバイオ医薬品製剤に添加する。しかし、その結果得られる溶液は、注入力が強いために痛みを伴うことが多く、その結果、組織を損傷することがある。また、これらの薬液の中には、投与できなくなるものもあり、患者にとって治療法の選択肢を失うことにもなりかねない。

代替案として、特定の高濃度タンパク質治療薬の粘度を下げる方法として、塩類、カンファー－１０－スルホン酸、特定のアミノ酸、例えばアルギニン、ヒスチジン、リジン、プロリンなどの異なる賦形剤が検討されている。
Ｇｕｏらは、疎水性、嵩高、及び脂肪族イオン成分を有する塩が、強力な粘度低下賦形剤(viscosity-lowering excipients)として作用し得ることを示唆している（非特許文献１）。
さらに、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４及び特許文献５は、異なる粘度低減賦形剤を開示している。

ＷＯ０２／３０４６３ ＷＯ１５／１９６０９１ ＷＯ１５／１９６１８７ ＷＯ１７／０７０５０１ ＷＯ１９／２０１９０４

Guo Z. et al., Pharmaceutical Research; 2012, 29(11):3102-9

しかし、モノクローナル抗体のようなタンパク質の製剤化は、タンパク質の変性や生物活性の損失を避けるために、製剤添加物や賦形剤を慎重に選択する必要がある。さらに、賦形剤は、アレルギー反応などの好ましくない副作用を避けるため、薬学的に安全で、生理学的に適合する必要がある。

そのため、製薬業界では、特に上記のようなＮａＣｌとアミノ酸に基づく標準溶液が使用できない場合の代替物として、薬学的に許容される粘度低減賦形剤を追加することが強く求められている。

従って、解決すべき課題は、タンパク質溶液の粘度を効果的に低減させ、及び／又はその安定性を向上させることができる賦形剤を提供することである。さらに、解決すべき問題は、タンパク質溶液の粘度を効果的に低減させ、及び／又はその安定性を向上させることができる賦形剤の組合せを提供することである。さらに解決すべき別の問題は、適切な濃度で使用される多くの粘度低下賦形剤が、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼすことである。

バイオプロセスでは、溶液をチューブやクロマトグラフィーカラムに送液する必要がある。
高粘度では、カラムを通過する流量が粘度によって制限されるため、処理時間が長くなり、クロマトグラフィー中にタンパク質が著しく失われたり、タンパク質溶液が完全に処理不能になる可能性がある。
さらに、細管から細管でないカラムにコネクタを通過する際に、せん断力が発生することがある。
せん断応力は、タンパク質が変性し、凝集する可能性があり、それによってプロセスの収率を低下させる典型的な理由である。
明らかに、このようなせん断応力による凝集はプロセスの経済性に悪影響を及ぼす。
さらに、クロマトグラフィーカラム内のゲルベッド（gel bed）が高圧で損傷する可能性もある。

さらに、いくつかの蛋白質はタンジェンシャルフローろ過（tangential flow filtration）（ＴＦＦ）を通して高濃度に製剤化される。
溶液の粘度が臨界に達すると、膜の近傍にゲル状の層が形成されることがある。
特に、膜の流速（flux）が著しく低下し、処理時間が長くなるため、製造コストが大幅に上昇する。
また、前述したように、ＴＦＦ時にせん断応力が発生し、不溶性タンパク質の凝集が起こり、収量が減少することがある。

一般に、高粘性溶液はある種の粘着性を持つため、容器や配管から溶液を完全に回収したり、処理システムから物質全体を取り除いたりすることが困難であることが観察されている。このような物質の損失は、製品の歩留まりを著しく低下させ、プロセスの経済性にも明らかに悪影響を及ぼす。

さらに、解決すべき問題は、タンパク質溶液の粘度を効果的に低減させることができる賦形剤の組合せを提供することである。

さらに解決すべき別の問題は、適切な濃度で使用される多くの粘度低減性賦形剤が、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼすことである。したがって、解決すべきさらなる問題は、タンパク質溶液の粘度を効果的に低減させることができ、組み合わせと比較して同様の粘度低減をもたらす高い濃度で使用される1つの粘度低減賦形剤単独と比較して改善されたタンパク質安定性を示す賦形剤の組み合わせを提供することである。

タンパク質溶液の高粘性は、バイオプロセスにおいて多くの困難を引き起こす。対応するタンパク質溶液の粘度を低減させるためにこれまで使用されてきた既知の添加剤は、多くの場合、十分な粘度低減効果をもたらさないので、本発明の目的は、対応する粘度低下効果を改善し、プロセス経済への悪影響を低減することができる新しい可能性を見出すことである。

本発明の追加の主題は、バイオプロセスにおける液体タンパク質組成物の粘度を低減する方法であって、液体タンパク質組成物と、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸又はそれらの塩、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤とを組み合わせるステップを含む方法である。

発明の概要：
課題は、タンパク質と、
シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤と、
を含む液体組成物によって解決される。

課題は、タンパク質と、
上述の少なくとも１つの第１の粘度低下賦形剤と、
好ましくはバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤と、
を含む液体組成物によって解決される。

少なくとも２種類の粘度低減賦形剤(viscosity reducing excipient)を使用することにより、個々の賦形剤の使用量を少なくし、第２の粘度低減賦形剤の安定化効果を活用することで、適切な濃度で使用される多くの粘度低減賦形剤がタンパク質の安定性に悪影響を与えるという問題を克服することができる。

同様に、課題は、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を、前記タンパク質溶液に添加する工程を含む、方法によって課題が解決される。

課題は、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる第２の賦形剤を添加する工程を含む、方法によって解決される。

また、課題は、タンパク質溶液の安定性を向上させる方法であって、バリン、ロイシン、アスコルビン酸、シアノコバラミン及びプロリンからなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を前記溶液に添加する工程を含む、方法によって解決される。

課題は、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を含むタンパク質及び粘度低減溶液を含む組成物によってさらに解決される。

課題は、タンパク質と、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる第２の賦形剤とを含む組成物によって解決される。

さらに、課題は、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を含む、タンパク質、特に治療用タンパク質の液体製剤によって解決される。

課題は、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる第２の賦形剤を含む、タンパク質、特に治療用タンパク質の液体製剤によって解決される。

さらに、課題は、タンパク質と、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤とを含む組成物の凍結乾燥タンパク質製剤によって解決される。

課題は、タンパク質と、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる第２の賦形剤とを含む組成物の凍結乾燥タンパク質製剤によって解決される。

さらに、タンパク質と、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の賦形剤とを含む組成物を含むキットによって問題が解決される。

課題は、タンパク質と、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる第２の賦形剤とを含む組成物を含むキットによって解決される。

本発明のさらなる主題は、バイオプロセスにおいて液体タンパク質組成物の粘度を低減させる方法であって、液体タンパク質組成物を、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤と組み合わせる工程を含む方法である。

好ましくは、液体タンパク質組成物は、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される第２の粘度低減賦形剤をさらに含む。

発明の詳細な説明：
本発明は、タンパク質及びシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤を含む医薬組成物又は液体製剤に向けられている。

「タンパク質」は、本明細書では、ペプチド結合によって互いに連結されてポリペプチドを形成するアミノ酸のポリマーとして定義される。

タンパク質は、天然に存在するもの、又は非天然に存在するもの、合成のもの、又は半合成のものがある。

「タンパク質」という用語は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及び以下に定義される任意の治療用タンパク質もカバーすると理解される。

好ましくは、「タンパク質」は、検出可能な三次構造を形成するのに十分な長さを有する。

メカニズムに拘束されることを望まないが、本発明に係る組成物及び製剤の粘度低減効果は、賦形剤とタンパク質のアミノ酸残基との間の相互作用に基づくと考えられる。すべてのタンパク質は同じアミノ酸プールからできているので、ここに述べた効果はすべてのタンパク質に適用できる。したがって、本発明に係る組成物及び製剤は、その配列、サイズ及び構造に関係なく、いずれのタンパク質に対しても有利な効果を有する。

本発明はまた、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、塩酸チアミン、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、パラセタモール、塩酸グアニジン及び塩酸キニーネを含む治療用タンパク質の液状製剤にも向けられる。本発明に係る製剤は、それぞれのタンパク質の粘度の低減及び安定性の向上を示す。

本明細書で使用される「液体組成物」という用語は、粘度低減賦形剤を少なくとも含有するタンパク質水溶液を指す。

本明細書で使用される「液体製剤」という用語は、治療的使用のための液体組成物を指し、ここで、タンパク質は、許容される薬学的希釈剤中で供給されるか、又は患者に投与する前に許容される薬学的希釈剤中で再構成されるかのいずれかである治療用タンパク質である。

好ましい実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤に含有されるタンパク質は、治療用タンパク質である。

本明細書で使用される「治療用タンパク質」という用語は、疾患又は医学的状態(medical condition)を治療又は予防する目的で被験体に投与される任意のタンパク質又はポリペプチドを意味する。特に、被験体は哺乳動物又はヒトであり得る。

治療用タンパク質は、例えば、不足している又は異常なタンパク質を置換する、既存の経路を増大させる、新規な機能又は活性を提供する、分子又は生物体を妨害する、及び放射性核種、細胞傷害性薬剤（cytotoxic drug）、又はエフェクタータンパク質などの他の化合物又はタンパク質を送達するなどの、異なる目的のために投与することができる。

治療用タンパク質は、抗体ベースの薬剤、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形態形成タンパク質、工学的タンパク質足場（engineered protein scaffolds）、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗体薬物結合体（ＡＤＣｓ）及び血栓溶解剤を包含する。

治療用タンパク質は、天然に存在するタンパク質又は組換えタンパク質であり得る。それらの配列は天然のものでも、工学的なものでもよい。

特に好ましい実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤中のタンパク質は、抗体、特に治療用抗体である。

さらに特に好ましい実施形態では、本発明に係る組成物及び製剤中のタンパク質は、血漿由来タンパク質、特にＩｇＧ又は高ＩｇＧ（ｈｙｐｅｒＩｇＧ）である。血漿タンパク質を含有する製剤の中には、異なる血漿タンパク質の混合物からなるものがある。

本明細書中の「血漿由来タンパク質」という用語は、血漿分画によってドナーの血漿に由来するタンパク質を意味する。前記ドナーは、ヒトであっても非ヒトであってもよい。血漿タンパク質の一例は免疫グロブリンである。

本明細書中の「ＩｇＧ」という用語は、免疫グロブリンＧ型を意味する。本明細書中の「ＩｇＭ」とは、免疫グロブリンＭ型を意味する。本明細書中の「ＩｇＡ」という用語は、免疫グロブリンＡ型を意味する。

本明細書中の「高ＩｇＧ」という用語は、特定の疾患によって感染されたか、又は特定の疾患に対してワクチン接種されたドナーから精製されたＩｇＧの製剤を指す。前記ドナーは、ヒトであっても非ヒトであってもよい。

本明細書中の「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（完全長又は完全なモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、及び抗体フラグメントを指す。

抗体フラグメントは、無傷の抗体の一部のみからなり、一般に無傷の抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原結合能力を保持する。本定義に包含される抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ領域、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント並びに単鎖抗体分子、二重特異性抗体（diabodies）及び直鎖抗体が挙げられる。

１つの実施形態において、タンパク質はバイオシミラー（biosimilar）である。
「バイオシミラー」とは、本明細書において、既に承認されている別の生物学的医薬（biological medicine）と高度に類似する生物学的医薬と定義される。好ましい実施形態では、バイオシミラーはモノクローナル抗体である。

１つの実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は、複数のタンパク質種を含む。

本発明に係る組成物及び製剤は、シアノコバラミン（ＣＡＳ登録番号６８－１９－９）、ピリドキシン（ビタミンＢ_６、ＣＡＳ登録番号６５－２３－６）、アスコルビン酸（ビタミンＣ、ＣＡＳ登録番号５０－８１－７）、葉酸（ＣＡＳ登録番号５９－３０－３）、チアミン一リン酸（ＣＡＳ登録番号１００２３－４８－０）、ピロリン酸チアミン（コカルボキシラーゼ、ＣＡＳ登録番号１５４－８７－０）、パラセタモール（アセトアミノフェン（acetaminophen）、ＣＡＳ登録番号１０３－９０－２）、塩酸グアニジン（塩化カルバミドイルアザニウム（carbamimidoylazanium chloride）、ＣＡＳ登録番号５０－０１－１）、及び、塩酸キニーネ（塩酸（Ｒ）－［（１Ｓ，２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）－５－エチル－１－アザビシクロ［２．２．２］オクタン－２－イル］（６－メトキシキノリン－４－イル）メタノール二水和物（(R)-[(1S,2S,4S,5R)-5-ethenyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl](6-methoxyquinolin-4-yl)methanol dihydrate hydrochloride）、ＣＡＳ登録番号６１１９－４７－７）からなる群より選択される第１の粘度低減賦形剤を含む。

本発明によれば、粘度低減賦形剤はまた、賦形剤の塩又は溶媒和物を含む。本発明の文脈（ｃｏｎｔｅｘｔ）で好ましい塩は、本発明に係る化合物の生理学的に許容される塩である。それ自体は医薬用途に適さないが、例えば、本発明に係る化合物の単離、精製又は保存のために使用できる塩も含まれる。

本発明に係る化合物の生理学的に許容される塩には、例えば、そして好ましくは、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム及びマグネシウム塩）、及びアンモニア又は１～１６個のＣ原子を有する有機アミンから誘導されるアンモニウム塩、例えば、そして好ましくは、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジメチルアミノエタノール、ジエチルアミノエタノール、プロカイン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、アルギニン、リジン及び１，２－エチレンジアミンなどの従来の塩基の塩が含まれる。

本発明に係る化合物の生理学的に許容される塩には、例えば、そして好ましくは、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、炭酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルホン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩（isethionate））、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、パラトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩が挙げられる。

具体例に限定されることなく、生理学的に許容される塩は、葉酸の塩、例えば葉酸ナトリウム、アスコルビン酸の塩、例えばアスコルビン酸ナトリウム、チアミンの塩、例えば塩酸チアミン、オルニチンの塩、例えば塩酸オルニチン（ornithine monohydrochloride）又はカルニチンの塩、例えば塩酸カルニチンであり得る。

本発明の文脈における溶媒和物とは、溶媒分子との配位により固体又は液体状態で錯体を形成する本発明に係る化合物の形態として指定される。水和物は、配位が水と行われる溶媒和物の特定の形態である。水和物は、本発明の文脈では好ましい溶媒和物である。

１つの実施形態において、本発明は、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を含む。

本発明に係る液体組成物及び製剤は、組成物の粘度を低減させ、及び／又はタンパク質を安定化させるのに十分な量の第一の賦形剤を含む。例えば、本発明に係る組成物及び製剤は、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２５０ｍＭ又は約５ｍＭ～約１５０ｍＭの第１の賦形剤を含み得る。例示的な実施形態では、第１の賦形剤の濃度は、１、５、１０、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、５０、７５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２５０、又は３００ｍＭ以上である。

好ましい態様において、本発明に係る組成物は、１～９ｍＭ、より好ましくは５ｍＭのシアノコバラミンを含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、５～５００ｍＭ、より好ましくは２５～３００ｍＭ、最も好ましくは、単独で使用される場合、１５０ｍＭ、組み合わせて使用される場合、７５ｍＭのピリドキシンを含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、５～５００ｍＭ、より好ましくは２５～３００ｍＭ、最も好ましくは１５０ｍＭのアスコルビン酸を含む。

好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、５～２０ｍＭ、より好ましくは５～１５ｍＭ、最も好ましくは、単独で使用される場合、１３ｍＭ、及び組み合わせて使用される場合、１２ｍＭの葉酸を含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、１～４２０ｍＭ、より好ましくは２５～３００ｍＭ、最も好ましくは、単独で使用される場合、１５０ｍＭ、及び組み合わせて使用される場合、７５ｍＭのチアミン一リン酸を含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、１～４５０ｍＭ、より好ましくは２５～３００ｍＭ、最も好ましくは７５ｍＭのピロリン酸チアミンを含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、５～５００ｍＭ、より好ましくは２５～３００ｍＭ、最も好ましくは１５０ｍＭの塩酸グアニジンを含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、１～２５ｍＭ、より好ましくは５～２５ｍＭ、最も好ましくは２５ｍＭの塩酸キニーネを含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、５～１００ｍＭ、より好ましくは２５～１００ｍＭ、最も好ましくは７５ｍＭのパラセタモールを含む。

本発明者らは、驚くべきことに、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、塩酸チアミン、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、パラセタモール、塩酸グアニジン又は塩酸キニーネの添加が、タンパク質溶液の粘度を著しく低減させ、溶液中のタンパク質の安定性を向上させることを見出した。したがって、本発明は、粘度を低減させ、及び／又は安定性を向上させた組成物及び製剤を提供する。

本発明に係る液体組成物及び製剤は、タンパク質を含むが、第１及び／又は第２の賦形剤を含まない組成物と比較して、向上した安定性を示す。

シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールは、いずれも毒性がなく、安全であることが知られている化合物である。したがって、それらの投与は忍容性（tolerated）が良好である。

本発明の一態様では、これらの組成物及び製剤は、粘度の低減以外の目的、例えば安定化、可溶化又は保存のために使用される賦形剤をさらに含むことができる。

本発明の別の態様において、組成物及び製剤は、一つ以上の第１の賦形剤を含む。例えば、本発明に係る組成物及び製剤は、２つ、３つ又は４つの第１の賦形剤を含み得、好ましくはそれらは２つの第１の賦形剤を含む。

２つ、３つ又は４つの第１の賦形剤の組合せは、粘度を相乗的に低減させ、及び／又はタンパク質を含む組成物及び製剤中又はタンパク質溶液中での安定性を向上させることができる。本明細書中で定義される「相乗的に」とは、成分の組合せの作用が、の各々の成分単独の作用の合計より大きいという効果を意味する。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びピリドキシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びアスコルビン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及び葉酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びチアミン一リン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びピロリン酸チアミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及び塩酸グアニジン塩酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及び塩酸キニーネを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びパラセタモールを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びアスコルビン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及び葉酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びチアミン一リン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びピロリン酸チアミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及び塩酸グアニジンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及び塩酸キニーネを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びパラセタモールを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及び葉酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びチアミン一リン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びピロリン酸チアミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及び塩酸グアニジンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及び塩酸キニーネを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びパラセタモールを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びチアミン一リン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びピロリン酸チアミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及び塩酸グアニジンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及び塩酸キニーネを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びパラセタモールを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及び塩酸グアニジンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及び塩酸キニーネを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びパラセタモールを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及び塩酸グアニジンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及び塩酸キニーネを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びパラセタモールを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及び塩酸キニーネを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びパラセタモールを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びパラセタモールを含む。

好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニンと、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、塩酸チアミン、チアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンからなる群から選択される賦形剤とを含む。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸チアミンと、ピリドキシン又は葉酸からなる群より選択される賦形剤とを含む。
これらの賦形剤の組み合わせは、タンパク質溶液又は組成物の粘度を低減させるために特に有用である。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸チアミン及び葉酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸チアミン及びピリドキシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びピリドキシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びチアミン一リン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びピロリン酸チアミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及び葉酸を含む。

本発明の組成物及び製剤中に１つ以上の賦形剤が存在する場合、賦形剤の濃度は同一であっても異なっていてもよい。

本発明に係る組成物及び製剤は、少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤をさらに含み得る。

本明細書で使用される「粘度低減賦形剤」という用語は、粘度低減賦形剤を含まない同一の組成物と比較して、タンパク質溶液の粘度を少なくとも５％低減させることが知られている適切な濃度の任意の化合物を指す。

少なくとも１つの第２の粘度低減添加剤は、好ましくは、バリン（ＣＡＳ登録番号７２－１８－４）、プロリン（ＣＡＳ登録番号１４７－８５－３）、ロイシン（ＣＡＳ登録番号６１－９０－５）、イソロイシン（ＣＡＳ登録番号７３－３２－５）、フェニルアラニン（ＣＡＳ登録番号６３－９１－２）、塩酸チアミン（ＣＡＳ登録番号６７－０３－８）、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－６－（メチルアミノ）ヘキサン－１，２，３，４，５－ペントール、ＣＡＳ登録番号６２８４－４０－８）、ベンゼンスルホン酸（ＣＡＳ登録番号９８－１１－３）、カフェイン（１，３，７－トリメチルキサンチン、ＣＡＳ登録番号５８－０８－２）及びカンファースルホン酸（（７，７－ジメチル－２－オキソビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メタンスルホン酸からなる群から選択される。

本発明に係る液体組成物及び製剤は、組成物の粘度をさらに低減させる及び／又はタンパク質を安定化させるのに十分な量のバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の賦形剤を含み得る。

例えば、本発明に係る組成物及び製剤は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ又は約１４０ｍＭ～約２００ｍＭの、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される第２の賦形剤を含み得る。

例示的な実施形態では、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の賦形剤の濃度は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、７５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２５０、又は３００ｍＭ以上である。

好ましい実施態様において、本発明に係る組成物は、１５０ｍＭのバリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、リシン又は塩酸チアミンを含む。

好ましい実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は、５０～１００ｍＭの、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される第２の賦形剤を含む。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は、５～１３ｍＭの濃度の葉酸を含む。

別の好ましい実施形態では、本発明に係る組成物及び製剤は、５ｍＭの濃度のシアノコバラミンを含む。

これらの実施形態において、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される第１の賦形剤は、粘度を低減させ及び／又は安定性を向上させるためにタンパク質又はタンパク質溶液を含む組成物及び製剤に添加することができるバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される第２の賦形剤と共に、粘度を低減させる溶液を形成する。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は、少なくとも１つの第１の及び少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤を含み、賦形剤は、タンパク質を含む組成物及び製剤において、又はタンパク質溶液において、相乗的に、粘度を低減させ、及び／又は安定性を向上させる。

本発明によれば、２つ以上の賦形剤の組合せによる粘度低減が、各個々の賦形剤の粘度低減の期待合計（expected sum）以上である場合に、粘度の相乗的低減が与えられる。
好ましくは、２つ以上の賦形剤の組合せによる粘度低減率が、各個々の賦形剤の粘度低減率の期待合計より大きい場合には、粘度の相乗的低下が与えられる。

さらに、本発明によれば、２つ以上の賦形剤の組合せによるタンパク質の安定性低減が、各個々の添加剤の安定性低減の期待合計以下である場合には、２つ以上の粘度低減賦形剤の組合せが相乗的である。

１つの実施形態では、本出願で言及される全ての組み合わせは、タンパク質を含む液体組成物の粘度の相乗的低減をもたらす。

１つの実施形態において、次の組合せ：ピリドキシン／アルギニン、葉酸／オルニチン、葉酸／カルニチン、ピリドキシン／メグルミン、チアミン一リン酸／メグルミン、ピリドキシン／チアミン一リン酸、フェニルアラニン／カンファースルホン酸及びフェニルアラニン／ベンゼンスルホン酸は、タンパク質を含む液体組成物の粘度を相乗的に低減させる。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、シアノコバラミン及び塩酸チアミンを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤はピリドキシン及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤はピリドキシン及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及び塩酸チアミンを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、アスコルビン酸及び塩酸チアミンを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及び塩酸チアミンを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及び塩酸チアミンを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及び塩酸チアミンを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸グアニジン及び塩酸チアミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、塩酸キニーネ及び塩酸チアミンを含む。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びアルギニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びオルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びカルニチンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びメグルミンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びカンファースルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びベンゼンスルホン酸を含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びカフェインを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びバリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及びプロリンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤はパラセタモール及びロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤はパラセタモール及びイソロイシンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤はパラセタモール及びフェニルアラニンを含む。
１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、パラセタモール及び塩酸チアミンを含む。

好ましい態様において、本発明に係る組成物及び製剤は、液体製剤である。
好ましい実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は液体製剤であり、タンパク質は治療用タンパク質である。

別の態様において、本発明は、タンパク質及びシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を含む凍結乾燥タンパク質製剤を提供する。

適切な量の希釈剤で再構成すると、製剤は、他は同じ組成を有するが賦形剤を含まないコントロール製剤と比較して低減された粘度を示す。
従って、賦形剤は、希釈剤での再構成時に粘度を低減させるのに有効な量で存在する。

別の態様において、本発明は、タンパク質及びシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の賦形剤、並びにバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤を含む凍結乾燥タンパク質製剤を提供する。

凍結乾燥タンパク質製剤は、タンパク質と、乾燥され、例えば粉末形態の粒子として存在する本発明に係る少なくとも１つの賦形剤とを含む。本発明の文脈において、表現「粉末」とは、本質的に乾燥した粒子の集合体、すなわち、水分含有量が少なくとも約１０重量％、６重量％、４重量％以下であることを指す。

本明細書中で定義される「粘度」とは、物質（典型的には液体）が流れる抵抗を意味する。
粘度はせん断力の概念に関係しており、流体の異なる層が互いに移動する際に、互いに、又は他の表面に対してせん断力を及ぼす効果として理解することができる。

粘度を表現する方法はいくつかある。粘度の単位はＮｓ／ｍ^２で、パスカル秒（Ｐａｓ）として知られている。粘度には、「動粘度」と「絶対粘度」がある。動粘度は、流体中を運動量が移動する速さを表す指標である。単位はストークス（Ｓｔ）である。粘度は、重力の影響を受けた流体の抵抗流を表す尺度である。同じ体積で粘度の異なる２つの流体を同じ毛細管粘度計に入れ、重力によって流動させると、粘度の高い流体は粘度の低い流体よりも長い時間をかけて毛細管内を流動することになる。例えば、ある流体が２００秒、別の流体が４００秒かかるとすると、２番目の流体は最初の流体の２倍の粘度と呼ばれ、動粘度計で表示される。動粘度の次元は長さ^２／時間である。一般に動粘度はセンチストークス（ｃＳｔ）で表わされる。動粘度のＳＩ単位はｍｍ^２／ｓで、１ｃＳｔである。「絶対粘度」とは、動粘度と流体密度の積で、「粘度（dynamic viscosity）」、「単純粘度（simple viscosity）」とも呼ばれる。絶対粘度の単位はセンチポイズ（ｃＰ）である。絶対粘度のＳＩ単位はミリパスカル・秒（ｍＰａｓ）で、１ｃＰ＝１ｍＰａｓである。

粘度は、例えば、所定のせん断速度又は複数のせん断速度で粘度計を用いることによって測定することができる。「外挿ゼロせん断」粘度は、絶対粘度対せん断速度のプロット上に４つの最高せん断点の最良適合線を作成し、粘度をゼロせん断に直線的に外挿することによって決定することができる。
あるいは、ニュートン流体については、複数のせん断速度で粘度値を平均することによって粘度を求めることができる。
粘度は、微小流体粘度計を用いて、単一又は複数のせん断速度（流量とも呼ばれる）で測定することもでき、ここでは、絶対粘度は液体が流路を流れる際の圧力変化から求める。
粘度はせん断速度以上のせん断応力に等しい。
マイクロ流体粘度計で測定された粘度は、いくつかの実施形態では、例えば、コーン・プレート粘度計を用いて複数のせん断速度で測定された粘度から外挿されたゼロせん断粘度と直接比較することができる。
本発明によれば、組成物及び製剤の粘度は、上記の方法の少なくとも１つが安定化効果を示す場合に減少する。
好ましくは、粘度は、マイクロ流体粘度計を用いて２０℃で測定される。より好ましくは、２０℃でＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用いて粘度を測定する。
最も好ましくは、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用い、５００μｌシリンジ、３０００秒^－１又は２０００秒^－１のせん断速度及び２００μｌの体積を用いて、２０℃で粘度を測定する。
通常の当業者であれば、マイクロ流体粘度計を用いた粘度測定に慣れている。
マイクロ流体粘度計としては、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計（ｍＶＲＯＣＴＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、特に上記のようなパラメータを設定したものを使用することができる。
詳細な仕様、方法、設定については、９０１００３．５．１－ｍＶＲＯＣ＿Ｕｓｅｒ’ｓ＿Ｍａｎｕａｌを参照されたい。

本明細書における「せん断速度」とは、流体のある層が隣接する層の上を通過する際の速度の変化率である。速度勾配は、プレートからの距離に伴う速度の変化率である。
この簡単な事例は、せん断速度（ｃｍ／秒）／（ｃｍ）＝１／秒の単位でのせん断速度（ｖ１-ｖ２）／時間を伴う均一な速度勾配を示す。
したがって、せん断速度の単位は秒の逆数、一般的には時間の逆数である。
マイクロ流体粘度計では、圧力と流量の変化がせん断速度に関係している。
「せん断速度」とは、材料が変形する速度のことである。
タンパク質及び粘度低下剤（viscosity-lowering agents）を含む製剤は、一般的に、目的のサンプルの粘性範囲における粘性を正確に測定するために、コーン・プレート粘度計と、当業者によって適切に選択された紡錘体を用いて測定すると、約０．５秒^－１～約２００秒^－１の範囲のせん断速度で測定される（すなわち、２０ｃＰのサンプルは、ＤＶ２Ｔ粘度計（ブルックフィールド）に貼付されたＣＰＥ４０紡錘体上で最も正確に測定される）；マイクロ流体粘度計を用いて測定すると、約２０秒^－１から約３０００秒^－１を超える。
タンパク質及び粘度低下剤を含む製剤は、典型的には、コーン・プレート粘度計及び目的のサンプルの粘度範囲の粘度を正確に測定するために当業者が適切に選択した紡錘体を用いて測定する場合（例えば、２０ｃＰのサンプルはＤＶ２Ｔ粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ社）に取り付けたＣＰＥ４０紡錘体で最も正確に測定される。）、約０．５秒^－１～約２００秒^－１の範囲のせん断速度で、マイクロ流体粘度計を用いて測定する場合には約２０秒^－１より大きく約３０００秒^－１の範囲で測定される。

古典的な「ニュートン」流体については、本明細書中で一般的に使用されるように、粘度は、せん断速度に本質的に無関係である。
本明細書で一般的に使用される古典的な「ニュートン流体」の場合、粘度はせん断速度に本質的に依存しない。
しかし、「非ニュートン流体」の場合、粘度はせん断速度の増加とともに減少又は増加し、例えば、流体はそれぞれ「せん断減粘（shear thinning）」又は「せん断増粘（shear thickening)」する。
濃厚な（すなわち高濃度の）タンパク質溶液の場合、これは擬塑性のせん断減粘挙動（pseudoplastic shear-thinning behavior）、すなわちせん断速度に伴う粘度の減少として現れることがある。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、少なくとも１つの第１の賦形剤を含まない同一の組成物と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％の粘度の低減を示す。

１つの実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、少なくとも１つの第１及び少なくとも１つの第２の賦形剤を含まない同一の組成物と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％の粘度の低減を示す。

本明細書中で使用される「安定性」という用語は、化学的及び物理的安定性の両方を包含する。

本明細書における「化学的安定性」という用語は、酸化、脱アミド化又は加水分解などの化学的経路を介する分解に抵抗する、製剤中のタンパク質成分の能力を指す。
４℃で２４ヵ月後に成分の約５％未満が分解された場合、典型的にはタンパク質製剤は化学的に安定であると考えられる。
本発明によれば、タンパク質製剤は、典型的には、相対湿度６０％、２５℃で２４週間後に約５％未満の成分が分解される場合、化学的に安定であると考えられる。

安定性は、ある範囲の温度（熱安定性）及び／又は期間（有効期間）にわたる立体構造変化のモニタリング、及び／又はストレスの多い取り扱い状況（例えば、物理的振盪）への曝露後を含む、当業者に知られている多くの方法で評価することができる。
様々な濃度の製剤成分を含有する製剤の安定性は、様々な方法を用いて測定することができる。
例えば、タンパク質凝集の量は、濁度の目視観察、特定の波長での吸光度の測定、サイズ排除クロマトグラフィー（タンパク質の凝集体が、本来の活性状態にあるタンパク質と比較して、異なる分画で溶出し得る）、ＨＰＬＣ、又は他のクロマトグラフィー法によって測定することができる。
コンホメーション変化を測定する他の方法として、例えば変性の温度を測定するための示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、又はタンパク質のモル楕円性を測定する円偏光二色性（ＣＤ）を用いることができる。蛍光を用いて組成を分析することもできる。
蛍光は、適当な波長を必要とする光の吸収に続く光の発光を包含する。
読み出される可能性（potential readouts）は、光、光強度、又は発光波長の極性特性における変化である。
蛍光発光は、タンパク質に固有のものであってもよく、例えば、部分的にほどけたタンパク質の疎水性ポケットに結合する蛍光レポーター分子に起因するものであってもよい。
レポーター分子の結合の増加は、タンパク質サンプルの蛍光シグナルの検出によってモニタリングすることができる。
安定性を測定する他の手段を用いることができ、当業者には周知である。
本発明によれば、組成物及び製剤の安定性は、上記の方法の少なくとも1つが安定化効果を示す場合に向上する。

１つの実施形態では、本発明の組成物及び製剤は、少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤を含まないか、又は少なくとも１つの第１及び少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤を含まない組成物と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％のタンパク質の安定性の向上を示す。

１つの実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は、バリン、ロイシン、アスコルビン酸、シアノコバラミン及びプロリンからなる群から選択される粘度低減賦形剤を含み、Ｔｍ及び／又はＴａｇｇの上昇を特徴とするタンパク質安定性の向上を示す。

１つの実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は、バリン、ロイシン、アスコルビン酸、シアノコバラミン及びプロリンからなる群から選択される粘度低減賦形剤を含み、（ｉ）上昇したＴｍ及び／又はＴａｇｇによって特徴付けられるタンパク質安定性の向上及び／又は（ｉｉ）粘度の低減の両方を示す。

好ましい実施形態において、本発明の組成物及び製剤は、第２の賦形剤としてフェニルアラニン、カンファースルホン酸又はベンゼンスルホン酸を含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びピリドキシンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及び塩酸チアミンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及び葉酸を含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びチアミン一リン酸を含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びピロリン酸チアミンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びアルギニンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びオルニチンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びカルニチンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びメグルミンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸を含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸を含む。

好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びアルギニンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及びオルニチンを含む。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤はピリドキシン及びカルニチンを含む。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤はピリドキシン及びメグルミンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、ピリドキシン及び塩酸チアミンを含む。

好ましい実施形態では、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びアルギニンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びオルニチンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びカルニチンを含む。
好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及びメグルミンを含む。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤は、葉酸及び塩酸チアミンを含む。

好ましい実施形態では、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びアルギニンを含む。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びオルニチンを含む。
好ましい実施形態では、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びカルニチンを含む。
好ましい実施形態では、本発明の組成物及び製剤は、チアミン一リン酸及びメグルミンを含む。

好ましい態様において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びアルギニンを含む。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びカルニチンを含む。
好ましい実施態様において、本発明の組成物及び製剤は、ピロリン酸チアミン及びメグルミンを含む。

好ましい態様において、組成物は、フェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸、塩酸チアミン及びベンゼンスルホン酸、塩酸チアミン及びカンファースルホン酸、ピリドキシン及びアルギニン、ピリドキシン及びオルニチン、ピリドキシン及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、葉酸及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、葉酸及びメグルミン、チアミン一リン酸及びアルギニン、チアミン一リン酸及びオルニチン、チアミン一リン酸及びカルニチン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピロリン酸チアミン及びアルギニン、ピロリン酸チアミン及びオルニチン、ピロリン酸チアミン及びカルニチン、ピロリン酸チアミン及びメグルミンからなる群から選択される２つの粘度低減賦形剤の組み合わせを含む。

さらなる実施形態において、液体組成物は、タンパク質と、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤と、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤を含む。

さらに好ましい実施態様において、液体組成物は、ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸、並びに、フェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せを含む。

さらに好ましい態様において、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせは、ピリドキシン及びアルギニンである。
さらに好ましい実施形態において、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせは、葉酸及びオルニチンである。
さらに好ましい実施形態では、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せは、葉酸及びカルニチンである。
さらに好ましい態様において、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせは、ピリドキシン及びメグルミンである。
さらに好ましい実施形態では、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せは、チアミン一リン酸及びメグルミンである。
さらに好ましい実施形態において、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせは、ピリドキシン及びチアミン一リン酸塩である。
さらに好ましい態様において、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせは、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸である。
さらに好ましい態様において、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせは、フェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸である。

さらに好ましい態様において、液体組成物は、ピリドキシン及びアルギニン、ピリドキシン及びメグルミン並びにピリドキシン及びチアミン一リン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせを含む。

さらに好ましい実施形態では、液体組成物は、葉酸及びオルニチン、並びに葉酸及びカルニチンからなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せを含む。

さらに好ましい実施形態では、液体組成物は、ピリドキシン及びメグルミン、並びにチアミン一リン酸及びメグルミンからなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せを含む。

さらに好ましい実施形態では、液体組成物は、チアミン一リン酸及びメグルミン並びにピリドキシンとチアミン一リン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せを含む。

さらに好ましい態様において、液体組成物は、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組み合わせを含む。

１つの実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤は、２～１０、好ましくは４～８、より好ましくは５～７．２のｐＨを有する。１つの実施形態において、組成物及び製剤は、正確に５又は正確に７．２のｐＨを有する。

本発明に係る組成物及び製剤は、さらに、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、接着剤、結合剤、保存剤、可溶化剤、界面活性剤、浸透増強剤、乳化剤又はバイオアベイラビリティ増強剤（bioavailability enhancers）を含み得る。当業者は、安全で忍容性が良好な液体組成物に適した添加物をどのように選択するかを知っている。

第１及び／又は第２の粘度低減賦形剤の組合せを含む本発明に係る組成物及び製剤は、粘度低減以外の目的、例えば安定化、可溶化又は保存で使用される賦形剤をさらに含むことができる。

好ましい実施形態では、本発明に係る組成物及び製剤は、糖及び／又は界面活性剤のような安定剤を含む。
安定剤として適当な糖、例えばショ糖又はトレハロースは文献において知られている。
好ましい実施形態では、糖はショ糖である。
適当な界面活性剤、例えばポリソルベート２０又はポリソルベート８０又はポロキサマー１８８は、文献において知られている。別の好ましい実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。さらに安定剤を加えると、本発明に係る組成物の安定化効果がさらに増強される。

本発明に係る液体組成物及び製剤は、組成物の粘度を低減させ、及び／又はタンパク質を安定化させるのに十分な量の第１及び任意に第２の賦形剤を含む。
例えば、本発明に係る組成物及び製剤は、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２５０ｍＭ又は約５ｍＭ～約１５０ｍＭの各第１及び任意に第２の賦形剤を含み得る。
例示的な実施形態では、各第１及び第２の賦形剤の濃度は、１、５、１０、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、５０、７５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２５０、又は３００ｍＭ以上である。
好ましくは、各第１及び任意に第２の賦形剤の濃度は、７５又は１５０ｍＭである。
１つの実施形態において、液体組成物は、２つの賦形剤の組み合わせを含み、ここで、賦形剤のモル濃度は、同一又は異なることができる。
好ましくは、各第１及び第２賦形剤の濃度は、１ｍＭ～２００ｍＭであり、より好ましくは２５～１５０ｍＭであり、最も好ましくは５０～１００ｍＭである。
第１及び第２の賦形剤のモル比は１：１００～１００：１であり、好ましくは１：１０～１０：１であり、より好ましくは１：５～５：１であり、最も好ましくは１：２～２：１である。
特定の実施形態では、第１及び第２の賦形剤のモル濃度は同一である。

本発明はさらに、タンパク質が、１２０ｋＤａ～２５０ｋＤａ、好ましくは１３０ｋＤａ～１８０ｋＤａの分子量を有する、本発明に係る液体組成物を提供する。

好ましい実施形態において、本発明に係る組成物及び製剤中のタンパク質濃度は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、及びより好ましくは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである。

別の好ましい実施形態において、タンパク質濃度は、９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは、タンパク質濃度は、１００～２５０ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは、１２０～２１０ｍｇ／ｍｌである。
本発明は、これらの高濃度組成物、製剤及び溶液に特に有用である。

本発明はさらに、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の緩衝液をさらに含む、本発明に係る液体組成物を提供する。緩衝液は好適な酢酸塩又はリン酸塩であり得、ｐＨ５～７．２を提供する。

本発明はさらに、安定剤として糖、好ましくは５０～１００ｍｇ／ｍｌのショ糖をさらに含む、本発明に係る液体組成物を提供する。

本発明はさらに、界面活性剤、好ましくは０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０をさらに含む、本発明に係る液体組成物を提供する。

本発明はさらに、本発明に係る液体組成物を提供するが、粘度は、１ｍＰａｓ～６０ｍＰａｓ、好ましくは１ｍＰａｓ～５０ｍＰａｓ、より好ましくは１ｍＰａｓ～３０ｍＰａｓ、最も好ましくは１ｍＰａｓ～２０ｍＰａｓである。好ましくは、粘度は、マイクロ流体粘度計を用いて、２０℃で測定される。より好ましくは、粘度は、２０℃でＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用いて測定される。最も好ましくは、粘度は、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用い、２０℃、５００μｌシリンジ、３０００秒^－１又は２０００秒^－１のせん断速度、２００μｌの体積を使用して測定される。

本発明はさらに、本発明に係る液体組成物を提供するが、タンパク質は、９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌの濃度で１２０ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有し、好ましくは１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液をさらに含み、製剤は、５～７．２のｐＨを有す、２０℃で測定した場合に、好ましくはマイクロ流体粘度計を使用して、より好ましくは２０℃でＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を使用して、最も好ましくはＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用い、２０℃、５００μｌシリンジ、３０００秒^－１又は２０００秒^－１のせん断速度、２００μｌの体積を使用して１ｍＰａｓ～６０ｍＰａｓの粘度を有する。

好ましくは、第１及び第２の粘度低減賦形剤が存在する本発明に係る液体組成物は、９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、及びそれぞれ５０～２００ｍＭ、より好ましくはそれぞれ５０～１００ｍＭ、最も好ましくはそれぞれ７５ｍＭの第１及び第２の粘度低減賦形剤の濃度を有する。
好ましくは、タンパク質は抗体であり、１２０ｋＤａから２５０ｋＤａの分子量を有する。
好ましくは、製剤は４～８、より好ましくは５～７．２のｐＨを有し、マイクロ流体粘度計を用いて２０℃で測定した場合、粘度は１ｍＰａｓ～６０ｍＰａｓの間である。

本発明はさらに、本発明に係る液体組成物を提供するが、タンパク質はインフリキシマブである。
好ましくは、液体組成物中のインフリキシマブ濃度は１２２ｍｇ／ｍｌ～１８５ｍｇ／ｍｌである。

Jａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が開発したインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））とＢｉｏｇｅｎが開発したそのバイオシミラー医薬品（ＦＵＸＡＢＩ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎの（Ｉｎｆｌｅｃｔｒａ）は、関節リウマチ、成人潰瘍性大腸炎、尋常性乾癬、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、成人・小児クローン病（用量・投与量：５ｍｇ／ｋｇ）に適用されている。
インフリキシマブは、自己免疫疾患の治療に用いられる腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－ａ）に対するｍＡｂである。
インフリキシマブは、可溶性及び膜貫通型のＴＮＦαに高い親和性で結合し、ＴＮＦαとその受容体の結合を阻害することにより、ＴＮＦαの生物活性を中和する。
これは、米国ではＪａｎｓｓｅｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ（以下、「Ｊａｎｓｓｅｎ」）、日本では田辺三菱製薬、中国ではＸｉａｎ Ｊａｎｓｓｅｎ、及びその他ではＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ（以下、「ＭＳＤ」）によってＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）という商品名で販売されている。いくつかの実施形態では、製剤は、ＲＥＭＳＩＭＡ^TM又はＩＮＦＬＥＣＴＲＡ（登録商標）などのＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）のバイオシミラーを含む。Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ，Ｉｎｃ．（以下、「Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ」）によって開発されたＲＥＭＳＩＭＡ（登録商標）、及び英国Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．によって開発されたＩＮＦＥＣＴＲＡ^TMの両方のインフリキシマブは、現在、約３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、静脈内注入を介して投与される。

本発明はさらに、タンパク質がエボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）である、本発明に係る液体組成物を提供する。好ましくは、液体組成物中のエボロクマブ濃度は、１６３ｍｇ／ｍｌ～２０４ｍｇ／ｍｌである。

Ａｍｇｅｎが開発したエボロクマブ（ＲＥＰＡＴＨＡ（登録商標））は、ＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ９）を標的として低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を低減するＨｅＦＨ、ＣＶＤの治療に用いられる（用量・投与量：４２０ｍｇ／月）。

本発明はさらに、本発明に係る組成物及び製剤を含むキットを提供する。キットは、さらに、投与のための説明書、ならびに投与のための容器、シリンジ及び／又は他のデバイスを含んでいてもよい。

本発明はまた、本発明の凍結乾燥タンパク質製剤、必要に応じて容器内に含み、その再構成及び投与のための説明書、必要に応じて滅菌希釈剤のバイアル、及び必要に応じて注射器又は他の投与デバイスを備えたキットにも向けられる。
例示的な容器には、バイアル、チューブ、ボトル、シングル又はマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ（single or multi-chambered pre-filled syringes）、又はカートリッジが含まれるが、ウェルにセットされている（sitting in the wells）すぐに使える凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤を含む９６ウェルプレート（96-well plate）も含まれる。例示的な投与デバイスには、針のある又はない注射器、輸液ポンプ、ジェット注射器、ペンデバイス（pen devices）、経皮注射器、又は他の針なし注射器が含まれる。

本発明はまた、全ての前述の液体組成物及び製剤の製造の目的の、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法に関する。
上記の液体組成物について述べたような賦形剤、タンパク質、タンパク質の濃度及び分子量、ｐＨ、緩衝液及び緩衝液濃度の組み合わせ及び濃度に関するすべての実施形態は、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法にも適用可能である。

本発明はさらに、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモール又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群より選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を、タンパク質溶液に添加する工程を含む方法を提供する。

本発明はさらに、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸チアミン、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモール又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を添加する工程と、第２の粘度低減賦形剤を添加する工程を含む方法を提供する。

本発明はさらに、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモール又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤を添加する工程、並びにバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される第２の賦形剤を、タンパク質溶液に添加する工程を含む方法を提供する。

本発明はさらに、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、少なくとも一つの、上記のような第１の粘度低減賦形剤又はそれらの塩又は溶媒和物、及び上記のような第２の粘度低減賦形剤又はその塩又は溶媒和物を添加する工程を含む方法を提供する。

本発明は、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、少なくとも１つの、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニン又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される第１の粘度低減賦形剤、及びアルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される第２の粘度低減賦形剤を、タンパク質溶液に添加する工程を含む方法を提供する。

本発明はさらに、タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せが、ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸、並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される方法を提供する。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、前記タンパク質溶液中のタンパク質は、１２０ｋＤａ～２５０ｋＤａ、好ましくは１３０ｋＤａ～１８０ｋＤａの分子量を有する方法を提供する。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、タンパク質溶液中のタンパク質濃度は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、及びより好ましくは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである方法を提供する。
別の好ましい実施形態では、タンパク質濃度は、９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは、タンパク質濃度は、１００～２００ｍｇ／ｍｌである。本発明は、これらの高濃度タンパク質溶液に特に有用である。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、タンパク質溶液は、さらに５ｍＭ～５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の緩衝液を含む方法を提供する。緩衝液は好適な酢酸塩又はリン酸塩であり得、ｐＨ５～７．２を提供する。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、タンパク質溶液は、さらに安定剤として糖、好ましくは５０～１００ｍｇ／ｍｌのショ糖を含む方法を提供する。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法を提供するが、タンパク質溶液は、さらに界面活性剤、好ましくは０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む方法を提供する。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、得られる溶液の粘度が、１ｍＰａｓ～６０ｍＰａｓ、好ましくは１ｍＰａｓ～５０ｍＰａｓ、より好ましくは１ｍＰａｓ～３０ｍＰａｓ、最も好ましくは１ｍＰａｓ～２０ｍＰａｓである方法を提供する。
好ましくは、粘度は、２０℃でマイクロ流体粘度計を用いて測定される。
より好ましくは、粘度は、２０℃でＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用いて測定される。
最も好ましくは、粘度は、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用い、２０℃、５００μｌシリンジ、３０００秒^－１又は２０００秒^－１のせん断速度、２００μｌの体積を使用して測定される。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、粘度が、少なくとも１つの第１の賦形剤を含まないか、又は少なくとも１つの第１及び少なくとも１つの第２の賦形剤を含まない同一の組成物と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％低減されている、方法を提供する。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、タンパク質溶液中のタンパク質は、９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌの濃度で１２０ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有し、溶液は、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液をさらに含み、溶液製剤は、２０℃で測定した場合、５～７．２のｐＨと、好ましくはマイクロ流体粘度計を用いて、より好ましくは２０℃でＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用いて、最も好ましくはＲｈｅｏＳｅｎｓｅ ｍＶＲＯＣマイクロ流体粘度計を用い、２０℃で、５００μｌシリンジ、３０００秒^－１又は２０００秒^－１のせん断速度、２００μｌの体積を使用して測定される１ｍＰａｓ～６０ｍＰａｓの粘度を有する方法を提供する。

本発明はさらに、上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、第１及び第２の粘度低減賦形剤が上記のように存在する方法を提供する。
好ましくは、本発明のこのような実施形態は、９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、及びそれぞれ５０～２００ｍＭ、より好ましくはそれぞれ５０～１００ｍＭ、最も好ましくはそれぞれ７５ｍＭの第１及び第２の粘度低減賦形剤の濃度を有する。
好ましくは、タンパク質は抗体であり、１２０ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有する。
好ましくは、この製剤は、５～７．２のｐＨを有し、２０℃、好ましくはマイクロ流体粘度計を用いて測定した場合、粘度は１ｍＰａｓ～６０ｍＰａｓの間である。

同様に、本発明は、タンパク質溶液の安定性を向上させる方法であって、バリン、ロイシン、アスコルビン酸、シアノコバラミン及びプロリン又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの粘度低減賦形剤を溶液に添加する工程を含む方法に向けられる。

本発明はさらに、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモール又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の賦形剤、又は上記のような少なくとも２つの粘度低減賦形剤の組合せを添加することにより、溶液中のタンパク質の自己会合を防止する方法を提供する。

１つの態様では、第１の賦形剤の組合せが本発明の方法において添加される。
本発明の方法で使用される組合せは、本発明の組成物及び製剤について定義されるものと同一であってもよい。

１つの態様では、本発明の方法は、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される第２の賦形剤を、溶液に添加する工程をさらに含む。本明細書では、本発明の組成物及び製剤に関して定義される第１及び第２の賦形剤の同じ組合せを加えてもよい。

本発明に係る方法において、賦形剤は、タンパク質溶液に当業者に公知の任意の方法で添加され得る。
１つ以上の賦形剤を加える場合には、賦形剤を一緒に混合して粘度低減液とし、これをたん白質溶液に加える。
同様に、賦形剤を別々にタンパク質溶液に加えてもよい。

本発明に係る方法において、タンパク質は治療用タンパク質であってもよい。
好ましい実施形態において、タンパク質は、上記定義の抗体である。
本発明に係る方法において、タンパク質は血漿由来タンパク質であってもよい。
さらに好ましい実施形態において、タンパク質は、上記定義のＩｇＧ又は高ＩｇＧである。

本発明の好ましい態様において、液体組成物は医薬組成物である。
また、本発明は、疾患の治療のための治療用タンパク質を含む、上記のような医薬組成物に向けられる。

治療用タンパク質を含む上記の特定の医薬組成物は、癌、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、大腸炎潰瘍、乾癬－関節炎、乾癬、高コレステロール血症、混合型脂質異常症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、心筋梗塞、末梢動脈疾患又は免疫不全疾患の治療に適している。

本発明はまた、治療方法に向けられ、治療は、治療用タンパク質を含む上記の医薬組成物の投与を含む。

１つの態様では、治療方法は癌を治療する方法である。
すなわち、本発明に係る組成物及び製剤は、癌、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬－関節炎、乾癬、高コレステロール血症、混合型脂質異常症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、心筋梗塞、末梢動脈疾患又は免疫不全疾患の治療に有用である。

吸光分光分析によって決定したタンパク質濃度が１２２ｍｇ／ｍｌの場合、タンパク質粘度は、賦形剤の非存在下で注射可能な限界を超えた。
注射の利便性の限界は、針の長さ、内径、シリンジバレルの内径など多くの要因に依存する。
粘度が１００ｍＰａｓまでの薬剤は患者に注射できることが知られている。しかし、６０ｍＰａｓの粘度が好ましい。患者の利便性を高めるために、３０ｍＰａｓ以下又は２０ｍＰａｓ以下のより低い粘度がさらに好ましい。

バリン、ロイシン、フェニルアラニン又はプロリンの添加は、製剤の粘度を低減させた。
１４３ｍｇ／ｍｌのより高い濃度では、賦形剤の非存在下での製剤の粘度は、８０ ｍＰａｓを超える値に劇的に増加する。
ロイシン、フェニルアラニン及びプロリンを添加すると、製剤の粘度が低下した。
この実験では、フェニルアラニンが最も効率的に粘度を下げる賦形剤であることがわかり、特に高タンパク濃度ではその効果が顕著であった。

１４９ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、１５０ｍＭピリドキシン、塩酸チアミン又はチアミン一リン酸を添加すると、製剤の粘度が低減することが見出された。
また、５ｍＭのシアノコバラミン、１３ｍＭの葉酸又は７５ｍＭのピロリン酸チアミンの添加は、製剤の粘度を低減させることが見出された。
特に塩酸チアミンは高い粘度低下能を示す。
さらに高い１７４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度では、１５０ｍＭのピリドキシン、アスコルビン酸、塩酸チアミン又はチアミンリン酸の粘度低減効果が観察された。
また、５ｍＭのシアノコバラミン、１３ｍＭの葉酸又は７５ｍＭのピロリン酸チアミンの添加は、粘度低減賦形剤なしの製剤と比較して、製剤の粘度を低減させることが見出された。
特に塩酸チアミン、チアミン一リン酸は高粘度低減可能性を示した。
ピロリン酸チアミン及び塩酸チアミン、チアミン一リン酸塩は、１５２ｍｇ／ｍｌ及び１８５ｍｇ／ｍｌのさらに高い蛋白質濃度で評価した。
７５ｍＭのピロリン酸チアミン及び１５０ｍＭの塩酸チアミン、チアミン一リン酸は、インフリキシマブ溶液に対して強い粘度低下効果を有することが見出された。

熱誘導蛋白質の展開（unfolding）（Ｔｍ）を特徴づける熱力学的転移温度の増加を、１５０ｍＭバリン、ロイシン、アスコルビン酸、又はプロリンの添加で観察した。
同様に５ｍＭのシアノコバラミンを加えるとＴｍが増加し、さらに１５０ｍＭのバリン、ロイシン、アスコルビン酸、プロリンを加えると凝集開始温度Ｔａｇｇが増加した。

賦形剤の組み合わせを用いると、熱力学的な展開温度も同様に上昇させることができる。
オルニチン／ピリドキシン、オルニチン／チアミン一リン酸、オルニチン／ピロリン酸チアミン、アルギニン／ピリドキシン、アルギニン／チアミン一リン酸、アルギニン／ピロリン酸チアミン、カルニチン／ピリドキシン、カルニチン／チアミン一リン酸、フェニルアラニン／チアミン一リン酸、フェニルアラニン／ピロリン酸チアミンを用いた場合、各７５ｍＭのカチオン／アニオンからなる組み合わせで、Ｔｍの増加が観察された。

タンパク質濃度１９２ｍｇ／ｍｌで吸収分光法を用いて測定した場合、１５０ｍＭのロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、リジン、及び塩酸グアニジンの添加によるエボロクマブ製剤の粘度の低下が観察された。
１９２ｍｇ／ｍｌのより高い蛋白質濃度を用いた場合、賦形剤として１５０ｍＭのロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、及び塩酸グアニジンを用いた粘度低減が観察された。ロイシン、リジン及び塩酸グアニジンが最も顕著な粘度低減効果を示した。

Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定した１８０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度では、エボロクマブ製剤の粘度は、１５０ｍＭのピリドキシン又は塩酸チアミンの添加により低減した。
同様に、５ｍＭのシアノコバラミン、２５ｍＭの塩酸キニーネ又は７５ｍＭのパラセタモールの添加は、製剤の粘度を低減させた。

１９６ｍｇ／ｍｌのさらに高い蛋白質濃度では、１５０ｍＭのピリドキシン、塩酸チアミン又はアスコルビン酸の添加により、製剤の粘度が低下した。
また、５ｍＭのシアノコバラミン、２５ｍＭの塩酸キニーネ又は７５ｍＭのパラセタモールを添加すると、製剤の粘度が低下した。
このデータセットでは、塩酸チアミンが最も効率的な粘度低減賦形剤であることが分かった。

３番目のデータセットでは、７５ｍＭのピロリン酸チアミンと１５０ｍＭの塩酸チアミン、チアミン一リン酸の粘度低下能を比較した。
いずれの添加剤もエボロクマブ製剤の粘度を低減させた。
７５ｍＭピロリン酸チアミンは、１７９ｍｇ／ｍｌ及び２０４ｍｇ／ｍｌのエボロクマブを含む製剤に使用される場合、非常に効率的である。
１５０ｍＭのチアミン一リン酸は、１８０ｍｇ／ｍｌのエボロクマブ濃度でのみ試験された。

２種の粘度低減賦形剤の組合せにより、相乗的に蛋白質溶液の粘度を低減させることができることが分かった。
１５０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２でのインフリキシマブ製剤のパーセント粘度（percentual viscosity）は、オルニチンと葉酸の組合せ、カルニチンと葉酸の組合せの添加により相乗的に低減された。

１９０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０でのエボロクマブ製剤のパーセント粘度は、フェニルアラニンとカンファースルホン酸の組み合わせ、フェニルアラニンとベンゼンスルホン酸の組み合わせ、アルギニンとピリドキシンの組み合わせ、メグルミンとピリドキシンの組み合わせ、メグルミンとチアミン一リン酸の組み合わせの添加により相乗的に低減された。

さらに、上記の賦形剤及び賦形剤の組み合わせは、バイオプロセスにおいて有益であることが見出されている。
本発明による実験は、賦形剤及び賦形剤の組み合わせが、クロマトグラフィーカラムの背圧を低減し、より大きな流速を可能にするのに適していることを示唆するものである。これは、溶液中のタンパク質を緊張させるせん断力の減少につながり、したがって、凝集が低減することになる。その結果、より高い収率を得ることができる。これ以上に、より高い流量を用いてプロセスを実行できる場合、プロセス時間は大幅に短縮される。

本明細書でいうバイオプロセスでは、粘度を下げる添加剤として機能することが分かっているこれらの賦形剤の添加は、一方では無傷のタンパク質の収率を改善し、他方ではプロセスの期間を短縮することができるという点で、プロセスの経済性を向上させることにつながる。

本発明では、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）による遠心ろ過の研究が実験の基礎となる。これらの実験は、溶液が遠心力によってフィルター膜を通過する、あらゆるプロセスステップに類似している。遠心力に対する抵抗は、フィルターの特性（この実験の文脈では一定と仮定する）及び溶液の粘度に依存する。最も好ましい溶液を提供する賦形剤と賦形剤の組み合わせは、攪拌セルを用いたより複雑な実験用に選択される。

Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）攪拌セルを用いた実験では、窒素ガスを用いて、フィルターを通して押されている溶液に圧力を加える。
圧力の抵抗はフィルターの特性（この実験の文脈では一定と仮定する）及び溶液の粘度に依存する。最も良好な結果が得られる賦形剤の組み合わせを、実験室規模のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システムを用いた実験に使用する。

これらの実験は、デッドエンドろ過アプローチ（dead-end filtration approaches）における粘度低減剤の有益な効果を強調する。さらに、例えばクロマトグラフィー精製中に、後端圧力（back-end pressure）によって加えられる力によって溶液がゲルベッド（gel bed）のようなフィルター又は媒体に通される技術的アプローチにおいて、開示される粘度低減賦形剤は有益な効果を有することが明らかになった。
前記ろ過工程は、主に下流プロセスで使用されるが、粘度低減賦形剤もまた、上流プロセスで有益であり得る。
タンパク質濃度が粘性の原因となるレベルまで上昇し、溶液をチューブやフィルターに通して細胞物質やゴミを除去する際に、圧力制限やせん断力による悪影響が記述されている場合、本発明は明らかに有益な効果をもたらすであろう。
タンジェンシャルフローろ過のプロセス効率を測定するために、以前に使用された方法とは対照的に、フィールドフロー（field flow）の大部分は、フィルタを通過するのではなく、フィルタの表面を接線方向に横切って進む、実験室規模のTFFシステムが使用された。
ろ過原理は前述の方法とは異なるが、ここでもろ過効率は膜の抵抗に依存し、ここでも一定であり、溶液粘度は本発明によって改良される。
ろ過法は、製剤緩衝液を交換したり、生体分子の濃度を所望のレベルにするために用いられる典型的な単位操作である。
本明細書で使用される攪拌セルは、デッドエンドフィルターの代表であり、供給物をフィルター材料に通すと、材料の上部に大きな分子が保留され、装置のもう一方の端に濾液が放出される仕組みになっている。

緩衝液を交換し、タンパク質を濃縮するための頻繁な方法はタンジェンシャルフローろ過であり、以前に使用されていた方法とは対照的に、フィールドフローの大部分は、フィルタを通過するのではなく、フィルタの表面を接線方向に横切って進む。
撹拌セルがタンジェンシャルフローろ過において使用される場合と同様に、大きな分子は、適切なフィルター材料に小さな分子を通すことによって小さな分子から分離される。
デッドエンドろ過（dead end filtration）の一種である攪拌セルとは対照的に、タンジェンシャルフローろ過では、フィードのフロー形状を変えることでフィルターケーキの形成を防ぎ、連続的なプロセスを可能にする。したがって、攪拌セルは、フィルター形状の違いにもかかわらず、タンジェンシャルフローろ過装置に酷似している。どちらの方法も、その効率は膜抵抗に決定的に依存する。また、粘度が高いと、使用できる流量が減少し、処理時間が長くなり、生産コストが高くなることが知られている。そこで、粘度を低減することで、せん断力を低く抑えながら効率的にろ過を行い、ろ過液のタンパク質濃度を高くすることが期待される。このことは、「During production of concentrated monoclonal antibody formulations by tangential flow ultrafiltration (TFF), high viscosities and aggregation often cause extensive membrane fouling, flux decay and low product yields」(Journal of Membrane Science Volume 508, 15 June 2016, Pages 113-126)を著述したHungらによって強調されている。

実験により、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される粘度低減賦形剤又はそれらの塩又は溶媒和物は、前述のようにバイオプロセス経済性を改善するのに適していることが示されている。
さらに、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモール又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される粘度低減賦形剤は、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される第２の粘度低減賦形剤と組み合わせてバイオプロセス経済性を改善する。
特に蛋白質溶液に依存する種々の比率での組合せは、上述のようにバイオプロセス経済性を改善する。

したがって、本発明の別の態様は、バイオプロセスにおいて、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のタンパク質を含むタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、タンパク質溶液をシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される第１の粘度低減賦形剤と組み合わせる工程を含む、方法を提供することである。
別の態様において、タンパク質溶液は、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される第１の粘度低減賦形剤、及びバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される第２の粘度低減賦形剤と組み合わせられる。

本発明の別の態様は、バイオプロセスにおける上記のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法の使用である。

本発明によれば、上記の全てのパラメータ；例えば、賦形剤の組合せ、賦形剤の濃度、タンパク質の濃度、賦形剤の比、組成物の更なる要素、例えば緩衝剤又は安定剤、ｐＨ値、粘度低下、タンパク質の規格、タンパク質の分子量は、バイオプロセスにおける使用にも適用される。

好ましくは、少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤は、ピリドキシン、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸及びフェニルアラニンからなる群から選択され、少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤は、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される。

好ましくは、ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤を含む組合せが用いられる。

好ましくは、第１の粘度低減賦形剤は、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン又はピリドキシン、より好ましくはチアミン及びピロリン酸チアミンである。
好ましくは、７５～５００ｍＭ、より好ましくは７５～１５０ｍＭ、最も好ましくは７５ｍＭ又は１５０ｍＭの濃度が用いられる。

好ましくは第２の粘度低減賦形剤は、アルギニン又はオルニチンである。
好ましい組み合わせはチアミン及びオルニチンとともにチアミン及びアルギニンである。
好ましくは、各賦形剤の濃度は７５～５００ｍＭ、より好ましくは７５～１５０ｍＭ、最も好ましくは７５ｍＭ又は１５０ｍＭである。

第１の粘度低減賦形剤を第２の粘度低減賦形剤と組み合わせて使用する場合、その比は１：３～３：１の範囲にあり、より好ましくは１：２～２：１、最も好ましくは１：１である。

タンパク質溶液及び実施したバイオプロセスに応じて、異なる緩衝系を緩衝液として使用してもよい。
本明細書では、バイオプロセス中の条件に応じて、酢酸アンモニウム又は酢酸ナトリウムのような酢酸塩、重炭酸アンモニウム又は重炭酸ナトリウムのような炭酸塩、リン酸ナトリウム又はトリスリン酸塩のようなリン酸塩を使用してもよい。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおけるタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、ろ過段階におけるタンパク質溶液の透過流量が、カンファースルホン酸を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤並びにバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される第２の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、増加される、方法を提供する。

本発明の別の態様は、バイオプロセスにおける上記方法の使用であって、ろ過工程におけるタンパク質溶液の透過流束が、カンファースルホン酸を含まないタンパク質溶液組成物と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも一つの第１の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも一つの第１の粘度低減賦形剤、並びに、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸、及びベンゼンスルホン酸らなる群より選択される少なくとも一つの第２の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、増加される使用を提供する。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおける方法の使用であって、ろ過工程におけるタンパク質溶液の透過流量が、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度減少賦形剤、並びにアルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の粘度減少賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して増加される方法を提供する。

本発明の別の態様は、上述のバイオプロセスにおけるタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、ろ過工程におけるタンパク質溶液の透過流量は、ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸塩、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せを含まない同一のタンパク質溶液と比較して増加される方法を提供する。

透過流束の増加は、少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、最も好ましくは１０％～１００％のパーセント増加（percentage increase）を意味する。

本発明の別の局面は、上記のバイオプロセスにおけるタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、フィルター中の緩衝液交換及び体積減少後のタンパク質回収率（recovery）が、カンファースルホン酸を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度減少賦形剤、並びにバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される第２の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、増加される方法を提供する。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおける方法の使用であって、フィルター中の緩衝液交換及び体積減少後のタンパク質回収率が、カンファースルホン酸を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群より選択される少なくとも１つの第１の粘度減少賦形剤、並びにバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される少なくとも１つの第２の粘度減少賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、増加される使用である。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおける方法の使用であって、フィルター中の緩衝液交換及び体積減少後のタンパク質回収率が、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度減少賦形剤、及びアルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して増加する、使用である。

本発明の別の態様は、上述のバイオプロセスにおける方法の使用であって、フィルター中の緩衝液交換及び体積減少後のタンパク質回収率が、ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せを含まない同一のタンパク質溶液と比較して増加する使用である。

フィルター中の緩衝液交換及び体積減少後のタンパク質回収率の増加は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは５％～２０％のタンパク質回収率のパーセンテージ増加を意味する。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおけるタンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、ろ過工程、好ましくはタンパク質が濃縮されるろ過工程のプロセス時間が、カンファースルホン酸を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも1つの第１の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモール、並びにバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される第２の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、低減されている方法を提供する。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおける方法の使用であって、ろ過工程、好ましくはタンパク質が濃縮されるろ過工程のプロセス時間が、カンファースルホン酸を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、又はシアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも1つの第１の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、シアノコバラミン、ピリドキシン、アスコルビン酸、葉酸、チアミン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミン、塩酸グアニジン、塩酸キニーネ及びパラセタモールからなる群から選択される少なくとも1つの第１の粘度低減賦形剤、並びにバリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群より選択される第２の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液と比較して、低減されている使用である。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおける方法の使用であって、ろ過工程、好ましくはタンパク質が濃縮されるろ過工程のプロセス時間が、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度減少賦形剤、及びアルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の粘度減少賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液に比較して、低減されている使用である。

本発明の別の態様は、上記のバイオプロセスにおける方法の使用であり、ろ過工程、好ましくはタンパク質が濃縮されるろ過工程のプロセス時間が、ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される第１と第２の粘度低減賦形剤を含まない同一のタンパク質溶液に比較して、低減されている使用である。

ろ過工程のためのプロセス時間の減少は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは２５％～１００％のパーセンテージ減少を意味する。

本発明の特定の実施形態では、ろ過工程はタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である。

「バイオプロセス」という用語は、治療用細胞製造プロセスを意味し、これは、上流プロセス及び下流プロセスに分離することができる。
上流プロセスは、タンパク質を細胞化合物から分離する前の全過程と定義される。
上流工程は、初期の細胞の分離・培養から、細胞のバンキング・培養拡大、最終的な採取までが含まれる。
バイオプロセスにおける下流とは、上流のフィードから目的のタンパク質を精製し、純度や品質の要求を満たすように処理する部分を指す。下流工程に入る際、ある種の細胞は破壊される必要がある。
また、目的タンパク質を培地中に分泌する細胞もあり、その場合はろ過で除去する必要がある。さらに下流の処理は、通常、精製セクションとポリッシングセクションに分けられる。バイオプロセスには、バッチプロセス、半連続プロセス、連続プロセスがある。

「透過流束（permeate flux）」という用語は、一定期間内に、典型的には数分のオーダーで、規定されたフィルターを通過する体積を意味する。

「ろ過工程」という用語は、孔径が定義された材料に液体を通過させ、その大きさに基づいて物質を分離する工程を意味する。
一部のフィルターでは、孔径はナノメートル単位で定義される。しかし、他のフィルターでは、孔径は直接定義されないが、保留される分子の重量が与えられる。ろ過材料は、ろ過装置の断面を塞ぐように配置することができる（デッドエンドろ過（dead-end filtration））。
しかし、ろ過材料は、ろ過される溶液が、例えばタンジェンシャルフローろ過のように、材料の表面を接線方向に流れるように配置することができる。
ろ過材は、膜、ガラスフィルター、金属フィルター、又は樹脂であり得る。
樹脂は、クロマトグラフィーカラムに保持することができる。
樹脂は、カチオン又はアニオン交換樹脂、プロテインＡ又はグルタチオン樹脂のような親和性樹脂、又は疎水性又は親水性樹脂であり得る。

緩衝液交換及び体積減少後の「タンパク質回収率」とは、プロセス工程の後に回収されるタンパク質の画分を指す。

「タンジェンシャルフローろ過」又は「ＴＦＦ」という用語は、溶液が規定のフィルターを接線方向に通過するろ過方法をいう。
ろ過孔より小さい物質は、溶液の流量、粘度、温度及びその他の要因から生じる圧力により、フィルターを通して溶液から押し出される。

１．粘度測定
１．１ ｐＨ７．２でのリン酸緩衝液中で製剤化したインフリキシマブに対するバリン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、アスコルビン酸、ピリドキシン、シアノコバラミン、塩酸チアミン、葉酸、ピロリンチアミン及びチアミン一リン酸の粘度低減効果

緩衝液の調製
リン酸二水素ナトリウムとリン酸二ナトリウムをｐＨ７．２となるように適宜混合し、超純水に溶解して５ｍＭリン酸緩衝液を調製した。この比率は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式で求めた。ｐＨは必要に応じてＨＣｌ及びＮａＯＨ用いて調整した。
安定剤として５０ｍｇ／ｍｌのショ糖と０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を添加した。

サンプルの調製
バリン、ロイシン、フェニルアラニン、アスコルビン酸、ピリドキシン、プロリン及びチアミン一リン酸の個々の賦形剤溶液１５０ｍＭを、リン酸緩衝液ｐＨ７．２中で調製した。
同じ緩衝液中にシアノコバラミンの５ｍＭ溶液を調製した。
葉酸は、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．２中、１３ｍＭの濃度で調製した。ピロリン酸チアミンは、リン酸緩衝液ｐＨ７．２中、７５ｍＭの濃度で調製した。ｐＨは、必要に応じてＨＣｌ又はＮａＯＨを用いて調整した。

遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）を用いて所望の賦形剤を含む濃縮インフリキシマブ溶液を調製し、それぞれの賦形剤を含む緩衝液と元の緩衝液を交換し、溶液の体積を減少させた。
その後、蛋白質をそれぞれ１２２ｍｇ／ｍｌ及び１４３ｍｇ／ｍｌに希釈した。

タンパク質濃度測定
蛋白質濃度はＬａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの法則を適用した吸収分光法を用いて決定した。
賦形剤自身が２８０ｎｍで強い吸光度を持つとき、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いた。

濃縮たん白質溶液を希釈し、その期待濃度が測定で０．３～１．０ｍｇ／ｍＬになるように調製した。
吸収分光法では、ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ｋｉｎｅｔｉｃｓ（エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）を用いて、タンパク質消衰係数（protein extinction coefficient）をＡ_０．１％、２８０ｎｍ＝１．４２８として２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。

賦形剤の中には、それ自身が２８０ｎｍで強い吸収を示すものがあり、濃度決定にＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いる必要がある。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）のキット及び牛γグロブリン標準品（Ｂｏｖｉｎｅ Ｇａｍｍａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用した。
吸光度は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）Ｗｅｌｌｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて５９５ｎｍで測定した。
蛋白質濃度は、１２５～１５００μｇ／ｍｌまでの標準曲線の直線回帰により決定した。

粘度測定
粘度測定にはｍＶＲＯＣ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｈｅｏ Ｓｅｎｓｅ、サンラモン カリフォルニア州、米国）を使用した。
測定は、２０℃で５００μｌのシリンジを用い、３０００秒^－１のせん断速度で実施した。２００μｌの体積が使用された。すべてのサンプルはトリプレット（triplicates）として測定した。

これらの実験に関する粘度測定結果を図１、図２及び図３に示す。

１．２ ｐＨ５．０での酢酸緩衝液中で製剤化したエボロクマブのロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、塩酸グアニジン、アスコルビン酸、ピリドキシン、シアノコバラミン、塩酸キニン、塩酸チアミン、パラセタモール、ピロリン酸チアミン及びチアミン一リン酸による粘度低減効果

緩衝液の調製
１．２ｍｇ／ｍｌの氷酢酸と超純水を混合して２０ｍＭ酢酸緩衝液を調製した。必要に応じてＨＣｌ及びＮａＯＨを用いてｐＨを５．０に調整した。安定剤として０．１ｍｇ／ｍｌのポリソルベー８０を添加した。

サンプルの調製
ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスコルビン酸、ピリドキシン、プロリン、リジン、塩酸グアニジン、塩酸チアミン、チアミン一リン酸の個々の賦形剤溶液１５０ｍＭを、それぞれ酢酸緩衝液ｐＨ５．０中で調製した。同様に、２５ｍＭの塩酸キニーネと５ｍＭのシアノコバラミンもそれぞれ調製した。パラセタモールとチアミンピロリン酸は７５ｍＭの濃度で調製した。ｐＨは、必要に応じてＨＣｌ又はＮａＯＨを用いて調整した。
遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）を用いて所望の賦形剤を含む濃縮エボロクマブ溶液を調製し、元の緩衝液を関連する賦形剤を含む緩衝液と交換し、溶液の体積を減少させた。
続いて、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、リジン及び塩酸グアニジンに関する実験ではそれぞれ１７２ｍｇ／ｍｌ及び１９２ｍｇ／ｍｌに、アスコルビン酸、ピリドキシン、シアノコバラミン、塩酸キニン、塩酸チアミン及びパラセタモールに関する実験では１８０及び１９６ｍｇ／ｍｌに、ピロリン酸チアミン及びチアミン一リン酸に関する実験では１７９及び２０４ｍｇ／ｍｌに希釈してタンパク質を調製した。

タンパク質濃度測定
タンパク質濃度は、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの法則を適用した吸光光度法を用いて決定した。賦形剤自体が２８０ｎｍで強い吸光度を持つ場合は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用した。
濃縮タンパク質溶液は、測定時の期待濃度が０．３～１．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。
吸収分光法では、ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ｋｉｎｅｔｉｃ（エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）を用いて、タンパク質消衰係数(protein extinction coefficient)をＡ_０．１％、２８０ｎｍ＝１．４２８として２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）のキット及び牛γグロブリン標準品（Ｂｏｖｉｎｅ Ｇａｍｍａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用した。
吸光度は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標） Ｗｅｌｌｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて５９５ｎｍで測定した。
蛋白質濃度は、１２５～１５００μｇ／ｍｌまでの標準曲線の直線回帰により決定した。

粘度測定
粘度測定にはｍＶＲＯＣ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｈｅｏ Ｓｅｎｓｅ、サンラモン カリフォルニア州、米国）を使用した。
測定は、２０℃で５００μｌのシリンジを用い、１６０～１７９ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液では３０００秒^－１のせん断速度で、１８０～２１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液では２０００秒^－１のせん断速度で実施した。２００μｌの体積が使用された。すべてのサンプルはトリプレットとして測定した。

これらの実験に関する粘度測定結果を、図４、図５及び図６に示す。

１．３ ｐＨ７．２でのリン酸緩衝液で製剤化したインフリキシマブに対する塩酸チアミン、ピリドキシン、葉酸、フェニルアラニン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミンの組み合わせの粘度低減効果

緩衝液の調製
リン酸二水素ナトリウムとリン酸二ナトリウムをｐＨ７．２となるように適宜混合し、その混合物を超純水に溶解して５ｍＭのリン酸塩緩衝液を調製した。この比率は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式で求めた。ｐＨは必要に応じてＨＣｌびＮａＯＨで調整した。
安定剤として５０ｍｇ／ｍｌのショ糖と０．０５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を添加した。

サンプルの調製
７５ｍＭの塩酸チアミン又は７５ｍＭのフェニルアラニンをｐＨ７．２のリン酸緩衝液に溶解した賦形剤溶液に、７５ｍＭのピリドキシン、１２ｍＭの葉酸、７５ｍＭのチアミン一リン酸又はピロリン酸チアミンを添加した。
所望の賦形剤を含む濃縮インフリキシマブ溶液を、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）を用いて調製し、元の緩衝液を関連する賦形剤を含む緩衝液と交換し、溶液の体積を減少させた。
続いて、タンパク質をそれぞれ１２２ｍｇ／ｍｌ及び１５４ｍｇ／ｍｌに希釈した。

タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して決定した。
そこで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）のキットと、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの法則を適用した吸収分光法を用いて作成した標準インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ－Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用した。
吸光度は、吸光度は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）Ｗｅｌｌｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて５９５ｎｍで測定した。
タンパク質濃度は、１２５～１５００μｇ／ｍＬの標準曲線を適切に多項式回帰することによって決定した。

粘度測定
粘度測定は、１．１記載の方法に従い実施した。

これらの実験に関する粘度測定の結果を、図７に示す。

１．４ ｐＨ７．２でのリン酸緩衝液中で製剤化したインフリキシマブに対するＬ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン、カンファースルホン酸、及びベンゼンスルホン酸からなる第１のセットと塩酸チアミン、フェニルアラニン、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミンからなる第２セットの組み合わせの粘度低減効果．

緩衝液の調製
１．３に記載の方法に従い、緩衝液の調製を実施した。

サンプルの調製
７５ｍＭのＬ－オルニチン一塩酸塩、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン塩酸塩又はフェニルアラニンをｐＨ７．２のリン酸緩衝液に溶解した賦形剤溶液に、７５ｍＭのピリドキシン、１２ｍＭの葉酸、７５ｍＭのチアミン一リン酸又は７５ｍＭピロリン酸チアミンを添加した。７５ｍＭの塩酸チアミン又はフェニルアラニンに、７５ｍＭのカンファースルホン酸又はベンゼンスルホン酸を添加した。
所望の賦形剤を含む濃縮インフリキシマブ溶液を、１．３に記載に従い調製した。

タンパク質濃度測定
１．３に記載の方法に従い、タンパク質濃度を測定した。

粘度測定
１．１に記載の方法に従い粘度測定を実施した。

これらの実験に関する粘度測定の結果を図８に示す。

１．５ ｐＨ５．０での酢酸緩衝液で製剤化したエボロクマブに対する塩化ナトリウム、アルギニン、並びにＬ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる第１セットと塩酸チアミン、ピリドキシン、チアミン一リン酸、ピロリン酸チアミンからなる第２セットとの組み合わせの粘度低減効果

緩衝液の調製
１．２ｍｇ／ｍｌの氷酢酸と超純水を混合して２０ｍＭ酢酸緩衝液を調製した。必要に応じてＨＣｌ及びＮａＯＨを用いてｐＨを５．０に調整した。
安定剤として０．１ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を添加した。

サンプルの調製
７５ｍＭのＬ－オルニチン一塩酸塩（L-ornithine monohydrochloride）、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン塩酸塩（L-carnitine hydrochloride）又はメグルミンをｐＨ５．０の酢酸緩衝液に溶解した賦形剤溶液に、７５のｍＭピリドキシン、７５ｍＭのチアミン一リン酸又は７５ｍＭのピロリン酸チアミンを添加した。７５ｍＭの塩酸チアミンには、７５ｍＭのピリドキシン、カンファースルホン酸又はベンゼンスルホン酸を添加した。
所望の賦形剤を含む濃縮エボロクマブ溶液を、遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）を用いて調製し、元の緩衝液を関連する賦形剤を含む緩衝液と交換し、溶液の体積を減少させた。
続いて、タンパク質をそれぞれ１６３ｍｇ／ｍｌ及び１８０ｍｇ／ｍｌに希釈した。

タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して決定した。
そこで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）のキットと、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの法則を適用した吸収分光法を用いて作成した標準エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ－Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用した。
吸光度は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）Ｗｅｌｌｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて５９５ｎｍで測定した。
タンパク質濃度は、１２５～１５００μｇ／ｍＬの標準曲線を適切に多項式回帰することによって決定した。

粘度測定
粘度測定は、１．２に記載の方法に従い実施した。

これらの実験に関する粘度測定の結果を図９に示す。

１．６ アルギニン／ピリドキシン、オルニチン／葉酸、カルニチン／葉酸、メグルミン／ピリドキシン、メグルミン／チアミン一リン酸、ピリドキシン／チアミン一リン酸、フェニルアラニン／カンファースルホン酸及びフェニルアラニン／ベンゼンスルホン酸の組み合わせにおける粘度低減の相乗効果について

７５ｍＭＬ－オルニチン一塩酸塩、Ｌ－カルニチン塩酸塩、ピリドキシン又はチアミン一リン酸を含む１５０ｍｇ／ｍＬのインフリキシマブのサンプルを、１．１に記載したように調製及び分析した。
７５ｍＭのメグルミン、カンファースルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ピリドキシン又はチアミン一リン酸を含む１９０ｍｇ／ｍＬのエボロクマブのサンプルは、１．２に記載したように調製及び分析した。

これらのデータ及び１．１～１．５で得られたデータについて、調査した粘度低減賦形剤を含まないそれぞれのコントロールサンプル（コントロールの粘度）と比較した低減率（percentual reduction）を算出した。これらの粘度低減率を用いて、これらを組み合わせれば、期待粘度低減率を算出することができる。

５０％ずつ粘度を低減する賦形剤を２つ組み合わせると、０ｍＰａｓの粘度になることから、期待値は絶対値で計算することはできない。科学的な観点からは、これは実現不可能であり、特に賦形剤が５０％以上粘度を低減させることにより、負の粘度値をもたらす場合はそうである。そこで、両賦形剤の期待粘度低減量を逐次計算により求めた。

期待粘度＝コントロールの粘度＊（１００％－第１の賦形剤の粘度低減率［％］）＊（１００％－第２の賦形剤の粘度低減率［％］）
粘度１００ｍＰａｓの溶液に、（ｉ）５０％ずつ、（ｉｉ）７５％ずつ粘度を低減する２つの賦形剤を組み合わせた場合の計算例である。
（ｉ）期待粘度＝１００ｍＰａｓ＊（１００％－５０％）＊（１００％－５０％）＝２５ｍＰａｓ
（ｉｉ）期待粘度＝１００ｍＰａｓ＊（１００％－７５％）＊（１００％－７５％）＝６．２５ｍＰａｓ

２つの賦形剤の組み合わせで、期待される粘度と比較して低い粘度、すなわち高い粘度低減が観察された場合、その組み合わせは相乗効果があると判断される。

図２１は、オルニチン／葉酸、カルニチン／葉酸及びピリドキシン／チアミン一リン酸の組み合わせにおける相乗的な粘度低減効果を示す図である。
図２２は、フェニルアラニン／カンファースルホン酸、フェニルアラニン／ベンゼンスルホン酸、アルギニン／ピリドキシンの組み合わせにおける相乗的な粘度低減効果を示す図である。
図２３は、メグルミン／ピリドキシン及びメグルミン／チアミン一リン酸の組み合わせにおける相乗的な粘度低減効果を示す図である。

２． 熱安定性測定
２．１ バリン、ロイシン、アスコルビン酸、シアノコバラミン及びプロリンを単一賦形剤とするｐＨ７．２でのリン酸緩衝液中で製剤化されたインフリキシマブの熱安定性

緩衝液及びサンプルは１．１に記載のように調製した。

熱安定性測定
Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）のナノＤＳＦ技術（nano-DSF Technology）を使用して、融点及び凝集点を決定した。
蛍光は３３０ｎｍと３５０ｎｍで、後方散乱強度（backscattering intensity）は２０～９５℃の温度範囲で１℃／ｍｉｎの傾斜で測定した。

これらの実験に関する熱安定性の測定結果を図１０に示す。

２．２ Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン、フェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなる第１セットとピリドキシン、チアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンからなる第２セットの組み合わせを含むｐＨ７．２でのリン酸緩衝液中で製剤化したインフリキシマブの熱安定性。

緩衝液とサンプルは１．４と１．５で記載のように調製した。

熱安定性測定は、２．１に記載のように実施した。

これらの実験に関する熱安定性測定の結果を図１１に示す。

３． 保存安定性の測定
３．１ 貯蔵条件
賦形剤の組み合わせの使用は、医薬製剤の安定性管理を補助するために有益である。当該製剤の安定性を評価するために、サンプルは温度と相対湿度の点で標準化された条件で保存される。典型的に評価される温度は、４℃、２０℃、２５℃、及び４０℃を含む。相対湿度は、典型的には４０％、６０％又は７５％である。タンパク質製剤の安定性は、異なる基準を用いて評価することができる。前記基準を測定する方法は、研究される特定のタンパク質に対して最適化及び検証される必要があるが、これは当業者にとって自明な課題である。

我々は、７０ｍｇ／ｍｌを超える高濃度のタンパク質の医薬製剤を調製し、２５℃、相対湿度６０％で保管する。その後２４週間の間に、６つの時点でサンプルを保管場所から取り出し、以下のパラメータに関して分析する。フラグメンテーション、凝集／モノマー含有量、含有量、コンフォメーション安定性、粒子含有量、及びｐＨ。

３．２ タンパク質フラグメンテーションの測定
フラグメントは、当該抗体よりも小さな物質に感度のある適切なサイズ排除カラムを備えたＨＰＬＣシステムを使用して測定することができる。分子はそのサイズに基づいて分離され、フラグメントの溶出時間は無傷のタンパク質の溶出時間より長くなければならない。フラグメントとタンパク質は、通常２１４ｎｍの吸収によって検出される。フラグメントを検出するもう一つの方法は変性ゲル電気泳動であり、一般的にはドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて行われる。ＳＤＳはタンパク質とそのフラグメントを可溶化し、電荷をマスクするため、ゲルマトリックス内で分子の大きさによる分離が可能になる。

３．３ タンパク質凝集度測定
凝集又はモノマー含有量は、標的タンパク質の分子量を決定するのに適したカラムを用いたＨＰＬＣ－ＳＥＣを用いて測定することができる。２１４ｎｍの吸収を用いるする場合は、標的タンパク質のピークの数値積分値から、サンプルのタンパク質含有量を決定することができる。インキュベーション後のサンプルのタンパク質含有量を基準サンプルで割ると、モノマー含有量になる。フラグメンテーションを決定するＨＰＬＣ法とは異なり、本カラムは標的タンパク質より大きな分子種を検出するのに適している。

３．４ タンパク質含有量の測定
タンパク質含有量は、前項に記載したＨＰＬＣ法、あるいはＬａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒ式を適用した吸光光度法を用いて測定することができる。さらに、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてもよい。
コンフォメーションの安定性を調べるために、蛍光分光法を用いたサーマルシフト法（thermal shift assay）を適用することができる。熱変性中間点（heat denaturation mid-point）Ｔｍを測定することにより、タンパク質のコンフォメーション変化を発見することができる。

３．５ 粒子分析法
粒子は、例えば、濁度測定、フローイメージング技術（flow Imaging techniques）、それぞれのサイズに依存する動的光散乱等の光掩蔽法（light obscuration methods）によって可視化することができる。
ｐＨは、ｐＨ電極を使用してモニターすることができる。
一般に、各パラメータの偏差は１０％未満であれば許容される。しかし、粒子分析法、特に一粒子計測に焦点を当てた分析法は、ポソイド統計（Possoinian statistics）の使用により、本質的に最大３０％の比較的高い誤差を有している。

４．遠心フィルターユニットの有益性
緩衝液調製
クエン酸一水和物を超純水に溶解して１０ｍＭクエン酸緩衝液を調製し、必要に応じて塩酸及び水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に調整した。安定剤として０，２５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を添加した。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、オルニチン（ＯＭ）、アルギニン（Ａｒｇ）、塩酸チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ ＨＣｌ）、チアミン一リン酸、及びピロリン酸チアミンの賦形剤溶液を、ｐＨ５．５、濃度１５０ｍＭのクエン酸緩衝液で調製した。これらの賦形剤のうち２種類を含む組み合わせは、それぞれ７５ｍＭ又はそれぞれ１５０ｍＭの濃度で調製した。

サンプル調製
約１４．７ｍｇ／ｍｌのセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）溶液を出発物質として使用した。そのため、最大２０％のサンプルロスを想定し、５００μＬのサンプルで１２０ｍｇ／ｍｌ以上の最終濃度を達成するのに十分な量を算出した。

蛋白質濃度測定
タンパク質濃度は、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの法則を適用した吸光光度法を用いて決定した。賦形剤自体が２８０ｎｍで強い吸光度を持つ場合は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法が使用した。
濃縮タンパク質溶液は、測定時の期待濃度が０．３～１．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。
吸収分光法では、ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ｋｉｎｅｔｉｃ（エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）を用いて、タンパク質消衰係数をＡ_０．１％、２８０ｎｍ＝１．４として２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
タンパク質濃度２８０ｎｍで光を吸収した賦形剤については、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定した。
そこで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）のキット及び、及びＬａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒ’ｓ－Ｌａｗを適用した吸収分光法を用いて調製した標準セツキシマブ（Cetuximab-Standard）を用いた。
吸光度は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）Ｗｅｌｌｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて５９５ｎｍで測定した。
タンパク濃度は、１２５～１５００μｇ／ｍＬの標準曲線の適切な多項式回帰により決定した。

体積測定
透過体積は適切なサイズのメスフラスコを用いて測定した。

Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルターユニットについては、遠心分離後、透過液をメスフラスコに移した。
Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）攪拌セル実験では、このようなものに直接透過液を回収した。
濃縮蛋白質溶液の体積は、Ｍｕｌｔｉｐｅｔｔｅ（登録商標）Ｅ３Ｘ（エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）及び適切なサイズのＣｏｍｂｉｔｉｐｓ ａｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）を用いてを測定した。

緩衝液交換と体積減少
３０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルターを用いて、元の緩衝液と関連する賦形剤を含む緩衝液を交換し、溶液の体積を減少させた。
５ダイア容量（Five diavolumes）を用いて、元の緩衝液と関連する賦形剤を含む緩衝液とを交換した。
透過流束を測定するために、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルターを２０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上述のように体積を測定した（４回繰り返し、平均を算出する）。
最終濃度を測定するために、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離機で小刻みに遠心分離し、５００μＬに達した時点で累積濃度を表示した。

図１２～図１６は、透過液流速の増加によるプロセスの改善を強調している。

５． 攪拌セルの有益性
Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離機での処理で効果があった賦形剤とその組み合わせを、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）撹拌セルでのろ過に使用した。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）スピンカラム濃縮機（spin column concentrators）が遠心力によって駆動するのに対し、攪拌セルは窒素や空気の流れの形で溶液に適用される背圧によって作動する。このモデルシステムは、溶液の処理性をテストするために頻繁に使用され、これまで使用されてきたＡｍｉｃｏｎ(R)遠心分離フィルターに比べ、より身近なモデルシステムとなっている。

緩衝液は、実施例４に従って調製した。

サンプルの調製
抗体原液の容量は、最大２０％の損失を想定し、２５ｍｇ／ｍＬのセツキシマブを含む溶液が少なくとも１０ｍＬ得られるように計算した。

タンパク質濃度測定及び体積測定は、実施例４に従って実施した。

緩衝液交換と体積減少
攪拌セルのセットアップには、ＮＭＷＬが３０ｋＤａ、活性膜面積（active membrane area）が１３．４ｃｍ²の限外ろ過ディスクフィルターを５０ｍＬまで収容できるモデルを使用した。
各体積のセツキシマブ原液を攪拌セルに充填し、各緩衝液を５０ｍＬになるように添加した。
５ダイア容量を用いて、元の緩衝液と関連する賦形剤を含む緩衝液とを交換した。
透過流量を測定するため、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）撹拌セルに４ｂａｒの圧力をかけ、２００ｒｐｍの攪拌速度で３０分間（４回）攪拌した（磁気スターラープレートを使用）。
最終濃縮時間として、セルに各緩衝液を５０ｍＬまで満たし、２００ｒｐｍのスターラー速度で４ｂａｒの圧力をかけた。
１０ｍＬに達した時点で、持続時間を表示し、プロセスを停止し、得られた抗体溶液の体積と濃度を上記のように測定した。
実施例４に記載したように、製剤の平均透過流束に対する効果を最初に評価する。
結果は、図１７～図１９に示す。

６． ＴＦＦによる処理の有益性
Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）フィルターと攪拌セルを用いたこれまでの実験に基づき、タンジェンシャルフローろ過システムでのろ過の有益性を評価するために、賦形剤の組み合わせを１つ選択した。
このシステムは大規模バイオプロセシング工程に最も近いモデルを表す。
本明細書で使用された賦形剤の組み合わせは、前の２つのステップによって模倣されたプロセスに対して有益な効果を示したことから、プロセス効率及び回収前にプラスの効果を持つ他の賦形剤も、この設定で同様の効果を持つことが想定される。プロセス効率及び回復率の事前にプラスの効果を有する他の賦形剤は、この設定においても同様の効果を持つことが想定される。

緩衝液は実施例４に従って調製した。

サンプルの調製
抗体原液の体積は、最大２０％の損失を想定して、８０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブを含む溶液が少なくとも３０ｍＬ得られるように計算した。

タンパク質濃度測定及び容量測定は、実施例４に従って実施した。

緩衝液交換と体積減少
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬカセット、Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）３０ｋＤａ、装置サイズ：５０ｃｍ²及び５００ｍｌのリザーバーを装備したAＫＴＡ流量Ｓクロスフローろ過システム（AKTA flux S cross flow filtration system）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、マールボロー、マサチューセッツ州、米国）を用いて、プロセス上の有益性を評価した。
上記の規定量のセツキシマブ溶液をリザーバーに注入し、４５０ｍｌのマークまで満たした。
サンプルをシステム内で循環させながら、移送ポンプを用いてさらに４ダイア容量を段階的に追加した。サンプルの濃縮のため、供給流量を３０ｍｌ／ｍｉｎに、スターラー回転数を６０ｒｐｍに調整した。プロセスは、最小のタンク残量２０ｇ又は供給ポンプ圧力４ｂａｒに到達することで停止した。濃縮された抗体溶液は、システムのインラインアウトレット（in-line outlets）を使用して回収された。

図２０では、タンク残量と圧力がプロセス時間に対してプロットされている。賦形剤なしの製剤と、７５ｍＭオルニチンと７５ｍＭ塩酸チアミンを使用して粘度を管理した製剤を比較している。粘度低減賦形剤を使用した場合、プロセス時間を約２時間から約１．４時間に短縮することができる。同時に、粘度低減賦形剤を使用した場合、システム圧力は、当該賦形剤を含まない同等の製剤のシステム圧力より低いままである。蛋白質により高いシステム圧力が十分に許容され、より高い流量が使用できるならば、システム時間のさらなる低減が可能であることは明らかである。さらに、粘度低減賦形剤を使用することで、３０％高い濃度に達することができた。

図１は、賦形剤としてバリン、ロイシン、フェニルアラニン及びプロリンを用い、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの法則を用いて決定したタンパク濃度における、ｐＨ７．２でのインフリキシマブ（Infliximab）の粘度を示す。
図２は、賦形剤としてアスコルビン酸、シアノコバラミン、塩酸チアミン、葉酸、ピロリン酸チアミン及びチアミン一リン酸を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定したタンパク質濃度における、ｐＨ７．２のインフリキシマブの粘度を示す。
図３は、賦形剤としてチアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定したタンパク質濃度における、ｐＨ７．２でのインフリキシマブの粘度を示す。
図４は、賦形剤としてロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、リジン及び塩酸グアニジンを用い、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの法則を用いて決定したタンパク濃度における、ｐＨ５．０でのエボロクマブ（Evolocumab）溶液の粘度を示す。
図５は、賦形剤としてアスコルビン酸、ピリドキシン、シアノコバラミン、塩酸キニーネ二水和物、塩酸チアミン及びパラセタモールを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定した、タンパク質濃度におけるｐＨ５．０でのエボロクマブ溶液の粘度を示す。
図６は、賦形剤としてピロリン酸チアミン及び塩酸チアミン、チアミン一リン酸を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定したタンパク質濃度における、ｐＨ５．０でのエボロクマブ溶液の粘度を示す。
図７は、賦形剤として塩酸チアミン、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンの組み合わせを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定したタンパク質濃度における、ｐＨ７．２でのインフリキシマブ溶液の粘度を示す。
図８は、賦形剤としてＬ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸から成る第１のセットと、塩酸チアミン、フェニルアラニン、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンからなる第２のセットを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定した、ｐＨ７．２でのインフリキシマブ溶液の粘度を示す。
図９は、賦形剤としてＬ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる第１のセットと、塩酸チアミン、ピリドキシン、チアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンからなる第２のセットを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定されたタンパク質濃度における、ｐＨ５．０でのエボロクマブ溶液の粘度を示す。
図１０は，賦形剤としてバリン，ロイシン，アスコルビン酸，シアノコバラミン，プロリンを用いた組成物のＴｍ／Ｔａｇｇの変化を，ｐＨ７．２でのインフリキシマブ溶液のコントロールと比較して示したものである。
図１１は、Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－カルニチン、フェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなる第一のセットと、ピリドキシン、チアミン一リン酸及びピロリン酸チアミンからなる第二のセットの組合せを用いた組成物のＴｍ／Ｔａｇｇの変化を、ｐＨ７．２でのインフリキシマブ溶液のコントロールと比較して示したものである。
図１２及び１３は、透過流束の増大により示される粘度低減賦形剤及びそれらの組合せのプロセス改善を示す。
図１４及び１５は、粘度低減賦形剤及びそれらの組合せによって達成され得るプロセス時間の減少を示す。
図１６は、粘度低減賦形剤がタンパク質回収率に及ぼす影響を示す。
図１７は、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）攪拌セルろ過（stirred Cell filtration）における透過流速（permeate flux）の増加によって示される粘度低減賦形剤及びそれらの組み合わせのプロセス改善を示す。
図１８は、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）攪拌セルろ過における粘度低減賦形剤及びそれらの組み合わせによるプロセス時間の減少を示したものである。
図１９は、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）攪拌セルろ過におけるタンパク質回収率に対する粘度低減賦形剤及びそれらの組み合わせの効果を示している。
図２０は、タンジェンシャルフローろ過システムにおいて、粘度低減賦形剤及びそれらの組み合わせがタンク残量に及ぼす影響を、圧力対プロセス時間でプロットしたものである。
図２１は、オルンチン、葉酸及びそれらの組み合わせ、カルニチン、葉酸及びそれらの組み合わせ、ならびにピリドキシン、チアミン一リン酸及びそれらの組み合わせを添加した際の、１５０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２でのインフリキシマブ製剤の粘度低減率を示す。期待される減少量は、１．６に記載したように計算した。
図２２は、フェニルアラニン、カンファースルホン酸、及びそれらの組み合わせ、フェニルアラニン、ベンゼンスルホン酸、及びそれらの組み合わせ、並びにアルギニン、ピリドキシン及びそれらの組み合わせを添加した際の、１９０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０でのエボロクマブ製剤の粘度低減率を示す。期待される減少量は、１．６に記載したように計算した。
図２３は、メグルミン、ピリドキシン及びそれらの組み合わせ、メグルミン、チアミン一リン酸及びそれらの組み合わせを添加した際の、１９０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０でのエボロクマブ製剤の粘度の減少率を示す。期待される減少量は、１．６に記載したように計算した。

参考文献：
・901003.5.1-mVROC_User’s_Manual
・Guo Z. et al., "Structure-Activity Relationship for Hydrophobic Salts as Viscosity-Lowering Excipients for Concentrated Solutions of Monoclonal Antibodies", Pharmaceutical Research; 2012, 29(11):3102-9
・Hung et al., “During production of concentrated monoclonal antibody formulations by tangential flow ultrafiltration (TFF), high viscosities and aggregation often cause extensive membrane fouling, flux decay and low product yields”, Journal of Membrane Science, Volume 508, 15 June 2016, Pages 113-126

Claims (15)

1. タンパク質を含む液体組成物であって、ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤、並びにアルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸からなる群から選択される少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤を含む、液体組成物。
2. ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸、並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せを含む、請求項１に記載の液体組成物。
3. 少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤及び少なくとも１つの第２の粘度低減賦形剤を含まない同一組成物と比較して粘度が低減された、請求項１又は２に記載の液体組成物。
4. タンパク質の濃度が９０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌである、請求項１～３の何れか１項に記載の液体組成物。
5. 前記少なくとも１つの第１及び第２の粘度低減賦形剤の濃度が、それぞれ５ｍＭ～３００ｍＭである、請求項１～４の何れか１項に記載の液体組成物。
6. 液体組成物が４～８のｐＨを有する、請求項１～５の何れか１項に記載の液体組成物。
7. 前記液体組成物が、５ｍＭ～５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液又は酢酸緩衝液及び安定剤をさらに含む、請求項１～６の何れか１項に記載の液体組成物。
8. 前記液体組成物が、マイクロ流体粘度計を用いて測定された場合、２０℃で１ｍＰａｓ～６０ｍＰａｓの粘度を有する、請求項１～７の何れか１項記載の液体組成物。
9. 前記タンパク質が、１２０ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１～８の何れか１項に記載の液体組成物。
10. 前記タンパク質が、抗体である、請求項１～９の何れか１項に記載の液体組成物。
11. 請求項１～１０の何れか１項に記載の液体組成物の凍結乾燥タンパク質製剤。
12. タンパク質溶液の粘度を低減させる方法であって、
    ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニン又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの第１の粘度低減賦形剤、及び、
    アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される第２の粘度低減賦形剤を前記タンパク質溶液に添加する工程を含む方法。
13. 第１及び第２の粘度低減賦形剤の組合せが、ピリドキシン及びアルギニン、葉酸及びオルニチン、葉酸及びカルニチン、ピリドキシン及びメグルミン、チアミン一リン酸及びメグルミン、ピリドキシン及びチアミン一リン酸、フェニルアラニン及びカンファースルホン酸、並びにフェニルアラニン及びベンゼンスルホン酸からなるリストから選択される、請求項１２に記載のタンパク質溶液の粘度を低減させる方法。
14. バイオプロセスにおける請求項１２又は１３記載の方法の使用
15. ろ過段階における前記タンパク質溶液の透過流束が、
    ピリドキシン、葉酸、チアミン一リン酸及びフェニルアラニン又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される第１の粘度低減賦形剤の少なくとも１つ、及び、
    アルギニン、オルニチン、カルニチン、メグルミン、カンファースルホン酸及びベンゼンスルホン酸又はそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択される第２の粘度低減賦形剤の少なくとも１つを含まない同一のタンパク質溶液と比較して増加する、請求項１２又は１３に記載の方法の使用。

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