CN117355321A - 增强性能的赋形剂以及降低生物制剂的粘度和提高生物制剂的稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制剂和制剂中生物治疗剂的粘度降低和稳定性增强。降低粘度和增强稳定性的方法包括将生物治疗剂与增强性能的赋形剂结合，所述赋形剂选自双乙酰精氨酸、双乙酰赖氨酸、双乙酰组氨酸、双乙酰丝氨酸、双乙酰脯氨酸、双乙酰色氨酸、丙酰精氨酸、丙酰赖氨酸、丙酰组氨酸、丙酰丝氨酸、丙酰脯氨酸、丙酰色氨酸及其混合物。

Description

增强性能的赋形剂以及降低生物制剂的粘度和提高生物制剂 的稳定性的方法
技术领域
本发明涉及增强性能的赋形剂，所述赋形剂通过例如抑制蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰将生物治疗剂的溶液粘度和物理及化学降解最小化。此外，本发明提供了将增强性能的赋形剂用于生物工程和生物制剂的方法，所述生物制剂包括蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物(ADC)、基因治疗剂、细胞治疗剂、核酸等。
背景技术
利用重组技术的生物制剂制造(生物工程)是一个复杂的过程。典型的生物工程步骤包括：(i)上游加工，在此生产产品；(ii)下游加工，在此纯化产品，以及(iii)制剂/填充和完成，在此配制产品以在整个保质期内保持所需的产品质量属性。生物制剂在制造、储存、运输和处理过程中会发生各种物理/化学降解，从而降低治疗剂的效果并增加安全隐患。生物制剂产品的实例包括蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物(ADC)、核酸以及基因治疗剂和细胞治疗剂。
生物制剂经常配制成液体溶液，特别是在用于肠胃外给药时。对于肠胃外产品有两种主要给药途径：i)静脉给药和ii)皮下给药。应力(如由温度漂移、剪切力、冷冻/解冻、光照、氧化等引起的那些)导致的稳定性损失，在静脉制剂和皮下制剂中都很常见。然而，由于经常大剂量且1ml-2ml的小输送体积的限制，给皮下给药带来额外的挑战。通常，患者不能很好地耐受输送体积大于1ml-2ml的皮下制剂。在这种情况下，为满足有限的剂量体积，高度浓缩的产品制剂可能是理想的。皮下给药的高剂量和小体积要求意味着产品浓度达到100mg/ml以上或更高。高度浓缩的制剂会对蛋白质治疗剂的可制造性、分析测试和给药带来许多挑战。高度浓缩的蛋白质制剂带来的一个挑战是提高粘度。高粘度的生物制剂在生产过程中很难处理，如，它们会减缓切向流过滤(TFF)和无菌过滤的过程，并增加加工过程中的产品损失。高粘度的制剂也难以被抽入注射器以及进行注射，使患者给药困难且不愉快。高浓度制剂的另一个挑战是稳定性。高浓度生物溶液在溶液中经常经历“拥挤”环境，形成可逆的蛋白质-蛋白质相互作用或自组装的网络。药物制造商通常使用氨基酸(如精氨酸和组氨酸)和盐(如氯化钠)使高浓度制剂的溶液粘度最小化。然而，这些添加剂经常以稳定性为代价降低粘度，其中粘度和稳定性都随着添加剂的加入而降低。因此，工业上需要能有效降低生物制剂(如，高度浓缩的蛋白质制剂)的粘度，并能在宽泛的产品浓度范围和多种治疗方式下有效稳定产品的化合物。浓度范围适当将使制造商有能力在更高浓度下储存药物，并根据商业需要或者低浓度或者高浓度配制药品。
发明内容
在一方面，包括图1所示化合物的增强性能的赋形剂通过减少蛋白质-蛋白质相互作用和防止天冬酰胺脱酰胺来降低高浓度生物制剂的粘度并增强其物理和化学稳定性。
在另一方面，包括图1所示化合物的增强性能的赋形剂适合用于生物工程，如，它们在制造过程中最小化生物制剂的物理和化学降解，并降低溶液粘度，从而简化TFF、无菌过滤和散装/药品灌装操作。
在一方面，本发明涉及生物制剂(如，蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物(ADC)、基因治疗剂、细胞治疗剂、核酸等)，所述生物制剂含有增强性能的赋形剂，以及可选的，含有表面活性剂碳水化合物、盐和氨基酸。在一个实施方案中，增强性能的赋形剂通过抑制蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰最小化蛋白质的溶液粘度和物理及化学降解。增强性能的赋形剂含有通过疏水相互作用、离子相互作用和氢键与蛋白质相互作用的官能团，导致粘度降低且物理及化学稳定性增强。在一个实施方案中，赋形剂为化学合成的，如通过氨基酸的衍生。
在一个实施方案中，本发明提供了降低生物制剂的粘度和/或提高生物制剂的稳定性的方法，包括：将生物制剂与增强性能的赋形剂结合，所述增强性能的赋形剂选自双乙酰精氨酸、双乙酰赖氨酸、双乙酰组氨酸、双乙酰丝氨酸、双乙酰脯氨酸、双乙酰色氨酸、丙酰精氨酸、丙酰赖氨酸、丙酰组氨酸、丙酰丝氨酸、丙酰脯氨酸、丙酰色氨酸及其混合物。生物制剂可以含有浓度为约1mg/ml至约500mg/ml的治疗性蛋白质，以提供增强的制剂。在一个实施方案中，生物制剂还含有其他赋形剂，其中增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。
在一个实施方案中，增强性能的赋形剂为双乙酰精氨酸。在一个实施方案中，增强性能的赋形剂为下列物质中的至少一种：双乙酰赖氨酸、双乙酰组氨酸、双乙酰丝氨酸、双乙酰脯氨酸、双乙酰色氨酸、丙酰精氨酸、丙酰赖氨酸、丙酰组氨酸、丙酰丝氨酸、丙酰脯氨酸、丙酰色氨酸。在一个实施方案中，增强性能的赋形剂为丙酰丝氨酸和双乙酰赖氨酸以约10wt.％:90wt.％至约90wt.％:10wt.％比例的混合物。
在一个实施方案中，生物制剂的粘度降低了至少约10％至约80％。在一个实施方案中，与缓冲液对照相比，增强的制剂具有较高的稳定性。在一个实施方案中，当暴露于应力温度条件下时，与缓冲液对照相比，增强的制剂具有较高的单体。在一个实施方案中，当暴露于应力温度条件下时，与缓冲液对照相比，增强的制剂具有较低的聚集体。在一个实施方案中，当暴露于应力温度条件下时，与缓冲液对照相比，增强的制剂具有较低的降解物。在一个实施方案中，当暴露于应力温度条件下时，与缓冲液对照相比，增强的制剂的酸性峰组(APG)百分比的变化较小。
在一个实施方案中，增强的制剂的pH为约4.0至约9.0。在一个实施方案中，增强的制剂为冻干粉的形式，其中至少一种增强性能的赋形剂以在用稀释剂重溶(reconstitution)时有效降低粘度的重量:重量浓度存在。在一个实施方案中，增强性能的赋形剂以约5mM至约1000mM的浓度存在，治疗性蛋白质以约1mg/ml至约500mg/ml的浓度存在。在一个实施方案中，生物制剂为蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物(ADC)、核酸、基因治疗剂和细胞治疗剂中的至少一种。
附图说明
图1：为本发明的增强性能的赋形剂的化学结构。每个赋形剂的R1、R2和R3基团不同。
图2：为mAb(单克隆抗体)的典型尺寸排阻色谱图(SEC-HPLC)。单体、聚集体和降解物的峰值如图所示。
图3：为mAb的典型离子交换色谱图(IEC-HPLC)。酸性峰组(APG)如图所示。
图4：为示出了25℃下表2中的mAb制剂的粘度的图。
图5：为示出了25℃下表3中的mAb制剂的粘度的图。
图6：为示出了在10mM磷酸盐pH 8.0缓冲液中，丙酰丝氨酸浓度随250mg/ml的mAb的粘度降低变化的图。在25℃下测量粘度。
图7：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表4中的mAb制剂的单体百分比的图。使用SEC-HPLC测定单体百分比。
图8：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表4中的mAb制剂的聚集体百分比的图。使用SEC-HPLC测定单体百分比。
图9：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表4中的mAb制剂的降解物百分比的图。使用SEC-HPLC测定单体百分比。
图10：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表4中的mAb制剂的酸性峰组(APG)百分比的图。使用IEC-HPLC测定APG百分比。
图11：为示出了初始和在40℃下储存2周和4周后，表4中的mAb制剂的单体百分比的图。使用SEC-HPLC测定单体百分比。
图12：为示出了初始和在40℃下储存2周和4周后，表4中的mAb制剂的聚集体百分比的图。使用SEC-HPLC测定聚集体百分比。
图13：为示出了初始和在40℃下储存2周和4周后，表4中的mAb制剂的降解物百分比的图。使用SEC-HPLC测定降解物百分比。
图14：为示出了初始和在40℃下储存2周和4周后，表4中的mAb制剂的酸性峰组(APG)百分比的图。使用IEC-HPLC测定APG百分比。
图15：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表5中的mAb制剂的单体百分比的图。使用SEC-HPLC测定单体百分比。
图16：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表5中的mAb制剂的聚集体百分比的图。使用SEC-HPLC测定聚集体百分比。
图17：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表5中的mAb制剂的降解物百分比的图。使用SEC-HPLC测定降解物百分比。
图18：为示出了初始和在50℃下储存1周和2周后，表5中的mAb制剂的酸性峰组(APG)百分比的图。使用SEC-HPLC测定APG的百分比。
图19：为示出了初始和在40℃下储存4周和8周后，表5中的mAb制剂的单体百分比的图。使用SEC-HPLC测定单体百分比。
图20：为示出了初始和在40℃下储存4周和8周后，表5中的mAb制剂的聚集体百分比的图。使用SEC-HPLC测定聚集体百分比。
图21：为示出了初始和在40℃下储存4周和8周后，表5中的mAb制剂的降解物百分比的图。使用SEC-HPLC测定降解物百分比。
图22：为示出了初始和在40℃下储存4周和8周后，表5中的mAb制剂的酸性峰组(APG)百分比的图。使用IEC-HPLC测定APG百分比。
图23：表7中的mAb制剂的脱酰胺百分比。使用质谱测定脱酰胺百分比。
图24：为示出了报道的相互扩散(Dm)随蛋白质浓度变化的图。使用ZetasizerNano ZS系列仪器在25℃下进行测量。
具体实施方式
在一方面，本发明涉及增强性能的赋形剂，所述增强性能的赋形剂使生物制剂的溶液粘度和物理及化学降解最小化，并提高制剂的物理及化学稳定性。例如，增强性能的赋形剂减少了蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)和翻译后修饰。化学降解的实例包括氧化、脱酰胺、水解、二硫键交换、β-消除等。物理稳定性的实例包括展开、聚集、降解、沉淀、微粒形成、表面吸附等。
本发明的赋形剂适合与多种生物制剂(例如药物产品形式、生物治疗剂、蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物(ADC)、核酸、基因治疗剂和细胞治疗剂)使用。不受作用机制的限制，据认为，粘度提高和降解途径的机制在这些形式中是相同的。
本发明的增强性能的赋形剂的实例包括如下(和图1中)所示并在表1中列出的化合物。
其中，
R1＝OH-、OCOCH3、OCOC2H5、OCOC3H7、OCOC4H9、OCOC5H11、OCOC6H13、CH3CONHCH2CH2CH2、C2H5CONHCH2CH2CH2、C3H7CONHCH2CH2CH2、C4H9CONHCH2CH2CH2、C5H11CONHCH2CH2CH2、C6H13CONHCH2CH2CH2、SH、SCOCH3、SCOC2H5、SCOC3H7、SCOC4H9、SCOC5H11、SCOC6H13、吲哚基、吲哚基(NCOCH3)、吲哚基(NCOC2H5)、吲哚基(NCOC3H7)、吲哚基(NCOC4H9)、吲哚基(NCOC5H11)、吲哚基(NCOC6H13)、(OH)(CH3)、(CH3)(OCOCH3)、(CH3)(OCOC2H5)、(CH3)(OCOC3H7)、(CH3)(OCOC4H9)、(CH3)(OCOC5H11)、(CH3)(OCOC6H13)、PhOH、PhOCOCH3、PhOCOC2H5、PhOCOC3H7、PhOCOC4H9、PhOCOC5H11、PhOCOC6H13、CONH2、CONHCH3、CONHC2H5、CONHC3H7、CONHC4H9、CONH2C5H11、CONH2C6H13、CH2CONH2、CH2CONHCH3、CH2CONHC2H5、CH2CONHC3H7、CH2CONHC4H9、CH2CONHC5H11、CH2CONHC6H13、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)CH3、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C2H5、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C3H7、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C4H9、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C5H11、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C6H13、咪唑基、咪唑基(NCOCH3)、咪唑基(NCOC2H5)、咪唑基(NCOC3H7)、咪唑基(NCOC4H9)、咪唑基(NCOC5H11)、咪唑基(NCOC6H13)、C(O)OH、C(O)OCH3、C(O)OC2H5、C(O)OC3H7、C(O)OC4H8、C(O)OC5H11、C(O)OC6H13、CH2C(O)OH、CH2C(O)OCH3、CH2C(O)OC2H5、CH2C(O)OC3H7、CH2C(O)OC4H8、CH2C(O)OC5H11、CH2C(O)OC6H13，
R2＝H、C(O)CH3、C(O)C2H5、C(O)C3H7、C(O)C4H9、C(O)C5H11、C(O)C6H13，
R3＝H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13。
表1：本发明的增强性能的赋形剂的实例1：
1该实例中包括d和l两种形式的氨基酸(例如n-丙酰基-d丝氨酸、n-丙酰基-l丝氨酸)
在一方面，本发明涉及增强的生物制剂(例如，蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物(ADC)、基因治疗剂、细胞治疗剂、核酸等)，所述增强的生物制剂包括本发明的增强性能的赋形剂，和可选的表面活性剂碳水化合物、盐、和/或氨基酸。
在一些实施方案中，增强的生物制剂为溶液制剂。在这些的实施方案中，至少一种增强性能的赋形剂以约5mM至约1000mM的浓度范围被包含在制剂中。
在一些实施方案中，增强的生物制剂为冻干粉的形式。在这些实施方案中，至少一种增强性能的赋形剂以在用稀释剂重溶时有效提高稳定性并降低粘度的重量:重量浓度存在于制剂中。生物制剂(例如，蛋白质)与赋形剂的比例可以在约1:10(重量∶重量)到约10:1(重量∶重量)之间变化。
在一个实施方案中，本发明提供了降低生物制剂的粘度和/或提高生物制剂的稳定性的方法。该方法包括将生物制剂与至少一种本发明的增强性能的赋形剂(例如，列于表1中的)结合以形成“增强的生物制剂”(例如，增强的蛋白质制剂)。在一些实施方案中，增强的生物制剂还包含至少一种其他赋形剂。
在一个实施方案中，提供了一种降低生物制剂(例如液体药物制剂)粘度的方法。该方法包括将浓度为至少约1mg/ml至约500mg/ml的生物制剂与至少一种选自表1的增强性能的赋形剂结合，以形成增强的生物制剂。在其他实施方案中，包含不同于表1那些的其他赋形剂。在这些实施方案中，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM；并且制剂的pH为约pH 4.0至约pH 9.0。粘度的变化可以根据蛋白质浓度、增强性能的赋形剂及其浓度的选择、溶液pH和其它制剂成分而变化。例如，制剂的粘度可以降低至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、或至少约80％。
如本文所用，“粘度”被定义为流体的流动阻力，并且可以在给定的剪切速率下以厘泊(cP)或毫帕斯卡-秒为单位来测量。可以使用粘度计测量粘度，例如BrookfieldEngineering Dial Reading粘度计、LVT型和AR-G2、TA仪器。可以使用本领域已知的任何其他方法和其他单位(例如，绝对粘度、运动粘度或动态粘度)来测量粘度，应当理解，重要的是通过使用本发明所述的赋形剂所提供的粘度降低百分比。不管用于测定粘度的方法如何，在给定的剪切速率下，增强的生物制剂(例如，蛋白质制剂)相对于对照制剂(即不含本发明赋形剂的制剂)的粘度降低百分比将大致保持相同。
在一个实施方案中，提供了一种用于生物制剂(例如，液体药物制剂)稳定化的方法。该方法包括将浓度为至少约1mg/ml至约500mg/ml的生物制剂与至少一种表1的增强性能的赋形剂结合，以形成增强的生物制剂。在该实施方案中，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM，制剂的pH为约pH 4.0至约pH 9.0。在其他实施方案中，包含不同于表1中所列的那些的其他赋形剂。
稳定化是指防止生物制剂(例如，治疗性蛋白质)在暴露于应力条件(例如温度、冷冻/解冻、剪切、光、低/高pH、氧和金属杂质等)下时质量属性的变化。在一个实施方案中，质量属性的变化是指单体物质、聚集体(也称为高分子量物质(HMWS))和降解物质(也称为低分子量物质(LMWS))的百分比变化。在另一个实施方案中，质量属性的变化是指电荷差异的变化。电荷差异的变化的实例为酸性峰组(APG)、碱性峰组(BPG)或中性峰组(NPG)。在另一个实施方案中，质量属性的变化是指功能活性的变化。功能活性的实例有体外活性、体内活性、结合活性、细胞基活性等。在另一个实施方案中，质量属性的变化是指溶液的可见外观和颗粒物的变化。可见外观变化的实例为溶液颜色、亚可见和可见颗粒和/或产品沉淀的变化。在另一个实施方案中，质量属性的变化是指翻译后修饰。翻译后修饰的实例有氧化、脱酰胺、异构化、水解、二硫键交换和β-消除。
可以通过多种方式评价稳定性，包括监测一定温度范围(热稳定性)、和/或时间段(保质期)、和/或暴露于应力处理环境(例如物理振动、冷冻/解冻和暴露于光线)后的构象变化。可以用不同方法测量含有不同浓度制剂成分的制剂的稳定性。例如，蛋白质聚集体的量可以通过浊度的目视观察、通过测量特定波长的吸光度、通过HPLC尺寸排阻色谱法(其中与天然活性状态下的蛋白质相比，蛋白质聚集体将在不同的级分洗脱)、或其他色谱分析的方法来测量。可以使用测量构象变化的其他方法，包括使用差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光测定法(DSF)来测定变性温度，或使用圆二色谱(CD)来测量蛋白质的摩尔椭圆率。也可以用荧光来分析构象。荧光包括以光或热的形式释放或吸收能量，以及改变光的极性。荧光发射可以是蛋白质固有的，或者可以是由于荧光报告分子引起的。例如，ANS为与部分未折叠蛋白质的疏水口袋(hydrophobic pocket)结合的荧光探针。随着未折叠蛋白质浓度的提高，疏水口袋的数量提高，随后可以结合的ANS的浓度提高。ANS结合的这种提高可以通过检测蛋白质样品的荧光信号来监测。电荷差异的变化可以通过基于其等电点(pI)来分离物质的离子交换色谱法(IEC-HPLC)测量。翻译后修饰(如氧化和脱酰胺)的变化可以通过LC-MS/MS或反相HPLC(RP-HPLC)来测量。可以使用本领域技术人员熟知的其他方法来测量稳定性。
不受作用机制的束缚，据认为增强性能的赋形剂具有结构特性，所述结构特性能使它们通过疏水、氢键和/或离子相互作用的机制与生物分子相互作用，导致蛋白质-蛋白质相互作用的降低，并保护敏感氨基酸免受翻译后修饰。
不同于表1所列那些的其他赋形剂或稳定剂的实例包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖、海藻糖、果糖、木糖、甘露醇、岩藻糖)、多元醇(例如，甘油、甘露醇、山梨醇、乙二醇、肌醇)、氨基酸或氨基酸衍生物(例如，精氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、蛋氨酸等)、或表面活性剂碳水化合物(例如，聚山梨醇酯(包括聚山梨醇酯20、或聚山梨醇酯80)、或泊洛沙姆(poloxamer)(包括泊洛沙姆188)、TPGS(d-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯))。表面活性剂的浓度可以为约0.001％至约20.0％。其他额外赋形剂的浓度可以为约5mM到约2000mM。
在一些实施方案中，增强的生物制剂还可以含有浓度为约0.1％至约2％的防腐剂(例如苯甲醇、苯酚、间甲酚、三氯叔丁醇和苄索氯铵)。
在一些实施方案中，增强的生物制剂还可以含有药学上可接受的盐和缓冲剂。药学上可接受的缓冲剂的实例包括磷酸盐(例如，磷酸钠)、醋酸盐(例如，醋酸钠)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸钠)、谷氨酸、谷氨酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、或其他有机酸缓冲剂。缓冲剂的浓度可以为约2mM至约1000mM，pH为约4.0至约9.0。药学上可接受的盐的实例包括浓度为约2mM至约1000mM的氯化钠、乙酸钠和氯化钾。
在一个实施方案中，评价了表1中列出的或者单独或者与其他赋形剂结合的增强性能的赋形剂，在热应力下对单体物质的影响。在一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1和2周后，与缓冲液对照相比，表1中的增强性能的赋形剂能够分别降低至少约2％和至少约3％的单体物质的变化。在另一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达4周。在40℃下储存2周和4周后，与缓冲液对照相比，表1中列出的增强性能的赋形剂能够分别降低至少3％和至少约5％的单体物质的变化。在另一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1周和2周后，与缓冲液对照相比，表1中的增强性能的赋形剂能够分别降低至少3％和至少5％的单体物质的变化。在另一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达8周。在40℃下储存4周和8周后，与缓冲液对照相比，表1中的增强性能的赋形剂能够分别降低至少约2％和至少约4％的单体物质的变化。
在另一个实施方案中，评价了表1中的或者单独或者与其他赋形剂结合的增强性能的赋形剂，在热应力下对聚集体(HMWS)物质的影响。在一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1周和2周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够分别降低至少约2％和至少约3％的聚集体含量的变化。在另一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达4周。在40℃下储存2周和4周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够降低至少3％和至少5％的聚集体含量的变化。在另一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1周和2周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中列出的增强性能的赋形剂能够分别降低至少2％和至少5％的聚集体含量的变化。在另一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达8周。在40℃下储存4周和8周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够分别降低至少约1％和至少约4％的聚集体含量的变化。
在另一个实施方案中，评价了表1中列出的或者单独或者与其他赋形剂结合的增强性能的赋形剂，在热应力下对降解物(低分子量物质，LMWS)的影响。在一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1周和2周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够分别降低至少约1％和至少约2％的降解物含量的变化。在另一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达4周。在40℃下储存2周和4周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够降低至少约1％和至少约2％的降解物含量的变化。在另一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1周和2周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够降低至少约1％和至少约2％的降解物含量的变化。在一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达8周。在该实施例中，在40℃下储存4周和8周后，与缓冲液对照相比，含有图1的增强性能的赋形剂的制剂的降解物含量没有显著差异。
在另一个实施方案中，评价了表1中列出的或者单独或与其他赋形剂结合的增强性能的赋形剂，在热应力下对电荷不均匀性(酸性峰组，APG)的影响。在一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1周和2周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够降低至少约10％和至少约20％的APG百分比的变化。在另一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达4周。在40℃下储存2周和4周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够降低至少约10％和至少约15％的APG百分比的变化。在一个实施例中，热应力条件为50℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在50℃下储存制剂长达2周。在50℃下储存1周和2周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够分别降低至少约5％和至少约10％的APG百分比的变化。在另一个实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达8周。在40℃下储存4周和8周后，与缓冲液对照的变化相比，表1中的增强性能的赋形剂能够降低至少约10％和至少约40％的APG百分比的变化。
在另一个实施方案中，评价了表1中的或者单独或与其他赋形剂结合的增强性能的赋形剂，在热应力下对翻译后修饰的影响。在该实施例中，热应力条件为40℃，治疗性蛋白质的浓度为约1mg/ml至约500mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。在40℃下储存制剂长达8周。在40℃下储存8周后，增强性能的赋形剂能够防止天冬酰胺脱酰胺的变化。在此期间，不含增强性能的赋形剂的制剂的脱酰胺百分比提高了约15％以上。
在另一个实施方案中，评价了表1中或者单独或者与其他赋形剂结合的增强性能的赋形剂对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。在该实施例中，在25℃下，测量了蛋白质-蛋白质相互作用随蛋白质浓度的变化，治疗性蛋白质的浓度为约0.001mg/ml至约100mg/ml，增强性能的赋形剂的浓度为约5mM至约1000mM。表1中的增强性能的赋形剂能够最小化蛋白质-蛋白质吸引的相互作用。不受作用机制的束缚，据认为粘度和聚集体随着蛋白质浓度的提高而提高的原因为蛋白质-蛋白质吸引的相互作用。
含有增强性能的赋形剂的生物制剂(即，增强的制剂)与缓冲液对照相比具有较高的稳定性；在暴露于应力温度条件下，与缓冲液对照相比具有更高的保留单体；在暴露于应力温度条件下，与缓冲液对照相比具有更低的聚集体；在暴露于应力温度条件下，与缓冲液对照相比具有更低的降解物；在暴露于应力温度条件下，与缓冲液对照相比具有更低的APG百分比的变化，和/或约4.0至约9.0的pH。
实施例
制备抗体：
用于评价增强性能的赋形剂的抗体由表达人抗体mAb(IgG1)的重组CHO-K1制造。细胞在带有25μM MSX(微孔)和0.1％泊洛沙姆188的CHO培养基(Gibco)中在有挡板的通气摇瓶中生长。培养物在37℃、125rpm、6％CO2和＞60％的湿度下孵育。在10天至14天内从25ml扩大到2000ml后，将培养物用于接种到含有7升至8升补充有1-酪氨酸二钠二水合物(Avantor)、进料(Feed)C+(Gibco)和0.1％泊洛沙姆188的CD CHO培养基的15升生产容器(10升工作体积)中。接种细胞以达到0.7×106至0.9×106活细胞/ml的初始细胞浓度。在37℃下以分批进料模式使培养物生长。通过碳酸钠和二氧化碳将pH控制在pH 7±0.2。通过搅拌、补充空气和/或O2，以级联模式将溶解氧(DO)控制在45±1％。根据需要，通过加入无菌二甲基硅油消泡剂溶液来控制起泡。使用ViCell分析仪(Beckman)监测培养物的活细胞和总细胞浓度。用Cedex分析仪(Roche)监测代谢物利用、mAb浓度和废物产物。在周期性添加葡萄糖和10％进料C+(Gibco)的分批进料模式下，使培养物生长并产生抗体14天至17天。在生产结束时，回收容器，以5000×g离心30分钟。用0.2μM的胶囊过滤器将上清液无菌过滤到无菌容器中，并在-80℃下储存直到通过亲和色谱法纯化并通过TFF最终浓缩。使用AvantorPROchiev A亲和树脂进行纯化，其中将样品装载到在10mM磷酸钠、pH 7.2的缓冲液(PBS)中预平衡的柱中。使用100mM乙酸钠、pH 3.4的洗脱缓冲液从柱上洗脱mAb。洗脱后立即用2MTris缓冲液将溶液中和至pH 7.0。
合成增强性能的赋形剂：
首先用碳酸氢钠处理氨基酸，然后在水溶液中与适当的链烷酸酐反应。通过将水溶液调节至pH 2，然后用乙酸乙酯萃取来处理反应混合物。然后纯化产物以得到可接受纯度的晶体。
制备用于粘度测量的样品：
使用Amicon Ultracel 50K离心过滤装置将约200mg/ml的mAb物质(stock)进行缓冲液交换至所需的制剂中。将材料与5X体积的所需缓冲液系统进行缓冲液交换，然后使用Beckman离心机在3800×g下进一步浓缩。然后测定浓缩材料的蛋白质浓度。将缓冲液交换的材料浓缩至300mg/ml和250mg/ml用于测量粘度。用于在300mg/ml和250mg/ml下测量粘度的制剂条件分别如表2和表3所示。
表2：用于粘度测量的mAb浓度为300mg/ml的制剂
制剂 成分
缓冲液 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0
氯化钠 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM氯化钠
组氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM组氨酸
乙酰组氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM乙酰组氨酸
丙酰组氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM丙酰组氨酸
精氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM精氨酸
乙酰精氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM乙酰精氨酸
丙酰精氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM丙酰精氨酸
丝氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM丝氨酸
乙酰丝氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM乙酰丝氨酸
丙酰丝氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM丙酰丝氨酸
赖氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM赖氨酸
乙酰赖氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM乙酰赖氨酸
丙酰赖氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM丙酰赖氨酸
双乙酰赖氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM双乙酰赖氨酸
双丙酰赖氨酸 300mg/ml mAb、10mM磷酸钠pH 8.0、300mM双丙酰赖氨酸
表3：用于粘度测量的mAb浓度为250mg/ml的制剂
制备用于稳定性测量的样品：
使用Amicon Ultracel 50K离心过滤装置将约200mg/ml mAb物质进行缓冲液交换至所需的制剂中。将材料与5X体积的所需缓冲液系统进行缓冲液交换，然后使用Beckman离心机在3800×g下进一步浓缩。然后测定浓缩材料的蛋白质浓度。将缓冲液交换的材料浓缩至250mg/ml，或使用匹配的缓冲液稀释至10mg/ml。用于稳定性研究的250mg/ml和10mg/ml的制剂条件如表4和表5所示。然后将缓冲液交换的材料等分到2ml的玻璃瓶中，每个瓶中含有约0.7ml的样品。然后根据表6将等分样品置于稳定站中，并在表6所示的预定时间点通过SEC-HPLC和IEC-HPLC进行分析。
表4：用于稳定性研究的mAb浓度为250mg/ml的制剂
表5：用于稳定性研究的mAb浓度为10mg/ml的制剂
表6：稳定性条件和时间点
制备用于LC-MS/MS测量的样品：
使用Amicon Ultracel 50K离心过滤装置将约200mg/ml的mAb物质进行缓冲液交换至所需的制剂中。将材料与5X体积的所需缓冲液系统进行缓冲液交换，然后使用Beckman离心机在3800×g下进一步浓缩。然后测定浓缩材料的蛋白质浓度。用匹配的缓冲液将缓冲液交换的材料稀释至10mg/ml。用于LC-MS/MS分析的制剂条件如表7所示。然后将缓冲液交换的材料等分到2ml玻璃瓶中，每个瓶中含有约0.7ml的样品。然后将等分样本置于40℃稳定站中8周。在预定的储存期后，通过LC-MS/MS分析对照的翻译后修饰和40℃样品的翻译后修饰。
表7：用于LC-MS/MS分析的制剂条件和储存条件
制备用于DLS测量的样品：
通过0.22μm无菌过滤器过滤缓冲液，并用于将过滤的抗体溶液物质(10mg/ml)稀释到1.0mg/ml至12.5mg/ml的浓度范围。一式两份制备所有的稀释液。
测定粘度：
在mAb浓度为300mg/ml和250mg/ml下测量粘度。检测样品前，将Brookfield DVII+粘度计的循环水浴温度设定为25℃并加热约1小时。首先，测量标准溶液B29(Brookfield，粘度29cp)、RT100(Cannon Instrument，粘度96cp)和RT500(Cannon Instrument，粘度480cp)的粘度，以确认仪器已针对样品的粘度范围进行了校准。在25℃、0.6ml的体积下采用类似的方法测量样品。对于每种条件，得到2个测量值，并记录平均粘度和标准偏差。
尺寸排阻色谱分析(SEC-HPLC)：
进行SEC-HPLC分析，以测定热应力导致的尺寸差异的变化(％单体、聚集体和降解物)。在表6所示的预定时间点从稳定性试验站取出样品，用磷酸盐缓冲盐水稀释至5mg/ml，然后装载到Tosoh Bioscience HPLC柱上。样品装载及洗脱缓冲液为10mM磷酸钠、500mM氯化铯，pH 7.0。流速为0.3ml/min且柱温保持在25℃。典型的SEC-HPLC色谱图见图2。如图2所示，计算测试样品的单体、聚集体和降解物百分比。
离子交换色谱分析(IEC-HPLC)：
进行IEC-HPLC分析以测定热应力引起的电荷差异的变化(％酸性峰组，APG)。单克隆抗体本质上是不同种类(heterogeneous)的，且酸性峰组(APG)为表观等电点(pI)低于原始变体的抗体变体。在IEC-HPLC中，APG先于主峰洗脱。在预定时间点从稳定性试验站取出样品，用磷酸盐缓冲盐水稀释至5mg/ml，然后装载到用10mM磷酸钠、pH 7.8的缓冲液预平衡的HPLC Thermo ProPac WCX-10柱上。用具有盐梯度(0至200mM氯化钠)的10mM磷酸钠、pH7.8的缓冲液洗脱样品。流速为1.0ml/min，且柱温保持在30℃。典型的IEC-HPLC色谱图见图3。如图3所示，计算测试样品的APG百分比。
LC-MS/MS分析：
通过添加N-乙基马来酰亚胺(NEM)封闭了蛋白质的游离硫代基团。通过用乙醇/氯仿法沉淀蛋白质除去多余的NEM试剂。将蛋白沉淀重新悬浮在含有8M尿素和50mM Tris(pH7.5)的裂解缓冲液中。在溶液中胰蛋白酶消化之前，通过DTT还原蛋白质，并通过IAM烷基化蛋白质。所得的肽进行C18脱盐，并使用OTOT法在Orbitrap Fusion Lumos MS仪器上通过LC-MS/MS直接分析。使用Proteome Discoverer(V2.4)平台的Sequest搜索引擎，对照UniProt人类数据库加上蛋白质序列HC和LC搜索MS/MS光谱，并分析翻译后修饰。
动态光散射(DLS)
使用Zetasizer Nano ZS系列仪器(Malvern Panalytical Ltd.,Malvern,UK)测量分子的动态光散射(DLS)。在25℃下对每个样品一式三份进行DLS测量，并自动检测运行次数。生成的数据按样品中的分子数量给出平均尺寸分布。利用633nm He-Ne激光器，并通过雪崩光电二极管分析光散射。剔除173°处的反向散射信号以最小化灰尘的影响。使用DTS(4.2版)软件(Malvern Panalytical Ltd.,Malvern,UK)获取并去卷积自相关图。应用对应于mAb单体的DLS测量的直径约为10nm的主峰的扩散系数获得相互扩散系数(Dm)。在相对较低的蛋白质浓度下，Dm可能与样品浓度(c)(g/mL)、相互作用参数(kD)(ml/g)以及自扩散系数(Ds)(单分子在无限稀释极限下的扩散，以μm2/秒测量)相关，如下所示：Dm＝Ds(1+kDc)
kD可从Dm对c图的斜率与截距之比获得。kD值可以用于描述分子间相互作用的性质，正kD表示分子间排斥，而负kD表示吸引的相互作用。对于每种制品，验证蛋白质浓度，并用测量的浓度值计算kD。
实施例1：通过增强性能的赋形剂降低溶液粘度：
在单克隆抗体(mAb)浓度为300mg/ml和250mg/ml的pH 8.0的10mM磷酸盐缓冲液下评价了氨基酸(组氨酸、精氨酸、丝氨酸和赖氨酸)及其衍生物、增强性能的赋形剂(乙酰基、丙酰基、双乙酰基、双丙酰基)对mAb粘度的影响。本研究的目的是评价增强性能的赋形剂是否能够降低mAb溶液的粘度。还将氨基酸及其衍生物(增强性能的赋形剂)的粘度降低与缓冲液对照(pH 8.0的10mM磷酸钠)和pH 8.0的含300mm氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液的粘度降低进行了比较。如图4所示，每种衍生物对粘度降低的效果不同。对于组氨酸和赖氨酸，乙酰基和丙酰基衍生物会导致降低mAb溶液的溶液粘度的能力下降。对于精氨酸，衍生物没有显著影响。然而，在丝氨酸的情况下，乙酰基和丙酰基衍生物都显著增强了丝氨酸降低粘度的能力。然而，丙酰丝氨酸的效果优于乙酰丝氨酸。乙酰基衍生物和丙酰基衍生物降低了赖氨酸降低粘度的能力；然而，与赖氨酸相比，双乙酰基衍生物和双丙酰基衍生物示出更好的粘度降低。在所有测试的制剂中，丙酰丝氨酸和双乙酰赖氨酸在300mM浓度下的粘度降低效果最好。与对照(8.0的10mM磷酸钠)相比，两者均可降低粘度约80％。
还在250mg/ml下测试了所选增强性能的赋形剂的粘度降低。在pH8.0的10mM磷酸钠缓冲液中，所选赋形剂对250mg/ml mAbs的粘度的影响见图5。丙酰丝氨酸和双乙酰赖氨酸的效果与在300mg/ml时的相当。两者都能降低粘度约75％。有趣的是，50％:50％丙酰丝氨酸和双乙酰赖氨酸混合物的效果优于单独的丙酰丝氨酸或双乙酰赖氨酸，表现出协同效应。相比于丙酰丝氨酸(300mM)或双乙酰赖氨酸(300mM)降低粘度75％，50％:50％(各150mM)的丙酰丝氨酸和双乙酰赖氨酸混合物降低粘度约80％。还测量了250mg/ml的mAb的粘度随丙酰丝氨酸的变化。图6的结果表明，粘度降低取决于赋形剂浓度。
实施例2：50℃、250mg/ml下治疗性蛋白质的稳定性
在mAb浓度为250mg/ml下测量了表4中所选制剂对mAb热稳定性的影响。通过将起初在pH 7.5的Tris缓冲液中的mAb物质进行缓冲液交换到表4所列的缓冲液中制备样品。将mAb物质材料与5X体积的每种所需缓冲液体系进行缓冲液交换，然后使用Beckman Coulter离心机在3800×g下进一步浓缩。然后测定浓缩材料的蛋白质浓度并调节至250mg/ml。然后将缓冲液交换的制剂等分到2ml玻璃瓶中。每个瓶中含有约0.7ml的样品。然后将制剂样品置于50℃的稳定性试验站中2周。在表6所示的预定时间点，通过尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法分析初始样品和稳定性样品。
图7、图8、图9和图10分别示出了初始样品以及在50℃下储存1周和2周后样品的单体百分比、聚集体百分比、降解物百分比和APG百分比。与缓冲液对照相比，表1中所列的含有增强性能的赋形剂的所有制剂均较好；然而，最好的制剂为含双乙酰赖氨酸的制剂，其次为含丙酰丝氨酸的制剂。
在50℃下储存2周后，与缓冲液对照相比，双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸分别提高约12％和8％的剩余单体百分比。与精氨酸相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂分别提高6.5％和3％的剩余单体百分比。
在50℃下储存2周后，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂分别降低约9％和6％的聚集体百分比。含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有精氨酸的制剂的聚集体百分比相当，且略低于含有丙酰丝氨酸的制剂。
在50℃下储存2周后，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂降低了约2％的降解物百分比。有趣的是，精氨酸使对照制剂的降解物含量提高了4.5％。在50℃下储存2周后，与含有精氨酸的制剂相比，含有双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂降低约6％的降解物。
在50℃下储存2周后，观察到制剂的最大差异为酸性峰组(APG)含量。储存后，所有制剂的APG百分比均提高；然而，与缓冲液对照和含有精氨酸的制剂相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂的变化显著降低。在50℃下储存2周后，与缓冲液对照相比，双乙酰赖氨酸的制剂和丙酰丝氨酸的制剂分别降约31％和24％的APG百分比变化。与精氨酸相比，双乙酰赖氨酸的制剂和丙酰丝氨酸的制剂也分别提高24％和16％的APG百分比。
实施例3：40℃、250mg/ml下治疗性蛋白质的稳定性
在40℃下测量了表4中所选制剂对热稳定性的影响。所有制剂中的mAb浓度为250mg/ml。通过将mAb物质(起初在pH 7.5的Tris缓冲液中)进行缓冲液交换到表4所列的缓冲液中制备样品。将物质材料与5X体积的所需缓冲液体系进行缓冲液交换，然后使用Beckman Coulter离心机在3800×g下进一步浓缩。然后测定浓缩材料的蛋白质浓度并调节至250mg/ml。然后将缓冲液交换的制剂等分到2ml玻璃瓶中。每个瓶中含有约0.7ml的样品。然后，将制剂样品置于40℃稳定站中2周和4周。在表6所示的预定时间点，通过尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法分析初始样品和稳定性样品。
图11、图12、图13和图14分别示出了在40℃下储存2周和4周后单体百分比、聚集体百分比、降解物百分比和APG百分比。与缓冲液对照相比，表1中所列的含有增强性能的赋形剂的所有制剂均较好；然而，最好的制剂是含有双乙酰赖氨酸的制剂，其次是含丙酰丝氨酸的制剂。
在40℃下储存4周后，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂分别提高约14％和8％的剩余单体百分比；与精氨酸相比，分别提高约9％和3％。
在40℃下储存4周后，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂分别降低约12％和6％的聚集体百分比。与精氨酸的制剂相比，双乙酰赖氨酸的制剂降低约4％的聚集体百分比。
在40℃下储存4周后，与缓冲液对照的降解物相比，含有双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂降低约2％的降解物百分比。有趣的是，精氨酸使对照制剂的降解物含量提高了3％。与含有精氨酸的制剂相比，含有双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂降低约5％的降解物。
观察到制剂的最大差异被认为是酸性峰组(APG)百分比。在40℃下储存后，所有制剂的APG百分比均提高；然而，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂的变化显著降低。在40℃下储存4周后，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂分别低约38％和26％的APG百分比变化；与精氨酸的制剂相比，分别降低约26％和13％。
实施例4：50℃、10mg/ml下的治疗性蛋白质的稳定性
在mAb浓度为10mg/ml下测量了表5中的制剂赋形剂对mAb热稳定性的影响。通过将pH 7.5的Tris缓冲液中的mAb物质进行缓冲液交换到表5所列的缓冲液中制备样品。mAb物质材料用5X体积的所需缓冲液体系进行缓冲液交换，然后用匹配的缓冲液稀释以获得10mg/ml的最终浓度。然后将缓冲液交换的制剂等分到2ml玻璃瓶中。每个瓶中含有约0.7ml的样品。然后，将制剂样品置于50℃稳定站中1周和2周。在表6所示的预定时间点，通过尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法分析初始样品和稳定性样品。
图15、图16、图17和图18分别示出了在50℃下储存1周和2周后单体百分比、聚集体百分比、降解物百分比和APG百分比。通过SEC-HPLC测量尺寸差异(单体、聚集体、降解物)，通过IEC-HPLC测量电荷差异(APG)。随着时间的推移，所有制剂的单体百分比下降，聚集体百分比和降解物百分比提高。所有制剂的APG百分比也随时间提高。
在50℃下储存2周后，含有双乙酰赖氨酸的制剂的剩余单体百分比最大，其次是丙酰丝氨酸和蔗糖。与缓冲液对照相比，双乙酰赖氨酸的制剂和丙酰丝氨酸的制剂分别提高约11％和5％的剩余单体百分比。就剩余单体百分比而言，除蔗糖外，没有更接近双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的其他制剂。在50℃下储存2周后，精氨酸在所有测试制剂中效果最差。
在50℃下储存2周后，与所有其他制剂相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂的聚集体百分比最低，其次是丙酰丝氨酸和蔗糖。与缓冲液对照相比，双乙酰赖氨酸、丙酰丝氨酸和蔗糖的制剂至少降低6％的聚集体百分比。在50℃下储存2周后，精氨酸在所有测试制剂中效果最差。
在50℃储存2周后，尽管丙酰丝氨酸表现优于所有其他测试制剂，但降解物百分比并不是制剂的主要区别。
观察到制剂的最大差异被认为是酸峰组(APG)百分比。在50℃下储存后，所有制剂的APG百分比均提高；然而，与其它制剂相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂的百分比提高的变化显著降低。在50℃下储存2周后，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂分别降低约20％和14％的APG百分比。蔗糖在防止尺寸差异变化方面效果良好，但不能防止电荷差异变化。
实施例5：40℃、10mg/ml下治疗性蛋白质的稳定性
在mAb浓度为10mg/ml下测量了表5中的制剂赋形剂对mAb热稳定性的影响。通过将pH 7.5的Tris缓冲液中的mAb物质进行缓冲液交换到表5所列的缓冲液中制备样品。该物质材料用5X体积的所需缓冲液体系进行缓冲液交换，然后用匹配的缓冲液稀释以获得10mg/ml的最终浓度。然后将缓冲液交换的制剂等分到2mL玻璃瓶中。每个瓶中含有约0.7ml的样品。然后将制剂样品置于40℃稳定站中4周和8周。在表6所示的预定时间点，通过尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法分析初始样品和稳定性样品，同时通过LC-MS/MS分析所选样品(表7)。
图19、图20、图21和图22分别示出了初始和在40℃下储存4周和8周后的单体百分比、聚集体百分比、降解物百分比和APG百分比。随着时间的推移，所有制剂出现了单体百分比下降、聚集体百分比和降解物百分比提高。所有制剂的APG百分比也随时间而提高。
在40℃下储存8周后，含有双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂的剩余单体百分比最大，其次是蔗糖。与缓冲液对照相比，双乙酰赖氨酸的制剂和丙酰丝氨酸的制剂分别提高约5％和7％的剩余单体百分比。在储存8周后，在剩余单体百分比方面，除蔗糖外，没有更接近双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的其他制剂。精氨酸是所有测试制剂中效果最差的。与含有精氨酸的制剂相比，双乙酰赖氨酸的制剂和丙酰丝氨酸的制剂分别提高约22％和24％的剩余单体百分比。
在40℃下储存8周后，与所有其他制剂相比，双乙酰赖氨酸的聚集体百分比较低，其次是丙酰丝氨酸、NaC1和蔗糖。与对照缓冲液制剂相比，双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂降低至少5％的聚集体百分比。精氨酸和甘氨酸是所有制剂中效果最差的，其中在40℃下储存8周后，与对照相比，精氨酸和甘氨酸分别提高约12％和5％的聚集体百分比的增加，与双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂相比，精氨酸和甘氨酸分别提高约19％和11％。
在40℃下储存8周后，尽管丙酰丝氨酸表现优于所有其他测试制剂，但降解物百分比不是制剂的主要区别。氯化钠、精氨酸和甘氨酸效果最差，其中，与对照、含有双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的制剂相比，降解物百分比的增加提高约4％。
制剂的最大差异为酸性峰组(APG)百分比含量。在40℃下储存后，所有制剂的APG百分比均提高；然而，与其它制剂相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂的变化显著降低。在40℃下储存8周后，与缓冲液对照相比，含有双乙酰赖氨酸的制剂和含有丙酰丝氨酸的制剂分别降低约29％和13％的APG百分比。蔗糖在防止尺寸差异变化方面效果良好，但不能防止电荷差异变化。
表7中样品的LC-MS/MS分析结果见图23。LS-MS/MS分析表明抗体的重链中有两个脱酰胺位点。储存在4℃的缓冲液对照样品的脱氨率为8％。在40℃下储存8周的样品中，缓冲液对照、双乙酰赖氨酸的制剂和丙酰丝氨酸的制剂的脱氨基百分比分别为23％、8％和7％。这些结果清楚地表明，双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸可以控制抗体的天冬酰胺脱酰胺。双乙酰赖氨酸和丙基丝氨酸能够保护抗体抵抗天冬酰胺脱酰胺的潜在机制可能是通过天冬酰胺侧链与双乙酰赖氨酸和丙酰丝氨酸的H-结合。这一观察与实施例5中在40℃下储存的双乙酰赖氨酸的制剂和丙酰丝氨酸的制剂的APG百分比变化的降低相吻合。在脱酰胺过程中，天冬酰胺被转化为酸性比天冬酰胺强的天冬氨酸。
使用DLS测量蛋白质-蛋白质相互作用
测量单独缓冲液(10mM磷酸盐[pH 8.0])和含有精氨酸的缓冲液、含有双乙酰赖氨酸的缓冲液和含有丙酰丝氨酸的缓冲液的蛋白质-蛋白质相互作用。测量Dm随抗体浓度(范围为1mg/ml(0.001g/ml)至12.5mg/ml(0.0125g/ml))的变化。如图24和表8所示，缓冲液、精氨酸和丙酰丝氨酸的负Dm斜率表明这些制剂中存在蛋白质-蛋白质吸引的相互作用。丙酰丝氨酸的吸引的相互作用最弱，其次是精氨酸和缓冲液。含有双乙酰赖氨酸的制剂示出了蛋白质-蛋白质排斥的相互作用。
表8.制剂的相互作用参数(kD)
制剂 kD(ml/g)
缓冲液(10mM磷酸盐pH 8.0) -8.53
缓冲液w/300mM精氨酸 -4.54
缓冲液w/300mM丙酰丝氨酸 -3.11
缓冲液w/300mM双乙酰赖氨酸 2.39

Claims (20)

1.一种生物制剂，所述生物制剂含有增强性能的赋形剂，所述赋形剂包括具有以下化学结构的化合物：
其中，
R1＝OH-、OCOCH3、OCOC2H5、OCOC3H7、OCOC4H9、OCOC5H11、
OCOC6H13、CH3CONHCH2CH2CH2、C2H5CONHCH2CH2CH2、C3H7CONHCH2CH2CH2、C4H9CONHCH2CH2CH2、C5H11CONHCH2CH2CH2、C6H13CONHCH2CH2CH2、SH、SCOCH3、SCOC2H5、SCOC3H7、SCOC4H9、SCOC5H11、SCOC6H13、吲哚基、吲哚基(NCOCH3)、吲哚基(NCOC2H5)、吲哚基(NCOC3H7)、吲哚基(NCOC4H9)、吲哚基(NCOC5H11)、吲哚基(NCOC6H13)、(OH)(CH3)、(CH3)(OCOCH3)、(CH3)(OCOC2H5)、(CH3)(OCOC3H7)、(CH3)(OCOC4H9)、(CH3)(OCOC5H11)、(CH3)(OCOC6H13)、PhOH、PhOCOCH3、PhOCOC2H5、PhOCOC3H7、PhOCOC4H9、PhOCOC5H11、PhOCOC6H13、CONH2、CONHCH3、CONHC2H5、CONHC3H7、CONHC4H9、CONH2C5H11、CONH2C6H13、CH2CONH2、CH2CONHCH3、CH2CONHC2H5、CH2CONHC3H7、CH2CONHC4H9、CH2CONHC5H11、CH2CONHC6H13、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)CH3、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C2H5、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C3H7、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C4H9、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C5H11、CH2CH2NHC(NH)NHC(O)C6H13、咪唑基、咪唑基(NCOCH3)、吲唑基(NCOC2H5)、咪唑基(NCOC3H7)、咪唑基(NCOC4H9)、咪唑基(NCOC5H11)、咪唑基(NCOC6H13)、C(O)OH、C(O)OCH3、C(O)OC2H5、C(O)OC3H7、C(O)OC4H8、C(O)OC5H11、C(O)OC6H13、CH2C(O)OH、CH2C(O)OCH3、CH2C(O)OC2H5、CH2C(O)OC3H7、CH2C(O)OC4H8、CH2C(O)OC5H11、CH2C(O)OC6H13，
R2＝H、C(O)CH3、C(O)C2H5、C(O)C3H7、C(O)C4H9、C(O)C5H11、
C(O)C6H13，
R3＝H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13，
其中所述赋形剂降低了高浓度生物制剂的粘度，
其中所述生物制剂选自蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物和核酸。
2.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为双乙酰精氨酸。
3.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为双乙酰赖氨酸。
4.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为双乙酰组氨酸。
5.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为双乙酰丝氨酸。
6.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为双乙酰脯氨酸。
7.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为双乙酰色氨酸。
8.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为丙酰精氨酸。
9.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为丙酰赖氨酸。
10.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为丙酰组氨酸。
11.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为丙酰丝氨酸。
12.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为丙酰脯氨酸。
13.根据权利要求1所述的生物制剂，其中所述化合物为丙酰色氨酸。
14.一种降低生物制剂的粘度和/或提高生物制剂的稳定性的方法，包括：
将所述生物制剂与增强性能的赋形剂结合，所述增强性能的赋形剂选自：双乙酰精氨酸、双乙酰赖氨酸、双乙酰组氨酸、双乙酰丝氨酸、双乙酰脯氨酸、双乙酰色氨酸、丙酰精氨酸、丙酰赖氨酸、丙酰组氨酸、丙酰丝氨酸、丙酰脯氨酸、丙酰色氨酸及其混合物，
其中所述生物制剂含有浓度为约1mg/ml至约500mg/ml的治疗性蛋白质和浓度为约5mM至约1000mM的增强性能的赋形剂，以提供增强的制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述增强性能的赋形剂为存在于所述生物制剂中的两种赋形剂以约10wt.％:90wt.％至约90wt.％:10wt.％的组合。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述增强性能的赋形剂为丙酰丝氨酸和双乙酰赖氨酸以约10wt.％:90wt.％至约90wt.％:10wt.％比例的混合物。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述增强的制剂为冻干粉的形式，其中至少一种增强性能的赋形剂以在用稀释剂重溶时有效降低粘度的重量:重量浓度存在。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物制剂选自蛋白质治疗剂、肽、抗体、抗体药物缀合物(ADC)、核酸、基因治疗剂和细胞治疗剂。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述增强的制剂还含有其他赋形剂，其中所述其他赋形剂选自糖、多元醇、氨基酸、氨基酸衍生物、表面活性剂、碳水化合物或其组合。
20.根据权利要求14所述的制剂，还含有盐、表面活性剂、缓冲剂、抗氧化剂、抗菌剂、人血清白蛋白、脂质和/或环糊精。
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