KR20230038752A - 고농축 단백질 제형을 위한 점도 감소 부형제 및 이들의 조합 - Google Patents

고농축 단백질 제형을 위한 점도 감소 부형제 및 이들의 조합 Download PDF

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토비아스 로젠크란츠
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메르크 파텐트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 감소된 점도 및/또는 증가된 안정성을 갖는 단백질을 포함하는 액체 조성물 및 제형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 용액의 점도 감소 및/또는 안정성 증가를 위한 방법에 관한 것이다.

Description

고농축 단백질 제형을 위한 점도 감소 부형제 및 이들의 조합
본 발명은 감소된 점도 및/또는 증가된 안정성을 갖는 단백질을 포함하는 액체 조성물 및 제형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 용액의 점도 감소 및/또는 안정성 증가를 위한 방법에 관한 것이다.
FDA 가 1982 년 첫 번째 생물의약품을 허가한 이후, 많은 다른 생물학적 약들이 그 뒤를 따랐다. 이들 대부분은 모노클로날 항체 (mAB) 또는 이중특이적 항체 또는 항체 단편과 같은 관련 형식이다. 이들 약물이 효능 측면에서 독특한 기회를 제공하는 반면, 그 구조와 크기는 다양한 도전을 제기한다.
항체 및 기타 단백질 치료제는 통상 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내 (iv), 근육내 (im) 또는 피하 (sc) 경로에 의해 투여된다. 피하 주사는 특히 환자 투여의 단순화 (빠르고, 적은 양의 주사) 와 치료 비용의 감소 (의료 지원 단축) 에 대한 그의 잠재력으로 인해 단백질 치료제 전달에 대해 유명하다. 환자 순응성을 보장하기 위해, 피하 주사 투약 형태가 등장성이고 작은 부피 (주사 위치 당 <2.0 ml) 로 주사될 수 있는 것이 바람직하다. 주사 부피를 줄이기 위해, 단백질은 종종 1 mg/ml 내지 150 mg/ml 의 농도로 투여된다.
동시에, mAb-기반 요법은 일반적으로 수 ㎎/㎏ 투약을 필요로 한다. 높은 치료 용량과 낮은 주사 부피의 조합은 따라서 치료 항체의 고농축된 제형의 필요성을 야기한다. 그러나, 큰 단백질인 항체는 복잡한 3차원 구조 외에도 다수의 작용기를 갖는다. 이는 특히 고농도가 요구되는 경우, 이들의 제형을 어렵게 한다.
고농도 단백질 용액의 주요 문제점 중의 하나는 점도이다. 고농도에서, 단백질은 주로 비-천연 자기-연합으로 인해 고점성 용액을 형성하는 경향이 있다. 추가로, 단백질은 이러한 고농도에서 증가된 응집 및 입자 형성 속도를 나타낸다.
이들 문제점은 제조 공정과 환자에 대한 투여 모두에 관한 것이다. 제조 공정에서, 고점도의 고농축 단백질 제형은 한외여과 및 멸균 여과에 대해 특정 어려움을 겪는다. 또한, 완충제 교환과 단백질 농도의 증대를 위해서 흔히 접선 유동 여과를 사용한다. 그러나, 다양한 용액이 주사 및 여과 중에 증가된 배압과 전단 응력을 나타내기 때문에, 치료 단백질이 잠재적으로 불안정해 지고/지거나 공정 시간이 연장된다. 상기 증가된 전단 응력은 종종 생성물의 손실을 초래한다. 두 양상 모두 공정 경제성에 악영향을 미친다.
동시에, 높은 점도는 단백질의 주입 가능성을 상당히 제한하므로 투여에 있어서는 허용되지 않는다.
이러한 문제를 해결하기 위해 및/또는 용액의 안정성을 향상시키기 위해, 수크로오스 및 염화나트륨과 같은 첨가제 및 부형제가 일반적으로 생물약학적 제형에 더 높은 농도로 첨가된다. 그러나, 산출된 용액은 종종 높은 주사력 및 산출된 조직 손상으로 인해 종종 통증을 일으킨다. 이들 용액 중 일부는 심지어 더 이상 투여가능하지 않을 수 있어서 환자에 대한 치료 옵션의 부족을 초래할 수 있다.
대안으로서, 염, 캠퍼-10-술폰산 및 특정 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 히스티딘, 리신 및 프롤린과 같은 상이한 부형제가 특정 고농도 단백질 치료제의 점도를 감소시키는 방법으로서 연구되었다. Guo et al. 은 소수성, 벌키 및 지방족 이온성 성분을 갖는 염이 강력한 점도-저하 부형제로서 작용할 수 있음을 시사한다 (Guo Z. et al., Pharmaceutical Research; 2012, 29(11):3102-9). 또한, WO 02/30463, WO 15/196091, WO 15/196187, WO 17/070501 및 WO 19/201904 는 상이한 점도 감소 부형제를 개시하고 있다.
그러나 모노클로날 항체와 같은 단백질을 제형화하려면 단백질 변성 및 생물학적 활성 손실을 방지하기 위해 제형 첨가제 및/또는 부형제를 신중하게 선택해야 한다. 또한, 부형제는 알레르기 반응과 같은 원하지 않는 부작용을 피하기 위해 약학적으로 안전하고 생리학적으로 적합할 필요가 있다.
결과적으로, 약학 산업은 특히 상기 언급된 NaCl 및 아미노산을 기반으로 한 표준 용액이 실패할 때 대체 옵션으로서, 약학적으로 허용가능한, 점도 감소 부형제가 필요하다.
따라서, 해결되어야 하는 문제점은 단백질 용액의 점도를 효과적으로 감소시킬 수 있는 및/또는 이의 안정성을 증가시킬 수 있는 부형제 조합의 제공이다. 게다가, 해결되어야 하는 문제점은 단백질 용액의 점도를 효과적으로 감소시킬 수 있는 및/또는 이의 안정성을 증가시킬 수 있는 부형제 조합의 제공이다. 해결되어야 하는 또 다른 문제점은 관련 농도에서 사용되는 많은 점도 감소 부형제가 단백질 안정성에 악영향을 가질 수 있다는 것이다.
생물공정 동안, 용액은 튜빙 및 크로마토그래피 컬럼을 통해 펌핑되어야 한다. 높은 점도에서, 이러한 컬럼을 통한 유량은 상기 점도에 의해 제한되어, 이는 더 긴 가공 시간, 크로마토그래피 동안 상당한 단백질 손실을 초래하거나 단백질 용액의 완전한 비-가공성을 초래할 수 있다. 또한, 좁은 튜브로부터 덜 좁은 컬럼으로 커넥터를 통과할 때, 전단력이 발생할 수 있다. 전단 응력은 단백질이 변성되고 잠재적으로 응집하여 그로써 공정의 수율을 감소시키는 전형적인 이유이다. 명백하게, 이러한 전단 응력 유도 응집은 공정 경제성에 악영향을 갖는다. 또한, 크로마토그래피 컬럼 내의 겔 베드는 고압에 의해 손상될 수 있다.
또한, 일부 단백질은 접선 유동 여과 (TFF) 를 통해 고농도로 제형화된다. 용액의 점도가 임계가 되면, 멤브레인 부근에 겔-유사 층이 형성될 수 있다. 특히, 멤브레인 플럭스는 상당히 감소되어 증가된 공정 시간, 및 따라서 상당한 더 높은 제조 비용을 산출한다. 상기 토의한 바와 같이, 또한 TFF 동안 전단 응력이 발생하여 불용성 단백질 응집물 및 감소된 수율을 산출할 수 있다.
일반적으로, 매우 점성인 용액이 특정한 끈적임을 발생시켜, 용기로부터, 튜빙 밖으로 완전한 용액을 회수하거나 가공 시스템으로부터 전체 물질을 제거하는 것을 어렵게 하는 것으로 관찰되었다. 이러한 물질의 손실은 공정 경제성에 명백한 부작용과 함께 상당히 감소된 생성물 수율을 초래한다.
또한, 해결되어야 하는 문제점은 단백질 용액의 점도를 효과적으로 감소시킬 수 있는 부형제 조합의 제공이다.
해결되어야 하는 또 다른 문제점은 관련 농도에서 사용되는 많은 점도 감소 부형제가 단백질 안정성에 악영향을 가질 수 있다는 것이다. 따라서, 해결되어야 하는 추가의 문제점은 단백질 용액의 점도를 효과적으로 감소시킬 수 있고 조합과 비교하여 유사한 점도 감소를 초래하는 더 높은 농도에서 사용되는 하나의 점도 감소 부형제 단독과 비교하여 개선된 단백질 안정성을 나타내는 부형제 조합의 제공이다.
단백질 용액의 높은 점도는 생물공정 (bioprocessing) 에서 수많은 어려움을 야기한다. 상응하는 단백질 용액에서 점도를 감소시키는데 사용되는 공지된 첨가제가 많은 경우에 충분한 점도-감소 효과를 초래하지 않으므로, 본 발명의 목적은 상응하는 점도-저하 효과를 개선시킬 수 있고 공정 경제성에 대한 악영향을 감소시킬 수 있는 새로운 가능성을 발견하는 것이다.
본 발명의 추가의 주제는 액체 단백질 조성물을 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산 또는 그의 염, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 배합하는 단계를 포함하는, 바이오공정에서 액체 단백질 조성물의 점도를 감소시키는 방법이다.
상기 과제는 단백질, 및 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하는 액체 조성물에 의해 해결된다. 상기 과제는 단백질, 및 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 바람직하게는 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하는 액체 조성물에 의해 해결된다.
적어도 2 종의 점도 감소 부형제의 사용은, 관련 농도에서 사용되는 다수의 점도 감소 부형제가 더 적은 양의 각각의 개별 부형제의 사용을 허용하고 제 2 점도 감소 부형제의 안정화 효과를 레버리지함으로써 단백질 안정성에 악영향을 미칠 수 있다는 문제를 극복할 수 있게 한다.
마찬가지로, 상기 과제는 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 단백질 용액에 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도 감소 방법에 의해 해결된다. 상기 과제는 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 제 2 부형제를 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도 감소 방법에 의해 해결된다.
상기 과제는 또한 발린, 류신, 아스코르브산, 시아노코발라민 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 용액에 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 안정성 증가 방법에 의해 해결된다.
상기 과제는 추가로, 단백질, 및 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함하는 점도-감소 용액을 포함하는 조성물에 의해 해결된다. 상기 과제는 단백질, 및 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 제 2 부형제를 포함하는 조성물에 의해 해결된다.
게다가, 상기 과제는 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함하는, 단백질, 특히 치료 단백질의 액체 제형에 의해 해결된다. 상기 과제는 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 제 2 부형제를 포함하는, 단백질 특히 치료 단백질의 액체 제형에 의해 해결된다.
게다가, 상기 과제는 단백질, 및 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함하는 조성물의 동결건조 단백질 제형에 의해 해결된다. 상기 과제는 단백질, 및 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 제 2 부형제를 포함하는 조성물의 동결건조 단백질 제형에 의해 해결된다.
게다가, 상기 과제는 단백질, 및 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함하는 조성물을 포함하는 키트에 의해 해결된다. 상기 과제는 단백질, 및 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 제 2 부형제를 포함하는 조성물을 포함하는 키트에 의해 해결된다.
본 발명의 부가적인 주제는 액체 단백질 조성물을 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 배합하는 단계를 포함하는, 생물공정에서의 액체 단백질 조성물의 점도 감소 방법이다. 바람직하게는 액체 단백질 조성물은 추가로 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 포함한다.
본 발명은 단백질 및, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하는 약학 조성물 또는 액체 제형에 관한 것이다.
본원에서 "단백질" 은 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어 폴리펩티드를 형성하는 아미노산의 중합체로서 정의된다. 단백질은 자연 발생 또는 비-자연 발생, 합성 또는 반합성일 수 있다. 용어 "단백질" 은 또한 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 및 하기 정의된 바와 같은 임의의 치료 단백질을 포함하는 것으로 이해된다. 바람직하게는 "단백질" 은 검출가능한 3차 구조를 형성하기에 충분한 길이를 갖는다.
메커니즘에 의해 구속되기를 원하지 않지만, 본 발명에 따른 조성물 및 제형의 점도 감소 효과는 부형제와 단백질의 아미노산 잔기 사이의 상호작용에 기초하는 것으로 여겨진다. 모든 단백질은 아미노산의 동일한 풀 (pool) 로부터 구축되기 때문에, 본원에 기재된 효과는 따라서 모든 단백질에 적용가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 그의 서열, 크기 및 구조에 관계 없이 임의의 단백질에 유리한 효과를 갖는다.
본 발명은 또한 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민 히드로클로라이드, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 파라세타몰, 구아니딘 히드로클로라이드 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함하는 치료 단백질의 액체 제형에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제형은 각각의 단백질의 감소된 점도 및 증가된 안정성을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "액체 조성물" 은 적어도 점도 감소 부형제를 함유하는 단백질 수용액을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "액체 제형" 은 단백질이 허용가능한 약학 희석제로 공급되거나 환자에게 투여하기 전에 허용가능한 약학 희석제로 재구성된 치료 단백질인, 치료적 용도를 위한 액체 조성물을 말한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형에 함유된 단백질은 치료 단백질이다.
본원에 사용된 용어 "치료 단백질" 은 질환 또는 의학적 상태의 치료 또는 예방을 목적으로 대상체에게 투여되는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 특히, 대상체는 포유동물 또는 인간일 수 있다. 치료 단백질은 상이한 목적, 예컨대 결핍되거나 비정상인 단백질을 대체하고, 기존 경로를 증가시키고, 새로운 기능 또는 활성을 제공하고, 분자 또는 유기체를 방해하고, 다른 화합물 또는 단백질, 예컨대 방사성 핵종, 세포독성 약물 또는 효과기 단백질을 전달하는 것을 위해 투여될 수 있다. 치료 단백질은 항체-기반 약물, Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 인자, 골 형성 단백질, 조작된 단백질 스캐폴드, 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터류킨, 항체 약물 접합체 (ADC) 및 혈전용해제를 포함한다. 치료 단백질은 자연 발생 단백질 또는 재조합 단백질일 수 있다. 그의 서열은 자연적인 것이거나 조작된 것일 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형 내의 단백질은 항체, 특히 치료 항체이다.
추가의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형 내의 단백질은 혈장 유래 단백질, 특히 IgG 또는 hyperIgG 이다. 혈장 단백질을 함유하는 일부 약학 제형은 상이한 혈장 단백질의 혼합물을 포함한다.
용어 "혈장 유래 단백질"은 공여자의 혈액 혈장에서 혈장 분획에 의해 유래된 단백질을 의미한다. 상기 공여자는 인간 또는 비인간일 수 있다. 혈장 단백질에 대한 하나의 예는 면역 글로불린이다.
본원에서 용어 "IgG" 는 면역 글로블린형 G 를 의미한다. 본원에서 용어 "IgM" 은 면역 글로블린형 M 을 의미한다. 본원에서 용어 "IgA" 는 면역 글로블린형 A 를 의미한다.
본원에서 용어 "hyper-IgG" 는 특정 질환에 의해 감염되거나 이에 대항해 백신접종된 기증자로부터 정제된 IgG 의 제형을 의미한다. 상기 공여자는 인간 또는 비인간일 수 있다.
본원에서 용어 "항체" 는 모노클로날 항체 (전장 또는 온전한 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 지칭한다.
항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 일반적으로 포함하여 항원에 결합하는 능력을 보유하는 온전한 항체의 일부 만을 포함한다. 본 정의에 포함되는 항체 단편의 예는 다음을 포함한다: Fab 단편, Fab' 단편, Fd 단편, Fd' 단편, Fv 단편, dAb 단편, 단리된 CDR 영역, F(ab')2 단편 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 분자, 디아바디 및 선형 항체.
하나의 구현예에서, 단백질은 바이오시밀러이다. "바이오시밀러" 는 본원에서 또다른 이미 승인된 다른 생물학적 의약품과 매우 유사한 생물학적 의약품으로 정의된다. 바람직한 구현예에서, 바이오시밀러는 모노클로날 항체이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 하나 이상의 단백질 종을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물 및 제형은 시아노코발라민 (CAS-등록 번호 68-19-9), 피리독신 (비타민 B6, CAS-등록 번호 65-23-6), 아스코르브산 (비타민 C, CAS-등록 번호 50-81-7), 엽산 (CAS-등록 번호 59-30-3), 티아민 모노포스페이트 (CAS-등록 번호 10023-48-0), 티아민 피로포스페이트 (코카르복실라제, CAS-등록 번호 154-87-0), 파라세타몰 (아세트아미노펜, CAS-등록 번호 103-90-2), 구아니딘 히드로클로라이드 (카르밤이미도일아자늄 클로라이드, CAS-등록 번호 50-01-1) 및 퀴닌 히드로클로라이드 ((R)-[(1S,2S,4S,5R)-5-에테닐-1-아자비시클로[2.2.2]옥탄-2-일](6-메톡시퀴놀린-4-일)메탄올 이수화물 히드로클로라이드, CAS-등록 번호 6119-47-7) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 1 점도 감소 부형제를 포함한다.
본 발명에 따르면, 점도 감소 부형제는 또한 부형제의 염 또는 용매화물을 포함한다. 본 발명의 문맥에서 바람직한 염은 본 발명에 따른 화합물의 생리학적으로 허용가능한 염이다. 그 자체가 약학적 용도에 적합하지 않지만, 예를 들어 본 발명에 따른 화합물의 단리, 정제 또는 저장에 사용될 수 있는 염이 또한 포함된다.
본 발명에 따른 화합물의 생리학적으로 허용가능한 염은 통상의 염기의 염, 예컨대 예를 들어, 바람직하게는 알칼리 금속 염 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨 염), 알칼리 토금속 염 (예를 들어, 칼슘 및 마그네슘 염) 및 암모니아 또는 1 내지 16 개의 탄소 원자를 갖는 유기 아민으로부터 유래된 암모늄 염, 예컨대 예를 들어, 바람직하게는 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디메틸아미노에탄올, 디에틸아미노에탄올, 프로카인, 디시클로헥실아민, 디벤질아민, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 아르기닌, 리신 및 1,2-에틸렌디아민을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 생리학적으로 허용가능한 염은 통상의 산의 염, 예컨대 예를 들어, 바람직하게는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 카르보네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-헥시에탄술포네이트 (이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌술포네이트, 메탄술포네이트, 나프틸렌술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로프리오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 비카르보네이트, 파라-톨루엔술포네이트 및 운데카노에이트를 포함한다.
특정 예에 제한되지 않으면서, 생리학적으로 허용가능한 염은 엽산의 염, 예를 들어 나트륨 폴레이트, 아스코르브산의 염, 예를 들어 나트륨 아스코르베이트, 티아민의 염, 예를 들어 티아민 히드로클로라이드, 오르니틴의 염, 예를 들어 오르니틴 모노히드로클로라이드 또는 카르니틴의 염, 예를 들어 카르니틴 히드로클로라이드일 수 있다.
본 발명의 문맥에서 용매화물은 용매 분자와 배위하여 고체 또는 액체 상태에서 복합체를 형성하는 본 발명에 따른 화합물의 형태로서 지정된다. 수화물은 배위가 물과 함께 일어나는, 용매화물의 특정 형태이다. 수화물은 본 발명의 문맥에서 바람직한 용매화물이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함한다.
본 발명에 따른 액체 조성물 및 제형은 조성물의 점도를 감소시키고/시키거나 단백질을 안정화시키기에 충분한 제 1 부형제의 양을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 약 5 mM 내지 약 300 mM, 약 5 mM 내지 약 250 mM 또는 약 5 mM 내지 약 150 mM 의 제 1 부형제를 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, 제 1 부형제의 농도는 1, 5, 10, 12, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 250, 또는 300 mM 또는 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 1 내지 9 mM, 더욱 바람직하게는 5 mM 의 시아노코발라민을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 단독으로 사용시 5 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 25 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 150 mM 및 조합으로 사용시 75 mM 의 피리독신을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 5 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 25 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 150 mM 의 아스코르브산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 단독으로 사용시 5 내지 20 mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 mM, 가장 바람직하게는 13 mM 및 조합으로 사용시 12 mM 의 엽산을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 단독으로 사용시 1 내지 420 mM, 더욱 바람직하게는 25 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 150 mM 및 조합으로 사용시 75 mM 의 티아민 모노포스페이트를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 1 내지 450 mM, 더욱 바람직하게는 25 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 75 mM 의 티아민 피로포스페이트를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 5 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 25 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 150 mM 의 구아니딘 히드로클로라이드를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 1 내지 25 mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 25 mM 의 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 5 내지 100 mM, 더욱 바람직하게는 25 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 75 mM 의 파라세타몰을 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민 히드로클로라이드, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 파라세타몰, 구아니딘 히드로클로라이드 또는 퀴닌 히드로클로라이드의 첨가가 단백질 용액의 점도를 유의하게 감소시키고 용액 내의 상기 단백질의 안정성을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명은 따라서 감소된 점도 및/또는 증가된 안정성을 갖는 조성물 및 제형을 제공한다.
본 발명에 따른 액체 조성물 및 제형은 단백질을 포함하지만 제 1 및/또는 제 2 부형제를 포함하지 않는 조성물과 비교하여 증가된 안정성을 나타낸다.
시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰은 모두 무독성이고 안전한 것으로 알려진 화합물이다. 따라서, 그들의 투여는 잘 용인된다.
본 발명의 하나의 양상에서, 이들 조성물 및 제형은 점도 감소 이외의 목적, 예를 들어 안정화, 가용화 또는 보존을 위해 사용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상에서, 조성물 및 제형은 하나 초과의 제 1 부형제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 2, 3 또는 4 개의 제 1 부형제를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 이들은 2 개의 제 1 부형제를 함유한다.
2, 3 또는 4 개의 제 1 부형제의 조합은 단백질을 포함하는 조성물 및 제형에서 또는 단백질 용액에서 점도를 상승적으로 감소시키고/시키거나 안정성을 증가시킬 수 있다. 본원에서 정의되는 "상승작용적" 은 성분의 조합의 작용이 각각의 성분 단독의 작용의 합계보다 더 큰 효과를 지칭한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 피리독신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 아스코르브산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 엽산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 티아민 모노포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 티아민 피로포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 파라세타몰을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 아스코르브산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 엽산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 티아민 모노포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 티아민 피로포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 파라세타몰을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 엽산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 티아민 모노포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 티아민 피로포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 파라세타몰을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 티아민 모노포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 티아민 피로포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 파라세타몰을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 파라세타몰을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 파라세타몰을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 퀴닌 히드로클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 파라세타몰을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌, 및 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민 히드로클로라이드, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 부형제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 히드로클로라이드 및 피리독신 또는 엽산으로 이루어진 군으로부터 선택된 부형제를 포함한다. 이들 부형제의 조합은 단백질 용액 또는 조성물의 점도를 감소시키는 데 특히 유용하다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 히드로클로라이드 및 엽산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 히드로클로라이드 및 피리독신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 피리독신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 티아민 모노포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 티아민 피로포스페이트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 엽산을 포함한다.
하나 이상의 부형제가 본 발명의 조성물 및 제형에 존재하는 경우, 부형제의 농도는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 및 제형은 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "점도 감소 부형제" 는, 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 조성물과 비교하여 단백질 용액의 점도를 적어도 5% 감소시키는 것으로 알려진 적합한 농도의 임의의 화합물을 지칭한다.
적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제는 바람직하게는 발린 (CAS-등록번호 72-18-4), 프롤린 (CAS-등록번호 147-85-3), 류신 (CAS-등록번호 61-90-5), 이소류신 (CAS-등록번호 73-32-5), 페닐알라닌 (CAS-등록번호 63-91-2), 티아민 히드로클로라이드 (CAS-등록번호 67-03-8), 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민 ((2R,3R,4R,5S)-6-(메틸아미노)헥산-1,2,3,4,5-펜톨, CAS-등록번호 6284-40-8), 벤젠술폰산 (CAS-등록번호 98-11-3), 카페인 (1,3,7-트리메틸크산틴, CAS-등록번호 58-08-2) 및 캄포르술폰산 ((7,7-디메틸-2-옥소바이시클로[2.2.1]헵탄-1-일)메탄술폰산) 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 액체 조성물 및 제형은 조성물의 점도를 추가로 감소시키고/시키거나 단백질을 안정화시키기에 충분한 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 부형제의 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 250 mM 또는 약 140 mM 내지 약 200 mM 의 제 2 부형제를 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 부형제의 농도는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 250, 또는 300 mM 또는 이상이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 150 mM 의 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 리신 또는 티아민 히드로클로라이드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 50-100 mM 의 제 2 부형제를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 5-13 mM 농도의 엽산을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 5 mM 농도의 시아노코발라민을 포함한다.
이러한 구현예에서, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 부형제는, 점도를 감소시키고/시키거나 그의 안정성을 증가시키기 위해 단백질 또는 단백질 용액을 포함하는 조성물 및 제형에 첨가될 수 있는 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 부형제와 함께 점도 감소 용액을 형성한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 적어도 하나의 제 1 및 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하며, 여기서 부형제는 단백질을 포함하는 조성물 및 제형 또는 단백질 용액 중의 점도를 상승작용적으로 감소시키고/시키거나 안정성을 증가시킨다.
본 발명에 따르면, 2 종 이상의 부형제의 조합에 의한 점도 감소가 각각의 개별 부형제의 점도 감소의 예상 합을 초과하는 경우 점도의 상승적 감소가 주어진다. 바람직하게는, 2 종 이상의 부형제의 조합에 의한 백분율 점도 감소가 각각의 개별 부형제의 백분율 점도 감소의 예상 합을 초과하는 경우 점도의 상승적 감소가 주어진다.
부가적으로, 본 발명에 따르면, 2 종 이상의 점도 감소 부형제의 조합은 2 종 이상의 부형제의 조합에 의한 단백질 안정성 감소가 각각의 개별 부형제의 안정성 감소의 예상 합 미만인 경우에 상승적이다.
하나의 구현예에서, 본 출원에서 언급된 모든 조합은 단백질을 포함하는 액체 조성물의 점도의 상승적 감소를 초래한다.
하나의 구현예에서, 피리독신/아르기닌, 엽산/오르니틴, 엽산/카르니틴, 피리독신/메글루민, 티아민 모노포스페이트/메글루민, 피리독신/티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌/캄포르술폰산 및 페닐알라닌/벤젠술폰산의 조합은 단백질을 포함하는 액체 조성물의 점도의 상승적 감소를 초래한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 시아노코발라민 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 아스코르브산 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 구아니딘 히드로클로라이드 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 퀴닌 히드로클로라이드 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 오르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 카르니틴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 메글루민을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 캄포르술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 벤젠술폰산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 카페인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 발린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 프롤린을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 이소류신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 페닐알라닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 파라세타몰 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 액체 제형이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 액체 제형이고 단백질은 치료 단백질이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 단백질, 및 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함하는 동결건조 단백질 제형을 제공한다. 적합한 양의 희석제로 재구성시, 제형은 부형제를 포함하지 않는 다르게는 동일한 조성을 갖는 대조군 제형에 비해 감소된 점도를 나타낸다. 따라서, 부형제는 희석제로 재구성 시 점도를 감소시키는 데 효과적인 양으로 존재한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 단백질, 및 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라아세트몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제 및 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하는 동결건조 단백질 제형을 제공한다.
동결건조 단백질 제형은 단백질 및 건조된 본 발명에 따른 적어도 하나의 부형제를 포함하고, 예를 들어 분말 형태로 입자로서 존재한다. 본 맥락에서, "분말" 이라는 표현은 본질적으로 건조한 입자의 집합, 즉 수분 함량이 적어도 약 10 중량%, 6 중량%, 4 중량%, 또는 그 미만인 것을 지칭한다.
본원에 정의된 바와 같이, "점도" 는 물질 (전형적으로 액체) 의 흐름에 대한 저항을 지칭한다. 점도는 전단력의 개념과 관련이 있다; 이는 서로 반대 방향으로 움직일 때 서로 또는 다른 표면에 전단력을 가하는 유체의 다른 층의 효과로 이해될 수 있다. 점도를 표현하는 방식에는 여러 가지가 있다. 점도 단위는 파스칼-초 (Pas) 로 알려져 있는, Ns/m2 이다. 점도는 "키네마틱" 또는 "절대" 일 수 있다. 키네마틱 점도는 운동량이 유체를 통해 전달되는 속도의 측정이다. 이것은 Stokes (St) 로 측정된다. 키네마틱 점도는 중력의 영향을 받는 유체의 저항 흐름의 측정이다. 부피가 같고 점도가 상이한 두 유체를 동일한 모세관 점도계에 넣고 중력에 의해 흐르게 하면, 좀더 점성인 유체가 모세관을 통해 흐르는게 덜 점성인 유체보다 더 오래 걸린다. 예를 들어, 하나의 유체가 흐름을 완료하는 데 200 초가 걸리고 다른 유체가 400 초가 걸리는 경우, 두 번째 유체는 키네마틱 점도 척도에서 첫 번째 유체보다 두 배의 점성이 있다고 한다. 키네마틱 점도의 치수는 길이2/시간 이다. 통상, 키네마틱 점도는 센티스토크 (centiStokes: cSt) 로 표현된다. 키네마틱 점도의 SI 단위는 mm2/s 로서, 이는 1 cSt 와 같다. 종종 "동점도" 또는 "단순 점도" 라고도 하는 "절대 점도" 는 키네마틱 점도와 유체 밀도의 곱이다. 절대 점도는 센티포이즈 (cP) 단위로 표현된다. 절대 점도의 SI 단위는 밀리파스칼 초 (mPas) 이며, 여기서 1 cP = 1 mPas 이다.
점도는 예를 들어, 주어진 전단 속도 또는 다중 전단 속도에서 점도계를 사용하여 측정할 수 있다. "외삽된 제로-전단" 점도는 절대 점도 대 전단 속도의 플롯에서 4 개의 가장 높은 전단 점의 최적 선을 만들고, 점도를 제로 전단으로 다시 선형 외삽하여 결정될 수 있다. 대안적으로는, 뉴턴 유체의 경우 여러 전단 속도에서 점도 값을 평균하여 점도를 결정할 수 있다. 점도는 또한 단일 또는 다중 전단 속도 (유량이라고도 함) 에서 미세유체 점도계를 사용하여 측정할 수 있으며, 여기서 절대 점도는 액체가 채널을 통해 흐를 때 압력 변화에서 유래된다. 점도는 전단율에 대한 전단 응력과 같다. 미세유체 점도계로 측정된 점도는 일부 구현예에서, 외삽된 제로 전단 점도, 예를 들어 콘 및 플레이트 점도계를 사용하여 다중 전단율에서 측정된 점도로부터 외삽된 점도와 직접 비교할 수 있다. 본 발명에 따르면, 조성물 및 제형의 점도는 상기 기재된 방법 중 적어도 하나가 안정화 효과를 나타낼 때 감소한다. 바람직하게는, 미세유체 점도계를 사용하여 20℃ 에서 점도를 측정한다. 보다 바람직하게는 점도는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하여 측정된다. 가장 바람직하게는 점도는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하고, 500 ㎕ 주사기, 전단 속도 3000 s-1 또는 2000 s-1 및 부피 200 ㎕ 을 사용하여 측정된다.
당업자라면 미세유체 점도계를 이용한 점도 측정에 대해서 잘 알 것이다. 미세유체 점도계로는 특히 상기 기재된 파라미터를 갖는 RheoSense mVROC microfluidic viscometer (mVROCTM Technology) 가 사용될 수 있다. 상세한 사양, 방법 및 설정은 901003.5.1-mVROC_User's_Manual 에서 확인할 수 있다.
본원에서 "전단율" 은 한 층의 유체가 인접한 층을 통과하는 속도 변화 속도를 말한다. 속도 구배는 플레이트로부터의 거리에 따른 속도 변화율이다. 이 간단한 사례는 (cm/sec)/(cm)=1/sec 단위로의 전단율 (v1-v2)/h 을 균일한 속도 구배로 보여준다. 따라서, 전단율 단위는 상호 초 또는 일반적으로 상호 시간이다. 미세유체 점도계의 경우, 압력 및 유속의 변화는 전단율과 관련이 있다. "전단율" 은 재료가 변형되는 속도이다. 단백질 및 점도-저하제를 포함하는 제형은, 관심 샘플의 점도 범위에서 점도를 정확하게 측정하기 위해 당업자가 적절하게 선택한 콘 및 플레이트 점도계 및 스핀들을 사용하여 측정할 때 (즉, 20 cP 의 샘플은 DV2T 점도계 (Brookfield) 에 부착된 CPE40 스핀들에서 가장 정확하게 측정됨) 일반적으로 약 0.5 s-1 내지 약 200 s-1; 미세유체 점도계를 사용하여 측정할 때 약 20 s-1 내지 약 3,000 s-1 범위의 전단율에서 측정된다.
본원에서 일반적으로 사용되는 고전적인 "뉴턴" 유체의 경우, 점도는 본질적으로 전단율과 독립적이다. 그러나, "비-뉴턴 유체" 의 경우, 점도는 전단율이 증가함에 따라 감소하거나 증가한다, 예를 들어 유체는 각각 "전단 박화" 또는 "전단 농후" 된다. 농축된 (즉, 고농도) 단백질 용액의 경우, 이는 의가소성 전단-박화 거동, 즉 전단율에 따른 점도 감소로 나타날 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함하지 않는 동일한 조성물과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 의 점도 감소를 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 적어도 하나의 제 1 및 적어도 하나의 제 2 부형제를 포함하지 않는 동일한 조성물과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 의 점도 감소를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "안정성" 은 화학적 및 물리적 안정성을 모두 포함한다.
본원에서 용어 "화학적 안정성" 은 산화, 탈아미드화 또는 가수분해 등의 화학적 경로를 통한 분해에 저항하는 제형 내의 단백질 성분의 능력을 지칭한다. 단백질 제형은 전형적으로 4℃ 에서 24 개월 후 약 5% 미만의 성분이 분해되면 화학적으로 안정한 것으로 간주된다. 본 발명에 따르면, 단백질 제형은 전형적으로 60% 의 상대 습도로 25℃ 에서 24 주 후에 약 5% 미만의 성분이 분해되는 경우 화학적으로 안정한 것으로 간주된다.
안정성은 다양한 온도 (열안정성) 및/또는 기간 (유효 기간) 에 걸친 및/또는 스트레스가 많은 취급 상황 (예, 물리적 교반) 에 대한 노출 후 형태 변화 모니터링을 포함하여, 당업자에게 공지된 여러 방법으로 평가할 수 있다. 다양한 농도의 제형 성분을 포함하는 제형의 안정성은 다양한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 단백질 응집의 양은 탁도의 육안 관찰에 의해, 특정 파장에서의 흡광도 측정에 의해, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 (단백질 응집체가 천연 활성 상태의 단백질과 비교하여 상이한 분획에서 용출됨), HPLC 또는 기타 크로마토그래피 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어 변성 온도를 결정하기 위한 시차 주사 열량계 (DSC), 또는 단백질의 몰 타원도를 측정하는 원형 이색성 (CD) 을 포함하여 입체적 변화를 측정하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 형광을 사용하여 조성을 분석할 수도 있다. 형광은 적합한 파장을 필요로 하는 광의 흡수에 후속하는 광의 방출을 포함한다. 잠재적 판독값은 광의 극성 특성, 광 강도 또는 방출 파장의 변화이다. 형광 방출은 단백질에 고유한 것일 수 있거나, 예를 들어 부분적으로 미폴딩된 단백질의 소수성 포켓에 결합하는 형광 리포터 분자에 기인할 수 있다. 리포터 분자의 결합 증가는 단백질 샘플의 형광 신호 감지에 의해 모니터링할 수 있다. 안정성을 측정하기 위한 다른 수단이 사용될 수 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 조성물 및 제형의 안정성은 상기 기재된 방법 중 적어도 하나가 안정화 효과를 나타낼 때 증가한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 또는 적어도 하나의 제 1 및 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 조성물과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 의 단백질의 안정성에서의 증가를 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 발린, 류신, 아스코르브산, 시아노코발라민 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택된 점도 감소 부형제를 포함하고, 상승된 Tm 및/또는 Tagg 를 특징으로 하는 증가된 단백질 안정성을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 발린, 류신, 아스코르브산, 시아노코발라민 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택된 점도 감소 부형제를 포함하고, (i) 상승된 Tm 및/또는 Tagg 를 특징으로 하는 증가된 단백질 안정성 및 (ii) 감소된 점도를 둘 다 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 제 2 부형제로서 페닐알라닌, 캄포르술폰산 또는 벤젠술폰산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 피리독신을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 엽산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 티아민 모노포스페이트를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 티아민 피로포스페이트를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 아르기닌을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 오르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 카르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 메글루민을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 벤젠술폰산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 페닐알라닌 및 캄포르술폰산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 아르기닌을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 오르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 카르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 메글루민을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 피리독신 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 아르기닌을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 오르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 카르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 메글루민을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 엽산 및 티아민 히드로클로라이드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 아르기닌을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 오르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 카르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 모노포스페이트 및 메글루민을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 아르기닌을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 카르니틴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 제형은 티아민 피로포스페이트 및 메글루민을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 조성물은 페닐알라닌 및 벤젠술폰산, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산, 티아민 히드로클로라이드 및 벤젠술폰산, 티아민 히드로클로라이드 및 캄포르술폰산, 피리독신 및 아르기닌, 피리독신 및 오르니틴, 피리독신 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 엽산 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 엽산 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 아르기닌, 티아민 모노포스페이트 및 오르니틴, 티아민 모노포스페이트 및 카르니틴, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 티아민 피로포스페이트 및 아르기닌, 티아민 피로포스페이트 및 오르니틴, 티아민 피로포스페이트 및 카르니틴, 티아민 피로포스페이트 및 메글루민으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 종의 점도 감소 부형제의 조합을 포함한다.
추가의 구현예에서, 액체 조성물은 단백질, 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 피리독신 및 아르기닌이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 엽산 및 오르니틴이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 엽산 및 카르니틴이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 피리독신 및 메글루민이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 티아민 모노포스페이트 및 메글루민이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 피리독신 및 티아민 모노포스페이트이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 페닐알라닌 및 캄포르술폰산이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 페닐알라닌 및 벤젠술폰산이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 피리독신 및 아르기닌, 피리독신 및 메글루민 및 피리독신 및 티아민 모노포스페이트로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 엽산 및 오르니틴 및 엽산 및 카르니틴으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 피리독신 및 메글루민 및 티아민 모노포스페이트 및 메글루민으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 티아민 모노포스페이트 및 메글루민 및 피리독신 및 티아민 모노포스페이트로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 2 내지 10, 바람직하게는 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 5 내지 7.2 의 pH 를 갖는다. 하나의 구현예에서, 조성물 및 제형은 정확히 5 또는 정확히 7.2 의 pH 를 갖는다.
본 발명에 따른 조성물 및 제형은 약학적으로 허용가능한 희석제, 용매, 담체, 접착제, 결합제, 보존제, 가용화제, 계면활성제, 침투 증진제, 유화제 또는 생체이용률 증진제를 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 안전하고 잘 허용되는 액체 조성물에 적합한 첨가제를 선택하는 방법을 알고 있다.
제 1 및/또는 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함하는 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 점도 감소 이외의 목적, 예를 들어 안정화, 가용화 또는 보존을 위해 사용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 당 및/또는 계면활성제와 같은 안정화제를 포함한다. 안정화제로서 적합한 당은 문헌에 공지되어 있으며, 예를 들어 수크로오스 또는 트레할로오스이다. 바람직한 구현예에서, 당은 수크로오스이다. 적합한 계면활성제는 문헌에 공지되어 있으며, 예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 또는 폴록사머 188 이다. 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80 이다. 추가의 안정화제의 첨가는 본 발명에 따른 조성물의 안정화 효과를 추가로 향상시킨다.
본 발명에 따른 액체 조성물 및 제형은 조성물의 점도를 감소시키고/시키거나 단백질을 안정화시키기에 충분한 제 1 및 임의로 제 2 부형제의 양을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 약 5 mM 내지 약 300 mM, 약 5 mM 내지 약 250 mM 또는 약 5 mM 내지 약 150 mM 의 각각의 제 1 및 임의로 제 2 부형제를 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, 각각의 제 1 및 임의로 제 2 부형제의 농도는 1, 5, 10, 12, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 250, 또는 300 mM 이상이다. 바람직하게는 각각의 제 1 및 임의로 제 2 부형제의 농도는 75 또는 150 mM 이다.
하나의 구현예에서, 액체 조성물은 2 개의 부형제의 조합을 포함하며, 여기서 부형제의 몰 농도는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는 각각의 제 1 및 임의로 제 2 부형제의 농도는 1 mM 내지 200 mM, 더욱 바람직하게는 25 mM 내지 150 mM, 가장 바람직하게는 50 mM 내지 100 mM 이다. 제 1 및 제 2 부형제의 몰비는 1:100 내지 100:1, 바람직하게는 1:10 내지 10:1, 더욱 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 가장 바람직하게는 1:2 내지 2:1 이다. 특정 구현예에서, 제 1 및 제 2 부형제의 몰 농도는 동일하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 액체 조성물을 제공하며, 단백질은 120 kDa 내지 250 kDa, 바람직하게는 130 kDa 내지 180 kDa 의 분자량을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 및 제형 중의 단백질 농도는 적어도 1 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 바람직하게는 적어도 75 mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 100 mg/ml 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 단백질 농도는 90 mg/ml 내지 300 mg/ml 이고, 더욱 바람직하게는 단백질 농도는 100 내지 250 mg/ml 이고, 더 더욱 바람직하게는 120 내지 210 mg/ml 이다. 본 발명은 이러한 고농도 조성물, 제형 및 용액에 특히 유용하다.
본 발명은 10 mM 내지 50 mM 농도의 완충제를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 액체 조성물을 추가로 제공한다. 완충제는 적합한 아세테이트- 또는 포스페이트 염일 수 있고 5 내지 7.2 의 pH 를 제공할 수 있다.
본 발명은 안정화제로서 당, 바람직하게는 50 내지 100 mg/ml 수크로오스를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 액체 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 계면활성제, 바람직하게는 0.01 내지 0.2 mg/ml 더욱 바람직하게는 0.05 mg/ml 의 폴리소르베이트 80 을 추가로 포함하는 본 발명에 따른 액체 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따르는 액체 조성물을 제공하며, 점도는 1 mPas 내지 60 mPas, 바람직하게는 1 mPas 내지 50 mPas, 더욱 바람직하게는 1 mPas 내지 30 mPas, 가장 바람직하게는 1 mPas 내지 20 mPas 이다. 바람직하게는, 미세유체 점도계를 사용하여 20℃ 에서 점도를 측정한다. 더욱 바람직하게는 점도는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하여 측정된다. 가장 바람직하게는 점도는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하고, 500 ㎕ 주사기, 전단 속도 3000 s-1 또는 2000 s-1 및 부피 200 ㎕ 을 사용하여 측정된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 액체 조성물을 제공하고, 단백질은 90 mg/ml 내지 300 mg/ml 의 농도에서 120 kDa 내지 250 kDa 의 분자량을 갖고, 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM 의 농도에서 아세테이트 완충제 또는 포스페이트 완충제를 추가로 포함하고, 제형은 20℃ 에서 바람직하게는 미세유체 점도계를 사용하여, 더욱 바람직하게는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하여, 가장 바람직하게는 20℃ 에서 500 ㎕ 주사기로 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하여, 3000 s-1 또는 2000 s-1 의 전단 속도 및 200 ㎕ 의 부피에서 측정할 때 pH 5 내지 7.2 의 pH 및 1 mPas 내지 60 mPas 의 점도를 갖는다.
바람직하게는, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제가 존재하는 본 발명에 따른 액체 조성물은 90 mg/ml 내지 300 mg/ml, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 내지 200 mg/ml 의 단백질 농도 및 각각 50 내지 200 mM, 더욱 바람직하게는 각각 50 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 각각 75 mM 의 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 농도를 갖는다. 바람직하게는, 단백질은 항체이고 120 kDa 내지 250 kDa 의 분자량을 갖는다. 바람직하게 제형은 미세유체 점도계를 사용하여 20℃ 에서 측정시 pH 가 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 5 내지 7.2 이고 점도는 1 mPas 내지 60 mPas 이다.
본 발명은 단백질이 인플릭시맙인 본 발명에 따른 액체 조성물을 추가로 제공한다. 바람직하게는 액체 조성물 중 인플릭시맙 농도는 122 mg/ml 내지 185 mg/ml 이다.
Janssen Biotech, Inc. 에 의해 개발된 인플릭시맙 (REMICADE®) 및 Biogen 에 의해 개발된 그의 바이오시밀러 약물 (FUXABI®), Celltrion 에 의해 개발된 (Inflectra) 는 류마티스 관절염, 성인 궤양성 대장염, 판상 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 & 소아 크론병의 치료에 사용된다 (용량/투약량: 5 mg/kg). 인플릭시맙은 자가면역 질환을 치료하는데 사용되는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-a) 에 대한 mAb 이다. 인플릭시맙은 TNFa 의 가용성 및 트랜스멤브레인 형태에 높은 친화성으로 결합하여 TNFa 의 생물학적 활성을 중화시키고, TNFa 와 그의 수용체의 결합을 억제한다. 이는 미국에서 Janssen Global Services, LLC ("Janssen"), 일본에서 Mitsubishi Tanabe Pharma, 중국에서 Xian Janssen, 및 그 외에서 Merck Sharp & Dohme ("MSD") 에 의해 상표명 REMICADE® 로 판매되고 있다. 일부 구현예에서, 제형은 REMICADE® 의 바이오시밀러, 예컨대 REMSIMATM 또는 INFLECTRATM 를 함유한다.. REMSIMATM 은 Celltrion, Inc. ("Celltrion") 에 의해 개발되었고, INFLECTRATM 은 Hospira Inc., UK 에 의해 개발되었다. 인플릭시맙은 현재 약 3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위의 용량으로 iv 주입을 통해 투여된다.
본 발명은 단백질이 에볼로쿠맙 (Evolocumab) 인 본 발명에 따른 액체 조성물을 추가로 제공한다. 바람직하게는 액체 조성물 중 에볼로쿠맙 (Evolocumab) 농도는 163 mg/ml 내지 204 mg/ml 이다.
Amgen 에 의해 개발된 에볼로쿠맙 (REPATHA®) 은 PCSK9 (프로단백질 컨버타아제 서브틸리신 켁신 유형 9) 를 표적화하여 저밀도 지질단백질 콜레스테롤 (LDL-C) 을 감소시키는 HeFH, CVD 의 치료에 사용된다 (용량/투약량: 매달 420 mg).
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물 및 제형을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 투여를 위한 설명서 뿐만 아니라, 용기, 주사기 및/또는 투여를 위한 다른 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 임의로 용기 내에, 본 발명의 동결건조 단백질 제형, 및 그의 재구성 및 투여 지침서를, 임의로 멸균 희석액의 바이알과 함께, 그리고 주사기 또는 다른 투여 장치와 함께 포함하는 키트에 관한 것이다. 예시적인 용기는 바이알, 튜브, 병, 단일 또는 다중 챔버 사전 충전 주사기 또는 카트리지 뿐 아니라, 웰에 놓인 즉시 사용 가능한 동결 건조 또는 분무 건조된 제형을 포함하는 96-웰 플레이트를 포함한다. 예시적인 투여 장치는 바늘이 있거나 없는 주사기, 주입 펌프, 제트 주입기, 펜 장치, 경피 주입기 또는 기타 바늘이 없는 주입기를 포함한다.
본 발명은 또한 모든 전술한 액체 조성물 및 제형의 제조 목적을 위해 단백질 용액의 점도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 액체 조성물에 대해 언급된 바와 같은 부형제, 단백질의 조합 및 농도, 단백질의 농도 및 분자량, pH, 완충제 및 완충제 농도에 관한 모든 구현예는 또한 단백질 용액의 점도를 감소시키기 위한 방법에 적용가능하다.
본 발명은 추가로 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 단백질 용액에 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 단백질 용액에 첨가하는 단계 및 제 2 점도 감소 부형제를 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 단백질 용액에 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 첨가하는 단계 및 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 부형제를 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 언급된 바와 같은 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 또는 그의 염 또는 용매화물 및 상기 언급된 바와 같은 제 2 점도 감소 부형제 또는 그의 염 또는 용매화물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 단백질 용액에, 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하며, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합은 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하며, 단백질 용액 중의 단백질은 120 kDa 내지 250 kDa, 바람직하게는 130 kDa 내지 180 kDa 의 분자량을 갖는다.
본 발명은 또한 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하며, 단백질 용액 중의 단백질 농도는 적어도 1 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 바람직하게는 적어도 75 mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 100 mg/ml 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 단백질 농도는 90 mg/ml 내지 300 mg/ml 이고, 더욱 바람직하게는 단백질 농도는 100 내지 200 mg/ml 이다. 본 발명은 이러한 고농도 단백질 용액에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하며, 단백질 용액은 5 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM 의 농도에서 완충제를 추가로 포함하고 있다. 완충제는 적합한 아세테이트- 또는 포스페이트 염일 수 있고 5 내지 7.2 의 pH 를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하며, 단백질 용액은 안정화제로서 당, 바람직하게는 50 내지 100 mg/ml 수크로오스를 추가로 포함하고 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하며, 단백질 용액은 계면활성제, 바람직하게는 0.01 내지 0.2 mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.05 mg/ml 의 폴리소르베이트 80 을 추가로 포함하고 있다.
본 발명은 추가로 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하며, 용액의 산출되는 점도는 1 mPas 내지 60 mPas, 바람직하게는 1 mPas 내지 50 mPas, 더욱 바람직하게는 1 mPas 내지 30 mPas, 가장 바람직하게는 1 mPas 내지 20 mPas 이다. 바람직하게는, 미세유체 점도계를 사용하여 20℃ 에서 점도를 측정한다. 더욱 바람직하게는 점도는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하여 측정된다. 가장 바람직하게는 점도는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하고, 500 ㎕ 주사기, 전단 속도 3000 s-1 또는 2000 s-1 및 부피 200 ㎕ 을 사용하여 측정된다.
본 발명은 추가로 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하고, 점도는 적어도 하나의 제 1 부형제를 포함하지 않는 또는 적어도 하나의 제 1 및 적어도 하나의 제 2 부형제를 포함하지 않는 동일한 조성물과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 감소된다.
본 발명은 또한 추가로 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하고, 단백질 용액 중의 단백질은 90 mg/ml 내지 300 mg/ml 의 농도에서 120 kDa 내지 250 kDa 의 분자량을 갖고, 용액은 10 mM 내지 50 mM 의 농도에서 아세테이트 완충제 또는 포스페이트 완충제를 추가로 포함하고, 용액 제형은 20℃ 에서 바람직하게는 미세유체 점도계를 사용하여, 더욱 바람직하게는 20℃ 에서 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하여, 가장 바람직하게는 20℃ 에서 500 ㎕ 주사기로 RheoSense mVROC 미세유체 점도계를 사용하여, 3000 s-1 또는 2000 s-1 의 전단 속도 및 200 ㎕ 의 부피에서 측정할 때 pH 5 내지 7.2 의 pH 및 1 mPas 내지 60 mPas 의 점도를 갖는다.
또한, 본 발명은 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제가 상기 언급된 바와 같이 존재하는, 상기 기재된 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 이러한 구현예는 90 mg/ml 내지 300 mg/ml, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 내지 200 mg/ml 의 단백질 농도 및 각각 50 내지 200 mM, 더욱 바람직하게는 각각 50 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 각각 75 mM 의 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 농도를 갖는다. 바람직하게는, 단백질은 항체이고 120 kDa 내지 250 kDa 의 분자량을 갖는다. 바람직하게 제형은 바람직하게는 미세유체 점도계를 사용하여 20℃ 에서 측정시, pH 가 5 내지 7.2 이고 점도는 1 mPas 내지 60 mPas 이다.
마찬가지로, 본 발명은 또한 발린, 류신, 아스코르브산, 시아노코발라민 및 프롤린 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 용액에 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 안정성 증가 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 부형제를 단백질 용액에 또는 상기 언급된 적어도 2 개의 점도 감소 부형제의 조합에 첨가함으로써 용액 중의 단백질의 자가-연합 방지 방법을 제공한다.
하나의 양상에서, 제 1 부형제의 조합이 본 발명의 방법에 첨가된다. 본 발명의 방법에 사용되는 조합은 본 발명의 조성물 및 제형에 대해 정의된 것과 동일한 것일 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 방법은 추가로 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 부형제를 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 본원에서, 본 발명의 조성물 및 제형에 대해 정의된 제 1 및 제 2 부형제의 동일한 조합이 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 부형제는 당업자에게 공지된 임의의 방식으로 단백질 용액에 첨가될 수 있다. 하나 초과의 부형제가 첨가되는 경우, 부형제는 함께 혼합되어 점도 감소 용액을 형성하고, 이어서 단백질 용액에 첨가될 수 있다. 마찬가지로, 부형제는 단백질 용액에 별도로 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 단백질은 치료 단백질일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단백질은 상기 정의된 바와 같은 항체이다. 본 발명에 따른 방법에서, 단백질은 혈장 유래 단백질일 수 있다. 추가로 바람직한 구현예에서, 단백질은 상기 정의된 바와 같은 IgG 또는 hyper-IgG 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 액체 조성물은 약학 조성물이다. 본 발명은 또한 질환의 치료를 위한 치료 단백질을 포함하는 상기 기재된 바와 같은 약학 조성물에 관한 것이다.
특히 치료 단백질을 포함하는 상기 기재된 바와 같은 약학 조성물은 암, 류마티스성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 건선-관절염, 건선, 고콜레스테롤혈증, 혼합 이상지질혈증, 동종접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 심근 경색, 말초 동맥 질환 또는 면역 결핍 장애의 치료에 적합하다.
본 발명은 또한 치료 단백질을 포함하는 상기 기재된 바와 같은 약학 조성물의 투여를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
하나의 양상에서, 치료 방법은 암의 치료 방법이다. 즉, 본 발명에 따른 조성물 및 제형은 암, 류마티스성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 건선-관절염, 건선, 고콜레스테롤혈증, 혼합 이상지질혈증, 동종접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 심근 경색, 말초 동맥 질환 또는 면역 결핍 장애의 치료에 유용하다.
흡수 분광법을 통해 측정된 122 mg/ml 의 단백질 농도에서, 단백질 점도는 부형제의 부재 하에 편리한 주입성의 한계를 초과하였다. 편리한 주입성의 한계는 바늘의 길이 및 내경, 주사기 배럴의 내경과 같은 많은 인자에 좌우된다. 최대 100 mPas 의 점도를 갖는 의약품은 환자에게 주사될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 60 mPas 의 점도가 바람직하다. 30 mPas 미만 또는 20 mPas 미만의 낮은 점도는 증가된 환자의 편의성으로 인해 더욱 바람직하다.
발린, 류신, 페닐알라닌 또는 프롤린의 첨가는 제형의 점도를 감소시켰다. 143 mg/ml 의 더 높은 농도에서, 부형제의 부재 하의 제형의 점도는 80 mPas 초과의 값으로 극적으로 증가된다. 류신, 페닐알라닌 및 프롤린의 첨가는 제형의 점도를 감소시켰다. 이 실험에서 페닐알라닌은 특히 더 높은 단백질 농도에 대해, 가장 효율적인 점도 감소 부형제인 것으로 밝혀졌다.
150 mM 피리독신, 티아민 히드로클로라이드 또는 티아민 모노포스페이트를 149 mg/ml 첨가하는 단백질 농도에서 제형의 점도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 5 mM 시아노코발라민, 13 mM 엽산 또는 75 mM 티아민 피로포스페이트의 첨가는 제형의 점도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 특히 티아민 히드로클로라이드는 높은 점도 감소 전위를 나타낸다.
174 mg/ml 의 훨씬 더 높은 단백질 농도에서 150 mM 피리독신, 아스코르브산, 티아민 히드로클로라이드 또는 티아민 포스페이트의 점도 감소 효과가 관찰되었다. 또한, 5 mM 시아노코발라민, 13 mM 엽산 또는 75 mM 티아민 피로포스페이트의 첨가는 점도 감소 부형제가 없는 제형에 비해 제형의 점도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 특히 티아민 히드로클로라이드, 티아민 모노포스페이트는 높은 점도 감소 전위를 나타내었다.
티아민 피로포스페이트 및 티아민 히드로클로라이드, 티아민 모노포스페이트를 152 mg/ml 및 185 mg/ml 의 훨씬 더 높은 단백질 농도에서 평가하였다. 75 mM 티아민 피로포스페이트 및 150 티아민 히드로클로라이드, 티아민 모노포스페이트는 인플릭시맙 용액에 대해 강한 점도 감소 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
150 mM 발린, 류신, 아스코르브산, 또는 프롤린 첨가 시, 열 유도 단백질 언폴딩을 특징으로 하는 열역학적 전이 온도 (Tm) 의 증가가 관찰되었다. 마찬가지로, 5 mM 시아노코발라민의 첨가는 Tm 의 증가를 초래하였다. 또한, 150 mM 발린, 류신, 아스코르브산 및 프롤린의 첨가는 응집 개시 온도 Tagg 의 증가를 유도하였다.
부형제 조합을 사용하여, 열역학적 언폴딩 온도는 마찬가지로 증가될 수 있다. 본 발명자들은 오르니틴/피리독신, 오르니틴/티아민 모노포스페이트, 오르니틴/티아민 피로포스페이트, 아르기닌/피리독신, 아르기닌/티아민 모노포스페이트, 아르기닌/티아민 피로포스페이트, 카르니틴/피리독신, 카르니틴/티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌/티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌/티아민 피로포스페이트를 사용하는 경우, 각각의 75 mM 양이온/음이온을 포함하는 조합에 대한 Tm 의 증가를 관찰하였다.
흡수 분광법을 사용하여 측정시 192 mg/ml 의 단백질 농도에서, 150 mM 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 리신, 및 구아니딘 히드로클로라이드의 첨가 시 에볼로쿠맙 제형에 대한 감소된 점도가 관찰되었다. 192 mg/ml 의 더 높은 단백질 농도를 사용한 경우, 150 mM 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 리신 및 구아니딘 히드로클로라이드를 부형제로서 사용한 감소된 점도가 관찰되었다. 류신, 리신 및 구아니딘 히드로클로라이드는 가장 현저한 점도 감소 효과를 보였다.
브래드포드 어세이를 사용하여 측정된 180 mg/ml 의 단백질 농도에서, 에볼로쿠맙 제형의 점도는 150 mM 피리독신 또는 티아민 히드로클로라이드의 첨가시 감소되었다. 마찬가지로, 5 mM 시아노코발라민, 25 mM 퀴닌 히드로클로라이드 또는 75 mM 파라세타몰의 첨가는 제형의 점도를 감소시켰다.
150 mM 피리독신, 티아민 히드로클로라이드 또는 아스코르브산을 196 mg/ml 첨가하는 더 높은 단백질 농도에서 제형의 점도를 감소시켰다. 또한, 5 mM 시아노코발라민, 25 mM 퀴닌 히드로클로라이드 또는 75 mM 파라세타몰의 첨가는 제형의 점도를 감소시켰다. 이 데이터 세트에서 티아민 히드로클로라이드가 가장 효율적인 점도 감소 부형제인 것으로 밝혀졌다.
세번째 데이터 세트에서 75 mM 티아민 피로포스페이트 및 150 mM 티아민 히드로클로라이드, 티아민 모노포스페이트의 점도 감소 용량을 비교하였다. 두 부형제 모두는 에볼로쿠맙 제형의 점도를 감소시켰다. 75 mM 티아민 피로포스페이트는 179 mg/ml 및 204 mg/ml 에볼로쿠맙을 갖는 제형에 사용될 때 매우 효율적이다. 150 mM 티아민 모노포스페이트를 180 mg/ml 의 에볼로쿠맙 농도에서만 시험하였다.
두 가지 점도 감소 부형제의 조합이 단백질 용액의 점도를 상승적으로 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 150 mg/ml, pH 7.2 에서의 인플릭시맙 제형의 백분위 점도는 오르니틴과 엽산의 조합 및 카르니틴과 엽산의 조합의 첨가시 상승적으로 감소되었다.
190 mg/ml, pH 5.0 에서 에볼로쿠맙 제형의 백분위 점도는 페닐알라닌과 캄포르술폰산의 조합, 페닐알라닌과 벤젠술폰산의 조합, 아르기닌과 피리독신의 조합, 메글루민과 피리독신의 조합 및 메글루민과 티아민 모노포스페이트의 조합의 첨가시 상승적으로 감소되었다.
또한, 상기 언급된 부형제 및 부형제 조합이 생물공정에서 유익하다는 것이 발견되었다. 본 발명에 따른 실험은 부형제 및 부형제 조합이 크로마토그래피 컬럼에 대한 배압을 감소시키고 더 큰 유량을 허용하기에 적합한 것을 제안하였다. 이는 용액 중의 단백질을 변형시키는 전단력을 감소시켜, 따라서 응집이 감소될 것이다. 전체적으로 더 높은 수율을 수득할 수 있다. 이 외에도, 공정이 더 높은 유량을 사용하여 실행될 수 있는 경우, 공정 시간은 상당히 감소될 것이다.
여기서 의미되는 바와 같은 생물공정에서, 점도-감소 첨가제로서 역할하는 것으로 발견되는 이들 부형제의 첨가는, 한편으로는 미손상 단백질의 수율이 개선될 수 있고 다른 한편으로는 공정의 지속시간이 감소될 수 있다는 점에서, 개선된 공정 경제성을 초래한다.
본 발명에서 실시된 실험의 기초는 Amicon® 원심분리 여과 연구에 의해 준비된다. 이들 실험은 용액이 원심력에 의해 필터 멤브레인을 통과하는 임의의 공정 단계와 유사하다. 원심력에 대한 저항은 이 실험의 맥락 내에서 일정한 것으로 가정되는 필터의 특성, 및 용액의 점도에 따라 좌우된다. 가장 유리한 용액을 제공하는 부형제 및 부형제 조합은 교반 셀을 사용하는 보다 복잡한 실험을 위해 선택된다.
Amicon® 교반 셀을 사용하는 실험에서 질소 기체는 필터를 통과하는 용액에 압력을 가하는데 사용된다. 압력의 저항은 이 실험의 맥락 내에서 일정한 것으로 가정되는 필터의 특성, 및 용액의 점도에 따라 좌우된다. 가장 유리한 결과를 제공하는 부형제 조합은 실험실 규모 접선 유동 여과 (TFF) 시스템을 사용하는 실험에서 사용된다.
이들 실험은 전량 여과 접근방식 동안 점도 감소제의 유익한 효과를 강조한다. 또한, 기술적 접근방식에서, 용액이 예를 들어 크로마토그래피 정제 동안, 백-엔드 압력에 의해 가해진 힘에 의해 필터 또는 매질, 예컨대 겔 베드를 통과하는 경우, 개시된 점도 감소 부형제가 유익한 효과를 갖는다는 것이 명백해진다. 상기 여과 단계가 다운스트림 공정에서 주로 사용되지만, 점도 감소 부형제는 또한 업스트림 공정에서 유익할 수 있다. 세포 물질 및 잔해를 제거하기 위해 용액이 튜빙 또는 필터를 통과할 때 압력 제한 및 전단력의 기재된 부정적 효과와 함께, 단백질 농도가 점도를 일으키는 수준으로 상승되는 경우, 본 발명은 명백하게 유익한 효과를 가질 것이다. 접선 유동 여과에서 공정 효율을 측정하기 위해, 이전에 사용된 방법과 대조적으로 대부분의 필드 유동이 필터를 통과하기보다는 필터의 표면을 가로질러 접선으로 이동하는 경우, 실험실 규모 TFF 시스템을 사용하였다. 여과 원리는 상기 기재된 방법에서와 상이하지만, 여기서 여과 효율은 또한 일정하게 유지되는 멤브레인의 저항, 및 본 발명에 의해 변형되는 용액 점도에 따라 좌우된다. 여과 방법은 제형 완충제를 교환하거나 생체분자의 농도를 원하는 수준으로 만들기 위해 사용되는 전형적인 단위 작업이다. 본원에서 사용되는 교반 셀은 전량 필터의 표현이며, 공급물은 물질의 상부에 더 큰 분자를 보유하는 여과 물질을 통과하여 장치의 다른 말단 상에서 여과물을 방출한다.
완충제를 교환하고 단백질을 농축하기 위한 빈번한 방법은 접선 유동 여과이며, 여기서는 이전에 사용된 방법과 대조적으로 대부분의 필드 유동이 필터를 통과하기보다는 필터의 표면을 가로질러 접선으로 이동한다. 교반 셀이 접선 유동 여과에서 사용되는 경우와 같이, 큰 분자는 작은 분자를 적합한 여과 물질을 통과시킴으로써 상기 작은 분자로부터 분리된다. 전량 여과의 한 형태를 나타내는 교반 셀과 대조적으로, 접선 유동 여과에서 공급물의 유동 기하학 구조는 필터 케이크의 형성을 방지하고 연속 공정을 허용하기 위해 상이하다. 교반 셀이 사용되는 경우 필터 케이크의 형성은 마찬가지로 교반 장치를 사용하여 방지된다. 따라서, 교반 셀은 필터 기하학 구조의 차이에도 불구하고 접선 유동 여과 장치와 매우 유사하다. 두 방법의 효율은 멤브레인 저항에 따라 결정적으로 좌우된다. 또한, 높은 점도는 사용할 수 있는 플럭스 속도를 감소시키는 것으로 알려져 있으며 따라서 공정 시간을 증가시켜 더 높은 제조 비용을 야기한다. 따라서, 감소된 점도는 보다 효율적인 여과 공정을 가능하게 하는 한편 전단력은 낮은 수준으로 유지되어 여과물에서의 더 높은 단백질 농도를 산출하는 것으로 예상된다. 이것은 하기를 언급한 Hung et al. 의 연구에 의해 강조된다: "During production of concentrated monoclonal antibody formulations by tangential flow ultrafiltration (TFF), high viscosities and aggregation often cause extensive membrane fouling, flux decay and low product yields" (Journal of Membrane Science Volume 508, 15 June 2016, Pages 113-126)
실험은 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰 또는 이들의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 점도 감소 부형제가 전술한 바와 같이 생물공정 경제성을 개선시키는데 적합하다는 것을 보여주었다. 게다가, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 점도 감소 부형제와, 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제와의 조합은 생물공정 경제학을 개선시킨다. 특히 단백질 용액에 따라 다양한 비율로의 조합은 상기 기재된 바와 같이 생물공정 경제성을 개선시킨다.
따라서, 본 발명의 또다른 양상은 단백질 용액을 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 점도 감소 부형제와 배합하는 단계를 포함하는, 적어도 90 mg/ml 내지 300 mg/ml 까지의 범위의 농도로 단백질을 포함하는, 생물공정에서의 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하기 위한 것이다. 또다른 양상에서, 단백질 용액은 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라아세트몰로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 점도 감소 부형제 및 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제와 조합된다.
본 발명의 또다른 양상은 생물공정에서 상기 기재된 바와 같은 단백질 용액의 점도를 감소시키는 방법의 용도이다.
본 발명에 따르면, 상기 언급된 모든 매개변수; 예를 들어, 부형제의 조합, 부형제의 농도, 단백질의 농도, 부형제의 비율, 조성물의 추가의 요소 예컨대 완충제 또는 안정화제, pH 값, 점도 감소, 단백질의 사양, 단백질의 분자량이 또한 생물공정에서 사용된다.
바람직하게는, 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제는 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제는 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 조합은 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제를 포함하여 사용된다.
바람직하게는, 제 1 점도 감소 부형제는 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트 또는 피리독신, 더욱 바람직하게는 티아민 및 티아민 피로포스페이트이다. 바람직하게는, 75 - 500 mM, 더욱 바람직하게는 75 - 150 mM, 가장 바람직하게는 75 mM 또는 150 mM 의 농도가 사용된다.
바람직하게는 제 2 점도 감소 부형제는 아르기닌 또는 오르니틴이다. 바람직한 조합은 티아민 및 아르기닌 뿐만 아니라 티아민 및 오르니틴이다. 바람직하게는 각각의 부형제의 농도는 75 - 500 mM, 더욱 바람직하게는 75 - 150 mM, 가장 바람직하게는 75 mM 또는 150 mM 이다.
제 1 점도 감소 부형제가 제 2 점도 감소 부형제와 조합하여 사용되는 경우, 상기 비는 1:3 내지 3:1, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 2:1, 가장 바람직하게는 1:1 의 범위이다.
단백질 용액 및 실행한 생물공정에 따라, 상이한 완충제 시스템이 완충제로서 사용될 수 있다. 생물공정 동안 조건에 따라 아세테이트 예컨대 암모늄 아세테이트 또는 나트륨 아세테이트, 카르보네이트 예컨대 암모늄 바이카르보네이트 또는 나트륨 바이카르보네이트, 또는 포스페이트 예컨대 나트륨 포스페이트 또는 트리스-포스페이트를 여기서 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계에서 단백질 용액의 투과 플럭스가 캄포르술폰산을 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 생물공정에서의 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계에서 단백질 용액의 투과 플럭스가 캄포르술폰산을 포함하지 않는 단백질 용액과 비교하여 증가되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 상기 언급된 생물공정에서의 방법의 용도이다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계 중의 단백질 용액의 투과 플럭스가 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 상기 언급된 생물공정에서의 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계 중의 단백질 용액의 투과 플럭스가 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 상기 언급된 생물공정에서의 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하는 것이다.
투과 플럭스의 증가는 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 가장 바람직하게는 10% 내지 100% 의 백분율 증가를 의미한다.
본 발명의 또다른 양상은, 필터에서의 완충제 교환 및 부피 감소 후 단백질 회수가 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되거나, 또는 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 상기 언급된 생물공정에서의 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 양상은, 필터에서의 완충제 교환 및 부피 감소 후 단백질 회수가 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되거나, 또는 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 상기 언급된 생물공정에서의 방법의 용도이다.
본 발명의 또다른 양상은, 필터에서의 완충제 교환 및 부피 감소 후 단백질 회수가 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 상기 언급된 생물공정에서의 방법의 용도이다.
본 발명의 또다른 양상은, 필터에서의 완충제 교환 및 부피 감소 후 단백질 회수가 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는, 상기 언급된 생물공정에서의 방법의 용도이다.
필터에서 완충제 교환 및 부피 감소 후 단백질 회수의 증가는 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 2%, 보다 바람직하게는 적어도 5%, 가장 바람직하게는 5% 내지 20% 의 단백질 회수의 백분율 증가를 의미한다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계, 바람직하게는 단백질이 농축되는 여과 단계에 대한 공정 시간이 캄포르술폰산을 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되는, 생물공정에서의 단백질 용액의 점도 감소 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계, 바람직하게는 단백질이 농축되는 여과 단계에 대한 공정 시간이 캄포르술폰산을 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되거나, 시아노코발라민, 피리독신, 아스코르브산, 엽산, 티아민, 티아민 모노포스페이트, 티아민 피로포스페이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 퀴닌 히드로클로라이드 및 파라세타몰로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제와 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되는, 상기 언급된 바와 같은 생물공정에서의 방법의 용도이다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계, 바람직하게는 단백질이 농축되는 여과 단계에 대한 공정 시간이 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되는, 상기 언급된 생물공정에서의 방법의 용도이다.
본 발명의 또다른 양상은, 여과 단계, 바람직하게는 단백질이 농축되는 여과 단계에 대한 공정 시간이 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 감소되는, 상기 언급된 생물공정에서의 방법의 용도이다.
여과 단계를 위한 공정 시간의 감소는 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 가장 바람직하게는 25% 내지 100% 의 백분율 감소를 의미한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 여과 단계는 접선 유동 여과 (TFF) 이다.
용어 "생물공정" 은 치료적 세포 제조 공정을 지칭하며, 이는 업스트림 공정 및 다운스트림 공정으로 분리될 수 있다. 업스트림 공정은 세포 화합물로부터 단백질을 분리하기 전의 전체 공정으로서 정의된다. 업스트림 공정은 세포 보관 (cell banking) 까지의 초기 세포 단리 및 배양, 및 최종 수확까지 세포의 배양 확장을 포함한다. 생물공정의 다운스트림 부분은 업스트림의 공급물로부터 표적 단백질이 정제되고 순도 및 품질 요건을 충족하도록 가공되는 부분을 의미한다. 다운스트림 공정에 들어갈 때 일부 유형의 세포는 파괴되어야 할 필요가 있다. 또 다른 세포는 표적 단백질을 배지 내로 분비할 수 있고 여과를 통해 제거될필요가 있다. 추가의 다운스트림 처리는 통상 주요 섹션: 정제 섹션 및 연마 섹션으로 나뉜다. 생물공정은 뱃치 공정 또는 반연속 또는 연속 공정일 수 있다.
용어 "투과 플럭스" 는 전형적으로 몇 분 정도의 특정 시간 내에 규정된 필터를 통과하는 부피를 지칭한다.
용어 "여과 단계" 는 액체가 그의 크기를 기반으로 하여 물질의 분리를 가능하게 하는 규정된 기공 크기를 갖는 물질을 통과하는 공정 단계를 지칭한다. 일부 필터의 경우 기공 크기는 나노미터로 정의된다. 또 다른 필터의 경우, 기공 크기는 직접 정의되지 않지만, 보류될 분자의 중량이 주어진다. 여과 물질은 여과 장치의 단면을 차단하는 방식으로 배치될 수 있다 (전량 (dead-end) 여과). 여과 물질은 여과될 용액이 상기 물질의 표면을 가로질러 접선으로 흐르는 방식, 예를 들어 접선 유동 여과로 배치될 수 있다. 여과 물질은 멤브레인, 유리 필터, 금속 필터 또는 수지일 수 있다. 수지는 크로마토그래피 컬럼에서 유지될 수 있다. 수지는 양이온성 또는 음이온성 교환 수지, 친화성 수지, 예컨대 단백질 A 또는 글루타티온 수지, 또는 소수성 또는 친수성 수지일 수 있다.
완충제 교환 및 부피 감소 후의 용어 "단백질 회수" 는 공정 단계 후에 회수될 단백질의 분획물을 지칭한다.
용어 "접선 유동 여과" 또는 "TFF" 는 용액이 규정된 필터를 접선으로 통과하는 여과 방법을 지칭한다. 필터 기공보다 더 작은 물질은 용액 유량, 점도, 온도 및 기타 인자로 인해 발생하는 압력에 의해 필터를 통해 용액 밖으로 배출된다.
실시예
1. 점도 측정
1.1 pH 7.2 의 포스페이트 완충제에서 제형화된 인플릭시맙에 대한 발린, 류신, 페닐알라닌, 프롤린, 아스코르브산, 피리독신, 시아노코발라민, 티아민 히드로클로라이드, 엽산, 티아민 피로포스페이트 및 티아민 모노포스페이트의 점도 감소 효과
완충제 제조
나트륨 디히드로겐포스페이트 및 디-나트륨 히드로겐포스페이트를 적절히 혼합하여 pH 7.2 로 만들고 상기 혼합물을 초순수에 용해하여, 5 mM 포스페이트 완충제를 제조하였다. 헨더슨-하셀바흐 식을 사용하여 상기 비를 결정하였다. 필요한 경우 HCl 및 NaOH 를 사용하여 pH 를 조정하였다.
50 mg/ml 수크로오스 및 0.05 mg/ml 폴리소르베이트 80 을 안정화제로서 첨가하였다.
샘플 제조
150 mM 발린, 류신, 페닐알라닌, 아스코르브산, 피리독신, 프롤린 및 티아민 모노포스페이트의 개별 부형제 용액을 포스페이트 완충제 pH 7.2 에서 제조하였다. 동일한 완충제에서, 시아노코발라민의 5 mM 용액을 제조하였다. 엽산을 포스페이트 완충제 pH 7.2 중에서 13 mM 농도로 제조하였다. 티아민 피로포스페이트를 포스페이트 완충제 pH 7.2 중에서 75 mM 농도로 제조하였다. pH 는 필요한 경우 HCl 또는 NaOH 를 사용하여 조정하였다.
원하는 부형제를 함유하는 농축된 인플릭시맙 용액을 원심분리 필터 (Amicon, 30 kDa MWCO) 를 사용하여 제조하여, 관련 부형제를 함유하는 완충제로 본래 완충제를 교환하고, 용액의 부피를 감소시켰다. 이후, 단백질을 각각 122 mg/ml 및 143 mg/ml 로 희석하였다.
단백질 농도 측정
람베르트-비어의 법칙 (Lambert-Beer's-Law) 을 적용하는 흡수 분광법을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 부형제 자체가 280 nm 에서 강한 흡광도를 갖는 경우, 브래드포드 (Bradford) 어세이를 사용하였다.
농축된 단백질 용액을 희석하여, 그의 예상된 농도가 측정에서 0.3 내지 1.0 mg/mL 가 되도록 하였다.
흡수 분광법을 위해, 280 nm 에서의 흡광도를 단백질 흡광 계수 A0.1%, 280 nm = 1.428 로 BioSpectrometer® kinetic (Eppendorf, Hamburg, Germany) 을 사용하여 측정하였다.
일부 부형제는 그 자체가 280 nm 에서 강한 흡수를 가지며, 이는 농도 결정을 위해 브래드포드 어세이를 사용하는 것을 필수적으로 만든다.
브래드포드 어세이를 위해, Thermo ScientificTM (Thermo Fisher, Waltham, USA) 로부터의 소 감마 글로불린 표준품 뿐만 아니라 키트를 사용하였다. MultiskanTM Wellplatereader (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 를 사용하여 595 nm 에서 흡수를 측정하였다. 125 내지 1500 ㎍/mL 의 표준 곡선의 선형 회귀에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
점도 측정
mVROCTM Technology (Rheo Sense, San Ramon, California USA) 를 점도 측정에 사용하였다.
500 ㎕ 주사기를 사용하여 20℃ 및 전단 속도 3000 s-1 에서 측정을 수행하였다. 200 ㎕ 의 부피를 사용하였다. 모든 샘플을 삼반복으로 측정하였다.
이러한 실험에 대한 점도 측정 결과는 도 1, 도 2 및 도 3 에서 볼 수 있다.
1.2 아세테이트 완충제 pH 5.0 에서 제형화된 에볼로쿠맙에 대한 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 리신, 구아닌 히드로클로라이드, 아스코르브산, 피리독신, 시아노코발라민, 퀴민 히드로클로라이드, 티아민 히드로클로라이드, 파라세타몰, 티아민 피로포스페이트 및 티아민 모노포스페이트의 점도 감소 효과
완충제 제조
1,2 mg/ml 빙초산과 초순수를 혼합하여 20 mM 아세테이트 완충제를 제조하였다. 필요시 HCl 및 NaOH 를 사용하여 pH 를 5.0 으로 조정하였다. 0.1 mg/ml 폴리소르베이트 80 을 안정화제로서 첨가하였다.
샘플 제조
150 mM 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 아스코르브산, 피리독신, 프롤린, 리신, 구아니딘 히드로클로라이드, 티아민 히드로클로라이드, 티아민 모노포스페이트의 부형제 용액을 각각, 아세테이트 완충제 pH 5.0 에서 제조하였다. 유사하게, 25 mM 퀴닌 히드로클로라이드 및 5 mM 시아노코발라민을 각각 제조하였다. 파라세타몰 및 티아민 피로포스페이트를 75 mM 의 농도로 제조하였다. pH 는 필요한 경우 HCl 또는 NaOH 를 사용하여 조정하였다.
원하는 부형제를 함유하는 농축된 에볼로쿠맙 용액을 원심분리 필터 (Amicon, 30 kDa MWCO) 를 사용하여 제조하여, 관련 부형제를 함유하는 완충제로 본래 완충제를 교환하고, 용액의 부피를 감소시켰다. 이어서, 상기 단백질을 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 리신 및 구아니딘 히드로클로라이드에 관한 실험을 위해 각각 172 mg/ml 및 192 mg/ml 로 희석시키고, 아스코르브산, 피리독신, 시아노코발라민, 퀴닌 히드로클로라이드, 티아민 히드로클로라이드 및 파라세타몰에 관한 실험을 위해 각각 180 및 196 mg/ml 로 희석시키고, 티아민 피로포스페이트 및 티아민 모노포스페이트에 관한 실험을 위해 179 및 204 mg/ml 로 희석시켰다.
단백질 농도 측정
람베르트-비어의 법칙 (Lambert-Beer's-Law) 을 적용하는 흡수 분광법을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 부형제 자체가 280 nm 에서 강한 흡광도를 갖는 경우, 브래드포드 (Bradford) 어세이를 사용하였다.
농축된 단백질 용액을 희석하여, 그의 예상된 농도가 측정에서 0.3 내지 1.0 mg/mL 가 되도록 하였다.
흡수 분광법을 위해, 280 nm 에서의 흡광도를 단백질 흡광 계수 A0.1%, 280 nm = 1.428 로 BioSpectrometer® kinetic (Eppendorf, Hamburg, Germany) 을 사용하여 280 nm 에서 측정하였다.
브래드포드 어세이를 위해, Thermo ScientificTM (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 로부터의 소 감마 글로불린 표준품 뿐만 아니라 키트를 사용하였다. MultiskanTM Wellplatereader (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 를 사용하여 595 nm 에서 흡수를 측정하였다. 125 내지 1500 ㎍/mL 의 표준 곡선의 선형 회귀에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
점도 측정
mVROCTM Technology (Rheo Sense, San Ramon, California USA) 를 점도 측정에 사용하였다.
500 ㎕ 주사기를 사용하여 20℃ 에서 160-179 mg/ml 에서의 단백질 용액의 경우 전단 속도 3000 s-1 에서, 그리고 180-210 mg/ml 에서의 단백질 용액의 경우 전단 속도 2000 s-1 에서 측정을 수행하였다. 200 ㎕ 의 부피를 사용하였다. 모든 샘플을 삼반복으로 측정하였다.
이러한 실험에 대한 점도 측정 결과는 도 4, 도 5 및 도 6 에서 볼 수 있다.
1.3 포스페이트 완충제, pH 7.2 에서 제형화된 인플릭시맙에 대한 티아민 히드로클로라이드, 피리독신, 엽산, 페닐알라닌, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트의 조합의 점도 감소 효과.
완충제 제조
나트륨 디히드로겐포스페이트 및 디-나트륨 히드로겐포스페이트를 적절히 혼합하여 pH 7.2 로 만들고 상기 혼합물을 초순수에 용해하여, 5 mM 포스페이트 완충제를 제조하였다. 헨더슨-하셀바흐 식을 사용하여 상기 비를 결정하였다. 필요시 HCl 및 NaOH 를 사용하여 pH 를 조정하였다.
50 mg/ml 수크로오스 및 0.05 mg/ml 폴리소르베이트 80 을 안정화제로서 첨가하였다.
샘플 제조
포스페이트 완충제, pH 7.2 에 용해된 75 mM 티아민 히드로클로라이드 또는 75 mM 페닐알라닌의 부형제 용액에 75 mM 피리독신, 12 mM 엽산, 75 mM 티아민 모노포스페이트 또는 티아민 피로포스페이트를 보충하였다.
원하는 부형제를 함유하는 농축된 인플릭시맙 용액을 원심분리 필터 (Amicon, 30 kDa MWCO) 를 사용하여 제조하여, 관련 부형제를 함유하는 완충제로 본래 완충제를 교환하고, 용액의 부피를 감소시켰다. 이후, 단백질을 각각 122 mg/ml 및 154 mg/ml 로 희석하였다.
단백질 농도 측정
브래드포드 어세이를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
따라서, Thermo ScientificTM (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 로부터의 키트 뿐만 아니라 램버트-비어 법칙을 적용하는 흡수 분광법을 사용하여 제조된 인플릭시맙-표준을 사용하였다. MultiskanTM Wellplatereader (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 를 사용하여 595 nm 에서 흡수를 측정하였다. 125 내지 1500 ㎍/mL 의 표준 곡선의 적절한 다항 회귀에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
점도 측정
점도 측정은 1.1 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
이러한 실험에 대한 점도 측정 결과는 도 7 에서 볼 수 있다.
1.4 포스페이트 완충제, pH 7.2 에서 제형화된 인플릭시맙에 대한 L-오르니틴, L-아르기닌, L-카르니틴, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 제 1 세트 및 티아민 히드로클로라이드, 페닐알라닌, 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트로 이루어진 제 2 세트의 조합의 점도 감소 효과.
완충제 제조
완충제 제조는 1.3 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
샘플 제조
포스페이트 완충제, pH 7.2 에 용해된 75 mM L-오르니틴 모노히드로클로라이드, L-아르기닌, L-카르니틴 히드로클로라이드 또는 페닐알라닌의 부형제 용액에 75 mM 피리독신, 12 mM 엽산, 75 mM 티아민 모노포스페이트 또는 75 mM 티아민 피로포스페이트를 보충하였다. 75 mM 티아민 히드로클로라이드 또는 페닐알라닌을 75 mM 캄포르술폰산 또는 벤젠술폰산으로 보충하였다.
원하는 부형제를 함유하는 농축된 인플릭시맙 용액을 1.3 에 기재된 바와 같이 제조하였다.
단백질 농도 측정
단백질 농도 측정은 1.3 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
점도 측정
점도 측정은 1.1 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
이러한 실험에 대한 점도 측정 결과는 도 8 에서 볼 수 있다.
1.5 아세테이트 완충제, pH 5.0 에서 제형화된 에볼로쿠맙에 대한 나트륨 클로라이드, 아르기닌 및, L-오르니틴, L-아르기닌, L-카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 제 1 세트 및 티아민 히드로클로라이드, 피리독신, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트로 이루어진 제 2 세트의 조합의 점도 감소 효과.
완충제 제조
1,2 mg/ml 빙초산과 초순수를 혼합하여 20 mM 아세테이트 완충제를 제조하였다. 필요시 HCl 및 NaOH 를 사용하여 pH 를 5.0 으로 조정하였다.
0.1 mg/ml 폴리소르베이트 80 을 안정화제로서 첨가하였다.
샘플 제조
아세테이트 완충제, pH 5.0 에 용해된 75 mM L-오르니틴 모노히드로클로라이드, L-아르기닌, L-카르니틴 히드로클로라이드 또는 메글루민의 부형제 용액에 75 mM 피리독신, 75 mM 티아민 모노포스페이트 또는 75 mM 티아민 피로포스페이트를 보충하였다. 75 mM 티아민 히드로클로라이드를 75 mM 피리독신, 캄포르술폰산 또는 벤젠술폰산으로 보충하였다.
원하는 부형제를 함유하는 농축된 에볼로쿠맙 용액을 원심분리 필터 (Amicon, 30 kDa MWCO) 를 사용하여 제조하여, 관련 부형제를 함유하는 완충제로 본래 완충제를 교환하고, 용액의 부피를 감소시켰다. 이후, 단백질을 각각 163 mg/ml 및 180 mg/ml 로 희석하였다.
단백질 농도 측정
브래드포드 어세이를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
따라서, Thermo ScientificTM (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 로부터의 키트 뿐만 아니라 램버트-비어 법칙을 적용하는 흡수 분광법을 사용하여 제조된 에볼로쿠맙-표준을 사용하였다. MultiskanTM Wellplatereader (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 를 사용하여 595 nm 에서 흡수를 측정하였다. 125 내지 1500 ㎍/mL 의 표준 곡선의 적절한 다항 회귀에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
점도 측정
점도 측정은 1.2 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
이러한 실험에 대한 점도 측정 결과는 도 9 에서 볼 수 있다.
1.6 아르기닌 / 피리독신, 오르니틴 / 엽산, 카르니틴 / 엽산, 메글루민 / 피리독신, 메글루민 / 티아민 모노포스페이트, 피리독신 / 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 / 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 / 벤젠술폰산의 조합에 대한 점도 감소의 시너지 효과
75 mM L-오르니틴 모노히드로클로라이드, L-카르니틴 히드로클로라이드, 피리독신 또는 티아민 모노포스페이트를 함유하는 150 mg/ml 의 인플릭시맙의 샘플을 1.1 에 기재된 바와 같이 제조하고 분석하였다.
75 mM 메글루민, 캄포르술폰산, 벤젠술폰산, 피리독신 또는 티아민 모노포스페이트를 함유하는 190 mg/ml 의 에볼로쿠맙의 샘플을 1.2 에 기재된 바와 같이 제조하고 분석하였다.
이들 데이터 및 1.1 내지 1.5 에서 수득된 데이터에 대해, 조사된 점도 감소 부형제를 함유하지 않는 각각의 대조군 샘플 (대조군의 점도) 과 비교한 백분위 감소를 계산하였다. 이러한 백분위 점도 감소를 사용하여, 이들이 조합된다면 예상된 점도 감소가 계산될 수 있다.
점도를 각각 50% 씩 감소시키는 2 개의 조합된 부형제가 0 mPas 의 점도를 초래할 것이기 때문에, 예상된 값은 절대값에 기초하여 계산될 수 없다. 과학적 관점에서, 이는 특히 부형제가 점도를 50% 넘게 감소시켜 음의 점도 값을 초래하는 경우에는 실현 가능하지 않다. 따라서, 양 부형제의 예상 점도 감소는 연속 계산에 기초하여 결정되었다:
예상된 점도 =
대조군의 점도 * (100% - 점도 감소 [%] 첫번째 부형제) * (100% - 점도 감소 [%] 두번째 부형제)
점도가 100 mPas 인 용액 중에서 (i) 각각 50% 및 (ii) 각각 75% 만큼 점도를 감소시키는 2 종의 부형제의 조합에 대한 예시 계산:
(i) 예상 점도 = 100 mPas*(100%-50%)*(100%-50%) = 25 mPas
(i) 예상 점도 = 100 mPas*(100%-75%)*(100%-75%) = 6,25 mPas
2 개의 부형제의 조합에 대해, 예상된 것과 비교하여 더 낮은 점도, 즉 더 높은 점도 감소가 관찰되는 경우, 조합은 상승작용성인 것으로 밝혀졌다.
도 21 은 오르니틴/엽산, 카르니틴/엽산 및 피리독신/티아민 모노포스페이트의 조합에 대한 상승적 점도 감소를 보여준다. 도 22 는 페닐알라닌/캄포르술폰산, 페닐알라닌/벤젠술폰산 및 아르기닌/피리독신 조합에 대한 상승적 점도 감소를 보여준다. 도 23 은 메글루민/피리독신 및 메글루민/티아민 모노포스페이트의 조합에 대한 상승적 점도 감소를 보여준다.
2. 열 안정성 측정
2.1 발린, 류신, 아스코르브산, 시아노코발라민 및 프롤린을 단일 부형제로서 함유하는 인산염 완충제 pH 7.2 에서 제제화된 인플릭시맙의 열 안정성
완충제 및 샘플을 실시예 1.1 에 기재된 바와 같이 제조했다.
열 안정성 측정
Prometheus system (NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany) 의 나노-DSF 기술을 사용하여 융점 및 응집 점을 결정하였다.
1℃/분의 기울기로 20 내지 95℃ 의 온도 범위에 걸쳐 역산란 강도뿐만 아니라 330 및 350 nm 에서 형광을 측정하였다.
이러한 실험에 대한 열 안정성 측정 결과는 도 10 에서 볼 수 있다.
2.2 L-오르니틴, L-아르기닌, L-카르니틴, 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 제 1 세트 및 피리독신, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트로 이루어진 제 2 세트의 조합을 함유하는 포스페이트 완충제 pH 7.2 에서 제형화된 인플릭시맙의 열안정성.
완충제 및 샘플을 1.4 및 1.5 에 기재된 바와 같이 제조했다.
열 안정성 측정은 2.1 에 기재된 바와 같이 수행하였다.
이러한 실험에 대한 열 안정성 측정 결과는 도 11 에서 볼 수 있다.
3. 저장 안정성 측정
3.1 저장 조건
부형제 조합의 사용은 약학 제형의 안정성을 관리하는 것을 돕는 데 유리하다. 상기 제형의 안정성을 평가하기 위해, 샘플은 온도 및 상대 습도의 관점에서 표준화된 조건으로 저장된다. 일반적으로 평가된 온도는 4℃, 20℃, 25℃ 및 40℃ 를 포함한다. 상대 수분은 전형적으로 40%, 60% 또는 75% 이다. 단백질 제형의 안정성은 상이한 기준을 사용하여 평가될 수 있다. 상기 기준을 측정하는 방법은 연구되는 특정 단백질에 대해 최적화 및 검증될 필요가 있으며, 이는 당업자에게 자명한 과제이다.
본 발명자들은 70 mg/ml 초과의 고농도로 단백질의 약학 제형을 제조하고, 이들을 60% 의 상대 습도로 25℃ 에서 저장한다. 다음 24 주 동안, 샘플은 저장으로부터 제거되고 다음 파라미터에 대해 분석되는 6 개의 시점에 있다: 단편화, 응집/단량체 함량, 함량, 입체형태적 안정성, 입자 함량, 및 pH.
3.2 단백질 분획화 측정
단편화는 해당 항체보다 더 작은 물질에 민감한 적절한 크기 배제 칼럼을 갖는 HPLC 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 분자의 크기를 기준으로 분자를 분리하고 단편의 용출 시간은 온전한 단백질의 용출 시간보다 높아야 한다. 단편 및 단백질은 전형적으로 214 nm 에서의 흡수에 의해 검출된다. 단편화를 검출하기 위한 또다른 방법은 변성 겔 전기영동이고, 전형적으로 나트륨 도데실 술페이트를 함유하는 폴리아실아미드 겔 (SDS-PAGE) 을 사용하여 수행된다. SDS 는 단백질 및 잠재적 전하를 차폐하는 그들의 단편을 가용화함으로써 겔 매트릭스 내에서 크기에 의한 분자의 분리를 허용한다.
3.3 단백질 응집 측정
응집 또는 단량체 함량은 표적 단백질의 분자량을 결정하는데 적합한 컬럼을 사용하여 HPLC-SEC 를 사용하여 측정될 수 있다. 214 nm 에서의 흡수가 사용되는 경우, 표적 단백질 피크의 수치 적분은 샘플의 단백질 함량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 인큐베이션 후 샘플의 단백질 함량을 참조 샘플에 의해 나누어 단량체 함량을 산출한다. 단편화를 결정하기 위한 HPLC 방법과 대조적으로, 본원에 사용된 컬럼은 표적 단백질보다 큰 분자 종을 검출하기에 적합하다.
3.4 단백질 함량 측정
단백질 함량은 이전 단락에 기재된 HPLC 방법에 의해 또는 대안적으로 람베르트-비어 방정식 (Lambert-Beer Equation) 을 적용하는 흡수 분광법을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 브래드포드 어세이가 사용될 수 있다.
형태 안정성을 위한 프로브를 위해, 형광 분광법을 사용하는 열 시프트 어세이가 사용될 수 있다. Tm 의 변화는 측정된 단백질의 구조의 변화를 보고하기 때문에, 단백질에서 열 변성 중간-지점 Tm 변화를 측정함으로써 변화를 발견할 수 있다.
3.5 입자 분석 방법
입자는 각각의 크기에 따라 광 차폐 방법, 예를 들어, 탁도 측정, 유동 영상화 기술, 및 동적 광 산란에 의해 가시화될 수 있다.
pH 는 pH-전극을 사용하여 모니터링할 수 있다.
일반적으로, 각각의 파라미터의 10% 미만의 편차가 수용될 수 있다. 그러나, 입자 분석 방법, 특히 단일 입자 계수에 초점을 맞춘 방법은 본질적으로 Possoinian 통계의 사용으로 인해 30% 까지의 비교적 높은 오차를 갖는다.
4. 원심분리 필터 유닛에 대한 이점
완충제 제조
시트르산 모노히드레이트를 사용하여 10 mM 시트레이트 완충제를 제조하고 이를 초순수에 용해하였다. 필요시 HCl 및 NaOH 를 사용하여 pH 를 5.5 로 조정하였다. 0.25 mg/mL 폴리소르베이트 80 을 안정화제로서 첨가하였다. 페닐알라닌 (Phe), 오르니틴 (OM), 아르기닌 (Arg) 티아민 HCl, 티아민 모노포스페이트, 및 티아민 피로포스페이트의 부형제 용액을 시트레이트 완충제 (pH 5.5) 중에서 150 mM 의 농도로 제조하였다. 이들 부형제 중 2 개를 함유하는 조합을 각각 75 mM 또는 각각 150 mM 의 농도로 제조하였다.
샘플 제조
대략 14.7 mg/ml 을 함유하는 세툭시맙 용액을 출발 물질로서 사용하였다. 최대 20% 샘플 손실을 가정하여 500 ㎕ 샘플 중 120 mg/ml 초과의 최종 농도가 달성되도록 이의 충분한 부피를 계산하였다.
단백질 농도 측정
램버트-비어 법칙 (Lambert-Beer's-Law) 을 적용하는 흡수 분광법을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 부형제 자체가 280 nm 에서 강한 흡광도를 갖는 경우, 브래드포드 (Bradford) 어세이를 사용하였다.
농축된 단백질 용액을 희석하여, 그의 예상된 농도가 측정에서 0.3 내지 1.0 mg/mL 가 되도록 하였다.
흡수 분광법을 위해, 280 nm 에서의 흡광도를 단백질 흡광 계수 A0.1%, 280 nm = 1.4 로 BioSpectrometer® kinetic (Eppendorf, Hamburg, Germany) 을 사용하여 280 nm 에서 측정하였다.
280 nm 에서 빛을 흡수하는 부형제의 경우 단백질 농도를 브래드포드 어세이를 사용하여 결정하였다. 따라서, Thermo ScientificTM (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 로부터의 키트 뿐만 아니라 램버트-비어 법칙을 적용하는 흡수 분광법을 사용하여 제조된 세툭시맙-표준을 사용하였다. MultiskanTM Wellplatereader (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) 를 사용하여 595 nm 에서 흡수를 측정하였다. 125 내지 1500 ㎍/mL 의 표준 곡선의 적절한 다항 회귀에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
부피 측정
적절한 크기의 메스 플라스크를 사용하여 투과물 부피를 측정하였다.
Amicon® 원심분리 필터 유닛의 경우, 투과물을 원심분리 후 메스 플라스크에 옮겼다. Amicon® 교반 셀 실험의 경우, 투과물을 이러한 것에 직접 수집하였다.
적절한 크기의 Multipette® E3X (Eppendorf, Hamburg, Germany) 및 Combitips advanced® 를 사용하여 농축된 단백질 용액의 부피를 측정하였다.
완충제 교환 및 부피 감소
30 kDa MWCO 를 갖는 Amicon® 원심분리 필터를 사용하여, 관련 부형제를 함유하는 완충제로 본래 완충제를 교환하고 용액의 부피를 감소시켰다. 5 정용 부피 (diavolume) 를 사용하여 관련 부형제를 함유하는 완충제로 본래 완충제를 교환하였다.
투과 플럭스를 측정하기 위해, Amicon® 원심분리 필터를 2000 xg 에서 15 분 동안 원심분리하고, 상기 기재된 바와 같이 부피를 측정하였다 (4 회 반복 및 평균 계산함).
최종 농도를 달성하기 위해, Amicon® 원심분리 필터를 작은 시간 단계에서 원심분리하고, 500 ㎕ 마크에 도달시 누적 기간을 표시하였다.
하기 도 12 내지 도 16 은 증가된 투과 플럭스에 의해 표시되는 공정 개선을 강조한다.
5. 교반 셀에 대한 이점
Amicon® 원심분리 필터를 사용한 처리에서 긍정적 효과를 갖는 부형제 및 조합을 Amicon® 교반 셀 여과에서 사용하였다. Amicon® 스핀 컬럼 농축기가 원심력에 의해 구동되는 한편, 교반 셀은 질소 또는 공기 흐름의 형태로 용액에 적용되는 배압에 의해 작동된다. 이러한 모델 시스템은 용액의 가공성을 시험하는데 종종 사용되며, 이전에 사용한 Amicon® 원심분리 필터와 비교하여 더 가까운 모델 시스템이다.
완충제를 실시예 4 에 따라 제조하였다.
샘플 제조
항체 스톡 용액의 부피를 계산하여, 20% 이하의 손실을 가정한 25 mg/ml의 세툭시맙을 포함하는 적어도 10 ㎖ 의 용액을 산출하였다.
단백질 농도 측정 및 부피 측정은 실시예 4 에 따라 수행하였다.
완충제 교환 및 부피 감소
교반 셀 설정의 경우 최대 50 mL 를 함유하는 모델에 NMWL 이 30 kDa 이고 활성 멤브레인 면적이 13.4 cm2 인 한외여과 디스크 필터를 장착하였다. 세툭시맙 저장 용액의 각각의 부피를 교반 셀에 충전하고 각각의 완충제를 50 mL 마크까지 첨가하였다. 5 정용 부피를 사용하여 관련 부형제 또는 조합을 함유하는 완충제로 본래 완충제를 교환하였다.
투과 플럭스를 측정하기 위해, 4 bar 의 압력을 200 rpm 의 혼합 속도 (자기 교반기 플레이트를 사용) 로 30 분 (4 회) 동안 Amicon® 교반된 셀 상에 적용하였다. 최종 농축 시간 동안, 셀을 각각의 완충제로 50 mL 마크로 다시 충전하고, 4 bar 압력을 200 rpm 교반기 속도로 적용하였다. 10 mL 마크에 도달하면 지속기간을 표시하고, 공정을 중단하고, 부피 뿐만 아니라 생성 항체 용액의 농도를 상기 기재된 바와 같이 측정하였다.
실시예 4 에 기재된 바와 같이, 제형의 평균 투과 플럭스에 대한 효과를 먼저 평가하였다. 결과가 도 17 내지 도 19 에 제시되어 있다.
6. TFF 를 사용한 가공의 이점
Amicon® Filters and Stirred Cell 을 사용한 이전 실험에 기초하여, 접선 유동 여과 시스템에서 여과 이점을 평가하기 위해 하나의 부형제 조합을 선택하였다. 이 시스템은 대규모 생물공정 단계에 가장 가까운 모델을 나타낸다. 본원에 사용된 부형제 조합은 2 개의 이전 단계에 의해 모방된 공정에 유리한 효과를 나타냈기 때문에, 공정 효율 및 이전에 회복에 대한 긍정적인 효과를 갖는 다른 부형제가 이 설정에서도 유사한 효과를 가질 것으로 추정된다.
완충제를 실시예 4 에 따라 제조하였다.
샘플 제조
항체 스톡 용액의 부피를 계산하여, 20% 이하의 손실을 가정한 80 mg/ml 의 세툭시맙을 포함하는 적어도 30 ㎖ 의 용액을 산출하였다.
단백질 농도 측정 및 부피 측정은 실시예 4 에 따라 수행하였다.
완충제 교환 및 부피 감소
Pellicon® XL 카세트, Biomax® 30 kDa 가 장착된
Figure pct00001
KTA 플럭스 S 교차 흐름 여과 시스템 (GE Healthcare, Marlborough, USA), 장치 크기: 50 cm² 및 500 ml 저장소를 사용하여 공정 이점을 평가하였다.
상기 명시된 양의 세툭시맙 용액을 저장소 내로 제공하고 450 ml 마크까지 충전하였다. 이송 펌프를 사용하여, 샘플이 시스템에서 순환되는 동안 4 개의 추가 정용적을 단계적으로 첨가하였다. 샘플 농축을 위해, 공급 유속을 30 ml/분으로, 교반기 속도를 60 rpm 으로 조정하였다. 공정은 20 g 의 최소 탱크 수준에 의해 또는 4 bar 의 공급 펌프 압력에 도달함으로써 중단되었다. 시스템의 인-라인 배출구를 이용하여 농축된 항체 용액을 회수하였다.
도 20 에서, 탱크 레벨 및 압력이 공정 시간에 대해 플롯된다. 75 mM 오르니틴 및 75 mM 티아민 HCl 을 사용하여 점도를 관리하는 제형과 부형제가 없는 제형을 비교한다. 점도 감소 부형제를 사용할 때, 가공 시간은 약 2 시간에서 약 1.4 시간으로 감소될 수 있다. 동시에, 점도 감소 부형제를 사용할 때, 시스템 압력은 상기 부형제가 없는 필적하는 제형에 대한 시스템 압력보다 낮게 유지된다. 더 높은 시스템 압력이 단백질에 의해 잘 허용되고 더 높은 유량이 사용될 수 있다면, 처리 시간의 추가 감소가 실현 가능하다는 것이 명백하다. 더욱이, 점도 감소 부형제를 사용하여 30% 더 높은 농도에 도달하였다.
도면 범례
도 1 은 pH 7.2 에서의 인플릭시맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 발린, 류신, 페닐알라닌 및 프롤린을 사용하여 람베르트-비어의 법칙을 사용하여 결정된다.
도 2 는 pH 7.2 에서 인플릭시맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 아스코르브산, 시아노코발라민, 티아민 히드로클로라이드, 엽산, 티아민 피로포스페이트 및 티아민 모노포스페이트를 사용하여 브래드포드 어세이를 사용하여 결정된다.
도 3 는 pH 7.2 에서 인플릭시맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트를 사용하여 브래드포드 어세이를 사용하여 결정된다.
도 4 는 pH 5.0 에서의 에볼로쿠맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 리신 및 구아니딘 히드로클로라이드를 사용하여 람베르트-비어의 법칙을 사용하여 결정된다.
도 5 는 pH 5.0 에서 에볼로쿠맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 아스코르브산, 피리독신, 시아노코발라민, 퀴닌 히드로클로라이드, 티아민 히드로클로라이드 및 파라세타몰을 사용하여 브래드포드 어세이를 사용하여 결정된다.
도 6 은 pH 5.0 에서 에볼로쿠맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 티아민 피로포스페이트, 티아민 히드로클로라이드 및 티아민 모노포스페이트를 사용하여 브래드포드 어세이를 사용하여 결정된다.
도 7 은 pH 7.2 에서 인플릭시맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 티아민 히드로클로라이드, 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트를 사용하여 브래드포드 어세이를 사용하여 결정된다.
도 8 은 pH 7.2 에서 인플릭시맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 L-오르니틴, L-아르기닌, L-카르니틴, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어지는 제 1 세트 및 티아민 히드로클로라이드, 페닐알라닌, 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트로 이루어지는 제 2 세트의 조합을 사용하여 브래드포드 어세이를 사용하여 결정된다.
도 9 는 pH 5.0 에서 에볼로쿠맙의 점도를 나타내며, 단백질 농도는 부형제로서 L-오르니틴, L-아르기닌, L-카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어지는 제 1 세트 및 티아민 히드로클로라이드, 피리독신, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트로 이루어지는 제 2 세트의 조합을 사용하여 브래드포드 어세이를 사용하여 결정된다.
도 10 은 pH 7.2 에서 인플릭시맙 용액의 대조군과 비교하여, 부형제로서 발린, 류신, 아스코르브산, 시아노코발라민 및 프롤린을 사용한 조성물의 Tm/Tagg 의 변화를 나타낸다.
도 11 은 pH 7.2 에서 인플릭시맙 용액의 대조군과 비교하여 L-오르니틴, L-아르기닌, L-카르니틴, 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 제 1 세트 및 피리독신, 티아민 모노포스페이트 및 티아민 피로포스페이트로 이루어진 제 2 세트의 조합을 사용한 조성물의 Tm/Tagg 의 변화를 나타낸다.
도 12 및 13 은 증가된 투과 플럭스에 의해 표시되는 점도 감소 부형제 및 이들의 조합의 공정 개선을 나타낸다.
도 14 및 15 는 점도 감소 부형제 및 이들의 조합에 의해 달성될 수 있는 공정 시간의 감소를 보여준다.
도 16 은 단백질 회수에 대한 점도 감소 부형제의 효과를 나타낸다.
도 17 은 Amicon® stirred Cell 여과에서 증가된 투과 플럭스에 의해 표시되는 점도 감소 부형제 및 이들의 조합의 공정 개선을 나타낸다.
도 18 은 Amicon® stirred Cell 여과에서 점도 감소 부형제 및 이들의 조합에 의해 달성될 수 있는 공정 시간의 감소를 보여준다.
도 19 는 Amicon® stirred Cell 여과에서 단백질 회수에 대한 점도 감소 부형제 및 이들의 조합의 효과를 나타낸다.
도 20 은 탱크 수준에 대한 점도 감소 부형제 및 이들의 조합의 효과를 나타내고, 압력은 접선 유동 여과 시스템에서 공정 시간에 대해 플롯팅된다.
도 21 은 오르니틴, 엽산 및 그의 조합, 카르니틴, 엽산 및 그의 조합, 및 피리독신, 티아민 모노포스페이트 및 그의 조합의 첨가시 150 mg/mL, pH 7.2 에서의 인플릭시맙 제형의 백분위 점도 감소를 보여준다. 예상된 감소는 1.6 에 기재된 바와 같이 계산되었다.
도 22 는 페닐알라닌, 캄포르술폰산 및 그의 조합, 페닐알라닌, 벤젠술폰산 및 그의 조합, 뿐 아니라, 아르기닌, 피리독신 및 그의 조합의 첨가시 190 mg/mL, pH 5.0 에서의 에볼로쿠맙 제형의 백분위 점도 감소를 보여준다. 예상된 감소는 1.6 에 기재된 바와 같이 계산되었다.
도 23 은 메글루민, 피리독신 및 그의 조합, 메글루민 뿐 아니라 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 그의 조합의 첨가시 190 mg/mL, pH 5.0 에서의 에볼로쿠맙 제형의 백분위 점도 감소를 보여준다. 예상된 감소는 1.6 에 기재된 바와 같이 계산되었다.
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Claims (15)

  1. 단백질, 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하는 액체 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택된 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합을 포함하는 액체 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 조성물과 비교하여 감소된 점도를 갖는 액체 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 농도가 90 mg/ml 내지 300 mg/ml 인 액체 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 농도가 각각 5 mM 내지 300 mM 인 액체 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물의 pH 가 4 내지 8 인 액체 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물이 5 mM 내지 50 mM 의 농도로의 포스페이트 완충제 또는 아세테이트 완충제, 및 안정화제를 추가로 포함하는 액체 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물의 점도가 미세유체 점도계를 사용하여 측정된 바와 같이 20℃ 에서 1 mPas 내지 60 mPas 인 액체 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 분자량이 120 kDa 내지 250 kDa 인 액체 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체인 액체 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 액체 조성물의 동결건조 단백질 제형.
  12. 단백질 용액에 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 점도 감소 부형제를 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질 용액의 점도 감소 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 제 1 및 제 2 점도 감소 부형제의 조합이 피리독신 및 아르기닌, 엽산 및 오르니틴, 엽산 및 카르니틴, 피리독신 및 메글루민, 티아민 모노포스페이트 및 메글루민, 피리독신 및 티아민 모노포스페이트, 페닐알라닌 및 캄포르술폰산 및 페닐알라닌 및 벤젠술폰산으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 단백질 용액의 점도 감소 방법.
  14. 생물공정에서의 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 방법의 용도.
  15. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 여과 단계 중의 단백질 용액의 투과물 플럭스가, 피리독신, 엽산, 티아민 모노포스페이트 및 페닐알라닌 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 1 점도 감소 부형제 및 아르기닌, 오르니틴, 카르니틴, 메글루민, 캄포르술폰산 및 벤젠술폰산 또는 이의 염 또는 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 점도 감소 부형제를 포함하지 않는 동일한 단백질 용액과 비교하여 증가되는 방법의 용도.
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