JP2023532699A - 改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）に関する。特に、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）－２－オキソブタン酸（ＰＰＯ）とアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加及び／又は動力学的特性の向上を示す。本発明は、本発明の改変型ＧｌｕＤＨをコードするポリヌクレオチド、本発明の改変型ＧｌｕＤＨを発現させるためのベクター及び宿主細胞、並びに本発明の改変型ＧｌｕＤＨ及び宿主細胞を用いてＬ－グルホシネートを生産するための方法にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、酵素工学の分野に関する。特に、本発明は、改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）及びグルホシネートの生産におけるその使用に関する。
グルホシネート（４－［ヒドロキシ（メチル）ホスホノ］－Ｄ，Ｌ－ホモアラニンとも呼ばれる）は、遺伝子組換え作物がそれに対して耐性である世界売上ランキング２位の除草剤である。グルホシネートは、Ｌ－グルタミンシンテターゼの活性を阻害することにより植物の窒素代謝に障害をもたらし、最終的には植物を枯死させる広域スペクトル接触枯死除草剤である。グルホシネートは、適用範囲が広く、効果が迅速であり、長期持続性であり、毒性が低く、安全であるなど、グリホサートよりも大きな利点を有する。したがって、グルホシネートの売上は急速に増加しており、来期には大きな需要が見込まれており、非常に有望である。
しかしながら、グルホシネートを生産するためのプロセスは複雑であり、生産の難易度が高くなる。価格が高いため、グリホサートに急速に取って代わることが妨げられている。現在、市販のグルホシネートは、等量の２つの光学異性体（Ｄ，Ｌ－グルホシネート）を含むラセミ混合物であり、Ｌ－グルホシネートのみが生物学的に活性である。したがって、Ｄ，Ｌ－グルホシネートの脱ラセミ化によるキラル純粋なＬ－グルホシネートの調製は、実用上重要であり、近年、Ｌ－グルホシネートの合成において一般的になりつつある。
近年、Ｄ，Ｌ－グルホシネートからＬ－グルホシネートを調製するための方法が数多く報告されている。化学修飾による伝統的な分離方法は、コストが高いため、及びＤ－グルホシネートを使用することができないという事実のため、競争力がない。現在、Ｄ－グルホシネート－アンモニウムをＬ－グルホシネートに変換するための、報告されている主要で代表的な技術的経路は以下の通りである。
Ｄ，Ｌ－グルホシネートをＮ－アセチルグルホシネートに変換し、次いでカルボキシペプチダーゼにより触媒されるＬ－Ｎ－アセチルグルホシネートの選択的加水分解によりＬ－グルホシネートが得られるが、Ｄ－Ｎ－アセチルグルホシネートは加水分解され得ず、化学的又は酵素的ラセミ化後に加水分解ステップに再利用することができる（例えば、中国特許出願公開第１０８６９０８５４号明細書を参照）。この方法の欠点としては、反応のステップが複数であること、及び加水分解から得られるＬ－グルホシネートをＮ－アセチル化基質から分離する必要があることが挙げられる。
Ｄ－グルホシネートを、２－カルボニル－４－（ヒドロキシメチルホスホノ）酪酸（ＰＰＯ）へと酸化し、次いでＰＰＯを還元又はアミノ基転移して、Ｌ－グルホシネート－アンモニウムを生成する。ほとんどの文献では、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒するために、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）が使用されている。ＰＰＯをパラジウム担持炭素の触媒作用下でギ酸により還元してＤ，Ｌ－グルホシネートを生成し、Ｄ，Ｌ－グルホシネートは、ＤＡＡＯの立体選択性のため徐々にＬ－グルホシネートへと変換される（例えば、中国特許出願公開第１０５５６７７８０号明細書を参照）。この解決策の欠点としては、大量のパラジウム－炭素触媒が必要であること、及び反応の原料（酸素及びギ酸アンモニウムなど）が無駄になることが挙げられる。
また、ＰＰＯを、Ｌ－アミノ酸トランスアミナーゼ（Ｌ－ＴＡ）により触媒される立体選択的アミノ基転移反応により、Ｌ－グルホシネートへと変換することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１８００３０４８７号明細書を参照）。この解決策には、アミノ基転移ステップが平衡反応であり、したがって高い変換率達成するためには過剰量のアミノ供与体（アミノ酸又は有機アミン）を供給する必要があり（例えば、３当量のアミノ供与体を供給する場合、変換率は９０％）、過剰量のアミノ供与体及び対応する副産物は、その後の分離及び精製ステップに深刻な影響を及ぼすことになるという欠点がある。
加えて、ＰＰＯを、ギ酸、グルコース、又は単純アルコールを消費するＮＡＤ（Ｐ）Ｈサイクルの支援下で無機アンモニウム塩をアミノ供与体として用いてＬ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ－ＡＡＤＨ）により触媒される立体選択的還元反応により、Ｌ－グルホシネートへと変換することができる。Ｌ－ＡＡＤＨにより触媒される反応は、非常に過剰な水素供与体を必要とせず、高い変換率を達成することができる。
ＰＰＯの不斉還元的アミノ化を触媒するための天然又は改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）を使用して、Ｌ－グルホシネートを調製することが報告されている（例えば、中国特許第１０７６３００５２号明細書、中国特許第１０６９７８４５３号明細書、中国特許第１０８５８８０４５号明細書、及び中国特許出願公開第１０９６０９４７４号明細書を参照）。
しかしながら、当技術分野では、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加及び／又は動力学的特性の向上（例えば、Ｖｍａｘ値の増加、Ｋｍ値の減少、又はＶｍａｘ／Ｋｍの増加）を示すＧｌｕＤＨを提供することが依然として必要とされている。
第１の態様では、本発明は、初期ＧｌｕＤＨと比較して２つ又はそれよりも多くの位置にアミノ酸の置換を含む改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼであって、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加及び／又は動力学的特性の向上（例えば、Ｖｍａｘの増加、Ｋｍの減少、又はＶｍａｘ／Ｋｍの増加）を示す改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼを提供する。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、初期ＧｌｕＤＨと比較して、
１０４位のアミノ酸がＣに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８１位のアミノ酸がＫ又はＲに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、２０３位のアミノ酸がＩに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１７３位のアミノ酸がＧに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；及び
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること
から選択されるアミノ酸の置換の組合せを含み、
位置は、配列番号１を参照して付番されている。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７３位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸はＧに置換されている。好ましくは、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。好ましくは、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、９位、２２位、２３位、２５位、３１位、５６位、１２４位、１４３位、１９９位、２１６位、２４２位、２６３位、３３９位、４２０位、４３１位、及び４３７位から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸の置換をさらに含む。好ましくは、９位のアミノ酸は、Ｓ、Ｌ、又はＹに置換されている。好ましくは、２２位のアミノ酸は、Ｗ又はＥに置換されている。好ましくは、２３位のアミノ酸は、Ｍに置換されている。好ましくは、２５位のアミノ酸は、Ｄに置換されている。好ましくは、３１位のアミノ酸は、Ｈに置換されている。好ましくは、５６位のアミノ酸は、Ｑに置換されている。好ましくは、１２４位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。好ましくは、１４３位のアミノ酸は、Ｅに置換されている。好ましくは、１９９位のアミノ酸は、Ｗ又はＹに置換されている。好ましくは、２１６位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。好ましくは、２６３位のアミノ酸はＳに置換されており、３３９位のアミノ酸はＱに置換されている。好ましくは、４２０位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、４３１位のアミノ酸は、Ｓに置換されている。好ましくは、４３７位のアミノ酸は、Ｋに置換されている。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、２２位、５６位、１７３位、１７５位、１８２位、１９９位、及び４２０位にアミノ酸の置換を含む。好ましくは、２２位のアミノ酸は、Ｅに置換されている。好ましくは、５６位のアミノ酸は、Ｑに置換されている。好ましくは、１７３位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。好ましくは、１７５位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。好ましくは、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、１９９位のアミノ酸は、Ｙに置換されている。好ましくは、４２０位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、３１位、１２４位、及び２１６位から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸の置換をさらに含む。好ましくは、３１位のアミノ酸は、Ｈに置換されている。好ましくは、１２４位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。好ましくは、２１６位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。
一部の実施形態では、初期ＧｌｕＤＨは、野生型ＧｌｕＤＨである。一部の実施形態では、初期ＧｌｕＤＨは、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の微生物、好ましくはリシニバチルス属（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の微生物、より好ましくはリシニバチルス・スファエリクス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）又はバチルス・ベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）に由来する。好ましい実施形態では、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、配列番号４～１４、１６～１９、２１、２２、２４、２５、２７～３０、３２～４８、５０、５１、及び５３～７２のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための改変型ＧｌｕＤＨの活性は、この反応を触媒する配列番号３の活性の少なくとも１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、又はそれよりも高い。
第２の態様では、本発明は、本発明の改変型ＧｌｕＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
第３の態様では、本発明は、本発明の改変型ＧｌｕＤＨ、そのコードポリヌクレオチド、又は上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
第４の態様では、本発明は、Ｌ－グルホシネートを生産するための方法であって、本発明の改変型ＧｌｕＤＨ又は本発明の宿主細胞をＰＰＯと接触させるステップを含む方法を提供する。
本発明は、主に、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための改変型ＧｌｕＤＨに関する。別様の指定がない限り、本明細書で使用される用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。
Ｉ． 改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
本明細書で使用される場合、「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ」及び「ＧｌｕＤＨ」という用語は、グルタミン酸の脱水素化を触媒してα－ケトグルタル酸を生成する酵素を指す。さらに、ＧｌｕＤＨは、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成する活性を有する。本発明は、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加、及び／又はこれらに限定されないが、Ｖｍａｘ値の増加、Ｋｍ値の減少、若しくはＶｍａｘ／Ｋｍの増加を含む動力学的特性の向上を示す改変型ＧｌｕＤＨポリペプチドを提供する。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む鎖を意味する。「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」と言い換えることができ、１０個又はそれよりも多くのアミノ酸残基を含む鎖を意味する。本明細書ではすべてのペプチド及びポリペプチドの化学式又は配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への方向を示す、左から右の順序で記載されている。
「アミノ酸」という用語は、タンパク質に天然に存在するアミノ酸及び非天然アミノ酸を含む。タンパク質に天然に存在するアミノ酸の慣例的命名法（１文字及び３文字）が使用され、この命名法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年）に見出すことができる。
アミノ酸 １文字 ３文字
アラニン Ａ Ａｌａ
アルギニン Ｒ Ａｒｇ
アスパラギン Ｎ Ａｓｎ
アスパラギン酸 Ｄ Ａｓｐ
システイン Ｃ Ｃｙｓ
グルタミン Ｑ Ｇｌｎ
グルタミン酸 Ｅ Ｇｌｕ
グリシン Ｇ Ｇｌｙ
ヒスチジン Ｈ Ｈｉｓ
イソロイシン Ｉ Ｉｌｅ
ロイシン Ｌ Ｌｅｕ
リジン Ｋ Ｌｙｓ
メチオニン Ｍ Ｍｅｔ
フェニルアラニン Ｆ Ｐｈｅ
プロリン Ｐ Ｐｒｏ
セリン Ｓ Ｓｅｒ
トレオニン Ｔ Ｔｈｒ
トリプトファン Ｗ Ｔｒｐ
チロシン Ｙ Ｔｙｒ
バリン Ｖ Ｖａｌ
本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、ポリペプチドに対する任意の改変、例えば、アミノ酸（複数可）の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を指す。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、２つ又はそれよりも多くの位置にアミノ酸の置換を含み、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加、及び／又はこれらに限定されないが、Ｖｍａｘ値の増加、Ｋｍ値の減少、若しくはＶｍａｘ／Ｋｍの増加を含む動力学的特性の向上を示す。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、アミノ酸の置換の以下の組合せ：
１０４位のアミノ酸がＣに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８１位のアミノ酸がＫ又はＲに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、２０３位のアミノ酸がＩに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１７３位のアミノ酸がＧに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；及び
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること
を有し、
位置は、配列番号１を参照して付番されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３３位、１７３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３３位及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１７３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７３位及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１３３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７５位及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１３３位、１７３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸はＣに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位、１３３位、及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１７３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位、１７３位、及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３３位、１７３位、及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３３位、１７３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３３位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１７３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７３位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１３３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。
アミノ酸の改変がそれに基づいて実施されるＧｌｕＤＨポリペプチドは、本明細書では開始ＧｌｕＤＨと呼ばれる。開始ＧｌｕＤＨは、野生型ＧｌｕＤＨであってもよく、また野生型ＧｌｕＤＨのバリアントであってもよい。例えば、改変が配列番号１のポリペプチドに基づいて開始される場合、配列番号１のポリペプチドは、改変型ＧｌｕＤＨに対して「開始ＧｌｕＤＨ」であり、改変が配列番号１のバリアントポリペプチド（例えば、配列番号３～３０）に基づいて開始される場合、バリアントポリペプチドは、改変型ＧｌｕＤＨに対して「開始ＧｌｕＤＨ」である。
本明細書で使用される場合、「野生型ＧｌｕＤＨ」という用語は、天然に存在するＧｌｕＤＨを指す。一部の実施形態では、初期ＧｌｕＤＨは、バチルス科の微生物に由来するＧｌｕＤＨである。一部の実施形態では、野生型ＧｌｕＤＨは、リシニバチルス属又はバチルス属の微生物に由来するＧｌｕＤＨである。好ましくは、野生型ＧｌｕＤＨは、リシニバチルス・スファエリクスに由来するＧｌｕＤＨ（配列番号２）又はバチルス・ベレゼンシスに由来するＧｌｕＤＨ（配列番号１）である。
本発明の場合、２つのアミノ酸配列間又は２つの核酸配列間の同一性パーセンテージを決定するために、配列は最適な比較の目的でアラインされる（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入してもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置において同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められている場合、そうした分子はこの位置が同一である。２つの配列間の同一性パーセンテージは、配列により共有されている同一位置の数の関数である（つまり、同一性パーセンテージ＝同一位置の数／位置の総数（つまり、重複する位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は長さが同一である。
当業者であれば、種々のコンピュータープログラムを使用して、２つの配列間の同一性を決定することができることを承知している。
「アミノ酸同一性パーセンテージ」又は「アミノ酸配列同一性パーセンテージ」は、２つのポリペプチドのアミノ酸間の比較を指し、最適にアラインされている場合、２つのポリペプチドはほぼ指定のパーセンテージの同一アミノ酸を有する。例えば、「９５％アミノ酸同一性」は、２つのポリペプチドのアミノ酸間の比較を指し、最適にアラインされている場合、２つのポリペプチドのアミノ酸の９５％が同一である。
一部の実施形態では、野生型ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、アミノ酸の置換の以下の組合せ：
１０４位のアミノ酸がＣに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８１位のアミノ酸がＫ又はＲに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、２０３位のアミノ酸がＩに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１７３位のアミノ酸がＧに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；及び
１３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること
を有し、
位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３３位、１７３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３３位及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１７３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７３位及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１３３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７５位及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１３３位、１７３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位、１３３位、及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１７３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位、１７３位、及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３３位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３３位、１７３位、及び１７５位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１８１位、及び１８２位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。一部の実施形態では、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３２位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３２位のアミノ酸はＬに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３３位、１７３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１３３位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１３３位のアミノ酸はＶに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１７３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１７３位のアミノ酸は、Ｇ又はＳに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７３位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１７３位のアミノ酸はＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１０４位、１３２位、１３３位、及び１８１位から選択される１つ又は複数の位置に置換をさらに含む。一部の実施形態では、１０４位のアミノ酸は、Ｃに置換されている。一部の実施形態では、１３２位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。一部の実施形態では、１３３位のアミノ酸は、Ｖに置換されている。一部の実施形態では、１８１位のアミノ酸は、Ｋ又はＲに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７３位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、位置は、配列番号１を参照して付番されている。好ましくは、１７３位のアミノ酸はＧに置換されており、１７５位のアミノ酸はＧに置換されており、１８２位のアミノ酸はＲに置換されている。一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、９位、２２位、２３位、２５位、３１位、５６位、１２４位、１４３位、１９９位、２１６位、２４２位、２６３位、３３９位、４２０位、４３１位、及び４３７位から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸の置換をさらに含む。好ましくは、９位のアミノ酸は、Ｓ、Ｌ、又はＹに置換されている。好ましくは、２２位のアミノ酸は、Ｗ又はＥに置換されている。好ましくは、２３位のアミノ酸は、Ｍに置換されている。好ましくは、２５位のアミノ酸は、Ｄに置換されている。好ましくは、３１位のアミノ酸は、Ｈに置換されている。好ましくは、５６位のアミノ酸は、Ｑに置換されている。好ましくは、１２４位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。好ましくは、１４３位のアミノ酸は、Ｅに置換されている。好ましくは、１９９位のアミノ酸は、Ｗ又はＹに置換されている。好ましくは、２１６位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。好ましくは、２６３位のアミノ酸はＳに置換されており、３３９位のアミノ酸はＱに置換されている。好ましくは、４２０位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、４３１位のアミノ酸は、Ｓに置換されている。好ましくは、４３７位のアミノ酸は、Ｋに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。例えば、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１を含むか又はからなる。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、２２位、５６位、１７３位、１７５位、１８２位、１９９位、及び４２０位にアミノ酸の置換を含む。好ましくは、２２位のアミノ酸は、Ｅに置換されている。好ましくは、５６位のアミノ酸は、Ｑに置換されている。好ましくは、１７３位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。好ましくは、１７５位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。好ましくは、１８２位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。好ましくは、１９９位のアミノ酸は、Ｙに置換されている。好ましくは、４２０位のアミノ酸は、Ｒに置換されている。一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、３１位、１２４位、及び２１６位から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸の置換をさらに含む。好ましくは、３１位のアミノ酸は、Ｈに置換されている。好ましくは、１２４位のアミノ酸は、Ｌに置換されている。好ましくは、２１６位のアミノ酸は、Ｇに置換されている。好ましくは、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。例えば、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１を含むか又はからなる。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、初期ＧｌｕＤＨは、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む点で、配列番号１又は２とは異なる。一部の実施形態では、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と比較して、１つ又は複数のアミノ酸の保存的置換を含む。一部の実施形態では、初期ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と比較して、１つ又は複数のアミノ酸の挿入又は欠失を含む。
「保存的置換」という用語は、「相同性」アミノ酸残基による置換とも呼ばれ、アミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基、例えば塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）により置き換えられる置換を意味する。
一般的に、アミノ酸の保存的置換は、得られるタンパク質の活性に対してもたらされる影響が最小限である。そのような置換は下記に記載されている。保存的置換は、アミノ酸を、サイズ、疎水性、電荷、極性、空間的特徴、及び芳香族性が類似しているアミノ酸で置き換えることである。タンパク質の特性を正確に調節することが所望の場合、置換は一般的に保存的である。
本明細書で使用される場合、「相同性」アミノ酸残基は、疎水性、電荷、極性、立体特徴、芳香族特徴などに関する化学特性が類似しているアミノ酸残基を指す。互いに相同性であるアミノ酸の例としては、正に荷電しているリジン、アルギニン、及びヒスチジン；負に荷電しているグルタミン酸及びアスパラギン酸；疎水性であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、及びフェニルアラニン；極性であるセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；芳香族であるフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；化学的に類似した側鎖基を有するセリン及びトレオニン又はグルタミン及びアスパラギン又はロイシン及びイソロイシンが挙げられる。
タンパク質における保存的アミノ酸置換の例としては、ＡｌａがＳｅｒに置換されること、ＡｒｇがＬｙｓに置換されること、ＡｓｎがＧｌｎ又はＨｉｓに置換されること、ＡｓｐがＧｌｕに置換されること、ＣｙｓがＳｅｒに置換されること、ＧｌｎがＡｓｎに置換されること、ＧｌｕがＡｓｐに置換されること、ＧｌｙがＰｒｏに置換されること、ＨｉｓがＡｓｎ又はＧｌｎに置換されること、ＩｌｅがＬｅｕ又はＶａｌに置換されること、ＬｅｕがＩｌｅ又はＶａｌに置換されること、ＬｙｓがＡｒｇ又はＧｌｎに置換されること、ＭｅｔがＬｅｕ又はＩｌｅに置換されること、ＰｈｅがＭｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒに置換されること、ＳｅｒがＴｈｒに置換されること、ＴｈｒがＳｅｒに置換されること、ＴｒｐがＴｙｒに置換されること、ＴｙｒがＴｒｐ又はＰｈｅに置換されること、及びＶａｌがＩｌｅ又はＬｅｕに置換されることが挙げられる。
一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、配列番号４～１４、１６～１９、２１、２２、２４、２５、２７～３０、３２～４８、５０、５１、及び５３～７２のうちの１つを含むか若しくはからなるか、又は改変型ＧｌｕＤＨは、配列番号４～１４、１６～１９、２１、２２、２４、２５、２７～３０、３２～４８、５０、５１、及び５３～７２のうちの１つと比較して、１～１０個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）を含み、置換は、９位、２２位、２３位、２５位、３１位、５６位、１０４位、１２４位、１３２位、１３３位、１４３位、１７３位、１７５位、１８１位、１８２位、１９９位、２０３位、２１６位、２４２位、２６３位、３３９位、４２０位、４３１位、及び４３７位以外の位置に存在し、改変型ＧｌｕＤＨは、その初期ＧｌｕＤＨと比較して、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加、及び／又は動力学的特性の向上、例えばＶｍａｘの増加、Ｋｍの減少、若しくはＶｍａｘ／Ｋｍの増加を示す。一部の実施形態では、改変型ＧｌｕＤＨは、配列番号４～１４、１６～１９、２１、２２、２４、２５、２７～３０、３２～４８、５０、５１、及び５３～７２のうちの１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くのアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）を含み、置換は、９位、２２位、２３位、２５位、３１位、５６位、１０４位、１２４位、１３２位、１３３位、１４３位、１７３位、１７５位、１８１位、１８２位、１９９位、２０３位、２１６位、２４２位、２６３位、３３９位、４２０位、４３１位、及び４３７位以外の位置に存在する。一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、配列番号１又は２と、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
本明細書で使用される場合、酵素の活性は、ある特定の条件下で単位質量の酵素により触媒される化学反応における単位時間当たりの基質の減少又は産物の増加を指す。例えば、本発明の改変型ＧｌｕＤＨの活性は、ある特定の条件下の単位質量の改変型ＧｌｕＤＨの触媒下における単位時間当たりのＰＰＯの減少量又はＬ－グルホシネートの増加量により表すことができる。
また、本明細書における酵素の活性は、相対的活性パーセンテージなど、目的の酵素の活性の、同じ反応を触媒する所与の酵素の活性に対する比として表される、酵素の相対的活性を指す場合がある。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨの活性は、配列番号３と比較した相対的活性パーセンテージとして表される。一部の実施形態では、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成する改変型ＧｌｕＤＨの活性は、この反応を触媒する配列番号３の活性の少なくとも１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、又はそれよりも高い。
一部の実施形態では、本発明の改変型ＧｌｕＤＨの活性は、配列番号３１と比較した相対的活性パーセンテージとして表される。一部の実施形態では、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成する改変型ＧｌｕＤＨの活性は、この反応を触媒する配列番号３１の活性の少なくとも１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、又はそれよりも高い。
本明細書で使用される場合、「アミノ供与体」という用語は、アミノ基を提供する化合物であって、無機化合物及び有機化合物を含む化合物を指す。「アミノ供与体」としては、これらに限定されないが、アンモニウム塩（例えば、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４ＮＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ４、酢酸アンモニウムなど）、アミノ酸、又は有機アミンが挙げられる。一部の実施形態では、アミノ供与体は、アンモニウム塩、例えばＮＨ４Ｃｌである。
生産するには、酵素の活性に加えて、動力学的特性を考慮に入れる必要がある。本明細書における酵素の動力学的特性としては、これらに限定されないが、酵素のＶｍａｘ、Ｋｍ、及びＶｍａｘ／Ｋｍが挙げられる。本明細書における動力学的特性の向上としては、これらに限定されないが、Ｖｍａｘの増加、Ｋｍの減少、及びＶｍａｘ／Ｋｍの増加が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「Ｖｍａｘ」という用語は、ある特定の濃度の酵素で達成することができる、触媒反応の最大速度を指す。特に、酵素の濃度が一定である条件下では、基質の濃度がある特定の範囲内にある場合、反応の速度は一般的に基質の濃度の増加と共に増加し、基質の濃度がある特定の値に到達すると、反応の速度は最大値に到達することになり、反応の速度は基質の濃度が増加しても増加することはない。
本明細書で使用する場合、「Ｋｍ」という用語は、ある特定の酵素濃度において、反応の速度が、触媒作用の最大速度、つまりＶｍａｘの半分に到達する基質の濃度を指す。
ＩＩ． 改変型ＧｌｕＤＨをコードするポリヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドアナログを使用して産生されるＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含む。核酸分子は、一本鎖であってもよく又は二本鎖であってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡであってもよい。核酸の合成には、ヌクレオチドアナログ又は誘導体（例えば、イノシンヌクレオチド又はホスホロチオエートヌクレオチド）を使用することができる。そのようなヌクレオチドを使用して、例えば、塩基対合能力が変更された又はヌクレアーゼ耐性が増加された核酸を調製することができる。
また、本発明は、本発明の改変型ＧｌｕＤＨをコードするポリヌクレオチドを提供する。したがって、本発明では、改変という用語は、本発明のＧｌｕＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの遺伝子操作も含む。改変は、１つ又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、及び／又は付加であってもよい。
本明細書で使用される場合、「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドが、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に指定することを意味する。コード配列の境界は、一般的にＡＴＧ開始コドン又はＧＴＧ及びＴＴＧなどの他の開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡなどの終止コドンで終わるオープンリーディングフレームにより一般的に決定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は組換えヌクレオチド配列であってもよい。
加えて、本発明の核酸配列の全部又は一部を包含する核酸分子は、配列に含まれる配列情報に基づいて設計及び合成されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡ、並びに好適なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って増幅することができる。上記のように増幅された核酸は、好適なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、標準的な合成技法により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用することにより調製することができる。
また、本発明は、本明細書に記載の核酸分子の相補鎖に関する。他のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、他方のヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定二重鎖を形成することができるように、ヌクレオチド配列に対して十分に相補的な分子である。
本明細書で使用される場合、一般的には、「ハイブリダイゼーション」という用語は、互いに少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも９８％相同性であるヌクレオチド配列が、所与のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で互いに対するハイブリダイゼーションを維持することである。
当業者であれば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件など、ハイブリダイゼーションのための種々の条件を承知している。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州；及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州を参照されたい。
当然のことだが、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）など）又はポリＴ（又はＵ）残基の相補的ストレッチにハイブリダイズするに過ぎないポリヌクレオチドを含まない。
ＩＩＩ． 改変型ＧｌｕＤＨの発現及び産生
本発明の改変型ＧｌｕＤＨを発現させるために、発現ベクターなど、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物及びベクターも提供される。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、これらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。
「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されているか又は天然に存在しない核酸セグメントを含むように改変されている一本鎖又は二本鎖核酸分子を指す。核酸構築物が、本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、核酸構築物という用語は、「発現カセット」という用語と同義である。
「発現ベクター」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチドの発現のために提供される追加のヌクレオチド、例えば制御配列に作動可能に連結した、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む線状又は環状ＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクターを含む。
「制御配列」という用語は、本明細書では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な又は有益なすべてのエレメントを含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して天然若しくは外来性であってもよく、又は互いに天然若しくは外来性であってもよい。そのような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。最低でも、制御配列は、プロモーター並びに転写及び翻訳を終結させるためのシグナルを含む。
例えば、制御配列は、宿主細胞により認識され、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるヌクレオチド配列である、好適なプロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を呈する任意のヌクレオチド配列、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンであってもよい。また、プロモーターとしては、変異型、切断型、及びハイブリッド型プロモーターが挙げられ、宿主細胞に対して同種性又は異種性の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
「作動可能に連結した」という用語は、本明細書では、制御配列がポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に配置され、それにより制御配列がポリペプチドコード配列の発現を指図する構成を指す。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を可能にするための種々の操作に供することができる。ベクターに挿入する前に、発現ベクターに応じてポリヌクレオチドを操作することが望ましいか又は必要である。組換えＤＮＡ法によりポリヌクレオチド配列を改変するための技法は、当技術分野で周知である。
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を特定及び選択するために、本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞、トランスフェクト細胞、形質導入細胞などの簡単な選択を可能にする１つ又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その産物が、殺生物剤をもたらすか、又はウイルス耐性、重金属耐性、補助栄養要求性などを提供する遺伝子である。例えば、細菌選択マーカーは、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するｄａｌ遺伝子、又はアンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。
本発明のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、又はゲノムとは独立して細胞内で自律的に複製してもよい。宿主細胞のゲノムへの組込み又は自律的複製に必要なエレメントは、当技術分野で公知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照）。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技法又はトランスフェクション技法により原核細胞又は真核細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、当技術分野で周知であり、例えば前述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６年）；及び他の実験マニュアルに見出すことができる、外来性核酸（ＤＮＡなど）を宿主細胞に導入のための種々の技法を指す。
また、本発明は、ＧｌｕＤＨポリペプチドの組換え産生において有利に使用される、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは宿主細胞に導入され、それによりベクターは、染色体組込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして保持される。当業者であれば、タンパク質を発現するための従来のベクター及び宿主細胞を承知している。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌細胞である。一部の実施形態では、発現ベクターはｐＥＴ－３０ａ（＋）である。
本発明の改変型ＧｌｕＤＨを、非ＧｌｕＤＨポリペプチド（例えば、異種性アミノ酸配列）に作動可能に連結して、融合タンパク質を形成することができる。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、ＧｌｕＤＨ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ－ＧｌｕＤＨ融合タンパク質である。この融合タンパク質は、組換えＧｌｕＤＨの精製を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種性シグナル配列を含むＧｌｕＤＨタンパク質である。ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞及び酵母宿主細胞）では、異種性シグナル配列の使用によりＧｌｕＤＨの発現及び／又は分泌を増加させることができる。
ＩＶ． Ｌ－グルホシネートの生産
さらに、本発明は、Ｌ－グルホシネートを調製するための方法であって、本発明の改変型ＧｌｕＤＨ又は宿主細胞をＰＰＯと接触させるステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明のＬ－グルホシネート－アンモニウムを調製するための方法は、
（ａ）本発明の改変型ＧｌｕＤＨの活性を、ＰＰＯ及びアミノ供与体を含む反応培地に供給し、任意選択で反応培地がＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰサイクル系を含むステップ、
（ｂ）反応培地をインキュベートして、Ｌ－グルホシネートを生成するステップ
を含む。
一部の実施形態では、無細胞触媒法を使用してＬ－グルホシネートを生産し、本発明の改変型ＧｌｕＤＨは、ステップ（ａ）において供給される。一部の実施形態では、遊離又は固定化された本発明の改変型ＧｌｕＤＨを使用することができる。
一部の実施形態では、アミノ供与体は、アンモニウム塩、例えばＮＨ４Ｃｌである。
一部の実施形態では、反応培地は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰを含む。本発明に好適なＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰサイクル系は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）を含む。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰサイクル系は、アルコールデヒドロゲナーゼを含む。また、一部の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼは固定化されていてもよい。
一部の実施形態では、インキュベーションは、２０～５０℃、好ましくは２５～４０℃、より好ましくは２８～３５℃、例えば３０℃で実施される。
一部の実施形態では、培地は、ＰＢＳ緩衝液及びＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などの緩衝液である。一実施形態では、培地は、１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液などのＰＢＳ緩衝液である。一部の実施形態では、反応培地のｐＨは７．５～８である。
一部の実施形態では、反応培地は、部分的に又は全体が細胞培養培地で構成されている培地であり、本発明の改変型ＧｌｕＤＨの活性は、反応培地中で培養される本発明の宿主細胞により提供される。
一部の実施形態では、反応培地は、部分的に又は全体が細胞培養培地で構成されている培地であり、アルコールデヒドロゲナーゼ活性などのＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰサイクル系は、反応培地で培養される本発明の宿主細胞により又は第２の宿主細胞により提供される。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞及び／又は第２の宿主細胞を細胞培養培地中で培養及び増殖させ、次いで増殖宿主細胞を細胞培養培地から分離し、緩衝液又は水を使用してバイオマスを再懸濁する。増殖宿主細胞の添加前、添加中、又は添加後に、ＰＰＯを緩衝液又は水に提供する。
一部の実施形態では、大腸菌細胞などの細菌細胞を使用することができる。
当業者であれば、以下の実施例を通じて本発明をより明確に理解するだろう。実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、説明のためのものに過ぎないことが理解されるべきである。
実施例１．物質及び方法
別様の指定がない限り、本発明で使用される実験方法はすべて従来法である。特定の遺伝子クローニング作業は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年に見出すことができる。
ｉ）試薬：
ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ）及びＤｐｎＩエンドヌクレアーゼは、ＴａＫａＲａから購入した。プラスミド単離キットは、Ａｘｙｇｅｎから購入した。ＰＰＯは、先行技術に従って本出願人が合成した（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１年、５６巻、１７８３～１７８８頁を参照）。ＮＨ４Ｃｌは、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、北京から購入した。ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨは、Ａｌａｄｄｉｎから購入した。アルコールデヒドロゲナーゼは、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）に由来するデヒドロゲナーゼ（ＮＣＢＩ受入番号ＷＰ＿０５４７６８７８５．１）であり、このデヒドロゲナーゼは大腸菌で組換え的に発現される。
ｉｉ）ベクター及び菌株：
使用した発現ベクターはｐＥＴ－３０ａ（＋）だった。プラスミドは、Ｎｏｖａｇｅｎから購入した。使用した宿主細胞は、Ｔｉａｎｇｅｎ ＢｉｏＴｅｃｈ（北京）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）だった。
ｉｉｉ）配列決定及びプライマー合成は、Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により行われた。
ｉｖ）部位特異的変異：
変異が必要なアミノ酸位置に対応する塩基に所望の置換を導入するために特異的プライマー対を設計した。単離された変異前プラスミド（野生型ＧｌｕＤＨのコード配列及びｐＥＴ－３０ａ（＋）骨格を含む）を鋳型として使用し、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ技術（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻（１４号）：ｅ１１５）を使用したＰＣＲにより変異を導入した。ＰＣＲ増幅後、増幅産物をＤｐｎＩで４時間消化して、鋳型プラスミドを除去した。消化産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、続いてＬＢ寒天（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に播種し、単一コロニーをＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に接種して培養し、配列決定して正しい変異体であることを確認した。確認したクローンを、将来の使用のために－８０℃で保存する。
ｖ）タンパク質発現及び粗酵素溶液の調製：
保管したクローンをＬＢ寒天で活性化した。次いで、単一コロニーをＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に接種し、３７℃で１２時間振盪しながらインキュベートした。１ｍＬの培養液を、５０ｍＬの新しいＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に移し、ＯＤ６００が約０．６に到達するまで３７℃で振盪しながらインキュベートし、ＩＰＴＧ（最終濃度０．４ｍＭ）を添加した後は２５℃で１６時間インキュベートして、タンパク質発現を誘導した。
インキュベーション後、培養物を４，０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離し、上清を破棄し、大腸菌細胞を収集した。収集した大腸菌細胞を、１５ｍＬの予冷５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．０に再懸濁し、４℃で超音波処理して破砕した。細胞破砕溶液を、６，０００ｇで１５分間４℃にて遠心分離して沈殿物を除去した。得られた上清は、組換え酵素を含む粗酵素溶液だった。
ｖｉ）酵素活性の決定
ＮＨ４Ｃｌ及びＮＡＤＰ＋を、ＰＢＳ中のＰＰＯ溶液（１００ｍＭ）に添加し、溶液のｐＨをアンモニア水溶液で８に調整した。この溶液は、最終濃度１００ｍＭのＰＰＯ、最終濃度５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、及び最終濃度０．２ｇ／ＬのＮＡＤＰ＋を含む。ｖ）に記載のようにして得られた粗酵素溶液及びアルコールデヒドロゲナーゼを、上記溶液に添加した。ＧｌｕＤＨの最終濃度は０．０２ｇ／Ｌであり、アルコールデヒドロゲナーゼの最終濃度は０．２ｇ／Ｌである。この溶液を、振盪機で２時間３０℃にて振盪し続け（４００ｒｐｍ）、次いで試料採取して、生成されたＬ－グルタミンの量をＯＰＡプレカラム誘導体化ＨＰＬＣで検出し、それにより触媒反応の初期速度を決定した。
ｖｉｉ）酵素の動力学的特性の決定
ｐＨ７．５の（アンモニア水溶液でｐＨを調整した）１００ｍＭ ＰＢＳ、０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨ（還元）、５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０容量％の希釈（５００倍）粗酵素溶液、及び種々の濃度（５～１００ｍＭ）の基質ＰＰＯを含む複数の反応系（２００μＬ）を９６ウェルプレートで調合した。３４０ｎｍのＵＶ吸光の強度を３０℃で検出し、吸光の変化速度を経時的に（ｍＡ／分）記録した。得られたパラメーターをミカエリス－メンテン式に代入し、吸光の変化速度で反応速度を算出した。
実施例２．バチルス・ベレゼンシスに由来するＧｌｕＤＨ（ＢｖＧｌｕＤＨ）の変異体の調製及び検出
ＢｖＧｌｕＤＨ（配列番号１）のコード核酸を鋳型として用いて変異体を調製し、実施例１の方法に従って、酵素活性並びに動力学的パラメーターであるＶｍａｘ及びＫｍを測定した。得られた変異体並びにそれらの酵素活性及び動力学的パラメーターは表１に示されている。相対的酵素活性は、配列番号３の変異体の酵素活性に対する変異体の酵素活性のパーセンテージを意味する。
Figure 2023532699000001
実施例３．リシニバチルス・スファエリクスに由来するＧｌｕＤＨ（ＬｓＧｌｕＤＨ）の変異体の調製及び検出
ＬｓＧｌｕＤＨ（配列番号２）のコード核酸を鋳型として用いて変異体を調製し、実施例１の方法に従って、酵素活性並びに動力学的パラメーターであるＶｍａｘ及びＫｍを測定した。得られた変異体並びにそれらの酵素活性及び動力学的パラメーターは表２に示されている。相対的酵素活性は、配列番号３１の変異体の酵素活性に対する変異体の酵素活性のパーセンテージを意味する。
Figure 2023532699000002
実施例４．ＢｖＧｌｕＤＨの変異体の調製及び検出
配列番号２１の変異体に基づき追加の変異を導入することにより変異体を調製し、実施例１の方法に従って酵素活性を測定した。得られた変異体及びそれらの酵素活性は表３に示されている。初期相対的酵素活性は、熱処理を行わない場合は、配列番号２１の変異体の酵素活性に対する変異体の酵素活性のパーセンテージを意味する。熱処理後の相対的酵素活性は、４５℃で３０分間インキュベートした後の、配列番号２１の変異体の酵素活性に対する変異体の酵素活性のパーセンテージを意味する。
Figure 2023532699000003
実施例５．ＢｖＧｌｕＤＨの変異体の調製及び検出
配列番号６５の変異体に基づき追加の変異を導入することにより変異体を調製し、実施例１の方法に従って酵素活性を測定した。得られた変異体並びにそれらの酵素活性は表４に示されている。相対的酵素活性は、配列番号６５の変異体の酵素活性に対する変異体の酵素活性のパーセンテージを意味する。
Figure 2023532699000004

Claims (17)

  1. 改変型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）であって、初期ＧｌｕＤＨと比較して、
    １０４位のアミノ酸がＣに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８１位のアミノ酸がＫ又はＲに置換されていること；
    １７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
    １７５位のアミノ酸がＧに置換されており、２０３位のアミノ酸がＩに置換されていること；
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
    １３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
    １７３位のアミノ酸がＧに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されていること；
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１７３位のアミノ酸がＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；
    １３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること；及び
    １３２位のアミノ酸がＬに置換されており、１３３位のアミノ酸がＶに置換されており、１７３位のアミノ酸がＧ又はＳに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されていること
    から選択されるアミノ酸の置換の組合せを含み、
    前記位置が、配列番号１を参照して付番されており、前記改変型ＧｌｕＤＨが、前記初期ＧｌｕＤＨと比較して、４－（ヒドロキシメチルホスフィニル）－２－オキソブタン酸（ＰＰＯ）とアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加、及び／又はＶｍａｘの増加、Ｋｍの減少、若しくはＶｍａｘ／Ｋｍの増加を示す、改変型ＧｌｕＤＨ。
  2. 前記初期ＧｌｕＤＨが野生型ＧｌｕＤＨである、請求項１に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  3. 前記初期ＧｌｕＤＨが、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の微生物、好ましくはリシニバチルス属（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の微生物、より好ましくはリシニバチルス・スファエリクス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）又はバチルス・ベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）に由来する、請求項１又は２に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  4. 前記初期ＧｌｕＤＨが、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  5. 配列番号４～１４、１６～１９、２１、２２、２４、２５、２７～３０、３２～４８、５０、５１、及び５３～７２のうちの１つのアミノ酸配列を含む改変型ＧｌｕＤＨ。
  6. その初期ＧｌｕＤＨと比較して、１７３位、１７５位、及び１８２位に置換を含み、１７３位のアミノ酸がＧに置換されており、１７５位のアミノ酸がＧに置換されており、１８２位のアミノ酸がＲに置換されている改変型ＧｌｕＤＨであって、前記位置が、配列番号１を参照して付番されており、前記改変型ＧｌｕＤＨが、前記初期ＧｌｕＤＨと比較して、ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための活性の増加を示す、改変型ＧｌｕＤＨ。
  7. 前記初期ＧｌｕＤＨが野生型ＧｌｕＤＨである、請求項６に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  8. 前記初期ＧｌｕＤＨが、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の微生物、好ましくはリシニバチルス属（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の微生物、より好ましくはリシニバチルス・スファエリクス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）又はバチルス・ベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）に由来する、請求項６又は７に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  9. ９位、２２位、２３位、２５位、３１位、５６位、１２４位、１４３位、１９９位、２１６位、２４２位、２６３位、３３９位、４２０位、４３１位、及び４３７位から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸の置換をさらに含み、９位のアミノ酸がＳ、Ｌ、又はＹに置換されており、２２位のアミノ酸がＷ又はＥに置換されており、２３位のアミノ酸がＭに置換されており、２５位のアミノ酸がＤに置換されており、３１位のアミノ酸がＨに置換されており、５６位のアミノ酸がＱに置換されており、１２４位のアミノ酸がＬに置換されており、１４３位のアミノ酸がＥに置換されており、１９９位のアミノ酸がＷ又はＹに置換されており、２１６位のアミノ酸がＧに置換されており、２６３位のアミノ酸がＳに置換されており、３３９位のアミノ酸がＱに置換されており、４２０位のアミノ酸がＲに置換されており、４３１位のアミノ酸がＳに置換されており、４３７位のアミノ酸がＫに置換されている、請求項６～８のいずれか一項に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  10. ２２位、５６位、１９９位、及び４２０位のアミノ酸の置換をさらに含み、２２位のアミノ酸がＥに置換されており、５６位のアミノ酸がＱに置換されており、１９９位のアミノ酸がＹに置換されており、４２０位のアミノ酸がＲに置換されている、請求項６～８のいずれか一項に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  11. ３１位、１２４位、及び２１６位から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸の置換をさらに含み、３１位のアミノ酸がＨに置換されており、１２４位のアミノ酸がＬに置換されており、２１６位のアミノ酸がＧに置換されている、請求項１０に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  12. 前記初期ＧｌｕＤＨが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項６～１１のいずれか一項に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  13. ＰＰＯとアミノ供与体との反応を触媒してＬ－グルホシネートを生成するための前記改変型ＧｌｕＤＨの活性が、前記反応を触媒するための配列番号３の活性の少なくとも１３０％である、請求項１２に記載の改変型ＧｌｕＤＨ。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変型ＧｌｕＤＨをコードするポリヌクレオチド。
  15. 請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  16. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変型ＧｌｕＤＨ、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
  17. Ｌ－グルホシネートを生産するための方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変型ＧｌｕＤＨ又は請求項１６に記載の宿主細胞を、ＰＰＯと接触させるステップを含む方法。
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