JP2023527886A - エンカプスリン基盤のワクチンの生産のための組換え発現ベクター及びその製造方法 - Google Patents

エンカプスリン基盤のワクチンの生産のための組換え発現ベクター及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023527886A
JP2023527886A JP2022573711A JP2022573711A JP2023527886A JP 2023527886 A JP2023527886 A JP 2023527886A JP 2022573711 A JP2022573711 A JP 2022573711A JP 2022573711 A JP2022573711 A JP 2022573711A JP 2023527886 A JP2023527886 A JP 2023527886A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
seq
encapsulin
rid
expression vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022573711A
Other languages
English (en)
Inventor
ヨン チェ，ドク
ギョ ジュン，ヒュン
Original Assignee
インテラ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020200066119A external-priority patent/KR102264535B1/ko
Priority claimed from KR1020210061143A external-priority patent/KR20220153767A/ko
Application filed by インテラ インコーポレイテッド filed Critical インテラ インコーポレイテッド
Publication of JP2023527886A publication Critical patent/JP2023527886A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/85—Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12323—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、エンカプスリンタンパク質及びこれを含む融合タンパク質に関するもので、より詳しくは、目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むことによって、目的タンパク質の発現効率を増進させて高効率で水溶性のワクチンを生産することができ、大きいサイズの目的タンパク質を用いることができる、ワクチン生産用組換え発現ベクター及びその製造方法に関する。

Description

本発明は、目的タンパク質の発現効率を増進させるためのエンカプスリンタンパク質及びこれを含む融合タンパク質に関し、より詳しくは、目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むことによって、高効率で水溶性のワクチンを生産することができ、大きいサイズの目的タンパク質を用いることができる、ワクチン生産用組換え発現ベクター及びその製造方法に関する。
最近、急増する感染性疾患に対する効率的な対応のための新規予防ワクチンの開発と身体が既に有している疾病（ウイルス、癌など）と闘うのを助ける治療用ワクチンの開発が活発に行われている。予防ワクチン（Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）は、健康な一般人を対象とした疾病の予防のためのワクチンであって、病源菌を注入して免疫反応を誘発するワクチンを言い、治療ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ）は、疾病を保有している患者を対象として疾病の治療のために免疫体系を強化（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ注入など）するワクチンであって、癌、アルツハイマー病などにおいて治療剤となり得る可能性によって多くの研究開発が推進中である。
伝統的なワクチンは、病源菌自体を培養する工程を基盤として長期間の継代培養を通じて毒性が弱化した弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）菌株又は化合物処理を通じて不活化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）した菌株を用いて製造されて来た。しかし、この場合、開発と製造期間が過度に長く、培養が難しい病源菌に対するワクチン開発には適用が不可能であるという短所がある。
病源菌自体の培養に影響を受けず、より効果的なワクチンの製造のために、病源菌成分のうち特定部位のタンパク質や変性した毒素のみを抗原に用いるサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）ワクチンの開発が行われた。この場合、より高い安全性が確保されるという長所はあるが、相対的に低い免疫原性により多回投与と別途の免疫増強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）が必要であるという短所も有している。
急増する新・変種ウイルス感染病に対するより安全で高い効能を有したワクチンの迅速な開発のために、最近、ウイルス様粒子（ＶＬＰ、Ｖｉｒｕｓｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ）ワクチンの製造方法が開発され、培養細胞を用いた感染性ウイルスの直接生産に基づいた既存ワクチン生産技術の限界点を飛び越えられる次世代ワクチンの製造技術として脚光を浴びている。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルス構造タンパク質を野生型ウイルスと外形が類似する構造を示すように特異的に発現させたものであって、非常に複雑で精巧な構造物である。直径２０～１００ｎｍのサイズを有し、多様な種類の遺伝子組換えタンパク質の発現システムを用いて既に配列が知られているウイルスの構造タンパク質を特異的に発現した後、重合体形成（ｖｉｒｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を通じて生産が可能である。
実際の感染性ウイルスと類似する構造と同一の外形を備えると共にウイルス由来の遺伝子がないので、増殖は不可能である一方、高密度の定配列の抗原表出（ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ＆ ｈｉｇｈｌｙ ｏｒｄｅｒｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて高い免疫原性を誘導する。野生型ウイルスとその構造が類似するため、体内でＴ－細胞、Ｂ－細胞の免疫経路を両方とも刺激できるという長所がある。また、形成された構造物内に遺伝物質がないので、感染能力がなくて高い安全性を有するという点と優れた構造的安定性を示すことが特徴である。しかし、その構造が複雑で且つウイルス別に大きく相異なっている特性を示すので、複雑な製造工程が必要であるか低い生産性などの理由により実際の商業用ワクチンとして許可されたＶＬＰはわずかな事例に過ぎないのが実情である。
より改善されたＶＬＰ基盤ワクチンの製造のために、重合体構造をよく形成するＶＬＰ構造体に外部病源菌の抗原を導入した融合ウイルス様粒子（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＶＬＰ）の製造技術が開発され、多様な病源菌を対象とするワクチン開発に活用されて来た。これは、他の特定ウイルスの構造タンパク質又は自己組織化（ｓｅｌｆａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）タンパク質で構成されたＶＬＰ基盤構造の表面に外部病源菌の抗原を表出させた形態をしている。ＶＬＰ基盤構造に外部抗原を導入するためには、化学的結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）又は遺伝的融合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）方式が用いられる。化学的結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方式は、既に製造されたＶＬＰ基盤構造に別に製造された外部抗原を共有結合を通じて化学的に融合させるものであって、一定な方向への抗原定配列が困難であり、表出される抗原の密集度が相対的に低いという短所が指摘されている。一方、遺伝的融合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）方式の場合は、ＶＬＰ構造形成タンパク質の遺伝子と目的抗原タンパク質の遺伝子をＤＮＡレベルで融合発現させることによって、より単純な工程で融合ウイルス様粒子（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＶＬＰ）の製造が可能であるという長所がある。ただし、この場合は、１０～２０個以下のアミノ酸で構成された非常に小さいサイズの外部抗原のみ導入が可能であり、それより大きい場合、構造的な限界性による立体的干渉現象（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）のため構造タンパク質による重合体形成が阻害される。特に、高効率迅速生産のために大腸菌で発現させる場合、適切なフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）が行われないため、不溶性のＩｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙを形成することになり、ＶＬＰの製造が不可能となる。
本発明者らは、以前の研究でＡＲＳＮＴＤ（ａｍｉｎｏａｃｙｌ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｎｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ）を含むＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を結合パートナーに用いたとき、多様なタンパク質のタンパク質フォールディング及び水溶性の増加に関与するという点を明らかにしたことがある。
本発明では、エンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の自己組織化（ｓｅｌｆａｓｓｅｍｂｌｙ）を通じて作られるＶＬＰ構造に、以前には不可能であった大きいサイズの目的抗原タンパク質をより効率的で安定的に表出するために、ＲＮＡ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ（ＲＩＤ）を新規融合パートナーに用いることによって、エンカプスリンと目的抗原の融合タンパク質を高効率水溶性に発現させ得るようになった。前記融合タンパク質は、ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ過程を経る必要なく精製後に自己組織化（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を通じて大量の融合ウイルス様粒子（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＶＬＰ）の迅速な生産を可能にすることを確認し、本発明を完成した。
本発明の目的は、大きいサイズの目的タンパク質をより効率的で安定的に表出でき、エンカプスリンタンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質を高効率で水溶性発現させ得るベクターを提供することであり、ロタウイルス又は子宮頸部癌ウイルスなどのウイルス抗原タンパク質を目的タンパク質に用いて腸炎又は子宮頸部癌などの予防又は治療に用いられる融合タンパク質を提供することである。
本発明の他の目的は、デングウイルス又はコロナウイルスなどのウイルス抗原タンパク質を目的タンパク質に用いてデングウイルスによるデング熱又はコロナウイルスによる呼吸器感染症などの予防又は治療に用いられる融合タンパク質を提供することである。
上述した課題を解決するために、本発明は、エンカプスリンタンパク質及び目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むワクチン生産用組換え発現ベクターを提供する。
また、本発明は、目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む、ワクチン生産用組換え発現ベクターを提供する。
本発明の一実施例によると、前記ポリヌクレオチドは、ＲＩＤの切断のためにＴＥＶタンパク質を追加でコーディングすることができる。
また、本発明は、目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
本発明の一実施例によると、前記目的タンパク質は、エンカプスリンタンパク質のＣ－末端に連結され得る。
また、本発明は、ａ）目的タンパク質；エンカプスリンタンパク質；及びＲＩＤタンパク質；をコーディングするポリヌクレオチドを含むウイルスワクチン生産用組換え発現ベクターを生産する段階、ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を生産する段階及びｃ）前記形質転換体を培養して組換え融合タンパク質の発現を誘導し、これを収得する段階を含むワクチン生産方法を提供する。
本発明の一実施例によると、前記ＲＩＤタンパク質は、生産されるワクチンの発現量の増加又は水溶性を増加させるための融合パートナーとして用いられ得る。
本発明の他の実施例によると、前記ＲＩＤタンパク質は、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことができる。
本発明のまた他の実施例によると、前記発現ベクターに形質転換された宿主細胞が提供され、本発明において宿主細胞は、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）を用いることができる。
本発明の一実施例によると、前記エンカプスリンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことができる。
本発明の他の実施例によると、前記目的タンパク質は、ウイルス抗原タンパク質、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清及び細胞タンパク質からなる群より１種以上選択され得る。
本発明のまた他の実施例によると、前記ウイルス抗原タンパク質は、子宮頸部癌ウイルス抗原タンパク質、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）抗原タンパク質、コロナウイルス抗原タンパク質又はデングウイルス抗原タンパク質であってもよい。
本発明の一実施例によると、前記目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質の間には、少なくとも一つのリンカータンパク質が位置し、前記リンカータンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の遺伝子配列を含むことができる。
本発明によって製造された融合タンパク質は、大きいサイズの目的タンパク質をより効率的で安定的に表出し得るという長所がある。
本発明の一実施例によると、新規融合パートナーとしてＲＩＤを含むことによってエンカプスリンと目的タンパク質の融合タンパク質を高効率で水溶性発現させ得るという長所がある。
本発明によって製造された融合タンパク質は、野生型ウイルスと構造が類似して体内でＴ－細胞及びＢ－細胞の免疫経路を全て刺激し得るので、免疫効果が大きい。
本発明によって製造された融合タンパク質は、目的タンパク質をロタウイルス抗原タンパク質にすることができ、これを用いて腸炎を予防又は治療することができる。
本発明によって製造された融合タンパク質は、目的タンパク質をデングウイルス抗原タンパク質にすることができ、これを用いてデング熱を予防又は治療することができる。
本発明によって製造された融合タンパク質は、目的タンパク質をコロナウイルス抗原タンパク質にすることができ、これを用いてコロナウイルス感染症を予防又は治療することができる。
本発明によって製造された融合タンパク質は、目的タンパク質を子宮頸部癌ウイルス抗原タンパク質にすることができ、これを用いて子宮頸部癌を予防又は治療することができる。
本発明のワクチン生産方法によると、大量の融合タンパク質を迅速に生産してワクチンの生産時間を短縮することができる。
図１は、本発明の一実施例によるエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質生産用組換え発現ベクターの模式図と高効率水溶性タンパク質の発現結果である。
図１の（ａ）は、ＰＤＢを用いて予測したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のタンパク質構造である。 図１の（ｂ）は、ｐＥＴ９ａ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ組換え発現ベクターの構造を示した模式図である。 図１の（ｃ）は、前記発現ベクターを用いてエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の高効率水溶性の発現有無をＳＤＳＰＡＧＥで確認した結果である。
図２の（ａ）は、本発明の実施例によって発現されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒタンパク質をニッケル親和性クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図２の（ｂ）は、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒタンパク質の分離様相をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果である。 図２の（ｃ）は、ニッケル親和性クロマトグラフィーで溶出したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質をイオン樹脂交換クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図２の（ｄ）は、ニッケル親和性クロマトグラフィーで溶出したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の精製様相をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果である。
図３の（ａ）は、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーを進行した後の溶出グラフである。 図３の（ｂ）は、サイズ排除クロマトグラフィーを行った後のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の分離様相をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果である。 図３の（ｃ）及び３の（ｄ）は、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質粒子の直径分布をＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を通じて分析した結果である。 図３の（ｅ）は、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のＶＬＰ（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）の全体的な外形を透過電子顕微鏡（ＴＥＭ)を通じて確認した結果である。
図４の（ａ）は、本発明の実施例によるロタウイルスＶＰ８＊を表出するエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のウイルス様粒子を製造するために発現量及び水溶性増進融合パートナーであるＲＩＤと適正配列の酵素切断部位及び連結部位をＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ ＲＶ ＶＰ８＊融合タンパク質に適用して発現する戦略を示した図である。 図４の（ｂ）は、図４の（ａ）に該当する発現ベクターの構造を示し、発現量及び水溶性増進融合パートナーであるＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ及びＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅの効率のための追加配列を挿入したｐＥＴ９ａ－ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤＬｉｎｋｅｒ－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ ＶＰ８＊のベクター構造に該当する。 図４の（ｃ）は、本発明のペプチドで発現量及び水溶性増進融合パートナーであるＲＩＤを適用したとき、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質と抗原タンパク質の融合タンパク質が融合発現に及ぼす影響を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）とＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＰ８＊に対する相対的発現量の変化を確認することができ、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒが組換えとなっているタンパク質（サイズ３２．１ｋＤａ）とナノプラットフォームとしての役目を確認するためのロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、ＲＶ）の抗原であるＶＰ８＊がそのＣ末端に結合されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＰ８＊組換えタンパク質（サイズ５０．３ｋＤａ）の発現結果である。 図４の（ｄ）の場合は、本発明の実施例によってＲＩＤとエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）の間に適用したＴＥＶ切断部位をＴＥＶ酵素を処理した後にイオン交換樹脂で精製するとき、タンパク質の分離様相と純度をＳＤＳＰＡＧＥを通じて確認した結果である。 図４の（ｅ）は、本発明の一実施例によって製造されたワクチン生産用組換え発現ベクターのロタバイロスタイプ別発現様相を確認した結果である。
図５の（ａ）は、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質と抗原タンパク質の融合タンパク質により形成されたＶＬＰの全体的な直径分布をＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を通じて分析した結果である。 図５の（ｂ）は、目的タンパク質が表面に表出されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のＶＬＰ（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）の全体的な外形を透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を通じて確認した結果である。
図６の（ａ）は、本発明の一実施例による試料をマウスに接種した後の血清獲得までの日程と本発明の一実施例によってマウスに注入された試料の組成及び含量表である。 図６の（ｂ）は、エンカプスリンと目的タンパク質の融合タンパク質により形成されたＶＬＰを接種した動物実験群から得た血清内の目的タンパク質の特異抗体反応を測定するために酵素結合免疫沈降分析法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ））で分析した結果である。
図６の（ｃ）は、エンカプスリンと目的タンパク質の融合タンパク質で構成されたＶＬＰを接種した後に収得した血清内の目的タンパク質の特異抗体力価を酵素結合免疫沈降分析法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ））で分析した結果である。一番目の図示結果は、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅに組換えタンパク質であるＰ２－ＶＰ８＊タンパク質を吸着させた後、それに反応する接種動物血清内の特異抗体価を測定した結果であり、二番目の図示結果は、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅにＨｕｍａｎ ＲｏｔａｖｉｒｕｓであるＷａ Ｓｔｒａｉｎ自体を吸着させた後に得た結果である。
図６の（ｄ）は、エンカプスリンと目的タンパク質の融合タンパク質で構成されたＶＬＰを３回接種した後、２ヶ月が経過した後に収得した血清内の目的タンパク質の特異抗体力価を測定した図であって、まず、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅにＨｕｍａｎ ＲｏｔａｖｉｒｕｓであるＷａ Ｓｔｒａｉｎ自体を吸着させた後に接種動物の血清を反応させる酵素結合免疫沈降分析法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ））で分析した結果である。
図６の（ｅ）は、目的タンパク質が受容体であるＨＢＧＡと結合する能力を測定するためにＨＢＧＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ構成要素及び分析過程を示した図であり、 図６の（ｆ）は、目的タンパク質と受容体（Ｌｅｄ（Ｈ ｔｙｐｅ１））の間の結合を測定した結果である。
図６の（ｇ）は、エンカプスリンと目的タンパク質の融合タンパク質により形成されたＶＬＰを接種した動物実験群の血清内の目的タンパク質の特異抗体が目的タンパク質と受容体の間の結合を阻害する能力を測定するためのＨＢＧＡ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｓｓａｙ構成要素及び分析過程を示した図であり、 図６の（ｈ）は、目的タンパク質と受容体（Ｌｅｄ（Ｈ ｔｙｐｅ１））の間の結合が免疫血清により阻害される程度を測定した結果であり、 図６の（ｉ）は、これを各実験群の免疫血清が目的タンパク質と受容体間の結合を５０％阻害する希釈倍数（ＢＴ５０）を測定した値である。
図７の（ａ）は、本発明の実施例によるヒトパピローマウイルスのアミノ酸の配列を有するペプチドであるＥ７ ＬＰとエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド及びこれによって製造されたワクチンの模式図である。 図７の（ｂ）は、図７の（ａ）に該当する発現ベクターの構造を示し、発現量及び水溶性増進融合パートナーであるＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ及びＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅの効率のための追加配列を挿入したｐＥＴ９ａ－ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ Ｅ７ ＬＰのベクター構造のイメージである。発現量及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤを適用したとき、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質の融合発現に及ぼす影響を図７の（ｃ）及び図７の（ｄ）の結果を通じて確認した。 図７の（ｃ）は、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、ＨＰＶ）Ｔｙｐｅ１６の抗原であるＥ７ ＬＰがＣ末端に結合したＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｅ７組換えタンパク質（サイズ３６．１ｋＤａ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 図７の（ｄ）は、ＲＩＤをＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＨＰＶ Ｅ７ ＬＰのＮ－末端に追加した後に発現してタンパク質の水溶性及び発現量の変化をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果である。これを通じて、ロタウイルスと同様にヒトパピローマウイルスの抗原をＣ－末端に追加した場合でも融合パートナーであるＲＩＤの必要性を確認した。
図８の（ａ）は、本発明の実施例によって発現されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＨＰＶ Ｅ７ ＬＰタンパク質をニッケル親和性クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図８の（ｂ）は、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＨＰＶ Ｅ７ ＬＰタンパク質の分離様相をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果である。 図８の（ｃ）は、ニッケル親和性クロマトグラフィーでＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＨＰＶ Ｅ７ ＬＰタンパク質融合体をイオン樹脂交換クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図８の（ｄ）は、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＨＰＶ Ｅ７ ＬＰタンパク質の精製様相をＳＤＳＰＡＧＥで確認した結果である。
図９の（ａ）は、本発明で進行されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＨＰＶ Ｅ７ ＬＰタンパク質の発現からＴＥＶ酵素処理及びイオン交換樹脂クロマトグラフィーに至るまでの精製過程での融合タンパク質の精製様相及び純度を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 図９の（ｂ）は、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質－目的タンパク質融合体のＶＬＰの全体的な直径分布を確認するためにＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を通じて分析した結果を示した図である。 図９の（ｃ）は、精製された透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を通じて表面に目的タンパク質が表出されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤の融合タンパク質のＶＬＰの全体的な外形を確認した結果である。
図１０の（ａ）は、本発明の実施例によるコロナウイルスＲＢＤ抗原を表出するエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のウイルス様粒子を製造するために発現量及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤと適正配列の酵素切断部位及び連結部位をＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ ＣｏＶ ＲＢＤ融合タンパク質に適用して発現する戦略を示した図である。 図１０の（ｂ）は、図１０の（ａ）に該当する発現ベクターの構造を示し、発現量及び水溶性の増進融合パートナーであるＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ及びＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅ効率のための追加配列を挿入したｐＥＴ９ａ－ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ１－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ２－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ＲＢＤのベクター構造に該当する。
図１１は、発現量及び水溶性増進融合パートナーであるＲＩＤの適用有無によるエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）と目的タンパク質の融合タンパク質の水溶性発現に及ぼす影響を確認した結果である。エンカプスリンのＣ末端にコロナウイルス（２０１９－ｎＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＣｏＶ）の抗原であるＲＢＤ（サイズ２３．６ｋＤａ）を融合したタンパク質の場合、タンパク質は不溶性発現様相を示す一方、そのＮ－末端にＲＩＤを融合して発現させれば大部分が水溶性で発現することを確認した結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて確認した。
図１２の（ａ）は、本発明の実施例によって発現されたＲＩＤ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質（サイズ６６．４ｋＤａ）をニッケル親和性クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図１２の（ｂ）は、ＲＩＤ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質の分離様相をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果である。 図１２の（ｃ）は、ニッケル親和性クロマトグラフィーでＮ－末端のＲＩＤとＴＥＶ切断部位を分離してＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質融合体を精製したときのクロマトグラム結果であり、 図１２の（ｄ）は、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質をＴＥＶ酵素処理及び２次ニッケル親和性クロマトグラフィーに至るまでの精製過程での融合タンパク質の精製様相及び純度を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 図１２の（ｅ）は、ニッケル親和性クロマトグラフィーでＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質融合体をイオン交換樹脂クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図１２の（ｆ）は、融合タンパク質の精製様相及び純度を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。
図１３の（ａ）は、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質－目的タンパク質融合体のＶＬＰの全体的な直径分布を確認するためにＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を通じて分析した結果を示した図である。 図１３の（ｂ）は、精製された透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を通じて表面に目的タンパク質が表出されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤の融合タンパク質のＶＬＰの全体的な外形を確認した結果である。
図１４の（ａ）は、本発明の実施例によるデングウイルスのＥＤＩＩＩ抗原タンパク質を表出するエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質基盤のウイルス様粒子及びこれによって製造されたワクチンの模式図である。 図１４の（ｂ）は、図１４（ａ）に該当する発現ベクターの構造を示し、発現量及び水溶性の増進融合パートナーであるＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ及びＴＥＶ Ｃｌｅａｖａｇｅの効率のための追加配列を挿入したｐＥＴ９ａ－ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ１－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ２－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３－Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ＥＤＩＩＩベクター構造のイメージである。発現量及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤを適用したとき、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質の融合発現に及ぼす影響を図１５及び図１６の結果を通じて確認した。
図１５は、発現量及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤの適用有無によるエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）と目的タンパク質の融合タンパク質の水溶性発現に及ぼす影響を確認した結果である。エンカプスリンのＣ末端にデングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ、ＤＥＮＶ）の抗原であるＥＤＩＩＩ（サイズ１１．４ｋＤａ）を融合したタンパク質の場合、タンパク質は不溶性発現様相を示す一方、そのＮ－末端にＲＩＤを融合して発現させると大部分が水溶性で発現することを確認した結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて確認した。
図１６の（ａ）は、本発明の実施例によって発現されたＲＩＤ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩタンパク質（サイズ５３．１ｋＤａ）をニッケル親和性クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図１６の（ｂ）は、ＲＩＤ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩタンパク質の分離様相をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果である。 図１６の（ｃ）は、ニッケル親和性クロマトグラフィーでＮ－末端のＲＩＤとＴＥＶ切断部位を分離してＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩタンパク質融合体を精製したときのクロマトグラム結果であり、 図１６の（ｄ）は、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩタンパク質をＴＥＶ酵素処理及び２次ニッケル親和性クロマトグラフィーに至るまでの精製過程での融合タンパク質の精製様相及び純度を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 図１６の（ｅ）は、ニッケル親和性クロマトグラフィーでＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩタンパク質融合体をイオン交換樹脂クロマトグラフィーを通じて精製したときのクロマトグラム結果であり、 図１６の（ｆ）は、融合タンパク質の精製様相及び純度を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。
図１７の（ａ）は、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質－目的タンパク質融合体のＶＬＰの全体的な直径分布を確認するためにＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を通じて分析した結果を示した図である。 図１７の（ｂ）は、精製された透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を通じて表面に目的タンパク質が表出されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤の融合タンパク質のＶＬＰの全体的な外形を確認した結果である。
以下、本発明の好ましい実施例を詳しく説明する。本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する後述する実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示する実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現され得、ただし、本実施例は、本発明の開示が完全となるようにし、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義される。明細書全体にわたって同一参照符号は同一構成要素を指称する。
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術及び科学的用語を含む）は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者が共通的に理解できる意味で使用され得る。また、一般的に使用される辞典に定義されている用語は、明白に別に定義されていない限り、理想的に又は過度に解釈されない。本明細書で使用された用語は、実施例を説明するためのものであり、本発明を制限しようとするものではない。本明細書で、単数形は文句で別に言及しない限り、複数形も含む。
本発明は、エンカプスリンタンパク質及び目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む、ワクチン生産用組換え発現ベクターを提供する。
本明細書で「エンカプスリンタンパク質」は、目的タンパク質に融合されて一緒に発現することによってタンパク質の発現効率を増進させ得る。本発明の一実施例によると、前記エンカプスリンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列又はその一部配列を含む。
本発明に用いられたエンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓなどから収得し得、最も好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから収得し得る。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから収得したエンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質を用いる場合、小さいサイズのパーティクル（ｐａｒｔｉｃｌｅ）を形成することができるので、ワクチンとして使うのに一層有利である。
本発明のエンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、約６０余個が自己組織化されて直径３０～３２ｎｍサイズのパーティクル（ｐａｒｔｉｃｌｅ）を形成することができる。これは、ｐＨ変化と温度変化にも安定的な形態を維持し得るという長所がある。したがって、多様なカーゴ（ｃａｒｇｏ）タンパク質又は物質を搭載し得、露出された表面ｄｏｍａｉｎ（好ましくは、Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）に多様な抗原を付着し得る。本発明の一実施例によって製造された組換え発現ベクターは、エンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質を用いることによって、バクテリア以外に多様な酵母又は培養細胞でも発現、自己組織化が可能である。
本明細書で用いられた用語「目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、当業者が大量に生産しようとするタンパク質であって、組換え発現ベクターに前記タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを挿入して宿主細胞で発現可能なタンパク質を意味する。
本発明の一実施例によると、前記目的タンパク質は、ウイルス抗原タンパク質、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清及び細胞タンパク質を含む。本発明の好ましい一実施例によると、前記ウイルス抗原タンパク質は、配列番号２～配列番号１０の遺伝子配列のうちいずれか一つの遺伝子配列又はその一部配列を含む。
本発明によると、目的タンパク質に該当するウイルス抗原タンパク質には、ロタウイルス抗原タンパク質、子宮頸部癌ウイルス抗原タンパク質が含まれるが、これに制限されるものではない。例えば、アミノ酸１０個～３００個のサイズを有する抗原タンパク質であってもよく、好ましくは、アミノ酸２０個～２５個サイズのウイルス抗原タンパク質であってもよい。
本発明の他の実施例によると、目的タンパク質に該当するウイルス抗原タンパク質には、コロナウイルス抗原タンパク質及びデングウイルス抗原タンパク質が含まれるが、これに制限されるものではない。例えば、アミノ酸１０個～３００個のサイズを有する抗原タンパク質であってもよく、好ましくは、アミノ酸２０個～２２３個サイズのウイルス抗原タンパク質であってもよい。
本発明において、前記デングウイルスは、血清型によって４種以上の抗原タンパク質を形成することができ、例えば、下記配列番号５（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ１ ＥＤＩＩＩ（ＫＰ４０６８０４．１））、配列番号６（Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ２ ＥＤＩＩＩ（ＥＦ６５４１１０．１））、配列番号７（Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ３ ＥＤＩＩＩ（ＫＰ４０６８０５．１)）、配列番号８（（Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ４ ＥＤＩＩＩ（ＫＰ４０６８０６．１））で表示されたものと同じである。
本明細書で用いられた用語「発現ベクター」は、発現ベクターの伝写に提供される追加断片に作動可能に連結された目的（ターゲット）タンパク質を暗号化する断片で構成される線形又は円形のＤＮＡ分子である。そのような追加断片は、プローモーター及び終了暗号配列を含む。発現ベクターは、一つ以上の複製開始点、一つ以上の選択マーカーなどをさらに含む。発現ベクターは、一般的に、プラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導するか、両方の要素を全て含む。本明細書で用いられた用語「作動可能に連結された」は、プローモーターで伝写が開始して暗号化配列を通じて終了暗号として進行するのに作用するように断片が配列されることを示す。
本発明による発現ベクターにおいて、前記発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ粒子又はゲノム挿入物であってもよい。前記発現ベクターは、宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムと関係なく複製されるか宿主細胞のゲノム内に統合され得る。
また、本発明は、目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含む、ワクチン生産用組換え発現ベクターを提供する。本発明の一実施例によると、前記ポリヌクレオチドは、「リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）」を追加でコーディングすることができ、前記目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質の間には、それぞれ少なくとも一つのリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）タンパク質が位置することができる。前記リンカーのアミノ酸配列には、少なくとも一つのグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）が含まれ得、前記リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９又は２０の遺伝子配列が含まれ得る。前記リンカーそれぞれの位置は、限定されないが、エンカプスリンタンパク質と抗原タンパク質の間に配列番号１７～配列番号２０の遺伝子配列を含むリンカータンパク質が位置することが好ましい。本発明で「Ｌｉｎｋｅｒ３」は、配列番号１７で表示されるｌｉｎｋｅｒ３－１、配列番号１８で表示されるｌｉｎｋｅｒ３－２、配列番号１９で表示されるｌｉｎｋｅｒ３－３又は配列番号２０で表示されるＬｉｎｋｅｒ３－４であってもよく、好ましくは、アミノ酸配列「ＧＧＧＳＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＳ」を含むことができる。
本明細書で用いられた用語「ＲＩＤ」、「ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ」、「Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｐｐｅｎｄｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｌｙｓｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ」又は「ＬｙｓＲＳ ＲＮＡ結合ドメイン（ＬｙｓＲＳ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」は、ＬｙｓＲＳのＲＮＡとその他タンパク質の間の相互作用に関与する固有のＮ－末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）延長部位を意味する。
本発明の一実施例によると、前記ＲＩＤタンパク質は、前記ワクチンの発現量増加又は水溶性を増加させるための融合パートナーとして用いられ得る。
本発明の好ましい一実施例によると、前記ＲＩＤタンパク質は、ワクチンの発現量を増加させるためのドメイン（以下、ＥＥドメイン）及び水溶性を増加させるためのドメイン（以下、ＳＥドメイン）を含むことができる。例えば、前記ＥＥドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことができ、前記ＳＥドメインは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことができる。
本発明のワクチン生産用組換え発現ベクターにおいて、タンパク質切断酵素は、ＴＥＶであってもよい。
本発明の好ましい一実施例によると、目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドは、ＲＩＤの切断のためにＴＥＶタンパク質をコーディングすることができる。
また、本発明は、前記発現ベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
本明細書で用いられた用語「形質転換」又は「導入」は、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子として又は染色体統合完成により複製可能となることを意味する。本発明による発現ベクターを形質転換させる方法は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）法、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリボソーム法又は酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明による宿主細胞において、前記宿主細胞は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が好ましく、原核及び真核を含む全ての微生物が用いられ得る。好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。
また、本発明は、目的タンパク質及びエンカプスリンタンパク質を含む融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、ＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質をさらに含むことができる。
本明細書で用いられた用語「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、目的タンパク質配列のＮ－末端又はＣ－末端に他のタンパク質が連結されるか他のアミノ酸配列が付加したタンパク質を意味する。本発明の好ましい一実施例によると、前記目的タンパク質は、エンカプスリンタンパク質のＣ－末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）に連結され得る。また、本発明で前記融合タンパク質は、本発明の組換え発現ベクターにより生産されたワクチンであってもよい。
本発明の一実施例によると、前記組換え発現ベクターを用いて融合タンパク質を形成することができ、前記融合タンパク質は、それ自体として、又は任意の追加工程を経てワクチンに用いられ得る。
本発明によるエンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、目的タンパク質の発現効率を向上させ得、また、水溶性の増進タンパク質としてよく知られているＲＩＤに前記エンカプスリンタンパク質を結合した融合タンパク質は、目的タンパク質の発現効率だけでなく水溶性を向上させることによって、融合タンパク質の生産に有用に用いられ得る。
本発明のまた他の実施例によると、ａ）目的タンパク質；エンカプスリンタンパク質；をコーディングするポリヌクレオチドを含むウイルスワクチン生産用組換え発現ベクターを生産する段階、ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を生産する段階及びｃ）前記形質転換体を培養して組換え融合タンパク質の発現を誘導し、これを収得する段階を含むワクチン生産方法を提供される。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。
これら実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界において通常の知識を有して者において自明である。
＜実施例１＞
エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）を含む融合タンパク質の製造
＜実施例１－１＞
エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）を含む融合タンパク質の高効率生産のために、図１の（ａ）のタンパク質構造を有するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ Ｍａｒｉｔａｍａ由来のＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＣ＿０００８５３、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：ＷＰ＿００４０８０８９８．１））遺伝子配列が用いられた（配列番号１）。前記遺伝子配列に基づいて大腸菌でコドン最適化後に合成された遺伝子配列を製造した（配列番号１）。（実施例１－１の前記遺伝子配列は、(株)バイオニクスにＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ遺伝子合成を依頼して製造した。）その後、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）の精製目的として配列番号１７と同じ配列の連結部位（ｌｉｎｋｅｒ）をＣ－末端に挿入した（アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳ（配列番号１７）、（ＨＨＨＨＨＨ：６ｘＨＩＳ ｔａｇに該当するアミノ酸））。前記製造された複合体は、「Ｅｎｃ」と名付ける。前記配列の遺伝子は、ｐＥＴ－９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、６９４３１－３ＣＮ）（配列番号１１）発現ベクターのＭＣＳ内に存在する切断酵素であるＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いて挿入した。
＜実施例１－２＞
前記実施例１－１で製作された発現ベクターをＨＭＳ１７４ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＲｅｃＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｋ－１２ ｓｔｒａｉｎ、Ｃａｔ：６９４５３－３））に形質転換した。全ての形質転換された大腸菌は、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれた３ｍｌのＬＢ培地で、３７℃で２５０ｒｐｍで５－７時間培養した後、１ｍｌを１０ｍｌに移して１０倍希釈した後に追加培養した。約２－４時間後、Ｏ．Ｄ６００ ０．８～０．９に到逹したとき、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、Ｃａｔ＃I１００６、Ｌｏｔ＃ＬＢ０Ｃ０３４０、ｃａｓ＃３６７－９３－１）を添加した後、１６℃で１７－１９時間（最大２１時間）の間培養した。培養液は、遠心分離を通じて沈澱された大腸菌のみを収得して－８０℃の超低温で冷凍保管した。３ｍｌの培養培地に該当する大腸菌収穫物に０．３ｍｌの溶解緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を入れて超音波粉砕した後、全体溶解物（Ｔ、Ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ）を遠心分離を通じて沈殿物（Ｐ、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）と上澄液（Ｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｌｙｓａｔｅ）に分離した後、分離されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
図１は、実施例１－１によるエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質生産用組換え発現ベクターの模式図と高効率の水溶性タンパク質の発現結果である。図１の（ａ）は、ＰＤＢを用いてエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）の予測されるタンパク質構造であり、図１の（ｂ）は、ｐＥＴ９ａ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ組換え発現ベクターの構造を示した模式図である。図１の（ｃ）に示したように、前記発現ベクターを用いてエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の高効率水溶性発現有無をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。実施例１－１及び１－２によって発現されたタンパク質は、３２．１ｋＤａのサイズで大腸菌で水溶性発現されたことが確認できた。
＜実施例１－３＞
実施例１－２と同一の方式の培養方法を用いて５００ｍｌの大腸菌を培養及び発現を誘導して収得した細胞を、７５ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［Ａバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で再懸濁した。前記細胞再懸濁物を超音波細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ：ｐｕｌｓｅ ３ｓ／１７ｓ、３５％ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ、１ｍｉｎ ３０ｓ、４ｔｉｍｅｓ ｔｏｔａｌ）を用いて細胞を粉砕させた。前記溶解された細胞を４℃で１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離、上層液を取ってＡＫＴＡ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＮｉ＋－親和クロマトグラフィーを行った。まず、陽イオン－交換樹脂カラムであるＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ、５ｍＬ ｓｉｚｅ）カラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で平衡化させた後、水溶性タンパク質を含む水溶性溶解液を１ｍｌ／分の流速で前記平衡化されたカラムに積載した。エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の精製は、緩衝液Ａ及び１Ｍのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び１Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を用いてイミダゾールが１０ｍＭ～１Ｍの濃度範囲で線形濃度勾配で増加注入される形態で行われ、これを通じて、それぞれ２ｍｌずつの分画を収得した。
図２の（ａ）及び図２の（ｂ）に示したように、前記溶出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じてエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の分離様相を確認した後、当該分画の溶出物を透析バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で９℃で１８時間の間透析した。
１次精製及びＤｉａｌｙｓｉｓ以後のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質がＶＬＰを形成するか否かを確認するための生化学的分析を行い、クロマトグラフィー（Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。前記の透析により収得したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、ＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイオン交換樹脂クロマトグラフィーで精製した。カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ、１ｍＬ ｓｉｚｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）は、緩衝溶液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で平衡化し、１ｍｌ／分の流速でローディングした。エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、１０ｍＭ～１Ｍの線形濃度勾配を有するＮａＣｌを注入して溶出し、緩衝溶液Ａと緩衝溶液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を通じて線形濃度勾配を通じた精製を進行し、それぞれ１ｍｌずつの分画を収得した。
線形濃度勾配（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ：１０ｍＭ→１Ｍ ＮａＣｌ）を通じたイオン交換樹脂クロマトグラフィーを通じて大腸菌由来の他のタンパク質などが精製された融合タンパク質を獲得した（図２の（ｃ）及び図２の（ｄ））。精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の割合を含む状態で４℃で保管した。
追加的に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いた精製を進行した。分析は、ＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実験を行った（図３の（ａ）及び図３の（ｂ））。前記用意したサンプルを透析溶液と同一の条件の緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で平衡化したゲル－濾過カラム（ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））に通過して溶出させた。サイズ排除クロマトグラフィーの溶出パターンは、２８０ｎｍの波長で測定し、Ｕｎｉｃｏｒｎプログラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて収集した。
図３（ｂ）に示したように、大腸菌で高効率で水溶性発現されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の最終精製を確認し、最終的に精製されたタンパク質の濃度は、ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて定量した。
＜実施例１－４＞
精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質を含む融合タンパク質（ＶＬＰ）の全体的な直径分布を確認するために動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を通じて分析した。前記複合体の分析は、ＤＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｆａｍｉｌｙ）を用いて１６℃の温度条件でサンプル１ｍLをＣｕｖｅｔｔｅに入れて測定した。細胞の動的光散乱分析は、イメージで各領域別ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ及びＭａｓｓなどを用いて確認した。図３の（ｃ）及び図３の（ｄ）のように、ＤＬＳのＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｄｉｕｓでの直径が野生型エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）が示す３０～４０ｎｍと類似するサイズで示されることを確認した。
＜実施例１－５＞
精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質を含む融合タンパク質（ＶＬＰ）の外形を電子顕微鏡で観察した。精製されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ ＶＬＰをまず銅グリッドに１分間載せた後、２％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて１分間染色し、１０分間常温で乾燥した後に透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１２０ｋＶ）；Ｔａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ、ＦＥＩ、Ｃｚｅｃｈ）を用いて撮影した。前記得られた結果、図３の（ｅ）に示したように、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質がＶＬＰを形成することが確認できた。確認されたＶＬＰの直径は、３０～４０ｎｍの間で確認された。これは、野生型エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）の直径と類似することが確認できた。
＜実施例２＞
高効率及び水溶性の増進のためのＮ－末端の発現量及び水溶性の増進パートナーを追加したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）ロタウイルス抗原複合体の製造
＜実施例２－１＞
Ｃ－末端に目的タンパク質を付着したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質融合タンパク質で構成されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のウイルス様粒子を作るために、ロタウイルス抗原であるＶＰ８＊（ＶＰ８ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ）を挿入した。挿入されたロタウイルスには、Ｒｏｔａ ｖｉｒｕｓ Ｇ１Ｐ［８］由来のＶＰ８ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ（Ｈｕｍａｎ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ Ａ ｓｔｒａｉｎ Ｗａ Ｇ１Ｐ［８］、（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓ ｎｕｍｂｅｒ：ＦＪ４２３１１６）遺伝子が用いられた（配列番号２）。ロタバイロスの抗原であるＶＰ８＊は、１５９個のアミノ酸で構成されており、タンパク質の分子量は、約１８．３ｋＤａに該当する。前記タンパク質配列に基づいて大腸菌でコドン最適化後に合成された遺伝子配列を製造した（配列番号２）。（株）バイオニクスにエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）遺伝子の合成依頼）
図４の（ａ）では、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質のＮ－末端に発現量増加及び水溶性増加の効能があるＭＳＡＶＫＡＡ（配列番号１２）とＲＩＤペプチド（配列番号１３）及び５０％以上類似する突然変異ＲＩＤペプチド（配列番号１４）を融合した組換えタンパク質を製造して水溶性発現様相を検証した。
また、ＴＥＶ切断部位の配列であるＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓを応用して最適化した配列の連結部位（Ｌｉｎｋｅｒ）として、アミノ酸配列が（ＧａＳｂ）ｎ（ａ≧１、ｂ≧１、ｎ≧１）であるペプチドを用い、これをＴＥＶ ｃｌｅａｖａｇｅ配列と前記融合タンパク質配列の間に入れた。本実施例で製作された融合タンパク質発現ベクターの模式図は、図４の（ｂ）の通りである。
前記配列の遺伝子は、ｐＥＴ－９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、６９４３１－３ＣＮ）（配列番号１１）発現ベクターを用いて前記例１で製作した組換え複合体タンパク質発現ベクターであるｐＥＴ－９ａ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ ｖｅｃｔｏｒを基盤として製作された。Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅがＩＰＴＧにより発現され、これを通じてＤＥ３ゲノム上に存在するＬａｃオペロンとＴ７プローモーターが作動するｐＥＴ ｖｅｃｔｏｒのＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ；多重クローニング部位）に挿入された既存のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）複合体タンパク質のベクター配列のＮ－末端に水溶性及び発現率の増加のためのＲＩＤ配列を追加し、ＴＥＶ切断効率を増進させるために連結部位配列を追加した。ｐＥＴ９ａ ｖｅｃｔｏｒにＮｄｅ１及びＫｐｎＩとＢａｍＨＩ切断酵素を用いて切り取りサブクローニングして再挿入した。ＭＣＳ内部に存在する切断酵素部位のうちＮｄｅＩとＫｐｎＩ配列の間に本研究のＲＩＤと連結部品（Ｌｉｎｋｅｒ１）、切断酵素部位及びＴＥＶ酵素の切断効率を高めるための連結部位（Ｌｉｎｋｅｒ２）を挿入し、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ切断酵素の間にエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）とロタバイロス抗原タンパク質が融合された形態のタンパク質を有するように構成されたＤＮＡ配列をそれぞれ挿入し、それぞれの遺伝子は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を通じてｐＥＴベクターと挿入遺伝子配列を連結させ、これらのＤＮＡの連結反応により発生したバクテリアクローンは、ＤＮＡ配列分析を通じてコドン最適化されたヌクレオチドの配列が挿入されることを確認した。
実施例２－１で製造された組換え複合体発現ベクターの配列は、次のとおりである。
ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＰ８＊［（配列番号１）－（配列番号１７）－（配列番号２）］
：ＭＥＦＬＫＲＳＦＡＰＬＴＥＫＱＷＱＥＩＤＮＲＡＲＥＩＦＫＴＱＬＹＧＲＫＦＶＤＶＥＧＰＹＧＷＥＹＡＡＨＰＬＧＥＶＥＶＬＳＤＥＮＥＶＶＫＷＧＬＲＫＳＬＰＬＩＥＬＲＡＴＦＴＬＤＬＷＥＬＤＮＬＥＲＧＫＰＮＶＤＬＳＳＬＥＥＴＶＲＫＶＡＥＦＥＤＥＶＩＦＲＧＣＥＫＳＧＶＫＧＬＬＳＦＥＥＲＫＩＥＣＧＳＴＰＫＤＬＬＥＡＩＶＲＡＬＳＩＦＳＫＤＧＩＥＧＰＹＴＬＶＩＮＴＤＲＷＩＮＦＬＫＥＥＡＧＨＹＰＬＥＫＲＶＥＥＣＬＲＧＧＫＩＩＴＴＰＲＩＥＤＡＬＶＶＳＥＲＧＧＤＦＫＬＩＬＧＱＤＬＳＩＧＹＥＤＲＥＫＤＡＶＲＬＦＩＴＥＴＦＴＦＱＶＶＮＰＥＡＬＩＬＬＫＦ－ＧＧＧＳＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＬＤＧＰＹＱＰＴＴＦＴＰＰＴＤＹＷＩＬＩＮＳＮＴＮＧＶＶＹＥＳＴＮＮＳＤＦＷＴＡＶＩＡＶＥＰＨＶＮＰＶＤＲＱＹＮＶＦＧＥＮＫＱＦＮＶＲＮＤＳＤＫＷＫＦＬＥＭＦＲＧＳＳＱＮＤＦＹＮＲＲＴＬＴＳＤＴＲＬＶＧＩＬＫＹＧＧＲＩＷＴＦＨＧＥＴＰＲＡＴＴＤＳＳＮＴＡＮＬＮＧＩＳＩＴＩＨＳＥＦＹＩＩＰＲＳＱＥＳＫＣＮＥＹＩＮＮＧＬ
前記製造された複合体は、「ＥＮＣ－ＶＰ８＊」と名付けた。
ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ１－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ２－ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ３－ＶＰ８＊［（配列番号１２）－（配列番号１４）－（配列番号１５）－ＴＥＶ－（配列番号１６）－（配列番号１）－（配列番号１７）－配列番号２］］
：ＭＳＡＶＫＡＡＡＡＶＱＡＡＥＶＫＶＤＧＳＥＰＫＬＳＡＮＥＬＡＡＲＬＡＡＥＡＡＶＡＥＡＥＡＡＱＡＥＬＳＥＫＱＬＳＱＡＴＡＡＡＴＮＨＴＴＤＮＧＶＧＰＥＥＥＳＶＧＧＧＳＧＧＧＳ－ＥＮＬＹＦＱ－ＧＳＧＳＧＳＭＥＦＬＫＲＳＦＡＰＬＴＥＫＱＷＱＥＩＤＮＲＡＲＥＩＦＫＴＱＬＹＧＲＫＦＶＤＶＥＧＰＹＧＷＥＹＡＡＨＰＬＧＥＶＥＶＬＳＤＥＮＥＶＶＫＷＧＬＲＫＳＬＰＬＩＥＬＲＡＴＦＴＬＤＬＷＥＬＤＮＬＥＲＧＫＰＮＶＤＬＳＳＬＥＥＴＶＲＫＶＡＥＦＥＤＥＶＩＦＲＧＣＥＫＳＧＶＫＧＬＬＳＦＥＥＲＫＩＥＣＧＳＴＰＫＤＬＬＥＡＩＶＲＡＬＳＩＦＳＫＤＧＩＥＧＰＹＴＬＶＩＮＴＤＲＷＩＮＦＬＫＥＥＡＧＨＹＰＬＥＫＲＶＥＥＣＬＲＧＧＫＩＩＴＴＰＲＩＥＤＡＬＶＶＳＥＲＧＧＤＦＫＬＩＬＧＱＤＬＳＩＧＹＥＤＲＥＫＤＡＶＲＬＦＩＴＥＴＦＴＦＱＶＶＮＰＥＡＬＩＬＬＫＦ－ＧＧＧＳＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＬＤＧＰＹＱＰＴＴＦＴＰＰＴＤＹＷＩＬＩＮＳＮＴＮＧＶＶＹＥＳＴＮＮＳＤＦＷＴＡＶＩＡＶＥＰＨＶＮＰＶＤＲＱＹＮＶＦＧＥＮＫＱＦＮＶＲＮＤＳＤＫＷＫＦＬＥＭＦＲＧＳＳＱＮＤＦＹＮＲＲＴＬＴＳＤＴＲＬＶＧＩＬＫＹＧＧＲＩＷＴＦＨＧＥＴＰＲＡＴＴＤＳＳＮＴＡＮＬＮＧＩＳＩＴＩＨＳＥＦＹＩＩＰＲＳＱＥＳＫＣＮＥＹＩＮＮＧＬ
上記製造された複合体は、「ＲＩＤ－ＥＮＣ－ＶＰ８＊」と名付けた。
＜実施例２－２＞
前記実施例２－１で製作された発現ベクターをＨＭＳ１７４ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＲｅｃＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｋ－１２ ｓｔｒａｉｎ、Ｃａｔ：６９４５３－３））に形質転換した。全ての形質転換された大腸菌は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれた３ｍｌのＬＢ培地で３７℃で２５０ｒｐｍで５－７時間培養した後、１ｍｌを１０ｍｌに移して１０倍希釈した後に追加培養した。約２－４時間後にＯ．Ｄ６００ ０．８～０．９に到逹したとき、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、Ｃａｔ＃I１００６、Ｌｏｔ＃ＬＢ０Ｃ０３４０、ｃａｓ＃３６７－９３－１）を添加した後、１６℃で１７－１９時間（最大２１時間）の間培養した。培養液は、遠心分離を通じて沈澱された大腸菌のみを収得して－８０℃の超低温で冷凍保管した。３ｍｌの培養培地に該当する大腸菌収穫物に０．３ｍｌの溶解緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を入れて超音波粉砕した後、全体溶解物（Ｔ、Ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ）を遠心分離を通じて沈殿物（Ｐ、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）と上澄液（Ｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｌｙｓａｔｅ）に分離した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。その結果は、図４の（ｃ）に示した通りである。実施例２－１で製作した組換えエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、大腸菌で高効率水溶性が発現されたことが確認できた。Ｅｎｃ－ＶＰ８＊とＲＩＤ－ＥＮＣ－ＶＰ８＊もそれぞれのサイズに該当する適切な位置で発現されたことを確認した。しかし、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）にロタウイルス抗原が融合されたタンパク質は、５０．３ｋＤａのサイズでＣ－末端に一定サイズ以上のペプチド又はタンパク質を融合して発現させる場合、融合タンパク質の水溶性が著しく減少することが確認できた。したがって、外部抗原タンパク質をＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ Ｍａｒｉｔａｍａ由来のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のＣ－末端に融合発現を通じて最終的に外部抗原が表面に露出されたＶＬＰ重合体を製造するためには、まず、融合タンパク質の高発現及び水溶性を顕著に増加させる水溶性発現標識因子（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔａｇ）が必須的に要求される。本発明では、高い発現量と水溶性を顕著に増加させるＲＩＤ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）を水溶性発現標識因子としてエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のＮ－末端に融合してそのＣ－末端に大きい分子量の（約１８ｋＤａ以上）の外部抗原を融合した融合タンパク質の高効率水溶性発現を試みた。その結果として、図４の（ｃ）に示したように、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）の単一タンパク質を発現した場合には、タンパク質が高い水溶性を有するが、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のＣ－末端に抗原タンパク質を融合した場合には、本実施例の水溶性標識発現因子をＮ－末端に追加して発現した場合にのみ水溶性が大きいタンパク質を得ることを確認した。また、酵素切断配列の後に適切な長さと配列の連結部位配列を追加したとき、ＴＥＶ酵素の切断効率が９０％以上と高くなって後続精製過程で高い収率の最終タンパク質の精製が可能となった。
＜実施例２－３＞
高効率の水溶性発現が確認された前記実施例２－２と同一の方式の培養方法を用いて５００ｍｌの大腸菌を培養及び発現を誘導して収得した細胞を７５ｍｌの溶解緩衝溶液［Ａバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で再懸濁した。前記細胞再懸濁物を超音波細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ：ｐｕｌｓｅ ３ｓ／１７ｓ、３５％ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ、１ｍｉｎ ３０ｓ、４ｔｉｍｅｓ ｔｏｔａｌ）を用いて細胞を粉砕した。前記溶解された細胞を４℃で１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層液を取ってＡＫＴＡ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＮｉ＋－親和クロマトグラフィーを行った。まず、陽イオン－交換樹脂カラムであるＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ、５ｍＬ ｓｉｚｅ）カラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で平衡化させた後、水溶性タンパク質を含む水溶性溶解液を１ｍｌ／分の流速で前記平衡化されたカラムに積載した。ＲＩＤＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ－ＶＰ８＊タンパク質の精製は、緩衝液Ａ及び１Ｍのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び１Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を用いてイミダゾールが１０ｍＭ～１Ｍの濃度範囲で線形濃度勾配で増加注入される形態で行い、これを通じて、それぞれ２ｍｌずつの分画を収得した。
前記溶出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて目的（ターゲット）タンパク質の分離様相を確認した後、該当分画の溶出物をＤｉａｌｙｓｉｓバッファー（［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０］）で９℃で１２－１６時間の間透析した。このとき、４時間の間先に透析した後、残り８－１２時間の間ＴＥＶ切断酵素を用いてＮ－末端の融合パートナーであるＲＩＤとエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質とロタウイルス抗原が融合された融合タンパク質を間を切断した。
ＩＭＡＣ及びＤｉａｌｙｓｉｓ以後のＥＮＣ－ＶＰ８＊タンパク質がＶＬＰを形成したか否かを確認するための生化学的分析を行い、後続精製のためにＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。前記の透析により収得したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、ＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイオン交換樹脂クロマトグラフィーで精製した。カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ、１ｍＬ ｓｉｚｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）は、緩衝溶液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で平衡化され、１ｍｌ／分の流速でローディングした。ＥＮＣ－ＶＰ８＊タンパク質は、１０ｍＭ～１Ｍの線形濃度勾配を有するＮａＣｌを注入して溶出し、緩衝溶液Ａと緩衝溶液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を通じて線形濃度勾配を通じた精製を進行し、それぞれ１ｍｌずつの分画を収得した。これを通じて、大腸菌由来の他のタンパク質などが精製された融合タンパク質を獲得した（図４の（ｄ））。精製されたＥＮＣ－ＶＰ８＊タンパク質は、２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の割合を含む状態で４℃で保管し、最終的に精製されたタンパク質の濃度は、ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて定量した。
＜実施例２－４＞
実施例２－３のＥＮＣ－ＶＰ８＊融合タンパク質で構成された融合タンパク質（ＶＬＰ）の全体的な直径分布を確認するために動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を通じて分析した。前記複合体の分析は、ＤＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｆａｍｉｌｙ）を用いて１６の温度条件でサンプル１ｍＬをＣｕｖｅｔｔｅに入れて測定した。細胞の動的光散乱分析は、イメージで各領域別ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ及びＭａｓｓなどを用いて確認した。図５の（ａ）のように、ＤＬＳのＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｄｉｕｓでの直径３０～４０ｎｍのＰａｒｔｉｃｌｅサイズの分布を有することを確認した。
＜実施例２－５＞
精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質からなるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の外形を電子顕微鏡で観察した。精製されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ ＶＬＰをまず銅グリッドに１分間載せた後、２％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて１分間染色し、１０分間常温で乾燥した後に透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１２０ｋＶ）；Ｔａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ、ＦＥＩ、Ｃｚｅｃｈ）を用いて撮影した。図５の（ｂ）に示したように、精製されたＥＮＣ－ＶＰ８＊タンパク質がＶＬＰを形成することが確認できた。確認されたＶＬＰの直径は、既存のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の直径である３０～４０ｎｍ間で示され、Ｃ－末端に抗原タンパク質が融合された融合タンパク質の形態でも球形のＶＬＰを形成することを確認した。
＜実施例２－６＞
抗原特異的抗体誘導能を測定するために最終的に精製されたＥＮＣ－ＶＰ８＊融合ＶＬＰタンパク質をＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて定量した後、２０％のグリセロールを含有したバッファーで適正濃度で希釈した。抗原と免疫補助剤（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃ ｖａｃ－ａｌｕ－２５０）を１：１でｓｙｒｉｎｇｅを用いて５分以上強く混ぜた後、４週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス群（６マウス／群）に１００μｌを筋肉注射を通じて接種した。ワクチンは、２週間隔でそれぞれＥＮＣ－ＶＰ８＊ ＶＬＰ ５μｇ又は１０μｇで総合３回接種及び免疫化し、ワクチン接種の一日前に眼窩採血を通じて血清を確保した。各動物実験群から得た血清の目的タンパク質特異抗体を測定するために酵素結合免疫沈降分析法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ））を進行した。対照群として用いられたロタウイルスＶＰ８抗原タンパク質（Ｐ２－ＶＰ８）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ◎ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ◎））に各ｗｅｌｌ当たり０．５μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌずつを入れて４度で１８時間コーティングした後、３％ ＢＳＡ溶液を２００μｌ入れて３７度で２時間を反応してブロッキングした。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後に免疫血清を希釈（１：１０００希釈率）してｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ入れ、同様に３７度で１時間３０分反応させた。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後にＰ２－ＶＰ８＊と結合した血清内の抗体を検出するために、ヤギ由来マウスＩｇＧ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １０３０－０５、Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ）に対する抗体を３７度で１時間処理した。その後、ＴＭＢ（ｓｉｇｍａ Ｔ０４４０）溶液を用いて室温で１０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸溶液で発色反応を止め、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。図６の（ｂ）に示したように、それぞれ１次、２次及び３次採血試料に存在するＥＮＣ－ＶＰ８＊のＶＰ８特異的な抗体価を測定したとき、１０μｇのＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ＿ＶＰ８＿Ｈｉｇｈだけでなく５μｇのＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ＿ＶＰ８＿Ｌｏｗグループでも高いレベルのＶＰ８特異的な抗体が形成されたことを確認した。また、ＶＰ８特異的抗体価が対照群の精製されたペプチドタンパク質では３次の２ｎｄ Ｂｏｏｓｔ ｓｅｒａ ｐｏｏｌから抗体が確認される一方、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ＿ＶＰ８＿Ｈｉｇｈ及びＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ＿ＶＰ８＿Ｌｏｗで全て２次採血試料であるＢｏｏｓｔ ｓｅｒａ ｐｏｏｌからＶＰ８特異的抗体の形成を確認した。
ＥＮＣ－ＶＰ８＊ ＶＬＰの接種後に血液内に存在するロタバイロス（Ｈｕｍａｎ Ｗａ ｓｔｒａｉｎ）の中和抗体価（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ）をプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ、Ｐｌａｑｕｅ－ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）方法で測定した。ウイルスを段階別に希釈した接種動物の血清と３７℃で反応させた後にプラーク形成試験（ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行い、ＰＢＳ対照群と比較して５０％のウイルスプラーク減少を示した希釈倍数を基準としてＰＲＮＴ力価（ｔｉｔｅｒ）を決定した。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ◎ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃTM））に対照群として用いられたロタウイルスＶＰ８抗原タンパク質（Ｐ２－ＶＰ８）１００ｎｇ又はヒトロタウイルスＷａ Ｓｔｒａｉｎ １００ｐｆｕを入れて４度で１８時間コーティングした後、３％ ＢＳＡ溶液を２００μｌ入れて３７度で２時間を反応してブロッキングした。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後、免疫血清希釈液（１：１０００）をｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ入れ、３７度で１時間３０分反応させた。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後、抗原タンパク質と結合した血清内の抗体を検出するためにヤギ由来抗－マウス ＩｇＧ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １０３０－０５、Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ）を３７度で１時間処理した。その後、ＴＭＢ（ｓｉｇｍａ Ｔ０４４０）溶液を用いて室温で１０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸溶液で発色反応を止め、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。図６の（ｃ）に示したように、対照群であるＰ２－ＶＰ８＊タンパク質抗原を３回接種した後に採血した試料に存在するロタウイルス特異抗体価は相当に低いレベルを示したことに比べ、ＥＮＣ－ＶＰ８＊を３回接種した後に採血した試料に存在するＶＰ８特異抗体価は相当に高いレベルを示した。特に、１００μｇのＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ＿ＶＰ８＿Ｈｉｇｈだけでなく５μｇのＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ＿ＶＰ８＿Ｌｏｗグループでも高いレベルのＶＰ８特異的な抗体が形成されたことを確認した。これは、ヒトロタウイルスに対する特異的な抗体価を測定したときにも同一の様相の結果を示すことが分かる。
また、ＶＰ８特異的抗体の形成以後に免疫力の持続性を確認するために、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ◎ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃTM））にヒトロタウイルスＷａ Ｓｔｒａｉｎ １００ｐｆｕを入れて４度で１８時間コーティングした後、３％ ＢＳＡ溶液を２００μｌ入れて３７度で２時間を反応してブロッキングした。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後、免疫血清希釈液（１：１０００）をｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ入れ、３７度で１時間３０分反応させた。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後、抗原タンパク質と結合した血清内の抗体を検出するために、ヤギ由来抗－マウスＩｇＧ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １０３０－０５、Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ）を３７度で１時間処理した。その後、ＴＭＢ（ｓｉｇｍａ Ｔ０４４０）溶液を用いて室温で１０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸溶液で発色反応を止め、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。図６の（ｄ）に示したように、対照群であるＰ２－ＶＰ８＊タンパク質抗原又はＥＮＣ－ＶＰ８＊を３回接種した後、２ヶ月が経過した後に採血した血清内に存在するロタウイルス特異的な抗体価を測定した。対照群であるＰ２－ＶＰ８＊タンパク質抗原を接種した血清に比べ、ＥＮＣ－ＶＰ８＊を接種した動物の血清内では非常に高いレベルに誘導された抗体力価が２ヶ月後にもヒトロタウイルスに対する特異的な抗体価が相変らず高く維持されることを確認した。
また、ＥＮＣ－ＶＰ８がＨＢＧＡに結合するか否かを確認するためにＨＢＧＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙを進行した。図６の（ｅ）に示したように、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎがコーティングされた９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＢＣ）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃTM））にｂｉｏｔｉｎが付いているＨＢＧＡを１０μｇ／ｍｌ濃度で各ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ入れて常温で５時間反応させた。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後、ＥＮＣ－ＶＰ８タンパク質をＰＢＳに希釈液してｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ入れ、４度で１８時間反応させた。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後、ＥＮＣ－ＶＰ８を接種したマウス血清を１：１０００割合で希釈してｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ入れ、常温で１時間反応させた。ＰＢＳＴを用いて洗浄した後、ヤギ由来マウスＩｇＧ（Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ）に対する抗体５種（Ｈ（ｔｙｐｅ２）－ＰＡＡ－ｂｉｏｔｉｎ（０１－０３４）、Ｌｅａ－ＰＡＡ－ｂｉｏｔｉｎ（０１－０３５）、Ｌｅｄ（Ｈ ｔｙｐｅ１）－ＰＡＡ－ｂｉｏｔｉｎ（０１－０３７）、Ｂｌｏｏｄ ｔｙｐｅ Ａ（ｔｒｉ）－ＰＡＡ－ｂｉｏｔｉｎ（０１－０３２）、Ｂｌｏｏｄ ｔｙｐｅ Ｂ（ｔｒｉ）－ＰＡＡ－ｂｉｏｔｉｎ（０１－０３３）；（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）を常温で１時間処理した。その後、ＴＭＢ溶液を用いて室温で１０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸溶液で発色反応を止め、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。図６の（ｄ）のように、ＥＮＣ－ＶＰ８＊を注射したグループから得たｐｒｉｍａｒｙ ｓｅｒａを用いてＨＢＧＡとＶＰ８抗原間の結合を確認した。その結果、ＥＮＣ－ＶＰ８＊ ＶＬＰ融合タンパク質は、Ｌｅｄ（Ｈ ｔｙｐｅ１）ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅと結合することを確認した。
＜実施例２－７＞
免疫血清がＥＮＣ－ＶＰ８＊抗原と受容体間の結合を阻害する程度を測定するためにＨＢＧＡ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙを進行した（図６の（ｇ））。ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎがコーティングされた９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｂｉｏｔｉｎが付いているＨＢＧＡを１０μｇ／ｍｌ濃度で各ｗｅｌｌ当たり１００μｌに入れ、常温で５時間反応させた。ＥＮＣ－ＶＰ８＊を１μｇ／ｍｌの濃度で希釈した後、免疫血清と１：１の割合で３７度で３時間反応させた。その後、ＰＢＳＴで洗浄したＨＢＧＡと反応したｐｌａｔｅにｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ血清とＥＮＣ－ＶＰ８＊反応液を入れ、４度で１８時間反応させた。ＰＢＳＴを用いてｐｌａｔｅを洗浄した後、ＥＮＣ－ＶＰ８＊を接種したマウス血清を１：１０００割合で希釈し、ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ入れて常温で１時間反応させた。ＰＢＳＴを用いて洗浄した後、ヤギ由来マウスＩｇＧ（Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ）に対する抗体を常温で１時間処理した。その後、ＴＭＢ溶液を用いて室温で１０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸溶液で発色反応を止め、４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。図６の（ｈ）のように、ＨＢＧＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＡｓｓａｙでＥＮＣ－ＶＰ８ ＶＬＰ抗原タンパク質が結合することを確認したＬｅｄ（Ｈ ｔｙｐｅ１）をｐｌａｔｅにＬｅｄ（Ｈ ｔｙｐｅ１）をコーティングした後にＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ＿ＶＰ８ ＶＬＰを多様な濃度で希釈されたｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒａ（ｐｒｉｍａｒｙ、ｂｏｏｓｔ、２ｎｄ ｂｏｏｓｔ）とそれぞれ反応し、Ｌｅｄと結合有無をＥＬＩＳＡで測定した結果を確認した。
図６の（ｉ）は、前記実施例で得たそれぞれの免疫血清のＨＢＧＡ ｂｌｏｃｋｉｎｇ効能を数値化して示した図である。各処理群は、低用量対照群（Ｐ２－ＶＰ８＿Ｌｏｗ）と高用量の対照群（（Ｐ２－ＶＰ８＿Ｈｉｇｈ）、そして低用量の試験群（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－ＶＰ８＿Ｌｏｗ）と高用量の試験群（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－ＶＰ８＿Ｈｉｇｈ）で総合４種処理群の３次接種までの血清を収得した後、各血清のＨＢＧＡ結合抑制能を測定した。各免疫血清のＨＢＧＡ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙを行った後、ＰＢＳに対して５０％の結合抑制効果を示した希釈倍数（ＢＴ５０）を算定した。
本実施例のＥＮＣ－ＶＰ８抗原融合ＶＬＰタンパク質の場合、ＥｎｃＶＰ８＿ＨｉｇｈとＬｏｗグループの両方で１次接種であるｐｒｉｍａｒｙ ｓｅｒａから免疫血清の阻害能を確認し、３次接種まで接種を繰り返すほど免疫血清の阻害能が対照群に比べて数等増加した。一方、対照群であるＰ２ ＶＰ８グループは、２次ワクチン接種後の２ｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒａから抗原－受容体間の結合を免疫血清が阻害し、その効果は、３次ワクチン接種後にもＥｎｃ＿ＶＰ８グループに比べて防御効能が低いことが確認された。
前記実施例２の結果を通じて、目的タンパク質のみを投与したときより本発明によるＥｎｃａｐｓｕｌｉｎと目的タンパク質が融合されたＶＬＰを投与したとき、より早期に一層高いレベルの目的タンパク質特異抗体が誘導され、その抗体は、目的タンパク質とその受容体間の結合を阻害する性能に優れていることを確認した。
＜実施例３＞
高効率及び水溶性の増進のためのＮ－末端のペプチドを追加したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）ヒトパピローマ抗原複合体の製造
＜実施例３－１＞
Ｃ－末端に１５９個のアミノ酸からなるサイズ約１８．３ｋＤａのロタウイルスＶＰ８＊抗原より小さいタンパク質を挿入したとき、融合タンパク質エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のウイルス様粒子で構成されたＶＬＰの形成可能有無を調べるためにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原を用いた。エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質でヒトパピローマウイルス抗原であるＥ７ ＬＰを挿入し、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６由来のＥ７ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ（Ｅ７ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｐａｒｔｉａｌ［Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６］Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＡＢＬ９６５８４．１）遺伝子が利用された（配列番号９）。ヒトパピローマウイルスの抗原であるＥ７ ＬＰ（Ｌｏｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）は、３５個のアミノ酸からなっており、約４ｋＤａのサイズを有する。前記タンパク質配列に基づいて大腸菌でコドン最適化した後に合成された遺伝子配列を製造した（配列番号９）。
（株）バイオニクスにエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）遺伝子の合成依頼）：
エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質のＣ－末端にヒトパピローマウイルスのＥ７ＬＰを挿入した。また、図８の（ａ）に示したように、高効率及び水溶性の増進のためにエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質のＮ－末端に発現量及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤを適用して融合タンパク質発現に及ぼす影響を確認した。これによって、発現量増加及び水溶性増加の効能があるＭＳＡＶＫＡＡ（配列番号１２）とＲＩＤペプチド（配列番号１３）及び５０％以上類似した突然変異ＲＩＤペプチド（配列番号１４）を融合した組換えタンパク質を製造して水溶性発現様相を検証した。
また、ＴＥＶ切断部位の配列であるＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓを応用して最適化された配列の連結部位（Ｌｉｎｋｅｒ）として、アミノ酸配列が（ＧａＳｂ）ｎ（ａ≧１、ｂ≧１、ｎ≧１）であるペプチドを用い、これをＴＥＶ ｃｌｅａｖａｇｅ配列と前記融合タンパク質配列の間に入れた。本実施例で製作された融合タンパク質発現ベクターの模式図は、図７の（ｂ）の通りである。
前記配列の遺伝子は、ｐＥＴ－９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、６９４３１－３ＣＮ）（配列番号１１）発現ベクターを用いて前記例２で製作した組換え複合体タンパク質発現ベクターであるｐＥＴ９ａ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－ＶＰ８＊ ｖｅｃｔｏｒ及びｐＥＴ９ａ－ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｅｎｃ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＰ８＊ Ｖｅｃｔｏｒを基盤として製作され、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ切断酵素を用いてＥｎｃのＣ－末端のロタウイルス抗原タンパク質をヒトパピローマウイルスの抗原に代替して挿入した。
実施例３－１で製造された組換え複合体発現ベクターの配列は、次の通りである。
ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｅ７ ＬＰ［（配列番号１）－（配列番号１７）－（配列番号９）］
ＭＥＦＬＫＲＳＦＡＰＬＴＥＫＱＷＱＥＩＤＮＲＡＲＥＩＦＫＴＱＬＹＧＲＫＦＶＤＶＥＧＰＹＧＷＥＹＡＡＨＰＬＧＥＶＥＶＬＳＤＥＮＥＶＶＫＷＧＬＲＫＳＬＰＬＩＥＬＲＡＴＦＴＬＤＬＷＥＬＤＮＬＥＲＧＫＰＮＶＤＬＳＳＬＥＥＴＶＲＫＶＡＥＦＥＤＥＶＩＦＲＧＣＥＫＳＧＶＫＧＬＬＳＦＥＥＲＫＩＥＣＧＳＴＰＫＤＬＬＥＡＩＶＲＡＬＳＩＦＳＫＤＧＩＥＧＰＹＴＬＶＩＮＴＤＲＷＩＮＦＬＫＥＥＡＧＨＹＰＬＥＫＲＶＥＥＣＬＲＧＧＫＩＩＴＴＰＲＩＥＤＡＬＶＶＳＥＲＧＧＤＦＫＬＩＬＧＱＤＬＳＩＧＹＥＤＲＥＫＤＡＶＲＬＦＩＴＥＴＦＴＦＱＶＶＮＰＥＡＬＩＬＬＫＦ－ＧＧＧＳＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳ－ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ
［Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＨＰＶ Ｅ７］［（配列番号１）－（配列番号１７）－（配列番号９）］
前記製造された複合体は、「Ｅｎｃ‐Ｅ７ ＬＰ」と名付けた。
ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ１－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ２－ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｅ７ ＬＰ
［（配列番号１２）－（配列番号１３）－（配列番号１５）－ＴＥＶ－（配列番号１６）－（配列番号１）－（配列番号１７）－（配列番号９）］
：ＭＳＡＶＫＡＡ－ＡＡＶＱＡＡＥＶＫＶＤＧＳＥＰＫＬＳＫＮＥＬＫＲＲＬＫＡＥＫＫＶＡＥＫＥＡＫＱＫＥＬＳＥＫＱＬＳＱＡＴＡＡＡＴＮＨＴＴＤＮＧＶＧＰＥＥＥＳＶ－ＥＮＬＹＦＱ－ＧＳＧＳＧＳＭＥＦＬＫＲＳＦＡＰＬＴＥＫＱＷＱＥＩＤＮＲＡＲＥＩＦＫＴＱＬＹＧＲＫＦＶＤＶＥＧＰＹＧＷＥＹＡＡＨＰＬＧＥＶＥＶＬＳＤＥＮＥＶＶＫＷＧＬＲＫＳＬＰＬＩＥＬＲＡＴＦＴＬＤＬＷＥＬＤＮＬＥＲＧＫＰＮＶＤＬＳＳＬＥＥＴＶＲＫＶＡＥＦＥＤＥＶＩＦＲＧＣＥＫＳＧＶＫＧＬＬＳＦＥＥＲＫＩＥＣＧＳＴＰＫＤＬＬＥＡＩＶＲＡＬＳＩＦＳＫＤＧＩＥＧＰＹＴＬＶＩＮＴＤＲＷＩＮＦＬＫＥＥＡＧＨＹＰＬＥＫＲＶＥＥＣＬＲＧＧＫＩＩＴＴＰＲＩＥＤＡＬＶＶＳＥＲＧＧＤＦＫＬＩＬＧＱＤＬＳＩＧＹＥＤＲＥＫＤＡＶＲＬＦＩＴＥＴＦＴＦＱＶＶＮＰＥＡＬＩＬＬＫＦ－ＧＧＧＳＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳ－ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ
前記製造された複合体は、「ＲＩＤ－ＥＮＣ－Ｅ７ ＬＰ」と名付けた（ＬＰは、Ｌｏｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅの略語である。）。
＜実施例３－２＞
前記実施例３－１で製作された発現ベクターをＨＭＳ１７４ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＲｅｃＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｋ－１２ ｓｔｒａｉｎ、Ｃａｔ：６９４５３－３））に形質転換した。全ての形質転換された大腸菌は、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれた３ｍｌのＬＢ培地で３７℃で２５０ｒｐｍで５－７時間培養した後、１ｍｌを１０ｍｌに移して１０倍希釈した後に追加培養した。約２－４時間後にＯ．Ｄ６００ ０．８～０．９に到逹したとき、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、Ｃａｔ＃I１００６、Ｌｏｔ＃ＬＢ０Ｃ０３４０、ｃａｓ＃３６７－９３－１）を添加した後、１６℃で１７－１９時間（最大２１時間）間培養した。培養液は、遠心分離を通じて沈澱された大腸菌のみを収得して－８０℃の超低温で冷凍保管した。３ｍｌの培養培地に該当する大腸菌収穫物に０．３ｍｌの溶解緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を入れて超音波粉砕した後、全体溶解物（Ｔ、Ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ）を遠心分離を通じて沈殿物（Ｐ、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）と上澄液（Ｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｌｙｓａｔｅ）に分離した後にＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。その結果、図７の（ｃ）及び図７の（ｄ）に示したように、それぞれのサイズに該当するＥＮＣ－Ｅ７ ＬＰとＲＩＤ－ＥＮＣ－Ｅ７ ＬＰを発現させて確認した結果、それぞれ３６．１ｋＤａと４５．７ｋＤａのタンパク質が適切な位置で発現したことを確認した。しかし、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のＣ－末端に１８ｋＤａのロタウイルスより３５アミノ酸の４ｋＤａ程度の小さいサイズのヒトパピローマウイルスを融合した場合にも融合タンパク質水溶性が顕著に減少することが確認でき、これを通じて、短い配列のペプチドや小さいサイズのタンパク質から大きいサイズのタンパク質まで全てエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）複合体として大腸菌で発現されるためには、高効率及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤが必要であることを確認した。したがって、実施例２の結果と同様に、外部抗原タンパク質をエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のＣ－末端に融合発現を通じて最終的に外部抗原が表面に露出されたＶＬＰ重合体を製造するためには、本発明の水溶性発現標識因子が必須的に要求されることを再確認し、本発明での高い発現量と水溶性を顕著に増加させるＲＩＤ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）及び水溶性の発現標識因子の大腸菌発現システムでの必要性を立証した。
＜実施例３－３＞
水溶性が確認された前記実施例３－２と同一の培養方法を用いて製造されたＲＩＤ－ＥＮＣ－Ｅ７ ＬＰ複合体タンパク質は、ニッケル（Ｎｉ）親和性クロマトグラフィーを通じて精製した。同一の方式の培養方法を用いて５００ｍｌの大腸菌を培養及び発現を誘導して収得した細胞を７５ｍｌの溶解緩衝溶液［Ａバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で再懸濁した。前記細胞再懸濁物を超音波細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ：ｐｕｌｓｅ ３ｓ／１７ｓ、３５％ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ、１ｍｉｎ ３０ｓ、４ｔｉｍｅｓ ｔｏｔａｌ）を用いて細胞を粉砕させた。前記溶解された細胞を４℃で１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層液を取ってＡＫＴＡ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＮｉ＋－親和クロマトグラフィーを行った。まず、陽イオン－交換樹脂カラムであるＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ、５ｍＬ ｓｉｚｅ）カラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で平衡化させた後、水溶性タンパク質を含む水溶性溶解液を１ｍｌ／分の流速で前記平衡化されたカラムに積載した。ＲＩＤ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－ＶＰ８＊タンパク質の精製は、緩衝液Ａ及び１Ｍのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び１Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を用いてイミダゾールが１０ｍＭ～１Ｍの濃度範囲で線形濃度勾配で増加注入される形態で行い、これを通じて、それぞれ２ｍｌずつの分画を収得した。
図８の（ａ）及び図８の（ｂ）に示したように、前記溶出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて目的（ターゲット）タンパク質の分離様相を確認した後、該当分画の溶出物をＤｉａｌｙｓｉｓバッファー（［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０］）で９℃で１２－１６時間の間透析した。このとき、４時間の間先に透析した後、残り８－１２時間の間ＴＥＶ切断酵素を用いてＮ末端の融合パートナーであるＲＩＤとエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質とヒトパピローマウイルス抗原が融合された融合タンパク質の間を切断した。
ＩＭＡＣ及びＤｉａｌｙｓｉｓ以後のＥＮＣ－Ｅ７ ＬＰタンパク質がＶＬＰを形成するか否かを確認するための生化学的分析を行い、後続精製のためにＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。前記の透析により収得したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質は、ＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイオン交換樹脂クロマトグラフィーで精製した。カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ、１ｍＬ ｓｉｚｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）は、緩衝溶液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で平衡化し、１ｍｌ／分の流速でローディングした。Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ－Ｅ７ ＬＰタンパク質は、１０ｍＭ～１Ｍの線形濃度勾配を有するＮａＣｌを注入して溶出し、緩衝溶液Ａと緩衝溶液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を通じて線形濃度勾配を通じた精製を進行し、それぞれ１ｍｌずつの分画を収得した。これを通じて、大腸菌由来の他のタンパク質などが精製された融合タンパク質を獲得した（図８の（ｄ））。精製されたＥＮＣＥ７ ＬＰタンパク質は、２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）割合を含む状態で４℃で保管し、最終的に精製されたタンパク質の濃度は、ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて定量した。図９の（ａ）に示したように、本発明のＲＩＤ及び水溶性のための追加標識因子がタンパク質発現からＴＥＶ酵素処理及びイオン交換樹脂クロマトグラフィーに至るまでの精製過程での融合タンパク質の精製様相及び純度を確認し、ヒトパピローマウイルスの抗原の場合にもタンパク質を安定的に獲得するのに必須的であることを確認した。
＜実施例３－４＞
実施例３－３のＥＮＣ－Ｅ７ ＬＰ複合体の精製されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）の全体的な直径を確認するために動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を通じて分析した。前記複合体の分析は、ＤＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｆａｍｉｌｙ）を用いて１６℃の温度条件でサンプル１ｍＬをＣｕｖｅｔｔｅに入れて測定した。細胞の動的光散乱分析は、イメージで各領域別ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ及びＭａｓｓなどを用いて確認した。図９の（ｂ）のように、ＤＬＳのＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｄｉｕｓでの直径が野生型エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）が示す３０～４０ｎｍと類似したサイズの分布を有することを確認した。
＜実施例３－５＞
精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質からなるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の外形を電子顕微鏡で観察した。精製されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ ＶＬＰをまず銅グリッドに１分間載せた後、２％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて１分間染色し、１０分間常温で乾燥した後に透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１２０ｋＶ）；Ｔａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ、ＦＥＩ、Ｃｚｅｃｈ）を用いて撮影した。図９の（ｃ）に示したように、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質がＶＬＰを形成することが確認できた。
前記得られた結果、図９の（ｃ）に示したように、精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質がＶＬＰを形成することが確認できた。確認されたＶＬＰの直径は、既存のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の直径である３０～４０ｎｍの間で確認され、Ｃ－末端に抗原タンパク質が融合された融合タンパク質の形態でも球形のＶＬＰを形成することを確認した。実施例３の結果でも実施例２の結果と同様に、本発明を用いてエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）の大腸菌での高効率タンパク質の生産及びＶＬＰ形成を全て確認し、これは、本実験の高効率及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤがエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のＣ－末端に抗原などのタンパク質を挿入した融合タンパク質基盤のプラットフォームを形成するのに必須的であることを示す。
＜実施例４＞
高効率及び水溶性の増進のためのＮ－末端の発現量及び水溶性増進パートナーを追加したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）コロナウイルス抗原複合体の製造
＜実施例４－１＞
Ｃ－末端にコロナウイルスＲＢＤ抗原（２２３ａ．ａ、２５．０ｋＤａ）の目的タンパク質を付着したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質融合タンパク質で構成されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のウイルス様粒子を作るためにコロナウイルス抗原であるＲＢＤ（ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）を挿入した。挿入されたコロナウイルスには、２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ Ｓタンパク質由来のＲＢＤ（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＣＤＣ０３／２０２０、（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓ ｎｕｍｂｅｒ：ＭＮ９０８９４７）遺伝子が利用された（配列番号１０）。コロナウイルスの抗原であるＲＢＤは、２２３個のアミノ酸で構成されており、タンパク質の分子量は、約２５ｋＤａに該当する。前記タンパク質配列に基づいて大腸菌でコドン最適化後に合成された遺伝子配列を製造した（配列番号１０）。（（株）バイオニクスに遺伝子の合成依頼）
図１１では、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質のＮ－末端に発現量増加及び水溶性増加の効能があるＭＳＡＶＫＡＡ（配列番号１２）とＲＩＤペプチド（配列番号１３）及び５０％以上類似した突然変異ＲＩＤペプチド（配列番号１４）を融合した組換えタンパク質を製造して水溶性発現様相を検証した。
また、ＴＥＶ切断部位の配列であるＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓを応用して最適化された配列の連結部位（Ｌｉｎｋｅｒ）として、アミノ酸配列が（ＧａＳｂ）ｎ（ａ≧１、ｂ≧１、ｎ≧１）であるペプチドを用い、これをＴＥＶ ｃｌｅａｖａｇｅ配列と前記融合タンパク質配列の間に入れた。本実施例で製作された融合タンパク質発現ベクターの模式図は、図１０の（ｂ）の通りである。
前記配列の遺伝子は、ｐＥＴ－９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、６９４３１－３ＣＮ）（配列番号１１）発現ベクターを用いて前記例１で製作した組換え複合体タンパク質発現ベクターであるｐＥＴ－９ａ－Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ ｖｅｃｔｏｒを基盤として製作された。Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅがＩＰＴＧにより発現され、これを通じて、ＤＥ３ゲノム上に存在するＬａｃオペロンとＴ７プローモーターが作動するｐＥＴ ｖｅｃｔｏｒのＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ；多重クローニング部位）に挿入された既存のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）複合体タンパク質のベクター配列のＮ－末端に水溶性及び発現率の増加のためのＲＩＤ配列を追加し、ＴＥＶ切断効率を増進させるために連結部位配列を追加した。ｐＥＴ９ａ ｖｅｃｔｏｒにＮｄｅＩ及びＫｐｎＩとＢａｍＨＩ切断酵素を用いて切ってサブクローニングして再挿入した。ＭＣＳ内部に存在する切断酵素部位のうちＮｄｅＩとＫｐｎＩ配列の間に本研究のＲＩＤと連結部品（Ｌｉｎｋｅｒ１）、切断酵素部位及びＴＥＶ酵素の切断効率を高めるための連結部位（Ｌｉｎｋｅｒ２）を挿入し、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ切断酵素の間にエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）とコロナウイルス抗原タンパク質が融合された形態のタンパク質を有するように構成されたＤＮＡ配列をそれぞれ挿入し、それぞれの遺伝子は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を通じてｐＥＴベクターと挿入遺伝子配列を連結させ、これらのＤＮＡの連結反応により発生したバクテリアクローンは、ＤＮＡ配列分析を通じてコドン最適化されたヌクレオチドの配列が挿入されることを確認した。
実施例４－１で製造された組換え複合体発現ベクターの配列は、次の通りである。
ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ１－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ２－ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤ［（配列番号１２）－（配列番号１４）－（配列番号１５）－ＴＥＶ－（配列番号１６）－（配列番号１）－（配列番号１８）－（配列番号１０）］
：ＭＳＡＶＫＡＡ－ＡＡＶＱＡＡＥＶＫＶＤＧＳＥＰＫＬＳＡＮＥＬＡＡＲＬＡＡＥＡＡＶＡＥＡＥＡＡＱＡＥＬＳＥＫＱＬＳＱＡＴＡＡＡＴＮＨＴＴＤＮＧＶＧＰＥＥＥＳＶＧＴ－ＨＨＨＨＨＨ－ＥＮＬＹＦＱ－ＧＳＧＳＧＳ－ＥＦＬＫＲＳＦＡＰＬＴＥＫＱＷＱＥＩＤＮＲＡＲＥＩＦＫＴＱＬＹＧＲＫＦＶＤＶＥＧＰＹＧＷＥＹＡＡＨＰＬＧＥＶＥＶＬＳＤＥＮＥＶＶＫＷＧＬＲＫＳＬＰＬＩＥＬＲＡＴＦＴＬＤＬＷＥＬＤＮＬＥＲＧＫＰＮＶＤＬＳＳＬＥＥＴＶＲＫＶＡＥＦＥＤＥＶＩＦＲＧＣＥＫＳＧＶＫＧＬＬＳＦＥＥＲＫＩＥＣＧＳＴＰＫＤＬＬＥＡＩＶＲＡＬＳＩＦＳＫＤＧＩＥＧＰＹＴＬＶＩＮＴＤＲＷＩＮＦＬＫＥＥＡＧＨＹＰＬＥＫＲＶＥＥＣＬＲＧＧＫＩＩＴＴＰＲＩＥＤＡＬＶＶＳＥＲＧＧＤＦＫＬＩＬＧＱＤＬＳＩＧＹＥＤＲＥＫＤＡＶＲＬＦＩＴＥＴＦＴＦＱＶＶＮＰＥＡＬＩＬＬＫＦ－ＧＧＧＳＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＳ－ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦ
前記製造された複合体は、「ＲＩＤ－ＥＮＣ－ＣｏＶ ＲＢＤ」と名付けた。
＜実施例４－２＞
前記実施例４－１で製作された発現ベクターをＨＭＳ１７４ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＲｅｃＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｋ－１２ ｓｔｒａｉｎ、Ｃａｔ：６９４５３－３）に形質転換した。全ての形質転換された大腸菌は、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ)が含まれた３ｍｌのＬＢ培地で３７℃で２５０ｒｐｍで５－７時間培養した後、１ｍｌを１０ｍｌに移して１０倍希釈した後に追加培養した。約２－４時間後にＯ．Ｄ６００ ０．５～０．７に到逹したとき、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、Ｃａｔ＃Ｉ１００６、Ｌｏｔ＃ＬＢ０Ｃ０３４０、ｃａｓ＃３６７－９３－１）を添加した後、１６℃で１７－１９時間（最大２１時間）の間培養した。培養液は、遠心分離を通じて沈澱された大腸菌のみを収得して－８０℃の超低温で冷凍保管した。３ｍｌの培養培地に該当する大腸菌収穫物に０．３ｍｌの溶解緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を入れて超音波粉砕した後、全体溶解物（Ｔ、Ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ）を遠心分離を通じて沈殿物（Ｐ、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）と上澄液（Ｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｌｙｓａｔｅ）に分離した後にＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果、図１１に示したように、ＲＩＤをＮ－末端に追加したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）－コロナウイルス抗原融合タンパク質が高効率の水溶性発現を示していることを確認した。
＜実施例４－３＞
高効率の水溶性発現が確認された前記実施例４－２と同一の方式の培養方法を用いて５００ｍｌの大腸菌を培養及び発現を誘導して収得した細胞を、７５ｍｌの溶解緩衝溶液［Ａバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で再懸濁した。前記細胞再懸濁を超音波細胞破砕機＋（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ：ｐｕｌｓｅ １５ｓ／５０ｓ、７０％ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ、２ｍｉｎ ３０ｓ、２ｔｉｍｅｓ ｔｏｔａｌ）を用いて細胞を粉砕させた。前記溶解された細胞を４℃で１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層液を取ってＡＫＴＡ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＮｉ＋親和クロマトグラフィーを行った。まず、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ、５ｍＬ ｓｉｚｅ）カラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で平衡化させた後、細胞溶解の上層液を１ｍｌ／分の流速で前記平衡化されたカラムに積載した。ＲＩＤ－ＥＮＣ－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質は、緩衝液Ａ及び１Ｍのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ及び１Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を用いてイミダゾールが１０ｍＭ～１Ｍ濃度範囲で線形濃度勾配で増加注入を通じて溶出し、２ｍｌずつの分画を収得した。
前記溶出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて目的（ターゲット）タンパク質の分離様相を確認した後、該当分画の溶出物をＤｉａｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で９℃で１２－１６時間の間透析した。このとき、４時間の間先に透析した後、残り８－１２時間の間ＴＥＶ切断酵素を用いてＮ－末端のＲＩＤとエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）－コロナウイルス抗原融合タンパク質の間を切断した。
Ｎ－末端の融合パートナーであるＲＩＤなどが除去された目的融合タンパク質を分離及び精製するために、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ、５ｍＬ ｓｉｚｅ）カラムを用いてＤｉａｌｙｓｉｓバッファーと同一の溶液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で平衡化させた後、１ｍｌ／分の流速で前記平衡化されたカラムに積載した。Ｎ－末端の融合パートナーであるＲＩＤなどが除去されたＥＮＣ－ＣｏＶ ＲＢＤ目的タンパク質は、前記カラムに吸着されず溶出される形態で回収した。
目的タンパク質の最終純度の増加のためにＡＫＴＡ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ、１ｍＬ ｓｉｚｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を緩衝溶液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で平衡化した後、１ｍｌ／分の流速で積載し、緩衝溶液Ａと緩衝溶液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１Ｍ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を通じて１０ｍＭ～１Ｍの線形濃度勾配を有するＮａＣｌ注入を通じて目的タンパク質を溶出し、各１ｍｌずつの分画で収得し、その結果、その精製様相と純度は、図１２の（ｆ）にし得した通りである（図１２の（ｆ）参照）。精製されたＥＮＣ－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質は、２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）割合を含む状態で４℃で保管し、最終的に精製されたタンパク質の濃度は、ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて定量した。
＜実施例４－４＞
実施例４－３のＥＮＣ－ＣｏＶ ＲＢＤ融合タンパク質で構成された融合タンパク質（ＶＬＰ）の全体的な直径分布を確認するために動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ ＬｉｇｈｔＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を通じて分析した。前記複合体の分析は、ＤＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｆａｍｉｌｙ）を用いて１６℃の温度条件でサンプル１ｍＬをＣｕｖｅｔｔｅに入れて測定した。細胞の動的光散乱分析は、イメージで各領域別ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ及びＭａｓｓなどを用いて確認した。図１３の（ａ）のように、ＤＬＳのＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｄｉｕｓでの直径３０～４０ｎｍのＰａｒｔｉｃｌｅサイズの分布を有することを確認した。
＜実施例４－５＞
精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質からなるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の外形を電子顕微鏡で観察した。精製されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ ＶＬＰを先に銅グリッドに１分間載せた後、２％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて１分間染色し、１０分間常温で乾燥した後に透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１２０ｋＶ）；Ｔａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ、ＦＥＩ、Ｃｚｅｃｈ）を用いて撮影した。図１３の（ｂ）に示したように、精製されたＥＮＣ－ＣｏＶ ＲＢＤタンパク質がＶＬＰを形成することが確認できた。確認されたＶＬＰの直径は、既存のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の直径である３０～４０ｎｍ間で観察され、Ｃ－末端に抗原タンパク質が融合された融合タンパク質の形態でも球形のＶＬＰを形成することを確認した。
前記実施例４の結果を通じて、本発明によるＥｎｃａｐｓｕｌｉｎと目的タンパク質が融合されたＶＬＰを投与したとき、高いレベルの目的タンパク質特異抗体が誘導され、この抗体は、目的タンパク質とその受容体の間の結合を阻害する性能に優れていることを確認した。
＜実施例５＞
高効率及び水溶性の増進のためのＮ－末端の発現量及び水溶性の増進パートナーペプチドを追加したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）デングウイルス抗原複合体の製造
＜実施例５－１＞
Ｃ－末端に目的タンパク質を付着したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の融合タンパク質で構成されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）基盤のウイルス様粒子を作るためにデングウイルス抗原を利用した。ＲＢＤ（ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）を挿入した。エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質でデングウイルス抗原であるＥＤＩＩＩを挿入し、デングウイルス由来のＥＤＩＩＩ（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ２ ｉｓｏｌａｔｅ ＤＥＮＶ－２／ＫＢＰＶ－ＶＲ－２９、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＫＰ４０６８０４．１）遺伝子が利用された（配列番号６）。デングウイルスの抗原であるＥＤＩＩＩは、１０１個のアミノ酸からなっており、約１１．４ｋＤａのサイズを有する。前記タンパク質配列に基づいて大腸菌でコドン最適化した後に合成された遺伝子配列を製造した（配列番号６）。（（株）バイオニクスに遺伝子の合成依頼）
図９では、エンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質のＮ－末端に発現量増加及び水溶性増加の効能があるＭＳＡＶＫＡＡ（配列番号１２）とＲＩＤペプチド（配列番号１３）及び５０％以上類似した突然変異ＲＩＤペプチド（配列番号１４）を融合した組換えタンパク質を製造して水溶性発現様相を検証した。前記突然変異ＲＩＤの場合、水溶性の増加のためにＲＩＤのアミノ酸をＬｙｓｉｎｅ（Ｌｙｓ、Ｋ）をＡｌａｎｉｎｅ（Ａｌａ、Ａ）で１個以上９個以下で置換して使用した。
また、ＴＥＶ切断部位の配列であるＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓを応用して最適化された配列の連結部位（Ｌｉｎｋｅｒ）としてアミノ酸配列が（ＧａＳｂ）ｎ（ａ≧１、ｂ≧１、ｎ≧１）であるペプチドを用い、これをＴＥＶ ｃｌｅａｖａｇｅ配列と前記融合タンパク質配列の間に入れた。本実施例で製作された融合タンパク質発現ベクターの模式図は、図１４の（ｂ）の通りである。
前記配列の遺伝子は、ｐＥＴ－９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、６９４３１－３ＣＮ）（配列番号１１）発現ベクターを用いて前記例２で製作した組換え複合体タンパク質の発現ベクターであるｐＥＴ９ａ－ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤ ｖｅｃｔｏｒ及びｐＥＴ９ａ－ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ１－６ｘＨＩＳ－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ２－ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＣｏＶ ＲＢＤ Ｖｅｃｔｏｒを基盤として製作され、ＮｏｔＩとＢａｍＨＩ切断酵素を用いてＥｎｃのＣ－末端のコロナウイルス抗原タンパク質をデングウイルスの抗原に代替して挿入した。
実施例５－１で製造された組換え複合体発現ベクターの配列は、次の通りである。
ＭＳＡＶＫＡＡ－ＲＩＤ－Ｌｉｎｋｅｒ１－ＴＥＶ－Ｌｉｎｋｅｒ２－ＥＮＣ－Ｌｉｎｋｅｒ３（３－２）－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩ［（配列番号１２）－（配列番号１３）－（配列番号１５）－ＴＥＶ－（配列番号１６）－（配列番号１）－（配列番号１８）－（配列番号６）］
：ＭＳＡＶＫＡＡ－ＡＡＶＱＡＡＥＶＫＶＤＧＳＥＰＫＬＳＫＮＥＬＫＲＲＬＫＡＥＫＫＶＡＥＫＥＡＫＱＫＥＬＳＥＫＱＬＳＱＡＴＡＡＡＴＮＨＴＴＤＮＧＶＧＰＥＥＥＳＶ－ＧＴＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱ－ＧＳＧＳＧＳ－ＥＦＬＫＲＳＦＡＰＬＴＥＫＱＷＱＥＩＤＮＲＡＲＥＩＦＫＴＱＬＹＧＲＫＦＶＤＶＥＧＰＹＧＷＥＹＡＡＨＰＬＧＥＶＥＶＬＳＤＥＮＥＶＶＫＷＧＬＲＫＳＬＰＬＩＥＬＲＡＴＦＴＬＤＬＷＥＬＤＮＬＥＲＧＫＰＮＶＤＬＳＳＬＥＥＴＶＲＫＶＡＥＦＥＤＥＶＩＦＲＧＣＥＫＳＧＶＫＧＬＬＳＦＥＥＲＫＩＥＣＧＳＴＰＫＤＬＬＥＡＩＶＲＡＬＳＩＦＳＫＤＧＩＥＧＰＹＴＬＶＩＮＴＤＲＷＩＮＦＬＫＥＥＡＧＨＹＰＬＥＫＲＶＥＥＣＬＲＧＧＫＩＩＴＴＰＲＩＥＤＡＬＶＶＳＥＲＧＧＤＦＫＬＩＬＧＱＤＬＳＩＧＹＥＤＲＥＫＤＡＶＲＬＦＩＴＥＴＦＴＦＱＶＶＮＰＥＡＬＩＬＬＫＦ－ＧＧＧＳＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＳ－ＫＧＭＳＹＳＭＣＴＧＫＦＫＶＶＫＥＩＡＥＴＱＨＧＴＩＶＩＲＶＱＹＥＧＤＧＳＰＣＫＩＰＦＥＩＭＤＬＥＫＲＨＶＬＧＲＬＩＴＶＮＰＩＶＴＥＫＤＲＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＤＳＹＩＩＩＧＶＥＰＧＱＬＫＬＮＷＦＫＫＧ
前記製造された複合体は、「ＲＩＤ－ＥＮＣ－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩ」と名付けた。
＜実施例５－２＞
前記実施例５－１で製作された発現ベクターをＨＭＳ１７４ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＲｅｃＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｋ－１２ ｓｔｒａｉｎ、Ｃａｔ：６９４５３―３））に形質転換した。全ての形質転換された大腸菌は、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれた３ｍｌのＬＢ培地で３７℃で２５０ｒｐｍで５－７時間培養した後、１ｍｌを１０ｍｌに移して１０倍希釈した後に追加培養した。約２－４時間後にＯ．Ｄ６００ ０．５～０．７に到逹したとき、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、Ｃａｔ＃Ｉ１００６、Ｌｏｔ＃ＬＢ０Ｃ０３４０、ｃａｓ＃３６７－９３－１）を添加した後、１６℃で１７－１９時間（最大２１時間）の間培養した。培養液は、遠心分離を通じて沈澱された大腸菌のみを収得し、－８０℃の超低温で冷凍保管した。３ｍｌの培養培地に該当する大腸菌収穫物に０．３ｍｌの溶解緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を入れて超音波粉砕した後、全体溶解物（Ｔ、Ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ）を遠心分離を通じて沈殿物（Ｐ、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）と上澄液（Ｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｌｙｓａｔｅ）に分離した後にＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果、図９に示したように、ＲＩＤをＮ－末端に追加したエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）－デングウイルス抗原融合タンパク質が高効率の水溶性発現を示していることを確認した。
＜実施例５－３＞
高効率の水溶性発現が確認された前記実施例５－２と同一の方式の培養方法を用いて５００ｍｌの大腸菌を培養及び発現を誘導して収得した細胞を７５ｍｌの溶解緩衝溶液［Ａバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で再懸濁した。前記細胞再懸濁を超音波細胞粉砕機＋（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ：ｐｕｌｓｅ １５ｓ／５０ｓ、７０％ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ、２ｍｉｎ ３０ｓ、２ｔｉｍｅｓ ｔｏｔａｌ）を用いて細胞を粉砕させた。前記溶解された細胞を４℃で１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層液を取ってＡＫＴＡ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＮｉ＋親和クロマトグラフィーを行った。まず、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ、５ｍＬ ｓｉｚｅ）カラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で平衡化させた後、細胞溶解の上層液を１ｍｌ／分の流速で前記平衡化されたカラムに積載した。ＲＩＤ－ＥＮＣ－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩタンパク質は、緩衝液Ａ及び１Ｍのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ及び１Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を用いてイミダゾールが１０ｍＭ～１Ｍ濃度範囲で線形濃度勾配で増加注入を通じて溶出し、２ｍｌずつの分画を収得した。
前記溶出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて目的（ターゲット）タンパク質の分離様相を確認した後、該当分画の溶出物をＤｉａｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で９℃で１２－１６時間の間透析した。このとき、４時間の間先に透析した後、残り８－１２時間の間ＴＥＶ切断酵素を用いてＮ－末端のＲＩＤとエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）－デングウイルス抗原融合タンパク質の間を切断した。
Ｎ－末端の融合パートナーであるＲＩＤなどが除去された目的融合タンパク質を分離及び精製するために、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ、５ｍＬ ｓｉｚｅ）カラムを用いてＤｉａｌｙｓｉｓバッファーと同一の溶液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で平衡化させた後、１ｍｌ／分の流速で前記平衡化されたカラムに積載した。Ｎ－末端の融合パートナーであるＲＩＤなどが除去されたＥＮＣ－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩ目的タンパク質は、前記カラムに吸着されず溶出される形態で回収した。
目的タンパク質の最終純度の増加のためにＡＫＴＡ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。カラム（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ、５ｍＬ ｓｉｚｅ（＃１２５０６９、Ｍｅｒｃｋ）を緩衝溶液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で平衡化した後、１ｍｌ／分の流速で積載し、緩衝溶液Ａと緩衝溶液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１Ｍ ＮａＣｌ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を通じて１０ｍＭ～１Ｍの線形濃度勾配を有するＮａＣｌ注入を通じて目的タンパク質を溶出し、各１ｍｌずつの分画で収得し、その結果、その精製様相と純度は、図１６の（ｆ）に示した通りである（図１６の（ｆ）参照）。精製されたＥＮＣ－ＤＥＮＶタンパク質は、２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）割合を含む状態で４℃で保管し、最終的に精製されたタンパク質の濃度は、ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて定量した。
＜実施例５－４＞
実施例５－３のＥＮＣ－ＤＥＮＶ ＥＤＩＩＩ融合タンパク質で構成された融合タンパク質（ＶＬＰ）の全体的な直径分布を確認するために、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を通じて分析した。前記複合体の分析は、ＤＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｆａｍｉｌｙ）を用いて１６℃の温度条件でサンプル１ｍＬをＣｕｖｅｔｔｅに入れて測定した。細胞の動的光散乱分析は、イメージで各領域別ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ及びＭａｓｓなどを用いて確認した。図１７の（ａ）のように、ＤＬＳのＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｄｉｕｓでの直径３０～４０ｎｍのＰａｒｔｉｃｌｅサイズの分布を有することを確認した。
＜実施例５－５＞
精製されたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質からなるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の外形を電子顕微鏡で観察した。精製されたＥｎｃａｐｓｕｌｉｎ ＶＬＰを先に銅グリッドに１分間載せた後、２％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて１分間染色し、１０分間常温で乾燥した後に透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１２０ｋＶ）；Ｔａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ、ＦＥＩ、Ｃｚｅｃｈ）を用いて撮影した。図１１の（ｂ）に示したように、精製されたＥＮＣ－ＤＥＮＶタンパク質がＶＬＰを形成することが確認できた。確認されたＶＬＰの直径は、既存のエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質の直径である３０～４０ｎｍの間で観察され、Ｃ－末端に抗原タンパク質が融合された融合タンパク質の形態でも球形のＶＬＰを形成することを確認した。
実施例５の結果からも実施例２の結果と同様に、本発明を用いたエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）の大腸菌での高効率タンパク質の生産及びＶＬＰ形成を全て確認した。これは、本実験の高効率及び水溶性の増進融合パートナーであるＲＩＤがエンカプスリン（Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）のＣ－末端に抗原などのタンパク質を挿入した融合タンパク質基盤のプラットフォームを形成するのに必須的であることを示す。
以上、本発明の実施例を説明したが、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明がその技術的思想や必須的な特徴を変更せずに他の具体的な形態で実施できることを理解すべきである。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。

Claims (21)

  1. 目的タンパク質；
    エンカプスリンタンパク質；及び
    ＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質；をコーディングするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ワクチン生産用組換え発現ベクター。
  2. 前記エンカプスリンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン生産用組換え発現ベクター。
  3. 前記ＲＩＤタンパク質は、前記ワクチンの発現量又は水溶性を増加させるための融合パートナーであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン生産用組換え発現ベクター。
  4. 前記ＲＩＤタンパク質は、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン生産用組換え発現ベクター。
  5. 前記目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質の間には、少なくとも一つのリンカータンパク質が位置し、
    前記リンカータンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の遺伝子配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン生産用組換え発現ベクター。
  6. 前記ポリヌクレオチドは、ＲＩＤタンパク質の切断のためにＴＥＶタンパク質を追加でコーディングすることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン生産用組換え発現ベクター。
  7. 前記目的タンパク質は、ウイルス抗原タンパク質、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清及び細胞タンパク質からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン生産用組換え発現ベクター。
  8. 前記ウイルス抗原タンパク質は、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）抗原タンパク質、子宮頸部癌ウイルス抗原タンパク質、デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）抗原タンパク質及びコロナウイルス抗原タンパク質からなる群より選択されたいずれか一つのタンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン生産用組換え発現ベクター。
  9. 請求項１～８のうちいずれか一項に記載の発現ベクターに形質転換された宿主細胞。
  10. 前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項９に記載の形質転換された宿主細胞。
  11. 目的タンパク質；エンカプスリンタンパク質；及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質；を含むことを特徴とする、融合タンパク質。
  12. 前記目的タンパク質は、エンカプスリンタンパク質のＣ－末端に連結されることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 前記目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質の間には、少なくとも一つのリンカータンパク質が位置し、
    前記リンカータンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の遺伝子配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  14. ａ）目的タンパク質；エンカプスリンタンパク質；及びＲＩＤタンパク質；をコーディングするポリヌクレオチドを含むワクチン生産用組換え発現ベクターを生産する段階；
    ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を生産する段階；及び
    ｃ）前記形質転換体を培養して組換え融合タンパク質の発現を誘導し、これを収得する段階；を含むことを特徴とする、ワクチン生産方法。
  15. 前記ＲＩＤタンパク質は、前記ワクチンの発現量又は水溶性を増加させるための融合パートナーであることを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン生産方法。
  16. 前記ＲＩＤタンパク質は、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン生産方法。
  17. 前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン生産方法。
  18. 前記エンカプスリンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列又はその一部配列を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン生産方法。
  19. 前記目的タンパク質は、ウイルス抗原タンパク質、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清及び細胞タンパク質からなる群より選択されたいずれか一つのタンパク質であることを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン生産方法。
  20. 前記ウイルス抗原タンパク質は、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）抗原タンパク質、子宮頸部癌ウイルス抗原タンパク質、デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）抗原タンパク質及びコロナウイルス抗原タンパク質からなる群より選択されたいずれか一つのタンパク質であることを特徴とする、請求項１９に記載のワクチン生産方法。
  21. 前記目的タンパク質、エンカプスリンタンパク質及びＲＩＤ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質の間には、少なくとも一つのリンカータンパク質が位置し、
    前記リンカータンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の遺伝子配列を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン生産方法。
JP2022573711A 2020-06-01 2021-05-31 エンカプスリン基盤のワクチンの生産のための組換え発現ベクター及びその製造方法 Pending JP2023527886A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0066119 2020-06-01
KR1020200066119A KR102264535B1 (ko) 2020-06-01 2020-06-01 엔캡슐린 기반 백신 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이의 제조방법
KR10-2021-0061143 2021-05-12
KR1020210061143A KR20220153767A (ko) 2021-05-12 2021-05-12 엔캡슐린 기반 뎅기 바이러스 또는 코로나 바이러스 백신 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이의 제조방법
PCT/KR2021/006758 WO2021246740A1 (ko) 2020-06-01 2021-05-31 엔캡슐린 기반 백신 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023527886A true JP2023527886A (ja) 2023-06-30

Family

ID=78831571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022573711A Pending JP2023527886A (ja) 2020-06-01 2021-05-31 エンカプスリン基盤のワクチンの生産のための組換え発現ベクター及びその製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240084310A1 (ja)
EP (1) EP4159864A1 (ja)
JP (1) JP2023527886A (ja)
AU (1) AU2021282837A1 (ja)
CA (1) CA3183499A1 (ja)
WO (1) WO2021246740A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101914779B1 (ko) * 2016-03-18 2018-11-02 (주)인테라 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터
JP6974358B2 (ja) * 2016-06-07 2021-12-01 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム Ｈｐｖ ｌ２ペプチドの免疫原性の改善
KR102014826B1 (ko) * 2017-11-23 2019-08-28 (주)인테라 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질

Also Published As

Publication number Publication date
CA3183499A1 (en) 2021-12-09
WO2021246740A1 (ko) 2021-12-09
US20240084310A1 (en) 2024-03-14
EP4159864A1 (en) 2023-04-05
AU2021282837A1 (en) 2023-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. Chaperna-mediated assembly of ferritin-based Middle East respiratory syndrome-coronavirus nanoparticles
KR100197819B1 (ko) 융합 ms2 코트 단백질을 포함하는 항원제공 캡시드
CN113164586B (zh) 免疫组合物及其制备方法与应用
AU659139B2 (en) Hybrid polypeptide
JP2528815B2 (ja) 多効果免疫性蛋白質
KR101914779B1 (ko) 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터
KR20160002938A (ko) 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖ ｆ 폴리펩타이드
CN113354740B (zh) 一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用
CN109575142B (zh) 一种cd4辅助性t细胞表位融合肽及其疫苗
CA2621466A1 (en) Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications
JP2003525619A (ja) ウイルスコートタンパク質融合体としての植物における外来ポリペプチドの産生
CN110551183A (zh) 一种人乳头瘤病毒39型l1蛋白的突变体
CN109966483B (zh) 一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用
CN113121704A (zh) 基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗
JP2023527886A (ja) エンカプスリン基盤のワクチンの生産のための組換え発現ベクター及びその製造方法
KR102038876B1 (ko) 목적 단백질의 수용성 발현을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드
CN116041534A (zh) 新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用
Muthamilselvan et al. Assembly of Human Papillomavirus 16 L1 Protein in Nicotiana benthamiana Chloroplasts into Highly Immunogenic Virus-Like Particles
WO2022177990A2 (en) Modified sars-cov-2 spike polypeptides and nanoparticles thereof
JP2023551047A (ja) ウイルス様粒子及びそれらの製造方法
CA2269757A1 (en) Structure of secretory immunoglobulin a
Wang et al. Preparation of a peptide vaccine against GnRH by a bioprocess system based on asparaginase
CN106337038B (zh) 一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用
JP4768944B2 (ja) 組換え型の治療的融合タンパク
WO2018175560A1 (en) Nanoparticle immunogens to elicit responses against the influenza receptor binding site on the hemagglutinin head domain

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230120

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20231222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231226

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240322

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240507