JP2023518223A - 有機及び無機不純物が減少したバイオベースナイロン前駆体 - Google Patents
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Abstract
有機及び無機不純物が減少したバイオベースナイロン前駆体を製造するための、改良された方法が本明細書に記載されている。この方法は一般に、リジンを生成するように操作された微生物を、好ましくは非必須無機イオンを欠くジカルボン酸アンモニウム緩衝系を有する培地を採用すること等によって、無機イオン含有量が低いか又は減少した改変培地中で発酵させる工程と、十分な量のジカルボン酸を添加することにより、使用済みリジン発酵上清からリジンを直接結晶化させる工程とを含む。このような戦略は、有機及び無機不純物が減少したカダベリンジカルボン酸塩の生成のための下流の生物変換工程で採用可能なリジンジカルボン酸塩結晶を製造することを目的としており、これにより、例えばポリアミド合成のための重合反応における下流の性能が改善される。
Description
本明細書は、バイオベースナイロン前駆体に関する。より詳細には、本明細書に記載されているのは、ナイロンの合成に使用するのに好適な有機及び無機不純物が減少したバイオベースナイロン前駆体、例えばリジン、カダベリン、及びそれらのジカルボン酸塩の製造のための改良された方法である。
地球環境への懸念の高まりにより、一般にバイオベースナイロンとして公知の生物学的前駆体に由来するポリアミドへの需要が高まっている。ほとんどのナイロンは、ジアミンとジカルボン酸の反応から作製されたポリマーである。バイオベースナイロン、例えばバイオベースナイロン6,6等は、ますます重要な工業材料になっている。バイオベースナイロン5,6は、ますます注目を集めているが、ナイロン5,6製品中の不純物はその後の用途で黄変、高温不耐性、及び他の不都合な特性を引き起こす可能性があるため、バイオベースナイロン5,6が直面している課題の1つは、純度の要件である。バイオベースナイロン5,6の重要な構成要素は、5炭素ジアミンカダベリン(ペンタメチレンジアミン、PDA)であり、これは、例えばこの目的のために特別に操作された微生物を発酵させるか、又はL-リジンの酵素的脱炭酸を伴う生物変換によって工業的に製造できる(Tsugeら、2016)。前者は、宿主微生物に対するカダベリンの有害な影響により生産性が低いことを欠点として持つが、後者は基質であるL-リジンの費用が高く純度が低いため、工業規模で実用的に実施することが困難である。カダベリンの発酵製造方法又はリジンの発酵製造方法では、基質、培地、pH調整処理等により、不可避的に大量の無機塩が生成され、これらの無機塩は除去するために複雑な処理工程を必要とすることがわかっている。また、従来技術では、カダベリンの発酵製造方法又はリジンの発酵製造方法で形成される無機塩の減少に着目した研究がある。ただし、発酵によってカダベリンを製造する場合、生物発酵の分野では、方法途中の精製工程(例えば中間体の精製工程)を最小限に抑えて全体的な効率を向上させ、操作費用を削減する「ワンポット」連続方法が好まれるのが慣例的であり、費用のかかる精製工程は通常、最終生成物まで保留される。
したがって、バイオベースナイロンが石油系ナイロンと工業規模で競合することを一層よく可能にする技術の進歩が、依然として必要である。特に、バイオベースナイロン及びその前駆体を非常に効率的で高純度な方法で製造する技術の進歩が、依然として必要である。
本発明者らは、本明細書に開示される方法を使用することにより、カダベリンジカルボン酸塩を高収率及び高純度で得ることができ、このようなカダベリンジカルボン酸塩から調製されるナイロン5,Xポリマーが高品質であり、例えば黄変又は高温不耐性が使用中に生じないことを予期せず発見した。
一態様では、本明細書に記載されているのは、無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、(c)リジンジカルボン酸塩結晶を得るように、1当量未満又は過剰のジカルボン酸を添加し、発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得るように水溶液に結晶を溶解する工程であり、リジンジカルボン酸塩流が、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を前記溶液に添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程とを含むか又は本質的にそれらからなる、方法である。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、(c)発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得る工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を前記流れに添加することにより、リジンジカルボン酸塩流のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、(e)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールであり、特に好ましくはイソプロパノールである工程とを含むか又は本質的にそれらからなる、方法である。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、(c)発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得る工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を添加することによって、リジンジカルボン酸塩流のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し;従来技術と比較して大幅に減少したリジンデカルボキシラーゼ添加比で、本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼを添加し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程とを含むか又は本質的にそれらからなる、方法である。
本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼは、その活性が比較的高いため、発酵方法中に大幅に減少した量で使用することができる。更に、本発明者らは、本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼを使用することにより、目的生成物であるカダベリンジカルボン酸塩の収率及び純度も改善できることを発見した。本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼは、以下の工程を含む方法によって処理されるリジンデカルボキシラーゼである。(1)配列番号1で表されるリジンデカルボキシラーゼのkdc遺伝子を含有するプラスミドを、大腸菌(E. coli)細胞に形質転換した。(2)形質転換した陽性単一コロニーを選択し、LB(ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/L)試験管培地に接種し、この培地に30℃及び180RPMで一晩接種した。(3)TB培地(ペプトン12g/L、酵母抽出物24g/L、及びグリセロール4g/L)を含有するフラスコに、一晩培養液から5%の接種用量で接種した。(4)フラスコをシェーカーに入れてインキュベートした。インキュベーション条件:30℃、250RPM、及び約2時間。(5)タンパク質の発現は、0.2mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。誘導条件:30℃、250RPM、及び約4時間。(6)発酵ブロスを遠心分離して細胞を採取し、遠心分離後の湿細胞を-80℃で保存した。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、(c)リジンジカルボン酸塩結晶を得るように、1当量未満又は過剰のジカルボン酸を添加し、発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得るように水溶液に結晶を溶解する工程であり、リジンジカルボン酸塩流が、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し;従来技術と比較して大幅に減少したリジンデカルボキシラーゼ添加比で本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼを添加し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、(e)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールであり、特に好ましくはイソプロパノールである工程とを含むか又は本質的にそれらからなる、方法である。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、本明細書に記載の方法によって製造されるカダベリンジカルボン酸塩、及びナイロンの作製のための本明細書に記載の方法によって製造されるカダベリンジカルボン酸塩の使用である。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスであり、この微生物は、炭素源からリジンを生成するように操作され、培地は、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されており、この発酵ブロスの無機イオン含有量は、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを採用する対応する発酵ブロスと比較して減少している。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、リジン発酵から得られるリジンジカルボン酸塩流であり、このリジンジカルボン酸塩流は、リジンカチオン、ジカルボン酸アニオンを含み、培地は、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されており、このリジンジカルボン酸塩流は、以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、無機不純物が減少し、かつカダベリンジカルボン酸塩を生成する下流の酵素的生物変換反応における性能が改善されたリジンジカルボン酸塩結晶を製造する方法である。この方法は一般に、(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、(c)リジンジカルボン酸塩結晶の形成を誘導するように、使用済み発酵ブロスに十分な量のジカルボン酸を添加する工程とを含むか又は本質的にそれらからなる。生成されたリジンジカルボン酸塩結晶は、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩と比較して、無機イオン含有量が減少している。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、有機及び無機不純物が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、上記で定義した工程(a)～(c)を含むか又は本質的にそれらからなり、 (d)工程(c)から分離したリジンジカルボン酸塩結晶を水溶液に溶解し、リジンを酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、(e)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%) 増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである工程とを更に含む、方法である。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、本明細書に記載の方法によって製造されるリジンジカルボン酸塩又はカダベリンジカルボン酸塩、及びナイロンの作製のための本明細書に記載の方法によって製造されるリジンジカルボン酸塩又はカダベリンジカルボン酸塩の使用である。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスであり、この微生物は、炭素源からリジンを生成するように操作され、培地は、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されており、この発酵ブロスの無機イオン含有量は、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを採用する対応する発酵ブロスと比較して減少している。
更なる態様では、本明細書に記載されているのは、リジン発酵から得られるリジンジカルボン酸塩流であり、このリジンジカルボン酸塩流は、リジンカチオン、ジカルボン酸アニオンを含み、培地は、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されており、このリジンジカルボン酸塩流は、以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する。
一般的な定義
見出し、及び他の識別子、例えば(a)、(b)、(i)、(ii)等は、単に明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために提示されている。明細書又は特許請求の範囲に見出し又は他の識別子が使用されていても、必ずしも工程又は要素をアルファベット順、又は数字順、又はそれらが提示されている順序で実施する必要はない。
見出し、及び他の識別子、例えば(a)、(b)、(i)、(ii)等は、単に明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために提示されている。明細書又は特許請求の範囲に見出し又は他の識別子が使用されていても、必ずしも工程又は要素をアルファベット順、又は数字順、又はそれらが提示されている順序で実施する必要はない。
特許請求の範囲及び/又は明細書で用語「含む」と組み合わせて使用される場合、単語「a」又は「an」の使用は、「1つ」を意味する場合があるが、「1つ又は複数」、「少なくとも1つ」、及び「1つ以上」の意味とも一致する。
用語「約」は、値を決定するために採用される装置又は方法の誤差の標準偏差を値が含むことを示すために使用される。一般に、術語「約」は、最大10%の変動の可能性を示すことを意味する。したがって、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10%の値の変動が、用語「約」に含まれる。別段に示されていない限り、範囲の前の用語「約」の使用は、範囲の両端に適用される。
本明細書では、用語「含む(comprising)」(並びにcomprisingの任意の形態、例えば「comprise」及び「comprises」)、「有する(having)」(並びにhavingの任意の形態、例えば「have」及び「has」)、「含む(including)」(並びにincludingの任意の形態、例えば「includes」及び「include」)又は「含有する(containing)」(並びにcontainingの任意の形態、例えば「contains」及び「contain」)は、包括的又は非制限的であり、引用されていない追加の要素又は方法(process)/方法(method)工程を排除するものではない。
本明細書では表現「本質的にそれらからなる」は、所定の実施形態に必要な要素及び実質的でない要素を指し、発明を大きく変える要素を排除する。例えば、本明細書に記載の方法は一般に、無機イオン(又は非ジカルボン酸イオン)の量を減少又は最小化すること、及び/又は本明細書で検討されるナイロン前駆体の純度を高めることに関する。したがって、このような文脈での表現「本質的にそれらからなる」は、望ましくない更なる無機イオン(又は非ジカルボン酸イオン)を導入する、及び/又はナイロン前駆体の純度を減少させ、それによって本説明の教示に反する工程及び要素を排除することを意味する。
本明細書では、本明細書に記載のイオン/対イオンの文脈における用語「無機」は、C-H結合を伴わないイオン(例えば、陰イオンすなわちアニオン)、例えばリン酸イオン、硫酸イオン、及び/又は塩化物イオンを指す。このような無機イオンは、pHの調整又は制御に利用される発酵緩衝液及び/又は緩衝剤中の反応溶液及び/又は酸/塩基の技術分野で一般的に使用される。
本明細書では、用語「リジン」は、別段に明記されていない限り、一般にL-リジンを指す。一般に、本明細書に記載の方法における発酵ブロスは、発酵のpH範囲(例えば、pH3～8)により、主にジカルボン酸塩としてモノカチオン型のリジン(Lys+)を含む。
バイオベースナイロン作製における重要な前駆体として、L-リジンを、リジンデカルボキシラーゼによって酵素的に変換することにより、カダベリン(ペンタメチレンジアミン又は1,5-ペンタンジアミン[PDA]としても公知である)を製造することができる。遊離塩基形態のL-リジンは比較的少量で市販されているが、アミノ酸は遊離塩基としての精製費用が高額であるため、現在、比較的不純な無機リジン塩酸塩又はリジン硫酸塩としてのみ工業的な量で作製及び販売されている。発酵によって工業規模で製造されるリジンの大部分は、動物飼料混合物での使用を意図しているため、市販のリジン塩酸塩又はリジン硫酸塩の純度の不足は、この目的のためには重要ではない。ただし、市販のリジン塩酸塩又はリジン硫酸塩に塩化物イオン又は硫酸イオン(及び他の有機及び/又は無機不純物)が存在すると、最終的にそこから製造されるカダベリン及び/又はカダベリンジカルボン酸塩の純度が低下し、それによってナイロン合成の性能が低下してしまう。それゆえ、バイオベースナイロン前駆体から有機及び無機不純物を除去するために、費用のかかる精製工程が従来採用されている。したがって、収率を犠牲にすることなく、有機及び無機不純物が減少した高純度のバイオベースナイロン前駆体を製造するための、改良された方法が非常に望ましい。
一部の態様では、本明細書に記載されているのは、無機不純物が減少したリジンジカルボン酸塩結晶を製造する方法であり、これはバイオベースナイロン合成の前駆体としてのカダベリンジカルボン酸塩の製造のための下流の生物変換工程において直接採用可能である。この方法は一般に、炭素源からリジンを生成するように操作された微生物を、このような操作された微生物の発酵に従来採用されていた標準的な培地(例えば、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム等の無機対アニオンを利用する培地)と比較して、無機イオン含有量が低いか又は減少した改変培地中で発酵させる工程を含む。より一般には、本明細書に記載の方法は、一部には、無機アニオン含有量(及び/又はリジン塩生成物中の所望のジカルボン酸塩以外のアニオンの含有量)を全体にわたって減少又は最小化し、それによって、最終的に製造された中間体及び/又は生成物(例えば、リジンジカルボン酸塩、カダベリンジカルボン酸塩、及びそこから製造されるナイロン)に存在するようになる対アニオン不純物の量を減少又は最小限に抑えるための戦略に関する。より具体的には、本明細書に記載の方法では、従来の方法で採用される無機アンモニウム塩(例えば、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム)をジカルボン酸アンモニウム緩衝系に置き換える。このような戦略は、イオン交換法及び/又は蒸留法等による望ましくない無機イオン(及び/又は非ジカルボン酸イオン)を除去するための下流の精製工程を削減又は回避することによって製造費用を下げ、ナイロン合成反応における性能が向上した高純度の生成物を提供し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のリジン発酵方法は、発酵が完了した後、使用済み発酵ブロス/上清に十分な量の対応するジカルボン酸を直接添加することにより、リジンをリジンジカルボン酸塩として結晶化する更なる工程を含む。驚くべきことに、ジカルボン酸を使用して得られたリジン塩結晶の収率/純度は、無機アニオン/無機酸(例えば硫酸イオン/硫酸又は塩化物イオン/塩酸)を使用して得られた収率/純度に匹敵するか、又はそれよりも高かったが、後者の方法には、イオン交換カラムに通すことによる、追加の脱塩工程が含まれているにも関わらずである。一部の実施形態では、リジンジカルボン酸塩を結晶化させるために添加されるジカルボン酸の量は、使用済み発酵ブロス中のリジンのモルに対して少なくとも1当量であってもよい。一部の実施形態では、リジンジカルボン酸塩を結晶化させるために添加されるジカルボン酸の量は、使用済み発酵ブロス中のリジンのモルに対して過剰当量であってもよい。興味深いことに、過剰なジカルボン酸を使用するリジン塩の結晶化の誘導は、等しい当量のジカルボン酸を使用する場合と比較して、結晶の形成をより促進し、結果として収率が増加することが判明した。特に、リジンジカルボン酸塩を過剰なアジピン酸で結晶化すると、本明細書で試験した様々な条件の中で、収率及び純度の両方の最も高い組合せを提示することが判明した。
本明細書では、表現「リジンジカルボン酸塩」、「リジンジカルボン酸塩結晶」及び「リジンジカルボン酸塩流」は、本明細書に記載の方法の文脈で使用される場合、本明細書に記載のリジン発酵方法の下流生成物を指し、ジカルボン酸塩緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオン(例えば、硫酸イオン、リン酸イオン、又は塩化物イオン)を用いる対応するリジン発酵方法から得られるリジン塩流と比較して、無機イオン含有量が減少している。より明確にするために、本明細書に記載のリジンジカルボン酸塩及びリジンジカルボン酸塩流は、細胞及び/若しくは細胞破片を除去するための遠心分離及び/若しくはろ過工程に供されてもよく、且つ/又はリジンジカルボン酸塩結晶を得るための結晶化工程に供されてもよい、リジン発酵の下流で得られる組成物を含む。ただし、本明細書に記載のリジンジカルボン酸塩流は、好ましくは無機イオンの除去を目的とした追加の精製工程、例えばイオン交換及び/又はこの目的のために従来採用されている他の脱塩方法を排除する。
一部の態様では、本明細書に記載されているのは、無機イオン含有量が減少した(及び/又は非ジカルボン酸イオン含有量が減少した)リジンジカルボン酸塩、リジンジカルボン酸塩結晶、及びリジンジカルボン酸塩流を製造する方法であって、改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地が、例えば、無機対アニオン(例えばリン酸イオン、硫酸イオン、及び/若しくは塩化物イオン)若しくは非ジカルボン酸対アニオン(例えば、炭酸イオン/重炭酸イオン)を採用する培地又は緩衝系の代わりに、ジカルボン酸緩衝系(例えば、アジピン酸アンモニウム緩衝系等のジカルボン酸アンモニウム緩衝系)を含むように改変されている、工程を含むか本質的にそれからなる、方法である。この方法は、リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、(例えば、水酸化アンモニウム及びジカルボン酸アンモニウムから選択される)窒素源の添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程を更に含む。この方法は、発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩結晶及び/又はリジンジカルボン酸塩流を得る工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程を更に含む。
本明細書では、表現「非ジカルボン酸イオン」又は「非ジカルボン酸アニオン」は、本明細書に記載のジカルボン酸アンモニウム緩衝系で採用されるジカルボン酸アニオン以外のジカルボン酸のアニオン、又は本明細書に記載の方法によって製造されるリジンジカルボン酸塩又はカダベリンジカルボン酸塩中に存在するジカルボン酸アニオン以外のジカルボン酸のアニオンを指す。好ましくは、本明細書に記載のリジン発酵及びカダベリンジカルボン酸塩製造方法全体を通して、単一の種類の非必須ジカルボン酸アニオン(例えば、アジピン酸アンモニウム)及び対応するジカルボン酸(例えば、アジピン酸)を採用し、それによってそれらから製造されるジカルボン酸塩に、より高度な均一性を提供する。より明確にするために、別段に明記されていない限り、本明細書では表現「ジカルボン酸塩」及び「ジカルボン酸」は、本明細書に記載の方法によって製造されるジカルボン酸塩(例えば、リジンジカルボン酸塩及び/又はカダベリンジカルボン酸塩)に組み込まれることを意図したジカルボン酸アニオン及び対応するジカルボン酸の種を指す。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法において採用される改変培地は、好ましくは非必須無機対イオン(及び/又は非必須非ジカルボン酸アニオン)を欠くように配合される。本明細書では、無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンの文脈での表現「非必須」は、所定の培地又は発酵ブロス中のそのようなアニオン(例えば、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、及び/又は炭酸/重炭酸イオン)の量を減少させ、培養/発酵された操作された微生物が、発酵方法においてその所望の機能を十分に果たすことができるが、過剰な無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンは除去されるようにすることを指す。このような改変培地は、「最少無機アニオン培地」又は「最少非ジカルボン酸アニオン培地」と称される場合があり、様々な微生物及び/又は発酵条件、並びに発酵の目的(すなわち、細胞増殖対リジン生成)に適応させてもよい。例えば、リジンを生成するために発酵される微生物(例えば、固定相微生物)の場合、非必須無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンは、培地又は発酵ブロスに存在するそのようなアニオンを指す場合があり、この目的には必要ないか、又はリジン生成に最低限必要な量を超える量で存在する。より明確にするために、リジン生成の文脈(例えば、生成発酵フェーズ)における最小必須無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンは、微生物の増殖(例えば、増殖発酵フェーズ)に必須なものと同一ではない場合がある。したがって、一部の実施形態では、細胞増殖のための非必須無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンを欠く第1の改変培地を、発酵の増殖フェーズにおいて採用することができ、微生物は、細胞増殖のために所望の細胞バイオマスのレベルに達するまで培養される。一部の実施形態では、リジン生成のための非必須無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンを欠く第2の改変培地を、発酵の生成フェーズにおいて採用することができ、微生物は細胞増殖の代わりにリジン生成のために培養される。最少培地中に存在する無機アニオン及び/又は非ジカルボン酸アニオンの種類及び正確な濃度は、リジン発酵のために選択される微生物によって異なり、採用される発酵方法条件の関数として経験的に決定される可能性があることを理解されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているのは、操作された微生物を使用してリジンジカルボン酸塩流を発酵製造するための工業的方法において使用するための改変培地であり、この改変培地は、ジカルボン酸塩緩衝系(例えば、アジピン酸アンモニウム緩衝系等のジカルボン酸アンモニウム緩衝系)を含み、好ましくは、非必須無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンを欠く。一部の実施形態では、本明細書に記載されているのは、リジンジカルボン酸塩流の発酵製造のための工業的方法において使用するための改変発酵ブロスであり、この改変発酵ブロスは、ジカルボン酸塩緩衝系(例えば、アジピン酸アンモニウム緩衝系等のジカルボン酸アンモニウム緩衝系)を含む改変培地に浸漬された、炭素源からリジンを生成するように操作された微生物を含み、好ましくは非必須無機及び/又は非ジカルボン酸対アニオンを欠く。一部の実施形態では、発酵ブロスの無機イオン含有量は、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを採用する対応する発酵ブロスと比較して減少している。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているのは、改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスであり、この微生物は炭素源からリジンを生成するように操作され、培地はジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変される。一部の実施形態では、発酵ブロスの無機イオン含有量は、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを採用する対応する発酵ブロスと比較して減少している。一部の実施形態では、総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するために、発酵ブロスにジカルボン酸アンモニウム溶液を補給してもよい。一部の実施形態では、発酵ブロスは、以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有してもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているのは、リジン発酵から得られるリジンジカルボン酸塩流であり、このリジンジカルボン酸塩流は、リジンカチオン、ジカルボン酸アニオンを含み、培地は、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されており、このリジンジカルボン酸塩流は、上記で計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リジン発酵工程において、リジンを生成するように操作された微生物によるリジン生成に十分な窒素源を発酵ブロスに補給する工程を更に含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、水酸化アンモニウム及びジカルボン酸アンモニウムから選択される窒素源を発酵ブロスに補給する工程を含む。一部の実施形態では、発酵開始後に発酵ブロスに補給される唯一の窒素源は、水酸化アンモニウム及びジカルボン酸アンモニウムから選択される。水酸化アンモニウムとジカルボン酸アンモニウムのどちらを補給するかの選択は、前者は後者よりも塩基性であるため、維持されるpHのレベルに基づいて行うことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するように、発酵ブロスに水酸化アンモニウム及び/又はジカルボン酸アンモニウム溶液を補給する工程を含む。一部の実施形態では、窒素源は、総アンモニウムレベルが約0.15%(質量/容量)に低下した場合に補給され、及び/又は総アンモニウム濃度を約0.05%～0.5%、0.05%～0.45%、0.05%～0.4%、0.05%～0.35%、0.05%～0.3%、0.05%～0.25%、0.05%～0.2%、0.1%～0.4%、0.1%～0.45%、0.1%～0.4%、0.1%～0.35%、0.1%～0.3%、0.1%～0.25%、0.1%～0.2%、又は約0.15%(質量/容量)のレベルに維持するために補給される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リジンジカルボン酸塩結晶を得るように、当量又は過剰量のジカルボン酸を添加する工程を含む結晶化工程を介して、発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩結晶及び/又はリジンジカルボン酸塩流を得る工程を含み、その後、リジンジカルボン酸塩結晶をろ過、乾燥し、水溶液に溶解できる。有利には、リジンジカルボン酸塩結晶を水溶液に溶解することができ、次いでそれに続く生物変換工程で直接採用して、リジンをカダベリンに酵素的に変換することができ、その際、追加のリジン精製工程、例えば、当技術分野で従来使用されているイオン交換法又は脱塩法を伴わない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、非必須無機イオンのいかなる更なる供給源の添加も含まず、それによってリジンジカルボン酸塩流、及びしたがって下流の中間体又はそこから派生した生成物に存在する無機イオンの量を最小限に抑える。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、発酵ブロス及び/又はリジンジカルボン酸塩流から無機及び/又は非ジカルボン酸アニオンを除去する精製工程を含まない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法において言及される無機アニオンは、微生物発酵において従来使用されているリン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、及び/又は他の非必須無機アニオンであるか、又はそれらを含む。上記は、従来の発酵によるリジンの製造方法とは対照的であり、従来の製造方法では、一般に、電気的中性を維持するためにリジン対アニオンとして培地に添加される硫酸イオン又は塩化物アニオンを採用しており、硫酸イオンの主な供給源は、従来硫酸アンモニウムである。更に、従来のリジン発酵法では、最も一般的にはイオン交換法によって発酵ブロスからリジンを精製する必要がある。例えば、リジンの場合、発酵ブロスを弱酸性にした後、典型的にはリジンをイオン交換樹脂に吸着させた後、アンモニウムイオンで樹脂から脱着させる。次いで、脱着したリジンをリジン塩基として「そのまま」使用するか、塩酸でリジン塩酸塩として結晶化する。一方、従来の方法でリジン精製工程を採用していない場合、残留成分として硫酸イオン及び塩化物イオンが残留し、製品の純度及び品質が低下してしまう。このような低純度製品は、動物飼料混合物等におけるリジンの使用には商業的に重要ではないが、バイオベースナイロン合成の前駆体としての使用には禁止されている。
EP 1182261及びUS 2019/0040429に記載されているような方法では、炭酸/重炭酸対イオンを採用して、発酵ブロス中の塩化物イオン又は硫酸イオンの存在を減少させることを試みている。ただし、このような手法では、発酵の終了時に炭酸/重炭酸イオンを蒸留するために追加の加熱工程が必要になり、それによってリジン製造方法の複雑さ及び費用が増大してしまう。対照的に、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、炭酸塩緩衝系(例えば、炭酸アンモニウム及び/又は重炭酸アンモニウム)の使用を含まず、且つ/又はリジン対アニオンとして炭酸塩若しくは炭酸イオンを含まない。更に、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リジンジカルボン酸塩流からのリジンを精製するための蒸留工程を含まないか、又は必要とせず、それによってこの方法が合理化される。
一部の実施形態では、炭素源からリジンを生成するように操作された任意の好適な微生物を採用してもよい。このような操作された微生物は、リジンの商業的製造の分野で広く利用されており、そのような操作された微生物は、いずれも本明細書に記載の方法に好適である可能性がある。一部の実施形態では、本明細書に記載のリジンを生成するように操作された微生物は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium) (例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum))又はブレビバクテリウム属(Brevibacterium) (例えば、ブレビバクテリウム・フラブム(Brevibacterium flavum)若しくはブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム(Brevibacterium Lactofermentum))に属してもよい。一部の実施形態では、リジンを生成するように操作された微生物は、操作された大腸菌(Escherichia coli)であってもよい。一部の実施形態では、リジンを生成するように操作された微生物は、真菌又は酵母であってもよい。一部の実施形態では、酵母又は真菌は、サッカロミケス属(Saccharomyces) (例えば、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、ピキア属(Pichia) (例えば、ピキア・クドリアブゼビ(Pichia kudriavzevii))、又はカンジダ属(Candida) (例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans))、又は他の工業的に好適な酵母又は真菌種に属していてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、好適な炭素源(例えば、糖類及び炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、及びセルロース;油及び脂肪、例えば、大豆油、ひまわり油、落花生油、及びやし油;脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸;アルコール、例えば、グリセロール及びエタノール;並びに有機酸類、例えば酢酸)の存在下で、微生物を発酵させる工程を含む。一部の実施形態では、これらの物質は、個別に使用してもよく、混合物として使用してもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リジン生成を可能にする培養条件下で微生物を発酵させながら、好適な塩基及び/又は酸を添加して、微生物によるリジン生成を促すレベルに発酵ブロスのpHを維持する工程を含む。一部の実施形態では、発酵中のpH制御は、発酵ブロスのpH低下を阻止するのに十分な量で、発酵ブロスに好適な塩基、例えば水酸化アンモニウムを添加することを含んでもよい。一部の実施形態では、水酸化アンモニウムの添加はまた、リジン生成のための微生物への継続的な窒素源を提供し、それによって発酵中の二重の目的(pH調節及び窒素源)を果たす。必要に応じて、一部の実施形態における発酵ブロスのpHは、有機酸類、例えばジカルボン酸(例えば、アジピン酸)及び/又はジカルボン酸アンモニウム(例えば、アジピン酸アンモニウム)を添加することによって低下/調整してもよい。ジカルボン酸及び/又はジカルボン酸アンモニウムは、コハク酸/コハク酸アンモニウム、グルタル酸/グルタル酸アンモニウム、アジピン酸/アジピン酸アンモニウム、ピメリン酸/ピメリン酸アンモニウム、スベリン酸/スベリン酸アンモニウム、アゼライン酸/アゼライン酸アンモニウム、セバシン酸/セバシン酸アンモニウム、ウンデカンジカルボン酸/ウンデカンジカルボン酸アンモニウム、ドデカンジカルボン酸/ドデカンジカルボン酸アンモニウム、トリデカンジカルボン酸/トリデカンジカルボン酸アンモニウム、テトラデカンジカルボン酸/テトラデカンジカルボン酸アンモニウム、ペンタデカンジカルボン酸/ペンタデカンジカルボン酸アンモニウム、ヘキサデカンジカルボン酸/ヘキサデカンジカルボン酸アンモニウム、ヘプタデカンジカルボン酸/ヘプタデカンジカルボン酸アンモニウム、オクタデカンジカルボン酸/オクタデカンジカルボン酸アンモニウムから選択されてもよい。好ましくは、ジカルボン酸及び/又はジカルボン酸アンモニウムは、アジピン酸/アジピン酸アンモニウム、ピメリン酸/ピメリン酸アンモニウム、スベリン酸/スベリン酸アンモニウム、アゼライン酸/アゼライン酸アンモニウムから選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、発酵終了時にリジンジカルボン酸塩流を得る工程を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、無機及び/又は非ジカルボン酸イオン(例えば、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン/重炭酸イオン、又は他の非ジカルボン酸アニオン)を除去するためのリジン精製工程を含まないか、又は必要としなくてもよい。一部の実施形態では、発酵ブロスは、細胞及び/若しくは細胞破片を除去するための遠心分離及び/若しくはろ過工程に供されてもよく、且つ/又はリジンジカルボン酸塩結晶を得るための結晶化工程に供されてもよく、続いてリジンジカルボン酸塩を水溶液に再溶解させてもよい。特に好ましい実施形態では、発酵ブロスは、リジンジカルボン酸塩結晶を得るための結晶化工程に供されてもよく、続いてリジンジカルボン酸塩を水溶液に再溶解させてもよい。一部の実施形態では、このようにして得られたリジンジカルボン酸塩流は、有利にはその後の脱炭酸反応において直接使用してカダベリン及び/又はカダベリンジカルボン酸塩を生成してもよい。
本発明者らは、ワンポット発酵方法によるカダベリンの製造方法と比較して、リジンの追加の精製工程、例えば当技術分野で従来使用されているイオン交換法又は脱塩法を必要とせずに、中間体リジン塩の結晶化による精製により、生成物であるカダベリンの収率及び純度の増加(不純物、例えば酢酸、タンパク質、乳酸、ピルビン酸の量を大幅に減少させ、場合によってはゼロまで減少させさえする)、並びに光透過率の増加及び黄変の回避を可能にできることを発見した。一部の実施形態では、ワンポット発酵方法により製造されるカダベリンジカルボン酸塩(好ましくはアジピン酸塩)と比較して、中間体リジンジカルボン酸塩(好ましくはアジピン酸塩)を結晶化することによって製造されるカダベリンジカルボン酸塩は、(1)収率の増加、(2)不純物、例えば酢酸、乳酸、及びピルビン酸がない、(3)タンパク質の量の大幅な減少、(4)光透過率の増加、並びに(5)黄変がない、という特徴の1つ又は複数を有することができる。別の実施形態では、過剰量のジカルボン酸を使用することによる結晶化は、等しい当量のジカルボン酸を使用することによる結晶化と比較して、生成物のカダベリン塩の収率及び純度を更に増加させ得ることが判明した。
一部の実施形態では、結晶性リジンジカルボン酸塩流を使用して製造されるカダベリンジカルボン酸塩は、結晶性リジン硫酸塩又は塩化リジンから製造される対応するカダベリンの無機塩(例えば、硫酸塩及び塩化物塩)の収率及び純度と比較して、より高い収率及び純度を有する。別の実施形態では、過剰量のジカルボン酸を使用してリジンジカルボン酸塩を形成する場合、等しい当量のジカルボン酸を使用して形成されるリジンジカルボン酸塩と比較して、最終生成物のカダベリンジカルボン酸塩をより高い収率で製造することができる。
なお更なる実施形態では、本明細書に記載のリジンジカルボン酸塩を形成する場合、使用されるジカルボン酸は、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸、トリデカンジカルボン酸、テトラデカンジカルボン酸、ペンタデカンジカルボン酸、ヘキサデカンジカルボン酸、ヘプタデカンジカルボン酸、及びオクタデカンジカルボン酸から選択されてもよい。特に、アジピン酸、スベリン酸、及びアゼライン酸を使用することができる。更に、驚くべきことに、使用するジカルボン酸の炭素鎖長が長過ぎる場合(例えば、ドデカンジカルボン酸)、最終生成物であるカダベリンジカルボン酸塩の収率及び純度が低下することが判明した。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ジカルボン酸イオンの代わりに無機イオンを用いる(すなわち、培地で採用される緩衝系において)対応する方法によって製造される発酵ブロスと比較して、無機イオン含有量が減少した発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得る工程を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リジン生成フェーズの前に、(例えば、リジン生成フェーズに非必須であると考えられる無機イオンを過剰に含むように配合された)増殖培地で、所望の細胞量のレベルに達するまで細胞増殖を最適化又は最大化するために、微生物を培養する工程を含む増殖フェーズを含んでもよく、その後、この増殖培地を本明細書に記載の非必須無機イオンを欠く改変培地に置き換える。代替的に、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リジン生成フェーズの前に、(例えば、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように配合され、非必須無機塩を欠くように配合された)最少増殖培地で、所望の細胞量のレベルに達するまで細胞増殖を最適化又は最大化するために、微生物を培養する工程を含む増殖フェーズを含んでもよく、この最少増殖培地は、改変培地であるか、又は本明細書に記載の改変培地に置き換えられる。
一部の実施形態では、微生物を固定化して培地交換及び/又は下流のリジン精製を容易にしてもよい。好適な細胞固定化法の例は、Zhu 2007で議論され、概説されている。
一部の態様では、本明細書に記載されているのは、無機塩含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法である。この方法は、無機イオン含有量が減少したリジンの発酵製造のための本明細書に記載の方法工程を含むか又は本質的にそれからなってもよく、且つ、リジンジカルボン酸塩流を酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程を更に含む。様々な実施形態では、任意の好適なリジンデカルボキシラーゼ酵素を脱炭酸反応に採用することができる。一部の実施形態では、採用されるリジンデカルボキシラーゼ酵素は、配列番号1と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一の核酸配列によってコードされ得る。一部の実施形態では、採用されるリジンデカルボキシラーゼ酵素は、配列番号2と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一のアミノ酸配列を含んでもよい。
リジンデカルボキシラーゼ添加比は、リジンデカルボキシラーゼの添加質量(リジンデカルボキシラーゼ細胞の乾燥ベースに基づいて計算)の、リジン発酵ブロス中のリジンの質量(リジンジカルボン酸塩の分子量に基づく)に対する比と定義できる。当技術分野では、リジンデカルボキシラーゼ添加比が比較的高く、例えば、(1:80)～(1:295)というのが一般的である。ただし、本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼを使用する場合、その活性が高いため、発酵中のリジンデカルボキシラーゼ添加比を劇的に低下させることができる。例えば、本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼのリジンデカルボキシラーゼ添加比は、(1:600)～(1:1000)であり得る。
更に、本発明者らは、本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼを使用することにより、目的生成物であるカダベリンジカルボン酸塩の収率及び純度も改善できることを発見した。本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼは、以下の工程を含む方法によって処理されるリジンデカルボキシラーゼである。(1)配列番号1で表されるリジンデカルボキシラーゼのkdc遺伝子を含有するプラスミドを、大腸菌細胞に形質転換した。(2)形質転換した陽性単一コロニーを選択し、LB(ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/L)試験管培地に接種し、この培地に30℃及び180RPMで一晩接種した。(3)TB培地(ペプトン12g/L、酵母抽出物24g/L、及びグリセロール4g/L)を含有するフラスコに、一晩培養液から5%の接種用量で接種した。(4)フラスコをシェーカーに入れてインキュベートした。インキュベーション条件:30℃、250RPM、及び約2時間。(5)タンパク質の発現は、0.2mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。誘導条件:30℃、250RPM、及び約4時間。(6)発酵ブロスを遠心分離して細胞を採取し、遠心分離後の湿細胞を-80℃で保存した。好ましい実施形態では、大腸菌は、BL21(DE3)大腸菌である。更に好ましい実施形態では、工程(2)におけるインキュベーション条件は、30℃、180RPM、及び16時間の振とうによるインキュベーションであった。更に好ましい実施形態では、TB培地を含有するフラスコに、一晩培養した40mLのLB培地発酵ブロスから5%の接種用量で接種した。更に好ましい実施形態では、工程(4)におけるインキュベーション時間は、2時間であった。更に好ましい実施形態では、IPTGの濃度は0.2mMであった。更に好ましい実施形態では、工程(5)において、振とうしながら30℃で更に4時間インキュベーションを行った。
米国特許第7,189,543号は、カダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、リジン溶液を酵素的脱炭酸反応に供しながら、溶液にジカルボン酸を添加することによってpHを目標範囲内に維持し、得られたカダベリンジカルボン酸塩を、例えば結晶化によって分離する工程を伴う、方法について記載している。米国特許第7,189,543号に記載の分離/結晶化方法を再現しようとしても、商業的に実行可能なカダベリンジカルボン酸塩の収率は結果的に得られなかった(例えば、わずか45%の収率しか得られなかった実施例18を参照されたい)。したがって、様々な結晶化方法が探究され、試験されており、その一部が本明細書に記載されている。驚くべきことに、十分な量の有機溶媒、好ましくは、例えば、25℃、20℃、又は15℃未満の温度(例えば、5℃～20℃又は10℃～15℃の範囲)の冷却された有機溶媒を溶液に添加することによって、結晶化を大幅に改善できることが判明した。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のカダベリン製造方法は、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程を含み、有機溶媒を添加することにより、有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の量が(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加し、この有機溶媒は、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである。
更に、本発明者らは、驚くべきことに、アルコール系溶媒を使用することによってカダベリンジカルボン酸塩を結晶化させる場合、イソプロパノールを使用して得られる生成物の収率及び純度の両方が、一般的な脂肪族低級アルコール(例えば、メタノール、エタノール、及びn-プロパノール)を使用して得られるものよりも高いことを発見した。一実施形態では、カダベリンアジピン酸塩を結晶化するためのイソプロパノールの使用は、カダベリンアジピン酸塩をn-プロパノールで結晶化することによって得られる収率と比較して、少なくとも10%、例えば少なくとも11%、12%、13%、14%、又は15%の生成物収率の増加をもたらす。
一部の態様では、本明細書に記載されているのは、無機塩の含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、リジンジカルボン酸塩を含む水溶液を用意する工程と、リジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、溶液にジカルボン酸を添加することにより、この溶液のpHを反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒の添加が、有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の量を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させる、工程とを含むか又は本質的にそれらからなる、方法である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の酵素的脱炭酸反応は、リジン生成物又はリジンジカルボン酸塩を、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞に供することによって実施され得る。一部の実施形態では、例えばZhu 2007に記載されているように、生存細胞又は無傷細胞が固定化されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の酵素的脱炭酸反応は、リジン生成物又はリジンジカルボン酸塩を、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の細胞溶解物に供することによって実施されてもよい。細胞溶解物の代わりに生存細胞又は無傷細胞を使用することにより、反応溶液からの細胞成分を下流で精製することを容易にする場合がある。
一部の実施形態では、本明細書では用語「ジカルボン酸塩」及び「ジカルボン酸」は、ナイロン塩、ナイロン、工業的に関連するリジン塩及び/又は工業的に関連するカダベリン塩の製造のための前駆体又は中間体として有用なジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸を指す。一部の実施形態では、ジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸は、4～10個の炭素を有するジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸(例えば、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、又はセバシン酸)であってもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び生成物に採用されるジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸は、アジピン酸塩及び/又はアジピン酸である。
一部の態様では、本明細書に記載されているのは、本明細書に記載の方法によって製造されるカダベリンジカルボン酸塩である。一部の態様では、本明細書に記載されているのは、ナイロン(例えば、ナイロン5,6)の作製のために本明細書に記載の方法によって製造されるカダベリンジカルボン酸塩の使用である。
項目
様々な態様では、本明細書に記載されているのは、以下の項目のうちの1つ又は複数である。
様々な態様では、本明細書に記載されているのは、以下の項目のうちの1つ又は複数である。
1. 無機不純物が減少したリジンジカルボン酸塩結晶を製造する方法であって、(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている工程と、(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、(c)リジンジカルボン酸塩結晶の形成を誘導するように、使用済み発酵ブロスに十分な量のジカルボン酸を添加する工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩と比較して、リジンジカルボン酸塩結晶の無機イオン含有量が減少している、工程とを含むか又は本質的にそれらからなる、方法。
2. 工程(c)で添加された十分な量のジカルボン酸が、使用済み発酵ブロス中のリジンのモルに対して少なくとも1当量に相当する、項目1に記載の方法。
3. 工程(c)で添加された十分な量のジカルボン酸が、使用済み発酵ブロス中のリジンのモルに対して過剰当量に相当する、項目1に記載の方法。
4. 工程(b)が、総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するように、好ましくは総アンモニウム濃度を0.05%w/v～0.5%w/vに維持するように、発酵ブロスにジカルボン酸アンモニウム溶液を補給する工程を更に含む、項目1から3のいずれか1つに記載の方法。
5. 結晶化前に、使用済み発酵ブロスが、以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、項目1から4のいずれか1つに記載の方法。
6. (i)いかなる更なる非必須無機アニオンの供給源の添加も含まず、それによってリジンジカルボン酸塩流に存在する無機アニオンの量を最小限に抑え、且つ/又は(ii)発酵ブロス及び/若しくはリジンジカルボン酸塩流から無機イオンを除去する精製工程(例えば、脱塩及び/若しくはイオン交換)を含まない、項目1から5のいずれか1つに記載の方法。
7. 無機イオンが、リン酸アニオン、硫酸アニオン、及び/若しくは塩化物アニオンであるか、又はそれらを含む、項目1から6のいずれか1つに記載の方法。
8. 炭酸塩緩衝系(例えば、炭酸アンモニウム及び/若しくは重炭酸アンモニウム)の使用を含まず、且つ/又はリジン対アニオンとして炭酸塩若しくは炭酸アニオンを含まない、項目1から7のいずれか1つに記載の方法。
9. リジンを精製するための蒸留工程を含まない、項目1から8のいずれか1つに記載の方法。
10. 工程(a)の前に、(i)無機塩を含むように配合された増殖培地、又は(ii)非必須無機塩を欠くように配合された増殖培地で、所望の細胞量に達するまで微生物を培養し、その後、この増殖培地を、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含み、非必須無機イオンを欠く前記改変培地に置き換える、項目1から9のいずれか1つに記載の方法。
11. リジンを生成するように操作された微生物を固定化して、培地交換及び/又はリジンジカルボン酸塩流処理を容易にする、項目1から10のいずれか1つに記載の方法。
12. リジンを生成するように操作された微生物が細菌であり、好ましくはコリネバクテリウム属(例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム)又はブレビバクテリウム属(例えば、ブレビバクテリウム・フラブム若しくはブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム)に属する、項目1から11のいずれか1つに記載の方法。
13. 有機及び無機不純物が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、項目1から12のいずれか1つに定義した工程(a)～(c)を含むか又は本質的にそれらからなり、(d)工程(c)から分離したリジンジカルボン酸塩結晶を水溶液に溶解する工程であり、リジンを酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、(e)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである工程とを更に含む、方法。
14. 有機及び無機不純物が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、(i)リジンジカルボン酸塩を含む水溶液を用意する工程と、(ii)リジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、(iii)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである工程とを含むか又は本質的にそれらからなる、方法。
15. 酵素的脱炭酸反応が、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞に、リジンを供することによって実施される、項目13又は14に記載の方法。
16. リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞が固定化される、項目15に記載の方法。
17. 酵素的脱炭酸反応が、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の細胞溶解物に、リジンを供することによって実施される、項目15又は16に記載の方法。
18. リジンデカルボキシラーゼが、配列番号2のリジンデカルボキシラーゼであるか、又は配列番号2と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%同一のアミノ酸配列を含むリジンデカルボキシラーゼ活性を有するその変異体である、項目15から17のいずれか1つに記載の方法。
19. 前記ジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸が、4～18個の炭素、4～16個の炭素、4～14個の炭素、4～12個の炭素、4～10個の炭素、4～9個の炭素、6～10個の炭素、又は6～9個の炭素を含有する、項目1から18のいずれか1つに記載の方法。
20. - ジカルボン酸塩がコハク酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がコハク酸であり、それによってリジンコハク酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がグルタル酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がグルタル酸であり、それによってリジングルタル酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアジピン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアジピン酸であり、それによってリジンアジピン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がピメリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がピメリン酸であり、それによってリジンピメリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がスベリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がスベリン酸であり、それによってリジンスベリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアゼライン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアゼライン酸であり、それによってリジンアゼライン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がセバシン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がセバシン酸であり、それによってリジンセバシン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がウンデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がウンデカンジカルボン酸であり、それによってリジンウンデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がドデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がドデカンジカルボン酸であり、それによってリジンドデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がトリデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がトリデカンジカルボン酸であり、それによってリジントリデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がテトラデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がテトラデカンジカルボン酸であり、それによってリジンテトラデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がペンタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がペンタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンペンタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘキサデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘキサデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘキサデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘプタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘプタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘプタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がオクタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がオクタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンオクタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成される、項目1から19のいずれか1つに記載の方法。
- ジカルボン酸塩がグルタル酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がグルタル酸であり、それによってリジングルタル酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアジピン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアジピン酸であり、それによってリジンアジピン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がピメリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がピメリン酸であり、それによってリジンピメリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がスベリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がスベリン酸であり、それによってリジンスベリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアゼライン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアゼライン酸であり、それによってリジンアゼライン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がセバシン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がセバシン酸であり、それによってリジンセバシン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がウンデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がウンデカンジカルボン酸であり、それによってリジンウンデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がドデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がドデカンジカルボン酸であり、それによってリジンドデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がトリデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がトリデカンジカルボン酸であり、それによってリジントリデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がテトラデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がテトラデカンジカルボン酸であり、それによってリジンテトラデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がペンタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がペンタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンペンタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘキサデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘキサデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘキサデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘプタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘプタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘプタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がオクタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がオクタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンオクタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成される、項目1から19のいずれか1つに記載の方法。
21. 項目13から20のいずれか1つに記載の方法によって製造される、カダベリンジカルボン酸塩。
22. ナイロンの作製のための、項目13から20のいずれか1つに記載の方法によって製造される、カダベリンジカルボン酸塩の使用。
23. カダベリンジカルボン酸塩が、カダベリンアジピン酸塩であり、ナイロンがナイロン5,6である、項目22に記載の使用。
24. 改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスであって、この微生物が炭素源からリジンを生成するように操作され、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変され、この発酵ブロスの無機イオン含有量が、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを採用する対応する発酵ブロスと比較して減少している、発酵ブロス。
25. 総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するために、好ましくは総アンモニウム濃度を0.05%w/v～0.5%w/vに維持するために、ジカルボン酸アンモニウム溶液が補給される、項目24に記載の発酵ブロス。
26. 以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、項目24又は25に記載の発酵ブロス。
27. リジンを生成するように操作された微生物が、項目11又は12で定義されているとおりである、項目24又は26に記載の発酵ブロス。
28. リジン発酵から得られるリジンジカルボン酸塩流であって、リジンカチオン、ジカルボン酸アニオンを含み、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されており、以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、リジンジカルボン酸塩流。
29. 無機イオンが、リン酸アニオン、硫酸アニオン、及び/若しくは塩化物アニオンであるか、又はそれらを含む、項目24から27のいずれか1つに記載の発酵ブロス、又は項目28に記載のリジンジカルボン酸塩流。
30. 炭酸塩緩衝系(例えば、炭酸アンモニウム及び/若しくは重炭酸アンモニウム)を含まず、且つ/又はリジン対アニオンとして炭酸塩若しくは炭酸アニオンを含まない、項目24から27若しくは29のいずれか1つに記載の発酵ブロス、又は項目28若しくは29に記載のリジンジカルボン酸塩流。
(実施例1)
一般的な材料及び方法
以下の基準材料が実施例で使用される。組換えDNA操作は一般に、Sambrookら(2001)に記載された方法に従う。制限酵素、T4 DNAリガーゼ、Rapid DNA Ligation Kit、SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit、Plasmid Mini-Prep Kit、及びアガロースは、Sangon Biotech社(中国、上海)から購入している。TE緩衝液は、10mMトリスHCl(pH8.0)及び1mMのNa2EDTA(pH8.0)を含有している。TAE緩衝液は、40mMトリスアセタート(pH8.0)及び2mMのNa2EDTAを含有している。
一般的な材料及び方法
以下の基準材料が実施例で使用される。組換えDNA操作は一般に、Sambrookら(2001)に記載された方法に従う。制限酵素、T4 DNAリガーゼ、Rapid DNA Ligation Kit、SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit、Plasmid Mini-Prep Kit、及びアガロースは、Sangon Biotech社(中国、上海)から購入している。TE緩衝液は、10mMトリスHCl(pH8.0)及び1mMのNa2EDTA(pH8.0)を含有している。TAE緩衝液は、40mMトリスアセタート(pH8.0)及び2mMのNa2EDTAを含有している。
実施例2では、制限酵素消化をSangon Biotech社が提供する緩衝液で実施した。
典型的な制限酵素消化は、8μLのTEにDNA0.8μg、制限酵素緩衝液(10倍濃度)2μL、ウシ血清アルブミン(0.1mg/mL)1μL、制限酵素1μL、及びTEを8μL含有する。反応物を37℃で1時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によって分析する。クローニング実験に使用したDNAを消化し、70℃で15分間加熱して反応を終了した後、SanPrep Column DNA Gel Extraction Kitを使用してDNAを抽出した。試料中のDNA濃度を、次のように求めた。DNAのアリコット(10μL)を、TEで1mLに希釈し、260nmでの吸光度をTEの吸光度に対して測定した。DNA濃度を、二本鎖DNA50μg/mLの260nmでの吸光度が1.0であるという事実に基づいて計算した。
アガロースゲルは、典型的にはTAE緩衝液に0.7%のアガロース(質量/容量)を含有している。臭化エチジウム(0.5μg/ml)をアガロースに添加して、UVランプ下でDNA断片を視覚化できるようにした。アガロースゲルを、TAE緩衝液に泳動させた。DNA断片のサイズを、Sangon Biotech社から入手した1kb Plus DNA Ladderを2セット使用して求めた。
(実施例2)
大腸菌で発現するリジンデカルボキシラーゼのクローニング、発現及び活性試験
大腸菌リジンデカルボキシラーゼkdc(2-ケト酸デカルボキシラーゼ)遺伝子を合成し、pET21a(Millipore Sigma社、旧Novagen社)にクローニングした。大腸菌株BW25113(E.C. 4.1.1.18)由来の野生型kdc核酸配列は、配列番号1、アミノ酸配列は、配列番号2で表されており、それぞれリジンデカルボキシラーゼとして注釈が付けられている。
大腸菌で発現するリジンデカルボキシラーゼのクローニング、発現及び活性試験
大腸菌リジンデカルボキシラーゼkdc(2-ケト酸デカルボキシラーゼ)遺伝子を合成し、pET21a(Millipore Sigma社、旧Novagen社)にクローニングした。大腸菌株BW25113(E.C. 4.1.1.18)由来の野生型kdc核酸配列は、配列番号1、アミノ酸配列は、配列番号2で表されており、それぞれリジンデカルボキシラーゼとして注釈が付けられている。
配列番号1で表されるkdc遺伝子を含有するプラスミドを、BL21(DE3)大腸菌細胞に形質転換した。また、空プラスミドpET21aをネガティブコントロールとして形質転換した。酵素の発現及び特性評価実験では、40mLのTBを含有するフラスコに一晩培養液から5%で接種し、振とうした。フラスコを30℃にて250rpmで2時間振とうしながらインキュベートし、次いで0.2mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)でタンパク質生成を誘導し、振とうしながら30℃にて250rpmで4時間インキュベートした後、インキュベーションを終了した。遠心分離によって細胞を採取し、遠心分離で採取された湿細胞を-80℃で保存した。
KDC酵素活性を、pHベースのin vitroアッセイで評価した。酵素活性を、市販のリジン-HCl塩を使用して試験した。別段に明記されていない限り、すべての化学物質はSigma-Aldrich Chemical社(米国ミズーリ州、St.Louis)から購入した。まず、卓上ソニケーターを使用して細胞を溶解した。細胞溶解物を、遠心分離(14,000gで5分間)によって部分的に清澄化した。得られた清澄化溶解物のタンパク質濃度を、Bradford Protein Assay Kit(Sangon Biotech社)で測定した。溶解物を、10mMトリス緩衝液での希釈によるタンパク質濃度によって標準化した。次いで、標準化した溶解物を、10mMトリス緩衝液で1:5に希釈した。マルチウェルプレートアッセイのために、各ウェルに20μLの溶解物を添加した。各条件を三連で実施した。
反応混合物は、リジン-HClを15%、ピリドキサール-5'-リン酸(PLP)を0.04%含有していた。各反応混合物のpHを、1MのH2SO4及び1NのNaOHを添加することにより、pH約6.5に調整した。次いで、1MのH2SO4を添加してpHを6.5に常に維持しながら、溶解物を反応混合物に添加した。H2SO4の使用量を記録し、酵素の活性を計算するために使用した。アッセイ反応は、pHを6.5に維持するためにH2SO4を添加する必要がなくなった時点で完了した。
(実施例3)
KDCを過剰発現する形質転換大腸菌の発酵
本実施例のために、増殖培地を次のように調製した。すべての溶液を蒸留脱イオン水で調製した。LB培地(1L)は、Bacto(商標)トリプトン(すなわち、カゼインの酵素消化物)(10g)、Bacto(商標)酵母抽出物(すなわち、自己消化酵母細胞の水溶性部分)(5g)、及びNaCl(10g)を含有していた。LB-グルコース培地は、1LのLB培地にグルコース(10g)、MgSO4(0.12g)、及び塩酸チアミン(0.001g)を含有している。LB凍結緩衝液は、1LのLB培地にK2HPO4(6.3g)、KH2PO4(1.8g)、MgSO4(1.0g)、(NH4)2SO4(0.9g)、クエン酸ナトリウム二水和物(0.5g)、及びグリセロール(44mL)を含有していた。M9塩(1L)は、Na2HPO4(6g)、KH2PO4(3g)、NH4Cl(1g)、及びNaCl(0.5g)を含有している。M9最小培地は、1LのM9塩にD-グルコース(10g)、MgSO4(0.12g)、及び塩酸チアミン(0.001g)を含有していた。抗生物質を、以下のアンピシリン(Ap)、50μg/mL;クロラムフェニコール(Cm)、20μg/mL;カナマイシン(Kan)、50μg/mL;テトラサイクリン(Tc)、12.5μg/mLの最終濃度に適切な場合に添加した。抗生物質の原液は、95%エタノールで調製されたクロラムフェニコール及び50%水性エタノールで調製されたテトラサイクリンを除いて、水中で調製した。IPTGの水性原液を、様々な濃度で調製した。
KDCを過剰発現する形質転換大腸菌の発酵
本実施例のために、増殖培地を次のように調製した。すべての溶液を蒸留脱イオン水で調製した。LB培地(1L)は、Bacto(商標)トリプトン(すなわち、カゼインの酵素消化物)(10g)、Bacto(商標)酵母抽出物(すなわち、自己消化酵母細胞の水溶性部分)(5g)、及びNaCl(10g)を含有していた。LB-グルコース培地は、1LのLB培地にグルコース(10g)、MgSO4(0.12g)、及び塩酸チアミン(0.001g)を含有している。LB凍結緩衝液は、1LのLB培地にK2HPO4(6.3g)、KH2PO4(1.8g)、MgSO4(1.0g)、(NH4)2SO4(0.9g)、クエン酸ナトリウム二水和物(0.5g)、及びグリセロール(44mL)を含有していた。M9塩(1L)は、Na2HPO4(6g)、KH2PO4(3g)、NH4Cl(1g)、及びNaCl(0.5g)を含有している。M9最小培地は、1LのM9塩にD-グルコース(10g)、MgSO4(0.12g)、及び塩酸チアミン(0.001g)を含有していた。抗生物質を、以下のアンピシリン(Ap)、50μg/mL;クロラムフェニコール(Cm)、20μg/mL;カナマイシン(Kan)、50μg/mL;テトラサイクリン(Tc)、12.5μg/mLの最終濃度に適切な場合に添加した。抗生物質の原液は、95%エタノールで調製されたクロラムフェニコール及び50%水性エタノールで調製されたテトラサイクリンを除いて、水中で調製した。IPTGの水性原液を、様々な濃度で調製した。
標準発酵培地(1L)は、K2HPO4(7.5g)、クエン酸鉄(III)アンモニウム(0.3g)、クエン酸一水和物(2.1g)、及び濃H2SO4(1.2mL)を含有していた。オートクレーブ処理前に、濃NH4OHを添加して発酵培地をpH7.0に調整した。発酵開始直前に、D-グルコース、MgSO4(0.24g)、カリウム及び(NH4)6(Mo7O24)・4H2O(0.0037g)、ZnSO4・7H2O(0.0029g)、H3BO3(0.0247g)、CuSO4・5H2O(0.0025g)、及びMnCl2・4H2O(0.0158g)を含む微量ミネラル類の補給物を添加した。IPTG原液は、必要に応じて(例えば、600nmの光学密度が15から20の間にある場合)、指定された最終濃度に添加した。グルコース供給溶液及びMgSO4(1M)溶液を、別々にオートクレーブ処理した。グルコース供給溶液(650g/L)を、300gのグルコース及び280mLのH2Oを組み合わせて調製した。微量ミネラル類及びIPTGの溶液を0.22μmの膜を通して滅菌した。必要に応じて、発酵ブロスに消泡剤(Sigma 204)を添加した。典型的な湿潤大腸菌細胞密度は、120g/Lに達した。
(実施例4A)
過剰硫酸(1.2当量)によるリジン発酵上清からのリジン硫酸塩の結晶化
リジンを、炭水化物からリジンを生成するように操作された市販のコリネバクテリウム・グルタミクム株の発酵によって得た。C.グルタミクムを、温度(一般に25℃から37℃の間、最適な温度は約30℃)及びpH(7.0から7.4の間)の厳密な制御を維持しながら発酵させた。更に、C.グルタミクムは非常に酸素を必要とするため、発酵容器を指数関数的増殖フェーズの間通気する。
過剰硫酸(1.2当量)によるリジン発酵上清からのリジン硫酸塩の結晶化
リジンを、炭水化物からリジンを生成するように操作された市販のコリネバクテリウム・グルタミクム株の発酵によって得た。C.グルタミクムを、温度(一般に25℃から37℃の間、最適な温度は約30℃)及びpH(7.0から7.4の間)の厳密な制御を維持しながら発酵させた。更に、C.グルタミクムは非常に酸素を必要とするため、発酵容器を指数関数的増殖フェーズの間通気する。
C.グルタミクムは、ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/Lを含有する種子培地で最初に培養し、3つの1L三角フラスコに400mLの量で導入した。フラスコは、最初に120℃で20分間加熱して滅菌した。滅菌後、フラスコを30℃まで冷却し、LBプレート上で増殖させたC.グルタミクムのコロニーをこの培地に接種した。得られた培養液を30℃及びpH7.0で9時間インキュベートし、十分な通気及び撹拌を行った。
種子培養後、次いでC.グルタミクムは、グルコース25g/L、硫酸アンモニウム15g/L、リン酸二水素カリウム1.5g/L、グルタミン酸ナトリウム5g/L、塩化ナトリウム1g/L、酵母抽出物0.5g/Lを含有する培地にてpH7で発酵させ、15Lステンレス鋼発酵槽に8Lの量(この容量は、発酵の過程で増大する)で導入した。槽は、最初に120℃で20分加熱して滅菌した。滅菌後、槽を30℃まで冷却し、次いで上記の種子培養液1Lを培地に接種し、30℃で培養し、1vvmでの通気及び800rpmでの撹拌を行った。25%水酸化アンモニウム溶液を添加して、pHを制御した。培養液中のグルコース濃度が0.5～1.0%に低下した場合、供給溶液を培地に連続的に添加して、糖レベルを0.5から0.8%の間に維持した。供給溶液は、pH7.0で、グルコース110g/L、硫酸マグネシウム8.9g/L、塩化カリウム5.3g/L、リン酸4g/L、及び酵母抽出物1.5g/Lを含有していた。総アンモニウムレベルが0.15%に低下した場合、硫酸アンモニウム溶液(450g/L)を補給して、総アンモニウムレベルを0.1～0.2%に維持した。
発酵が完了した後、グルコース、水酸化アンモニウム、及び硫酸アンモニウムを添加して発酵ブロスの総容量を10Lに増加させ、次いで遠心分離によって細胞を使用済み培地から分離した。次いで、精密ろ過及び限外ろ過により、無細胞上清を清澄化した。続いて、このプロセス流をイオン交換カラムに通して脱塩し、リジン146g/Lを含有する溶液を得て濃縮させ、次いで1200g(1.2当量、1200g/L)の98%硫酸を添加して生成物であるリジン硫酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジン硫酸塩(すなわち、ジリジンモノサルファート)の純度を求めた。経時的な発酵によるリジンの生成を、図1に示す。リジン-硫酸塩の含有量は98.3%であり、収率は82.6%であることがわかった。
(実施例4B)
過剰塩酸(1.2当量)によるリジン発酵上清からのリジン塩酸塩の結晶化
リジンを、炭水化物からリジンを生成するように操作された市販のC.グルタミクム株の発酵によって得た。C.グルタミクムを、温度(一般に25℃から37℃の間、最適な温度は約15～30℃)及びpH(7.0から7.4の間)の厳密な制御を維持しながら発酵させた。更に、C.グルタミクムは非常に酸素を必要とするため、発酵容器を指数関数的増殖フェーズの間通気した。C.グルタミクムは、ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/Lを含有する種子培地で最初に培養し、3つの1L三角フラスコに400mLの量で導入した。フラスコは、最初に120℃で20分間加熱して滅菌した。滅菌後、フラスコを30℃まで冷却し、LBプレート上で増殖させたC.グルタミクムのコロニーをこの培地に接種した。得られた培養液を30℃及びpH7.0で9時間インキュベートし、十分な通気及び撹拌を行った。
過剰塩酸(1.2当量)によるリジン発酵上清からのリジン塩酸塩の結晶化
リジンを、炭水化物からリジンを生成するように操作された市販のC.グルタミクム株の発酵によって得た。C.グルタミクムを、温度(一般に25℃から37℃の間、最適な温度は約15～30℃)及びpH(7.0から7.4の間)の厳密な制御を維持しながら発酵させた。更に、C.グルタミクムは非常に酸素を必要とするため、発酵容器を指数関数的増殖フェーズの間通気した。C.グルタミクムは、ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/Lを含有する種子培地で最初に培養し、3つの1L三角フラスコに400mLの量で導入した。フラスコは、最初に120℃で20分間加熱して滅菌した。滅菌後、フラスコを30℃まで冷却し、LBプレート上で増殖させたC.グルタミクムのコロニーをこの培地に接種した。得られた培養液を30℃及びpH7.0で9時間インキュベートし、十分な通気及び撹拌を行った。
種子培養後、次いでC.グルタミクムは、グルコース25g/L、塩化アンモニウム15g/L、リン酸二水素カリウム1.5g/L、グルタミン酸ナトリウム5g/L、塩化ナトリウム1g/L、酵母抽出物0.5g/Lを含有する培地にてpH7で発酵させ、15Lステンレス鋼発酵槽に8Lの量(この容量は、発酵の過程で増大する)で導入した。槽は、最初に120℃で20分加熱して滅菌した。滅菌後、槽を30℃まで冷却し、次いで上記の種子培養液1Lを培地に接種し、30℃で培養し、1vvmでの通気及び800rpmでの撹拌を行った。25%水酸化アンモニウム溶液を添加して、pHを制御した。培養液中のグルコース濃度が0.5～1.0%に低下した場合、供給溶液を培地に連続的に添加して、糖レベルを0.5から0.8%の間に維持した。供給溶液は、pH7.0で、グルコース110g/L、硫酸マグネシウム8.9g/L、塩化カリウム5.3g/L、リン酸4g/L、及び酵母抽出物1.5g/Lを含有していた。総アンモニウムレベルが0.15%に低下した場合、塩化アンモニウム溶液(450g/L)を補給して、総アンモニウムレベルを0.1～0.2%に維持した。
発酵が完了した後、グルコース、水酸化アンモニウム、及び塩化アンモニウムを添加して発酵ブロスの総容量を10Lに増加させ、次いで遠心分離によって細胞を使用済み培地から分離した。次いで、精密ろ過及び限外ろ過により、無細胞上清を清澄化した。続いて、このプロセス流をイオン交換カラムに通して脱塩し、リジン146g/Lを含有する溶液を得て濃縮させ、次いで1251g(125.1g/L;1.2当量)の35%塩酸を添加して生成物であるリジン硫酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジン塩酸塩の純度を求めた。リジン-塩酸塩の含有量は99.1%であり、収率は87.4%であることがわかった。
(実施例5A)
過剰アジピン酸(1.2当量)によるリジン発酵上清からのリジンアジピン酸塩の結晶化
C.グルタミクムは種々の炭素源及び窒素源を生成のために利用できるが、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムの代わりに)アジピン酸アンモニウム緩衝系を有する最少培地を採用すると、方法全体及び下流の生成物において、無機アニオン含有量を減らすことによって下流の処理が合理化される。
過剰アジピン酸(1.2当量)によるリジン発酵上清からのリジンアジピン酸塩の結晶化
C.グルタミクムは種々の炭素源及び窒素源を生成のために利用できるが、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムの代わりに)アジピン酸アンモニウム緩衝系を有する最少培地を採用すると、方法全体及び下流の生成物において、無機アニオン含有量を減らすことによって下流の処理が合理化される。
実施例4Aで記載した種子培養後、次いでC.グルタミクムは、グルコース25g/L、アジピン酸アンモニウム10g/L、リン酸二水素カリウム0.5g/L、グルタミン酸ナトリウム5g/L、塩化ナトリウム0.1g/L、及び酵母抽出物0.5g/Lを含有する培地にてpH7.0で発酵させ、15L容量のステンレス鋼発酵槽に8L(この容量は、発酵過程で増大する)の量で導入した。槽は、最初に120℃で20分間加熱して滅菌した。アジピン酸アンモニウムは、25%水酸化アンモニウム(3kg)の7L水溶液にアジピン酸3.2kgを添加して調製した。得られた溶液を、50℃で4時間撹拌した。発酵培地を滅菌後、槽を30℃まで冷却し、次いで上記の種子培養液1Lを培地に接種し、30℃で培養し、1vvmでの通気及び800rpmでの撹拌を行った。25%水酸化アンモニウム溶液を添加して、pHを制御した。培養液中のグルコース濃度が0.5～1.0%に低下した場合、グルコース源を培地に連続的に添加して、糖レベルを0.5から0.8%の間に維持した。総アンモニウムレベルが0.15%に低下した場合、アジピン酸アンモニウム溶液(39.7%)を補給して、総アンモニウムレベルを0.1～0.2%に維持した。
発酵が完了した後、グルコース、水酸化アンモニウム、及びアジピン酸アンモニウムを添加して発酵ブロスの総容量を10Lに増加させ、次いで遠心分離によって細胞を使用済み培地から分離した。次いで、精密ろ過及び限外ろ過により、無細胞上清を清澄化した。この時点で、リジンの濃度は146g/Lであり、1752g(1.2当量、175.2g/L)のアジピン酸を添加して、生成物であるリジンアジピン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンアジピン酸塩の純度を求めた。リジンアジピン酸塩の含有量は99.3%であり、収率は93.4%であることがわかった。
この実施例では、アジピン酸塩割合が80%を超えており、アジピン酸塩割合を次のように計算した:アジピン酸塩割合=[(アジピン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジンイオン(Lys+)のモル濃度]×100%。有利には、(細胞及び細胞破片から分離された)リジン-アジピン酸塩流は、次いで実施例13～20に示されているリジンアジピン酸塩からPDAアジピン酸塩への生物変換の出発原料として直接採用できるため、それによって生物変換工程の前にイオン交換によるリジン精製の必要性が回避される。
(実施例5B)
0.6当量のアジピン酸によるリジン発酵上清からのリジンアジピン酸塩の結晶化
C.グルタミクムは種々の炭素源及び窒素源を生成のために利用できるが、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムの代わりに)アジピン酸アンモニウム緩衝系を有する最少培地を採用すると、方法全体及び下流の生成物において、無機アニオン含有量を減らすことによって下流の処理が合理化される。
0.6当量のアジピン酸によるリジン発酵上清からのリジンアジピン酸塩の結晶化
C.グルタミクムは種々の炭素源及び窒素源を生成のために利用できるが、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムの代わりに)アジピン酸アンモニウム緩衝系を有する最少培地を採用すると、方法全体及び下流の生成物において、無機アニオン含有量を減らすことによって下流の処理が合理化される。
実施例4で記載した種子培養後、次いでC.グルタミクムは、グルコース25g/L、アジピン酸アンモニウム10g/L、リン酸二水素カリウム0.5g/L、グルタミン酸ナトリウム5g/L、塩化ナトリウム0.1g/L、及び酵母抽出物0.5g/Lを含有する培地にてpH7.0で発酵させ、15L容量のステンレス鋼発酵槽に8L(この容量は、発酵過程で増大する)の量で導入した。槽は、最初に120℃で20分間加熱して滅菌した。アジピン酸アンモニウムは、25%水酸化アンモニウム(3kg)の7L水溶液にアジピン酸3.2kgを添加して調製した。得られた溶液を、50℃で4時間撹拌した。発酵培地を滅菌後、槽を30℃まで冷却し、次いで上記の種子培養液1Lを培地に接種し、30℃で培養し、1vvmでの通気及び800rpmでの撹拌を行った。25%水酸化アンモニウム溶液を添加して、pHを制御した。培養液中のグルコース濃度が0.5～1.0%に低下した場合、グルコース源を培地に連続的に添加して、糖レベルを0.5から0.8%の間に維持した。総アンモニウムレベルが0.15%に低下した場合、アジピン酸アンモニウム溶液(39.7%)を補給して、総アンモニウムレベルを0.1～0.2%に維持した。
発酵が完了した後、グルコース、水酸化アンモニウム、アジピン酸アンモニウムを添加して発酵ブロスの総容量を10Lに増やし、次いで遠心分離によって細胞を使用済み培地から分離した。次いで、精密ろ過及び限外ろ過により、無細胞上清を清澄化した。この時点で、リジンの濃度は146g/Lであった。876g(0.6当量、87.6g/L)のアジピン酸を添加して、生成物であるリジンアジピン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンアジピン酸塩の純度を求め、リジンアジピン酸塩の含有量は99.4%であり、収率は88.5%であることがわかった。
(実施例5C)
リジンアジピン酸塩の結晶化を伴わないアジピン酸アンモニウムによるリジン発酵
C.グルタミクムは種々の炭素源及び窒素源を生成のために利用できるが、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムの代わりに)アジピン酸アンモニウム緩衝系を有する最少培地を採用すると、方法全体及び下流の生成物において、無機アニオン含有量を減らすことによって下流の処理が合理化される。
リジンアジピン酸塩の結晶化を伴わないアジピン酸アンモニウムによるリジン発酵
C.グルタミクムは種々の炭素源及び窒素源を生成のために利用できるが、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムの代わりに)アジピン酸アンモニウム緩衝系を有する最少培地を採用すると、方法全体及び下流の生成物において、無機アニオン含有量を減らすことによって下流の処理が合理化される。
実施例4で記載した種子培養後、次いでC.グルタミクムは、グルコース25g/L、アジピン酸アンモニウム10g/L、リン酸二水素カリウム0.5g/L、グルタミン酸ナトリウム5g/L、塩化ナトリウム0.1g/L、及び酵母抽出物0.5g/Lを含有する培地にてpH7.0で発酵させ、15L容量のステンレス鋼発酵槽に8Lの量で導入した。槽は、最初に120℃で20分間加熱して滅菌した。アジピン酸アンモニウムは、25%水酸化アンモニウム(3kg)の7L水溶液にアジピン酸3.2kgを添加して調製した。得られた溶液を、50℃で4時間撹拌した。発酵培地を滅菌後、槽を30℃まで冷却し、次いで上記の種子培養液1Lを培地に接種し、30℃で培養し、1vvmでの通気及び800rpmでの撹拌を行った。25%水酸化アンモニウム溶液を添加して、pHを制御した。培養液中のグルコース濃度が0.5～1.0%に低下した場合、グルコース源を培地に連続的に添加して、糖レベルを0.5から0.8%の間に維持した。総アンモニウムレベルが0.15%に低下した場合、アジピン酸アンモニウム溶液(39.7%)を補給して、総アンモニウムレベルを0.1～0.2%に維持した。
発酵が完了した後、グルコース、水酸化アンモニウム、アジピン酸アンモニウムを添加して発酵ブロスの総容量を10Lに増やし、次いで遠心分離によって細胞を使用済み培地から分離した。次いで、精密ろ過及び限外ろ過により、無細胞上清を清澄化した。上清中のリジン濃度は146g/Lであり、上清を結晶化精製せずに次の反応で直接使用した。
(実施例6)
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジン塩酸塩のPDA塩酸塩への変換
ペンタメチレンジアミン(PDA)-HClの製造のために、PLPを0.1g/L含有する200g/Lリジン塩酸塩溶液1Lに、リジンデカルボキシラーゼを含有する操作された湿潤大腸菌(湿潤細胞1gは、乾燥ベースで細胞0.1～0.15gに相当する)を2g添加した。pHを、HClを使用して6.5に維持した。溶液の温度を37℃にした。次いで反応を開始し、pHを6.5に維持しながら10時間継続させた。リジン含有量を、反応終了時に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって求めた(<0.%w/v)。
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジン塩酸塩のPDA塩酸塩への変換
ペンタメチレンジアミン(PDA)-HClの製造のために、PLPを0.1g/L含有する200g/Lリジン塩酸塩溶液1Lに、リジンデカルボキシラーゼを含有する操作された湿潤大腸菌(湿潤細胞1gは、乾燥ベースで細胞0.1～0.15gに相当する)を2g添加した。pHを、HClを使用して6.5に維持した。溶液の温度を37℃にした。次いで反応を開始し、pHを6.5に維持しながら10時間継続させた。リジン含有量を、反応終了時に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって求めた(<0.%w/v)。
反応混合物を0.2ミクロンの精密ろ過膜に通し(大きな粒子、例えば細胞、細菌の断片、及び凝集体を除去するため)、10kDaの限外ろ過膜に通した(培地中のタンパク質及び他の可溶性高分子を除去するため)。ろ液は、減圧下で元の容量の1/4に濃縮した。混合物に2倍の容量のメタノールを添加し、その後15℃で結晶化させた。次いで、固体を回収して乾燥させた。この白色固体生成物の質量は174.67gであり、PDA-HClの含有量を分析した。PDA-HClの含有量は99.3%であり、収率は91.1%であることがわかった。
(実施例7)
細胞溶解物からのリジンデカルボキシラーゼを使用したリジン塩酸塩のPDA塩酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、全細胞の代わりにリジンデカルボキシラーゼを含有する操作された大腸菌細胞からの溶解物2gを添加した。可溶性細胞抽出物を得るために、2gの大腸菌操作細菌細胞を10mLのリン酸緩衝液(pH7.0)に添加し、よく撹拌した。次いで、高圧均質化によって細胞を粉砕し、次いで遠心分離して可溶性細胞抽出物を得た。反応で残った白色固体の質量は172.9gであった。PDA-HClの含有量は99.5%であり、収率は90.2%であることがわかった。
細胞溶解物からのリジンデカルボキシラーゼを使用したリジン塩酸塩のPDA塩酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、全細胞の代わりにリジンデカルボキシラーゼを含有する操作された大腸菌細胞からの溶解物2gを添加した。可溶性細胞抽出物を得るために、2gの大腸菌操作細菌細胞を10mLのリン酸緩衝液(pH7.0)に添加し、よく撹拌した。次いで、高圧均質化によって細胞を粉砕し、次いで遠心分離して可溶性細胞抽出物を得た。反応で残った白色固体の質量は172.9gであった。PDA-HClの含有量は99.5%であり、収率は90.2%であることがわかった。
(実施例8)
エタノールによるPDA塩酸塩の結晶化
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、15℃で結晶化するためにメタノールの代わりにエタノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は177.35gであった。PDA-HClの含有量は99.2%であり、収率は92.5%であることがわかった。
エタノールによるPDA塩酸塩の結晶化
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、15℃で結晶化するためにメタノールの代わりにエタノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は177.35gであった。PDA-HClの含有量は99.2%であり、収率は92.5%であることがわかった。
(実施例9)
イソプロパノールによるPDA塩酸塩の結晶化
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、15℃で結晶化するためにメタノールの代わりに3倍の容量のイソプロピルアルコールを添加した。反応で残った白色固体の質量は171.2gであった。PDA-HClの含有量は99.4%であり、収率は89.3%であることがわかった。
イソプロパノールによるPDA塩酸塩の結晶化
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、15℃で結晶化するためにメタノールの代わりに3倍の容量のイソプロピルアルコールを添加した。反応で残った白色固体の質量は171.2gであった。PDA-HClの含有量は99.4%であり、収率は89.3%であることがわかった。
(実施例10)
リジン塩酸塩濃度の増加及びpH7への調整
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、リジン塩酸塩の濃度はpH6.5で200g/Lではなく300g/Lであり、pHを7に維持し、2gではなく4gの操作された湿潤大腸菌を添加し、PLPは0.1g/Lではなく0.15g/Lであり、反応時間は10時間ではなく13時間であった。反応で残った白色固体の質量は223.4gであった。PDA-HClの含有量は99.3%であり、収率は91.5%であることがわかった。
リジン塩酸塩濃度の増加及びpH7への調整
実施例6と同一の方法をPDA-HClの生成に使用したが、リジン塩酸塩の濃度はpH6.5で200g/Lではなく300g/Lであり、pHを7に維持し、2gではなく4gの操作された湿潤大腸菌を添加し、PLPは0.1g/Lではなく0.15g/Lであり、反応時間は10時間ではなく13時間であった。反応で残った白色固体の質量は223.4gであった。PDA-HClの含有量は99.3%であり、収率は91.5%であることがわかった。
(実施例11)
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジン硫酸塩のPDA硫酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-硫酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を200g/Lのリジン硫酸塩に置き換え、反応時間は10時間ではなく12時間であり、結晶化は15℃で2倍の容量のエタノールで行った。pHを、硫酸塩を使用して6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は201.88gであった。PDA-硫酸塩の含有量は99.1%であり、収率は92.1%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジン硫酸塩のPDA硫酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-硫酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を200g/Lのリジン硫酸塩に置き換え、反応時間は10時間ではなく12時間であり、結晶化は15℃で2倍の容量のエタノールで行った。pHを、硫酸塩を使用して6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は201.88gであった。PDA-硫酸塩の含有量は99.1%であり、収率は92.1%であることがわかった。
(実施例12)
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジン酢酸塩のPDA酢酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-酢酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を200g/Lのリジン酢酸塩に置き換え、反応時間は10時間ではなく12時間であり、結晶化は15℃で2倍の容量のイソプロピルアルコールで行った。pHを、酢酸塩を使用して6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は259.4gであった。PDA-酢酸塩の含有量は99.2%であり、収率は85.3%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジン酢酸塩のPDA酢酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-酢酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を200g/Lのリジン酢酸塩に置き換え、反応時間は10時間ではなく12時間であり、結晶化は15℃で2倍の容量のイソプロピルアルコールで行った。pHを、酢酸塩を使用して6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は259.4gであった。PDA-酢酸塩の含有量は99.2%であり、収率は85.3%であることがわかった。
(実施例13)
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例5Aで得られたリジンアジピン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、反応時間は10時間ではなく12時間であり、結晶化は15℃で行った。pHを、アジピン酸塩を使用して6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は306.8gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.2%であり、収率は90.3%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例6と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例5Aで得られたリジンアジピン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、反応時間は10時間ではなく12時間であり、結晶化は15℃で行った。pHを、アジピン酸塩を使用して6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は306.8gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.2%であり、収率は90.3%であることがわかった。
(実施例14A)
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アジピン酸塩を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は313.56gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.2%であり、収率は92.3%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アジピン酸塩を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は313.56gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.2%であり、収率は92.3%であることがわかった。
(実施例14B)
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例5Bで得られたリジンアジピン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、25.2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アジピン酸塩を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は309.82gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.0%であり、収率は91.3%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例5Bで得られたリジンアジピン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、25.2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アジピン酸塩を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は309.82gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.0%であり、収率は91.3%であることがわかった。
(実施例14C)
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩発酵反応溶液の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例5Cで得られたリジン-アジピン酸塩発酵ブロスの上清に置き換え、リジン-アジピン酸塩の濃度を200g/Lに調整し、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、25.2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アジピン酸塩を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は299.97gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は98.6%であり、収率は88.3%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩発酵反応溶液の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例5Cで得られたリジン-アジピン酸塩発酵ブロスの上清に置き換え、リジン-アジピン酸塩の濃度を200g/Lに調整し、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、25.2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アジピン酸塩を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は299.97gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は98.6%であり、収率は88.3%であることがわかった。
(実施例15)
細胞溶解物からのリジンデカルボキシラーゼを使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、全細胞の代わりにリジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞からの細胞溶解物を採用した。反応後、反応で残った白色固体の質量は308.8gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は90.9%であることがわかった。
細胞溶解物からのリジンデカルボキシラーゼを使用したリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、全細胞の代わりにリジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞からの細胞溶解物を採用した。反応後、反応で残った白色固体の質量は308.8gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は90.9%であることがわかった。
(実施例16)
メタノールの代わりにエタノールを用いたPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、15℃で結晶化するために、メタノールの代わりにエタノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は311gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.5%であり、収率は91.5%であることがわかった。
メタノールの代わりにエタノールを用いたPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、15℃で結晶化するために、メタノールの代わりにエタノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は311gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.5%であり、収率は91.5%であることがわかった。
(実施例17)
pHを6.5ではなく7.5に上昇
実施例16と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、pHを6.5ではなくアジピン酸で7.5に制御し、反応を12時間ではなく16時間行った。反応で残った白色固体の質量は309.2gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は91.0%であることがわかった。
pHを6.5ではなく7.5に上昇
実施例16と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、pHを6.5ではなくアジピン酸で7.5に制御し、反応を12時間ではなく16時間行った。反応で残った白色固体の質量は309.2gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は91.0%であることがわかった。
(実施例18)
リジン-アジピン酸塩濃度を200g/Lから400g/Lに増加
実施例16と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、リジンアジピン酸塩の開始濃度は200g/Lではなく400g/Lであり、反応を12時間ではなく18時間行った。反応で残った白色固体の質量は615gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.2%であり、収率は90.5%であることがわかった。
リジン-アジピン酸塩濃度を200g/Lから400g/Lに増加
実施例16と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、リジンアジピン酸塩の開始濃度は200g/Lではなく400g/Lであり、反応を12時間ではなく18時間行った。反応で残った白色固体の質量は615gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.2%であり、収率は90.5%であることがわかった。
(実施例19A)
メタノールの代わりにイソプロパノールを用いたPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、15℃で結晶化するために、メタノールの代わりに3倍の容量のイソプロパノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は312.7gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は92.0%であることがわかった。
メタノールの代わりにイソプロパノールを用いたPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、15℃で結晶化するために、メタノールの代わりに3倍の容量のイソプロパノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は312.7gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は92.0%であることがわかった。
(実施例19B)
メタノールの代わりにn-プロパノールを用いたPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、15℃で結晶化するために、メタノールの代わりに3倍の容量のn-プロパノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は274.0gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.3%であり、収率は80.6%であることがわかった。
メタノールの代わりにn-プロパノールを用いたPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、15℃で結晶化するために、メタノールの代わりに3倍の容量のn-プロパノールを添加した。反応で残った白色固体の質量は274.0gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.3%であり、収率は80.6%であることがわかった。
(実施例20)
水中での直接結晶化によるPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、PDA-アジピン酸塩の結晶化は水中で直接行った(有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノールを添加せずに)。反応溶液を4℃までゆっくりと冷却し、1gのPDA-アジピン酸塩種結晶を添加し、この結晶を低速で撹拌した。次いで、この溶液を吸引ろ過によって10時間乾燥させた。反応で残った白色固体の質量は153.9gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率はわずか45.3%であることがわかった。
水中での直接結晶化によるPDA-アジピン酸塩の結晶化
実施例13と同一の方法をPDA-アジピン酸塩の生成に使用したが、PDA-アジピン酸塩の結晶化は水中で直接行った(有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノールを添加せずに)。反応溶液を4℃までゆっくりと冷却し、1gのPDA-アジピン酸塩種結晶を添加し、この結晶を低速で撹拌した。次いで、この溶液を吸引ろ過によって10時間乾燥させた。反応で残った白色固体の質量は153.9gであった。PDA-アジピン酸塩の含有量は99.1%であり、収率はわずか45.3%であることがわかった。
(実施例21A)
過剰量のスベリン酸による結晶化の組み合わせたスベリン酸アンモニウムによるリジン発酵
実施例5Aと同一の方法を使用したが、アジピン酸アンモニウム緩衝系の代わりにスベリン酸アンモニウム緩衝系(セバシン酸/セバシン酸アンモニウム)を採用した。発酵が完了し、分離及びろ過した後、過剰量のスベリン酸を添加して生成物であるリジンスベリン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンスベリン酸塩の純度を求めた。リジンスベリン酸塩の含有量は99.3%であり、収率は92.5%であることがわかった。
過剰量のスベリン酸による結晶化の組み合わせたスベリン酸アンモニウムによるリジン発酵
実施例5Aと同一の方法を使用したが、アジピン酸アンモニウム緩衝系の代わりにスベリン酸アンモニウム緩衝系(セバシン酸/セバシン酸アンモニウム)を採用した。発酵が完了し、分離及びろ過した後、過剰量のスベリン酸を添加して生成物であるリジンスベリン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンスベリン酸塩の純度を求めた。リジンスベリン酸塩の含有量は99.3%であり、収率は92.5%であることがわかった。
(実施例21B)
過剰量のアゼライン酸による結晶化と組み合わせたアゼライン酸アンモニウムによるリジン発酵
実施例5Aと同一の方法を使用したが、アジピン酸アンモニウム緩衝系の代わりにアゼライン酸アンモニウム緩衝系(アゼライン酸/アゼライン酸アンモニウム)を採用した。発酵が完了し、分離及びろ過した後、過剰量のアゼライン酸を添加して生成物のリジンアゼライン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンアゼライン酸の純度を求めた。リジンアアゼライン酸塩の含有量は99.0%であり、収率は91.2%であることがわかった。
過剰量のアゼライン酸による結晶化と組み合わせたアゼライン酸アンモニウムによるリジン発酵
実施例5Aと同一の方法を使用したが、アジピン酸アンモニウム緩衝系の代わりにアゼライン酸アンモニウム緩衝系(アゼライン酸/アゼライン酸アンモニウム)を採用した。発酵が完了し、分離及びろ過した後、過剰量のアゼライン酸を添加して生成物のリジンアゼライン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンアゼライン酸の純度を求めた。リジンアアゼライン酸塩の含有量は99.0%であり、収率は91.2%であることがわかった。
(実施例21C)
過剰量のドデカンジカルボン酸による結晶化との組み合わせたドデカンジカルボン酸アンモニウムによるリジン発酵
実施例5Aと同一の方法を使用したが、アジピン酸アンモニウム緩衝系の代わりにドデカンジカルボン酸アンモニウム緩衝系(ドデカンジカルボン酸/ドデカンジカルボン酸アンモニウム)を採用した。発酵が完了し、分離及びろ過した後、過剰量のドデカンジカルボン酸を添加して生成物のリジンドデカンジカルボン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンドデカンジカルボン酸塩の純度を求めた。リジンドデカンジカルボン酸塩の含有量は98.6%であり、収率は88.7%であることがわかった。
過剰量のドデカンジカルボン酸による結晶化との組み合わせたドデカンジカルボン酸アンモニウムによるリジン発酵
実施例5Aと同一の方法を使用したが、アジピン酸アンモニウム緩衝系の代わりにドデカンジカルボン酸アンモニウム緩衝系(ドデカンジカルボン酸/ドデカンジカルボン酸アンモニウム)を採用した。発酵が完了し、分離及びろ過した後、過剰量のドデカンジカルボン酸を添加して生成物のリジンドデカンジカルボン酸塩を結晶化させた。生成物をろ過して乾燥させた。次いで、HPLC分析により、リジンドデカンジカルボン酸塩の純度を求めた。リジンドデカンジカルボン酸塩の含有量は98.6%であり、収率は88.7%であることがわかった。
(実施例22A)
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンスベリン酸塩のPDAスベリン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-スベリン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例21Aで得られたリジンスベリン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。スベリン酸を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は340.6gであった。PDAスベリン酸塩の含有量は99.6%であり、収率は90.3%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンスベリン酸塩のPDAスベリン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-スベリン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例21Aで得られたリジンスベリン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。スベリン酸を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は340.6gであった。PDAスベリン酸塩の含有量は99.6%であり、収率は90.3%であることがわかった。
(実施例22B)
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアゼライン酸塩のPDAアゼライン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アゼライン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例21Bで得られたリジンアゼライン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アゼライン酸を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は366.05gであった。PDAアゼライン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は91.9%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンアゼライン酸塩のPDAアゼライン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-アゼライン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例21Bで得られたリジンアゼライン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。アゼライン酸を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は366.05gであった。PDAアゼライン酸塩の含有量は99.1%であり、収率は91.9%であることがわかった。
(実施例22C)
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンドデカンジカルボン酸塩のPDAドデカンジカルボン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-ドデカンジカルボン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例21Cで得られたリジンドデカンジカルボン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。ドデカンジカルボン酸を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は399.46gであった。PDAドデカンジカルボン酸塩の含有量は98.1%であり、収率は87.2%であることがわかった。
リジンデカルボキシラーゼを発現する固定化全細胞を使用したリジンドデカンジカルボン酸塩のPDAドデカンジカルボン酸塩への変換
実施例13と同一の方法をPDA-ドデカンジカルボン酸塩の生成に使用したが、リジン塩酸塩を実施例21Cで得られたリジンドデカンジカルボン酸塩結晶の200g/L溶液に置き換え、全細胞の代わりに2gの固定化リジンデカルボキシラーゼ含有大腸菌細胞を採用した。細胞を固定化するために、8%ポリビニルアルコール及び2.5%アルギン酸ナトリウムの混合溶液20mLを2.5gの大腸菌細胞に添加した。溶液をよく混合し、蠕動ポンプを使用して、2%の塩化カルシウム及び3%のホウ酸を含有する架橋剤に10cmの高さから滴下した。次いで、これを8時間固化させ、ろ過し、蒸留水で繰り返しすすいだ(3～4回)。固定化細胞は常に使用できるようになり、再利用できるようになった。ドデカンジカルボン酸を使用して、反応のpHを6.5に維持した。反応で残った白色固体の質量は399.46gであった。PDAドデカンジカルボン酸塩の含有量は98.1%であり、収率は87.2%であることがわかった。
概要及び結論
使用済みリジン発酵上清からのリジンジカルボン酸塩の結晶化
実施例4A、4B、5A、5B、21A、21B、及び21Cは、使用済みリジン発酵ブロスの無細胞上清からリジン塩結晶を得るための様々な手法を比較している。実施例4A及び4Bでは、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムを含有する)アンモニウム無機アニオン緩衝系の存在下でリジン発酵を行い、その後、得られた無細胞上清を、イオン交換カラムに通して最初に脱塩してから、リジン無機塩の結晶化を(例えば、リジン硫酸塩又はリジン塩酸塩として)、過剰な硫酸(実施例4A)又は塩酸(実施例4B)の添加によって誘導した。対照的に、実施例5A、5B、21A、21B、及び21Cに記載のリジン発酵は、アンモニウム有機アニオン緩衝系(すなわち、ジカルボン酸アンモニウムを含有する)の存在下で行い、その後、リジン有機塩の結晶化を、対応するジカルボン酸、すなわち、アジピン酸(実施例5A及び5B)、スベリン酸(実施例21A)、アゼライン酸(実施例21B)、又はドデカンジカルボン酸(実施例21C)の添加によって、無細胞上清から直接誘導した(すなわち、イオン交換カラムを介した脱塩を伴わない)。得られたリジン塩結晶の収率及び純度の概要を、以下のTable 1(表1)に示す。
使用済みリジン発酵上清からのリジンジカルボン酸塩の結晶化
実施例4A、4B、5A、5B、21A、21B、及び21Cは、使用済みリジン発酵ブロスの無細胞上清からリジン塩結晶を得るための様々な手法を比較している。実施例4A及び4Bでは、(硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムを含有する)アンモニウム無機アニオン緩衝系の存在下でリジン発酵を行い、その後、得られた無細胞上清を、イオン交換カラムに通して最初に脱塩してから、リジン無機塩の結晶化を(例えば、リジン硫酸塩又はリジン塩酸塩として)、過剰な硫酸(実施例4A)又は塩酸(実施例4B)の添加によって誘導した。対照的に、実施例5A、5B、21A、21B、及び21Cに記載のリジン発酵は、アンモニウム有機アニオン緩衝系(すなわち、ジカルボン酸アンモニウムを含有する)の存在下で行い、その後、リジン有機塩の結晶化を、対応するジカルボン酸、すなわち、アジピン酸(実施例5A及び5B)、スベリン酸(実施例21A)、アゼライン酸(実施例21B)、又はドデカンジカルボン酸(実施例21C)の添加によって、無細胞上清から直接誘導した(すなわち、イオン交換カラムを介した脱塩を伴わない)。得られたリジン塩結晶の収率及び純度の概要を、以下のTable 1(表1)に示す。
Table 1(表1)に示すように、リジン発酵にジカルボン酸アンモニウム緩衝系を採用した場合、及び対応するジカルボン酸の添加によってリジン塩の結晶化を誘導した場合(実施例5A、5B、21A、21B、及び21C)、アンモニウム無機アニオン緩衝系を使用する場合(実施例4A及び4B)と比較して、一般に高い収率及び/又は純度のリジン塩結晶が得られた。驚くべきことに、ジカルボン酸を使用して得られたリジン塩結晶の収率/純度(実施例5A、5B、21A、21B、及び21C)は、無機アニオン/酸を使用して得られた収率/純度(実施例4A及び4B)に匹敵するか、又はそれよりも高かったが、後者の方法は、イオン交換カラムに通すことによる追加の脱塩工程を含んでいるにも関わらずである。更に、実施例5A及び5Bの結果は、当量又は過剰量のジカルボン酸を使用してリジン塩の結晶化を誘導すると、限られた量(例えば0.6当量)の有機ジカルボン酸を使用する場合と比較して結晶の形成が更に促進され、結果として収率が増加することを示唆している。興味深いことに、Table 1(表1)に示した様々な条件の中で、過剰なアジピン酸によるリジンジカルボン酸塩の結晶化は、収率及び純度の両方の最も高い組合せを提示した。
リジンジカルボン酸塩のPDAジカルボン酸塩への生物変換
従来の工業的発酵方法では、方法途中の精製工程(例えば中間体の精製工程)を最小限に抑えて全体的な効率を向上させ、操作費用を削減する、合理化された、いわゆる「ワンポット」手法が非常に好まれており、費用のかかる精製工程は通常、最終生成物まで保留される。最終生成物(PDAアジピン酸塩)の収率及び純度に対する追加のリジン塩結晶化工程の導入の影響を評価し、追加のリジン塩結晶化工程を欠いたより従来の合理化された手法と比較した。より具体的には、実施例14A及び14Bのリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への生物変換では、実施例5A及び5Bのリジンアジピン酸塩結晶を出発原料として利用し、一方実施例14Cの生物変換では、実施例5Cのリジンアジピン酸塩発酵上清を出発原料として利用した。生成されたPDAアジピン酸塩の収率及び純度の概要を、以下のTable 2(表2)に示す。
従来の工業的発酵方法では、方法途中の精製工程(例えば中間体の精製工程)を最小限に抑えて全体的な効率を向上させ、操作費用を削減する、合理化された、いわゆる「ワンポット」手法が非常に好まれており、費用のかかる精製工程は通常、最終生成物まで保留される。最終生成物(PDAアジピン酸塩)の収率及び純度に対する追加のリジン塩結晶化工程の導入の影響を評価し、追加のリジン塩結晶化工程を欠いたより従来の合理化された手法と比較した。より具体的には、実施例14A及び14Bのリジンアジピン酸塩のPDAアジピン酸塩への生物変換では、実施例5A及び5Bのリジンアジピン酸塩結晶を出発原料として利用し、一方実施例14Cの生物変換では、実施例5Cのリジンアジピン酸塩発酵上清を出発原料として利用した。生成されたPDAアジピン酸塩の収率及び純度の概要を、以下のTable 2(表2)に示す。
Table 2(表2)に示すように、リジン発酵上清で直接生物変換を実施する従来の合理化された生成方法では、結果としてPDAアジピン酸の収率が88.3%、全体の純度が98.6%になった。検出された不純物の中には、かなりの量の有機不純物、例えば酢酸、タンパク質、乳酸、及びピルビン酸があった。250℃で8時間加熱すると、これらの有機不純物の悪影響がPDAアジピン酸塩生成物の黄変という形で目に見えるようになり、また溶解時の光透過率の低下として定量化された。対照的に、リジン発酵上清にアジピン酸を添加して分離した再可溶化リジンアジピン酸塩結晶で生物変換を実施すると、得られたPDAアジピン酸塩生成物は純度がより高い(99.0～99.2%)だけでなく、収率も大幅に高かった(91.3%～92.3%)。有機不純物の減少は、より白色のPDAアジピン酸塩生成物の形で目に見え、また溶解時の光透過率の増加として定量化された。興味深いことに、リジン発酵上清に過剰なアジピン酸を添加して分離したリジンアジピン酸塩結晶を使用することにより、結果として0.6当量のアジピン酸を添加して分離したリジンアジピン酸塩結晶と比較して、PDAアジピン酸塩の収率及び純度がより高くなった。
アジピン酸(C6)よりも炭素鎖長のより長いジカルボン酸を用いた本生成方法の適用可能性はまた、実施例22A(スベリン酸、C8)、実施例22B(アゼライン酸、C9)、及び実施例22C(ドデカンジカルボン酸、C12)で考察された。生成されたPDAジカルボン酸塩の収率及び純度の概要を以下のTable 3(表3)に示す。
Table 3(表3)の結果からわかるように、炭素鎖長のより長いジカルボン酸を採用することにより、結果としてPDAジカルボン酸塩の収率及び純度が高くなった。しかし、炭素12個のジカルボン酸を使用すると、収率及び純度の低下が観察された。
アルコールにより誘導されるPDAジカルボン酸塩の結晶化
本発明者らは更に、生物変換後、アルコールを添加して結晶化を誘導することにより、PDAジカルボン酸塩生成物の収率が非常に増加し得ることを予期せず発見した。試験したアルコールはすべて収率を増加させたが、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールは、種々のPDAジカルボン酸塩の結晶化誘導に特に優れていることが証明された。興味深いことに、最も高いPDAアジピン酸塩の収率は、イソプロパノールによって得られたが(収率92%、実施例19A)、最も性能が低かったアルコールは、n-プロパノールであった(収率80.6%、実施例19B)。更に、アルコールの非存在下で、4℃ではなく約15℃に冷却することにより、PDAジカルボン酸塩結晶の高い収率が得られた(実施例20)。
本発明者らは更に、生物変換後、アルコールを添加して結晶化を誘導することにより、PDAジカルボン酸塩生成物の収率が非常に増加し得ることを予期せず発見した。試験したアルコールはすべて収率を増加させたが、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールは、種々のPDAジカルボン酸塩の結晶化誘導に特に優れていることが証明された。興味深いことに、最も高いPDAアジピン酸塩の収率は、イソプロパノールによって得られたが(収率92%、実施例19A)、最も性能が低かったアルコールは、n-プロパノールであった(収率80.6%、実施例19B)。更に、アルコールの非存在下で、4℃ではなく約15℃に冷却することにより、PDAジカルボン酸塩結晶の高い収率が得られた(実施例20)。
要約すると、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変された培地を使用することにより、本明細書に記載の方法では、カダベリンを調製するための従来の生物学的発酵方法で典型的に生成される大量の無機イオンを生成する問題を回避することができる。培地中で使用される無機アニオンの量を減らすことにより、無機イオンの除去に必要なその後の精製工程を回避することができ、それによって製造費用及び過剰な無機イオンの処理に伴う環境への悪影響が大幅に低減する。本発明者らは驚くべきことに、ジカルボン酸を添加して中間体であるリジン塩を結晶化し、次いでリジンジカルボン酸塩結晶を製造方法に戻すことにより、ワンポット発酵方法によるカダベリンの製造方法と比較して、最終生成物のカダベリン塩の収率及び純度の大幅な増加、並びに光透過率の増加及び生成物の黄変の回避を可能にできることを発見した。有機ジカルボン酸を結晶化に使用する場合、過剰量の酸を使用して得られるリジン塩結晶の純度及び収率は、0.6当量の酸を使用して得られる対応する結果よりも高くなる。更に、本発明者らは驚くべきことに、本明細書に記載の高活性リジンデカルボキシラーゼを使用することにより、使用される酵素の量を大幅に削減して費用を抑制できるだけでなく、生成物であるカダベリン塩の収率及び純度も改善できることを発見した。更に、本発明者らは驚くべきことに、特定のアルコール系溶媒を使用して最終生成物であるカダベリン塩を結晶化することにより、生成物であるカダベリン塩の収率及び/又は純度も改善できることを発見した。更に、本発明はまた、好ましくはC6～C9有機ジカルボン酸を使用して塩を形成し、特に好ましくはアジピン酸を使用してカダベリン塩を形成する。
実施形態
実施形態1. 無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得る工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、
(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を添加することによって、リジンジカルボン酸塩流のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し;従来技術と比較して大幅に減少したリジンデカルボキシラーゼ添加比で、高活性リジンデカルボキシラーゼを添加し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程であり、リジンデカルボキシラーゼ添加比が、リジンデカルボキシラーゼ細胞の乾燥ベースに基づいて計算されたリジンデカルボキシラーゼの添加質量の、リジンジカルボン酸塩の分子量に基づくリジン発酵ブロス中のリジンの質量に対する比と定義される工程と、
(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程と
を含むか本質的にそれらからなる、方法。
実施形態1. 無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得る工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、
(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を添加することによって、リジンジカルボン酸塩流のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し;従来技術と比較して大幅に減少したリジンデカルボキシラーゼ添加比で、高活性リジンデカルボキシラーゼを添加し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程であり、リジンデカルボキシラーゼ添加比が、リジンデカルボキシラーゼ細胞の乾燥ベースに基づいて計算されたリジンデカルボキシラーゼの添加質量の、リジンジカルボン酸塩の分子量に基づくリジン発酵ブロス中のリジンの質量に対する比と定義される工程と、
(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程と
を含むか本質的にそれらからなる、方法。
実施形態2. 無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、この微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)リジンジカルボン酸塩結晶を得るように、等しい当量又は過剰のジカルボン酸を添加し、発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得るように、水溶液にこの結晶を溶解する工程であり、リジンジカルボン酸塩流が、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、
(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を前記溶液に添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、
(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程と
を含むか本質的にそれらからなる、方法。
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、この微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)リジンジカルボン酸塩結晶を得るように、等しい当量又は過剰のジカルボン酸を添加し、発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得るように、水溶液にこの結晶を溶解する工程であり、リジンジカルボン酸塩流が、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、
(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を前記溶液に添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、
(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程と
を含むか本質的にそれらからなる、方法。
実施形態3. 高活性リジンデカルボキシラーゼが、以下の手順:
(1)配列番号1で表されるリジンデカルボキシラーゼのkdc遺伝子を含有するプラスミドを、大腸菌細胞に形質転換し、
(2)形質転換した陽性単一コロニーを選択し、LB試験管培地に接種し、培地に30℃及び180RPMで一晩接種し、LB試験管培地が、ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/Lを含み、
(3)TB培地を含有するフラスコに、一晩培養液から5%の接種用量で接種し、TB培地が、ペプトン12g/L、酵母抽出物24g/L、及びグリセロール4g/Lを含み、
(4)フラスコをシェーカーに入れて、インキュベーション条件:30℃、250RPMで約2時間、インキュベートし、
(5)タンパク質の発現を、0.2mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGで誘導条件:30℃、250RPMで4時間、誘導し、
(6)発酵ブロスを遠心分離して細胞を採取し、遠心分離後の湿細胞を-80℃で保存する、
で処理されるリジンデカルボキシラーゼである、実施形態1に記載の方法。
(1)配列番号1で表されるリジンデカルボキシラーゼのkdc遺伝子を含有するプラスミドを、大腸菌細胞に形質転換し、
(2)形質転換した陽性単一コロニーを選択し、LB試験管培地に接種し、培地に30℃及び180RPMで一晩接種し、LB試験管培地が、ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/Lを含み、
(3)TB培地を含有するフラスコに、一晩培養液から5%の接種用量で接種し、TB培地が、ペプトン12g/L、酵母抽出物24g/L、及びグリセロール4g/Lを含み、
(4)フラスコをシェーカーに入れて、インキュベーション条件:30℃、250RPMで約2時間、インキュベートし、
(5)タンパク質の発現を、0.2mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGで誘導条件:30℃、250RPMで4時間、誘導し、
(6)発酵ブロスを遠心分離して細胞を採取し、遠心分離後の湿細胞を-80℃で保存する、
で処理されるリジンデカルボキシラーゼである、実施形態1に記載の方法。
実施形態4.
手順(i)で、大腸菌がBL21(DE3)大腸菌であるか、又は
手順(ii)で、インキュベーション条件が30℃、180RPM、及び16時間の振とうによるインキュベーションであるか、又は
手順(iii)で、TB培地を含有するフラスコに、一晩培養した40mLのLB培地発酵ブロスから5%の接種用量で接種するか、又は
手順(iv)で、インキュベーション時間が2時間であるか、又は
手順(v)で、IPTGの濃度が0.2mMであるか、又は
手順(v)で、振とうしながら30℃で更に4時間インキュベーションを実行する、
実施形態3に記載の方法。
手順(i)で、大腸菌がBL21(DE3)大腸菌であるか、又は
手順(ii)で、インキュベーション条件が30℃、180RPM、及び16時間の振とうによるインキュベーションであるか、又は
手順(iii)で、TB培地を含有するフラスコに、一晩培養した40mLのLB培地発酵ブロスから5%の接種用量で接種するか、又は
手順(iv)で、インキュベーション時間が2時間であるか、又は
手順(v)で、IPTGの濃度が0.2mMであるか、又は
手順(v)で、振とうしながら30℃で更に4時間インキュベーションを実行する、
実施形態3に記載の方法。
実施形態5. 高活性リジンデカルボキシラーゼのリジンデカルボキシラーゼ添加比が、(1:600)～(1:1000)である、実施形態1、3、又は4のいずれか1つに記載の方法。
実施形態6. 工程(c)において、過剰のジカルボン酸を添加する、実施形態2に記載の方法。
実施形態7. 工程(b)が、総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するように、好ましくは総アンモニウム濃度を0.05%w/v～0.5%w/vに維持するように、発酵ブロスにジカルボン酸アンモニウム溶液を補給する工程を更に含む、実施形態1から6のいずれか1つに記載の方法。
実施形態8. リジンジカルボン酸塩流が、以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、実施形態1から7のいずれか1つに記載の方法。
実施形態9.
(i)いかなる更なる非必須無機アニオンの供給源の添加も含まず、それによってリジンジカルボン酸塩流に存在する無機アニオンの量を最小限に抑え、且つ/又は
(ii)発酵ブロス及び/又はリジンジカルボン酸塩流から無機イオンを除去する精製工程を含まない、
実施形態1から8のいずれか1つに記載の方法。
(i)いかなる更なる非必須無機アニオンの供給源の添加も含まず、それによってリジンジカルボン酸塩流に存在する無機アニオンの量を最小限に抑え、且つ/又は
(ii)発酵ブロス及び/又はリジンジカルボン酸塩流から無機イオンを除去する精製工程を含まない、
実施形態1から8のいずれか1つに記載の方法。
実施形態10. 無機イオンが、リン酸アニオン、硫酸アニオン、及び/若しくは塩化物アニオンであるか、又はそれらを含む、実施形態1から9のいずれか1つに記載の方法。
実施形態11. 炭酸塩緩衝系の使用を含まず、且つ/又はリジン対アニオンとして炭酸塩若しくは炭酸アニオンを含まない方法であって、炭酸塩緩衝系が、炭酸アンモニウム及び/又は重炭酸アンモニウムを含む、実施形態1から10のいずれか1つに記載の方法。
実施形態12. リジンジカルボン酸塩流からのリジンを精製する蒸留工程を含まない、実施形態1から11のいずれか1つに記載の方法。
実施形態13. 工程(a)の前に、
(i)無機塩を含むように配合された増殖培地、又は
(ii)非必須無機塩を欠くように配合された増殖培地で、
所望の細胞量に達するまで微生物を培養し、その後、この増殖培地を、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含み、非必須無機イオンを欠く前記改変培地に置き換える、実施形態1から12のいずれか1つに記載の方法。
(i)無機塩を含むように配合された増殖培地、又は
(ii)非必須無機塩を欠くように配合された増殖培地で、
所望の細胞量に達するまで微生物を培養し、その後、この増殖培地を、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含み、非必須無機イオンを欠く前記改変培地に置き換える、実施形態1から12のいずれか1つに記載の方法。
実施形態14. リジンを生成するように操作された微生物を固定化して、培地交換及び/又はリジンジカルボン酸塩流処理を容易にする、実施形態1から13のいずれか1つに記載の方法。
実施形態15. リジンを生成するように操作された微生物が細菌である、実施形態1から14のいずれか1つに記載の方法。
実施形態16. 十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程(e)が、有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されるカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を少なくとも20%増加させるように、溶液に十分な量のアルコール溶媒を添加する工程を含む、実施形態1から15のいずれか1つに記載の方法。
実施形態17. 収率の増加が、少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%である、実施形態16に記載の方法。
実施形態18. アルコール溶媒が、メタノール、エタノール、又はイソプロパノールである、実施形態16又は17に記載の方法。
実施形態19. アルコール溶媒が、イソプロパノールである、実施形態18に記載の方法。
実施形態20. 酵素的脱炭酸反応が、リジンジカルボン酸塩流中のリジンを、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞に供することによって実施される、実施形態1から19のいずれか1つに記載の方法。
実施形態21. リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞が固定化される、実施形態20に記載の方法。
実施形態22. 酵素的脱炭酸反応が、リジンジカルボン酸塩流中のリジンを、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の細胞溶解物に供することによって実施される、実施形態1から21のいずれか1つに記載の方法。
実施形態23. 前記ジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸が、4～18個の炭素を含有する、実施形態1から22のいずれか1つに記載の方法。
実施形態24. 前記ジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸が、6～9個の炭素を含有する、実施形態1から22のいずれか1つに記載の方法。
実施形態25. ジカルボン酸塩が、アジピン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸が、アジピン酸であり、これにより、リジンアジピン酸塩流であるリジンジカルボン酸塩流が生成される、実施形態1から22のいずれか1つに記載の方法。
実施形態26. 精製工程が、脱塩及び/又はイオン交換である、実施形態9に記載の方法。
実施形態27. 細菌が、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属する、実施形態15に記載の方法。
実施形態28. 細菌が、コリネバクテリウムに属し、コリネバクテリウム・グルタミクムである、実施形態27に記載の方法。
実施形態29. 細菌が、ブレビバクテリウムに属し、ブレビバクテリウム・フラブム又はブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツムである、実施形態27に記載の方法。
実施形態30. 実施形態1から29のいずれか1つに記載の方法によって製造される、カダベリンジカルボン酸塩。
実施形態31. ナイロンの作製のための、実施形態1から29のいずれか1つに記載の方法によって製造される、カダベリンジカルボン酸塩の使用。
実施形態32. カダベリンジカルボン酸塩が、カダベリンアジピン酸塩であり、ナイロンがナイロン5,6である、実施形態31に記載の使用。
実施形態33. 無機不純物が減少したリジンジカルボン酸塩結晶を製造する方法であって、
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)リジンジカルボン酸塩結晶の形成を誘導するように、使用済み発酵ブロスに十分な量のジカルボン酸を添加する工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩と比較して、リジンジカルボン酸塩結晶の無機イオン含有量が減少している、工程と
を含むか又は本質的にそれらからなる、方法。
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)リジンジカルボン酸塩結晶の形成を誘導するように、使用済み発酵ブロスに十分な量のジカルボン酸を添加する工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩と比較して、リジンジカルボン酸塩結晶の無機イオン含有量が減少している、工程と
を含むか又は本質的にそれらからなる、方法。
実施形態34. 工程(c)で添加された十分な量のジカルボン酸が、使用済み発酵ブロス中のリジンのモルに対して少なくとも1当量に相当する、実施形態33に記載の方法。
実施形態35. 工程(c)で添加された十分な量のジカルボン酸が、使用済み発酵ブロス中のリジンのモルに対して過剰当量に相当する、実施形態33に記載の方法。
実施形態36. 工程(b)が、総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するように、好ましくは総アンモニウム濃度を0.05%w/v～0.5%w/vに維持するように、発酵ブロスにジカルボン酸アンモニウム溶液を補給する工程を更に含む、実施形態33から35のいずれか1つに記載の方法。
実施形態37. 結晶化前に、使用済み発酵ブロスが、DSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、実施形態33から36のいずれか1つに記載の方法。
実施形態38.
(i)いかなる更なる非必須無機アニオンの供給源の添加も含まず、それによってリジンジカルボン酸塩流に存在する無機アニオンの量を最小限に抑え、且つ/又は
(ii)発酵ブロス及び/又はリジンジカルボン酸塩流から無機イオンを除去する精製工程(例えば、脱塩及び/又はイオン交換)を含まない、
実施形態33から37のいずれか1つに記載の方法。
(i)いかなる更なる非必須無機アニオンの供給源の添加も含まず、それによってリジンジカルボン酸塩流に存在する無機アニオンの量を最小限に抑え、且つ/又は
(ii)発酵ブロス及び/又はリジンジカルボン酸塩流から無機イオンを除去する精製工程(例えば、脱塩及び/又はイオン交換)を含まない、
実施形態33から37のいずれか1つに記載の方法。
実施形態39. 無機イオンが、リン酸アニオン、硫酸アニオン、及び/若しくは塩化物アニオンであるか、又はそれらを含む、実施形態33から38のいずれか1つに記載の方法。
実施形態40. 炭酸塩緩衝系(例えば、炭酸アンモニウム及び/又は重炭酸アンモニウム)の使用を含まず、且つ/又はリジン対アニオンとして炭酸塩若しくは炭酸アニオンを含まない、実施形態33から39のいずれか1つに記載の方法。
実施形態41. リジンを精製するための蒸留工程を含まない、実施形態33から40のいずれか1つに記載の方法。
実施形態42. 工程(a)の前に、
(i)無機塩を含むように配合された増殖培地、又は
(ii)非必須無機塩を欠くように配合された増殖培地で、
所望の細胞量に達するまで微生物を培養し、その後、この増殖培地を、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含み、非必須無機イオンを欠く前記改変培地に置き換える、実施形態33から41のいずれか1つに記載の方法。
(i)無機塩を含むように配合された増殖培地、又は
(ii)非必須無機塩を欠くように配合された増殖培地で、
所望の細胞量に達するまで微生物を培養し、その後、この増殖培地を、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含み、非必須無機イオンを欠く前記改変培地に置き換える、実施形態33から41のいずれか1つに記載の方法。
実施形態43. リジンを生成するように操作された微生物を固定化して、培地交換及び/又はリジンジカルボン酸塩流処理を容易にする、実施形態33から42のいずれか1つに記載の方法。
実施形態44. リジンを生成するように操作された微生物が細菌であり、好ましくはコリネバクテリウム属(例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム)又はブレビバクテリウム属(例えば、ブレビバクテリウム・フラブム若しくはブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム)に属する、実施形態33から43のいずれか1つに記載の方法。
実施形態45. 有機及び無機不純物が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、実施形態33から44のいずれか1つに定義される工程(a)～(c)を含むか、又は本質的にそれらからなり、
(d)工程(c)から分離したリジンジカルボン酸塩結晶を水溶液に溶解し、リジンを酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、
(e)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、この有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである、工程と
を更に含む、方法。
(d)工程(c)から分離したリジンジカルボン酸塩結晶を水溶液に溶解し、リジンを酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、
(e)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、この有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである、工程と
を更に含む、方法。
実施形態46. 有機及び無機不純物が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、
(i)リジンジカルボン酸塩を含む水溶液を用意する工程と、
(ii)リジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、
(iii)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである、工程と
を含むか又は本質的にそれらからなる、方法。
(i)リジンジカルボン酸塩を含む水溶液を用意する工程と、
(ii)リジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、前記溶液にジカルボン酸を添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、
(iii)有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されたカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、又は40%)増加させるように、十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程であり、有機溶媒が、好ましくはアルコール、例えばメタノール、エタノール、又はイソプロパノールである、工程と
を含むか又は本質的にそれらからなる、方法。
実施形態47. 酵素的脱炭酸反応が、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞にリジンを供することによって実施される、実施形態45又は46に記載の方法。
実施形態48. リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞が固定化される、実施形態47に記載の方法。
実施形態49. 酵素的脱炭酸反応が、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の細胞溶解物にリジンを供することによって実施される、実施形態47又は48に記載の方法。
実施形態50. リジンデカルボキシラーゼが、配列番号2のリジンデカルボキシラーゼであるか、又は配列番号2と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%同一のアミノ酸配列を含むリジンデカルボキシラーゼ活性を有するその変異体である、実施形態47から49のいずれか1つに記載の方法。
実施形態51. 前記ジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸が、4～18個の炭素、4～16個の炭素、4～14個の炭素、4～12個の炭素、4～10個の炭素、4～9個の炭素、6～10個の炭素、6～9個の炭素を含有する、実施形態33から50のいずれか1つに記載の方法。
実施形態52.
- ジカルボン酸塩がコハク酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がコハク酸であり、それによってリジンコハク酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がグルタル酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がグルタル酸であり、それによってリジングルタル酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアジピン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアジピン酸であり、それによってリジンアジピン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がピメリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がピメリン酸であり、それによってリジンピメリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がスベリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がスベリン酸であり、それによってリジンスベリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアゼライン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアゼライン酸であり、それによってリジンアゼライン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がセバシン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がセバシン酸であり、それによってリジンセバシン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がウンデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がウンデカンジカルボン酸であり、それによってリジンウンデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がドデカンジカルボン酸塩であり且つ/又はジカルボン酸がドデカンジカルボン酸であり、それによってリジンドデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がトリデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がトリデカンジカルボン酸であり、それによってリジントリデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がテトラデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がテトラデカンジカルボン酸であり、それによってリジンテトラデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がペンタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がペンタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンペンタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘキサデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘキサデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘキサデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘプタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘプタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘプタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がオクタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がオクタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンオクタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成される、
実施形態33から51のいずれか1つに記載の方法。
- ジカルボン酸塩がコハク酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がコハク酸であり、それによってリジンコハク酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がグルタル酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がグルタル酸であり、それによってリジングルタル酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアジピン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアジピン酸であり、それによってリジンアジピン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がピメリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がピメリン酸であり、それによってリジンピメリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がスベリン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がスベリン酸であり、それによってリジンスベリン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がアゼライン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアゼライン酸であり、それによってリジンアゼライン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がセバシン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がセバシン酸であり、それによってリジンセバシン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がウンデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がウンデカンジカルボン酸であり、それによってリジンウンデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がドデカンジカルボン酸塩であり且つ/又はジカルボン酸がドデカンジカルボン酸であり、それによってリジンドデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がトリデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がトリデカンジカルボン酸であり、それによってリジントリデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がテトラデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がテトラデカンジカルボン酸であり、それによってリジンテトラデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がペンタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がペンタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンペンタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘキサデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘキサデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘキサデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がヘプタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がヘプタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンヘプタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成され、
- ジカルボン酸塩がオクタデカンジカルボン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がオクタデカンジカルボン酸であり、それによってリジンオクタデカンジカルボン酸塩であるリジンジカルボン酸塩が生成される、
実施形態33から51のいずれか1つに記載の方法。
実施形態53. 実施形態45から52のいずれか1つに記載の方法によって製造される、カダベリンジカルボン酸塩。
実施形態54. ナイロンの作製のための、実施形態45から52のいずれか1つに記載の方法によって製造される、カダベリンジカルボン酸塩の使用。
実施形態55. カダベリンジカルボン酸塩が、カダベリンアジピン酸塩であり、ナイロンがナイロン5,6である、実施形態54に記載の使用。
実施形態56. 改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスであって、この微生物が炭素源からリジンを生成するように操作され、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変され、この発酵ブロスの無機イオン含有量が、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを採用する対応する発酵ブロスと比較して減少している、発酵ブロス。
実施形態57. 総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するために、好ましくは総アンモニウム濃度を0.05%w/v～0.5%w/vに維持するために、ジカルボン酸アンモニウム溶液が補給される、実施形態56に記載の発酵ブロス。
実施形態58. DSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、実施形態56又は57に記載の発酵ブロス。
実施形態59. リジンを生成するように操作された微生物が、実施形態43又は44で定義されているとおりである、実施形態56又は58に記載の発酵ブロス。
実施形態60. リジン発酵から得られるリジンジカルボン酸塩流であって、リジンカチオン、ジカルボン酸アニオンを含み、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変され、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されており、以下のDSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%の式を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、リジンジカルボン酸塩流。
実施形態61. 無機イオンが、リン酸アニオン、硫酸アニオン、及び/若しくは塩化物アニオンであるか、又はそれらを含む、実施形態56から59のいずれか1つに記載の発酵ブロス、又は実施形態26に記載のリジンジカルボン酸塩流。
実施形態62. 炭酸塩緩衝系(例えば、炭酸アンモニウム及び/若しくは重炭酸アンモニウム)を含まず、且つ/又はリジン対アニオンとして炭酸塩若しくは炭酸アニオンを含まない、実施形態56から59若しくは61のいずれか1つに記載の発酵ブロス、又は実施形態28若しくは29に記載のリジンジカルボン酸塩流。
本出願は、2020年2月24日に作成された約9kbのサイズの配列表を、コンピューターで読み込み可能な形式で含有する。コンピューターで読み込み可能な形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
(参考文献)
Claims (32)
- 無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得る工程であり、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、
(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を添加することによって、リジンジカルボン酸塩流のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し;従来技術と比較して大幅に減少したリジンデカルボキシラーゼ添加比で高活性リジンデカルボキシラーゼを添加し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程であり、リジンデカルボキシラーゼ添加比が、リジンデカルボキシラーゼ細胞の乾燥ベースに基づいて計算されたリジンデカルボキシラーゼの添加質量の、リジンジカルボン酸塩の分子量に基づくリジン発酵ブロス中のリジンの質量に対する比と定義される、工程と、
(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程と
を含むか又は本質的にそれらからなる、方法。 - 無機イオン含有量が減少したカダベリンジカルボン酸塩を製造する方法であって、
(a)改変培地に浸漬された微生物を含む発酵ブロスを用意する工程であり、微生物が炭素源からリジンを生成するように操作されており、培地がジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含むように改変されており、好ましくは非必須無機イオンを欠くように改変されている、工程と、
(b)リジン生成を可能にする培養条件下で、炭素源の存在下で微生物を発酵させながら、水酸化アンモニウムの添加によって発酵ブロスのpHを制御して、リジン生成を促す範囲にpHを維持する工程と、
(c)リジンジカルボン酸塩結晶を得るように等しい当量又は過剰のジカルボン酸を添加し、発酵ブロスからリジンジカルボン酸塩流を得るように水溶液に結晶を溶解する工程であり、リジンジカルボン酸塩流が、緩衝系においてジカルボン酸アニオンの代わりに無機アニオンを用いる対応する方法によって得られるリジン無機塩流と比較して、リジンジカルボン酸塩流の無機イオン含有量が減少している、工程と、
(d)リジンジカルボン酸塩流中のリジンジカルボン酸塩を酵素的脱炭酸反応に供しながら、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を前記溶液に添加することにより、溶液のpHを前記反応が起こるのに十分なレベルに維持し、それによってカダベリンジカルボン酸塩を含む溶液を製造する工程と、
(e)十分な容量の有機溶媒を溶液に添加することにより、カダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程と
を含むか又は本質的にそれらからなる、方法。 - 高活性リジンデカルボキシラーゼが、以下の手順:
(1)配列番号1で表されるリジンデカルボキシラーゼのkdc遺伝子を含有するプラスミドを、大腸菌細胞に形質転換し、
(2)形質転換した陽性単一コロニーを選択し、LB試験管培地に接種し、培地に30℃及び180RPMで一晩接種し、LB試験管培地が、ペプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、及び塩化ナトリウム10g/Lを含み、
(3)TB培地を含有するフラスコに、一晩培養液から5%の接種用量で接種し、TB培地が、ペプトン12g/L、酵母抽出物24g/L、及びグリセロール4g/Lを含み、
(4)フラスコをシェーカーに入れて、インキュベーション条件:30℃、250RPMで約2時間、インキュベートし、
(5)タンパク質の発現を、0.2mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGで誘導条件:30℃、250RPMで約4時間、誘導し、
(6)発酵ブロスを遠心分離して細胞を採取し、遠心分離後の湿細胞を-80℃で保存する
で処理されるリジンデカルボキシラーゼである、請求項1に記載の方法。 - 手順(i)で、大腸菌がBL21(DE3)大腸菌であるか、又は
手順(ii)で、インキュベーション条件が30℃、180RPM、及び16時間の振とうによるインキュベーションであるか、又は
手順(iii)で、TB培地を含有するフラスコに、一晩培養した40mLのLB培地発酵ブロスから5%の接種用量で接種するか、又は
手順(iv)で、インキュベーション時間が2時間であるか、又は
手順(v)で、IPTGの濃度が0.2mMであるか、又は
手順(v)で、振とうしながら30℃で更に4時間インキュベーションを実行する、
請求項3に記載の方法。 - 高活性リジンデカルボキシラーゼのリジンデカルボキシラーゼ添加比が、(1:600)～(1:1000)である、請求項1、3及び4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)において、過剰なジカルボン酸を添加する、請求項2に記載の方法。
- 工程(b)が、総アンモニウム濃度を、リジン生成を促すレベルに維持するように、好ましくは総アンモニウム濃度を0.05%w/v～0.5%w/vに維持するように、発酵ブロスにジカルボン酸アンモニウム溶液を補給する工程を更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- リジンジカルボン酸塩流が、以下の式:DSR=[(ジカルボン酸イオンのモル濃度)×2]/[モノカチオン性リジン(Lys+)イオンのモル濃度]×100%を使用して計算される、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のジカルボン酸塩割合(DSR)を有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- (i)いかなる更なる非必須無機アニオンの供給源の添加も含まず、それによってリジンジカルボン酸塩流に存在する無機アニオンの量を最小限に抑え、且つ/又は
(ii)発酵ブロス及び/又はリジンジカルボン酸塩流から無機イオンを除去する精製工程を含まない、
請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。 - 無機イオンが、リン酸アニオン、硫酸アニオン、及び/若しくは塩化物アニオンであるか、又はそれらを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 炭酸塩緩衝系の使用を含まず、且つ/又はリジン対アニオンとして炭酸塩若しくは炭酸アニオンを含まず、炭酸塩緩衝系が、炭酸アンモニウム及び/又は重炭酸アンモニウムを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- リジンジカルボン酸塩流からのリジンを精製する蒸留工程を含まない、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)の前に、
(i)無機塩を含むように配合された増殖培地、又は
(ii)非必須無機塩を欠くように配合された増殖培地で、
所望の細胞量に達するまで微生物を培養し、その後、増殖培地を、ジカルボン酸アンモニウム緩衝系を含み、非必須無機イオンを欠く前記改変培地に置き換える、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。 - リジンを生成するように操作された微生物を固定化して、培地交換及び/又はリジンジカルボン酸塩流処理を容易にする、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- リジンを生成するように操作された微生物が細菌である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 溶液に十分な量の有機溶媒を添加することによってカダベリンジカルボン酸塩を結晶化する工程(e)が、有機溶媒の添加を伴わない対応する結晶化方法と比較して、回収されるカダベリンジカルボン酸塩結晶の収率を少なくとも20%増加させるように、溶液に十分な量のアルコール溶媒を添加する工程を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 収率の増加が、少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%である、請求項16に記載の方法。
- アルコール溶媒が、メタノール、エタノール、又はイソプロパノールである、請求項16又は17に記載の方法。
- アルコール溶媒が、イソプロパノールである、請求項18に記載の方法。
- 酵素的脱炭酸反応が、リジンジカルボン酸塩流中のリジンを、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞に供することによって実施される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の生存細胞又は無傷細胞が固定化される、請求項20に記載の方法。
- 酵素的脱炭酸反応が、リジンジカルボン酸塩流中のリジンを、リジンデカルボキシラーゼを発現する微生物の細胞溶解物に供することによって実施される、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸が、4～18個の炭素を含有する、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ジカルボン酸塩及び/又はジカルボン酸が、6～9個の炭素を含有する、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- ジカルボン酸塩が、アジピン酸塩であり、且つ/又はジカルボン酸がアジピン酸であり、これにより、リジンアジピン酸塩流であるリジンジカルボン酸塩流が生成される、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 精製工程が、脱塩及び/又はイオン交換である、請求項9に記載の方法。
- 細菌が、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属する、請求項15に記載の方法。
- 細菌が、コリネバクテリウムに属し、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項27に記載の方法。
- 細菌が、ブレビバクテリウムに属し、ブレビバクテリウム・フラブム又はブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツムである、請求項27に記載の方法。
- 請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって製造される、カダベリンジカルボン酸塩。
- ナイロンの作製のための、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって製造されるカダベリンジカルボン酸塩の使用。
- カダベリンジカルボン酸塩が、カダベリンアジピン酸塩であり、ナイロンがナイロン5,6である、請求項31に記載の使用。
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