JP2023516147A - 新型コロナウイルスのヒトモノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents

新型コロナウイルスのヒトモノクローナル抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣＯＶ）に対するヒト化モノクローナル抗体およびその使用が本発明において提供される。本抗体は、２０１９－ｎＣＯＶの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に特異的に結合し、２０１９－ｎＣＯＶのＲＢＤとＡＣＥ２との間の結合を遮断し、さらに２０１９－ｎＣＯＶによって引き起こされる感染を阻害することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、医療技術の分野にあり、特に、高い中和活性を有する新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としても知られる）に対するヒトモノクローナル抗体およびその使用に関する。
２０２０年１０月２２日の時点で、新型コロナウイルス２０１９－ｎＣｏＶが引き起こす疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の確認された症例数は、全世界で４０００万を超え、死亡数は、１１０万を超えており、公衆の生命および健康に大きな脅威を及ぼしている。
しかしながら、現在、このウイルスに対して特異的な薬剤は存在しない。
治療用抗体医薬は、腫瘍および自己免疫疾患においてだけでなく、感染性疾患の治療においても重要な役割を果たしている。現在市販されているウイルス感染を治療および予防するための薬物は、小児呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防するためのＳｙｎａｇｉｓ、ＨＩＶ感染を治療するためのＴｒｏｇａｒｚｏ、および狂犬病ウイルスの曝露後予防のためのＲａｂｉｓｈｉｅｌｄである。臨床研究の種々の段階にあるいくつかのモノクローナル抗体もまた存在する（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／）。
２０１９－ｎＣｏＶは、コロナウイルスに属する。コロナウイルスの同じ属の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）および中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）もまた、それぞれ２００２～２００３年および２０１２年にアウトブレイクを引き起こした。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶは８，０００人の感染および７９４人の死亡を引き起こしている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／）。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染性ウイルス症例の数は、２０１２年以来増加し続けており、２０１９年の終わりまでに全世界で２，４９９人の感染および８６１人の死亡が確認されている。２０２０年１月１２日に、世界保健機関は、新型コロナウイルスを「２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）」と公式に命名し、次いで、新たなコロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）が、２０２０年２月１１～１２日に国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）によって重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）として公式に分類されたことを発表した。世界保健機関（ＷＨＯ）は、同日、ジュネーブで開催されたＧｌｏｂａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｆｏｒｕｍで、このウイルスによって引き起こされる疾患が「ＣＯＶＩＤ－１９」と公式に命名されたことを発表した。
細胞に感染するために、ウイルスはまずエンベロープタンパク質を通じて宿主の受容体に結合する必要がある。抗体、特に中和活性抗体は、エンベロープタンパク質に結合することによってウイルス感染を遮断し、それによってウイルスの細胞受容体への結合を遮断する。その間、抗体は、エンベロープタンパク質に結合し、それによって遊離ウイルスまたは感染細胞を標識し、マクロファージまたは免疫細胞（例えば、補体）および免疫分子を抗体のＦｃ領域を通じて動員し、それによって遊離ウイルスおよび感染細胞を排除する。したがって、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を標的とする抗体は、ウイルス感染を中和する活性を有するだけでなく、また、ウイルスおよび感染細胞のクリアランスを促進するようにＦｃ領域を通じて作用する。
他のコロナウイルスの研究、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶの研究に基づけば、受容体に結合する重要なエンベロープタンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）である。Ｓは、Ｓ１およびＳ２の２つの部分にさらに分けられ得る。Ｓ２の役割は、膜融合を媒介することである。Ｓ１のＮ末端（ＮＴＤ）およびＣ末端（ＣＴＤ）の両方がＲＢＤであり得る。２０１９－ｎＣｏＶの研究を通じて、チームは、ＣＴＤがこのコロナウイルスのＲＢＤであり、受容体ＡＣＥ２に結合することを見出した。したがって、ＲＢＤを標的とし、ＳのＡＣＥ２への結合を遮断する抗体は、ウイルス感染を阻害する中和抗体であり得る。本発明の目的は、２０１９－ｎＣｏＶに対する防御効果を有する特異的ヒト中和抗体を同定することである。
防御効果を有するヒト中和抗体を得るために、本発明は、まず、昆虫細胞によって発現された２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤを抗原として使用するフローソーティングによって、２０１９－ｎＣｏＶ感染後に治癒した退院者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質に特異的に結合するメモリーＢ細胞を選択し、次いで、選択された単一Ｂ細胞に対してＲＴ－ＰＣＲを行って、抗体の可変領域配列およびフラグメントを得、さらに定常領域を発現ベクター中に連結する。哺乳動物細胞において発現および精製された後、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質への結合能力、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を遮断する遮断効果、および２０１９－ｎＣｏＶ感染を阻害する中和効果を含む、一連の機能試験が行われた。２０１９－ｎＣｏＶ感染を中和するヒトモノクローナル抗体が得られ、それらはそれぞれＣＢ６およびＧＨ１２と命名された。
２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのゲルろ過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定を示す。 ２ａ：ＣＢ６抗体のモレキュラーシーブクロマトグラフィーおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定を示す。２ｂ：ＧＨ１２抗体のモレキュラーシーブクロマトグラフィーおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定を示す。 ３ａ：２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに結合するＣＢ６抗体の動力学プロファイルを示す。３ｂ：２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに結合するＧＨ１２抗体の動力学プロファイルを示す。 ４ａ：ＣＢ６抗体は、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２への結合を遮断する。４ｂ：ＧＨ１２抗体は、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２への結合を遮断する。 ５ａ：ＶＳＶ－２０１９－ｎＣｏＶ感染を中和するＣＢ６抗体の効果を示す。５ｂ：ＶＳＶ－２０１９－ｎＣｏＶ感染を中和するＧＨ１２抗体の効果を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスに対するＣＢ６抗体の中和を示す。 実験動物の体温および体重変化を示す。７ａ：実験動物の温度変化を示す。７ｂ：実験動物の体重変化を示す。 実験動物の咽喉スワブ、鼻腔スワブおよび肛門スワブのウイルス量の変化を示す。８ａ：咽頭スワブウイルス量：咽頭スワブのウイルス量は、ウイルスが動物において有効に増幅され得ることを反映するが、抗体処理後、ウイルス量は大いに減少するかまたは基本的に検出され得ない。８ｂ：鼻腔スワブウイルス量：鼻腔スワブ中のウイルス量は低く、すべて検出限界付近であるかまたはそれより下である。８ｃ：肛門スワブウイルス量：ウイルス量は低く、すべて検出限界付近であるかまたはそれより下である。Ｌ．Ｏ．Ｄ（検出限界）：２００コピー／ｍｌ。 実験動物の画像分析を示す。９ａ：対照群中の動物のＸ線観察を示す。（上）：Ｃ１、（中）：Ｃ２、（下）：Ｃ３。９ｂ：予防群中の動物の画像観察を示す。（上）：ＰＡ１、（中）：ＰＡ２、（下）：ＰＡ３。９ｃ：治療群中の動物の画像観察を示す。（上）：ＡＣ１、（中）：ＡＣ２、（下）ＡＣ３。 実験動物の気管、気管支および肺のウイルス量の分析を示す。１０ａ：チャレンジ後５日目。１０ｂ：チャレンジ後６日目。１０ｃ：チャレンジ後７日目。Ｌ．Ｏ．Ｄ（検出限界）：検出限界、１０００コピー／ｇ。
具体的には、本発明は以下の態様によって達成される。
（Ｉ）
一態様では、本発明は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、２０１９－ｎＣｏＶ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
重鎖可変領域が、
（Ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、あるいは
（ＩＩ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、
（Ｉ）それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、あるいは
（ＩＩ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、
重鎖可変領域が、
（Ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または
（ＩＩ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、
（Ｉ）それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、
（ＩＩ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（Ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、または
（ＩＩ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（Ｉ）重鎖可変領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列、または配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列、または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ＩＩ）重鎖可変領域は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、または配列番号３１に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、または配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（Ｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
（ＩＩ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体が、重鎖および軽鎖を含み、
（Ｉ）重鎖が、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２２に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列、または配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ＩＩ）重鎖が、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、または配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、または配列番号３４に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体が、
（Ｉ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖、または
（ＩＩ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディから選択される、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号７、８、２２または２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３１、３２、３３または３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３１、３２、３３または３４から選択される配列を含むポリペプチドであって、ポリペプチドは、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の一部であり、
ポリペプチドが、配列番号３１を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３２に示されるポリペプチドをさらに含み、
ポリペプチドが、配列番号３２を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３１に示されるポリペプチドをさらに含み、
ポリペプチドが、配列番号３３を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３４に示されるポリペプチドをさらに含むみ、または
ポリペプチドが、配列番号３４を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３３に示されるポリペプチドをさらに含む、ポリペプチドを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本明細書に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、好ましくは、ベクターは、真核生物発現ベクターである、発現ベクターを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、宿主細胞は、真核細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞である、宿主細胞を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを調製するための方法であって、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを、本明細書に記載の宿主細胞において、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドの発現に適した条件下で発現させ、次いで発現された抗体もしくはその抗原結合フラグメントを宿主細胞から回収することを含む、方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび／または宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ感染の治療および／または予防のための医薬の製造における、本明細書に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ポリペプチドまたは医薬組成物の使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ感染を治療および／または予防するための方法であって、治療および／または予防を必要とする対象に、本明細書に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞および／または医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞および／または医薬組成物を含む、キットを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ感染を診断するための医薬の製造における、キットの使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを使用して、サンプルにおける２０１９－ｎＣｏＶの存在を検出するための方法を提供する。
（ＩＩ）
一態様では、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
そのＶＨ鎖の相補性決定領域のＣＤＲが、
配列番号１に示されるＣＤＲ１、
配列番号２に示されるＣＤＲ２、および
配列番号３に示されるＣＤＲ３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
そのＶＬ鎖の相補性決定領域のＣＤＲが、
配列番号４に示されるＣＤＲ１、
配列番号５に示されるＣＤＲ２、および
配列番号６に示されるＣＤＲ３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
一態様では、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
そのＶＨ鎖の相補性決定領域のＣＤＲが、
配列番号２５に示されるＣＤＲ１、
配列番号２６に示されるＣＤＲ２、および
配列番号２７に示されるＣＤＲ３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
そのＶＬ鎖の相補性決定領域のＣＤＲが、
配列番号２８に示されるＣＤＲ１、
配列番号２９に示されるＣＤＲ２、および
配列番号３０に示されるＣＤＲ３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号７に示される重鎖可変領域と、
配列番号８に示される軽鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号３１に示される重鎖可変領域と、
配列番号３２に示される軽鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号２２に示される重鎖と、
配列番号２３に示される軽鎖と、を含む。
一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号３３に示される重鎖と、
配列番号３４に示される軽鎖と、を含む。
一実施形態では、ここで、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディから選択される。
別の態様では、本発明は、配列番号７、８、２２または２３から選択される配列を含む、ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号３１、３２、３３または３４から選択される配列を含むポリペプチドであって、ポリペプチドは、ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＢＤに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の一部であり、
ポリペプチドが、配列番号３１を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３２に示されるポリペプチドをさらに含み、
ポリペプチドが、配列番号３２を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３１に示されるポリペプチドをさらに含み、
ポリペプチドが、配列番号３３を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３４に示されるポリペプチドをさらに含み、または
ポリペプチドが、配列番号３４を含む場合、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３３に示されるポリペプチドをさらに含む、ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、前述のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントのいずれか１つ、または前述のポリペプチドのいずれか１つをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上記の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、前述のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか１つと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、２０１９－ｎＣｏＶ感染を治療するための医薬の製造における、上記のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか１つの使用を提供する。
本明細書に開示されるヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤなどのコロナウイルスに特異的に結合する。
本明細書において言及されるすべての文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
定義
本発明の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用い、これらは当技術分野の技術範囲内である。
本発明がより容易に理解され得るために、特定の科学用語および技術用語は以下のように具体的に定義される。本明細書中の他の部分における別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野の定義および用語について、当業者は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を特に参照し得る。アミノ酸残基のための略語は、２０個の一般的に使用されるＬ－アミノ酸のうちの１つを指すために当技術分野で使用される標準的な３文字および／または１文字コードである。本明細書で使用される場合（特許請求の範囲を含む）、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の指示がない限り、対応する複数を包む。
「約」という用語は、数値と併せて使用される場合、指定された数値より５％小さな下限と、指定された数値より５％大きな上限とを有する範囲内の数値を包含することが意図され、±５％、±２％、±１％、および±０．１％を含むが、これらに限定されず、そのような変動は、開示される方法を行うために適切である。
「および／または」という用語は、選択肢のうちの任意の１つ、または選択肢のうちの任意の２つもしくはそれ以上の組み合わせを意味すると理解される。
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、上記で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、数または要素のリストうちの少なくとも１つ（２つ以上も含む）、および、任意選択で、追加のリストされていない項目を含むものと解釈されるべきである。特許請求の範囲において使用される「１つのみ」または「実際に１つ」、または「からなる」など、用語が明確にそれとは反対に指示されている場合にのみ、１つの数またはリストの１つの要素のみを指す。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」または単に「同一性」という用語は、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮することなしに最大パーセント配列同一性を得るようにアミノ酸配列に整列させた（かつ、必要に応じて、ギャップを導入した）後に、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基と同一である候補アミノ酸配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列アラインメントは、パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための当技術分野で知られている種々の方法を使用して、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピューターソフトウェアを使用して、行われ得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定し得る。
「抗体」という用語は、所望の生物学的活性を有する任意の形態の抗体を指す。したがって、それは、その最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、全ヒト抗体、キメラ抗体、およびラクダ化単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
「モノクローナル抗体」という用語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一のエピトープに対するものである。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、様々なエピトープに対する（または特異的な）多数の抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られているという抗体の特徴を示すものであり、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきでない。
「抗原結合フラグメント」は、親抗体の抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部、例えば、１つ以上のＣＤＲを一般に含む、抗体および抗体アナログの抗原結合フラグメントを指す。抗体のフラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくともいくらかを保持する。抗原結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、ＣＤＲ含有ペプチドなどからなる群から選択されるものが含まれる。
「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖および１つの重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含有する。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合によって、およびＣＨ３ドメインの疎水作用によって一緒に保持される。
「Ｆａｂ’フラグメント」は、軽鎖と、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の部分を含む重鎖の部分とを含み、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖の間に形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成する。
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２つの軽鎖と、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の部分を含む重鎖の２つの部分とを含み、それによって２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’フラグメントからなる。
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
「単鎖Ｆｖ抗体」（ｓｃＦｖ抗体）は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗原結合フラグメントを指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に含まれる。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。
「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗原結合フラグメントである。このフラグメントは、同じポリペプチド鎖中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）。短く、同じ鎖の２つのドメインの間で対形成することを可能にしないリンカーを使用することによって、ドメインは、他の鎖の相補性ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を形成する。
「特異的」結合は、リガンド／受容体、抗体／抗原または他の結合対に言及する場合、タンパク質および／または他の生物学的物質の不均一な集団における、本発明のモノクローナル抗体などのタンパク質の、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質との結合反応の存在または非存在を決定することを指す。したがって、特異的条件下で、特定のリガンド／抗原は、特定の受容体／抗体に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質には有意な量で結合しない。
「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー間の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離速度定数と結合速度定数（それぞれ、ｋｄｉｓおよびｋｏｎ）の比である、平衡解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定され得る。親和性を測定するための１つの特定の方法は、本明細書におけるＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学結合アッセイである。タンパク質または細胞に「結合しない」という用語は、それがタンパク質または細胞に結合しない、または高親和性でそれに結合しないことを意味し、すなわち、結合タンパク質または細胞のＫＤは、１．０×１０－６Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－５Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－４Ｍ以上、１．０×１０－３Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－２Ｍ以上である。
ＩｇＧ抗体についての「高親和性」という用語は、１．０×１０－６Ｍ以下、好ましくは５．０×１０－８Ｍ以下、より好ましくは１．０×１０－８Ｍ以下、５．０×１０－９Ｍ以下、より好ましくは１．０×１０－９Ｍ以下の抗原に対するＫＤを意味する。他の抗体サブタイプについては、「高親和性」結合は変動し得る。例えば、ＩｇＭサブタイプの「高親和性」結合は、１０－６Ｍ以下、好ましくは１０－７Ｍ以下、より好ましくは１０－８Ｍ以下のＫＤを指す。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される既知の天然ヌクレオチドのアナログを含有する核酸を含む（その中でウリジンがプソイドウリジンによって置換されているｍＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子を合成する方法、および治療用タンパク質をインビボで送達するための方法を開示する、Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．の米国特許第８，２７８，０３６号を参照）。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列だけでなく、保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、およびその相補配列を黙示的に含む。特に、縮重コドン置換は、その中で１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）、ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１－９８（１９９４））。
「構築物」は、任意の供給源に由来し、ゲノムに組み込まれるかまたは自律的に複製することができ、その中で１つ以上のポリヌクレオチド分子が機能的に連結されている（すなわち、作動可能に連結されている）ポリヌクレオチド分子を構成する、任意の組換えポリヌクレオチド分子（例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージまたは直鎖状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド分子）を指す。組換え構築物は、典型的には、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写を指示する転写開始調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。異種および非異種（すなわち内因性）の両方のプロモーターが、本発明の核酸の発現を導くために使用され得る。
「ベクター」は、形質転換目的（すなわち、宿主細胞中への異種ＤＮＡの導入）のために使用され得る任意の組換えポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、その中に追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、その中で追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中に連結され得るウイルスベクターである。特定のベクターは、その中にそれが導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。加えて、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、宿主細胞中に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入されたときに、複製し、目的の遺伝子を発現させることができる核酸分子を指す。発現ベクターは、所望であれば、ベクターの維持を確実にし、宿主中での増幅を提供するための、１つ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含有する。
本発明はまた、本発明の２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに特異的に結合するヒト高中和活性モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物を調製するために、抗体またはその抗原結合フラグメントは、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することによって、種々の所望の剤形に製剤化され得る。本発明の医薬組成物の剤型のタイプとしては、例えば、錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細顆粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、小丸剤、舌下錠、軟膏剤などが経口剤として挙げられ得、非経口剤としては、注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏、硬膏剤、外用液体製剤などが挙げられ、当業者は、投与経路および投与対象などに従って適切な剤型を選択し得る。
投与される本発明の医薬組成物の有効成分の量は、投与される対象、対象の臓器、症状、投与方法などに応じて変動し、剤形のタイプ、投与方法、患者の年齢および体重、患者の症状などを考慮して医師の判断に従って決定され得る。
本発明の有益な効果：
本発明は、ヒト起源の高中和活性抗体であるＣＢ６およびＧＨ１２を達成する。上記の抗体は、２０１９－ｎＣｏＶ感染を中和するヒト抗体である。２０１９－ｎＣｏＶに対するＣＢ６抗体の結合定数は８．１５Ｅ－１０Ｍであり、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに対するＧＨ１２抗体の親和性は５．８７Ｅ－０９Ｍであった。ヒト高中和活性抗体ＣＢ６およびＧＨ１２は、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのｈＡＣＥ２への結合を有効に遮断し得、２０１９－ｎＣｏＶシュードウイルス感染の中和活性を阻害し得る。本発明のＣＢ６およびＧＨ１２は、２０１９－ｎＣｏＶ感染の治療および予防における臨床的有用性を有する。
本発明の目的、態様および利点をより明らかにするために、本発明のより詳細な説明が、具体的な実施形態と組み合わせて、図面を参照して、以下で詳細に与えられる。
実施例１：２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤの発現および精製
２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質（配列番号９に示されるアミノ酸配列）のコード領域の３’末端に、６個のヒスチジンタグ（ｈｅｘａ－Ｈｉｓタグ）のコード配列および翻訳終止コドンを連結し、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを連結することによってｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）中に構築した。次いで、連結産物を、バキュロウイルス組換えのためにＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎから購入）中に形質転換した。組換えバキュロウイルスを抽出し、バキュロウイルスのパッケージングのためにｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）中にトランスフェクトし、増幅し、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質の発現のためにＨｉ５細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に添加した。
ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＴＭＨＰ（ＧＥ））およびゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ））による精製の後、比較的純粋な標的タンパク質を、標的タンパク質を含有する細胞培養液から得ることができる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、３０ＫＤのサイズを同定し、結果を図１に示す。
実施例２：２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質特異的メモリーＢ細胞の単離
２０１９－ｎＣｏＶ感染後に回復した退院者のインフォームドコンセントを得て、１５ｍＬの血液を採取し、ＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを、１０７／ｍＬの密度で、４００ｎＭの最終濃度の２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質とともに、結合のために半時間氷上でインキュベートし、次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、以下の抗体とともにインキュベートした（すべてＢＤから購入）：抗ヒトＣＤ３／ＰＥ－Ｃｙ５、抗ヒトＣＤ１６／ＰＥ－Ｃｙ５、抗ヒトＣＤ２３５ａ／ＰＥ－Ｃｙ５、抗ヒトＣＤ１９／ＡＰＣ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ２７／Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、抗ヒトＣＤ３８／ＡＰＣ、抗ヒトＩｇＧ／ＦＩＴＣ、および抗Ｈｉｓ／ＰＥ。氷上での半時間のインキュベーションの後、ＰＢＭＣをＰＢＳで２回洗浄した。
ＰＢＳ洗浄したＰＢＭＣをＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩによってソートし、ＰＥ－Ｃｙ５－ＡＰＣ－ＡＰＣ－Ｃｙ７＋Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ＋ＦＩＴＣ＋ＰＥ＋の細胞（すなわち、Ｂ細胞）を９６ウェルプレート中に１細胞／ウェルで直接採取した。
実施例３：単一Ｂ細胞ＰＣＲ、配列分析およびヒト抗体設計
Ｑｉｈｕｉ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ，ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．８，Ｎｏ．３６９，Ｄｅｃ．２０１６に記載される方法に従って、実施例２で得たＢ細胞を、表１に示す逆転写プライマーを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって逆転写し、５５℃で６０分間反応させた。
Figure 2023516147000002
３．１ ヒト抗体ＣＢ６
上記の逆転写産物をテンプレートとして使用して、抗体可変領域配列を、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｐ Ｐｌｕｓ酵素（ＱＩＡｇｅｎ）を使用するＰＣＲ（ＰＣＲａ）によって増幅した。対応するプライマーを設計し、反応条件は以下のとおりである：９５℃５分；９５℃３０秒、５５℃（重鎖）３０秒、７２℃９０秒、３５サイクル；７２℃７分。この産物を、ＰＣＲ産物を得るために、以下の条件下での別のラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲｂ）のためのテンプレートとして使用した：９５℃５分；９５℃３０秒、５８℃（重鎖）／６０℃（κ鎖）３０秒、７２℃９０秒、３５サイクル；７２℃７分。
ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル電気泳動によって分離した。４００～５００ｂｐのバンドサイズのゲルを回収し、シーケンシングに送った。シーケンシング結果を、ＩＭＧＴオンラインソフトウェアを使用して分析した。
分析からの適正な可変領域配列を、ブリッジＰＣＲによって対応する重／カッパ鎖定常領域と連結し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）中にクローニングした。重鎖をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて連結し、κ鎖をＳａｃＩおよびＸｈｏＩを用いて連結した。Ｂ細胞シーケンシングおよび発現プラスミド構築は以下のとおりである。
ヒト抗体設計戦略は以下のとおりである：
重鎖：ＣＭＶプロモーター－ＥｃｏＲＩ－リーダー配列－重鎖可変領域－ＣＨ－ＸｈｏＩ、
軽鎖（κ）：ＣＭＶプロモーター－ＳａｃＩ－リーダー配列－軽鎖可変領域－ＣＬ（κ）－ＸｈｏＩ、
ここで、リーダー配列のアミノ酸配列を配列番号１８に示し、ＣＨのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、ＣＬのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。配列決定によって、ＣＢ６と命名された抗体の配列を得た。
ここで、ＣＢ６の重鎖可変領域配列を配列番号７に示し、軽鎖可変領域配列を配列番号８に示し、重鎖配列を配列番号２２に示し、軽鎖配列を配列番号２３に示す。
ＣＢ６の重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有し、軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。ここで、生殖系列遺伝子に対するＣＢ６抗体の配列同一性は、以下のように比較される。
Figure 2023516147000003
Figure 2023516147000004
３．２ ヒト抗体ＧＨ１２
上記の逆転写産物をテンプレートとして使用して、抗体可変領域配列を、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｐ Ｐｌｕｓ酵素（ＱＩＡｇｅｎ）を使用するＰＣＲ（ＰＣＲａ）によって増幅した。対応するプライマーを設計し、反応条件は以下のとおりである：９５℃５分；９５℃３０秒、５５℃（重鎖）／５０℃（ラムダ鎖）３０秒、７２℃９０秒、３５サイクル；７２℃７分。この産物を、ＰＣＲ産物を得るために、以下の条件下での別のラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲｂ）のためのテンプレートとして使用した：９５℃５分；９５℃３０秒、５８℃（重鎖）／６４℃（ラムダ鎖）３０秒、７２℃９０秒、３５サイクル；７２℃７分。
ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル電気泳動によって分離した。４００～５００ｂｐのバンドサイズのゲルを回収し、シーケンシングに送った。シーケンシング結果を、ＩＭＧＴオンラインソフトウェアを使用して分析した。
分析からの適正な可変領域配列を、ブリッジＰＣＲによって対応する重／ラムダ鎖定常領域と連結し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）中にクローニングした。ここで、重鎖を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いてラムダ鎖に連結する。Ｂ細胞シーケンシングおよび発現プラスミド構築は以下のとおりである。
ヒト抗体設計戦略は以下のとおりである：
重鎖：ＣＭＶプロモーター－ＥｃｏＲＩ－リーダー配列－重鎖可変領域－ＣＨ－ＸｈｏＩ、
軽鎖（λ）：ＣＭＶプロモーター－ＥｃｏＲＩ－リーダー配列－軽鎖可変領域－ＣＬ（λ）－ＸｈｏＩ、
ここで、リーダー配列のアミノ酸配列を配列番号１８に示し、ＣＨのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、ＣＬのアミノ酸配列を配列番号２４に示す。配列決定によって、ＧＨ１２と命名された抗体の配列を得た。
ここで、ＧＨ１２の重鎖可変領域配列を配列番号３１に示し、軽鎖可変領域配列を配列番号３２に示し、重鎖配列を配列番号３３に示し、軽鎖配列を配列番号３４に示す。
ＧＨ１２の重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有し、軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する。
ここで、生殖系列遺伝子に対するＧＨ１２抗体の配列同一性は、以下のように比較される。
Figure 2023516147000005
Figure 2023516147000006
実施例４：抗体の発現
２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。２９３Ｔを、実施例３で得た特異的抗体の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４～６時間後に、細胞培養培地を無血清ＤＭＥＭに交換し、培養を３日間継続した。上清を採取した後、ＤＭＥＭを再度添加し、培養を４日間継続し、上清を採取した。
採取した上清を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を含有する等量のバッファーと混合し、０．２２μｍフィルター膜を通してろ過し、プロテインＡプレパックカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と合わせた。結合したタンパク質を、１０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を用いて溶出した。タンパク質を、採取し、濃縮し、モレキュラーシーブクロマトグラフィーに供した。目的のピークをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元および非還元）によって決定し、結果を図２ａ（ＣＢ６抗体）および図２ｂ（ＧＨ１２抗体）に示す。精製ＣＢ６およびＧＨ１２抗体を得た。
実施例５：２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに対する抗体の結合能の表面プラズモン共鳴検出
表面プラズモン共鳴分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して行った。具体的なステップは以下のとおりである。
プロテインＡチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）を使用し、実施例４で得た精製抗体を、抗体のＦｃに対するプロテインＡの親和性によってチップ上に約５０００ＲＵの量で固定化し、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤタンパク質を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４溶液で２倍溶液で希釈し、１つずつ低濃度から高濃度へロードした。２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに対する抗体結合の動力学プロファイルを、図３ａ（ＣＢ６抗体）および図３ｂ（ＧＨ１２抗体）に示す。２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに対する抗体結合についての動力学定数を表６に示す。結合動力学定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア８Ｋ（Ｂｉａｃｏｒｅ，ｉｎｃ．）を使用して算出した。ＣＢ６およびＧＨ１２抗体は、より高い親和性で２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤに結合することができることがわかる。
Figure 2023516147000007
実施例６：２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を遮断する本発明の抗体の検出
ｈＡＣＥ２（配列番号２１に示されるアミノ酸配列）をコードする遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩによってｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）中に構築し、ＧＦＰとの融合によって発現させて、ｐＥＧＦＰ－ｈＡＣＥ２プラスミドを形成した。ｐＥＧＦＰ－ｈＡＣＥ２プラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡下で２４時間観察した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２細胞を、反応当たり２×１０５個で採取し、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤ（２００ｎｇ／ｍＬ）とともに３０分間室温でインキュベートした。５００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。抗Ｈｉｓ／ＡＰＣ（ａｎｔｉ－Ｈｉｓ／ＡＰＣ）との３０分間室温でのインキュベーションおよびＰＢＳでの２回の洗浄の後、細胞表面蛍光を、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いて検出した。
ＣＢ６およびＧＨ１２の遮断効果を調べるために、実施例４で得た精製抗体（ＣＢ６およびＧＨ１２）を、２００ｎｇ／ｍＬの２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤとともに１０：１のモル比で室温で１時間それぞれインキュベートし、次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２細胞とともにインキュベートした。残りのステップは上記と同じであり、タンパク質の細胞への結合を検出するために抗Ｈｉｓ／ＡＰＣを使用する。抗体は、図４ａ（ＣＢ６抗体）および図４ｂ（ＧＨ１２抗体）に示すように、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２細胞への結合を遮断する。このように、ＣＢ６抗体およびＧＨ１２抗体の両方は、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤのＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２細胞への結合を遮断した。
実施例７：２０１９－ｎＣｏＶシュードウイルス感染を中和する本発明における抗体の検出
実施例４で得た精製抗体（ＣＢ６およびＧＨ１２）を、それぞれ５０μｇ／ｍＬから開始して第１０の勾配（２．５ｎｇ／ｍＬ）まで３倍希釈し、１．６×１０４ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－２０１９－ｎＣｏＶシュードウイルスと混合し、１時間３７℃でインキュベートし、次いで、Ｈｕｈ７細胞（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅから購入）を事前接種した９６ウェルプレートに添加した。４時間のインキュベーションの後、培養培地およびウイルス溶液を捨て、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を添加し、インキュベーションを４８時間継続した。培養液を捨て、ＰＢＳで１回洗浄し、１×溶解溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、細胞を溶解し、１０μＬの溶解溶液を取り、５０μＬの反応基質を添加し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒｓ検出を行った。ＶＳＶ－２０１９－ｎＣｏＶシュードウイルスに対する抗体の中和能力を、様々な濃度でのルシフェラーゼ活性に基づいて算出し、結果を図５ａ（ＣＢ６抗体）および図５ｂ（ＧＨ１２抗体）に示し、結果を表７に統計的に示す。
Figure 2023516147000008
ＣＢ６抗体およびＧＨ１２抗体は高い中和活性で２０１９－ｎＣｏＶシュードウイルスを中和し得ることがわかる。
まとめると、ＣＢ６抗体およびＧＨ１２抗体は、新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）に対する高い中和活性を有するヒトモノクローナル抗体として作用し得る。
実施例８：２０１９－ｎＣｏＶ生ウイルスを中和する本発明における抗体の検出
本研究は、インビトロ中和アッセイによって、２０１９－ｎＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）生ウイルスに対するＣＢ６抗体の中和効果を評価した。
Figure 2023516147000009
８．２ 実験方法
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、９６ウェル培養プレート中にウェル当たり１×１０５個の密度で接種し、３７℃での２４時間の後に使用した。９６ウェル組織培養プレートにおいてＤＭＥＭ培地中、５０μｌのＣＢ６抗体の段階２倍希釈液（４８．８ｎｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまで）を添加した。次いで、２００ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有する等量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワーキングストックを、１００ＴＣＩＤ５０の最終ウイルス量のために添加した。抗体－ウイルス混合物を１時間３７℃でインキュベートし、次いで、８量体融合Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、３日間３７℃でＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。１００ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞または対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した細胞を、それぞれ陽性対照または陰性非感染対照として使用した。感染の前後に各ウェルにおいて細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察および記録した。ウイルス逆タイトレーションを行って、実験において使用した適正なウイルスタイトレーションを評価した。５０％中和用量（ＮＤ５０）を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して算出した。すべての実験を、承認されたバイオセーフティレベル３施設において標準作業手順に従って行った。
８．３ 結果および結論
ＣＢ６の中和機能を、様々な濃度のＣＢ６の存在下で細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスと共培養することによって評価した。図６に示すように、ＣＢ６は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの細胞変性効果を用量依存的な様式で低下させた。中和用量中央値（ＮＤ５０）は５．５６ｎＭであった。
ＣＢ６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスを中和し、ウイルスの細胞への病理学的損傷を低下させる。
実施例９：動物に対する本発明の抗体の防御効果の評価
９．１ 実験計画
１）非ヒト霊長類実験動物は、およそ７年齢のアカゲザルであり（Ｈｕｂｅｉ Ｔｉａｎｑｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、雌性３匹および雄性６匹、体重５．７～１０．９ｋｇ、２５１２～２５４５日齢である。ルーチン病原体検出およびコロナウイルスウイロイド検出を、実験動物品質管理の要件に従って完了させ、要件を満たす実験動物を、研究室において３日間適応飼育する。
２）対照群、ＣＯＶＩＤ－１９抗体治療群および予防群を設定し、対照群に３匹のアカゲザル（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）を、予防群に３匹のアカゲザル（ＰＡ１、ＰＡ２およびＰＡ３）を、治療群に３匹のアカゲザル（ＡＣ１、ＡＣ２およびＡＣ３）を含めた。ここで、対照群に、チャレンジの２４時間前にＰＢＳの単回注射を与え、一方、予防群に、チャレンジの２４時間前に５０ｍｇ／ｋｇの用量でＣＢ６与えた。治療群に、チャレンジの２４時間後および７２時間後に５０ｍｇ／ｋｇの用量でＣＢ６を注射した。
３）動物を気管内挿管によって感染させ、１ｍｌのウイルス溶液を接種し、ウイルス接種量は、１×１０５ＴＣＩＤ５０であった。
４）パラメータ収集：
ａ．実験動物の疾患経過および健康スコアの変化を毎日観察および記録した。
ｂ．動物を様々な時点で麻酔した後、体重および体温を測定し、肛門スワブ、咽喉スワブ、肺胞洗浄液および血液サンプルを採取した。
ｃ．感染後３日目および６日目に、実験動物の胸部Ｘ線画像を収集し、その時間を観察およびサンプリングと同期化した。
ｄ．感染後５日目、６日目および７日目に、１匹の動物を剖検のために無作為に選択し、様々な組織および臓器サンプルを採取した。組織病理学、ウイルス量および免疫組織化学分析を、研究室において従来の方法によって不活化した後にサンプルに対して行った。
５）様々なサンプル（鼻腔スワブ、咽喉スワブ、肛門スワブ、血液、組織および臓器）のウイルス量分析、血液ルーチン分析、血液生化学分析および中和抗体タイター分析を完了し、感染動物の画像化および主要な臓器組織の病理学的分析を完了した。
６）研究室の標準作業手順およびバイオセーフティ管理の要件に従って、すべての採取した動物組織および臓器サンプルを、研究室における不活化処理の後に組織病理学、ウイルス量および免疫組織化学分析に供する。実験の間に生じたすべての廃棄物を、研究室の廃棄物管理規制に従って廃棄した。
９．２ 実験方法
１）新型コロナウイルス株
新型コロナウイルス株２０１９－ｎＣｏＶ－ＷＩＶ０４（ＧＩＳＡＩＤアクセッション番号：ＥＰＩ＿ＩＳＩ＿４０２１２４）は、Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって、２０１９年１２月に武漢のウイルス性肺炎患者からの気管支肺胞洗浄液のサンプルから単離された。単離されたウイルス株を精製、培養、増殖および濃縮した後、ウイルスの５０％組織細胞感染用量（ＴＣＩＤ５０）を決定し、ウイルスタイターの単位はＴＣＩＤ５０／ｍｌである。
２）動物行動観察
実験動物の免疫化およびウイルスチャレンジ期の間、皮膚および毛髪、分泌物、呼吸、糞便および尿、飼料摂取および運動行動、体重および温度を毎日または指示された時刻に観察し、各動物の健康を「新型コロナウイルスチャレンジ後のアカゲザルのための臨床スコア化基準」に従ってスコア化した。
３）ウイルスタイター決定
新型コロナウイルスサンプルをＶｅｒｏ Ｅ６細胞含有ＤＭＥＭ中に接種し、３７℃および５％ＣＯ２での３日間の培養の後、培養液を採取し、将来の使用のためにＤＭＥＭ中で貯蔵した。単離されたウイルス株を精製、培養、増殖、濃縮した後、ウイルスの５０％組織細胞感染用量（ＴＣＩＤ５０）を決定する。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、エンドポイントタイトレーションによってウイルスについてタイトレートした。ウイルス希釈液の１０倍希釈液を細胞に接種し、１時間のインキュベーションの後、ウイルス希釈液を吸引し、１００μｌのＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清、１ｍｍ Ｌ－グルタミン、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充）を添加した。細胞変性スコアを３日間の培養の後に行い、ウイルスタイター（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を算出した。
４）リアルタイム定量的蛍光ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
１ステップリアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲを、サンプル中のウイルスＲＮＡの定量分析のために使用した。ウイルスＲＮＡを、スワブおよび血液サンプルから、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を供給業者の説明書に従って使用して抽出した。サンプルをＤＭＥＭ（１：１０、Ｗ／Ｖ）中でホモジナイズし、４５００ｇの低速で３０分間４℃で遠心分離し、ＲＮＡをすぐに上清から抽出した。ＲＮＡを、５０μｌの溶出液中にＲＴ－ＰＣＲテンプレートとして溶出した。以前の研究の結果に基づいて、Ｓ遺伝子のためのプライマー：ＲＢＤ－ｑＦ１：５’－ＣＡＡＴＧＧＴＴＡＡＧＧＣＡＧＧ－３’；ＲＢＤ－ｑＲ１：５’－ＣＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＣＧ－３’を使用した。
サンプル中のＲＮＡのコピー数を、ＨｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）キットを説明書に従って使用して決定した。４０サイクルの５０℃、３分、９５℃、３０秒（９５℃、１０秒の終結を含む）、６０℃、３０秒を、ＡＢＩ ７７００装置で行い、標準曲線に従ってウイルスコピー数（コピー／ｍｌ）に変換した。
５）中和抗体アッセイ
血清サンプル中の中和抗体タイターを、血清抗体を新型コロナウイルス生ウイルスで中和することによって決定した。得られた動物血清サンプルを、５６℃で３０分間熱失活し、１：５０、１：１５０、１：４５０、１：１３５０、１：４０５０および１：１２１５０に希釈し、等量の生ウイルスを添加し、５％ＣＯ２を含有するインキュベーター中３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、１００マイクロリットルの混合物を１２ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞の単層上に接種し、１５分ごとに振とうしながら１時間インキュベートした。残存する接種物を除去した後、０．９％メチルセルロースおよび２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭの培養培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。３日後に、細胞を４％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、固定溶液を除去し、水道水ですすぎ、次いで、クリスタルバイオレットで染色した。プラークの数を計数し、中和抗体タイター（ＥＣ５０）を決定した。
６）実験動物手順
すべてのチャレンジ実験を、レベルＩＶバイオセーフティ研究室において行った。アカゲザルを麻酔し、気管内挿管によって１ｍｌのウイルス溶液を接種した。動物を、任意の重度のまたは可視の変化の性質、発生、重症度および持続期間を含む臨床症状について毎日観察および記録する。肺Ｘ線を、ＨＦ１００Ｈａ（ＭＩＫＡＳＡ，Ｊａｐａｎ）を用いて様々な時点で行って、肺画像ならびに中咽頭、鼻甲介および肛門領域からのスワブサンプルおよび血液サンプルを得た。採取したスワブサンプルを、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌに入れた。全血を、ウイルスＲＮＡ抽出および血液ルーチン分析のためにＫ２ ＥＤＴＡチューブ中で貯蔵した。気道の病態形成および病理学的損傷を研究するために、１匹の動物をチャレンジ後５、６および７日目に無作為に安楽死させた。気管、右気管支、左気管支、６つの肺葉ならびにその他の組織および臓器を、病理学的、ウイルス学的および免疫学的分析のために採取した。
７）動物解剖および病理学的分析
動物解剖を、実験動物のための標準手順に従って行った。採取した臓器および組織サンプルを、１０％中性ホルマリンバッファー中で固定し、次いで、パラフィン包埋および切片化のために研究室から取り出した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した後、光学顕微鏡下で観察した。新型コロナウイルスの分布を検出するために、パラフィン脱水した組織切片を抗原バッファーに入れ、５％ウシ血清アルブミンで１時間室温で遮断し、次いで、１：５００の自製の一次抗体（ウサギ抗ＲＰ３－ＲＰ３－ＣｏＶ Ｎタンパク質ポリクローナル抗体）で遮断した。ＰＢＳで洗浄した後、切片を少し乾燥させ、１：２００希釈し、Ｃｙ３コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）二次抗体で覆った。スライドをＰＢＳで洗浄し、１：１００希釈したＤＡＰＩで染色した。画像を、Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ＭＩＤＩシステム（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）によって取得した。
実験動物の肺における病理学的変化に従って、臓器および組織の損傷レベルを決定し、ここで、「＋＋＋」は重度の病変を示し、「＋＋」は中等度の病変であり、「＋」は軽度の病変であり、「－」は病変なしであり、「＋／－」は軽度の病変と病変なしとの間である。
８）その他の操作
バイオセーフティレベルＩＶ研究室の管理システム文書の要件に従って、研究室の標準作業手順を使用して、完了する。
９．３ 実験結果
１）実験動物の選択および適応給餌
実験動物は、湖北省における実験動物の品質管理の要件を満した。実験動物の行動、健康および摂食は、研究室における３日間の適応給餌を完了した後に異常でなかった。
２）ウイルス接種後の実験動物の臨床症状についての観察
対照群、治療群および予防群中の動物を、Ｐ４研究室に移した。研究室における３日間の適応給餌の後、以下の操作をそれぞれ行った。
対照群および予防群：ＰＢＳおよびモノクローナル抗体（最大５０ｍｇ／ｋｇ）を計画に従って屋内で静脈内注射した。２４時間後、動物を気管内挿管によってチャレンジした。ルーチン観察、体温および体重試験を実験計画に従って行った。
治療群：気管内挿管による２４時間のチャレンジの後、薬物を１日目および３日目に計画どおりに投与し、ルーチン観察、体温および体重試験を実験計画に従って行った。
結果は、対照群、ＣＯＶＩＤ－１９抗体治療群および予防群の実験動物が、体温（図７ａを参照）および体重（図７ｂを参照）の有意な変化なしに、実験期間全体を通して有意な行動の差異を示さなかったことを示した。
３）咽喉スワブ、鼻腔スワブおよび肛門スワブのウイルス量の変化
咽喉スワブ、鼻腔スワブおよび肛門スワブサンプルを毎日採取して、様々なサンプル中のウイルス量の変化を検出した。結果は、対照群における咽喉スワブのウイルス量が感染時間とともに変化し、実験動物（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のウイルス量が接種後２日目から４日目にピークに達し、次いで、絶え間なく減少したことを示した。７日目までに、サンプル中のウイルス量はより低いレベルに下がった。しかしながら、咽喉スワブのウイルス量は、異なる動物の間で変動し、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３におけるウイルス複製のピークは、それぞれチャレンジ後２、３および４日目であった。しかしながら、全体として、咽喉スワブサンプル中のウイルス量の変動は、インビボでのウイルスの増殖プロセスを示した（図８ａを参照）。対照動物の咽喉スワブ中のウイルス量の検出結果と比較すると、実験期間全体を通して、予防群中のＰＡ１およびＰＡ２動物において、低レベルのウイルス核酸がチャレンジ後２日目および３日目に検出され得たのみであり、一方、他の検出ポイントは検出され得なかった。実験期間全体を通して、ウイルス核酸はＰＡ３動物において検出されなかった。
ＣＯＶＩＤ－１９抗体治療群において有意な個体差が存在した。しかしながら、すべてはチャレンジ後２日目にウイルス量のピーク値に達し、次いで、減少し続け、ウイルス量は対照群におけるものよりもはるかに低かった。３日目のＡＣ１個体のウイルス量は検出下限より低い。鼻腔スワブサンプル、すべて群はより低いウイルス量を有した。チャレンジ初期の低レベルのウイルス核酸コピー数が鼻腔スワブサンプルにおいてのみ検出され、７日目までにすべての鼻腔スワブサンプルにおいてウイルス核酸は検出されなかった（図８ｂを参照）。
肛門スワブサンプルのウイルス量は、すべての群において、より低かった。チャレンジ初期の低レベルのウイルス核酸コピー数が少数の動物においてのみ検出され、７日目までにすべての鼻腔スワブサンプルにおいてウイルス核酸は検出されなかった（図８ｃを参照）。
４）感染動物の画像分析
チャレンジの０日目の対照群中の３匹の動物のＸ線肺画像はクリアであり、肺陰影は観察されなかった。ウイルスチャレンジの日に、対照群中の実験動物の肺において明らかな陰影は観察されなかった。チャレンジの３日目に、１匹の動物（Ｃ３）は、わずかにぼやけた／乱れた肺テクスチャを有しており、他の２匹の動物（Ｃ１およびＣ２）は、有意な肺陰影を有しており、６日目までに有意な肺陰影は見られなかった（図９ａを参照）。
しかしながら、Ｘ線画像は、チャレンジ後３日目に、予防群中の３匹の動物または治療群中の３匹の動物に関係なく、すべての感染動物において肺陰影を示さず、わずかにぼやけた／乱れた肺テクスチャは観察されたが、明らかな肺陰影は観察されなかった（図９ｂおよび９ｃを参照）。
５）感染動物の病理学的変化
感染後５、６および７日目に、対照群、予防群および治療群の各々中の１匹の動物を解剖のために無作為に選択し、肺、気管、気管支、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、胃腸管、生殖器およびリンパ節などの臓器および組織を採取した。実験要件に従って、各臓器の形状、色および組織病変部位を観察した。
チャレンジ後５日目に、対照群中の動物（Ｃ２）は、肺表面全体の淡オフホワイト色、中等度およびわずかに重度の両側下肺病変、肺葉の縁での肺気腫を有しており、気管および気管支においては明らかな異常を有しなかった。チャレンジ後６日目および７日目に、対照群中の動物（Ｄ６：Ｃ３、Ｄ７：Ｃ１）は、濃赤色の肺表面全体、中等度およびわずかに重度の両側下部肺病変を有しており、肺葉の縁での肺気腫は肺硬化領域と混ざっており、気管および気管支においては明らかな異常はなかった。
チャレンジ後５日目に、予防群中の動物（ＰＡ２）および治療群中の動物（ＡＣ２）は、濃赤色の肺表面全体、中等度およびわずかに重度の両側下肺病変、明らかな肺葉縁肺気腫を有し、気管および気管支においては明らかな異常を有しなかった。チャレンジ後６日目および７日目に、実験動物（予防群：Ｄ６：ＰＡ３、Ｄ７：ＰＡ１、治療群：Ｄ６：ＡＣ３、Ｄ７：ＡＣ１）は、肺表面全体の淡オフホワイト色、中等度を有し、肺、気管および気管支においては明らかな異常を有しなかった。
肺の組織病理学的変化は、感染後５日目に、肺びまん性間質性肺炎、肺胞壁肥厚、線維芽細胞増殖、線維化、ならびに単球およびリンパ球の浸潤の変化が、対照群において観察されたことを示した。いくらかの肺胞浮腫およびフィブリン滲出、透明膜形成および肺出血が観察された。透明血栓が肺毛細管腔の一部において形成され、細気管支の上皮細胞は壊死性であり剥離していた。感染後６日目および７日目に、肺浮腫およびフィブリン滲出が増加し、肺胞マクロファージが増加し、肺胞壁および肺胞線維化および器質化が明らかであった。対照群と比較して、治療群または予防群に関係なく、実験動物は、より少ない、新型コロナウイルスによって引き起こされる肺傷害を有した。感染後５日目に、２匹の動物（ＡＣ２およびＰＡ２）の肺胞構造は基本的にインタクトであり、限局性または斑状の肺線維化が観察され、単核細胞およびリンパ球浸潤が観察されたが、その数は対照群と比較して有意に低下しており、肺胞腔におけるより多くのマクロファージ、より少ない浮腫が存在し、透明膜形成は存在せず、重度の小細気管支および肺毛細血管病変は存在しなかった。感染後６日目および７日目に、動物の肺の病理学的変化は有意に改善され、肺組織の滲出性病変は基本的に消失し、限局性または斑状の組織線維化が見られ得た。
６）様々な臓器組織におけるウイルス量
上気道および肺の様々な組織におけるウイルスの分布をさらに理解するために、対照群および２つの抗体群の動物の気管、気管支および肺の様々な部分の組織を、それぞれチャレンジ後５、６および７日目に採取し、様々な臓器および組織におけるウイルス量を決定した。結果は、チャレンジ後５日目に、４～８×１０５ウイルスコピー／ｇが予防群中の１匹の動物（ＡＣ２）のみの気管および左気管支において検出され、一方、他の組織サンプルにおいてはビロソームは検出されず、ウイルス核酸は、すべての治療群動物サンプルにおいて検出されなかったことを示した（図１０ａを参照）。
図１０ｂに示すように、感染後６日目に、４×１０５～１×１０６ウイルスコピー／ｇが、対照動物（Ｃ３）の気管、左および右気管支、ならびに左肺の上葉において検出され、ビロソームは他の組織サンプルにおいて検出されなかった。同時に、３×１０５ウイルスコピー／ｇがまた、予防群中の１匹の動物（ＡＣ３）の気管組織において検出され、ビロソームは他の組織サンプルにおいて検出されなかった。ウイルス核酸は、治療した動物のサンプルにおいて検出されなかった。
図１０ｃに示すように、感染後７日目に、５×１０４ウイルスコピー／ｇが、対照動物（Ｃ１）の左気管支および左肺の下葉において検出され、ビロソームは他の組織サンプルにおいて検出されなかった。同時に、ビロソームは、予防群および治療群中の動物の組織サンプルにおいて検出されなかった。
７）免疫組織化学的分析
肺組織におけるウイルスの免疫組織化学的分析の結果は、ウイルスタンパク質が、５、６および７日目に対照群からの肺において検出され得たことを示した。しかしながら、ウイルスタンパク質は、様々な時点の抗体治療群および予防群からの肺において検出され得なかった。
上記の具体的な実施形態は、本発明の目的、技術的解決法および利点をさらに例証する。前述の説明は、本発明の具体的な実施形態を例示するのみであり、本発明を限定することを意図していないことを理解されたい。本発明は、すべてのそのような改変および変更を、それが添付の特許請求の範囲またはその等価物の範囲内に入る限り、含むと解釈されることが意図される。

Claims (20)

  1. 重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、２０１９－ｎＣｏＶ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    前記重鎖可変領域が、
    （Ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、あるいは
    （ＩＩ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域が、
    （Ｉ）それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、あるいは
    （ＩＩ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列との１、２もしくは３個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、
    前記重鎖可変領域が、
    （Ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または
    （ＩＩ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変領域が、
    （Ｉ）それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または
    （ＩＩ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （Ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、または
    （ＩＩ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
    （Ｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号７に示されるアミノ酸配列、または配列番号７に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるアミノ酸配列、または配列番号８に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは
    （ＩＩ）前記重鎖可変領域が、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、または配列番号３１に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、または配列番号３２に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. （Ｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
    （ＩＩ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 前記抗体が、重鎖および軽鎖を含み、
    （Ｉ）前記重鎖が、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２２に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列、または配列番号２３に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは
    （ＩＩ）前記重鎖が、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、または配列番号３３に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、または配列番号３４に示される前記アミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 前記抗体が、
    （Ｉ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖、または
    （ＩＩ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項６に記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 配列番号７、８、２２または２３から選択される配列を含む、ポリペプチド。
  10. 配列番号３１、３２、３３または３４から選択される配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、２０１９－ｎＣｏＶ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の一部であり、
    前記ポリペプチドが、配列番号３１を含む場合、前記ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３２に示されるポリペプチドをさらに含み、
    前記ポリペプチドが、配列番号３２を含む場合、前記ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３１に示されるポリペプチドをさらに含み、
    前記ポリペプチドが、配列番号３３を含む場合、前記ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３４に示されるポリペプチドをさらに含み、または
    前記ポリペプチドが、配列番号３４を含む場合、前記ヒトモノクローナル抗体は、配列番号３３に示されるポリペプチドをさらに含む、ポリペプチド。
  11. 請求項１～８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項９もしくは１０に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、真核生物発現ベクターである、発現ベクター。
  13. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、真核細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞である、宿主細胞。
  14. 請求項１～８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項９もしくは１０に記載のポリペプチドを調製するための方法であって、前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは前記ポリペプチドを、請求項１３に記載の宿主細胞において、前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは前記ポリペプチドの発現に適した条件下で発現させ、次いで発現された前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは前記ポリペプチドを前記宿主細胞から回収することを含む、方法。
  15. 請求項１～８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項９もしくは１０に記載のポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載の発現ベクターおよび／または請求項１３に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  16. ２０１９－ｎＣｏＶ感染の治療および／または予防のための医薬を調製するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項９もしくは１０に記載のポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の宿主細胞および／または請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
  17. 請求項１～８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項９もしくは１０に記載のポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の宿主細胞および／または請求項１５に記載の医薬組成物を含む、キット。
  18. ２０１９－ｎＣｏＶ感染の診断のための医薬を調製するための、請求項１７に記載のキットの使用。
  19. サンプルにおける２０１９－ｎＣｏＶの存在を検出するための方法であって、請求項１～８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項９もしくは１０に記載のポリペプチドを使用することを含む、方法。
  20. ２０１９－ｎＣｏＶ感染を治療および／または予防するための方法であって、前記治療および／または予防を必要とする対象に、請求項１～８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項９もしくは１０に記載のポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、および／または請求項１５に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
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