JP2023176102A - 細胞用培地添加剤 - Google Patents

細胞用培地添加剤 Download PDF

Info

Publication number
JP2023176102A
JP2023176102A JP2022088202A JP2022088202A JP2023176102A JP 2023176102 A JP2023176102 A JP 2023176102A JP 2022088202 A JP2022088202 A JP 2022088202A JP 2022088202 A JP2022088202 A JP 2022088202A JP 2023176102 A JP2023176102 A JP 2023176102A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell culture
culture medium
meth
vinyl polymer
carbon atoms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022088202A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2023176102A5 (ja
Inventor
文哉 田尾
Fumiya Tao
勇樹 金井
Yuuki Kanai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Artience Co Ltd
Original Assignee
Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Ink SC Holdings Co Ltd filed Critical Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Priority to JP2022088202A priority Critical patent/JP2023176102A/ja
Publication of JP2023176102A publication Critical patent/JP2023176102A/ja
Publication of JP2023176102A5 publication Critical patent/JP2023176102A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】本発明は、細胞毒性が低く、優れた薬物代謝関連分子の発現及び活性の誘導を示す細胞用添加剤、当該添加剤を含む細胞用培地、及び当該添加剤を使用した細胞培養方法を提供することを課題とする。【解決手段】一般式（１）～（６）で表される構造単位のうち、少なくともいずれか１つの構造単位を有するビニル系重合体（Ｖ）を含み、前記ビニル系重合体（Ｖ）の質量平均分子量が６００以上であり、２０００より小さい、細胞用培地添加剤。前記の細胞用培地添加剤を含む、細胞用培地。ビニル系重合体（Ｖ）の培地中の濃度が１質量％より大きく、４質量％以下である、前記の細胞用培地。【選択図】なし

Description

本発明は、薬物代謝関連分子を誘導可能な細胞用培地添加剤に関するものである。
薬剤スクリーニングにおいて薬物代謝酵素／トランスポーターに由来する薬物相互作用を明らかにすることは非常に重要である。その中でも、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は、ヒトにおいては主に肝臓に存在し物質の解毒と分解に関与する薬物代謝酵素である。特に、ＣＹＰ３Ａは主要な分子種であり、市販医薬品の約５０％の代謝に関与する（非特許文献１）。したがって、医薬品開発において、一定レベルの薬物代謝酵素活性を有する培養肝細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ評価系が求められる。しかし、肝細胞ソースとして理想的なヒト初代肝細胞は、ロットごとに薬物代謝酵素の活性が大きく異なることや、供給量に制限があるために非常に高価なことが課題となっている。
そこで、初代肝細胞に代わる細胞ソースとして株化細胞や、近年ではヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞の利用が進められている。株化細胞は、高い増殖能を有し安定供給が可能であるが、初代肝細胞に比べてＣＹＰを始めとする薬物代謝関連遺伝子の発現が極めて低い。また、ｉＰＳ細胞の肝細胞分化プロトコルは種々報告されており、主要な肝機能を有する肝細胞を得ることに成功しているものの、これらの機能は初代肝細胞と比較すると著しく低く、医薬品開発の観点からは薬物代謝酵素活性を十分確保するための改良が求められる。
上記の問題を解決すべく、培養条件の最適化や培養手法の検討が多く行われてきた。例えば、ＤＭＳＯ処理や、コンフルエント培養によりＣＹＰの遺伝子発現・活性が改善されることが報告されている （非特許文献２、３）。特許文献１では、複数の低分子化合物を組み合わせて、ＣＹＰ３Ａ，ＣＹＰ１Ａを誘導する方法が報告されている。さらに、特許文献２では植物抽出物を培養液中に添加すると、ＣＹＰ３Ａの核内受容体ＰＸＲを賦活化させ、ＣＹＰ活性が向上することが示されている。
しかし、上記方法を用いて活性が増加することが明示されているのはＣＹＰのみであり、その他薬物代謝酵素／トランスポーターについては検証されていない。また、合成高分子による薬物代謝酵素の顕著な活性増加は報告されていない。
そこで、本発明は従来技術よりも、より強力に薬物代謝関連分子の発現及び活性を誘導可能な細胞用培地添加剤を提供する。
特開２０１０－１１１５８７号公報 特開２０１６－６７２１８号公報
Ｌ．Ｃ． Ｗｉｅｎｋｅｒｓ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｓｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．， ４：８２５－８３３， ２００５ Ｓ．Ｃｈｏｉ， ｅｔ ａｌ， Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ， ３９（３）：２０５－２１７， ２００９ Ｌ．Ｓｉｖｅｒｔｓｓｏｎ， ｅｔ ａｌ， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．， ３８：９９５－１００２， ２０１０
本発明は、細胞毒性が低く、優れた薬物代謝関連分子の発現及び活性の誘導を示す細胞用添加剤、当該添加剤を含む細胞用培地、及び当該添加剤を使用した細胞培養方法を提供することを課題とする。
すなわち、本発明は、下記一般式（１）～（６）で表される構造単位のうち、少なくともいずれか１つの構造単位を有し、質量平均分子量が６００以上かつ２０００より小さいビニル系重合体（Ｖ）を含む、細胞用培地添加剤に関する。
一般式（１）
一般式（２）
一般式（３）
一般式（４）
一般式（５）
一般式（６）
（式中、
Ｒ２、Ｒ１６はそれぞれ独立して炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１７、Ｒ１８はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基を表し、
Ｒ５は炭素数１～４のアルキレン基を表し、
Ｘは酸素原子又はＮＨ－を表し、
Ｙは－ＣＯＯ－又はＳＯ３ －を表し、
Ｒ７、Ｒ２０はそれぞれ独立して水素原子又はメチル基を表し、
Ｒ８は炭素数１～６のアルキレン基又は炭素数１～６のヒドロキシアルキレン基を表し、
Ｒ９～Ｒ１３のうち４つは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基、Ｒ９～Ｒ１３のうち１つは、ビニル系重合体の主鎖との結合位置を表し、
Ｒ２１～Ｒ２５のうち４つは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基、Ｒ２１～Ｒ２５のうち１つは、ビニル系重合体の主鎖との結合位置を表し、
Ｒ１４は炭素数１～６のアルキレン基又は炭素数１～６のヒドロキシアルキレン基を表し、
＊はビニル系重合体の主鎖との結合位置を表す。）
また、本発明は、上記の細胞用培地添加剤を含む、細胞用培地に関する。
また、本発明は、ビニル系重合体（Ｖ）の培地中の濃度が１質量％より大きく、４質量％以下である、上記の細胞用培地に関する。
また、本発明は、上記の細胞用培地で細胞を培養することを特徴とする、細胞培養方法に関する。
本発明により、細胞毒性が低く、優れた薬物代謝関連分子の発現及び活性の誘導を示す細胞用添加剤、当該添加剤を含む細胞用培地、及び当該添加剤を使用した細胞培養方法を提供することが可能になった。
本発明の細胞用培地添加剤は、質量平均分子量が６００以上かつ２０００より小さいビニル系重合体（Ｖ）を含むことを特徴とする。
ビニル系重合体（Ｖ）は、上記一般式（１）～（６）で示されるベタイン構造、又は、アミンオキシド構造の少なくともいずれかの構造単位を側鎖に有する。下記一般式（１）～（６）で示されるベタイン構造、又は、アミンオキシド構造の少なくともいずれかの構造単位の含有量は、前記ビニル系重合体（Ｖ）を構成する単量体単位の合計１００質量％に対して、３０～９５質量％であることが好ましく、４０～８０質量％であることがより好ましい。上記の範囲であることで、水中での溶解性が向上する。
以下、ビニル系重合体（Ｖ）のうち、上記一般式（１）～（３）で示されるベタイン構造の少なくともいずれかの構造単位を側鎖に有するビニル系重合体を、ベタイン構造を有するビニル系重合体（Ａ）といい、上記一般式（４）～（６）で示されるアミンオキシド構造の少なくともいずれかの構造単位を側鎖に有するビニル系重合体を、アミンオキシド構造を有するビニル系重合体（Ｂ）という。また、これらのビニル系重合体を、単にビニル系重合体（Ａ）、ビニル系重合体（Ｂ）ということがあるが同義である。
＜ベタイン構造を有するビニル系重合体（Ａ）＞
ベタイン構造を有するビニル系重合体（Ａ）は、以下の方法で得ることが好ましい。
即ち、
（１）下記一般式（７）～（９）で示される単量体（ａ１）～（ａ３）と、必要に応じて他の単量体とを共重合する。得られる共重合体をビニル系重合体（Ａ１）という。
又は、
（２）下記一般式（１０）～（１２）で示される単量体（ａ４）～（ａ６）と、必要に応じて他の単量体とを共重合し、得られた共重合体中の単量体（ａ４）～（ａ６）に由来する部分に後述するベタイン化剤を反応させる。得られる反応生成物は、単量体（ａ１）～（ａ３）を用いた共重合体と同様にベタイン構造を有し、ビニル系重合体（Ａ２）という。
一般式（７）（ａ１）
一般式（８）（ａ２）
一般式（９）（ａ３）
一般式（１０）（ａ４）
一般式（１１）（ａ５）
一般式（１２）（ａ６）
（式中、
Ｒ１は水素原子又はメチル基、
Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、
＊＊はベタイン化剤との反応部位を表す。
その他の記号は、一般式（１）～（３）と同様である。）
＜ビニル系重合体（Ａ１）＞
ビニル系重合体（Ａ１）は、前述の通り、一般式一般式（７）～（９）で示される単量体（ａ１）～（ａ３）を共重合体の構成単位とするものである。単量体（ａ１）～（ａ３）の利用によって、ビニル重合体の側鎖にベタイン構造を導入することができる。
＜単量体（ａ１）＞
単量体（ａ１）は、一般式（７）に示す通り、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と、ベタイン構造とを有する。
このような単量体としては、例えば、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、などのＮ－（メタ）アクリロイルオキシアルキル－Ｎ，Ｎ－ジアルキルアンモニウムアルキル－α－カルボキシベタイン；Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、などのＮ－（メタ）アクリルアミドアルキル－Ｎ，Ｎ－ジアルキルアンモニウムアルキル－α－カルボキシベタイン；Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアンモニウムメチル－α－カルボキシベタイン、などのＮ－（メタ）アクリルアミドアルキル－Ｎ，Ｎ－ジアルキルアンモニウムアルキル－α－カルボキシベタイン；Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、などのＮ－（メタ）アクリロイルオキシアルキル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムアルキル－α－スルホベタイン；Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキプロポキシプロポキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムエチル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン、などのＮ－（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアネルコキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムアルキル－α－スルホベタイン；Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムプロピル－α－スルホベタイン、Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタインなどのＮ－（メタ）アクリルアミドアルキル－Ｎ，Ｎ－ジアルキルアンモニウムアルキル－α－スルホベタインなどが挙げられる。
＜単量体（ａ２）＞
単量体（ａ２）も、一般式（８）に示す通り、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と、ベタイン構造とを有する。
このような単量体としては、例えば、１－ビニル－３－（３－スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩、１－ビニル－３－（３－スルホブチル）イミダゾリウム内部塩、１－ビニル－２－メチル－３－（３－スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩、１－ビニル－２－メチル－３－（４－スルホブチル）イミダゾリウム内部塩などの１－ビニル－２－アルキル－３－（４－スルホアルキル）イミダゾリウム内部塩などが挙げられる。
＜単量体（ａ３）＞
単量体（ａ３）も、一般式（９）に示す通り、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と、ベタイン構造とを有する。
このような単量体としては、例えば、２－ビニル－１－（３－スルホプロピル）ピリジニウム内部塩、２－ビニル－１－（３－スルホブチル）ピリジニウム内部塩、などの２－ビニル－１－（３－スルホアルキル）ピリジニウム内部塩；４－ビニル－１－（３－スルホプロピル）ピリジニウム内部塩、４－ビニル－１－（３－スルホブチル）ピリジニウム内部塩、などの４－ビニル－１－（３－スルホアルキル）ピリジニウム内部塩が挙げられる。
＜ビニル系重合体（Ａ２）＞
本発明におけるビニル系重合体（Ａ）は、前述の通り、単量体（ａ１）～（ａ３）そのものを共重合した共重合体である必要はなく、以下のような段階を経て得ることができる。
即ち、単量体（ａ１）～（ａ３）の前駆体ともいうべき一般式（１０）～（１２）で示される単量体（ａ４）～（ａ６）のうち少なくともいずれかと、必要に応じて他の単量体を共重合し、得られた共重合体中の＊＊で示された窒素の少なくとも一部とベタイン化剤（Ｄ）とを反応させて得ることができる。得られるビニル系重合体（Ａ２）は、ベタイン構造を側鎖に有する。ベタイン化剤（Ｄ）は、単量体（ａ４）～（ａ６）を全てベタイン化するように使用することが好ましい。
このような単量体（ａ４）としては、例えば、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロピル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアミン、
などのＮ－（メタ）アクリロイルオキシアルキル－Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミン；
Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリルアミドプロピル－Ｎ，Ｎ－ジエチルアミン、
などのＮ－（メタ）アクリルアミドアルキル－Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミン；
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
Ｎ－（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン、
などのＮ－（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアネルコキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンなどが挙げられる。
このような単量体（ａ５）としては、例えば、
１－ビニルイミダゾール、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、２－ラウリル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾールが挙げられる。
このような単量体（ａ６）としては、例えば、２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－ラウリル－４－ビニルピリジン、２－ラウリル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジンが挙げられる。
＜ベタイン化剤（Ｄ）＞
ベタイン化剤（Ｄ）は、環状スルホン酸エステル（Ｄ１）、ω‐ハロゲン化アルキルスルホン酸金属塩（Ｄ２）、環状カルボン酸エステル（Ｄ３）及びω‐ハロゲン化アルキルカルボン酸金属塩（Ｄ４）からなる群より選択される。一般式（７）～（９）で示される単量体（ａ４）～（ａ６）の＊＊で示される窒素を重合後に、スルホベタイン化もしくはカルボベタイン化するために用いられる化合物群である。
このような環状スルホン酸エステル（Ｄ１）としては、例えば、１，２－エタンスルトン、１，３－プロパンスルトン、１，４－ブタンスルトンが挙げられる。
このようなω‐ハロゲン化アルキルスルホン酸金属塩（Ｄ２）としては、例えば、２－クロロエタンスルホン酸ナトリウム、２－ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、３－クロロプロパンスルホン酸ナトリウム、３－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム、４－クロロブタンスルホン酸ナトリウム、４－ブロモブタンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
このような環状カルボン酸エステル（Ｄ３）としては、例えば、β－プロピオラクトン、γ－ブチロラクトン、δ－バレロラクトンなどが挙げられる。
このようなω‐ハロゲン化アルキルカルボン酸金属塩（Ｄ４）としては、例えば、２－クロロ酢酸ナトリウム、２－ブロモ酢酸ナトリウム、３－クロロプロピオン酸ナトリウム、３－ブロモプロピオン酸ナトリウム、４－クロロ酪酸ナトリウム、４－ブロモ酪酸ナトリウム、５－クロロペンタン酸ナトリウム、５－ブロモペンタン酸ナトリウムなどが挙げられる。
＜アミンオキシド構造を有するビニル系重合体（Ｂ）＞
アミンオキシド構造を有するビニル系重合体（Ｂ）は、
以下のような２つの方法で得ることが好ましい。
即ち、
（１）アミンオキシド基を有する単量体と、必要に応じて他の単量体とを共重合する。（Ｂ１）
あるいは、
（２）３級アミノ基を有する重合体を得たのち前記３級アミノ基に後述する酸化剤 （以下、オキシド化剤ともいう）（Ｅ）を反応させる。得られる反応生成物は、（Ｂ１）と同様にアミンオキシド構造を有し、ビニル系重合体（Ｂ２）という。
なお、３級アミノ基に酸化剤を反応させアミンオキシド構造を導入することを、「オキシド化」ともいう。
＜３級アミノ基含有単量体（ｂ）＞
オキシド化前の前駆体としての３級アミノ基含有単量体のうち、一般式（４）の構造を形成するためのものとしては、例えば、上記単量体（ａ４）に記載のものが挙げられる。
一般式（５）の構造を形成するためのものとしては、例えば、上記単量体（ａ５）に記載のものが挙げられる。
一般式（６）の構造を形成するためのものとしては、例えば、上記単量体（ａ６）に記載のものが挙げられる。
＜オキシド化＞
３級アミノ基含有単量体、又は、３級アミノ基を有する重合体を含む溶液に、オキシド化剤を加えて２０℃～１００℃の範囲で０．１～１００時間、好ましくは１～５０時間反応させることによって、３級アミノ基をオキシド化することができる。
＜オキシド化剤（Ｅ）＞
オキシド化剤としては、過酸化物又はオゾン等の酸化剤が用いられる。
過酸化物としては、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等が挙げられ、過酸化水素が好ましく、通常は水溶液の形で用いられる。程度の違いはあるが、過酸化物にはラジカル発生剤としての機能もあるので、３級アミノ基含有不飽和単量体を必須の原料とするビニル系重合体の場合には、重合後にオキシド化することが好ましい。
一般的にはオキシド化剤の使用量は、オキシド化可能な官能基、即ち、３級アミノ基に対して、０．２～３倍モル当量の割合で使用し、更に０．５～２倍モル当量使用するのがより好ましい。
＜単量体（ｃ）＞
ビニル系重合体（Ｖ）を得る際に、単量体（ａ１）～（ａ３）、（ｂ）以外のその他の単量体（ｃ）も使用することができる。
単量体（ｃ）としては、例えば、
メチルメタクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｎーブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、へプチル（メタ）アクリレート、２‐エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、イソステアリル（メタ）アクリレート、ベヘニル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート等のアルキルエステル（メタ）アクリレート；
フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族エステル（メタ）アクリレート；
スチレン、α－メチルスチレン、２－メチルスチレン、クロロスチレン、アリルベンゼン、エチニルベンゼン等の芳香族ビニル単量体が挙げられる。
これらは単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせてもよい。
上記単量体（ｃ）として、分配係数ＬｏｇＰが０．８～１０である単量体（ｃ１）を用いることができ、ビニル系重合体（Ｖ）は、分配係数ＬｏｇＰが０．８～１０である単量体（ｃ１）に由来する構造単位を含むことが好ましい。単量体（ｃ１）に由来する構造単位の導入により、極性がより適切に制御され、細胞との疎水性相互作用が制御され、細胞の抗体産生性をはじめとする効果を最大限に発揮することができる。
分配係数ＬｏｇＰは、化学物質の性質を表す数値の１つであり、添加量に依存しない一定の値である。対象とする物質が水と１－オクタノールの混合液において、水相とオクタノール相が接した系中で平衡状態にある場合を対象として、各相の濃度をその常用対数で示したものである。ＬｏｇＰが大きくなると、比較的に疎水性が増大する傾向にあり、ＬｏｇＰが小さくなると、比較的に親水性が増大する傾向にある。
ＬｏｇＰの測定は、一般にＪＩＳ日本工業規格Ｚ７２６０－１０７（２０００）に記載のフラスコ浸とう法により実施することができる。また、ＬｏｇＰは実測に代わって、計算化学的手法、あるいは経験的方法により見積もることも可能である。ＬｏｇＰの計算に用いる方法やソフトウェアについては公知のものを用いることができるが、本発明ではＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ社のシステム：ＣｈｅｍｄｒａｗＰｒｏ１１．０に組み込まれたプログラムを用いて、ＬｏｇＰを求めている。
単量体（ｃ１）に由来する構造単位の含有量は、ビニル系重合体（Ｖ）を構成する単量体単位の合計１００質量％中、５～７０質量％であることが好ましく、１０～６５質量％であることがより好ましく、２０～６０質量％であることが更に好ましい。５質量％以上であることにより、単量体（ａ１）～（ａ３）、（ｂ）の量が相対的に少なくなり、ビニル重合体（Ｖ）の水溶性を適切な範囲とすることができる。７０質量％以下とすることにより、細胞との疎水的相互作用を適度に抑制できる。
上記単量体（ｃ）として、分配係数ＬｏｇＰが０．８～１０の範囲外の単量体（ｃ２）も使用することができる。 分配係数ＬｏｇＰが０．８～１０の範囲外の単量体（ｃ２）を用いる場合、その含有量は、ビニル系重合体（Ｖ）を構成する単量体単位の合計１００質量％中、０～６５質量％であることが好ましく、０～４０質量％であることがより好ましく、０～２０質量％であることがさらに好ましい。ベタイン構造及び／又はアミンオキシド構造の機能を、より発現しやすいためである。
本発明では、ビニル系重合体の分子量・分子量分布を制御するため、連鎖移動剤を用いてもよい。連鎖移動剤としては、特に限定されず、例えば、チオール基や水酸基を有する化合物が一般に知られている。チオール基を有する化合物としては、例えばラウリルメルカプタン、２－メルカプトエチルアルコール、ドデシルメルカプタン、及びメルカプトコハク酸等のメルカプタン；メルカプトプロピオン酸ｎ－ブチル、及びメルカプトプロピオン酸オクチル等のメルカプトプロピオン酸アルキル；、メルカプトプロピオン酸メトキシブチル等のメルカプトプロピオン酸アルコキシアルキル等が挙げられる。また、メチルアルコール、ｎ－プロピルアルコール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、ｔ－ブチルアルコール、及びベンジルアルコール等のアルコールも挙げられる。連鎖移動剤は、単独又は２種類以上併用できる。
＜質量平均分子量（Ｍｗ）＞
ビニル系重合体（Ｖ）の質量平均分子量は、６００以上であり、２０００より小さい。前記質量平均分子量は、７００～１９５０であることが好ましく、８００～１９００であることがさらに好ましい。
ビニル系重合体（Ｖ）の質量平均分子量が上記範囲であることにより、細胞との相互作用がより昂進し、薬物代謝関連分子に対する誘導能を向上させることができる。
ビニル系重合体（Ｖ）の質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準プルラン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては下記条件１を用いた。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照した。また、条件１での分子量測定が困難な場合は、下記条件２によることを基本とし、ビニル系重合体の分子量測定が困難な場合は、ベタイン又はアミンオキシド前駆体重合体の質量平均分子量を重合体の質量平均分子量とした。前駆体重合体の質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用した。
（条件１）
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ－Ｇ、
ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０６Ｍ ＨＱを３本及び、
ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０２．５ ＨＱを連結したもの。
キャリア：１／１５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０ リン酸緩衝液
（りん酸緩衝剤粉末１／１５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０（富士フイルム和光純薬（株）製）をイオン交換水１Ｌに溶解させたもの）
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．５質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
得られた重合体溶液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて精製することができる。精製方法としては、特に限定するものではないが、たとえば、再沈殿、限外ろ過、透析、イオン交換樹脂処理等が挙げられる。それぞれ単独で行っても又は組み合わせても良い。
＜細胞用培地＞
本発明の細胞用添加剤を添加する細胞用培地としては、従来公知の細胞用培地を使用することができる、例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）や、これらの組み合わせが挙げられる。
上記細胞用培地において、ビニル系重合体（Ｖ）の培地総質量中の濃度は１質量％より大きく、４質量％以下であることが好ましく、３．５質量％以下であることがより好ましく、３質量％以下であることが更に好ましく、２．５質量％以下であることが特に好ましい。細胞用培地におけるビニル系重合体（Ｖ）の濃度が上記範囲であることにより、細胞毒性を低くし、かつ優れた薬物代謝関連分子の活性増強効果を発揮する。
細胞用培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２－メルカプトエタノールなど）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清など）、血清代替物等を添加するのが好ましい。
＜細胞＞
本発明の細胞用培地添加剤を用いて培養される細胞としては、薬物代謝酵素誘導が生じる生体内の組織中の細胞が挙げられ、由来する組織としては肝臓、小腸等が挙げられる。前記細胞は、薬物代謝酵素誘導を試験することを目的とする生物であることが望ましく、例えば、ヒト、マウスなどの哺乳動物が挙げられる。本発明の細胞用培地添加剤を用いて培養することのできる、薬物代謝酵素を産生可能な細胞として例えば、動物組織から採取された初代肝細胞/腸細胞、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞から分化誘導させた肝細胞/腸細胞が挙げられる。肝がん由来の細胞株として、ＨｅｐＧ２細胞やＨｕＨ－７細胞、ＨＬＥ細胞、ＨＬＦ細胞、及びＨｅｐａＲＧ細胞等が挙げられる。また、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ－２、ＨＴ－２９、ＳＷ １１１６、Ｔ８４、ＩＥＣ－１８、及びＩＥＣ－６細胞が挙げられる。
本発明の細胞用培地添加剤を用いて培養を行う際は、通常の培養に用いられている容器又は装置を使用することができる。例えば、マルチウェルプレート、シャーレ、培養フラスコ、スピナーフラスコ、ジャーファーメンター、ファーメンター、ローラーボトル、ホローファイバー、マイクロキャリアーが挙げられる。
本発明の細胞用培地添加剤を用いて培養を行う際の培養条件は、通常の動物細胞の培養条件でよく、例えば、５体積％ＣＯ２雰囲気下で、温度３７℃である条件とすることができる。
発明の細胞用培地添加剤を用いて培養を行う際、培養液から細胞を採取するには、浮遊細胞の場合は、例えば、培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集めることができる。接着細胞の場合は、例えば０．２５％トリプシン－０．０２％ＥＤＴＡ液を添加して細胞を浮遊させた後、遠心分離やろ過により集めることができる。
＜薬物代謝酵素＞
産生される薬物代謝酵素は特に限定されず、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、エポキシドヒドラーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、γ －グルタミルトランスペプチダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、ＣＹＰが挙げられる。
＜薬物代謝関連分子の機能評価＞
薬剤代謝関連分子の発現量又は活性測定は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。例えば、ＣＹＰの発現量の測定は、定量的ＰＣＲ法、ウエスタンブロット法、フローサイトメータ法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法など、周知の技術を用いて実施することができる。ＣＹＰ酵素活性は、培養肝細胞にＣＹＰの基質を添加し、当該基質がＣＹＰによって変換される量（ＣＹＰ酵素活性）を測定することによって評価することができ、その場合、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定することができる。また、ＣＹＰ酵素活性の相対比（ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅ）を評価する場合、市販されているＣＹＰ酵素活性の測定に利用可能なキットを用いても実施可能であり、例えば、ＣＹＰ３Ａ４であれば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＰ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡなどを利用することができる。測定するＣＹＰの種類によって、公知の方法やキットを使用すればよい。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の権利範囲を何ら制限するものではない。尚、実施例及び比較例における「部」及び「％」は「質量部」及び「質量％」を表し、ｍｏｌとは物質量を表し、ｍｏｌ％は全単量体中の物質量の割合を表す。
＜ベタインモノマーの合成＞
ビニル系重合体の合成に用いたＮ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタインは、特許５６９０６４５号を参考に合成した。同様に、Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボベタインは特許３８７８３１５を、１－ビニル－３－（３－スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩と２－ビニル－１－（３－スルホプロピル）ピリジニウム内部塩は特許３５８４９９８を参考に合成した。
＜ベタイン構造を有するビニル系重合体の合成＞
［製造例１］
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、イソプロパノール１５０部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、２，２’－アゾジイソブチロニトリル１０部、単量体（ａ１）としてＮ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン１００部を内温７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに２時間撹拌を続けた。固形分測定によって転化率が９８％を超えたことを確認後、冷却して取出した。その後、オーブンでイソプロパノールを完全に揮発させ、ビニル系重合体（Ａ１）を得た。
［製造例２～１１、比較製造例１］
表１に示す配合組成で、製造例１と同様の方法でビニル系重合体を合成した。
Figure 2023176102000013
表１中の略称は以下の通りである。
ＤＭＢＳ：Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン
ＤＭＭＣ：Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムメチル－α－カルボベタイン
ＶＳＰＩ：１－ビニル－３－（３－スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩
ＶＳＰＰ：２－ビニル－１－（３－スルホプロピル）ピリジニウム内部塩
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
ＬＭＡ：メタクリル酸ラウリル
Ｓｔ：スチレン
ＨＥＡ：２－ヒドロキシエチルアクリレート
ＡＡ：アクリル酸
表１に記載した単量体（ｃ）の分配係数ＬｏｇＰを下記に記す。ＬｏｇＰは、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ社のシステム：ＣｈｅｍｄｒａｗＰｒｏ１１．０に組み込まれたプログラムにより求めた。
ＢＭＡ：ＬｏｇＰ＝２．２３
ＬＭＡ：ＬｏｇＰ＝５．５７
Ｓｔ：ＬｏｇＰ＝２．６７
ＨＥＡ：ＬｏｇＰ＝０．４８
ＡＡ：ＬｏｇＰ＝０．３８
＜ベタイン構造を有するビニル系重合体（Ａ２）の合成＞
［製造例１２］
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、イソプロパノール１５０部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、２，２’－アゾジイソブチロニトリル１０部、単量体（ａ４）としてＮ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン６０部、単量体（ｃ）としてブチルメタクリレート３０部、２－ヒドロキシエチルアクリレート１０部を混合したものを、内温を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに２時間撹拌を継続し、ビニル共重合体を得た。
固形分測定にて転化率が９８％を超えたことを確認後、ベタイン化剤（Ｄ）として１，４－ブタンスルトンを４７部、イオン交換水２００部を加え、イソプロパノールを留去しながら更に２０時間撹拌を続けた。次いで、反応物を冷却して取出し、オーブンで溶媒を完全に揮発させ、製造例１２のビニル系重合体（Ａ２）を得た。
なお、以下の反応式に示すように、１，４－ブタンスルトンの開環反応により、単量体（ａ１）の一種であるＮ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブチル－α－スルホベタイン由来の構造をビニル系重合体の側鎖に導入することができる。
［製造例１３～１６］
表２に示す組成にて、製造例１２と同様に合成を行い、製造例１３～１６のビニル系重合体（Ａ２）を得た。
表２中の略称は以下の通りである。
ＤＭ：Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン
ＶＩ：１－ビニルイミダゾール
ＶＰ：２－ビニルピリジン
ＤＥＡＡ：ジエチルアクリルアミド
ＢＳ：１，４－ブタンスルトン
ＰＳ：１，３－プロパンスルトン
ＳＢＳ：４-ブロモブタンスルホン酸ナトリウム
ＰＬ：β－プロピオラクトン
ＳＣ：クロロ酢酸ナトリウム
表２に記載した単量体（ｃ）の分配係数ＬｏｇＰを下記に記す。
ＤＥＡＡ：ＬｏｇＰ＝０．２
［製造例１７］
＜アミンオキシド構造を有するビニル系重合体（Ｂ）の合成＞
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒としてイソプロパノール１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを８０部、ブチルメタクリレートを２０部、重合開始剤として２，２’－アゾジイソブチロニトリルを１０部、溶媒としてイソプロパノールを１０部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後６時間熟成した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、イソプロパノール１５０部とオキシド化剤として３５％過酸化水素水を５０部（用いたＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルメタクリレートと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることでアミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、ビニル系重合体（Ｂ）を得た。
［製造例１８～２５］
表３に示す配合組成で、製造例１７と同様の方法でビニル系重合体（Ｂ）を合成した。
表３中の略称は以下の通りである。
ＤＭＡＰＡＡ： Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＤＥＡＥＭＡ： Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
２ＥＨＡ： ２－エチルヘキシルアクリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＡＡ：アクリル酸
表２に記載した単量体（ｃ）の分配係数ＬｏｇＰを下記に記す。
２ＥＨＡ：ＬｏｇＰ＝３．５２
なお、２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に、製造例１～２５、比較製造例１で得られたビニル系重合体を１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。
＜細胞用培地添加剤の調製＞
［実施例１～２５、比較例１］
上記製造例１～２５、比較製造例１で得られた、溶媒揮発後のビニル系重合体を、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ溶液）に溶かし、濃度１０質量％の細胞用培地添加剤をそれぞれ得た。
［比較例２、３］
ポリビニルアルコール （ＰＶＡ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、ＰＢＳ溶液に溶解し、濃度１０質量％の細胞用培地添加剤をそれぞれ得た。
［比較例４］
リファンピシンを、２０ｍＭになるようジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、細胞用培地添加剤を得た。
得られた細胞用培地添加剤について、以下の評価を実施した。結果を表５に示す。
以下に述べる評価は、それぞれの基礎培地に細胞用培地添加剤を所定量添加し、細胞用培地組成物（以下、培地組成物という）を調製し、最終濃度１．５質量％、及び３質量％でそれぞれ評価した。
＜細胞毒性評価＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に得られた細胞用培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｕＨ－７細胞を１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、ポリマーを含む細胞用培地添加剤を添加した培地組成物を播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり１００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後の肝細胞を含む培養液にＷＳＴ－８試薬（株式会社同人社研究所社製）を１０μＬ添加した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内に２時間静置した。２時間後、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定し、ＷＳＴ－８試薬を添加していない培養液の吸光度を差し引くことで細胞毒性を評価した。ポリマーを含む細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
（評価基準）
◎：１．０以上（非常に良好）
○：０．９０以上～１．０未満（良好）
×：０．９０未満（不良）
＜ｑＲＴ－ＰＣＲ法による薬剤代謝関連分子の遺伝子発現解析＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に得られた細胞用培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。各種培地で３日間培養したＨｕＨ－７細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出した各全ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと目的遺伝子のＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ及びＴａｑｍａｎ ｆａｓｔ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。発現解析に使用したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを下記表４に示した。リファレンス遺伝子にはＧＡＰＤＨを用いて、各遺伝子の相対発現量はＧＡＰＤＨを基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
（評価基準）
◎：５以上（非常に良好）
○：１．５以上５未満（良好）
△：１以上１．５未満（変化なし）
×：１未満（不良）
＜薬物代謝酵素活性：ＣＹＰ３Ａ４活性の評価＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に得られた細胞用培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｕＨ－７細胞を上記の細胞用培地添加剤を添加した培地組成物で３日間、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて培養した。３日間培養後、細胞をＰＢＳにて洗浄し、ＤＭＥＭ培地を入れ替えた。ＣＹＰ３Ａ４活性はＰ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用い、ＣＹＰ３Ａ４の基質としてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを用いた。ＣＹＰ３Ａ４活性値はプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）を用いて測定した。また、細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりのＣＹＰ活性値として算出した。樹脂微粒子を含む細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
（評価基準）
◎：５以上（非常に良好）
○：１．５以上５未満（良好）
△：１以上１．５未満（変化なし）
×：１未満（不良）
＜排泄活性：モデル薬物の代謝物の毛細胆管構造への排泄＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に得られた細胞用培地添加剤を表５に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｕＨ－７細胞を上記の細胞用培地添加剤を添加した培地組成物で３日間、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて培養した。３日間培養後、細胞をＰＢＳにて洗浄・除去した後、モデル薬物としてＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（以下、ＦＤとする）を含む培養液を添加し、ＣＯ２インキュベーター内にて６０分間培養した。ＦＤは、そのままでは蛍光を発しないが、肝細胞内のエステラーゼ活性によりエステル結合が切れることで、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１４ｎｍ）が観察される。ＦＤを含む培養液を除去後、ＰＢＳにて洗浄し、次いで、蛍光顕微鏡で観察した。
（評価基準）
◎：明確な排泄あり
○：排泄あり
×：排泄なし
＜結果＞
表５の結果から、実施例１～２５の細胞培養用培地添加剤は、細胞毒性が低く、優れた薬物代謝関連分子の発現及び活性の誘導を示すことが分かった。一方で、比較例１～４の添加剤は、細胞毒性、並びに、薬物代謝関連遺伝子の発現及び活性の誘導能いずれにおいても実施例１～２５の細胞培養用添加剤に劣る結果となった。
以上より、本発明の細胞用培地添加剤は、細胞用培地に添加し得られた培地を用いて、薬物代謝関連分子の発現を有する細胞を培養した際に、それらの活性を増強させることが可能である。また、本発明の細胞用培地添加剤により、薬物代謝関連分子の活性を高めることができるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで医薬品候補化合物の生体内での薬効、副作用発現を精度よく予測することが可能になる。また、本発明の細胞用培地添加剤を株化細胞やｉＰＳ細胞由来肝細胞に添加することで、医薬品開発に関してロット差が小さく安定的に供給可能な細胞ソースの創出につながることも期待される。以上のことから、本発明は、医薬品開発における薬剤スクリーニングに大きく貢献することができる。

Claims (4)

  1. 下記一般式（１）～（６）で表される構造単位のうち、少なくともいずれか１つの構造単位を有し、質量平均分子量が６００以上かつ２０００より小さいビニル系重合体（Ｖ）を含む、細胞用培地添加剤。
    一般式（１）
    一般式（２）
    一般式（３）
    一般式（４）
    一般式（５）
    一般式（６）
    （式中、
    Ｒ２、Ｒ１６はそれぞれ独立して炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１７、Ｒ１８はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基を表し、
    Ｒ５は炭素数１～４のアルキレン基を表し、
    Ｘは酸素原子又はＮＨ－を表し、
    Ｙは－ＣＯＯ－又はＳＯ３ －を表し、
    Ｒ７、Ｒ２０はそれぞれ独立して水素原子又はメチル基を表し、
    Ｒ８は炭素数１～６のアルキレン基又は炭素数１～６のヒドロキシアルキレン基を表し、
    Ｒ９～Ｒ１３のうち４つは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基、Ｒ９～Ｒ１３のうち１つは、ビニル系重合体の主鎖との結合位置を表し、
    Ｒ２１～Ｒ２５のうち４つは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基、Ｒ２１～Ｒ２５のうち１つは、ビニル系重合体の主鎖との結合位置を表し、
    Ｒ１４は炭素数１～６のアルキレン基又は炭素数１～６のヒドロキシアルキレン基を表し、
    ＊はビニル系重合体の主鎖との結合位置を表す。）
  2. 請求項１に記載の細胞用培地添加剤を含む、細胞用培地。
  3. ビニル系重合体（Ｖ）の培地中の濃度が１質量％より大きく、４質量％以下である、請求項２に記載の細胞用培地。
  4. 請求項２又は３記載の細胞用培地で細胞を培養することを特徴とする、細胞培養方法。
JP2022088202A 2022-05-31 2022-05-31 細胞用培地添加剤 Pending JP2023176102A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022088202A JP2023176102A (ja) 2022-05-31 2022-05-31 細胞用培地添加剤

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022088202A JP2023176102A (ja) 2022-05-31 2022-05-31 細胞用培地添加剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023176102A true JP2023176102A (ja) 2023-12-13
JP2023176102A5 JP2023176102A5 (ja) 2024-03-28

Family

ID=89122643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022088202A Pending JP2023176102A (ja) 2022-05-31 2022-05-31 細胞用培地添加剤

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2023176102A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11046803B2 (en) Block copolymer and surface treatment agent using same
US11441120B2 (en) Cell culture substrate
JP2016192957A (ja) 細胞培養基材、その製造方法、およびそれを用いた細胞培養方法
JP6497677B2 (ja) ブロック共重合体、表面処理剤、その膜、およびそれを被覆した細胞培養基材
JP2016194054A (ja) ブロック共重合体
JP7127330B2 (ja) ブロック共重合体およびそれを用いた表面処理剤
Jeon et al. Dual-crosslinked hydrogel microwell system for formation and culture of multicellular human adipose tissue-derived stem cell spheroids
JP7425946B2 (ja) 蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤、並びにその用途
JP2023176102A (ja) 細胞用培地添加剤
JP2022008203A (ja) 細胞用培地添加剤およびその利用
JP2020110140A (ja) 細胞培養方法
JP5044777B2 (ja) 細胞固定化基材被覆膜用材料
JP2018012811A (ja) ブロック共重合体
WO2019035436A1 (ja) 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法
KR20170082510A (ko) 배양체 형성용 용기의 제조 방법
JP7250248B2 (ja) ブロック共重合体、それを含む表面処理剤及び膜、並びに、それを用いた細胞培養用器材及び細胞培養方法
JP7226634B1 (ja) 生体適合性ポリマー組成物及びその用途
JP6286947B2 (ja) 細胞凝集塊の製造方法、及び薬剤のスクリーニング方法
JP7293683B2 (ja) ブロック共重合体及び培養基材、幹細胞の製造方法
JP7271870B2 (ja) 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法
JP2017186291A (ja) Ｎ−フェニルマレイミド誘導体およびその製造方法、ｎ−フェニルマレイミド誘導体の前駆体、重合体、タンパク質付着防止剤、ならびに医療用デバイス
JP2019085520A (ja) ブロック共重合体、細胞培養基材及び細胞培養方法
JP6286948B2 (ja) 細胞凝集塊の製造方法、及び薬剤のスクリーニング方法
JP7018175B2 (ja) 共重合体、基材用表面処理剤および細胞培養基材
JP7151203B2 (ja) 細胞培養培地添加剤、細胞培養培地及び細胞凝集塊の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240319

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240319

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20240319