JP2023117243A

JP2023117243A - Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤、腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤、腸内タウリン分泌促進剤、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物、腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物及び腸内タウリン分泌促進用経口組成物

Info

Publication number: JP2023117243A
Application number: JP2022019852A
Authority: JP
Inventors: 徳興侯; Norioki Ko; 珂雨陳; Keyu Chen; こず枝坂尾; Kozue SAKAO; 靖仲宗根; Yasushi Nakasone
Original assignee: KENKO KAZOKU KK; Kagoshima University NUC
Current assignee: KENKO KAZOKU KK; Kagoshima University NUC
Priority date: 2022-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2023-08-23

Abstract

【課題】ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効に利用することができるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤、腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤、腸内タウリン分泌促進剤、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物、腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物及び腸内タウリン分泌促進用経口組成物を提供する。【解決手段】Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。【選択図】図９

Description

本発明は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤、腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤、腸内タウリン分泌促進剤、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物、腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物及び腸内タウリン分泌促進用経口組成物に関する。

ニンニク（Ａｌｌｉｕｍｓａｔｉｖｕｍ）は健康食材として古くから知られている。加工過程でニンニクが粉砕又は切断されることで、ニンニクの機能成分である有機硫黄化合物は、ニンニクの細胞中から放出される分解酵素アリイナーゼの作用によって構造が異なる様々な揮発性物質に変化する。例えば、有機硫黄化合物のひとつであるアリイン（Ｓ－アリル－Ｌ－システインスルフォオキシド）は、アリイナーゼの作用でアリシン（アリル－２－プロペンチオスルフィネート）に変化する。アリシンは不安定で反応性の高い分子であり、硫化ジアリル（ＤＡＳ）、二硫化ジアリル（ＤＡＤＳ）、三硫化ジアリル（ＤＡＴＳ）及びアホエン等に変換される。このため、ニンニク由来の安定な有機硫黄化合物が得られない。

ニンニク由来の安定な有機硫黄化合物を得るために、アリイナーゼを失活させたニンニクの加工が行われる。例えば、特許文献１では、加熱によって、アリイナーゼを失活させている。熱処理の他、特許文献２には、マイクロ波、高圧、酵素、酸又はアルコールでニンニクを処理することで酵素を失活させることが記載されている。

ニンニクに含まれる有機硫黄化合物、特にアリインには、肝障害抑制作用、血中脂質上昇抑制作用、血小板凝集抑制作用等の様々な生理活性が報告されている。さらに、非特許文献１には、アリイナーゼを失活させたニンニク抽出物が高脂肪食によって誘導された脂質異常症及び腸内細菌叢の乱れを改善することが示されている。

特開２０１９－１８０３３８号公報特開２００５－８９４１９号公報

ＫｅｙｕＣｈｅｎ，外４名，"ＭｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＡｌｌｉｃｉｎ－ＦｒｅｅＧａｒｌｉｃｏｎＧｕｔＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ"，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０２０，２５，６８２

ニンニクに含まれる有機硫黄化合物の腸内での作用、特に腸内細菌叢に対する作用機序は明らかになっていない。有機硫黄化合物の腸内での機能を明らかにできれば、新たな機能性素材としてニンニクを利用することができる。

本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効に利用することができるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤、腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤、腸内タウリン分泌促進剤、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物、腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物及び腸内タウリン分泌促進用経口組成物を提供することを目的とする。

本発明者は、ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を安定的に制御したニンニク加工物を用いて、ニンニクの脂質代謝経路、糖質代謝経路及び腸内細菌叢へのニンニクの作用について鋭意研究し、有機硫黄化合物が腸内のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの増殖を促進させ、腸内でのＤＰＰ－４の発現を抑制し、タウリンの分泌を促進することを見いだし、本発明を完成させた。

本発明の第１の観点に係るＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。

本発明の第２の観点に係る腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤は、
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。

本発明の第３の観点に係る腸内タウリン分泌促進剤は、
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。

本発明の第４の観点に係るＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物は、
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。

本発明の第５の観点に係る腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物は、
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。

本発明の第６の観点に係る腸内タウリン分泌促進用経口組成物は、
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。

前記有機硫黄化合物は、
Ｓ－アリル－Ｌ－システインスルフォオキシド、γ－グルタミル－Ｓ－アリルシステイン及びＳ－アリルシステインからなる群から選択される少なくとも１種を含む、
こととしてもよい。

本発明によれば、ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効に利用することができる。

Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ試験例１におけるマウスの最終体重、精巣上体脂肪重量、血清中のトリグリセリドの濃度及び血清中の総コレステロールの濃度を示す図である。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ試験例１におけるマウスの肝臓組織の切片像、肝臓重量及び肝臓脂肪率を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ試験例１におけるマウスの血清中のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）／グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）の比及び肝臓中のＭＣＰ－１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ－１）の濃度を示す図である。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ試験例１におけるマウスの空腹時血清グルコース（Ｇｌｕ）濃度、空腹時血清インスリン濃度及びインスリン抵抗性の指標ＨＯＭＡ－ＩＲ（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃｍｏｄｅｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ－ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ試験例１における実験終了時のマウスの糞便中の細菌の門レベルでの相対的存在量及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの相対的存在量を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ試験例１におけるマウスの腸内細菌叢のβ多様性を評価した結果及びバクテロイデス門に対するフィルミクテス門の比率を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ実施例１におけるマウスの糞便中のタウリンの濃度、肝臓でのＰＰＡＲα、ＣＰＴ１Ａ及びＣＹＰ４Ａ１のタンパク質発現量を示す図である。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ実施例１におけるマウスの血清中のＤＰＰ－４濃度、肝臓におけるグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）及びＰＥＰＣＫのタンパク質発現量を示す図である。Ａは試験例２における３０時間の培養での異なる濃度のニンニク有機硫黄化合物存在下でのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの増殖を示す図である。Ｂは試験例２における５ｍｇ／ｍＬのニンニク有機硫黄化合物存在下でのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの増殖の経時変化を示す図である。

以下、本発明に係る実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。

本実施の形態に係るＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。ニンニクはヒガンバナ科ネギ属に属する植物で、寒地型でも暖地型でもよい。より詳細には、有機硫黄化合物は、ニンニクの細胞中に含まれるアリイナーゼ等の酵素によって変化していない天然のニンニク（生ニンニク）の鱗茎に含まれる有機硫黄化合物である。有機硫黄化合物は、例えば、アリイン、Ｓ－アリルシステイン（ＳＡＣ）及びγ－グルタミル－Ｓ－アリルシステイン（Ｇ－ＳＡＣ）等である。好ましくは、有機硫黄化合物は、少なくともアリイン、ＳＡＣ及びＧ－ＳＡＣを含む。有機硫黄化合物がアリイン、ＳＡＣ及びＧ－ＳＡＣを含む場合のアリイン、ＳＡＣ及びＧ－ＳＡＣの質量比（アリイン：ＳＡＣ：Ｇ－ＳＡＣ）は、特に限定されず任意であるが、例えば２０～５：３～１：２～２５である。好ましくは、アリイン、ＳＡＣ及びＧ－ＳＡＣの質量比は、５：３：２又は２２：１：２０である。

好適には、有機硫黄化合物は、ニンニク加工物又は抽出物としてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤に含まれる。ニンニク加工物又は抽出物は、公知の方法でニンニクから取得できる。例えば、ニンニク加工物は、アリイナーゼを失活させた生ニンニクの鱗茎を乾燥させ、粉砕して得られる粉末でもよい。また、ニンニク抽出物は、アリイナーゼを失活させた生ニンニクの鱗茎を均質化（ホモジナイズ）し、分離した上清を凍結乾燥することで得られる粉末でもよい。このようにして得られた粉末をエタノール等で洗浄し、再度凍結乾燥した粉末をニンニク加工物及びニンニク抽出物としてもよい。

アリイナーゼの失活には、公知の方法を採用すればよい。アリイナーゼを失活させる方法としては、例えば、加熱、マイクロ波照射、高圧処理、酵素処理、酸処理又はアルコール処理が挙げられる。

本実施の形態に係るＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０００１～９９．９質量％、０．０００１～９９．８質量％、０．０００１～９９．７質量％、０．００１～９９．６質量％、０．０１～９９．５質量％、０．１～９９質量％、０．５～６０質量％、１～５０質量％又は１～２０質量％の上記有機硫黄化合物を含む。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、固形製剤であっても、液状製剤であってもよい。

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は上記有機硫黄化合物に加え、薬理学上許容される任意の成分を含んでもよい。任意の成分は、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等である。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤に配合されてもよい。

賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軟質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、キシリトール、ソルビトール及びエリスリトール等が挙げられる。

滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ及びポリエチレングリコール等である。

結合剤としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン等が例示される。

崩壊剤は、例えば、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、軟質無水ケイ酸及び炭酸カルシウム等である。

溶剤としては、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油及び綿実油等が挙げられる。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム及び酢酸ナトリウム等である。

懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム及びモノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子；ポリソルベート類、並びにポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が挙げられる。

等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、ブドウ糖、キシリトール及び果糖等が挙げられる。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びクエン酸塩等の緩衝液等である。無痛化剤は、例えば、プロピレングリコール、塩酸リドカイン及びベンジルアルコール等である。

防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸及びソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、亜硫酸塩及びアスコルビン酸塩等が例示される。着色剤としては、水溶性着色タール色素、レーキ色素及び天然色素等が挙げられる。甘味剤は、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム及びステビア等である。

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤の投与量は、投与対象の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、有機硫黄化合物が有効量となるように投与される。有効量とは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの増殖を促進させるために必要な有機硫黄化合物の量である。

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤の投与量は、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤を分割して投与する場合、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、１日に１回又は複数回投与される。また、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週及び１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤の投与経路は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、非経口又は経口で投与される。非経口投与の場合、経腸投与が好ましい。

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、任意の形態の製剤とすることができる。経口投与の場合、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、糖衣錠、バッカル錠、コーティング錠及びチュアブル錠等の錠剤、トローチ剤、丸剤、散剤及びソフトカプセル等のカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤及びドライシロップ等のシロップ剤、並びにエリキシル剤等の液剤であってもよい。

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤の投与対象は、脊椎動物が好ましく、哺乳類動物がより好ましい。哺乳類動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット、マウス及びモルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられる。好ましくは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤の投与対象はヒトである。

本実施の形態に係るＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、下記実施例において、腸内のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの増殖を促進させることが示されたニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する。このため、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、投与対象の腸内のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓを増加させるのに有効である。

別の実施の形態では、上記有機硫黄化合物を有効成分として含む、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物が提供される。経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。

サプリメントの形態は、特に制限されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣錠、フイルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液、懸濁液等の任意の形態でよい。サプリメントは、オオムギ抽出物又はホルデニン以外に、サプリメントとして通常使用される任意の成分を含んでもよい。当該成分としては、例えば、アミノ酸、ペプチド；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＢ及び葉酸等のビタミン類；ミネラル類；糖類；無機塩類；クエン酸又はその塩；茶エキス；油脂；プロポリス、ローヤルゼリー及びタウリン等の滋養強壮成分；ショウガエキス及び高麗人参エキス等の生薬エキス；ハーブ類；並びにコラーゲン等が挙げられる。

上記有機硫黄化合物を日常的に経口摂取しやすいように各種の食品又は飲料に上記有機硫黄化合物を混合して機能性食品とすることで、上記有機硫黄化合物を長期的に摂取することができる。“機能性食品”とは、健康の維持の目的で摂取する食品又は飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、健康食品及び栄養補助食品等を含む。機能性食品としては、保健機能食品である特定保健用食品又は栄養機能食品が好ましい。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、甘味料、調味料、乳化剤、強化剤及び香料等をＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物に添加してもよい。

機能性食品の対象となる、食品及び飲料は特に限定されるものではない。機能性食品の形態は、例えば、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶及び緑茶等の飲料；キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム及びゼリー等の菓子；麺、パン、米飯及びビスケット等の穀類加工品；ソーセージ、ハム及びかまぼこ等の練り製品；バター及びヨーグルト等の乳製品；ふりかけ；並びに調味料等である。なお、機能性食品には、甘味料、香料及び着色料等の添加物が含まれてもよい。

上記有機硫黄化合物を機能性食品に配合する割合は任意であるが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの増殖促進に寄与する範囲で割合が選択される。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの増殖促進作用を食品に付与するために、上記有機硫黄化合物を、食品添加剤として使用してもよい。

なお、他の実施の形態では、上記有機硫黄化合物を対象に投与することにより腸内のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓを増加させる方法が提供される。また、別の実施の形態は、腸内のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓを増加させるための上記有機硫黄化合物の使用である。他の実施の形態では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤としての使用のための上記有機硫黄化合物が提供される。また、別の実施の形態は、腸内のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓを増加させるための医薬の製造のための上記有機硫黄化合物の使用である。

上記有機硫黄化合物は、下記実施例に示すように、腸内のＤＰＰ－４の発現を抑制し、
タウリンの分泌を促進する。このため、上述のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤は、腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤又は腸内タウリン分泌促進剤としても使用できる。また、上述のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物は、腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物又は腸内タウリン分泌促進用経口組成物としても使用できる。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１
（ニンニク粉末の調製）
ニンニクのアリイナーゼを失活させ、アリイン、ＳＡＣ及びＧ－ＳＡＣ等の有機硫黄化合物を含有するニンニク粉末を調整した。まず、９５℃に加熱した食塩水（塩分濃度３～１２％）１００ｍｌにニンニク鱗茎３０ｇを入れて１５分間加熱し、アリイナーゼを失活させた。次いで、鱗茎をスライスして温風乾燥機で乾燥させた（６０℃、２４時間）。鱗茎をミキサーで粉砕し、目開き３５５μｍのふるいに通した粉末をニンニク粉末とした。

（有機硫黄化合物の定量分析）
上記で調製したニンニク粉末における有機硫黄化合物を、ＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬＣのカラムにはＩｎｔｅｒｓｉｌＯＤＳ－４５μｍ（内径：４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を使用した。検出器の波長を２０５ｎｍとし、オーブンの温度を３５℃とした。注入量を１．０μｌとし、流量を０．８ｍｌ／分とした。移動相は、Ａ液をリン酸二水素カリウム水溶液（ｐＨ２．６）８５％とし、Ｂ液をＨＰＬＣ用メタノール１５％とした。まず、標準溶液１．０μｌをカラムに注入し、有機硫黄化合物（アリイン、ＳＡＣ及びＧ－ＳＡＣ）並びにアリシンのピーク高より検量線を作成した。

ニンニク粉末１ｇと水／メタノール混合液（１：１）２４ｍｌとを混ぜ、３０分間、振盪抽出した。１２１００×ｇで１０分間遠心し、上清を０．２μｍフィルタ濾過して試料溶液とした。試料溶液１．０μｌをカラムに注入し、各標準溶液と同一の溶出時間のピーク高から検量線に基づいて各有機硫黄化合物の濃度を求めた。なお、フルクタンの濃度は、ＦＲＵＣＴＡＮＡＳＳＡＹＫＩＴ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）で決定した。
有機硫黄化合物の濃度がそれぞれ２０．８８９ｍｇ／ｍｌ及び４３．８６９ｍｇ／ｍｌとなるようにＧ１及びＧ２を調製し、以下の実験に供した。表１にＧ１及びＧ２の機能性成分の組成を示す。

試験例１
（マウスの飼育）
５週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳＩｃマウス（日本エスエルシー社製）を用いて動物実験を行った。飼育条件は、２３．５℃で１２時間明暗周期とし、飼料と水を自由摂取させた。１週間の予備飼育期間では、すべてのマウスに標準食（ＮＤ）と水とを与えた。予備飼育期間終了後、与える飼料に応じた群分けをして１２週間の本飼育を行った。実験群は、ＮＤ群、西洋食（ＷＤ）群、西洋食＋Ｇ１（ＷＧ１）群及び西洋食＋Ｇ２（ＷＧ２）群とした。各飼料の組成を表２に示す。飼料は毎日交換し、床替えと水の交換を週に２回行い、週に１回、体重を測定した。マウスの糞便を予備飼育期間終了後と実験終了直前に回収した。実験期間終了後、マウスを麻酔で安楽死させ、血清及び肝臓を回収し、解析に供した。

（血液生化学指標の分析）
血液生化学指標を乾式臨床化学分析装置スポットケムＥＺ（アークレイ社製）で測定した。測定項目は、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（Ｔ－Ｃｈｏ）、Ｇｌｕ、ＧＰＴ及びＧＯＴである。糖代謝への作用を明らかにするために、実験最終日に１２時間絶食後の空腹時血清グルコース濃度と空腹時血清インスリン濃度を測定した。血清インスリン濃度は、ＭｏｕｓｅＩＮＳＵＬＩＮＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＥＭＩＮＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。キットの説明書に従って、血清を氷上で溶かし、測定希釈液で２倍希釈し、標準インスリンの吸光度から作成した検量線に基づいて血清インスリン濃度を求めた。

（組織切片及び肝臓脂肪率の分析）
マウスの肝臓を収集し、凍結ミクロトームシステム（ＲＥＭ－７１０、大和光機工業社製）を使用して、５μｍの切片を作製した。次に、肝臓切片をＨ＆Ｅ染色剤で染色し、顕微鏡で観察して撮像した。また、ヘキサンを抽出溶媒として、肝臓から脂肪を抽出した。脂肪抽出後にヘキサンを蒸発させて、ヘキサン蒸発後の残留物を脂肪とし秤量し、肝臓脂肪率を算出した。肝臓でのＰＰＡＲα、ＣＰＴ１Ａ、ＣＹＰ４Ａ１、Ｇ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫのタンパク質発現量はウエスタンブロッティング法で定量した。

マウス肝臓のＭＣＰ－１濃度は、ＭｏｕｓｅＭＣＰ－１ＵｎｃｏａｔｅｄＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。肝臓組織の重量に対し２０倍の１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加し、ホモゲナイザー後遠心分離した（１２０００ｇ、１０分）。得られた上清をサンプルとしてキットの説明書に従ってＭＣＰ－１を測定した。

肝臓組織の５０倍量のＲＩＰＡＢｕｆｆｅｒを添加し、ホモゲナイザー後、遠心分離することで（１２０００ｇ、１０分）肝臓タンパク質を抽出した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準を用いて得られた上清もタンパク質量を定量した。上清に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加し、１００℃、５分間でタンパク質を変性させたサンプルをウエスタンブロッティング法に供した。ウエスタンブロッティング法に使用した抗体は、抗ＣＰＴ１Ａ（ｓｃ－３９３０７０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）、抗ＣＹＰ４Ａ１（ｓｃ－５３２４８、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）、抗ＰＰＡＲα（ｓｃ－９０００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）、抗ＰＥＰＣＫ（Ｄ１２Ｆ５、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、抗Ｇ－６－Ｐａｓｅ（ａｂ８３６９０、Ａｂｃａｍ社製）である。

（タウリン及びＤＰＰ－４の測定）
マウスの糞便中のタウリン濃度の測定には、タウリンアッセイキット（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ社製）を、製造元のマニュアルに従って使用した。マウス血清中のＤＰＰ－４濃度は、マウスＤＰＰ－４ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ社製、ａｂ２６４６３０）を、製造元のマニュアルに従って使用して測定した。

（腸内細菌の解析）
マウスの糞便を、ＬｙｓｉｎｇＭａｔｒｉｘＥｔｕｂｅ（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を用いて破砕した。抽出されたＤＮＡを、シリカを素材とするスピンフィルタで精製した。得られたＤＮＡについて、下記のように１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子を標的としたＰＣＲを行い、次世代シーケンサーで解析することにより、網羅的に腸内細菌叢を解析した。

まず、ＳｙｎｅｒｇｙＨ１（ＢｉｏＴｅｋ社製）とＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒｄｓＤＮＡＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＤＮＡ溶液の濃度を測定した。２－ｓｔｅｐｔａｉｌｅｄＰＣＲ法を用いてライブラリーを作製した。第１の（１ｓｔ）ＰＣＲ及び第２の（２ｎｄ）ＰＣＲの反応組成を表３に示す。第１のＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分間に続き、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間からなるサイクルを３０サイクルの後、７２℃で５分間とした。第２のＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分間に続き、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間からなるサイクルを１０サイクルの後、７２℃で５分間とした。第１のＰＣＲで使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。第２のＰＣＲで使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。なお、シーケンス解析時の品質向上を目的として、第１のＰＣＲのプライマーには混合プライマーを使用した。配列番号１及び２に示される塩基配列には０～５塩基の異なる長さのランダム配列が挿入されている。また、配列番号３及び４に示される塩基配列には８塩基のサンプル識別配列が挿入されている。

ＳｙｎｅｒｇｙＨ１とＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒｄｓＤＮＡＳｙｓｔｅｍを用いて、作製したライブラリーの濃度を測定した。シーケンシング解析では、ＭｉＳｅｑシステムとＭｉＳｅｑＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、２×３００ｂｐの条件でシーケンシングを行った。

なお、本試験例において得られた結果は平均値±標準偏差で表す。２群間の有意差検定はｔ検定で、多群間の有意差検定では、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＤｕｎｃａｎ法による多重分析を行った。統計ソフトはＩＢＭＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ（バージョン１９．０、ＩＢＭ社製）を用いた。５％水準で有意差を認め、有意差のある群には異なるアルファベットを付した。

（結果）
初期体重及び飼料総摂食量は群間において有意差がなかった。図１Ａに示すように、ＷＤ群の最終体重は、ＮＤ群よりも有意に高くなった。図１Ｂに示すように、腹部脂肪重量については、ＷＧ２群はＷＤ群より有意に減少し、ＷＧ１群はＷＤ群より減る傾向があった。図１Ｃ及び図１Ｄに示すように、血清中のＴＧ及びＴ－Ｃｈｏの濃度は、ＷＤ群はＮＤ群より有意に増加し、ＷＧ１とＷＧ２群はＷＤ群により有意に減少した。ＷＧ２群のＴ－Ｃｈｏの抑制効果はＷＧ１群よりも有意に強かった。

図２Ａは肝臓組織の切片像を示す。図２Ｂ及び図２Ｃは、それぞれ肝臓重量及び肝臓脂肪率を示す。ＷＧ１群及びＷＧ２群のいずれも、ＷＤ群によって誘発された肝脂肪滴の蓄積、肝臓重量の増加及び肝臓脂肪率の増加を大幅に減少させた。ＷＧ２群ではＷＧ１群より強い抑制効果が示された。

図３ＡはＧＰＴ／ＧＯＴを示す。ＷＧ１群及びＷＧ２群では、ＷＤによって上昇するＧＰＴ／ＧＯＴが有意に抑制された。図３Ｂは肝臓中のＭＣＰ－１の濃度を示す。ＷＧ１群及びＷＧ２群では、ＷＤによって上昇するＭＣＰ－１の濃度が有意に抑制された。以上のデータは、ニンニクの有機硫黄化合物がＷＤによって誘発された脂質異常症と脂肪肝とを軽減したことを示している。

空腹時血清グルコース濃度及び空腹時血清インスリン濃度をそれぞれ図４Ａ及び図４Ｂに示す。ＷＧ１群及びＷＧ２群では、ＷＤによって誘発される血清グルコース濃度及び血清インスリン濃度の上昇を有意に抑制した。ＷＧ２群はＷＧ１群よりも血清グルコース濃度の増加に対してより強い抑制効果を示した。空腹時の血糖値とインスリン値から算出され、インスリン抵抗性の指標であるＨＯＭＡ－ＩＲを図４Ｃに示す。ＨＯＭＡ－ＩＲは、ＷＤ群ではＮＤ群より有意に増加し、ＷＧ１群及びＷＧ２群において有意に減少した。これらの結果は、ニンニクの有機硫黄化合物がＷＤによるインスリン抵抗性を緩和したことを示している。

マウスの腸内細菌叢に対するニンニクの有機硫黄化合物の影響を評価するために、実験終了時（１８週齢）に新鮮な糞便を収集し糞便中の細菌の存在量を測定した。図５Ａに示すように、門レベルでは、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）がＷＤ群と比較してＷＧ１群及びＷＧ２群において増加した。図５Ｂに示すように、ＷＧ１群とＷＧ２群の両方でＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ（以下、“ＢＡ”と称する）の存在量が大幅に増加した。なお、ＫＥＧＧデータベースに基づく代謝予測結果では、ＷＧ１群及びＷＧ２群で脂肪酸代謝、コレステロール代謝、グルカゴンシグナル伝達及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に係るパスウェイを有意に調節した。

本実験の終了時の腸内細菌叢のβ多様性を、主座標分析（ＰＣｏＡ）（Ａ）によって評価した結果を図６Ａに示す。主座標によって説明されるデータセットの変動については、ＰＣ１、ＰＣ２及びＰＣ３がそれぞれ３８．８８％、１８．１８％及び１０．２０％であった。各ドットは、各グループの８つの希薄化値の平均値を表し、ドット間の距離が近いほど、類似であることを示す。図６Ｂは、バクテロイデス門に対するフィルミクテス門の比率を示す図である。腸内細菌のデータによって、ニンニクの有機硫黄化合物が腸内細菌叢の組成を変え、特にＢＡの存在量を増加させることを示された。これらの結果は、脂質及び糖代謝に対するニンニクの有機硫黄化合物の調節機構が、ＢＡの成長刺激作用阻害に関連していることを示唆している。

ＢＡの代謝メカニズムを検討するために、糞便中のタウリン、及び肝臓中の脂肪酸酸化関連タンパク発現量を測定した。図７Ａに示すように、ＷＧ１群及びＷＧ２群は、タウリンの濃度を有意に増加させ、ＷＧ２群ではＷＧ１群より有意に増加させた。肝臓でのＰＰＡＲα、ＣＰＴ１Ａ及びＣＹＰ４Ａ１のタンパク質発現量を、それぞれ図７Ｂ、図７Ｃ及び図７Ｄに示す。ＰＰＡＲα、ＣＰＴ１Ａ及びＣＹＰ４Ａ１は、ＷＤ群ではＮＤ群より減少したが、ＷＧ２群では有意に増加した。ＷＧ１群も増加傾向を示した。これらの結果は、ニンニクの有機硫黄化合物がタウリンの産生とＰＰＡＲαの活性化を通じて脂肪酸β酸化を促進することを示唆している。

糖代謝の調節に対するニンニクの有機硫黄化合物の作用機序を明らかにするため、ＢＡと負相関であるＤＰＰ－４濃度を図８Ａに示す。血清中のＤＰＰ－４濃度は、ＷＤ群ではＮＤ群より有意に増加し、ＷＧ１群とＷＧ２群では有意に抑えられた。肝臓糖新生に関するＧ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫの肝臓におけるタンパク質の発現量を、それぞれ図８Ｂ及び図８Ｃに示す。Ｇ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫの発現量は、ＷＤ群ではＮＤ群より増加し、ＷＧ２群において有意に減少した。ＷＧ１群では、Ｇ６Ｐａｓｅの発現量が有意に減少し、ＰＥＰＣＫの発現量も減少傾向であった。これらの結果は、ニンニクの有機硫黄化合物はＤＰＰ－４の活性を阻害し、肝臓糖新生を抑制することにより、糖代謝を改善することを示唆している。

試験例２
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓの体外培養）
嫌気細菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ（ＪＣＭ１０５５６）を、理化学研究所バイオリソース研究センターから取得した。細菌を、ＢｒｕｃｅｌｌａＢｒｏｔｈ培地（５２１５８６１）及び７％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓ－００１Ａ－ＢＲ）を用いて３７℃で培養した。培養には、嫌気培養キットであるアネロパック（商標）（スギヤマゲン社製、Ａ－０２）と専用角型ジャー（三菱ガス化学社製）を使用した。

上記ニンニク粉末Ｇ１及びＧ２を、それぞれ５倍重量の滅菌水に１２時間懸濁し、２５００ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを回収して、ニンニク水抽出物Ｇｗ１及びＧｗ２を調製した。分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００ｃ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、細菌数がＯＤ_６００＝０．０６となるように調整し、１００μｌを９６ウェルプレートに播種した。各ウェルに１００μｌのニンニク水抽出物Ｇｗ１又はＧｗ２を、有機硫黄化合物の濃度を適宜調整して添加した。添加時のＯＤ_６２０の値を初期値（０時間）として、３０時間後までの細菌の増殖をＯＤ_６２０の値で評価した。表４にＧｗ１及びＧｗ２の機能性成分の組成を示す。

（結果）
図９Ａに示すように、３０時間の培養で、Ｇｗ１及びＧｗ２は、いずれも１．２５０～５．０００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で濃度依存的にＢＡの増殖を有意に増加させた。図９Ｂに示すように、５．０００ｍｇ／ｍｌのＧｗ１及びＧｗ２は、１８時間後からＢＡの増殖を有意に促進させた。ＢＡの増殖に関して、Ｇｗ２の促進効果はＧｗ１より有意に高かった。これらの結果は、ニンニクの有機硫黄化合物がｉｎｖｉｔｒｏでＢＡの増殖を直接促進することを示唆している。

この発明は、この発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、この発明の範囲を限定するものではない。すなわち、この発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。

Claims

ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤。
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する、
腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤。
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する、
腸内タウリン分泌促進剤。
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物。
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する、
腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物。
ニンニクに含まれる有機硫黄化合物を有効成分として含有する、
腸内タウリン分泌促進用経口組成物。
前記有機硫黄化合物は、
Ｓ－アリル－Ｌ－システインスルフォオキシド、γ－グルタミル－Ｓ－アリルシステイン及びＳ－アリルシステインからなる群から選択される少なくとも１種を含む、
請求項１に記載のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進剤、請求項２に記載の腸内ＤＰＰ－４発現抑制剤、請求項３に記載の腸内タウリン分泌促進剤、請求項４に記載のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ増殖促進用経口組成物、請求項５に記載の腸内ＤＰＰ－４発現抑制用経口組成物又は請求項６に記載の腸内タウリン分泌促進用経口組成物。