JP2023089809A

JP2023089809A - スクリーニング方法

Info

Publication number: JP2023089809A
Application number: JP2021204549A
Authority: JP
Inventors: 優子斉藤; Yuko Saito; 亜佑美諸隈; Ayumi Morokuma; まゆみ宍戸; Mayumi Shishido; 和紀中山; Kazunori Nakayama
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2023-06-28

Abstract

【課題】温度差のある環境下での肌の黒化や色素沈着を予防し得る成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング方法を確立することを課題とする。【解決手段】温度差刺激を与えたケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の活性を指標として、美白剤をスクリーニングする。好ましい態様において前記スクリーニング方法は、ケラチノサイトに被験試料を添加し、温度差刺激を与えて培養する工程、及び前記ケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の発現量を測定する工程を含む。前記メラノサイト刺激因子としては、ＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄが好ましい。【選択図】図１

Description

本発明は、美白剤をスクリーニングする方法に関する。

皮膚における日焼け後の色素沈着、シミ、肝斑、老人性色素斑等は、皮膚に存在するメラノサイト（色素細胞）の活性化によりメラニン生成が著しく亢進した状態である。これらの皮膚色素沈着に関連するトラブルの発生や悪化は肌の美しさを妨げるものであるため、従来これらを予防又は改善する作用を有する成分に関する研究が盛んになされており、様々な作用機序に基づく美白成分が創出されている。
例えば、シミ等の色素沈着と相関性の高い遺伝子群の発現量を指標として美白成分を探索することが提案されている（特許文献１等）。

特開２０１９－００４７４６号公報

近年、夏の外気温は従前より上昇する傾向にある。また、マスクを常時装着する生活が定着し、顔表面の温度が高くなりやすい。一方で、室内では冷房により低い気温となる。そのような、温度に差がある環境を行き来する条件は、肌にとって過酷なものとなり得る。
本発明者らは、そのような温度差刺激が肌に与える影響に着目したところ、温度差刺激を受けた肌では紫外線照射による黒化や色素沈着が進行しやすいという新たな知見を見出した。これまでに、温度差が肌の黒化や色素沈着に与える影響やそれを抑制する成分を探索しようとすることはなされてこなかった。
本発明は、温度差のある環境下での肌の黒化や色素沈着を予防し得る成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング方法を確立することを課題とする。

本発明者らは、温度差刺激を受けたケラチノサイト（表皮細胞）ではメラノサイト刺激因子の発現が亢進すること、それによりメラノサイトにおいてメラニン合成が促進され、肌の黒化や色素沈着が進行しやすくなることを見出した。かかる知見に基づき、温度差刺激を与えたケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の活性を指標として、美白剤の有効成分をスクリーニングする方法を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］温度差刺激を与えたケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の活性を指標とする、美白剤をスクリーニングする方法。
［２］ケラチノサイトに被験試料を添加し、温度差刺激を与えて培養する工程、及び
前記ケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の発現量を測定する工程を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記メラノサイト刺激因子が、ＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］温度差刺激を与えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の活性を指標とする、美白剤をスクリーニングする方法。
［５］ケラチノサイトに被験試料を添加し、温度差刺激を与えて培養する工程、
前記ケラチノサイトの培養上清をメラノサイトに添加して培養する工程、及び
前記メラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の発現量を測定する工程を含む、［４］に記載の方法。
［６］前記メラニン合成関連因子が、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｔｙｒｐ１及びＭＩＴＦからなる群から選択される、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］前記発現量が、ケラチノサイトに被験試料を添加しなかったときの発現量と比較して小さい場合に、前記被験試料は美白作用を有すると判定する、［２］、［３］、［５］及び［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記温度差刺激が、５℃以上の差の温度変化に１回又は複数回曝すことである、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の方法により美白剤をスクリーニングする工程を含む、美白用化粧料の設計方法。

本発明により、温度差のある環境下での肌の黒化や色素沈着を予防し得る、新たな美白剤の有効成分をスクリーニングする方法が提供される。

温度条件を変えて培養したケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子（ＫＩＴＬＧ）の遺伝子発現量を示すグラフ（低温群：２８℃一定、高温群：３７℃一定、温度刺激あり群：３７℃→２８℃→３７℃）。温度条件を変えて培養したケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子（ＫＩＴＬＧ）の遺伝子発現量を示すグラフ（低温群：３２℃一定、高温群：３７℃一定、温度刺激あり群：３７℃→３２℃→３７℃）。温度条件を変えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子（ＴＹＲ１）の発現量を示すグラフ（高温群：３７℃一定、温度刺激あり群：３７℃→２８℃→３７℃）。温度条件を変えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子（ＴＹＲＰ１）の発現量を示すグラフ（高温群：３７℃一定、温度刺激あり群：３７℃→２８℃→３７℃）。温度条件を変えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子（ＭＩＴＦ）の発現量を示すグラフ（高温群：３７℃一定、温度刺激あり群：３７℃→２８℃→３７℃）。温度条件を変えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトの光学顕微鏡写真（高温群：３７℃一定、温度刺激あり群：３７℃→２８℃→３７℃）。温度条件を変えて培養した後に被験試料を添加又は未添加で培養したケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子（ＫＩＴＬＧ）の発現量を示すグラフ（高温群：３７℃一定、温度刺激あり群：３７℃→３２℃→３７℃、温度刺激あり・試料添加群：３７℃→３２℃→３７℃）。

本発明のスクリーニング方法は、温度差刺激を与えたケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の活性を指標とする。

温度差刺激を与えた肌に紫外線を照射すると、該刺激を与えない場合に比べて肌が黒化することが観察された。また、後述の実施例で示される通り、温度差刺激を与えたケラチノサイトにおいては、該刺激が与えられていない、すなわち温度条件が一定であったケラチノサイトに比べて、著しくメラノサイト刺激因子の発現が亢進する。また、温度差刺激
を与えたケラチノサイト、すなわちメラノサイト刺激因子の発現が亢進しているケラチノサイトの培養上清を、紫外線照射したメラノサイトに添加して培養すると、温度条件が一定であったケラチノサイトの培養上清を添加した場合に比べてメラニン合成関連因子の発現が亢進する。これらのことから、温度差刺激を与えたケラチノサイトにおいてメラノサイト刺激因子の発現を抑制する成分は、温度差刺激により生じやすくなるメラニン黒化を抑制する化粧料の有効成分になり得る。

本発明において、メラノサイト刺激因子の活性としては、メラノサイト刺激因子の発現量であってよい。ここで発現量は、メラノサイト刺激因子の遺伝子の発現量や、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の翻訳量又は存在量であってよい。
本発明のスクリーニング法の好ましい態様としては、ケラチノサイトに被験試料を添加し、温度差刺激を与えて培養する工程、及び前記ケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の発現量を測定する工程を含む。
メラノサイト刺激因子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、メラノサイト刺激因子をコードする遺伝子の発現量、通常はｍＲＮＡ量を、該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、既知のメラノサイト刺激因子の遺伝子の塩基配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の翻訳量又は存在量を、常法により定量的に測定して、前記因子の発現量としてもよい。

本発明においてメラノサイト刺激因子としては、特に限定されないがＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄ（受容体型チロシンキナーゼｋｉｔのリガンド、別名ＳＣＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＦａｃｔｏｒ／ｃ－ｋｉｔＬｉｇａｎｄ）等が好ましく挙げられる。

また、本発明において、メラノサイト刺激因子の活性としては、メラノサイト刺激因子により活性化されるメラノサイトで発現する、メラニン合成関連因子の活性により間接的に表されてもよい。これは、メラニン産生のメカニズムにおいてメラノサイト刺激因子の下流にあるメラニン合成関連遺伝子も、後述の実施例で示される通り温度差刺激によりメラノサイト刺激因子と連動した発現挙動を示すからである。そのため、本発明の別の態様として、温度差刺激を与えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の活性を指標とする、美白剤をスクリーニングする方法も提供される。

メラニン合成関連因子の活性としては、メラニン合成関連因子の発現量であってよい。ここで発現量は、メラニン合成関連因子の遺伝子の発現量や、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の翻訳量又は存在量であってよい。
本発明のスクリーニング法の好ましい態様としては、ケラチノサイトに被験試料を添加し、温度差刺激を与えて培養する工程、前記ケラチノサイトの培養上清をメラノサイトに添加して培養する工程、及び前記メラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の発現量を測定する工程を含む。
メラニン合成関連因子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、メラニン合成関連因子をコードする遺伝子の発現量、通常はｍＲＮＡ量を、該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、既知のメラニン合成関連因子の遺伝子の塩基配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の存在量を、常法により定量的に測定して、前記因子の発現量としてもよい。

本発明においてメラニン合成関連因子としては、特に限定されないがＴｙｒｏｓｉｎａ
ｓｅ（メラニン合成酵素チロシナーゼ）の遺伝子ＴＹＲ１、Ｔｙｒｐ１（チロシナーゼ関連タンパク質１）の遺伝子ＴＹＲＰ１、ＭＩＴＦ（メラニン合成酵素遺伝子の発現を制御する転写因子）の遺伝子ＭＩＴＦ等が好ましく挙げられる。

通常、メラノサイト刺激因子はメラノサイトが活性化する方向に刺激を与える。また、メラニン合成関連因子は、メラニン合成が促進する方向に働くものを好ましく本発明の方法に用いることができる。
そのため、本発明においては、被験試料を添加して温度差刺激を与えて培養したケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の発現量、又は被験試料を添加して温度差刺激を与えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の発現量が、通常は被験試料を添加しなかった場合の発現量（コントロール）と比較して小さい場合に、前記験試料は美白作用を有すると判定される。また、被験試料を添加して温度差刺激を与えて培養したケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の発現量、又は被験試料を添加して温度差刺激を与えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の発現量が、予め決めた発現量の基準値と比較して小さい場合に、前記験試料は美白作用を有すると判定されてもよい。
なお、発現量が小さいことの程度としては、コントロールに対して好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である。ただし、顕著な細胞毒性の起きない濃度範囲で試験試料を添加するものとする。

本発明の方法においてケラチノサイトに与える温度差刺激としては、特に限定されないが、好ましくは５℃以上、より好ましくは７℃以上、さらに好ましくは９℃以上の差の温度変化に一時的に曝すことをいう。温度変化の差の上限は特に限定されないが、通常は１０℃以下である。また、温度変化に曝す回数は、１回又は複数回である。なお、温度変化は、低温から高温に曝し再び低温に戻す、高温から低温に曝し再び高温に戻す、のいずれでもよい。ここでの「低温」、「高温」は変化前後の相対的な高低を指す。温度変化に曝した後に戻す温度は、温度差があれば特に限定されず、元の温度と同一でなくてもよい。また、一つの温度条件に置く時間は、好ましくは１時間以上、より好ましくは３時間以上、さらに好ましくは６時間以上である。時間の上限は特に限定されないが、通常は２４時間以下である。

本発明のスクリーニング方法に使用する表皮細胞としては、ヒト由来の表皮細胞のほか、ラット、マウス、ウサギなどの哺乳動物由来の表皮細胞であれば特段の限定なく使用することができるが、通常は、いずれも正常な細胞を用いることが好ましく、ヒト由来の正常な表皮細胞を用いることがより好ましい。
細胞の培養の条件としては、通常の培養条件の他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。

本発明のスクリーニング方法が対象とする被験試料は、純物質、動植物由来の抽出物、またはそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物又は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花、花蕾、果実等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン
類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される一種又は二種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法における手順の一例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
まず、プレ培養したケラチノサイトに被験試料を添加し、３７℃で２４～７２時間、次いで２８℃又は３２℃で１～２４時間、次いで再び３７℃で６～２４時間インキュベーションする。その後、該ケラチノサイトにおけるＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄ等のメラノサイト刺激因子をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量を定法により測定する。コントロールとして、被験試料を添加せず同様に培養したケラチノサイトにおいても該発現量を測定する。被験試料を添加したケラチノサイトにおける発現量が、被験試料を添加しなかったケラチノサイトにおける発現量（コントロール）に対して小さい場合、前記被験試料は美白作用を有すると判定する。

本発明でいう美白作用は、言い換えると肌の黒化抑制作用、色素沈着抑制作用、又はメラニン生成抑制作用であってよく、好ましくは温度差刺激で生じる肌の黒化抑制作用、温度差刺激で生じる色素沈着抑制作用、又は温度差刺激で生じるメラニン生成抑制作用をいう。

本発明のスクリーニング方法により美白作用を有すると判定された成分は、任意の調製方法により組成物に含有させることができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、美白用組成物に好適に用いることができる。かかる組成物としては、例えば皮膚外用組成物が好ましく、化粧料がより好ましく、美白用スキンケア化粧料が好適に挙げられる。

本発明のスクリーニングにより有効性が判定された物質を組成物に含有させる場合、その含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。有効成分の含有量（配合量）が少なすぎると所望の効果が得られにくい場合があり、多すぎると効果が頭打ちになるばかりか組成物の処方の自由度を損なう場合があるからである。また、組成物に含有させる有効成分の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。なお、動植物抽出物等についてはその配合量は固形物換算量とする。

本発明に係る美白剤を皮膚外用組成物に含有させる場合、その製造に際しては、化粧料、医薬部外品、医薬品などの製剤化で通常使用される成分を任意に配合することができる。
かかる任意成分としては例えば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリ
エチレングリコール、グリセリン、１，３－ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を任意に配合することができる。
該皮膚外用組成物は、常法に従って前述の成分を処理・配合することにより製造することができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

＜試験例１＞温度差刺激による正常ヒト表皮細胞におけるメラノサイト刺激因子の遺伝子発現量への影響１
正常ヒト表皮細胞（倉敷紡績株式会社）を、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（倉敷紡績株式会社）を用いて起眠した後、細胞培養用フィルターキャップフラスコ７５ｃｍ^２内で、３
７℃、５％ＣＯ_２環境下で５日間培養した。
フラスコをＰＢＳにてＷａｓｈ後、０．０５％トリプシンを２ｍＬ加え、３７℃に数分間静置し、細胞を剥離した。中和液を加えてフラスコ内をピペッティングし、細胞を液ごと５０ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を２４ウェルプレート３枚に３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種した。各プレートでは中央の３ウェルにのみ細胞を播種し、残りのウェルにはＰＢＳを添加した。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
２４時間後、各プレートの培地を新しいＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２に交換した後、３枚のうち２枚のプレートについては、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。残る１枚のプレートについては、２８℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
２４時間後、３７℃で培養したプレートのうち、１枚については２８℃、５％ＣＯ_２環境下に移動させ、６時間静置した。６時間後に３７℃、５％ＣＯ_２環境下に戻し、２４時間静置した。３７℃で培養したプレートのうち残りの１枚についてはそのまま３７℃、５％ＣＯ_２環境下に、また２８℃で培養したプレート１枚についてはそのまま２８℃、５％ＣＯ_２環境下に静置した。
２４ウェルプレートへ播種した２４時間後から、２８℃で培養した細胞群を「低温群」、３７℃一定で培養した細胞群を「高温群」、及び３７℃で２４時間培養後に２８℃で６時間培養し、その後３７℃に戻し２４時間培養した細胞群を「温度差刺激あり群」とした。
各プレートの培地を除いてＰＢＳで洗浄し、ＢｕｆｆｅｒＲＬＴ（株式会社キアゲン
）を加え細胞を溶解し、各ウェルの細胞溶解液を別々のＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒチュー
ブ（株式会社キアゲン）に回収した。遠心分離によりチューブ内のフィルターを通過した溶液を回収した。

回収した溶液から、ＲＮｅａｓｙｐｌｕｓｍｉｃｒｏｋｉｔ（株式会社キアゲン）
を用いてそれぞれＲＮＡを抽出した。
ＱｕａｎｔｉＴｅｃＴＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲＴ－ＰＣＲｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、内在性コントロールとしてＡＣＴＢ（ＡｃｔｉｎＢｅ
ｔａの遺伝子、プライマーは株式会社キアゲンのものを使用）及びＫＩＴＬＧ（メラノサイト刺激因子であるＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄの遺伝子、プライマーは株式会社キアゲンのものを使用）のｍＲＮＡ発現量を測定した。
ＫＩＴＬＧのｍＲＮＡ発現量を、ＡＣＴＢのｍＲＮＡ発現量で除した値（ＫＩＴＬＧ／ＡＣＴＢ）を求め、各サンプルのＫＩＴＬＧのｍＲＮＡ発現量とした。

図１に、各群のＫＩＴＬＧのｍＲＮＡ発現量の平均値を、低温群のｍＲＮＡ発現量平均値を１とする相対値としてグラフで示す。この結果から、高温群は低温群よりもＫＩＴＬ
Ｇの発現量が有意に高いが、温度差刺激あり群はその高温群よりもＫＩＴＬＧの発現量が有意に高いことがわかる。
以上の結果から、正常ヒト表皮細胞において、温度差刺激によりメラノサイト刺激因子（ＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄ）の遺伝子であるＫＩＴＬＧの発現量が高まることが明らかとなった。

＜試験例２＞温度差刺激による正常ヒト表皮細胞におけるメラノサイト刺激因子の遺伝子発現量への影響２
正常ヒト表皮細胞（倉敷紡績株式会社）を、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（倉敷紡績株式会社）を用いて起眠した後、細胞培養用フィルターキャップフラスコ７５ｃｍ^２内で、３
７℃、５％ＣＯ_２環境下で５日間培養した。
フラスコをＰＢＳにてＷａｓｈ後、０．０５％トリプシンを２ｍＬ加え、３７℃に数分間静置し、細胞を剥離した。中和液を加えてフラスコ内をピペッティングし、細胞を液ごと５０ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を２４ウェルプレート３枚に３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種した。各プレートでは中央の３ウェルにのみ細胞を播種し、残りのウェルにはＰＢＳを添加した。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
２４時間後、各プレートの培地を新しいＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２に交換した後、３枚のうち２枚のプレートについては、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。残る１枚のプレートについては、２８℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
２４時間後、３７℃で培養したプレートのうち、１枚については３２℃、５％ＣＯ_２環境下に移動させ、３時間静置した。３時間後に３７℃、５％ＣＯ_２環境下に戻し、２４時間静置した。３７℃で培養したプレートのうち残りの１枚についてはそのまま３７℃、５％ＣＯ_２環境下に、また３２℃で培養したプレート１枚についてはそのまま３２℃、５％ＣＯ_２環境下に静置した。
２４ウェルプレートへ播種した２４時間後から、３２℃で培養した細胞群を「低温群」、３７℃一定で培養した細胞群を「高温群」、及び３７℃で２４時間培養後に３２℃で３時間培養し、その後３７℃に戻し２４時間培養した細胞群を「温度差刺激あり群」とした。
各プレートの培地を除いてＰＢＳで洗浄し、ＢｕｆｆｅｒＲＬＴ（株式会社キアゲン
）を加え細胞を溶解し、各ウェルの細胞溶解液を別々のＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒチュー
ブ（株式会社キアゲン）に回収した。遠心分離によりチューブ内のフィルターを通過した溶液を回収した。

回収した溶液から、ＲＮｅａｓｙｐｌｕｓｍｉｃｒｏｋｉｔ（株式会社キアゲン）
を用いてそれぞれＲＮＡを抽出した。
試験例１と同様にＡＣＴＢ及びＫＩＴＬＧのｍＲＮＡ発現量を測定し、（ＫＩＴＬＧ／ＡＣＴＢ）を求め、各サンプルのｍＲＮＡ発現量とした。

図２に、各群のＫＩＴＬＧのｍＲＮＡ発現量の平均値を、低温群のｍＲＮＡ発現量平均値を１とする相対値としてグラフで示す。この結果から、高温群は低温群よりもＫＩＴＬＧの発現量が有意に高いが、温度差刺激あり群はその高温群よりもＫＩＴＬＧの発現量が有意に高いことがわかる。
以上の結果から、正常ヒト表皮細胞において、温度差刺激によりメラノサイト刺激因子（ＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄ）の遺伝子であるＫＩＴＬＧの発現量が高まることが明らかとなった。

＜試験例３＞温度差刺激を与えた正常ヒト表皮細胞の培養上清を添加したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の遺伝子発現量への影響
正常ヒト表皮細胞（倉敷紡績株式会社）を、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（倉敷紡績株式会
社）を用いて起眠した後、細胞培養用フィルターキャップフラスコ７５ｃｍ^２内で、３
７℃、５％ＣＯ_２環境下で５日間培養した。
フラスコをＰＢＳにてＷａｓｈ後、０．０５％トリプシンを２ｍＬ加え、３７℃に数分間静置し、細胞を剥離した。中和液を加えてフラスコ内をピペッティングし、細胞を液ごと５０ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を２４ウェルプレート２枚に３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種した。各プレートでは中央の３ウェルにのみ細胞を播種し、残りのウェルにはＰＢＳを添加した。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
２４時間後、各プレートの培地を新しいＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２に交換した後、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
２４時間後、プレートのうち１枚については２８℃、５％ＣＯ_２環境下に移動させ、６時間静置した。６時間後に３７℃、５％ＣＯ_２環境下に戻し、２４時間静置した。残りの１枚についてはそのまま３７℃、５％ＣＯ_２環境下に静置した。
各プレートの細胞を播種した各ウェルから、培養上清を１．５ｍＬチューブにそれぞれ回収し、－８０℃で凍結保存した。

一方、正常ヒトメラノサイト（コスモ・バイオ株式会社）を、Ｍｅｄｉｕｍ２５４（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて起眠した後、細胞培養用フィルターキャップフラスコ７５ｃｍ^２内で、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で７日間培養した
。
フラスコをＰＢＳにてＷａｓｈ後、０．０５％トリプシンを２ｍＬ加え、３７℃に数分間静置し、細胞を剥離した。中和液を加えてフラスコ内をピペッティングし、細胞を液ごと５０ｍＬチューブに回収。回収した細胞を２４ウェルプレート１枚のうち６ウェルに５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、残りのウェルにはＰＢＳを添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間培養した。
前述の凍結保存した正常ヒト表皮細胞の培養上清が入った１．５ｍＬチューブを常温に戻し、遠心分離した後、上清を別の１．５ｍＬチューブに回収した。等量のＭｅｄｉｕｍ２５４を加え、よく混合した。
正常ヒトメラノサイトを播種した２４ウェルプレートの培地を除去し、ＰＢＳに置換した。プレートの蓋を外し、紫外線Ｂ波を４０ｍＪ／ｃｍ^２となるよう照射した。照射後、ＰＢＳを除去し、各ウェルに前述の１．５ｍＬチューブ中の表皮細胞培養上清を含む培地を添加した。３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間培養した。なお、２４ウェルプレートへ播種した２４時間後から、３７℃一定で培養した表皮細胞の培養上清を添加したメラノサイト群を「高温群」、及び３７℃で２４時間培養後に２８℃で６時間培養し、その後３７℃に戻し２４時間培養した表皮細胞の培養上清を添加したメラノサイト群を「温度差刺激あり群」とし、各群３ウェルずつとした。
２４時間後、各プレートの培地を除いてＰＢＳで洗浄し、ＢｕｆｆｅｒＲＬＴ（株式
会社キアゲン）を加え細胞を溶解し、各ウェルの細胞溶解液を別々のＱＩＡｓｈｒｅｄ
ｄｅｒチューブ（株式会社キアゲン）に回収した。遠心分離によりチューブ内のフィルターを通過した溶液を回収した。

回収した溶液から、ＲＮｅａｓｙｐｌｕｓｍｉｃｒｏｋｉｔ（株式会社キアゲン）
を用いてそれぞれＲＮＡを抽出した。
ＱｕａｎｔｉＴｅｃＴＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲＴ－ＰＣＲｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、内在性コントロールとしてＡＣＴＢ（ＡｃｔｉｎＢｅ
ｔａの遺伝子、プライマーは株式会社キアゲンのものを使用）、ＴＹＲ１（メラニン合成酵素チロシナーゼの遺伝子、プライマーは株式会社キアゲンのものを使用）、ＴＹＲＰ１（チロシナーゼ関連タンパク質１の遺伝子、プライマーは株式会社キアゲンのものを使用）及びＭＩＴＦ（メラニン合成酵素遺伝子の発現を制御する転写因子の遺伝子、プライマーは株式会社キアゲンのものを使用）のｍＲＮＡ発現量を測定した。
各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、ＡＣＴＢのｍＲＮＡ発現量で除した値（ＴＹＲ１／ＡＣＴＢ、ＴＹＲ１／ＡＣＴＢ、及びＭＩＴＦ／ＡＣＴＢ）を求め、各サンプルのｍＲＮＡ発現量とした。

また、同様に表皮細胞培養上清を含む培地を添加して３７℃、５％ＣＯ_２環境下で７２時間培養したヒト正常メラノサイトを、光学顕微鏡で観察した。

図３～５に、各群の各メラニン合成関連因子のｍＲＮＡ発現量の平均値を、高温群のｍＲＮＡ発現量平均値を１とする相対値としてグラフでそれぞれ示す。これらの結果から、温度差刺激あり群は高温群よりもＴＹＲ１、ＴＹＲ１及びＭＩＴＦのいずれについても発現量が有意に高いことがわかる。
図６に、光学顕微鏡で観察した各群のメラノサイトの写真を示す。温度差刺激あり群は高温群よりもメラニン（写真中の褐色部）が多く認められる。
以上の結果から、温度差刺激を与えた正常ヒト表皮細胞の培養上清を添加したメラノサイトでは、温度差刺激を与えなかった正常ヒト表皮細胞の培養上清を添加したメラノサイトと比べて、メラニン合成関連因子（ＴＹＲ１、ＴＹＲ１及びＭＩＴＦ）の遺伝子発現量が有意に高まり、メラニンの合成が促進されてメラニン量が増加することが明らかとなった。

＜試験例４＞正常ヒト表皮細胞を用いた、温度差のある環境下での肌の黒化や色素沈着を予防し得る成分のスクリーニング
正常ヒト表皮細胞（倉敷紡績株式会社）を、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（倉敷紡績株式会社）を用いて起眠した後、細胞培養用フィルターキャップフラスコ７５ｃｍ^２内で、３
７℃、５％ＣＯ_２環境下で５日間培養した。
フラスコをＰＢＳにてＷａｓｈ後、０．０５％トリプシンを２ｍＬ加え、３７℃に数分間静置し、細胞を剥離した。中和液を加えてフラスコ内をピペッティングし、その液を５０ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を２４ウェルプレート２枚に３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種した。１枚のプレートでは中央の４ウェルにのみ細胞を播種し、残りのウェルにはＰＢＳを添加した。もう１枚のプレートでは中央の８ウェルに細胞を播種し、残りのウェルにはＰＢＳを添加した。これら２枚のプレートを３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
２４時間後、各プレートから培地を除去し、４ウェルに細胞を播種したプレートには溶媒対照を添加したＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２を加え、８ウェルに細胞を播種したプレートのうち４ウェルには溶媒対照を添加したＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２を、残りの４ウェルには試料を添加したＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２を加え、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間静置した。
試料としては、ｄ－パントテニルアルコール（終濃度０．０１重量％）、ヒオウギ抽出液（一丸ファルコス株式会社、終濃度０．１重量％）、及びビルベリー葉エキス（一丸ファルコス株式会社、終濃度０．１重量％）の混合物を用いた。

２４時間後、８ウェルに細胞を播種したプレートを３２℃、５％ＣＯ_２環境下に移動させ、６時間静置した。６時間後に３７℃、５％ＣＯ_２環境下に戻し、２４時間静置した。４ウェルに細胞を播種したプレートについては、そのまま３７℃、５％ＣＯ_２環境下に静置した。
２４ウェルプレートへ播種した２４時間後から、溶媒対照培地を添加して３７℃一定で培養した細胞群を「高温群」、溶媒対照培地を添加して３７℃で２４時間培養後に３２℃で６時間培養し、その後３７℃に戻し２４時間培養した細胞群を「温度差刺激あり群」、試料添加培地を添加して３７℃で２４時間培養後に３２℃で６時間培養し、その後３７℃に戻し２４時間培養した細胞群を「温度差刺激あり・試料添加群」とした。
各プレートの培地を除いてＰＢＳで洗浄し、ＢｕｆｆｅｒＲＬＴ（株式会社キアゲン
）を加え細胞を溶解し、各ウェルの細胞溶解液を別々のＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒチュー
ブ（株式会社キアゲン）に回収した。遠心分離によりチューブ内のフィルターを通過した溶液を回収した。

図７に、各群のＫＩＴＬＧのｍＲＮＡ発現量の平均値を、高温群のｍＲＮＡ発現量平均値を１とする相対値としてグラフで示す。この結果から、温度差刺激あり群は高温群よりもＫＩＴＬＧの発現量が有意に高く、温度差刺激あり・試料添加群は温度差刺激あり群よりもＫＩＴＬＧの発現量が有意に低いことがわかる。
以上の結果から、正常ヒト表皮細胞において、温度差刺激によりメラノサイト刺激因子ＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄの遺伝子であるＫＩＴＬＧの発現量が高まるが、試料の添加により、ＫＩＴＬＧの発現量増加が抑制されたことが明らかとなった。
温度差刺激によりケラチノサイトにおいてＫＩＴＬＧの発現量が亢進するとメラノサイトにおいてメラニン合成量が増加し肌の黒化や色素沈着に至るところ、温度差刺激により亢進するＫＩＴＬＧの発現量を抑制することができる試料は、美白剤の有効成分となり得る。

Claims

温度差刺激を与えたケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の活性を指標とする、美白剤をスクリーニングする方法。
ケラチノサイトに被験試料を添加し、温度差刺激を与えて培養する工程、及び
前記ケラチノサイトにおけるメラノサイト刺激因子の発現量を測定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
前記メラノサイト刺激因子が、ＫＩＴ－ｌｉｇａｎｄである、請求項１又は２に記載の方法。
温度差刺激を与えて培養したケラチノサイトの培養上清を添加して培養したメラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の活性を指標とする、美白剤をスクリーニングする方法。
ケラチノサイトに被験試料を添加し、温度差刺激を与えて培養する工程、
前記ケラチノサイトの培養上清をメラノサイトに添加して培養する工程、及び
前記メラノサイトにおけるメラニン合成関連因子の発現量を測定する工程を含む、請求項４に記載の方法。
前記メラニン合成関連因子が、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｔｙｒｐ１及びＭＩＴＦからなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
前記発現量が、ケラチノサイトに被験試料を添加しなかったときの発現量と比較して小さい場合に、前記被験試料は美白作用を有すると判定する、請求項２、３、５及び６のいずれか一項に記載の方法。
前記温度差刺激が、５℃以上の差の温度変化に１回又は複数回曝すことである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法により美白剤をスクリーニングする工程を含む、美白用化粧料の設計方法。