JP2023063411A

JP2023063411A - 粒子およびその製造方法

Info

Publication number: JP2023063411A
Application number: JP2023038520A
Authority: JP
Inventors: 桂一小泉; Keiichi Koizumi; 亮鈴木; Akira Suzuki; 一雄丸山; Kazuo Maruyama
Original assignee: Revius Pharma LLC
Current assignee: Revius Pharma LLC
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2023-03-13
Publication date: 2023-05-09
Also published as: WO2018062343A1; TW201827040A; JPWO2018062343A1; JP7274863B2

Abstract

【課題】製剤に添加することで硬度、崩壊性等の特性を容易に制御することのできる新しい粒子を提供する。【解決手段】最大径１～８００ｎｍの粒子を、細胞壁を構成する成分から得るようにした。【選択図】図１

Description

本発明は、熱安定性等の特性に優れた、細胞壁を構成する成分から得られる１～８００ｎｍの最大径を有する粒子に関するものである。

これまで、数多くの微細な粒子が様々な分野で用いられている。このような微細な粒子として、例えば、フラーレンやカーボンナノチューブ等のナノ粒子や、リポソーム等の天然物由来の微細な粒子が知られている。前者は耐熱性や耐溶剤性等の物性があり、後者は天然物由来で人体への適用が容易である等、多種多様な物性が認められている。

しかしながら、各技術分野において、このような微細な粒子の物性は、更なる向上が望まれているのが現状である。また、微細な粒子は、微細化、ナノ化していくほど製造が困難であり、その品質安定性や生産性の向上も望まれている。

このような微細な粒子を用いる技術分野のうち、本発明者らは、製剤の技術分野に着目した。すなわち、製剤の技術分野では、製剤化を容易にする、品質の安定化を図る、有用性を高める等の目的で、ほとんどすべての製剤に、賦形剤、安定剤、保存剤、成形助剤等の添加剤が添加されている（特許文献１参照）。しかし、製剤の硬度を高めるための添加剤を用いると、製剤の硬度は高まるものの、崩壊性が低下するという問題が生じる傾向にある。また、逆に製剤の崩壊性を重視すると、所望の硬度を得ることができないという問題が生じる傾向にある。

ところで、製剤のなかでも、医師等の処方箋が不要な一般用医薬品は、管理が厳格な医療用医薬品とは異なり、薬局等に陳列され、一般の人が容易に購入できるようになっている。しかしながら、薬局等の店舗構成によっては店内の温度が一定でないため、一般用医薬品は、医療用医薬品に比べ、より耐熱性、耐寒性が求められる傾向にある。また、食品、化粧品等も同様に、より耐熱性、耐寒性が求められる傾向にある。

特開２０１５－１９３６００

本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、製剤に添加することで硬度、崩壊性等の特性を容易に制御することができ、しかも、これらの特性を損なうことなく耐熱性、耐寒性を高めることができ、一般用医薬品に配合しても充分に特性を発揮することのできる、新しい微細な粒子を提供する。

本発明は、細胞壁を構成する成分から得られる、最大径が１～８００ｎｍの粒子を第１の要旨とする。

また、第１の要旨の粒子のうち、細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、球体であるものを第２の要旨とし、第１または第２の要旨の粒子のうち、細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、糖を主成分としているものを第３の要旨とする。

さらに、第１～第３の要旨のいずれかの粒子を製造する方法であって、細胞壁を溶解する工程と、該工程により得られた溶解物から粒子を分離する工程とを備える粒子の製造方法を第４の要旨とし、第１～第３の要旨のいずれかの粒子を製造する方法であって、細胞壁を構成する成分を含有する液体を準備し、該液体から粒子を分離する工程を備える粒子の製造方法を第５の要旨とする。

そして、第１～第３の要旨のいずれかの粒子を含有する組成物を第６の要旨とし、第６の要旨の組成物のうち、医薬組成物、食品組成物および化粧品組成物からなる群から選ばれた少なくとも一つである組成物を第７の要旨とする。

すなわち、本発明者らは、様々な用途に適用可能な微細な粒子を得るため、種々の検討を重ねた。その結果、これまで明らかになっていない新しい微細な微粒子を見出した。この微細な粒子は、これまでの研究によって、分散性、耐熱性、耐寒性等に優れることが明らかにされている。

このように、本発明の粒子は、細胞壁を構成する成分から得られるものであるため、天然の食物繊維に由来する健康面の利益を享受することができる。しかも、最大径が、１～８００ｎｍと極めて小さく、水系および油系のいずれにも耐溶解性を有し、かつ耐熱性、耐寒性、耐乾燥性等に優れているため、幅広い製剤に配合することができる。また、本発明の粒子を製剤に用いると、硬度、崩壊性等の特性の制御を容易に行うことができ、所望の特性を備えた製剤を得ることができる。

なかでも、細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、球体であることで、流動性、分散性に優れるものとなる。

そして、細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、糖を主成分としていることで、相対的にアレルゲンとなりやすいタンパク質含量が少ない、あるいは全くなくなるため、服用に際し、より安全性の高いものとすることができる。

さらに、本発明の粒子を製造する方法であって、細胞壁を溶解する工程と、該工程により得られた溶解物から粒子を分離する工程とを備えるものは、細胞壁を有する生物を選択することで、所望の細胞壁を構成する成分を用いることができ、得られる粒子設計の自由度を高めることができる。

また、本発明の粒子を製造する方法であって、細胞壁を構成する成分を含有する液体を準備し、該液体から粒子を分離する工程を備えるものは、予め細胞壁を構成する成分以外の夾雑物を排除することができるため、効率よく粒子を製造することができる。

そして、本発明の粒子を含有する組成物は、天然の食物繊維に由来する健康面の利益を享受することができる。

また、その組成物が、医薬組成物、食品組成物および化粧品組成物からなる群から選ばれた少なくとも一つであると、本発明の粒子がアレルゲンとなりやすいタンパク質含量が少ない、あるいは全くないものであるため、安全性をより高めることができる。

なお、本発明において「主成分」とは、その材料の特性に影響を与える成分の意味であり、その成分の含有量は、通常、材料全体の５０重量％以上である。

（ａ）は本発明の一実施の形態である粒子Ａの集合体を示した写真であり、（ｂ）は上記粒子Ａの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｃ）は上記粒子Ａの粒子径の分布を示した図である。上記粒子ＡのＲａｍａｎ分析スペクトルを示した図である。（ａ）は上記粒子Ａを超純水に分散させたものを凍結乾燥した状態を示した写真であり、（ｂ）はその粒子Ａを再度超純水に分散させた状態の写真であり、（ｃ）はその粒子Ａの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｄ）はその粒子Ａの粒子径の分布を示した図である。（ａ）は凍結乾燥した粒子を再度超純水に分散させ、超純水ごとオートクレーブした状態を示した写真であり、（ｂ）はその粒子Ａの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｃ）はその粒子Ａの粒子径の分布を示した図である。（ａ）は凍結乾燥後の粒子Ａを超純水に分散させて一週間経過後の状態を示した写真であり、（ｂ）はその粒子Ａの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｃ）はその粒子Ａの粒子径の分布を示した図である。（ａ）は本発明の一実施の形態である粒子Ｂの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｂ）はその粒子Ｂの粒子径の分布を示した図である。（ａ）は本発明の一実施の形態である粒子Ｃの集合体を示した写真であり、（ｂ）はその粒子Ｃの透過型電子顕微鏡写真である。（ａ）は本発明の一実施の形態である粒子Ｄの集合体を示した写真であり、（ｂ）は上記粒子Ｄの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｃ）は上記粒子Ｄの粒子径の分布を示した図である。上記粒子ＤのＲａｍａｎ分析スペクトルを示した図である。（ａ）は上記粒子Ｄを超純水に分散させたものを凍結乾燥した状態を示した写真であり、（ｂ）はその粒子Ｄを再度超純水に分散させた状態を示した写真であり、（ｃ）はその粒子Ｄの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｄ）はその粒子Ｄの粒子径の分布を示した図である。（ａ）は凍結乾燥した粒子を再度超純水に分散させ、超純水ごとオートクレーブした状態を示した写真であり、（ｂ）はその粒子Ｄの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｃ）はその粒子Ｄの粒子径の分布を示した図である。（ａ）は凍結乾燥後の粒子Ｄを超純水に分散させて一週間経過後の状態を示した写真であり、（ｂ）はその粒子Ｄの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｃ）はその粒子Ｄの粒子径の分布を示した図である。

つぎに、本発明を実施するための形態について説明する。但し、本発明は、この実施の形態に限定されるものではない。

本発明において「細胞壁を構成する成分」とは、植物界に属する生物、菌界に属する生物、原生生物界に属する生物、原核生物界に属する生物等の細胞にみられる細胞壁を形成する物質のことをいい、この物質を構成する糖類をも含む意味である。

上記植物界に属する生物としては、例えば、紅藻類、褐藻類、緑藻類、車軸藻類、コケ植物、シダ植物、種子植物等があげられる。また、上記菌界に属する生物としては、例えば、藻菌類、子のう菌類、担子菌類、地衣類等があげられ、原生生物界に属する生物としては、例えば、ケイ藻類があげられる。さらに、原核生物界に属する生物としては、例えば、細菌類、ラン藻類等があげられる。これらのなかでも、均一性が高いものを大量生産することが容易な点から、菌界、原生生物界、原核生物界に属する生物や、いわゆる藻類（紅藻類、褐藻類、緑藻類、車軸藻類、ケイ藻類、ラン藻類等）が材料として好ましく用いられ、とりわけ、菌界のなかでも、子のう菌類、担子菌類等に属する酵母が好ましく用いられる。また、得られた粒子が、製剤の添加剤としてより優れた効果を奏する点から、種子植物のうち、マメ科およびショウガ科に属するもの、緑藻類のうち、クロレラ科に属するもの、子のう菌類、担子菌類等のうち、サッカロマイセス属やシゾサッカロマイセス属に属する酵母が好ましく用いられる。

なお、細胞壁を構成する成分は、生物によって成分およびその配合が大きく異なっている。したがって、材料とする生物によって、粒子の構成糖の割合が異なっている。例えば、植物界に属する生物の細胞壁は、通常、２層構造になっており、セルロース、リグニン、ヘミセルロースが代表的な成分としてあげられる。そして、植物界に属する生物の中でも、その種族ごとにヘミセルロースの含有割合は大きく異なっている。また、藻類の中には２次細胞であるリグニンを有していないものがある。

さらに、酵母の細胞壁は、通常、単層になっており、β－グルカン、ガラクトマンナンが代表的な成分としてあげられる。また、細菌類に分類される乳酸菌の細胞壁は、通常、単層になっており、デキストラン、テイコ酸、細胞壁多糖が代表的な成分としてあげられる。

すなわち、本発明の粒子が、細胞壁を構成する成分から得られるものであることは、材料とする生物の種類ごとに、得られる粒子の構成糖の割合が定まることから導ける。例えば、カンゾウ（学名：Glycyrrhiza uralensis）は種子植物であるため、細胞壁は、セルロース、リグニン、ヘミセルロースを多く有しており、通常、構成糖としてグルコース６０重量％前後、リグニン１０～３０重量％、その他１０～３０重量％となっている。一方、カンゾウを材料とする本発明の粒子は、後記の実施例１（表１、表２）で示すように、構成糖としてグルコースを６４．８重量％有するとともにそれ以外の糖も含量は少ないものの多種有し、リグニンを１４．０重量％有している。このように、カンゾウの細胞壁と、カンゾウを材料とする本発明の粒子とは、構成糖およびリグニンの割合が極めて近似している。なお、以下に示す成分組成は、特に記載がない限り、すべて重量基準（重量部、重量％）で示している。

また、クロレラは緑藻類に属するため、カンゾウと同様に、その細胞壁はセルロース、リグニン、ヘミセルロースを多く有している。そして、クロレラを材料とする本発明の粒子は、後記の実施例３（表３、表４）で示すように、構成糖としてグルコースを５９．８重量％有するとともにそれ以外の糖も含量は少ないものの多種有し、リグニンを６．１重量％有している。なお、クロレラのリグニン含有量がカンゾウに比べて低くなっているのは、リグニンが植物進化の過程において最後に出現した代表的な成分であり、クロレラとカンゾウとの種別差に基づくものであると考えられる。

さらに、酵母は、通常、子のう菌類または担子菌類等に属しており、その細胞壁はβ－グルカン、ガラクトマンナンを多く有している一方、リグニンをほとんど含まない。これを反映するように、酵母を材料とする本発明の粒子は、後記の実施例４（表５、表６）で示すように、構成糖のほぼ全量がグルコースであり、リグニンを０．６重量％有する以外、グルコース以外の糖をほぼ有しない。

本発明の粒子は、このような細胞壁を構成する成分から得られるものであればよく、これらの成分を特定する必要はない。しかし、このような細胞壁を構成する成分を具体的にあげるとすれば、例えば、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、糖タンパク質、フェノール化合物等である。

上記ヘミセルロースとしては、例えば、キシログルカン、１，３－１，４－β－Ｄ－グルカン、キシラン、グルコマンナン、カロース等があげられる。上記ペクチンとしては、例えば、ホモガラクツロナン、ラムノガラクツロナンＩ、ラムノガラクツロナンII、アピオガラクツロナン、アラビノガラクタン、アラビナン、ガラクタン等があげられる。上記糖タンパク質としては、例えば、エクステンシン、アラビノガラクタンタンパク質等があげられる。上記フェノール化合物としては、例えば、リグニン等があげられる。

上記細胞壁を構成する成分は、複数の糖が結合した構成のものが多数含まれる。このような構成糖としては、例えば、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、セロトリオース、セロテトラオース、キシラン、アラビノース、マンノース、ラムノース等があげられる。上記細胞壁を構成する成分には、これらの糖も含まれる。

本発明において「粒子」とは、電子顕微鏡で観察した際、その構造が、２層構造、２重膜構造、多層構造、多重膜構造にも見えるものを意味する。すなわち、本発明の粒子は、少なくとも最外層と内部とは異なる電子密度を有している。

本発明の粒子は、最大径が１～８００ｎｍであり、１０～８００ｎｍであることがより好ましく、さらに好適には３０～５００ｎｍであり、さらに好適には４０～３００ｎｍである。そして、本発明において「粒子の最大径」とは、粒子が球体である場合にはその直径をいい、その他の形状である場合には、その最大長をいう。粒子の径は、例えば、得られた粒子を超純水に分散させ、その分散液を、濃厚系粒径アナライザーを用いて測定することができる。濃厚系粒径アナライザーを用いて粒子径を測定した場合、算出された平均粒子径をその粒子の最大径とし、算出された平均粒子径が、最大径で規定される範囲に入っていればよい。

本発明の粒子は、通常、カーボンナノチューブ等の尖った部分がない形状をしており、好ましくは球体の形状をしている。上記球体には、真球だけでなく、楕円体等の形状も含まれる。粒子の形状は、例えば、ネガティブ染色した粒子を、透過型電子顕微鏡で撮影し、その外観を観察することにより判別することができる。例えば、ペレット状に集合した粒子を超純水に分散させ、この分散液をメッシュに吸着させ、その上に染色液を載せる。そして、余剰の染色液を濾紙で吸い取り、乾燥させたものを、透過型電子顕微鏡で撮影することにより、粒子の外観を観察することができる。

本発明の粒子は、水系および油系のいずれの液体に対する分散性がよく、なかでも水系の液体に対する分散性が高い。また、その優れた分散性が長期間保たれる。粒子の分散性は、例えば、得られた粒子を超純水に分散させ、その分散液を透過型電子顕微鏡で撮影し、その分散の程度を観察することにより判別することができる。また、上記分散液を、一定期間保存後のものと対比することにより、分散性保持の程度を判別することができる。

本発明の粒子は、耐圧性および耐熱性に優れ、少なくとも２気圧までの加圧、１２１℃までの加熱により粒子径の変化がほぼない。粒子の耐圧性、耐熱性は、例えば、超純水に分散させた粒子と、この分散液を加圧および加熱したものとに含まれる粒子について、それぞれ濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出し、両者を対比したときに、両者において粒子径の分布が変動していないことから判別することができる。

本発明の粒子は、耐寒性および耐乾燥性に優れ、－５０から－８０℃までの冷却、乾燥により粒子径の変化がほぼない。粒子の耐寒性および耐乾燥性は、例えば、超純水に分散させた粒子と、この分散液を凍結乾燥（－５０℃）し、その乾燥物を再度超純水に分散させたものに含まれる粒子について、それぞれ濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出し、両者を対比したときに粒子径の分布が変動していないことから判別することができる。また、上記凍結乾燥物を－８０℃で７日間保存後、超純水に分散させたものに含まれる粒子を、同様に対比させても粒子径の分布の変動はない。

なお、加圧、加熱、冷却、乾燥を行っても、本発明の粒子の構造は変化しない。このことは、粒子を超純水に分散させたものと、この分散液を加圧および加熱したもの、または冷却および乾燥したものを再度超純水に分散させたものを、電子顕微鏡でそれらに含まれる粒子の構造を対比観察することにより判別することができる。

これらは、従来のナノ粒子である、リポソーム等では得られなかった特性である。このような粒子は、例えば、細胞壁を溶解する工程と、該工程により得られた溶解物から粒子を分離する工程とを備える方法により製造することができる。

上記細胞壁を溶解する工程としては、例えば、加熱処理、超音波処理、分解酵素による処理、アルカリ分解処理等があげられる。これらは単独でもしくは組み合わせて用いることができる。なかでも、効率化と健康面への配慮の点から、加熱処理、分解酵素による処理が好ましく、とりわけ加熱処理が好ましい。

上記加熱処理としては、例えば、細胞壁を有する生物を液体に浸漬し、この液体ごとその生物を加熱することにより、細胞壁を構成する成分を液体に溶解させて溶解物を得ることがあげられる。より詳しく説明すると、まず、材料となる、細胞壁を有する生物を準備する。この生物はどのような状態であってもよいが、効率化の点から、乾燥、粉砕されていることが好ましい。上記準備した生物を別途用意した液体に浸漬し、通常、６０℃以上で３分間以上、加熱し、溶解物を得るが、上記準備した生物が液体に浸漬された状態で加熱および乾燥されたものであれば、液体に浸漬した際にさらに加熱しなくてもよい。しかし、加熱時間が長いほど収率が高まる傾向がみられるため、加熱してもよい。上記液体としては、水、アルコール等の各種溶媒として用いられる液体を単独もしくは２種以上混合して用いてもよい。しかし、粒子を服用等することを考慮すると、健康面への配慮の点から、水もしくは水系の液体が好ましく用いられる。

なお、本発明において「細胞壁を構成する成分を液体に溶解させる」とは、基本骨格と基質とを分離する等して細胞壁の構造を崩壊させ、液体中に該成分が分散した系を形成することをいい、該成分のひとつである多糖をサイズの小さいものに分解する等により、液体中に分散させることも含む意味である。

つぎに、上記工程により得られた溶解物から、本発明の粒子を分離する工程としては、例えば、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、超遠心分離等があげられる。これらは、材料となる細胞壁を有する生物の種類等に応じて、より適するものが用いられる。なかでも、操作の容易性の点から、遠心分離、フィルターろ過が好ましく、精製度を高める点から、これらを組み合わせて用いることが好ましい。

上記遠心分離としては、粒子のサイズにもよるが、例えば、溶解物を１万～１００万Ｇで遠心分離し、その上清を採取する方法があげられる（粗分離工程）。さらに、より精製度を高めるために、例えば、上記上清をポアサイズ０．２２～０．４５μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を得るようにしてもよい（精密分離工程）。

このように、本発明の粒子は、細胞壁を構成する成分、例えばセルロース等に対し、末端分子の置換等を行うことを目的とする手法（例えば、苛性ソーダ、塩酸等を用いる手法）を採用していないため、安全性にも優れている。

上記製造例では、細胞壁を有する生物を材料として用いているが、生物ではなく、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、グルカン、プルラン、糖タンパク質、フェノール化合物等の細胞壁を構成する、具体的な成分を材料として用いてもよく、とりわけペクチン、グルカンが好ましい。すなわち、上記具体的な細胞壁を構成する成分のうち、少なくとも１成分を液体に溶解させ、細胞壁を構成する成分を含有する液体を準備し、上記液体から本発明の粒子を分離するようにしてもよい。これによると、細胞壁を構成する成分以外の、生物由来の夾雑物を予め排除することができるため、効率よく粒子を製造することができる。

本発明の粒子は、例えば、医薬品、食品、化粧品等の製剤に配合することにより、添加剤として各特性、例えば、硬度や崩壊性等の制御が可能になる。製剤において、添加剤を検討する際には、添加剤が主剤の配合量に制限を生じさせないことが重要になる。しかし、本発明の粒子は、製剤を構成する組成物に対し比較的少量の添加で各特性の制御が可能となるため、主剤の配合量に制限を生じさせることがなく、配合の自由度を高めることができる。

本発明の粒子を製剤に配合する場合には、製剤を構成する組成物全体に対し、０．０１～９５重量％含まれていることが好ましく、より好ましくは０．０１～９０重量％、さらに好ましくは０．１～５０重量％、より一層好ましくは１～２０重量％である。

つぎに、実施例を説明する。まず、本発明の粒子自体について検討を行い（実施例１～４）、ついで、これらの粒子を用いた製剤について検討を行った（実施例５～７、比較例１～３）。ただし、本発明は、これに限定されるものではない。

〔本発明の粒子自体についての検討〕
下記に示す手順で本発明の粒子をそれぞれ作製した。そして、得られた各粒子について、下記の各項目に従い、外観の観察（実施例１～４）、粒子径の分布の算出（実施例１，２，４）、構成糖およびリグニンの分析（実施例１，３，４）、Ｒａｍａｎ分析（実施例１，４）、耐熱性、耐寒性および耐乾燥性の評価（実施例１，４）、水分散性および保存性の評価（実施例１，４）を行った。

〔実施例１〕
カンゾウ〔根およびストロンで、ときには周皮を除いたもの(皮去りカンゾウ)、栃本天海堂社製、トチモトのカンゾウＰ〕を沸騰させた後に９５℃にした水に浸漬し、５０分間加熱を続けて、溶解物を得た。次にこの溶解物を２０，０００Ｇで遠心分離を行い、比較的大きなサイズの夾雑物を取り除いた上清を得た。この上清を１４０，０００Ｇで遠心分離することにより、ペレット状に集合した粒子Ａを得た。精製度を高めるために、ペレット状に集合した粒子Ａを水に分散させ、この分散液を２０，０００Ｇで２０分間遠心分離して夾雑物を取り除き、その上清を０．４５μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ社製，Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ，０．４５μｍ，ＰＶＤＦ）にて濾過し、そのろ液をさらに０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ，０．２２μｍ，ＰＶＤＦガンマ線滅菌済）で濾過し、このろ液を１４０，０００Ｇで遠心分離し、精製度を高めた粒子Ａの集合体であるペレットを得た〔図１（ａ）〕。

（外観の観察）
この粒子Ａをネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図１（ｂ）に示す。すなわち、ペレット状に集合し精製度が高まった粒子Ａを超純水に分散させ、この分散液をコロジオン貼付メッシュ（日新イーエム社製）に吸着させ、その上に酢酸ウラニル（染色剤）を載せる。そして、余剰の酢酸ウラニルを濾紙で吸い取り、乾燥させたものを、透過型電子顕微鏡（日本電子社製、ＪＥＭ－１４００ＴＣ）で撮影したものである。粒子Ａの代表的なものは、図１（ｂ）に示されるとおり、その最大径が約２００ｎｍの球体をしていた。

（粒子径の分布の算出）
上記ペレット状に集合し精製度が高まった粒子Ａについて、これを超純水で分散させ、その分散液を濃厚系粒径アナライザー（大塚電子社製、ＦＰＡＲ－１０００）を用いて、ヒストグラム法により粒子径の分布を算出した。その結果を図１（ｃ）に示す。図１（ｃ）に示されるとおり、粒子Ａの粒子径は、１９３ｎｍを平均粒子径とする正規分布を示していた。

（構成糖の分析）
上記粒子Ａの構成糖の分析は、以下のとおり行った。すなわち、まず、ペレット状に集合し精製度が高まった粒子Ａを真空乾燥機にて６０℃で約１日乾燥させたものを供試試料（無水ベース）とし、この供試試料の適量（約０．３g）を天秤でビーカーへ量り取り、７２％硫酸３ｍＬを加え、３０℃で撹拌しながら１時間放置した。この反応液を精製水８４ｍＬと混釈しながら耐圧瓶に完全に移した後、１２０℃で１時間オートクレーブで加熱分解した。加熱分解後、分解液と残渣をろ別し、ろ液と残渣の洗液を加えて１００ｍＬに定容したものを検液とした。また、分解時の糖の過分解を補正するために、単糖を用いた回収率試験を並行して行った。検液中の単糖（ラムノース、リボース、キシロース、アラビノース、フルクトース、マンノース、グルコース、ガラクトース）については、高速液体クロマトグラフ法（蛍光検出器）により定量を行った。分析に使用した装置は、ジーエルサイエンス社製、ＧＬ－７４００ＨＰＬＣｓｙｓｔｅｍである。得られた分解液の単糖濃度と試料分解量から、試料中の構成糖量を算出した。得られた結果を下記の表１に示す。なお、表１の結果は、単糖の回収率試験より求めた分解時の糖過分解補正係数（Ｓｆ）を用い構成糖量を補正したものである。また、フルクトースは過分解されやすいため、Ｓｆが大きな値となり、含まれる誤差が大きい。よって、過分解補正後のフルクトース量は参考値扱い（例えば表１中では「※２」として記載）としている。これらは以下の構成糖の分析において同じである。

上記粒子Ａは、その構成糖の分析結果を上記の表１に示すとおり、構成糖の６５重量％近くがグルコースであり、そして、その他に、フルクトース、ガラクトース、アラビノース、ラムノース等を有している。この結果は、カンゾウの細胞壁を構成する成分の多くが、セルロースおよびヘミセルロースであることと相関するものである。すなわち、セルロースは多数のβ－グルコース分子がグリコシド結合により直鎖状に重合した天然高分子であり、加熱分解により、グルコースに分解されるものである。また、ヘミセルロースは、グルコースとβ－グルカン等が結合し、通常、網状構造をとる多糖類の総称であり、加熱分解により、グルコースだけでなく、ガラクトース等の多種の糖に分解されるものである。上記構成糖の分析は、粒子Ａを加熱分解等したものを検液とし、この検液中の単糖を測定したものであり、グルコースが多く、かつガラクトース等の多種の糖を含有するという結果は、粒子Ａにはセルロースおよびヘミセルロースが多く含まれていることと矛盾しない。

（リグニンの分析）
上記粒子Ａのリグニンの分析は、以下のとおり行った。本来、リグニン測定は、試料中の可溶分(油分、タンニン、ポリフェノール等)を有機溶剤等で事前に除去するのが定法であるが、上記リグニンの分析では抽出を行っていない。すなわち、上記リグニンの分析では、酸不溶性リグニンの定量として、上記構成糖分析でろ別し得られた残渣を１０５℃で乾燥し重量をはかり分解残渣率を算出し、さらに、残渣中の灰分を測定し補正することで、酸不溶性リグニン濃度を算出した。また、酸可溶性リグニンの定量として、上記構成糖分析でろ別し得られたろ液を、ダブルビーム分光光度計（日立ハイテクサイエンス社製、Ｕ－２００１型）を用いて２１０ｎｍの波長で測定し、下記の式（１）に従い、カバ（植物名）の酸可溶性リグニンの吸光係数を用いて濃度を算出した。得られた結果を下記の表２に示す。なお、カバのリグニンの吸光係数は１１０Ｌ・ｇ^-1ｃｍ^-1近傍であることが知られている。

上記表２に示されるとおり、上記粒子Ａは、酸不溶性および酸可溶性のリグニンを１４．０重量％程度有している。この結果からも、粒子Ａが、植物界に属する生物の細胞壁を由来としていることが裏付けられる。

（Ｒａｍａｎ分析）
上記粒子ＡのＲａｍａｎ分析は、粒子Ａを少量（０．５ｍｍ四方程度）スライドガラスに載せたものに対し、ｉｎＶｉａＲｅｆｌｅｘラマンマイクロスコープを用い、下記の条件により行った。すなわち、ＬＤ励起グレーンレーザー（波長５３２ｎｍ）を用い、使用対物レンズ５０倍、照射レーザービーム径１．５μｍ、照射レーザーパワー１ｍＷ以下、測光ラマンシフト範囲４０００～１５０ｃｍ^-1、波数分解能６ｃｍ^-1、積算回数１０回とし、データベースとのスペクトル波形比較照合によるライブラリー検索により分析を行った。得られたスペクトルを図２に示す。

上記分析の結果、上記粒子Ａはセルロースに近いスペクトルを有することがわかった。セルロースは、細胞壁を構成する多糖類成分であり、構成糖はグルコースである。また、３５００～３３００ｃｍ^-1を中心とした幅の広いピークは主に水酸基に帰属するものであり、２９００ｃｍ^-1近傍にみられるピークはＣ－Ｈ結合に帰属するものである。水酸基およびＣ－Ｈ結合は、いずれも糖類にみられる基であることからも、粒子Ａが植物界に属する生物の細胞壁を由来としていることがわかる。

（耐熱性、耐寒性および耐乾燥性）
まず、精製度を高めた粒子Ａを超純水に分散させたものを凍結乾燥し〔図３（ａ）〕、その乾燥物を再度超純水に分散させたもの〔図３（ｂ）〕を、上記外観の観察と同様に観察し〔図３（ｃ）〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図３（ｄ）〕。つぎに、上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図４（ａ）〕を、さらにオートクレーブにより加熱加圧（１２１℃、２０分間）し、上記外観の観察と同様に観察し〔図４（ｂ）〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図４（ｃ）〕。これらの結果を対比させて考察した結果、凍結乾燥を行っても、加熱加圧を行っても、粒子Ａの外観および粒子径に大きな変化はみられず、粒子Ａは、耐熱性、耐寒性および耐乾燥性に優れることがわかった。

（水分散性および保存性）
上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図４（ａ）〕を、４℃の雰囲気下で１週間保存したものを図５（ａ）に示す。また、この保存後の分散液に含まれる粒子Ａを、上記外観の観察と同様に観察し〔図５（ｂ）〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図５（ｃ）〕。これらの結果は、いずれも粒子Ａの外観および粒子径に大きな変化はみられないことを示しており、長期低温保存によっても、粒子Ａの水分散性は保たれ、しかも保存性に優れることがわかった。

〔実施例２〕
ショウガ（ショウキョウ）（学名：Zingiber officinale、栃本天海堂社製、ショウキョウ刻み）を用い、実施例１と同様にして精製度を高めた粒子Ｂの集合体であるペレットを得た。

（外観の観察）
実施例１と同様にして、粒子Ｂを透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図６（ａ）に示す。図６（ａ）によると、粒子Ｂは、その最大径が約２００ｎｍの球体であった。

（粒子径の分布の算出）
上記ペレット状に集合した粒子Ｂについて、実施例１と同様にして粒子径の分布を算出した。その結果を図６（ｂ）に示す。図６（ｂ）に示されるとおり、粒子Ｂの粒子径は、２３０ｎｍの平均粒子径とする正規分布を示していた。

〔実施例３〕
クロレラ（ヤエヤマクロレラ、八重山殖産社製）を用い、実施例１と同様にして精製度を高めた粒子Ｃの集合体であるペレットを得た。図７（ａ）に、精製度を高めた粒子Ｃの集合体であるペレットを得た際の写真を示す。

（外観の観察）
実施例１と同様にして、粒子Ｃを透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図７（ｂ）に示す。粒子Ｃは、図７（ｂ）に示されるとおり、その最大径が約４００ｎｍの球体であった。

（構成糖の分析）
上記粒子Ｃの構成糖の分析を、適量の試料として粒子Ｃを約０．１５ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。その構成糖の分析結果を下記の表３に示す。

上記表３に示されるとおり、粒子Ｃの構成糖の６０重量％近くがグルコースである。そして、その他に、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、リボース、マンノース等を有している。この結果は、カンゾウと同様に、クロレラの細胞壁を構成する成分の多くが、セルロースおよびヘミセルロースであることと相関するものである。すなわち、グルコースが多く、それ以外の多種の糖を含有するという結果は、粒子Ｃにはセルロースおよびヘミセルロースが多く含まれていることと矛盾しない。

（リグニンの分析）
上記粒子Ｃのリグニンの分析を、適量の試料として粒子Ｃを約０．１５ｇ用いた以外は、実施例１と同様にして行った。そのリグニンの分析結果を下記の表４に示す。

上記の表４に示されるとおり、粒子Ｃには、リグニンが６．１重量％程度含まれている。この結果からも、粒子Ｃが、植物界に属する生物の細胞壁を由来としていることが裏付けられる。

〔実施例４〕
酵母（ＭＣフードスペシャリティーズ社製、乾燥ビール酵母）および酵母（日本ガーリック社製、天然ビール酵母）を同量ずつ混合したものを用い、実施例１と同様にして精製度を高めた粒子Ｄの集合体であるペレットを得た〔図８（ａ）〕。

（外観の観察）
実施例１と同様にして、粒子Ｄを透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図８（ｂ）に示す。粒子Ｄは、図８（ｂ）に示されるとおり、その最大径が約７０ｎｍの球体であった。

（粒子径の分布の算出）
上記ペレット状に集合した粒子Ｄについて、実施例１と同様にして粒子径の分布を算出した。その結果を図８（ｃ）に示す。図８（ｃ）に示されるとおり、粒子Ｄの粒子径は、６６ｎｍの平均粒子径とする正規分布を示していた。

（構成糖の分析）
上記粒子Ｄの構成糖の分析を、実施例１と同様にして行った。その結果を下記の表５に示す。表５に示される結果より、上記粒子Ｄの構成糖は、ほぼ全量がグルコースである。この結果は、酵母の細胞壁の多くがβ－グルカンで構成され、ヘミセルロースおよびリグニンをほぼ含有していないことに相関する。すなわち、β－グルカンは、グルコースのみからなる多糖類であるため、上記結果は、粒子Ｄにはβ－グルカンが多く含まれ、ヘミセルロースおよびリグニンを有しないことと矛盾しない。

（リグニンの分析）
上記粒子Ｄのリグニンの分析を、実施例１と同様にして行った。その結果を下記の表６に示す。表６に示される結果より、上記粒子Ｄには、リグニンがほとんど含まれていないことがわかった。この結果からも、粒子Ｄが、酵母の細胞壁を由来としていることが裏付けられる。

（Ｒａｍａｎ分析）
上記粒子ＤのＲａｍａｎ分析を、実施例１と同様にして行った。得られたスペクトルを図９に示す。分析の結果、上記粒子Ｄは、酵母の細胞壁の構成糖であるβ－グルカンの一種であるセルロースに近いスペクトルを有することがわかった。また、図９においても、主に水酸基に帰属する３５００～３３００ｃｍ^-1を中心とした幅の広いピークがみられ、Ｃ－Ｈ結合に帰属する２９００ｃｍ^-1近傍のピークがみられた。水酸基およびＣ－Ｈ結合は、いずれも糖類にみられる基であることからも、粒子Ｄは酵母の細胞壁に由来としていると考えることができる。

（耐熱性、耐寒性および耐乾燥性）
まず、精製度を高めた粒子Ｄを超純水に分散させたものを凍結乾燥した〔図１０（ａ）〕。そして、その凍結乾燥物を再度超純水に分散させたもの〔図１０（ｂ）〕を、上記外観の観察と同様にして観察し〔図１０（ｃ）〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図１０（ｄ）〕。つぎに、上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図１１（ａ）〕を、さらにオートクレーブにより加熱加圧（１２１℃、２０分間）し、上記外観の観察と同様に観察し〔図１１（ｂ）〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図１１（ｃ）〕。これらの結果を対比させて考察した結果、凍結乾燥を行っても、加熱加圧を行っても、粒子Ｄの外観および粒子径に大きな変化はみられず、粒子Ｄは、耐熱性、耐寒性および耐乾燥性に優れることがわかった。

（水分散性および保存性）
上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図１０（ｂ）〕を、４℃の雰囲気下で１週間保存したものを図１２（ａ）に示す。また、この保存後の分散液に含まれる粒子Ｄを、上記外観の観察と同様に観察したものを図１２（ｂ）に示す。そして、この保存後の分散液に含まれる粒子Ｄを上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出したものを図１２（ｃ）に示す。これらの結果は、いずれも粒子Ｄの外観および粒子径に大きな変化はみられないことを示しており、長期保存によっても、粒子Ｄは水分散性が保たれ、保存性に優れることがわかった。

〔本発明の粒子を用いた製剤についての検討〕
つぎに、実施例１，３，４で作製した粒子を用いた製剤（実施例５～７）と、これらの粒子を用いない製剤（比較例１～３）とを作製し、それぞれの溶出率（％）を算出した。また、実施例７および比較例３については、硬度および崩壊性の測定も行った。

〔実施例５、比較例１〕
実施例１で作製した粒子Ａおよび下記の材料を準備し、これらの材料を撹拌混合し得られた混合物を、滑沢としてステアリン酸マグネシウムが塗布された臼杵を備えた打錠機（市橋精機社製、ＨＡＮＤＴＡＢ－１００）を用いて６ｋＮで圧縮し、１２０ｍｇの製剤（直径７ｍｍ、曲率半径１０ｍｍ）である実施例５を得た。また、比較例１として、粒子Ａの代わりに乳糖を用いた以外は実施例５と同様にして１２０ｍｇの製剤（本発明の粒子を用いない製剤）を作製した。下記の表７に、実施例５および比較例１の配合を示す。

実施例５および比較例１について、下記の項目にしたがって溶出率（％）を算出した。その結果を後記の表８に示す。

（溶出率（％）の算出）
溶出試験器（富山産業社製、ＮＴＲ－３０００）を用いて、第１６改正日本薬局方溶出試験法にしたがってその溶出率（％）を算出した。なお、上記試験は、試験液として精製水９００ｍＬを用い、パドル法にて行った。そして、試験開始６０分後まで定期的に試験液をサンプリングし、０．４５μｍのメンブランフィルターを通したものを測定試料とした。得られた各測定試料の２７５ｎｍにおける吸光度を、紫外可視吸光光度計（島津製作所社製、ＵＶ－１８００）を用いて測定した。得られた吸光度を下記の式（２）に当てはめ、試験開始ｔ分後における溶出率（％）を算出した。
溶出率（％）＝試験開始ｔ分後の吸光度／試験開始６０分後の吸光度×１００・・・（２）

この結果から、混合物全体に対し、わずか１６．７重量％の粒子Ａの添加で、試験開始から３０分後および４０分後の時点で、約２倍の溶出率の遅延が確認できた。これより、粒子Ａは、徐放型錠剤の添加剤としての機能を有していることがわかった。

〔実施例６、比較例２〕
実施例３で作製した粒子Ｃおよび下記の材料を準備し、これらの材料を撹拌混合し得られた混合物を実施例５と同様にして、１２０ｍｇの製剤（直径７ｍｍ、曲率半径１０ｍｍ）である実施例６を得た。また、比較例２として、粒子Ｃの代わりに乳糖を用いた以外は実施例６と同様にして１２０ｍｇの製剤（本発明の粒子を用いない製剤）を作製した。下記の表９に、実施例６および比較例２の配合に示す。

実施例６および比較例２について、実施例５および比較例１と同様に上記の項目に従い、試験開始ｔ分後における溶出率（％）を算出した。その結果を下記の表１０に示す。

この結果から、混合物全体に対し、わずか１６．７重量％の粒子Ｃの添加で、試験開始から１０分後の時点で、約２倍の溶出率の遅延が確認できた。これより、粒子Ｃは、徐放型錠剤の添加剤としての機能を有していることがわかった。

〔実施例７、比較例３〕
実施例４で作製した粒子Ｄおよび下記の材料を準備し、これらの材料を撹拌混合し得られた混合物を、打錠機（市橋精機社製、ＨＡＮＤＴＡＢ－１００）を用いて８ｋＮで圧縮し、２００ｍｇの製剤（直径８ｍｍ、曲率半径１２ｍｍ）である実施例７を得た。また、比較例３として、粒子Ｄの代わりに乳糖を用いた以外は実施例７と同様にして２００ｍｇの製剤（本発明の粒子を用いない製剤）を作製した。下記の表１１に、実施例７および比較例３の配合を示す。

実施例７および比較例３について、上記の項目に準じて試験開始７０分後まで定期的に試験液をサンプリングし、吸光度を測定した。得られた値を下記の式（３）に当てはめ、試験開始ｔ分後における溶出率（％）を算出した。その結果を下記の表１２に示す。
溶出率（％）＝試験開始ｔ分後の吸光度／試験開始７０分後の吸光度×１００・・・（３）

この結果から、混合物全体に対し、わずか１０重量％の粒子Ｄの添加で、試験開始から５分後の時点から４０分後の時点までの間で、約２倍の溶出率の亢進が確認できた。これより、粒子Ｄは、速溶解・崩壊型錠剤の添加剤としての機能を有していることがわかった。

また、実施例７および比較例３について、下記の項目にしたがって硬度および崩壊時間の測定を行った。その結果を後記の表１３に示す。

（硬度の測定）
ロードセル式錠剤硬度計（岡田精工社製、ポータブルチェッカーＰＣ－３０）を用い、製剤の直径方向に徐々に荷重を加え、製剤が破砕した時の荷重をその製剤の硬度として測定した。測定はｎ＝５で行い、その平均を製剤の硬度として採用した。

（崩壊時間の測定）
崩壊試験器（富山産業社製、ＮＴ－２００）を用い、第１６改正日本薬局方崩壊試験法にしたがってその崩壊時間（崩壊性）を測定した。なお、上記試験においては、試験液として精製水１０００ｍＬを使用し、測定温度は３７±２℃とした。製剤が試験液に崩壊・分散するまでに要した時間を崩壊時間とした。

上記表１３に示された結果より、実施例７は、比較例３に対し硬度が高いことがわかった。しかしながら、実施例７は硬度が高いにもかかわらず、比較例３に対し製剤の崩壊までの時間が短くなっている。すなわち、本発明の粒子を製剤に用いると、硬度、崩壊性、および薬物の溶出性等の特性を制御する、今までにない非常に優れた添加剤になり得ることがわかった。

上記実施例においては、本発明における具体的な形態について示したが、上記実施例は単なる例示にすぎず、限定的に解釈されるものではない。当業者に明らかな様々な変形は、本発明の範囲内であることが企図されている。

本発明の粒子は、医薬品、食品、化粧品等に代表される製剤の添加剤等に適している。

Ａ粒子

Claims

細胞壁を構成する成分から得られる、最大径が１～８００ｎｍの粒子。
細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、球体である請求項１記載の粒子。
細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、糖を主成分としている請求項１または２記載の粒子。
請求項１～３のいずれか一項に記載の粒子を製造する方法であって、細胞壁を溶解する工程と、該工程により得られた溶解物から粒子を分離する工程とを備えることを特徴とする粒子の製造方法。
請求項１～３のいずれか一項に記載の粒子を製造する方法であって、細胞壁を構成する成分を含有する液体を準備し、該液体から粒子を分離する工程を備えることを特徴とする粒子の製造方法。
請求項１～３のいずれか一項に記載の粒子を含有することを特徴とする組成物。
上記組成物が、医薬組成物、食品組成物および化粧品組成物からなる群から選ばれた少なくとも一つである請求項６記載の組成物。