JPWO2018062343A1 - 粒子およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
下記に示す手順で本発明の粒子をそれぞれ作製した。そして、得られた各粒子について、下記の各項目に従い、外観の観察(実施例1〜4)、粒子径の分布の算出(実施例1,2,4)、構成糖およびリグニンの分析(実施例1,3,4)、Raman分析(実施例1,4)、耐熱性、耐寒性および耐乾燥性の評価(実施例1,4)、水分散性および保存性の評価(実施例1,4)を行った。
カンゾウ〔根およびストロンで、ときには周皮を除いたもの(皮去りカンゾウ)、栃本天海堂社製、トチモトのカンゾウP〕を沸騰させた後に95℃にした水に浸漬し、50分間加熱を続けて、溶解物を得た。次にこの溶解物を20,000Gで遠心分離を行い、比較的大きなサイズの夾雑物を取り除いた上清を得た。この上清を140,000Gで遠心分離することにより、ペレット状に集合した粒子Aを得た。精製度を高めるために、ペレット状に集合した粒子Aを水に分散させ、この分散液を20,000Gで20分間遠心分離して夾雑物を取り除き、その上清を0.45μmフィルター(Merck社製,Millex−HV,0.45μm,PVDF)にて濾過し、そのろ液をさらに0.22μmフィルター(Millex−GV,0.22μm,PVDFガンマ線滅菌済)で濾過し、このろ液を140,000Gで遠心分離し、精製度を高めた粒子Aの集合体であるペレットを得た〔図1(a)〕。
この粒子Aをネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図1(b)に示す。すなわち、ペレット状に集合し精製度が高まった粒子Aを超純水に分散させ、この分散液をコロジオン貼付メッシュ(日新イーエム社製)に吸着させ、その上に酢酸ウラニル(染色剤)を載せる。そして、余剰の酢酸ウラニルを濾紙で吸い取り、乾燥させたものを、透過型電子顕微鏡(日本電子社製、JEM−1400TC)で撮影したものである。粒子Aの代表的なものは、図1(b)に示されるとおり、その最大径が約200nmの球体をしていた。
上記ペレット状に集合し精製度が高まった粒子Aについて、これを超純水で分散させ、その分散液を濃厚系粒径アナライザー(大塚電子社製、FPAR−1000)を用いて、ヒストグラム法により粒子径の分布を算出した。その結果を図1(c)に示す。図1(c)に示されるとおり、粒子Aの粒子径は、193nmを平均粒子径とする正規分布を示していた。
上記粒子Aの構成糖の分析は、以下のとおり行った。すなわち、まず、ペレット状に集合し精製度が高まった粒子Aを真空乾燥機にて60℃で約1日乾燥させたものを供試試料(無水ベース)とし、この供試試料の適量(約0.3g)を天秤でビーカーへ量り取り、72%硫酸3mLを加え、30℃で撹拌しながら1時間放置した。この反応液を精製水84mLと混釈しながら耐圧瓶に完全に移した後、120℃で1時間オートクレーブで加熱分解した。加熱分解後、分解液と残渣をろ別し、ろ液と残渣の洗液を加えて100mLに定容したものを検液とした。また、分解時の糖の過分解を補正するために、単糖を用いた回収率試験を並行して行った。検液中の単糖(ラムノース、リボース、キシロース、アラビノース、フルクトース、マンノース、グルコース、ガラクトース)については、高速液体クロマトグラフ法(蛍光検出器)により定量を行った。分析に使用した装置は、ジーエルサイエンス社製、GL−7400 HPLC systemである。得られた分解液の単糖濃度と試料分解量から、試料中の構成糖量を算出した。得られた結果を下記の表1に示す。なお、表1の結果は、単糖の回収率試験より求めた分解時の糖過分解補正係数(Sf)を用い構成糖量を補正したものである。また、フルクトースは過分解されやすいため、Sfが大きな値となり、含まれる誤差が大きい。よって、過分解補正後のフルクトース量は参考値扱い(例えば表1中では「※2」として記載)としている。これらは以下の構成糖の分析において同じである。
上記粒子Aのリグニンの分析は、以下のとおり行った。本来、リグニン測定は、試料中の可溶分(油分、タンニン、ポリフェノール等)を有機溶剤等で事前に除去するのが定法であるが、上記リグニンの分析では抽出を行っていない。すなわち、上記リグニンの分析では、酸不溶性リグニンの定量として、上記構成糖分析でろ別し得られた残渣を105℃で乾燥し重量をはかり分解残渣率を算出し、さらに、残渣中の灰分を測定し補正することで、酸不溶性リグニン濃度を算出した。また、酸可溶性リグニンの定量として、上記構成糖分析でろ別し得られたろ液を、ダブルビーム分光光度計(日立ハイテクサイエンス社製、U−2001型)を用いて210nmの波長で測定し、下記の式(1)に従い、カバ(植物名)の酸可溶性リグニンの吸光係数を用いて濃度を算出した。得られた結果を下記の表2に示す。なお、カバのリグニンの吸光係数は110L・g-1cm-1近傍であることが知られている。
上記粒子AのRaman分析は、粒子Aを少量(0.5mm四方程度)スライドガラスに載せたものに対し、inVia Reflexラマンマイクロスコープを用い、下記の条件により行った。すなわち、LD励起グレーンレーザー(波長532nm)を用い、使用対物レンズ50倍、照射レーザービーム径1.5μm、照射レーザーパワー1mW以下、測光ラマンシフト範囲4000〜150cm-1、波数分解能6cm-1、積算回数10回とし、データベースとのスペクトル波形比較照合によるライブラリー検索により分析を行った。得られたスペクトルを図2に示す。
まず、精製度を高めた粒子Aを超純水に分散させたものを凍結乾燥し〔図3(a)〕、その乾燥物を再度超純水に分散させたもの〔図3(b)〕を、上記外観の観察と同様に観察し〔図3(c)〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図3(d)〕。つぎに、上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図4(a)〕を、さらにオートクレーブにより加熱加圧(121℃、20分間)し、上記外観の観察と同様に観察し〔図4(b)〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図4(c)〕。これらの結果を対比させて考察した結果、凍結乾燥を行っても、加熱加圧を行っても、粒子Aの外観および粒子径に大きな変化はみられず、粒子Aは、耐熱性、耐寒性および耐乾燥性に優れることがわかった。
上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図4(a)〕を、4℃の雰囲気下で1週間保存したものを図5(a)に示す。また、この保存後の分散液に含まれる粒子Aを、上記外観の観察と同様に観察し〔図5(b)〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図5(c)〕。これらの結果は、いずれも粒子Aの外観および粒子径に大きな変化はみられないことを示しており、長期低温保存によっても、粒子Aの水分散性は保たれ、しかも保存性に優れることがわかった。
ショウガ(ショウキョウ)(学名:Zingiber officinale、栃本天海堂社製、ショウキョウ刻み)を用い、実施例1と同様にして精製度を高めた粒子Bの集合体であるペレットを得た。
実施例1と同様にして、粒子Bを透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図6(a)に示す。図6(a)によると、粒子Bは、その最大径が約200nmの球体であった。
上記ペレット状に集合した粒子Bについて、実施例1と同様にして粒子径の分布を算出した。その結果を図6(b)に示す。図6(b)に示されるとおり、粒子Bの粒子径は、230nmの平均粒子径とする正規分布を示していた。
クロレラ(ヤエヤマクロレラ、八重山殖産社製)を用い、実施例1と同様にして精製度を高めた粒子Cの集合体であるペレットを得た。図7(a)に、精製度を高めた粒子Cの集合体であるペレットを得た際の写真を示す。
実施例1と同様にして、粒子Cを透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図7(b)に示す。粒子Cは、図7(b)に示されるとおり、その最大径が約400nmの球体であった。
上記粒子Cの構成糖の分析を、適量の試料として粒子Cを約0.15gを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。その構成糖の分析結果を下記の表3に示す。
上記粒子Cのリグニンの分析を、適量の試料として粒子Cを約0.15g用いた以外は、実施例1と同様にして行った。そのリグニンの分析結果を下記の表4に示す。
酵母(MCフードスペシャリティーズ社製、乾燥ビール酵母)および酵母(日本ガーリック社製、天然ビール酵母)を同量ずつ混合したものを用い、実施例1と同様にして精製度を高めた粒子Dの集合体であるペレットを得た〔図8(a)〕。
実施例1と同様にして、粒子Dを透過型電子顕微鏡により撮影した写真を図8(b)に示す。粒子Dは、図8(b)に示されるとおり、その最大径が約70nmの球体であった。
上記ペレット状に集合した粒子Dについて、実施例1と同様にして粒子径の分布を算出した。その結果を図8(c)に示す。図8(c)に示されるとおり、粒子Dの粒子径は、66nmの平均粒子径とする正規分布を示していた。
上記粒子Dの構成糖の分析を、実施例1と同様にして行った。その結果を下記の表5に示す。表5に示される結果より、上記粒子Dの構成糖は、ほぼ全量がグルコースである。この結果は、酵母の細胞壁の多くがβ−グルカンで構成され、ヘミセルロースおよびリグニンをほぼ含有していないことに相関する。すなわち、β−グルカンは、グルコースのみからなる多糖類であるため、上記結果は、粒子Dにはβ−グルカンが多く含まれ、ヘミセルロースおよびリグニンを有しないことと矛盾しない。
上記粒子Dのリグニンの分析を、実施例1と同様にして行った。その結果を下記の表6に示す。表6に示される結果より、上記粒子Dには、リグニンがほとんど含まれていないことがわかった。この結果からも、粒子Dが、酵母の細胞壁を由来としていることが裏付けられる。
上記粒子DのRaman分析を、実施例1と同様にして行った。得られたスペクトルを図9に示す。分析の結果、上記粒子Dは、酵母の細胞壁の構成糖であるβ−グルカンの一種であるセルロースに近いスペクトルを有することがわかった。また、図9においても、主に水酸基に帰属する3500〜3300cm-1を中心とした幅の広いピークがみられ、C−H結合に帰属する2900cm-1近傍のピークがみられた。水酸基およびC−H結合は、いずれも糖類にみられる基であることからも、粒子Dは酵母の細胞壁に由来としていると考えることができる。
まず、精製度を高めた粒子Dを超純水に分散させたものを凍結乾燥した〔図10(a)〕。そして、その凍結乾燥物を再度超純水に分散させたもの〔図10(b)〕を、上記外観の観察と同様にして観察し〔図10(c)〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図10(d)〕。つぎに、上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図11(a)〕を、さらにオートクレーブにより加熱加圧(121℃、20分間)し、上記外観の観察と同様に観察し〔図11(b)〕、上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出した〔図11(c)〕。これらの結果を対比させて考察した結果、凍結乾燥を行っても、加熱加圧を行っても、粒子Dの外観および粒子径に大きな変化はみられず、粒子Dは、耐熱性、耐寒性および耐乾燥性に優れることがわかった。
上記凍結乾燥物を超純水に分散させたもの〔図10(b)〕を、4℃の雰囲気下で1週間保存したものを図12(a)に示す。また、この保存後の分散液に含まれる粒子Dを、上記外観の観察と同様に観察したものを図12(b)に示す。そして、この保存後の分散液に含まれる粒子Dを上記濃厚系粒径アナライザーで粒子径の分布を算出したものを図12(c)に示す。これらの結果は、いずれも粒子Dの外観および粒子径に大きな変化はみられないことを示しており、長期保存によっても、粒子Dは水分散性が保たれ、保存性に優れることがわかった。
つぎに、実施例1,3,4で作製した粒子を用いた製剤(実施例5〜7)と、これらの粒子を用いない製剤(比較例1〜3)とを作製し、それぞれの溶出率(%)を算出した。また、実施例7および比較例3については、硬度および崩壊性の測定も行った。
実施例1で作製した粒子Aおよび下記の材料を準備し、これらの材料を撹拌混合し得られた混合物を、滑沢としてステアリン酸マグネシウムが塗布された臼杵を備えた打錠機(市橋精機社製、HANDTAB−100)を用いて6kNで圧縮し、120mgの製剤(直径7mm、曲率半径10mm)である実施例5を得た。また、比較例1として、粒子Aの代わりに乳糖を用いた以外は実施例5と同様にして120mgの製剤(本発明の粒子を用いない製剤)を作製した。下記の表7に、実施例5および比較例1の配合を示す。
溶出試験器(富山産業社製、NTR−3000)を用いて、第16改正日本薬局方溶出試験法にしたがってその溶出率(%)を算出した。なお、上記試験は、試験液として精製水900mLを用い、パドル法にて行った。そして、試験開始60分後まで定期的に試験液をサンプリングし、0.45μmのメンブランフィルターを通したものを測定試料とした。得られた各測定試料の275nmにおける吸光度を、紫外可視吸光光度計(島津製作所社製、UV−1800)を用いて測定した。得られた吸光度を下記の式(2)に当てはめ、試験開始t分後における溶出率(%)を算出した。
溶出率(%)=試験開始t分後の吸光度/試験開始60分後の吸光度×100・・・(2)
実施例3で作製した粒子Cおよび下記の材料を準備し、これらの材料を撹拌混合し得られた混合物を実施例5と同様にして、120mgの製剤(直径7mm、曲率半径10mm)である実施例6を得た。また、比較例2として、粒子Cの代わりに乳糖を用いた以外は実施例6と同様にして120mgの製剤(本発明の粒子を用いない製剤)を作製した。下記の表9に、実施例6および比較例2の配合に示す。
実施例4で作製した粒子Dおよび下記の材料を準備し、これらの材料を撹拌混合し得られた混合物を、打錠機(市橋精機社製、HANDTAB−100)を用いて8kNで圧縮し、200mgの製剤(直径8mm、曲率半径12mm)である実施例7を得た。また、比較例3として、粒子Dの代わりに乳糖を用いた以外は実施例7と同様にして200mgの製剤(本発明の粒子を用いない製剤)を作製した。下記の表11に、実施例7および比較例3の配合を示す。
溶出率(%)=試験開始t分後の吸光度/試験開始70分後の吸光度×100・・・(3)
ロードセル式錠剤硬度計(岡田精工社製、ポータブルチェッカーPC−30)を用い、製剤の直径方向に徐々に荷重を加え、製剤が破砕した時の荷重をその製剤の硬度として測定した。測定はn=5で行い、その平均を製剤の硬度として採用した。
崩壊試験器(富山産業社製、NT−200)を用い、第16改正日本薬局方崩壊試験法にしたがってその崩壊時間(崩壊性)を測定した。なお、上記試験においては、試験液として精製水1000mLを使用し、測定温度は37±2℃とした。製剤が試験液に崩壊・分散するまでに要した時間を崩壊時間とした。
Claims (7)
- 細胞壁を構成する成分から得られる、最大径が1〜800nmの粒子。
- 細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、球体である請求項1記載の粒子。
- 細胞壁を構成する成分から得られる粒子が、糖を主成分としている請求項1または2記載の粒子。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の粒子を製造する方法であって、細胞壁を溶解する工程と、該工程により得られた溶解物から粒子を分離する工程とを備えることを特徴とする粒子の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の粒子を製造する方法であって、細胞壁を構成する成分を含有する液体を準備し、該液体から粒子を分離する工程を備えることを特徴とする粒子の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の粒子を含有することを特徴とする組成物。
- 上記組成物が、医薬組成物、食品組成物および化粧品組成物からなる群から選ばれた少なくとも一つである請求項6記載の組成物。
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