JP2023028872A - 経口摂取用老化関連ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】白鶴霊芝のエタノール抽出物の有する新規な性質を明らかにし、これに基づいて新たな用途を提供する。【解決手段】白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有する経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤及び経口摂取用抗老化剤。【選択図】図２

Description

本発明は、白鶴霊芝のエタノール抽出物を含有する経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤及び経口摂取用抗老化剤に関する。

白鶴霊芝（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ ｎａｓｕｔｕｓ（Ｌ．）Ｋｕｒｚ。白鶴霊芝草ともいう。）は、インド南部デカン高原の原産とされるリナカンサス属キツネノマゴ科に属する常緑小低木である。白鶴霊芝の全草は駆虫、消炎、皮膚真菌に対する抗菌作用があることが知られ（例えば、非特許文献１参照。）、主に中国、台湾等において、また、最近では日本国において漢方薬や食品として用いられている。その他、本出願人による以前の出願で、白鶴霊芝に活性酸素消去能があること（例えば、特許文献１参照。）、排泄促進作用があること（例えば、特許文献２参照。）、抗アレルギー作用があること（例えば、特許文献３参照。）及び抗腫瘍作用があること（例えば、特許文献４参照。）等が開示されている。

特開平９－１４３０９１号公報 特開平９－１６９６６２号公報 特開２００１－１０９６４号公報 特開２００２－５３４８１号公報

原色牧野和漢薬草大図鑑、４９２頁、北隆館、１９８８年

しかしながら、白鶴霊芝の抽出物が経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤及び経口摂取用抗老化剤の有効成分となることは知られていない。

本発明は、白鶴霊芝の抽出物の有する新規な性質を明らかにし、これに基づいて新たな用途を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために本発明者らは、白鶴霊芝の抽出物の新たな有用性について鋭意検討した結果、動物モデルを用いた実験系において、白鶴霊芝のエタノール抽出物を含む組成物が、経口摂取により血中のＩＬ－１β濃度の上昇抑制作用、脳内のアミロイド－β濃度の上昇抑制作用、毛髪の改善作用及び抗老化作用を有することを見出して本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。

（１）白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有し、経口摂取することでＩＬ－１βの血中濃度の上昇を抑制する経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
（２）前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である（１）に記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
（３）医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である（１）又は（２）に記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
（４）前記飲食品が健康増進用飲食品である（３）に記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
（５）経口摂取によりＩＬ－１βの血中濃度の上昇を抑制することで、慢性閉塞性肺疾患、自己炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎及び動脈硬化のうち少なくとも１つを緩和、改善、抑制、予防又は治療するものである（１）～（４）のいずれかに記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
（６）白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有し、経口摂取することでアミロイド－βの脳内濃度の上昇を抑制する経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
（７）前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である（６）に記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
（８）医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である（６）又は（７）に記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
（９）前記飲食品が健康増進用飲食品である（８）に記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
（１０）経口摂取によりアミロイド－βの脳内濃度の上昇を抑制することで、脳アミロイドアンギオパチーを緩和、改善、抑制、予防又は治療するものである（６）～（９）のいずれかに記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
（１１）白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有し、経口摂取することで毛髪の光沢の低下を抑制する経口摂取用毛髪改善剤。
（１２）前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である（１１）に記載の経口摂取用毛髪改善剤。
（１３）医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である（１１）又は（１２）に記載の経口摂取用毛髪改善剤。
（１４）前記飲食品が美容用飲食品又は健康増進用飲食品である（１３）に記載の経口摂取用毛髪改善剤。
（１５）白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有する、経口摂取用抗老化剤。
（１６）前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である（１５）に記載の経口摂取用抗老化剤。
（１７）医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である（１５）又は（１６）に記載の経口摂取用抗老化剤。
（１８）前記飲食品が美容用飲食品又は健康増進用飲食品である（１７）に記載の経口摂取用抗老化剤。
（１９）ヒトまたは非ヒト哺乳動物におけるＩＬ－１βの血中濃度上昇抑制、アミロイド－βの脳内濃度上昇抑制、毛髪の改善及び抗老化のために用いる、経口摂取用の医薬品、飲食品又はこれらに配合する有効成分組成物を製造するための、白鶴霊芝のエタノール抽出物の使用。

本発明によれば、白鶴霊芝のエタノール抽出物の有する新規な用途として、白鶴霊芝のエタノール抽出物を含む経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤、経口摂取用抗老化剤及び美容用飲食品・健康増進用飲食品を提供することができる。

図１は、本発明の有効成分組成物の製造工程を示すフロー図である。 図２は、本発明の有効成分組成物等を投与した老化促進マウスの試験開始１３３日目における血清のＩＬ－１βの濃度を示すグラフである。 図３は、本発明の有効成分組成物等を投与した老化促進マウスの試験開始１３３日目における脳ホモジネート上清のアミロイド－βの濃度を示すグラフである。 図４は、本発明の有効成分組成物等を投与した老化促進マウスの２２週齢における毛の光沢スコアを示すグラフである。 図５は、本発明の有効成分組成物等を投与した老化促進マウスの１１項目の老化度評価スコアの平均値の経時変化を示すグラフである。 図６は、本発明の有効成分組成物等を投与した老化促進マウスの２２週齢における１１項目の老化度評価スコアの平均値を示すグラフである。

次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。

（Ｉ）白鶴霊芝のエタノール抽出物
本発明の一実施形態における有効成分は、白鶴霊芝（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ ｎａｓｕｔｕｓ（Ｌ．）Ｋｕｒｚ）からエタノールにより抽出されたエタノール抽出物である。なお、本明細書において単に「エタノール」という場合には、「全質量のうちエタノールの質量が３０％以上である溶媒」のことをいう。つまり、「エタノール」には、いわゆる無水エタノールだけではなく、エタノールと他の溶媒との混合溶媒も含む。

（ＩＩ）経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤
本明細書における「経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤」とは、ＩＬ－１βの血中濃度の上昇を抑制するもののことをいう。ＩＬ－１βは炎症性サイトカインの一種であり、ＩＬ－１βの持続的な産生は、骨、間接、血管、筋肉等における種々の慢性炎症性疾患を発生させる（小野嵜、インターロイキン１：細胞増殖制御から慢性炎症性疾患まで、ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ、１３３（６）、６４５－６６０、２０１３）。具体的には、ＩＬ－１βは慢性閉塞性肺疾患（肺気腫）、自己炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎、動脈硬化といった疾患と関連があることが知られている。なお、本発明における「経口摂取用」とは、飲食（服用を含む）により摂取するためのものであることをいう。

（ＩＩＩ）経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤
本明細書における「経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤」とは、アミロイド－βの脳内濃度の上昇を抑制するもののことをいう。後述するようにアミロイド－βはアルツハイマー型認知症に深いかかわりがある他、髄膜及び脳内の血管壁に沈着することで脳アミロイドアンギオパチー及びこれに伴う脳出血の原因ともなる（古和ら、高齢者脳卒中の現状に寄せて ２．高齢者の脳出血の現状、日本老年医学会雑誌、５４巻４号、５１４－５１８、２０１７）。

（ＩＶ）経口摂取用毛髪改善剤
本明細書における「経口摂取用毛髪改善剤」とは、毛髪の改善に資するもの、特に毛髪の光沢の低下を予防又は改善するもののことをいう。後述する実施例２からも明らかなように、本発明の経口摂取用毛髪改善剤は、毛髪の光沢の低下に対して顕著な効果を有する。

（Ｖ）経口摂取用抗老化剤
用語、「抗老化」とは、広く定義されるものであり、心筋梗塞、脳梗塞、骨粗鬆症、関節リウマチ、白内障などの老化（加齢）関連疾患やしみ、しわ、くすみなどの皮膚疾患を緩和、改善、抑制、予防又は治療することをいう。好ましくは、加齢に伴う慢性的な炎症や加齢に伴う有害物質の蓄積及び沈着に起因する疾患に対して緩和、改善、抑制、予防又は治療といった作用を有することをいう。また、外的因子（紫外線、空気の乾燥等）や加齢に起因する皮膚や毛髪の老化予防や改善作用を有することもいう。用語、「抗老化剤」とは、このような抗老化のために用いられる薬剤を含む。

（ＶＩ）剤の形態
本実施形態の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤及び経口摂取用抗老化剤は、医薬品、飲食品又はこれらに配合する有効成分組成物の形態で用いることができる。当該有効成分組成物として用いる場合、白鶴霊芝のエタノール抽出物をそのまま用いることのみならず、当該白鶴霊芝のエタノール抽出物の粗精製品あるいは精製品も用いることができる。

本実施形態の有効成分組成物は、適当な可食性担体（食品素材）、製薬上許容される担体を適宜配合して、後述するような飲食品、医薬品等の形態に調製されるのが好ましい。以下に、当該有効成分組成物を含む医薬品及び飲食品の形態について具体的に説明する。

（医薬品）
本実施形態の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤及び経口摂取用抗老化剤を医薬品とする場合は、白鶴霊芝のエタノール抽出物と共に製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて、一般的な医薬組成物の形態に調製されて実用される。該製剤担体としては、通常、この分野で使用されることの知られている充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。

医薬組成物の投与単位形態としては、各種の形態が選択できるが、好適には経口投与用製剤が挙げられる。経口投与製剤の代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。

錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。

丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。

更に、医薬組成物中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。

上記医薬組成物の投与方法は特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。また、その投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常成人一日あたり０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～３００ｍｇ、さらに好ましくは１０～１５０ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１～４回に分けてヒトに投与することができる。

（飲食品）
本実施形態の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤及び経口摂取用抗老化剤を飲食品とする場合は、有効成分組成物を加えたお茶としての形態の食品や、有効成分組成物を配合した加工食品としての形態の食品を例示することができる。お茶としては、白鶴霊芝自体の葉・茎若しくは根の乾燥物と混合して、又は、他の茶原料と混合して用いることが好ましい。茶原料としては、緑茶、ウーロン茶、プーアル茶、紅茶、ほうじ茶、玄米茶、杜仲茶、柿の葉茶、桑の葉茶等、通常お茶として用いられるものであれば、どのようなものでも用いることができる。なお、白鶴霊芝の葉・茎または根の乾燥物は、他の茶原料と同様に焙煎して用いることもできる。

他の飲食品形態の例としては、漬物、味噌、発酵茶、パン等の発酵食品、離乳食、粉ミルク、ベビーフード等の乳児用食品、発泡製剤、ガム、グミ、プディング等の菓子類、麺類、カプセル、顆粒、粉末、錠剤等の栄養補助食品等、発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料、発酵豆乳飲料等を挙げることができる。「発酵乳」とは、乳又は乳製品を乳酸菌、ビフィズス菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものをいう。従って該発酵乳には飲料形態と共にヨーグルト形態が包含される。また「乳酸菌飲料」とは、乳又は乳製品を乳酸菌、ビフィズス菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものを主原料としてこれを水に薄めた飲料をいう。

本明細書における「飲食品」とは、専ら飲食のために経口的に用いられる形態のものすべてを含み（例えば、飲料も含む）、錠剤などの形態のものであっても、専ら飲食のために用いられる限りにおいては、本明細書における飲食品に含まれる。例えば、ＩＬ－１βの血中濃度上昇抑制、アミロイド－βの脳内濃度上昇抑制、毛髪改善又は抗老化をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した、健康食品、健康補助食品、病者用食品、栄養補助食品、あるいは、厚生労働省の定める保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）も、本明細書における飲食品に含まれる。

好ましい実施形態としては、健康増進用飲食品が挙げられる。健康増進用飲食品とは、加齢に伴う慢性的な炎症等を緩和等することにより対象者の体調を整え、体質を改善するもののことをいう。本明細書において、「健康増進」とは、単に病気でない、虚弱でないというのみならず、身体的、精神的そして社会的に完全に良好な状態である「健康」状態を増強することを意味する。

また、好ましい実施形態として、美容用飲食品も挙げられる。用語、「美容用」とは、対象者の老化の進行等を抑制して美的外観を維持又は改善するための用途のことをいい、これには、肌や髪の美的外観の改善等も含まれる。特に、後述する実施例において、本実施形態の有効成分を経口摂取した老化マウスの毛並み、毛の艶及び眼周囲の皮膚状態等の老化指標が改善されることから、対象者の老化を抑制することによる美的外観の改善、すなわち美容用の飲食品としての用途が期待される。また、本実施形態の美容用飲食品は、さらに、経口摂取用の皮膚（肌）老化防止（予防）剤、皮膚（肌）の弾力性改善剤、抗皺剤、肌質改善剤、髪美容改善剤、便通改善剤、体調改善剤、体質改善剤として使用することもできる。

また、この健康増進用飲食品及び美容用飲食品は、上記の有効成分以外にも、生理活性物質、（食品）原料、（食品）添加物などを適宜必要に応じて含有していてもよい。添加物・原料としては、例えば、食品等の製造・加工・保存に際して、添加・混和・浸潤その他の方法によって使用するものが挙げられ、例えば、賦形剤、増量剤、増粘剤、結合剤、滑沢剤、安定化剤、着色剤、乳化剤、可溶化剤、着色料、香味料、調味料、香辛料、甘味料、保存料、香料として通常用いられているようなものが挙げられる。

本実施形態による飲食品における有効成分組成物の含有量としては特に限定されるものではなく、適宜決定できる。ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制、アミロイド－β脳内濃度上昇抑制、毛髪改善又は抗老化の効果を奏する観点から、それぞれの飲食品の全質量に対して、例えば、０．０１質量％以上が好ましく、０．１質量％以上がより好ましく、１質量％以上がより好ましい。一方、飲食品中における有効成分組成物の含有量の上限は特に制限されず、例えば、有効成分組成物としての白鶴霊芝のエタノール抽出物をそのまま摂取してもよいが、通常は、飲食品の形態に合わせて適宜調整することができる。

（ＶＩＩ）有効成分組成物の製造方法
本発明の他の側面では、ＩＬ－１βの血中濃度上昇抑制作用、アミロイド－βの脳内濃度上昇抑制作用、毛髪改善作用及び抗老化作用を有する有効成分組成物の製造方法を提供する。図１は、当該有効成分組成物の製造工程を示すフロー図である。この方法は、白鶴霊芝を粉砕する粉砕工程（Ｓ０１）と、白鶴霊芝からエタノールによる抽出を行う抽出工程（Ｓ０２）と、抽出に用いた溶媒（エタノール）を除去する溶媒除去工程（Ｓ０３）と、を含む。

粉砕工程（Ｓ０１）は、例えば、通常用いられる粉砕機等を用いて実施することができる。白鶴霊芝については、原料である白鶴霊芝の葉、茎、根、花等を、適当な時期に採取した後、そのままのもの、又は、通常通風乾燥等の乾燥工程に付し、原料としたものを用いることができる。抽出原料となる白鶴霊芝のどの部位を用いるか、どの程度細かく粉砕するか等については、白鶴霊芝の状態や製造すべき製品の形態等に応じて適宜決定することができる。なお、白鶴霊芝の粉砕は抽出を促進するために行うものであるため、白鶴霊芝を粉砕する代わりに細切しても同じような効果が得られる。また、白鶴霊芝を粉砕しなくても十分なエタノール抽出物が得られる場合には、粉砕工程を実施しなくてもよい。

抽出工程（Ｓ０２）は、白鶴霊芝及びエタノールを用いる限り、通常工業的・実験的に用いられる公知の抽出方法（例えば、「ファイトメディシン、第１６巻、９２９～９３４ページ、２００９年」を参照。）により行うことができる。白鶴霊芝から抽出を行うときには、溶媒として含水エタノール（エタノールと水との混合溶媒）を用いることが好ましく、９０％（ｗ／ｗ）エタノールを用いることが一層好ましい。

抽出温度は、通常０～１００℃、好ましくは５～８０℃である。溶媒が沸騰する条件で抽出を行う場合には、溶媒を還流させながら抽出を行うことが好ましい。抽出時間は、１時間～１０日間程度であり、溶媒量は、乾燥原料あたり１回ごとに通常１～３０倍重量、好ましくは５～１０倍重量である。抽出操作は、攪拌であっても単なる浸漬であってもよい。抽出操作は、必要に応じて複数回繰り返してもよい。また、条件が異なる抽出操作を組み合わせてもよい。さらに、上記の操作で得られた粗抽出液から不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除く操作を行うことが好ましい。

溶媒除去工程（Ｓ０３）では、真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥などにより溶媒（エタノール）を除去し、白鶴霊芝のエタノール抽出物を固形乾燥物（乾固物）として回収することができる。かくして得られる白鶴霊芝のエタノール抽出物は、本発明の有効成分組成物として利用することができる。なお、最終的に医薬品又は飲食品とするにあたって、この段階で溶媒除去を行う必要が無い場合（例えば、医薬品又は飲食品の材料としてエタノールを含むことが好ましい場合）には、溶媒除去工程を省略してもよい。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。

（実施例１）白鶴霊芝のエタノール抽出物の製造
まず、原料として白鶴霊芝（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ ｎａｓｕｔｕｓ（Ｌ．）Ｋｕｒｚ）の根の乾燥物２ｋｇを準備し、汎用の粉砕機で粉砕した。続いて、白鶴霊芝を１０Ｌの９０％（ｗ／ｗ）エタノールに浸し、溶媒を８０℃で１時間還流させる還流抽出により抽出液を得た。抽出液と抽出残渣とはフィルター濾過により分離し、濾液を得た。濾過にはアドバンテック東洋株式会社製の定性濾紙Ｎｏ．２を用いた。当該抽出を同じ原料に対して計３回おこなった。３回分の濾液から減圧により溶媒を取り除き、白鶴霊芝のエタノール抽出物の固形乾燥物７７．８ｇを得た。実験での取り扱いを容易にするため、白鶴霊芝のエタノール抽出物に９倍量（７００．２ｇ）のデキストリンを適量の９０％（ｗ／ｗ）エタノールとともに添加してよく混ぜた後、再度の減圧により溶媒を取り除き、実験用有効成分組成物（白鶴霊芝のエタノール抽出物１０％とデキストリン９０％との混合物）を得た。デキストリンは、松谷化学工業株式会社製のパインデックス＃２を用いた。

（実施例２）老化動物モデルによるＩＬ－１βの血中濃度上昇抑制作用、アミロイド－βの脳内濃度上昇抑制作用、毛髪改善作用及び抗老化作用の評価
ＡＫＲ／Ｊ系統の選択的な近親交配により、老化促進マウス（ＳＡＭ）が作製されている。このマウスは、老人性アミロイドーシス、老人性骨粗しょう症、白内障、免疫応答の低下、学習・記憶障害などの早期老化現象を示す。老化促進マウス・プローン８（ＳＡＭＰ８）は、脳の萎縮が早期に始まり、傾眠・記憶障害や情緒障害を伴うことから、特に認知症の研究に広く用いられているモデルである（Ｔ．Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｍｅｃｈ． Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．１７（１９８１）１８３－１９４）。ＳＡＭＰ８の寿命は、対照株であるＳＡＭ／ｒｅｓｉｓｔａｎｔ１（ＳＡＭＲ１）のほぼ半分である。老化促進マウスＳＡＭＰ８は、高脂肪食を与えることで、さらに老化が加速し、ＩＩ型糖尿病を発症しながら、アルツハイマー型認知症の病理モデルとなることが知られている（Ｍｅｈｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ａｇｉｎｇ－Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｍｉｃｅ Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ－Ｌｉｋｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｍｏｒｙ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ３９：１４５－１６２，２０１４）。

３－１．マウス
雄のＳＡＭＰ８／ＴａＨｓｄ（老化促進マウス）はＥｎｖｉｇｏ ＲＭＳ Ｂ．Ｖ．（オランダ）から入手した。ベンダーのハウジングポリシーによると、ＳＡＭＰ８マウスは６週齢でシングルハウジングにすることになっている。到着時、マウスは４～７週齢であった。６～７週齢のＳＡＭＰ８マウスは出荷前にシングルハウジングされており、バッチ１として割り当てられた。４～５週齢のＳＡＭＰ８マウスは５～６週齢（検疫後）にシングルハウジングされ、バッチ２として割り当てられた。すべてのマウスは、３６５×２０７×１４０ｍｍのケージ（キャップなし）に単身で収容し、温度は２３±２℃、午前７時３０分から１２時間の明暗サイクルで飼育した。バッチ２のマウスはバッチ１のマウスよりも２週間遅く実験を開始し、年齢を合わせた。馴化のために、試験開始１７日前からすべてのマウスにＣｏｎｔｒｏｌ ｄｉｅｔ（ＬＦＤ，Ｄ１２４５０Ｊｉ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を与えた。ＳＡＭＰ８の一部のマウスは、試験開始時の１０～１１週齢時に高脂肪食（ＨＦＤ，Ｄ１２４９２ｉ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）に変更した。ＨＦＤとＬＦＤは週に３回給餌した。動物の健康状態は毎日モニターした。水と餌は自由摂取とした。餌の一日あたりの消費量は、１週間ごとに測定した。水の消費量は２～３週間ごとに２４時間の飲水量を測定した。体重は、試験期間中、週に２回測定した。マウスの体重の変化率を算出した。すべての動物実験および手順は、台湾工業技術研究院の施設内動物管理・使用委員会Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＴＲＩ－ＩＡＣＵＣ－２０１９－０６９Ｖ１）により承認された。

３－２．投与方法
１０～１１週齢の雄性ＳＡＭＰ８マウスを３群に分けた（各群ｎ＝９、バッチ１とバッチ２の両方で構成、バッチ２では４～５匹／群とした）。（１）ＬＦＤ（低脂肪食）群、（２）ビークル（高脂肪食）群（３）ＲＮ３０（高脂肪食）群の３群である。ビークル（高脂肪食）群とＲＮ３０（高脂肪食）群（実施例１で調製した実験用有効成分組成物を３００ｍｇ／ｋｇ／日、つまり、白鶴霊芝のエタノール抽出物を３０ｍｇ／ｋｇ／日で投与した群）には試験開始０日目から高脂肪食を摂食させ、ＬＦＤ群には低脂肪食を摂食させた。また、ＬＦＤ（低脂肪食）群とビークル（高脂肪食）群には、デキストリン１５００ｍｇ／ｋｇ／日を投与し、ＲＮ３０（高脂肪食）群には、実験用有効成分組成物３００ｍｇ／ｋｇ／日（白鶴霊芝のエタノール抽出物３０ｍｇ／ｋｇ／日）と共にデキストリン１２００ｍｇ／ｋｇ／日を投与した。投与方法は、５ｍＬ／ｋｇ／日を１２２日間（試験開始０～１２１日目）、毎日ゾンデを用いて経口投与を行った。１２２日目から１３２日目の間は、検体の投与を行わないで試験を継続し、１３３日目でマウスを犠牲にした。

統計解析は、解析ソフトＥＺＲ（Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ４．０．３，Ｒコマンダー２．７－１）により、図２は、反復測定の分散分析（Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ ＡＮＯＶＡ）、図３～６は、一元配置のＡＮＯＶＡを用いて解析し、ＤｕｎｎｅｔｔのＰｏｓｔ－ｈｏｃ解析を行った。＊＊ｐ＜０．０１、 ＊＊＊ｐ＜０．００１

３－３．組織の回収
マウスを犠牲にした時、マウスの血清と脳組織を保存した。誘導ボックスとマスクを用いて２．５％イソフルランの吸入によりマウスを深部麻酔し、足指ピンチ反射で麻酔状態を確認した。開胸し、シリンジ（２５Ｇ針）で右心室から０．３５ｍＬの全血を採取して血清とした。心腔内灌流は、ペリスタルティックポンプを用いて、右心房を切開した直後の左心室から氷冷した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を１５～２０ｍＬ（１０ｍＬ／ｍｉｎ）注入した。ＡＣＳＦは１２４ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏで構成されていた。ＡＣＳＦのｐＨは、室温でカルボゲン（９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２）を用いて酸素を供給した後、７．４に調整した。ＡＣＳＦは４℃または氷上で保存し、使用前にカルボゲンで２０分間再酸素化した。心腔内灌流後，脳を速やかに回収し、２つの半球に分離した。左半球は液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。全血サンプルを室温で２時間かけて凝固させた後、１０００×ｇで１０分間遠心分離した。血清を回収し、－８０℃で保存した。

３－４．血清中の炎症因子インターロイキン１β（ＩＬ－１β）の測定
高齢者ではＩＬ－１などの炎症性サイトカインの産生が高まることが知られている（磯部ら、老年医学の展望―老化と免疫―日本老年医学会雑誌、４８：２０５－２１０、２０１１、及びＬｉｃａｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ：ａ ｋｅｙ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ＆ Ａｇｅｉｎｇ２：８、２００５）。白鶴霊芝のエタノール抽出物の投与によりＳＡＭＰ８マウスのＩＬ－１βのレベルが変化するかどうかを調べるため、ＥＬＩＳＡを行った。各群の血清サンプルをプールし、Ａｂｃａｍ社のＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｌ９７７４２）を用いてＩＬ－１βを検出した結果を図２に示す。図２に示すように、ＩＬ－１βレベルは、ＬＦＤ（低脂肪食）群に比べてビークル（高脂肪食）群で有意に上昇（Ｄｕｎｎｅｔｔ，ｐ＜０．００１）したが、ＲＮ３０（高脂肪食）群では、ビークル（高脂肪食）群に比べてＩＬ－１βの上昇が有意に抑制された（Ｄｕｎｎｅｔｔ，ｐ＜０．００１）。

３－５．脳内アミロイド－βの測定
凍結（－８０℃）した左半球の脳を、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｋ２６６－１００，ＢｉｏＶｉｓｏｎ）を加えた８００μＬのＴ－ＰＥＲ^ＴＭ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（７８５１０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でホモジナイズした。その後、ホモジネートを１００００×ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、－８０℃で保存した。半球中のアミロイド－β_１－４２の総濃度は、ＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｕｓｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅ １－４２ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ， ＣＳＢ－Ｅ１０７８７ｍ， ＣＵＳＡＢＩＯ）を用いて、製造者の指示に従って測定した。

老化促進モデルマウスＳＡＭＰ８は、アミロイド－βの高発現による酸化ストレス増加を病因とするアルツハイマー型認知症のモデルになることが知られている（Ｍｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ（ＳＡＭＰ８） ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８２２：６５０－６５６、２０１２）。ＲＮ３０（高脂肪食）群のアミロイド－βに対する効果を、ＳＡＭＰ８マウスの脳で評価した結果を図３に示す。図３に示すように、脳ホモジネート上清中のアミロイド－βのレベルは、ＬＦＤ群に比べてビークル（高脂肪食）群で有意（Ｄｕｎｎｅｔｔ，ｐ＜０．０１）に上昇したが、ＲＮ３０（高脂肪食）群では、ビークル（高脂肪食）群に比べてアミロイド－βの上昇が有意に抑えられた（Ｄｕｎｎｅｔｔ，ｐ＜０．０１）。

３－６．毛の光沢感
マウスが２２週齢となったときに、毛の光沢感についての観察を行った。当該観察は目視にて行い、０～４の４段階のスコア（スコアが低いほど良い）で評価した。各投与群における２２週齢の毛の光沢感（Ｇｌｏｓｓｉｎｅｓｓ ｏｆ ｆｕｒ）のスコアを図４に示す。図４に示したように、ＬＦＤ（低脂肪食）群にくらべてビークル（高脂肪食）群は有意に高いスコアを示した（Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｐ＜０．００１）。一方、ＲＮ３０（高脂肪食）群は、ビークル（高脂肪食）群に比べてこの上昇を有意に抑えた（Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｐ＜０．００１）。

３－７．老化指標の測定
ＳＡＭＰ８マウスの老化の程度を評価するために、上記の毛の光沢感を含む、行動や外見の変化を表す１１項目のスコア（表１参照）を０～４で合計した老化度評価スコアを用いた。図５は、本発明の有効成分組成物等を投与した老化促進マウスの１１項目の老化度評価スコアの平均値（トータル老化指標）の経時変化を示す。

各投与群の平均評点は、９週齢から２５週齢にかけて徐々に上昇した。１５週齢までは有意な差はなかったが、２２週齢以降は明らかに差がついた（図５）（Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ ＡＮＯＶＡ；ＲＮ３０ ｖｓ． ビークル：Ｐ＜０．０１、ＬＦＤ ｖｓ． ビークル：Ｐ＜０．００１）。２２週齢の各群の老化度評価スコア平均値の合計を図６に示す。図６に示したように、ＬＦＤ（低脂肪食）群にくらべてビークル（高脂肪食）群は有意に高いスコアを示した（Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｐ＜０．００１）。一方、ＲＮ３０（高脂肪食）群は、ビークル（低脂肪食）群に比べてこの上昇を有意に抑えた（Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｐ＜０．００１）。スコアの変化は、主に、毛の外観の指標である光沢感と密集度のカテゴリーが中心であった（表２参照）。

（処方例１ 錠剤）
常法に従って、以下の成分を混合し、錠剤を製造した。なお、有効成分組成物は、実施例１で得た白鶴霊芝のエタノール抽出物の固形乾燥物を用いた。
組成
有効成分組成物（実施例１） １５０ｍｇ
セルロース ８０ｍｇ
デンプン ２０ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル ２ｍｇ
上記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。

（処方例２ カプセル剤）
常法に従って、以下の成分を混合し、軟カプセルを得た。なお、有効成分組成物は、実施例１で得た白鶴霊芝のエタノール抽出物の固形乾燥物を用いた。
組成
有効成分組成物（実施例１） １００ｍｇ
ミツロウ １０ｍｇ
ぶどう種子オイル １１０ｍｇ
上記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。

（処方例３ 美容用飲料水）
常法に従って、以下の成分を混合し、全量を１００ｇとして美容用飲料水を調製した。なお、有効成分組成物は、実施例１で得た白鶴霊芝のエタノール抽出物の固形乾燥物を用いた。
組成
有効成分組成物（実施例１） ５００ｍｇ
コエンザイムＱ１０ ５００ｍｇ
ビタミンＢ２ ５ｍｇ
ビタミンＢ６ ５ｍｇ
ニコチン酸アミド １０ｍｇ
ビタミンＥ １００ｍｇ
Ｌ－アスコルビン酸 １００ｍｇ
黒糖ぶどう糖液糖 １０ｇ
クエン酸 １ｇ
香料 １００ｍｇ
色素 １００ｍｇ
水 ９７．５ｇ

白鶴霊芝のエタノール抽出物を含む組成物の適用は、高脂肪食投与老化促進モデルマウスを用いた評価において、ＩＬ－１βの血中濃度上昇抑制作用、アミロイド－βの脳内濃度上昇抑制作用、毛髪改善作用及び抗老化作用を示すことが確認できた。したがって、本発明の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤、経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤、経口摂取用毛髪改善剤及び経口摂取用抗老化剤は、医薬品、飲食品、特に、健康増進用飲食品として利用できる可能性がある。

本発明は、白鶴霊芝から全質量のうちエタノールの質量が３０％以上である溶媒により抽出された抽出物を含有する経口摂取用老化関連ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤の製造方法に関する。

Claims (18)

1. 白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有し、経口摂取することでＩＬ－１βの血中濃度の上昇を抑制する経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
2. 前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である請求項１に記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
3. 医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項１又は２に記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
4. 前記飲食品が健康増進用飲食品である請求項３に記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
5. 経口摂取によりＩＬ－１βの血中濃度の上昇を抑制することで、慢性閉塞性肺疾患、自己炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎及び動脈硬化のうち少なくとも１つを緩和、改善、抑制、予防又は治療するものである請求項１～４のいずれかに記載の経口摂取用ＩＬ－１β血中濃度上昇抑制剤。
6. 白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有し、経口摂取することでアミロイド－βの脳内濃度の上昇を抑制する経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
7. 前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である請求項６に記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
8. 医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項６又は７に記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
9. 前記飲食品が健康増進用飲食品である請求項８に記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
10. 経口摂取によりアミロイド－βの脳内濃度の上昇を抑制することで、脳アミロイドアンギオパチーを緩和、改善、抑制、予防又は治療するものである請求項６～９のいずれかに記載の経口摂取用アミロイド－β脳内濃度上昇抑制剤。
11. 白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有し、経口摂取することで毛髪の光沢の低下を抑制する経口摂取用毛髪改善剤。
12. 前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である請求項１１に記載の経口摂取用毛髪改善剤。
13. 医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項１１又は１２に記載の経口摂取用毛髪改善剤。
14. 前記飲食品が美容用飲食品又は健康増進用飲食品である請求項１３に記載の経口摂取用毛髪改善剤。
15. 白鶴霊芝のエタノール抽出物を有効成分として含有する、経口摂取用抗老化剤。
16. 前記エタノール抽出物が含水エタノールによる抽出物である請求項１５に記載の経口摂取用抗老化剤。
17. 医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項１５又は１６に記載の経口摂取用抗老化剤。
18. 前記飲食品が美容用飲食品又は健康増進用飲食品である請求項１７に記載の経口摂取用抗老化剤。

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