JP2023017607A - 液体クロマトグラフおよび液体試料分析方法 - Google Patents

液体クロマトグラフおよび液体試料分析方法 Download PDF

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Abstract

【課題】装置の小型化および低コスト化を実現しつつ、各成分の分離分解能と測定精度とを向上させることができる液体クロマトグラフおよび液体試料分析方法を提供する。【解決手段】液体試料分析装置（ＨＰＬＣ装置）は、１台のポンプと、切替バルブと、カラム（ＨＰＬＣカラム）と、第１の流路と、第２の流路と、空気導入路と、検出器と、制御部と、を備える。制御部は、ポンプおよび切替バルブを制御して、第１の流路への溶離液と液体試料との導入を切り替え可能であり、溶離液と液体試料との間に空気導入路から気泡を導入して、第１の流体において空気分節液体試料を生成する。また、制御部は、ポンプおよび切替バルブを制御して、第１の流路から第２の流路へ空気分節液体試料を流入し、第２の流路を通過する気泡を溶離液および液体試料の少なくとも一方に溶解させる。【選択図】 図１

Description

本発明は、液体クロマトグラフおよび液体試料分析方法に関する。
従来、試料の成分分析を行う試料分析装置として、クロマトグラフが知られている。クロマトグラフは、移動相媒体をポンプなどによって加圧してカラムを通過させ、分析種を固定相及び移動相との相互作用の差を利用して高性能に分離して検出する分析装置である。気体試料の分析においては、移動相媒体としてキャリアガスと呼ばれる気体を用いるガスクロマトグラフ（Gas Chromatograph）などが使われる。一方、液体試料の分析においては、移動相媒体として溶離液と呼ばれる液体を用いる液体クロマトグラフ（Liquid Chromatograph）などが使われる。
液体試料の成分分析を行う方法としては、水耕栽培の培養液のような多項目の成分が含まれる液体試料を簡易に分析することができる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：High Performance Liquid Chromatography）が知られている。
例えば非特許文献１には、ＨＰＬＣにおける試料導入装置が開示されている。この試料導入装置は、カラムにつながる移動相流路と試料（サンプル）が導入される試料ループ（サンプルループ）との接続・分離を切り替え可能な切替バルブを備え、まず、切替バルブを介して、第１のポンプにより加圧された移動相（溶離液）がカラムを流れるようにする。試料ループには、移動相流路と切り離された状態で、分析したい成分を含む試料が第２のポンプによって導入される。その後、移動相流路と試料ループとを接続することにより、移動相流路内に試料が導入され、試料を含む移動相（溶離液）がカラムへ導入される。
このように、従来のＨＰＬＣ装置は、移動相をカラムへ導入するための第１のポンプと、試料ループへ試料を導入するための第２のポンプと、移動相流路と試料ループとの接続・分離を切り替え可能な切替バルブと、を備える。
また、このようなＨＰＬＣ装置において、例えば特許文献１には、サンプルループ中の圧力および流れの乱れを低減するために、サンプルループ中に気泡を置き、サンプルを先行もしくは後続のサンプルから分離する技術が開示されている。
特許第５１１４４７１号公報
三上博久、外１名、「液体クロマトグラフにおける試料導入装置」、ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ、２０１１年、ｖｏｌ．３２、Ｎｏ．１、ｐ．１７－２１
上記従来のＨＰＬＣ装置は、２つのポンプを有し、移動相流路と試料ループとの分離・接続機能を有する構成であるため、装置が大型化するとともにコストが嵩む。そこで、１つのポンプのみを用い、上記の移動相流路と試料ループとの分離・接続機能を有する構成を廃止したＨＰＬＣ装置構成とすることが考えられる。この場合、装置の小型化およびコストダウンを実現することができる。
ところが、１つのポンプのみを用いたＨＰＬＣ装置の場合、分離型（流路切替型）の試料ループ（サンプルループ）は設けられず、ＨＰＬＣカラムへつながる１つの流路へ移動相（溶離液）とサンプルとを切り替えて導入し、移動相（溶離液）とサンプルとを同時に流すことになる。このとき、ポンプの吸引動作や吐出動作が繰り返し行われる。そのため、流路中におけるサンプルの不所望な拡散が生じやすい。サンプルの不所望な拡散が生じると、ＨＰＬＣカラムにサンプルが導入されても、ＨＰＬＣカラムにおけるサンプルの分離が不十分になってしまう。
このように、装置構成が簡素化された分、従来の分離型（流路切替型）のＨＰＬＣ装置では発生し得なかった不具合が発生し得る。
上記特許文献１は、サンプルループ中の圧力および流れの乱れを低減するために、サンプルループ中に気泡を置く点を開示する。しかしながら、気泡がＨＰＬＣカラムや検出部に導入されると、検出対象である成分のＨＰＬＣカラム内での分離が不十分になったり、検出器において空気（気泡）に起因するノイズが発生したりする。そのため、ＨＰＬＣ装置においては、流路内に空気（気泡）を導入することは回避されるのが一般的である。上記特許文献１に記載の技術では、圧力および流れの乱れの影響は低減することができるが、流路内に導入した気泡に起因する上記不具合が生じ得る。
そこで、本発明は、装置の小型化および低コスト化を実現しつつ、各成分の分離分解能と測定精度とを向上させることができる液体クロマトグラフおよび液体試料分析方法を提供することを課題としている。
上記課題を解決するために、本発明に係る液体クロマトグラフの一態様は、流体を吸引および吐出する１台のポンプと、多方にポートを有する切替バルブと、溶離液と液体試料とを含む液体が供給され、内部に保持された固定相との相互作用によって前記液体試料の成分を分離するカラムと、前記ポンプと前記切替バルブとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第１の流路と、前記切替バルブと前記カラムとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第２の流路と、一端が前記切替バルブに接続された空気導入路と、前記カラムにおいて分離された成分を検出する検出器と、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御する制御部と、を備え、前記制御部は、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路への前記溶離液と前記液体試料との導入を切り替え可能であり、前記溶離液と前記液体試料との間に前記空気導入路から気泡を導入して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路において前記気泡、前記液体試料、前記気泡の順に配置されてなる空気分節液体試料を生成し、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から前記第２の流路へ前記溶離液および前記空気分節液体試料を流入し、前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させる。
このように、溶離液と液体試料とが同時に流れる流路において、溶離液と液体試料とを気泡によって分離するので、ポンプの吸引動作や吐出動作を行った場合であっても、液体試料の不所望な拡散を抑制することができる。また、溶離液と液体試料との間に導入された気泡は、第２の流路において溶離液や液体試料に溶解させるので、当該気泡がカラムや検出器に導入されることはない。つまり、溶離液と液体試料とを含む液体を、液体試料の拡散が抑制された状態で、かつ、気泡が消えた状態で、カラムに導入することができる。したがって、カラムにおける検出対象の成分の分離を適切に行うことができるとともに、検出器における空気（気泡）に起因するノイズの発生を抑制することができる。
また、上記の液体クロマトグラフにおいて、前記制御部は、前記第２の流路における前記カラムの液体流入口の直前で、前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させてもよい。
この場合、カラムの液体流入口の直前まで溶離液と液体試料とを適切に分離し、液体試料の不所望な拡散を抑制することができるので、カラムにおける分離分解能の低下をより適切に抑制することができる。
さらに、上記の液体クロマトグラフにおいて、前記制御部は、前記溶離液と前記液体試料との間に前記空気導入路から導入する前記気泡の体積量を制御することで、前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させてもよい。
この場合、第２の流路において溶離液や液体試料に溶解されるような体積量の気泡を導入することができる。そのため、カラムや検出器に気泡が導入されてしまうことを適切に抑制することができる。
また、上記の液体クロマトグラフにおいて、前記溶離液と前記液体試料との間に導入される前記気泡の体積量は、前記第１の流路から前記第２の流路へ前記空気分節液体試料を流入するときの前記ポンプの単位時間当たりの吐出量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて設定されていてもよい。
この場合、ポンプの動作によって発生すると想定される第２の流路の内部の圧力値を考慮した適切な体積量の気泡を導入することができ、第２の流路において気泡を確実に溶離液や液体試料に溶解させることができる。
さらに、上記の液体クロマトグラフにおいて、前記溶離液と前記液体試料との間に導入される前記気泡の体積量は、１マイクロリットル以上４５マイクロリットル以下に設定されていてもよい。
この場合、第２の流路において気泡を適切に溶離液や液体試料に溶解させることができる。
また、上記の液体クロマトグラフにおいて、前記制御部は、前記第１の流路から前記第２の流路を介して前記カラムへ前記空気分節液体試料を流入しているときの前記ポンプの単位時間当たりの吐出量を制御することで、前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させてもよい。
この場合、第２の流路の内部の圧力が、気泡が溶離液や液体試料に溶解されるような圧力値となるように制御ことができる。そのため、カラムや検出器に気泡が導入されてしまうことを適切に抑制することができる。
さらにまた、上記の液体クロマトグラフにおいて、前記第１の流路から前記第２の流路を介して前記カラムへ前記空気分節液体試料を流入するときの前記ポンプの単位時間当たりの吐出量は、前記空気導入路から導入された前記気泡の体積量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて設定されていてもよい。
この場合、導入された気泡を溶解するために必要な圧力値（目標圧力値）を考慮して適切にポンプの単位時間当たりの吐出量を制御することができ、第２の流路において気泡を確実に溶離液や液体試料に溶解させることができる。
また、上記の液体クロマトグラフは、前記検出器の下流側に配置された排圧部をさらに備えていてもよい。
この場合、排圧部によってカラムよりも下流側の流路内圧力を維持することができ、カラムから排出された流体が圧力開放されて再び気泡が生じないようにすることができる。これにより、検出器に気泡が導入されてしまうことを適切に抑制することができる。
さらに、上記の液体クロマトグラフにおいて、前記排圧部は、前記検出器の下流側の流路上に設けられた、前記カラムと前記検出器との間を接続する第３の流路の断面積よりも小さい断面積を有する流路を有していてもよい。
この場合、比較的簡易な構成で、カラムよりも下流側の流路内圧力を適切に維持することができる。
また、上記の液体クロマトグラフは、溶離液槽に貯留された溶離液を採取する溶離液流路と、液体試料槽に貯留された前記液体試料を採取する液体試料流路と、をさらに備え、前記溶離液流路の一端および前記液体試料流路の一端は、それぞれ前記切替バルブに接続されていてもよい。
この場合、１つのポンプと切替バルブとの制御によって、溶離液と液体試料との第１の流路への注入と、溶離液と液体試料との第２の流路への送出とを適切に実現することができる。
さらに、本発明に係る液体試料分析方法の一態様は、流体を吸引および吐出する１台のポンプと、多方にポートを有する切替バルブと、溶離液と液体試料とを含む液体が供給され、内部に保持された固定相との相互作用によって前記液体試料の成分を分離するカラムと、前記ポンプと前記切替バルブとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第１の流路と、前記切替バルブと前記カラムとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第２の流路と、一端が前記切替バルブに接続された空気導入路と、前記カラムにおいて分離された成分を検出する検出器と、を備える液体クロマトグラフにおける液体試料分析方法であって、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から、前記溶離液の一部を前記第２の流路を経由して前記カラムに導入し、前記カラムの内部に前記溶離液を充填する第１のステップと、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路へ前記液体試料と前記空気導入路からの気泡とを導入して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路において前記気泡、前記液体試料、前記気泡の順に配置されてなる空気分節液体試料を生成する第２のステップと、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から前記第２の流路へ前記溶離液および前記空気分節液体試料を流入する第３のステップと、前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させる第４のステップと、前記溶離液および前記液体試料を含む液体を前記カラムで分離し、前記検出器で検出する第５のステップと、を含む。
このように、溶離液と液体試料とが同時に流れる流路において、溶離液と液体試料とを気泡によって分離するので、ポンプの吸引動作や吐出動作を行った場合であっても、液体試料の不所望な拡散を抑制することができる。また、溶離液と液体試料との間に導入された気泡は、第２の流路において溶離液や液体試料に溶解させるので、当該気泡がカラムや検出器に導入されることはない。つまり、溶離液と液体試料とを含む液体を、液体試料の拡散が抑制された状態で、かつ、気泡が消えた状態で、カラムに導入することができる。したがって、カラムにおける検出対象の成分の分離を適切に行うことができるとともに、検出器における空気（気泡）に起因するノイズの発生を抑制することができる。
また、上記の液体試料分析方法において、前記第２のステップでは、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記空気導入路から前記切替バルブを経由して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路に気泡を導入し、次いで、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、一端が前記切替バルブに接続されて液体試料槽に貯留された前記液体試料を採取する液体試料流路から、前記切替バルブを経由して前記第１の流路に前記液体試料を導入し、次いで、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記空気導入路から前記切替バルブを経由して、前記第１の流路に気泡を導入してもよい。
この場合、溶離液を内部に有する第１の流路において、気泡、液体試料、気泡の順に配置されてなる空気分節液体試料を適切に生成することができ、溶離液と液体試料とを気泡によって適切に分離することができる。
さらに、上記の液体試料分析方法において、前記第１のステップの後、前記ポンプの動作を停止し、一定の待機時間が経過した後、前記第２のステップを行ってもよい。
この場合、第１のステップにおけるポンプの吐出動作によって上昇した第１の流路および第２の流路内の圧力を、ポンプの動作を停止している待機時間中に低下させることができる。このように、流路内圧力を低下させてから第２のステップを実施することで、第２のステップにおいて空気導入路から気泡を導入するべく切替バルブを切り替えた際に、空気導入路に第１の流路および第２の流路内の溶離液が逆流することを抑制することができる。その結果、所望量の気泡を第１の流路に導入することが可能となる。
また、上記の液体試料分析方法において、前記第１のステップでは、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、一端が前記切替バルブに接続されて溶離液槽に貯留された溶離液を採取する溶離液流路から、前記切替バルブを経由して前記第１の流路に前記溶離液を導入し、次いで、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から、前記溶離液の一部を前記第２の流路を経由して前記カラムに導入し、前記カラムの内部に前記溶離液を充填してもよい。
この場合、適切に第１の流路、第２の流路およびカラムを含む流路内を溶離液で置換することができる。
また、上記の液体試料分析方法において、前記第２のステップでは、前記第３のステップにおける前記ポンプの単位時間当たりの吐出量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて設定された体積量の前記気泡を導入してもよい。
この場合、ポンプの動作によって発生すると想定される第２の流路の内部の圧力値を考慮した適切な体積量の気泡を導入することができ、第２の流路において気泡を確実に溶離液や液体試料に溶解させることができる。
さらに、上記の液体試料分析方法において、前記第２のステップでは、前記溶離液と前記液体試料との間に、１マイクロリットル以上４５マイクロリットル以下の体積量の前記気泡を導入してもよい。
この場合、第２の流路において気泡を適切に溶離液や液体試料に溶解させることができる。
また、上記の液体試料分析方法において、前記第４のステップでは、前記第２のステップにおいて前記空気導入路から導入された前記気泡の体積量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて、前記ポンプの単位時間当たりの吐出量を制御してもよい。
この場合、導入された気泡を溶解するために必要な圧力値（目標圧力値）を考慮して適切にポンプの単位時間当たりの吐出量を制御することができ、第２の流路において気泡を確実に溶離液や液体試料に溶解させることができる。
本発明では、装置の小型化および低コスト化を実現しつつ、各成分の分離分解能と測定精度とを向上させることができる。
本実施形態における液体試料分析装置の構造例を示す図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 空気分節サンプルのイメージ図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 空気分節サンプルの圧縮状態のイメージ図である。 液体試料分析装置の動作例を示す図である。 カラム導入直前の空気分節サンプルのイメージ図である。 液体分析システムの基本構成例を説明するための図である。 液体分析システムの基本構成例を説明するための図である。 従来の液体試料分析装置の構造例を示す図である。 検出器から得られる信号の一例である。
液体クロマトグラフィーを採用した分析システムは、例えば、テロやパンデミックなどの対策として、感染症などの対象物をより早期に発見するための検知システムや、上記対象物の拡大防止を目的として、複数個所での分析情報に基づく状況把握システムとして用いられる。
感染症検査においては、対象病原菌やウィルスのＲＮＡもしくはＤＮＡを対象物として、直接的に液体クロマトグラフィーにて分析することも、ＰＣＲやＬＡＭＰ法、ハイブリダイゼーション法、インタカレーター法のなど増感方法を介して液体クロマトグラフィーにて分析することも可能である。
上記の感染症としては、例えば炭疽、鳥インフルエンザ、クリミア・コンゴ出血熱、デング熱、エボラ出血熱、ヘンドラウイルス感染症、肝炎、インフルエンザ、ラッサ熱、マールブルグ熱、髄膜炎症（en:Meningococcal disease）、ニパウイルス感染症、ペスト、リフトバレー熱、重症急性呼吸器症候群（SARS）、天然痘、野兎病、黄熱病などがある。
また、液体クロマトグラフィーを採用した分析システムは、飲料水等の製造工場において飲料水等の品質をモニタするシステムや、植物工場において植物（野菜等の作物）に必要な養分を水に溶かした養液の成分分析を行うシステムとしても用いられる。
図１４は、飲料水等の製造工場における液体分析システムの例を示す図である。
この図１４に示すように、飲料水等の製造工場においては、製造する飲料水等の品質をモニタするために、飲料水等を貯蔵する液体タンク８１より分析対象の飲料水等の液体８２の一部を採取する。そして、採取された液体８２は、液体試料採取流路８３を介して液体分析装置８４に送液され、当該液体分析装置８４により成分分析される。
図１５は、植物工場における液体分析システムの例を示す図である。
一般に、植物工場においては、植物（野菜等の作物）に必要な養分を水に溶かした養液による養液栽培が行われる。図１５では、養液栽培として、養液９１を循環させる循環式の水耕栽培の例を示している。
この図１５に示すように、作物９２が育成される栽培槽９３に供給される養液９１は、送液ポンプ９４により、循環流路９５を介して循環する。循環する養液９１の一部は、循環流路９５の一部から分岐した液体試料採取流路９６を介して、例えば自動的に採取され、採取された養液９１は液体分析装置９７により成分分析される。
循環式の水耕栽培の場合、養液が循環するにつれ栽培槽に保持される養液の組成が変化する。植物の生育は養液成分に影響されるので、養液分析の結果に基づき、必要に応じて適宜、養液の調整が行われる。
液体分析装置８４、９７としては、液体試料に含まれる多項目の成分を簡易に分析することができる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：High Performance Liquid Chromatography ）装置を用いることができる。
これらのシステムにおける分析装置は、設置場所を選ばず設置可能であり、小型かつ低コストのものが望まれる。
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
（第一の実施形態）
まず、従来の小型かつ低コストのＨＰＬＣ装置の一例について、図１６を参照しながら説明する。
図１６は、従来のＨＰＬＣ装置１０Ａの構成例を示す図である。
ＨＰＬＣ装置１０Ａは、ポンプ１１と、切替バルブ１２と、ＨＰＬＣカラム１３と、を備える。制御部３２は、ポンプ１１および切替バルブ１２の動作を制御して、溶離液槽４１に貯蔵されている移動相媒体である溶離液４１ａ、および液体試料槽（サンプル槽）４２に貯蔵されている液体試料（サンプル）４２ａを、それぞれ溶離液流路２１、液体試料流路（サンプル流路）２２を介してＨＰＬＣカラム１３に導入する。
ＨＰＬＣカラム１３に導入された液体試料４２ａは、ＨＰＬＣカラム１３により構成成分毎に分離される。そして、検出器３１において分離成分が検出され、データ処理部３３において検出器３１からの検出データが解析され、分離成分の同定や定量が行われる。データ処理部３３により分析された分析結果は、例えば、制御部３２に送出される。
ＨＰＬＣカラム１３と検出器３１とを通過した溶離液４１ａおよび液体試料４２ａは、排液流路２５を介して排液槽４３に排液４３ａとして保持される。
ＨＰＬＣカラム１３を溶離液４１ａとともに液体試料４２ａが流れると、液体試料４２ａを構成する各成分は、固定相であるＨＰＬＣカラム１３と相互作用しながら移動する。この各成分とＨＰＬＣカラム１３との相互作用の強さの相違により、ＨＰＬＣカラム１３から各成分が溶出する時間が決定される。すなわち、ＨＰＬＣカラム１３を通過する各成分の溶出時間の相違を利用して、液体試料４２ａに含まれる各成分が分離される。
分離された成分は、検出器３１により検出される。このとき、検出器３１は、各成分のＨＰＬＣカラム１３での保持時間に対応して、各成分に相当する信号を検出する。つまり、各成分に相当する信号は時間依存性を持つ。ここで、保持時間とは、ＨＰＬＣカラム１３に流入後、ＨＰＬＣカラム１３から溶出して、検出器３１により検出されるまでの時間である。
例えば、液体試料４２ａに物質Ａ、物質Ｂ、物質Ｃが含まれており、ＨＰＬＣカラム１３を通過する物質Ａ、物質Ｂ、物質Ｃの保持時間がｔ１、ｔ２、ｔ３（ｔ１＜ｔ２＜ｔ３）であるとき、検出器３１からは、図１７に示すように物質Ａ、物質Ｂ、物質Ｃに相当する信号が順に得られる。
図１６に示すＨＰＬＣ装置１０Ａは、大まかに以下のように動作する。
まず、ポンプ１１の吸引動作により、溶離液槽４１から溶離液４１ａを溶離液流路２１、切替バルブ１２を介して第１の流路２３に導入する（工程１）。
次に、ポンプ１１の吐出動作により、第１の流路２３内の溶離液４１ａを、第１の流路２３、切替バルブ１２、第２の流路２４を介してＨＰＬＣカラム１３に導入する（工程２）。このとき、ＨＰＬＣカラム１３に導入された溶離液４１ａの少なくとも一部は、検出器３１、廃液流路２５を介して排液槽４３に排液４３ａとして貯留される。
次に、ポンプ１１の吸引動作により、サンプル槽４２から液体試料（サンプル）４２ａをサンプル流路２２、切替バルブ１２を介して第１の流路２３に導入する（工程３）。このとき、サンプル４２ａは、第１の流路２３内において、当該第１の流路２３に残留している溶離液４１ａと混合する。
次に、ポンプ１１の吐出動作により、第１の流路２３内の溶離液４１ａおよびサンプル４２ａが、切替バルブ１２、第２の流路２４を介してＨＰＬＣカラム１３に導入される（工程４）。すると、ＨＰＬＣカラム１３により、溶離液４１ａ中のサンプル４２ａを構成する各成分が分離されて、分離された順に各成分が検出器３１に導入される。
そして、検出器３１は、成分毎に導入されるサンプル４２ａを検出する（工程５）。検出後の溶離液４１ａおよびサンプル（各成分）４２ａは、排液流路２５を介して排液槽４３に排液４３ａとして貯留される（工程６）。
この図１６に示すＨＰＬＣ装置１０Ａは、搭載されるポンプが１台であり、溶離液流路とサンプル流路とが分離された分離型（流路切替型）のＨＰＬＣ装置のように溶離液とサンプルとをそれぞれ導入するための２台のポンプを必要としないため、装置の小型化および低コスト化を実現することができる。
しかしながら、例えばシリンジポンプから構成されるポンプ１１は、吸引動作と吐出動作とを繰り返して流路内の液体を置換する。ＨＰＬＣカラム１３へサンプル４１ａを導入するためには、上述したように工程１～工程４を経る必要があり、ポンプ１１の吸引動作や吐出動作も複数回行われる。
上記のようにポンプ１１の吸引動作や吐出動作が行われた場合、流路内においてはサンプル４２ａの不所望な拡散が生じる場合がある。サンプル４２ａの不所望な拡散が生じると、ＨＰＬＣカラムに溶離液４１ａとサンプル４２ａとを含む液体が導入されても、ＨＰＬＣカラムにおけるサンプルの分離が不十分になってしまう。
本実施形態におけるＨＰＬＣ装置は、搭載されるポンプが１台である小型化および低コスト化を実現したＨＰＬＣ装置であって、流路内におけるサンプル（液体試料）の不所望な拡散といった不具合を抑制する。具体的には、本実施形態におけるＨＰＬＣ装置では、流路内のサンプル（液体試料）の流路方向の前後に気泡を設ける構成（以下、「空気分節サンプル」ともいう。）を用いて、流路内におけるサンプル（液体試料）の不所望な拡散を抑制する。
ただし、空気分節サンプル（空気分析液体試料）がＨＰＬＣカラムや検出器に導入されると、検出対象である成分のＨＰＬＣカラム内での分離が不十分になったり、検出器において空気（気泡）に起因するノイズが発生したりする。
そこで、本実施形態におけるＨＰＬＣ装置は、空気分節サンプルを用いて流路内におけるサンプル（液体試料）の不所望な拡散といった不具合を抑制しつつ、空気分節サンプルを構成する気泡がＨＰＬＣカラムに導入される前に消えるようにして、空気に起因するカラムや検出器における不具合を回避する。
図１は、本実施形態における液体分析装置（ＨＰＬＣ装置）１０を備える液体分析システムの構成例を示す図である。
この図１に示すＨＰＬＣ装置１０は、上述した図１６に示すＨＰＬＣ装置１０Ａと同様に、１つのポンプのみを用いたＨＰＬＣ装置であり、図１６に示すＨＰＬＣ装置１０Ａと同一構成を有する部分には図１６と同一符号を付している。
具体的には、図１に示すＨＰＬＣ装置１０において、切替バルブ１４、排圧部３４および圧力計３５を除く構成は、図１６に示すＨＰＬＣ装置１０Ａの構成と同一である。
ＨＰＬＣ装置１０は、１台のポンプ１１と、多方にポートを有する切替バルブ１４と、ＨＰＬＣカラム１３（本発明のカラムに相当）とを、この順番に備える。また、ＨＰＬＣ装置１０は、溶離液流路２１と、サンプル流路２２（液体試料流路）と、第１の流路２３と、第２の流路２４と、第３の流路２６と、第４の流路２７と、排液流路２５と、空気導入路２８と、を備える。さらに、ＨＰＬＣ装置１０は、検出器３１と、制御部３２と、データ処理部３３と、排圧部３４と、圧力計３５と、を備える。
溶離液流路２１は、溶離液槽４１に貯蔵されている溶離液４１ａを第１の流路２３に導入するための流路であり、サンプル流路２２は、サンプル槽（本発明の液体試料槽に相当）４２に貯蔵されているサンプル（液体試料）４２ａを第１の流路２３に導入するための流路である。溶離液流路２１の一端とサンプル流路２２の一端とは、それぞれ切替バルブ１４に接続されている。
第１の流路２３は、ポンプ１１と切替バルブ１４との間を接続する流路であり、第２の流路２４は、切替バルブ１４とＨＰＬＣカラム１３との間を接続する流路である。第１の流路２３および第２の流路２４は、溶離液４１ａとサンプル４２ａとが同時に流れる流路であり、ＨＰＬＣ装置１０の主流路を構成している。
第３の流路２６は、ＨＰＬＣカラム１３と検出器３１とを接続する流路であり、第４の流路２７は、検出器３１と排圧部３４とを接続する流路である。
排液流路２５は、ＨＰＬＣ装置１０の流路内の流体を、排液４３ａとして排液槽４３に排出するための流路である。
空気導入路２８は、ＨＰＬＣ装置１０の外部の空気を第１の流路２３に導入するための流路である。空気導入路２８の一端は切替バルブ１４に接続されており、空気導入路２８の他端は開放された空気取込口となっている。
ポンプ１１は、ＨＰＬＣカラム１３に溶離液４１ａおよび／またはサンプル４２ａを送液するための送液部であり、切替バルブ１４を介してＨＰＬＣカラム１３に接続されている。
検出器３１は、主流路におけるＨＰＬＣカラム１３の後段に設けられている。
ＨＰＬＣカラム１３に導入されたサンプル４２ａは、当該ＨＰＬＣカラム１３の内部に保持された固定相との相互作用によって構成成分毎に分離される。検出器３１は、ＨＰＬＣカラム１３において分離された成分を検出し、検出された検出データをデータ処理部３３に送出する。
データ処理部３３は、検出器３１によって検出された検出データを分析し、サンプル（液体試料）成分の同定や定量を行う。データ処理部３３は、分析された分析結果を制御部３２に送出する。
制御部３２は、ポンプ１１や切替バルブ１４の動作を制御する。制御部３２は、切替バルブ１４を切り替えることで、第１の流路２３と接続する流路を、溶離液流路２１、サンプル流路２２、第２の流路２４または空気導入路２８のいずれかに切り替えることができる。また、制御部３２は、ポンプ１１の吸引動作と吐出動作とを制御することで、ＨＰＬＣ装置１０の流路内を流れる流体の流れ方向を切り替えることができる。
また、制御部３２は、後述するように、第１の流路２３に設けられた圧力計３５からの圧力データに基づき、ポンプ１１の動作を制御することもできる。
さらに、制御部３２は、データ処理部３３により分析された分析結果を受信し、必要に応じて外部に送信したり、不図示のモニタ等に結果を表示したりすることもできる。
以下、図２～図１３を用いて、本実施形態のＨＰＬＣ装置１０の動作プロセスについて説明する。なお、図２～図８、図１０および図１２においては、制御部３２とデータ処理部３３の図示を省略している。
本動作プロセスは、大きく前準備工程、サンプリング工程、分析工程の３工程からなる。
（１）前準備工程
前準備工程は、溶離液４１ａの吸引ステップ（ＳＴＥＰ１）と、それに続く溶離液４１ａによりＨＰＬＣカラム１３内部を置換する置換ステップ（ＳＴＥＰ２）とからなる。
〔ＳＴＥＰ１：溶離液の吸引〕
図２は、溶離液の吸引ステップ（ＳＴＥＰ１）を説明する図である。
このＳＴＥＰ１において、図示を省略した制御部３２は、切替バルブ１４の切り替え動作を行って溶離液流路２１と第１の流路２３とを接続し、次いで、ポンプ１１の吸引動作を行って、溶離液槽４１から溶離液４１ａを吸い上げ、吸い上げた溶離液４１ａを溶離液流路２１、切替バルブ１４を介して第１の流路２３に導入する。切替バルブ１４とポンプ１１と間の第１の流路２３は、溶離液４１ａの貯留流路として機能する。
なお、図２においては、溶離液流路２１と第１の流路２３とに溶離液４１ａが満たされている様子が太線により仮想的に示されている。
〔ＳＴＥＰ２：溶離液による置換〕
図３は、溶離液による置換ステップ（ＳＴＥＰ２）を説明する図である。
このＳＴＥＰ２において、図示を省略した制御部３２は、切替バルブ１４の切り替え動作を行って第１の流路２３と第２の流路２４とを接続し、次いで、ポンプ１１の吐出動作を行って、第１の流路２３に導入されている溶離液４１ａの一部を、第１の流路２３、切替バルブ１４、第２の流路２４を介してＨＰＬＣカラム１３に導入する。ＨＰＬＣカラム１３に導入された溶離液４１ａの少なくとも一部は、第３の流路２６、検出器３１、第４の流路２７、排圧部３４、排液流路２５を介して排液槽４３に貯留される。
これにより、第１の流路２３の少なくとも一部、第２の流路２４、ＨＰＬＣカラム１３、第３の流路２６、検知器３１、第４の流路２７、排圧部３４、排液流路２５の内部は、溶離液４１ａが充填された状態となる。
なお、図３においては、第１の流路２３、第２の流路２４、第３の流路２６、第４の流路２７および排液流路２５に溶離液４１ａが満たされている様子が太線により仮想的に示されている。
（２）サンプリング工程
前準備工程に続くサンプリング工程は、第１の空気吸引ステップ（ＳＴＥＰ３）と、それに続く液体試料吸引ステップ（ＳＴＥＰ４）、更にそれに続く第２の空気吸引ステップ（ＳＴＥＰ５）とからなる。
〔ＳＴＥＰ３：第１の空気吸引ステップ〕
図４は、第１の空気吸引ステップ（ＳＴＥＰ３）を説明する図である。
このＳＴＥＰ３において、図示を省略した制御部３２は、切替バルブ１４の切り替え動作を行って第１の流路２３と空気導入路２８とを接続し、次いで、ポンプ１１の吸引動作を行って、空気導入路２８の空気取込口より空気Ａを、切替バルブ１４を介して第１の流路２３に導入する。このとき、空気Ａは、第１の流路２３に気泡として導入される。
つまり、第１の流路２３内は、少なくとも一部に溶離液４１ａが充填され、切替バルブ１４側に空気（気泡）Ａが導入された状態となる。また、第２の流路２４、ＨＰＬＣカラム１３、第３の流路２６、検知器３１、第４の流路２７、排圧部３４、排液流路２５の内部は、溶離液４１ａにより置換されている。
なお、図４においては、第１の流路２３の切替バルブ１４側に気泡Ａが導入されている様子が仮想的に示されている。
ここで、溶離液４１ａによる置換ステップ（ＳＴＥＰ２）と第１の空気吸引ステップ（ＳＴＥＰ３）との間には、一定時間、ポンプ１１の動作を停止する期間を設けることが好ましい。
一般に、ＨＰＬＣカラム１３のコンダクタンスは小さいため、ＳＴＥＰ２において、第１の流路２３に保持する溶離液４１ａをポンプ１１の吐出動作によって第２の流路２４以降の流路に導入した場合、第１の流路２３や第２の流路２４内の圧力が上がってしまう。このような状態で、ＳＴＥＰ３において切替バルブ１４の切り替え動作を行って、第１の流路２３と空気導入路２８とを接続すると、第１の流路２３内の溶離液４１ａの少なくとも一部が空気導入路２８に逆流するおそれがある。つまり、第１の流路２３へ導入する空気の容量が所望の容量とならないおそれがある。
そのため、ＳＴＥＰ２の終了後は、ポンプ１１の動作を停止し、一定の待機時間が経過した後、ＳＴＥＰ３を行うことが好ましい。これにより、第１の流路２３、切替バルブ１４、および第２の流路２４から排液流路２５に至る流路内圧力は、排液４３ａが排液槽４３に流れるにつれて徐々に低下する。上記流路内圧力が十分に（例えば、大気圧と同等圧力まで）下がった後にＳＴＥＰ３の工程を実施することにより、空気導入路２８に第１の流路２３および第２の流路２４内の溶離液４１ａが逆流することなく、空気Ａを第１の流路２３に導入することが可能となる。
〔ＳＴＥＰ４：液体試料吸引ステップ〕
図５は、液体試料吸引ステップ（ＳＴＥＰ４）を説明する図である。
このＳＴＥＰ４において、図示を省略した制御部３２は、切替バルブ１４の切り替え動作を行って第１の流路２３とサンプル流路２２とを接続し、次いで、ポンプ１１の吸引動作を行って、サンプル槽４２からサンプル４２ａを吸い上げ、吸い上げたサンプル４２ａをサンプル流路２２、切替バルブ１４を介して第１の流路２３に導入する。
このＳＴＥＰ４では、第１の流路２３において、ＳＴＥＰ３により第１の流路２３に導入された気泡Ａと切替バルブ１４と間にサンプル４２ａが充填される。すなわち、第１の流路２３において、ポンプ１１側に充填された溶離液４１ａと切替バルブ１４側に充填されたサンプル４２ａとは気泡Ａにより分離されており、溶離液４１ａとサンプル４２ａとは混合されない。また、第２の流路２４、ＨＰＬＣカラム１３、第３の流路２６、検知器３１、第４の流路２７、排圧部３４、排液流路２５の内部は、溶離液４１ａにより置換されている。
なお、図５においては、第１の流路２３の切替バルブ１４側にサンプル４２ａが導入されて、溶離液４１ａとサンプル４２ａとが気泡Ａによって分離されている様子が仮想的に示されている。
〔ＳＴＥＰ５：第２の空気吸引ステップ〕
図６は、第２の空気吸引ステップ（ＳＴＥＰ５）を説明する図である。
このＳＴＥＰ５において、図示を省略した制御部３２は、切替バルブ１４の切り替え動作を行って第１の流路２３と空気導入路２８とを接続し、次いで、ポンプ１１の吸引動作を行って、空気導入路２８の空気取込口より空気Ａを、切替バルブ１４を介して第１の流路２３に導入する。このとき、空気Ａは、第１の流路２３に気泡として導入される。
このＳＴＥＰ５では、第１の流路２３において、ＳＴＥＰ４により第１の流路２３に導入されたサンプル４２ａと切替バルブ１４と間に気泡Ａが導入される。これにより、第１の流路２３において、サンプル４２ａは気泡Ａに挟まれた状態、すなわち、空気分節サンプルとなる。また、第２の流路２４、ＨＰＬＣカラム１３、第３の流路２６、検知器３１、第４の流路２７、排圧部３４、排液流路２５の内部は、溶離液４１ａにより置換されている。
なお、図６においては、第１の流路２３の切替バルブ１４側に気泡Ａが導入されて、第１の流路２３内に空気分節サンプルが形成されている様子が仮想的に示されている。
（３）分析工程
サンプリング工程に続く分析工程は、空気分節サンプル排出ステップ（ＳＴＥＰ６）と、それに続く圧縮ステップ（ＳＴＥＰ７）と、それに続く検出ステップ（ＳＴＥＰ８）とからなる。
〔ＳＴＥＰ６：空気分節サンプル排出ステップ〕
図７および図８は、第１の流路２３からＨＰＬＣカラム１３へ向けて空気分節サンプルを排出する排出ステップ（ＳＴＥＰ６）を説明する図である。
このＳＴＥＰ６において、図示を省略した制御部３２は、切替バルブ１４の切り替え動作を行って第１の流路２３と第２の流路２４とを接続し、次いで、ポンプ１１の吐出動作を行って、第１の流路２３における気泡Ａ、サンプル４２ａ、気泡Ａ、溶離液４１ａを、この順に第２の流路２４へ排出する。
なお、図７は、ポンプ１１の吐出動作を開始した直後の様子を示しており、第１の流路２３内の空気分節サンプル（気泡Ａ、サンプル４２ａ、気泡Ａ）は、ＳＴＥＰ６により形成された図６に示す空気分節サンプルから大きな変化はない。
図７に示す状態からポンプ１１の吐出動作を継続すると、図８に示すように、第１の流路２３に存在していた空気分節サンプルが排出されて、第２の流路２４に導入される。
図９は、第２の流路２４に導入されたサンプル４２ａの状態を示す図であり、図８の符号５１で示す第２の流路２４の内部イメージ図である。この図９に示すように、第２の流路２４内においては、サンプル４２ａは両端を気泡Ａに挟まれた状態であり、当該気泡Ａにより溶離液４１ａと分離された状態である。すなわち、溶離液４１ａとサンプル４２ａは、混合されていない。
〔ＳＴＥＰ７：圧縮ステップ〕
図１０～図１３は、圧縮ステップ（ＳＴＥＰ７）を説明する図である。
このＳＴＥＰ７において、切替バルブ１４の状態は、ＳＴＥＰ６と同様、第１の流路２３と第２の流路２４とを接続した状態である。
上記したように、一般にＨＰＬＣカラム１３のコンダクタンスは小さいので、ポンプ１１の吐出動作の結果として第１の流路２３や第２の流路２４の内部の圧力が上昇する。
サンプル４２ａをＨＰＬＣカラム１３に導入するために、ポンプ１１の吐出動作を行うと、第１の流路２３、第２の流路２４内の圧力が上昇し、第２の流路２４内に導入された空気分節サンプルが圧縮される。その結果、空気分節サンプルを構成する気泡Ａの少なくとも一部が溶離液４１ａおよびサンプル４２ａの少なくとも一方に溶け込み、気泡Ａの体積が減少する。
図１１は、図１０の符号５２で示す第２の流路２４の内部イメージ図である。この図１１に示すように、空気分節サンプルが圧縮されることで、気泡Ａの体積が、第１の流路２３において導入した気泡Ａの体積よりも減少する。
第１の流路２３、第２の流路２４内の圧力は、ポンプ１１の吐出動作を開始した時点からポンプ１１の吐出動作を行っている間、徐々に上昇する。この圧力の上昇は、流路の径、流路の長さ、ＨＰＬＣカラム１３を含むＨＰＬＣカラム１３よりも下流の流路のコンダクタンス、ポンプ１１の単位時間当たりの吐出量等に依存する。
そこで、本実施形態では、第２の流路２４内の圧力上昇によって当該第２の流路２４におけるＨＰＬＣカラム１３の液体流入口の直前で気泡Ａが溶離液４１ａやサンプル４２ａに完全に溶け込むように（気泡Ａが消えるように）、ＳＴＥＰ３およびＳＴＥＰ５において導入する気泡Ａの体積量を設定する。
上記のように予め設定された体積量の気泡Ａを導入することで、ポンプ１１の吐出動作に伴って第２の流路２４内の圧力が上昇した場合に、図１２に示すように、第２の流路２４におけるＨＰＬＣカラム１３の直前で気泡Ａを溶離液４１ａやサンプル４２ａに完全に溶解させることができる。
図１３は、図１２の符号５３で示す第２の流路２４の内部イメージ図である。この図１３に示すように、ＨＰＬＣカラム１３の直前で気泡Ａを完全に消すことができる。
ここで、気泡Ａの導入量は、例えば１μｌ（マイクロリットル）以上４５μｌ以下とすることができる。例えば、流路中の気泡Ａの長さが１ｍｍあれば、溶離液４１ａとサンプル４２ａとを適切に分離することができる。したがって、気泡Ａの最小体積は、流路の径にもよるが１マイクロリットルでも十分である。また、気泡Ａの量が多いほど、当該気泡Ａを溶離液４１ａやサンプル４２ａに完全に溶解するための圧力値も大きくなるため、ポンプ１１の吐出能力にもよるが、気泡Ａの最大体積は４５マイクロリットル程度であることが好ましい。
気泡Ａの導入量は、事前の実験やシミュレーションにより決定することができる。例えば、実験により気泡Ａの導入量を決定する場合には、透明な管路（チューブ）を用いて、ＨＰＬＣカラム１３の直前で気泡Ａが消えることを目視で確認するなどして、気泡Ａの適切な導入量を決定してもよい。なお、気泡Ａの導入量を決定した後は、管路（チューブ）が透明である必要はない。
本実施形態では、第２の流路２４におけるＨＰＬＣカラム１３の直前で気泡Ａが溶離液４１ａやサンプル４２ａに完全に溶け込むように気泡Ａの導入量を設定する場合について説明したが、第２の流路２４におけるＨＰＬＣカラム１３の直前で気泡Ａが溶離液４１ａやサンプル４２ａに完全に溶け込むように、ポンプ１１の単位時間当たりの吐出量（以降、単に「吐出量」という。）を調整してもよい。
第１の流路２３に導入した所定量の気泡Ａが完全に溶離液４１ａやサンプル４２ａに溶け込むときの流路内圧力（以下、「目標圧力値」という。）は、予め算出することができる。そこで、例えば第１の流路２３に設けられた圧力計３５により計測された圧力値が、気泡Ａが第２の流路２４を通過しているときに上記目標圧力値と一致（または略一致）するように、ポンプ１１の吐出量を調整するようにしてもよい。
具体的には、圧力計３５は、計測した圧力値（第１の流路２３および第２の流路２４の圧力値）を制御部３２に送信し、制御部３２は、圧力計３５から受信した圧力値と目標圧力値とを比較して、第１の流路２３および第２の流路２４の圧力値が上記目標圧力値と一致（または略一致）するようにポンプ１１の動作を制御すればよい。
このように気泡Ａの導入量やポンプ１１の吐出量を調整することにより、ＨＰＬＣカラム１３へは、サンプル４２ａおよび溶離液４１ａのみが導入され、気泡Ａは導入されない。
以上のような工程により、サンプル４１ａは、ＨＰＬＣカラム１３の液体流入口の直前に到達するまでは、空気分節サンプルとして第１の流路２３、第２の流路２４内を輸送される。つまり、サンプル４２ａは、前後に配置される気泡Ａにより溶離液４１ａと分離された状態で第１の流路２３、第２の流路２４内を輸送され、第１の流路２３、第２の流路２４内部において不所望な拡散が生じることが回避される。
一方、上記工程により、空気分節サンプルを構成するサンプル４２ａの前後に配置される気泡Ａは、サンプル４２ａがＨＰＬＣカラム１３の液体流入口の直前に到達する時点で、溶離液４１ａやサンプル４２ａに溶解される。そのため、気泡Ａは、ＨＰＬＣカラム１３や検出器３１には導入されない。
よって、サンプル４２ａを構成する検出対象である各成分のＨＰＬＣカラム１３内での分離が不十分になったり、検出器３１において空気（気泡）に起因するノイズが発生したりするといった不具合は発生しない。
〔ＳＴＥＰ８：検出ステップ〕
ＳＴＥＰ８において、切替バルブ１４の状態は、ＳＴＥＰ７と同様、第１の流路２３と第２の流路２４とを接続した状態である。
このＳＴＥＰ８では、制御部３２は、ポンプ１１の吐出動作を継続し、第２の流路２４の溶離液４１ａおよびサンプル４２ａをＨＰＬＣカラム１３に導入する。
ＨＰＬＣカラム１３を、溶離液４１ａとともにサンプル４２ａが流れると、サンプル４２ａを構成する各成分は、固定相であるＨＰＬＣカラム１３と相互作用しながら移動する。この各成分とＨＰＬＣカラム１３との相互作用の強さの相違により、ＨＰＬＣカラム１３から各成分が溶出する時間が決定される。すなわち、ＨＰＬＣカラム１３を通過する各成分の溶出時間の相違を利用して、サンプル４２ａに含まれる各成分が分離される。
そして、分離された成分は、ＨＰＬＣカラム１３の後段に配置された検出器３１によって検出される。このとき、検出器３１は、ＨＰＬＣカラム１３から溶出する各成分の溶出時間に対応して、各成分に相当する信号を得る。
そして、検出器３１から排出される流体は、排液流路２５を介して排液槽４３に排出され、排液４３ａとして保持される。
なお、検出器３１の下流側には、コンダクタンスが小さい排圧部３４を設けてもよい。排圧部３４は、例えば第４の流路２７の少なくとも一部に、第３の流路２６の断面積より小さい断面積を有する流路を含んで構成されていてもよい。この排圧部３４により、ＨＰＬＣカラム１３よりも下流側の流路内圧力を維持することができ、ＨＰＬＣカラム１３から排出された流体が圧力開放されて再び気泡Ａが生じないようにすることができる。これにより、検出器３１に空気が導入されてしまうことを適切に抑制することができる。
上記の各ＳＴＥＰのうち、ＳＴＥＰ１およびＳＴＥＰ２が第１のステップに対応し、ＳＴＥＰ３～ＳＴＥＰ５が第２のステップに対応し、ＳＴＥＰ６が第３のステップに対応し、ＳＴＥＰ７が第４のステップに対応し、ＳＴＥＰ８が第５のステップに対応している。
以上説明したように、本実施形態におけるＨＰＬＣ装置１０は、１台のポンプ１１と、切替バルブ１４と、ＨＰＬＣカラム１３と、ポンプ１１と切替バルブ１４との間を接続し、溶離液４１ａとサンプル（液体試料）４２ａとが同時に流れる第１の流路２３と、切替バルブ１４とＨＰＬＣカラム１３との間を接続し、溶離液４１ａとサンプル４２ａとが同時に流れる第２の流路２４と、一端が切替バルブ１４に接続された空気導入路２８と、を備える。また、ＨＰＬＣ装置１０は、ＨＰＬＣカラム１３において分離された成分を検出する検出器３１と、ポンプ１１および切替バルブ１４を制御する制御部３２と、を備える。
制御部３２は、ポンプ１１および切替バルブ１４を制御して、第１の流路２３への溶離液４１ａとサンプル４２ａとの導入を切り替え可能であり、溶離液４１ａとサンプル４２ａとの間に空気導入路２８から気泡を導入して、第１の流体２３において気泡Ａ、サンプル４２ａ、気泡Ａの順に配置されてなる空気分節サンプル（空気分節液体試料）を生成することができる。また、制御部３２は、ポンプ１１および切替バルブ１４を制御して、第１の流路２３から第２の流路２４へ空気分節サンプルを流入し、第２の流路２３を通過する気泡Ａを溶離液４１ａおよびサンプル４２ａの少なくとも一方に溶解させることができる。
このように、１つのポンプ１１によって、溶離液４１ａやサンプル４２ａの第１の流路２３への導入と、溶離液４１ａとサンプル４２ａとの混合液のＨＰＬＣカラム１３への送液とを実現することができる。したがって、ポンプを複数個設ける必要がなく、その分の小型化およびコスト削減を実現することができる。そのため、植物（野菜等の作物）を生産する農家等への普及が容易となる。
また、ポンプ１１を、第１の流路２３から切替バルブ１４、第２の流路２４を経由してＨＰＬＣカラム１３に流入する経路の外に配置するので、流体がポンプ１１を通過しない構成とすることができる。したがって、ポンプ１１を通過することによる流体の分散（拡散）を防止することができ、ＨＰＬＣカラム１３における分離能の低下を防止することができる。
さらに、本実施形態では、第１の流路２３において空気分節サンプルを生成し、その空気分節サンプルを第２の流路２４を介してＨＰＬＣカラム１３へ向けて流すので、溶離液４１ａとサンプル４２ａとを気泡Ａによって分離した状態で、サンプル４２ａをＨＰＬＣカラム１３まで送液することができる。したがって、サンプル４２ａがＨＰＬＣカラム１３に導入される前にサンプル４２ａの不所望な拡散が生じることを適切に抑制することができ、ＨＰＬＣカラム１３における分離能の低下を防止することができる。
また、本実施形態では、空気分節サンプルを構成する気泡Ａを、第２の流路２４において溶離液４１ａおよびサンプル４２ａの少なくとも一方に溶解させることができる。つまり、気泡ＡがＨＰＬＣカラム１３や検出器３１に導入される前に、当該気泡Ａを消すことができる。したがって、気泡Ａに起因するＨＰＬＣカラム１３における分離能の低下や検出器３１におけるノイズ発生といった不具合を適切に回避することができる。
ここで、気泡Ａを、ＨＰＬＣカラム１３の液体流入口の直前で溶離液４１ａやサンプル４２ａに溶解させるようにすれば、サンプル４２ａの流路内における不所望な拡散をより適切に抑制することができる。
制御部３２は、溶離液４１ａとサンプル４２ａとの間に空気導入路２８から導入する気泡Ａの体積量、および、第１の流路２３から第２の流路２４を介してＨＰＬＣカラム１３へ空気分節サンプルを流入するときのポンプ１１の吐出量の少なくとも一方を制御することで、第２の流路２４を通過する気泡Ａを溶離液４１ａやサンプル４２ａに溶解させることができる。
具体的には、制御部３２は、ポンプ１１の吐出動作により第１の流路２３から第２の流路２４へ空気分節サンプルを流入しているときに発生する第２の流路２４の内部の圧力によって、第２の流路２３を通過する気泡Ａが溶離液４１ａやサンプル４２ａに溶解されるような体積量の気泡Ａを、溶離液４１ａとサンプル４２ａとの間に導入する。
ここで、第１の流路２３から第２の流路２４へ空気分節サンプルを流入しているときに発生する第２の流路２４の内部の圧力は、第１の流路２３から第２の流路２４へ空気分節サンプルを流入しているときのポンプ１１の吐出量、ＨＰＬＣカラム１３のコンダクタンス、第１の流路２３および第２の流路２４の径、ならびに、第１の流路２３および第２の流路２４の長さに基づいて決まる。したがって、これらの条件をもとに設定された体積量の気泡Ａを導入するようにすれば、第２の流路２４において確実に気泡Ａを溶解させることができる。
また、制御部３２は、第１の流路２３から第２の流路２４を介してＨＰＬＣカラム１３へ空気分節サンプルを流入しているときに、第２の流路２４の内部に第２の流路２４を通過する気泡Ａが溶離液４１ａやサンプル４２ａに溶解されるような圧力（目標圧力値）が印加されるように、ポンプ１１の吐出量を制御してもよい。
ここで、空気導入路２８から導入された気泡Ａが溶離液４１ａやサンプル４２ａに溶解される圧力は、空気導入路２８から導入された気泡Ａの体積量、ＨＰＬＣカラム１３のコンダクタンス、第１の流路２３および第２の流路２４の径、ならびに、第１の流路２３および第２の流路２４の長さに基づいて決まる。したがって、これらの条件をもとに設定された目標圧力値を印加するようにポンプ１１の吐出量を制御することでも、第２の流路２４において確実に気泡Ａを溶解させることができる。
なお、本実施形態では、ＨＰＬＣカラム１３の液体流入口の直前で気泡Ａを完全に溶解させる場合について説明したが、気泡Ａは完全に溶解されなくてもよい。気泡Ａは、ＨＰＬＣカラム１３における各成分の分離分解能や検出器３１におけるノイズが許容できる程度に小さくできればよい。
以上のように、本実施形態におけるＨＰＬＣ装置１００は、液体クロマトグラフィーを用いた液体試料分析装置であって、装置の小型化および低コスト化を実現しつつ、各成分の分離分解能と測定精度とを向上させることができる。
なお、上記において特定の実施形態が説明されているが、当該実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定する意図はない。本明細書に記載された装置及び方法は上記した以外の形態において具現化することができる。また、本発明の範囲から離れることなく、上記した実施形態に対して適宜、省略、置換及び変更をなすこともできる。かかる省略、置換及び変更をなした形態は、請求の範囲に記載されたもの及びこれらの均等物の範疇に含まれ、本発明の技術的範囲に属する。
１０…液体試料分析装置（ＨＰＬＣ装置）、１１…ポンプ、１２…切替バルブ、１３…ＨＰＬＣカラム、１４…切替バルブ、２１…溶離液流路、２２…サンプル流路（液体試料流路）、２３…第１の流路、２４…第２の流路、２５…排液流路、２６…第３の流路、２７…第４の流路、２８…空気導入路、３１…検出器、３２…制御部、３３…データ処理部、４１…溶離液槽、４１ａ…溶離液、４２…サンプル槽（試料槽）、４２ａ…サンプル（液体試料）、４３…排液槽、４３ａ…排液、Ａ…空気（気泡）

Claims (17)

  1. 流体を吸引および吐出する１台のポンプと、
    多方にポートを有する切替バルブと、
    溶離液と液体試料とを含む液体が供給され、内部に保持された固定相との相互作用によって前記液体試料の成分を分離するカラムと、
    前記ポンプと前記切替バルブとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第１の流路と、
    前記切替バルブと前記カラムとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第２の流路と、
    一端が前記切替バルブに接続された空気導入路と、
    前記カラムにおいて分離された成分を検出する検出器と、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御する制御部と、を備え、
    前記制御部は、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路への前記溶離液と前記液体試料との導入を切り替え可能であり、前記溶離液と前記液体試料との間に前記空気導入路から気泡を導入して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路において前記気泡、前記液体試料、前記気泡の順に配置されてなる空気分節液体試料を生成し、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から前記第２の流路へ前記溶離液および前記空気分節液体試料を流入し、前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させることを特徴とする液体クロマトグラフ。
  2. 前記制御部は、
    前記第２の流路における前記カラムの液体流入口の直前で、前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ。
  3. 前記制御部は、
    前記溶離液と前記液体試料との間に前記空気導入路から導入する前記気泡の体積量を制御することで、前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させることを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフ。
  4. 前記溶離液と前記液体試料との間に導入される前記気泡の体積量は、前記第１の流路から前記第２の流路へ前記空気分節液体試料を流入するときの前記ポンプの単位時間当たりの吐出量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて設定されていることを特徴とする請求項３に記載の液体クロマトグラフ。
  5. 前記溶離液と前記液体試料との間に導入される前記気泡の体積量は、１マイクロリットル以上４５マイクロリットル以下に設定されていることを特徴とする請求項３に記載の液体クロマトグラフ。
  6. 前記制御部は、
    前記第１の流路から前記第２の流路を介して前記カラムへ前記空気分節液体試料を流入しているときの前記ポンプの単位時間当たりの吐出量を制御することで、前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させることを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフ。
  7. 前記第１の流路から前記第２の流路を介して前記カラムへ前記空気分節液体試料を流入するときの前記ポンプの単位時間当たりの吐出量は、前記空気導入路から導入された前記気泡の体積量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて設定されていることを特徴とする請求項６に記載の液体クロマトグラフ。
  8. 前記検出器の下流側に配置された排圧部をさらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフ。
  9. 前記排圧部は、前記検出器の下流側の流路上に設けられた、前記カラムと前記検出器との間を接続する第３の流路の断面積よりも小さい断面積を有する流路を有することを特徴とする請求項８に記載の液体クロマトグラフ。
  10. 溶離液槽に貯留された溶離液を採取する溶離液流路と、
    液体試料槽に貯留された前記液体試料を採取する液体試料流路と、をさらに備え、
    前記溶離液流路の一端および前記液体試料流路の一端は、それぞれ前記切替バルブに接続されていることを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフ。
  11. 流体を吸引および吐出する１台のポンプと、
    多方にポートを有する切替バルブと、
    溶離液と液体試料とを含む液体が供給され、内部に保持された固定相との相互作用によって前記液体試料の成分を分離するカラムと、
    前記ポンプと前記切替バルブとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第１の流路と、
    前記切替バルブと前記カラムとの間を接続し、前記溶離液と前記液体試料とが同時に流れる第２の流路と、
    一端が前記切替バルブに接続された空気導入路と、
    前記カラムにおいて分離された成分を検出する検出器と、を備える液体クロマトグラフにおける液体試料分析方法であって、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から、前記溶離液の一部を前記第２の流路を経由して前記カラムに導入し、前記カラムの内部に前記溶離液を充填する第１のステップと、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路へ前記液体試料と前記空気導入路からの気泡とを導入して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路において前記気泡、前記液体試料、前記気泡の順に配置されてなる空気分節液体試料を生成する第２のステップと、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から前記第２の流路へ前記溶離液および前記空気分節液体試料を流入する第３のステップと、
    前記第２の流路を通過する前記気泡を前記溶離液および前記液体試料の少なくとも一方に溶解させる第４のステップと、
    前記溶離液および前記液体試料を含む液体を前記カラムで分離し、前記検出器で検出する第５のステップと、を含むことを特徴とする液体試料分析方法。
  12. 前記第２のステップでは、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記空気導入路から前記切替バルブを経由して、前記溶離液を内部に有する前記第１の流路に気泡を導入し、
    次いで、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、一端が前記切替バルブに接続されて液体試料槽に貯留された前記液体試料を採取する液体試料流路から、前記切替バルブを経由して前記第１の流路に前記液体試料を導入し、
    次いで、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記空気導入路から前記切替バルブを経由して、前記第１の流路に気泡を導入することを特徴とする請求項１１に記載の液体試料分析方法。
  13. 前記第１のステップの後、前記ポンプの動作を停止し、一定の待機時間が経過した後、前記第２のステップを行うことを特徴とする請求項１１または１２に記載の液体試料分析方法。
  14. 前記第１のステップでは、
    前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、一端が前記切替バルブに接続されて溶離液槽に貯留された溶離液を採取する溶離液流路から、前記切替バルブを経由して前記第１の流路に前記溶離液を導入し、
    次いで、前記ポンプおよび前記切替バルブを制御して、前記第１の流路から、前記溶離液の一部を前記第２の流路を経由して前記カラムに導入し、前記カラムの内部に前記溶離液を充填することを特徴とする請求項１１または１２に記載の液体試料分析方法。
  15. 前記第２のステップでは、
    前記第３のステップにおける前記ポンプの単位時間当たりの吐出量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて設定された体積量の前記気泡を導入することを特徴とする請求項１１または１２に記載の液体試料分析方法。
  16. 前記第２のステップでは、
    前記溶離液と前記液体試料との間に、１マイクロリットル以上４５マイクロリットル以下の体積量の前記気泡を導入することを特徴とする請求項１４に記載の液体試料分析方法。
  17. 前記第４のステップでは、
    前記第２のステップにおいて前記空気導入路から導入された前記気泡の体積量、前記カラムのコンダクタンス、前記第１の流路および前記第２の流路の径、ならびに、前記第１の流路および前記第２の流路の長さに基づいて、前記ポンプの単位時間当たりの吐出量を制御することを特徴とする請求項１１または１２に記載の液体試料分析方法。
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