JP2022541548A - ＰＤ１遺伝子の切断を誘導し、外因性配列の効率的な組み込みを実現するｓｇＲＮＡ - Google Patents

Abstract

ＰＤ１遺伝子の切断を誘導し、外因性配列の効率的な組み込みを実現するｓｇＲＮＡを開示する。すなわち、細胞内のＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行う方法を提供し、前記方法は、ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを細胞に導入することにより、ＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行うステップを含み、前記ｓｇＲＮＡは、ヌクレアーゼによるＰＰＤ１遺伝子の切断を誘導して切断部位を形成し、まだ切断部位に外因性ドナー修復テンプレートを導入することによって、ＰＤ１遺伝子座の特定部位にＣＡＲ－Ｔエレメントを指向的に挿入し、ＰＤ１がノックアウトされた強化ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞をワンステップで構築することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、ヌクレオチドに関し、特に、ＰＤ１遺伝子座の切断を誘導することにより、その部位での外因性配列の効率的な組み込みを実現することができるｓｇＲＮＡに関する。

キメラ抗原受容体Ｔ細胞技術（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）は、近年出現した新規養子免疫療法である。これは、患者のＴ細胞をインビトロで遺伝子変改、所定の増幅をした後に患者の体内に投与することで、腫瘍の標的殺傷を実現する。ＣＡＲ－Ｔ構造は、腫瘍の特定の抗原を細胞外で特異的に認識する一本鎖抗体、膜貫通ドメイン、細胞内のＴ細胞活性化のタンデムシグナルドメインを主に含む（現在、多く使用されるのは、ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ及び４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚである）。２０１３年に、《科学》雑誌が腫瘍免疫治療技術を２０１３年トップテンの科学技術の飛躍的進歩として評価して以来、この分野の研究は盛んに発展してきた。現在、２つのＣＡＲ－Ｔ製品は、米国食品薬品監督管理局により、血液腫瘍の臨床治療に用いることが承認され、ＣＡＲ－Ｔ技術の巨大な成功を意味する。しかし、新興の技術として、ＣＡＲ－Ｔ技術は、各面で依然として多くのチャレンジに直面し、改善する余裕がある。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、古細菌及び細菌に由来しプラスミド、ファー等の外因性ＤＮＡ断片の侵入を抵抗する獲得免疫機構である。この系は、主に、ＣＲＩＳＰＲ配列及びＣａｓタンパク質をコードする遺伝子座により機能し、現在最も一般的に使用されるのは、ＩＩ型ファミリーのＣａｓ９ヌクレアーゼであり、この系は、単一のエフェクタータンパク質だけで機能することができる。外因性ＤＮＡが細菌に侵入する場合、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、先ず、侵入ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ反復配列の間に組み込む。その後、侵入ＤＮＡ配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、転写され加工される。その後、トランス活性化ｃｒＲＮＡ （ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、 ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡと結合し、最終的にＣａｓ９タンパク質と複合体を形成する。最後に、Ｃａｓ９タンパク質は、そのＨＮＨ及びＲｕｖＣ様ドメインによってエンドヌクレアーゼ作用を発揮してＤＮＡ二重鎖切断を引き起こす。ＤＮＡの二重鎖切断は、損傷修復メカニズムを引き起こし、それにより、相同組換え等によって特定の遺伝子の編集を実現する。今まで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は既に多くの分野で応用されており、将来性が期待できる。

ＰＤ－１は、Ｔ細胞表面で発現された重要な免疫抑制膜貫通タンパク質であり、２つのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を有する。研究によると、腫瘍細胞がＰＤ－Ｌ１を高発現してＰＤＬ１／ＰＤ１経路を活性化することができ、それによりＰＤ－１の細胞内ドメインをリン酸化し、チロシンフォスファターゼＳＨＰ－２を募集し、それにより、ＴＣＲシグナル経路の活性化を減少させ、Ｔ細胞の活性化を抑制する。臨床研究によると、ＰＤＬ１／ＰＤ１経路を遮断すると、Ｔ細胞の抑制作用を解消し、腫瘍を殺傷する効果を果たすことができる。現在、ＰＤＬ１／ＰＤ１経路を遮断する複数の抗体薬物は、米国食品医薬品監督局により、非小細胞肺がん、黒色腫等の様々な悪性腫瘍の治療に用いられることが承認され、良好な治療効果を示し、ＰＤ１免疫チェックポイン療法の巨大な成功を示す。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を向上させるために、本発明は、遺伝子編集技術を利用してＰＤ１遺伝子座の特定部位ＤＮＡを切断し、また、外因性の目的配列を導入し、ＣＡＲ－Ｔ技術の応用を広げる。

本発明は、ＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行う方法を提供する。

本発明では、「遺伝子編集」とは、細胞の遺伝子の標的部位での置換、欠失及び／又は挿入を指す。一実施形態では、遺伝子編集は、１つ以上の天然または人工的に修飾されたヌクレアーゼを細胞に導入して、細胞の標的部位でＤＮＡ突然変異を引き起こすことによって達成することができ、他の実施形態では、外因性ドナー修復テンプレートを提供することができる。

本発明では、本技術分野における従来の技術を使用してヌクレアーゼを細胞に導入することができ、たとえば、ベクター転換、マイクロ注射、トランスフェクション、脂質トランスフェクション、熱ショック、エレクトロポレーション、形質転換、遺伝子銃、マイクロ注射、ＤＥＡＥ－グルカン仲介転移などを用いて、ヌクレアーゼを細胞に導入することができ、好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞であってもよく、前記導入の方式は、エレクトロポレーションであってもよい。

「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球細胞」は、当技術分野で認められたものであり、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含む。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などのＴヘルパー（Ｔｈ）細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）腫瘍浸潤性細胞毒性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞又は任意のその他のＴ細胞亜集団であってもよい。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞であってもよい。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現するように修飾される。

本発明では、ヌクレアーゼを使用して細胞内のＰＤ１遺伝子を編集することができ、前記ヌクレアーゼは、ＰＤ１遺伝子上の標的配列に対して結合したり切断したりことができる。前記ヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド配列に二本鎖切断を導入することができ、前記二重鎖切断は、ドナー修復テンプレートなどのポリヌクレオチドテンプレートの非存在下で、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復してもよいし、ドナー修復テンプレートの存在下で、相同指向性修復（ＨＤＲ）すなわち相同組換えによって修復してもよい。

本発明では、ヌクレアーゼとは、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン及び１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指す。本発明のヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼ又は人工的に修飾されたヌクレアーゼから設計および／または修飾されるものであってもよい。本発明のヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬｓ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及びクラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む。好ましい実施形態では、本発明のヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む。

本発明では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｃａｓヌクレアーゼ及びＣａｓヌクレアーゼを標的部位に募集する１つ以上のＲＮＡを含み、例えば、トランス活性化ｃＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」の１つのポリヌクレオチド配列を設計することができる。

一実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含み、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡと標的錯体を形成して、ＰＤ１遺伝子座内にあるプロトスペーサー標的配列に対して、部位特異的ＤＮＡ認識及び部位特異的切断を行う。プロトスペーサーモチーフに隣接する短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、Ｃａｓ／ＲＮＡ錯体の募集に作用を果たす。Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドに特異的なＰＡＭモチーフを認識する。

本発明では、Ｃａｓ酵素は、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ酵素、好ましくはＩＩ型Ｃａｓ酵素である。本発明のＩＩ型Ｃａｓ酵素は、任意のＣａｓ酵素であってもよく、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、及び本分野で知られている他のヌクレアーゼ、並びにそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限られない。

好ましい実施形態では、本発明のＣａｓ酵素は、Ｃａｓ９であり、さらに好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌又はストレプトコッカス・サーモフィルスに由来するＣａｓ９である。ここでは、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌又はストレプトコッカス・サーモフィルスに由来することは、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌又はストレプトコッカス・サーモフィルスに由来又は派生すると理解すべきである。派生する酵素の場合、野生型酵素との配列相同性が高いことを意味し、たとえば、特定の部位が突然変異または修飾されている。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ又はＤ９８６Ａ及び／又はその他の１つ以上の、Ｃａｓ酵素のＲｕｖＣ１又はＨＮＨドメインでの突然変異から選択される１つ以上の突然変異を含む。好ましい実施形態では、前記Ｃａｓ酵素突然変異は、化膿レンサ球菌（Ｄ１０Ａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｄ９Ａ）、トレポネーマデンティコラ（Ｄ１３Ａ）、髄膜炎菌（Ｄ１６Ａ）、化膿レンサ球菌（Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ又はＮ８６３Ａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ又はＮ６２２Ａ）、トレポネーマデンティコラ（Ｄ８７８Ａ、Ｈ８７９Ａ又はＮ９０２Ａ）、及び髄膜炎菌（Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ又はＮ６１１Ａ）を含む。

一実施形態では、Ｃａｓ酵素は、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異を有し、転写する際に、このｔｒａｃｒペアリング配列がこのｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされ、且つこのガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体とこの標的配列との配列特異的結合をガイドし、この酵素は、機能ドメインをさらに含む。

他の実施形態では、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、以下の種からも得ることができる。エンテロコッカス・フェシウム（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア・イノキュア（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、リステリア・イバノビ（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、ｂ群溶血性連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・ボヴィス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ｂ群溶血性連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・エクイナス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ガロリティカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、サルミュータンス菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａ）、ストレプトコッカス・マカカエ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、化膿レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ミティス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ガロリティカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、豚レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ベスティブラリス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ダウネイ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）、ナイセリア・バシリフォルミス（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア‐フラヴェセンス（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア‐ラクタミカ（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、髄膜炎菌（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・フラベセンス（ｎ． ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ラブレ菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ブーフナー菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、カセイ菌（ｌ．ｃａｓｅｉ）、乳酸菌、ラクトバチルス・ファーメンタム（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｉｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、イエンセン乳酸杆菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサスｇｇ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ｇｇ）、ラクトバチルス・ルミニス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリウス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・マツルショッティ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ウエルシュ菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、トレポネーマ・ヴァンサン（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、トレポネーマ・ファージデニス（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ）及びトレポネーマ・デンティコラ（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）。

他の実施形態では、前記ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１から選択されてもよく、Ｃｐｆ１は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、アシドアミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プレボテーラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ）、ラクノスピラ属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などを含むが、これらに限定されない細菌種から得ることができる。

本発明では、ガイド核酸配列ｓｇＲＮＡは遺伝子に特異的であり、かつこの遺伝子を標的としてＣａｓ核酸エンドヌクレアーゼ誘導二重鎖切断を行う。ガイド核酸配列の配列は、遺伝子の遺伝子座内であってもよい。一実施形態では、ガイド核酸配列の長さは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個以上のヌクレオチドである。

ガイド核酸配列は任意の遺伝子に特異的であってもよく、本発明では、ｓｇＲＮＡはＰＤ１遺伝子に特異的である。

本発明では、ドナー修復テンプレートは、１つ以上の相同アームを含む。「相同アーム」とは、ドナーテンプレートにおいてヌクレアーゼにより標的部位に導入された、ＤＮＡの切断両側のＤＮＡ配列が完全に同じであるか又はほぼ完全に同じである核酸配列を指す。

一実施形態では、ドナーテンプレートは、５’相同アームを含み、前記５’相同アームは、ＤＮＡ切断部位の５’でのＤＮＡ配列と完全に同じであるか又はほぼ完全に同じである核酸を含む。他の実施形態では、ドナーテンプレートは、３’相同アームを含み、前記３’相同アームは、ＤＮＡ切断部位の３’でのＤＮＡ配列と完全に同じであるか又はほぼ完全に同じである核酸を含む。好ましい実施形態では、ドナーテンプレートは、５’相同アーム及び３’相同アームを含む。

本発明の相同アームは、適切な長さを有し、１００ｂｐ～３０００ｂｐを含むがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、相同アームの長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ又は３０００ｂｐ又はそれ以上の相同アーム、及び、すべての中間長さを含む相同アームから選択することができる。

好ましい実施形態では、ドナーテンプレートは、５’相同アーム、ＣＡＲ及び３’相同アームを含む。

好ましい実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む外因性ドナーテンプレートによって、ＣＡＲをＰＤ１の遺伝子座に挿入する。

ＣＡＲは、標的抗原（たとえば、腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性と、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインとを組み合わせて、キメラタンパク質を生成する分子であり、前記キメラタンパク質は、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を呈する。

本発明では、ＣＡＲは、特異的標的抗原に結合される細胞外ドメイン（結合ドメイン又は抗原特異的結合ドメインとも呼ばれる）、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

一実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞で発現された標的ポリペプチドたとえば標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。結合ドメインは、生体分子（たとえば、細胞表面受容体又は腫瘍タンパク質、脂質、多糖又は他の細胞表面標的分子又はその成分）を特異的に認識し結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドを含むことができる。結合ドメインは、関心生体分子の任意の天然に存在するか、合成されるか、半合成されるか、又は組換えて生成された結合パートナーを含む。

さらに、細胞外結合ドメインは、抗体又はその抗原結合断片を含む。

抗体とは、少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドとする結合剤であり、前記軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域は、標的抗原を特異的に認識して結合するエピトープであり、例えば、ペプチド、脂質、多糖、又は抗原決定クラスターを含有する核酸例えば、免疫細胞により認識される核酸である。抗体は、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体又はそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ）′２断片、Ｆ（ａｂ）′３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディー、ダイアボディー、トリボディー、テトラボディー、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）及び単一ドメインン抗体（ｓｄＡｂ、ナノ抗体）又は他の抗体断片などの抗原結合断片を含む。好ましい実施形態では、結合ドメインはｓｃＦｖである。

一実施形態では、前記ＣＡＲは、α葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｋａｐｐａ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２及びＷＴ－１から選択されるいずれか又は任意の幾つかの抗原の細胞外ドメインと結合することを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、各ドメインの間にリンカー残基を含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に連結し、前記２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供するアミノ酸配列であり、同じ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子への特異的結合親和性を得られたポリペプチドに保持させる。具体的な実施例では、リンカーは、１つ以上の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを分離する。具体的な実施例では、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以上のリンカーを含む。具体的な実施例では、リンカーの長さは約１個のアミノ酸～約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸、又は約１０個のアミノ酸～約２０個のアミノ酸又は任意の中間長さのアミノ酸である。いくつかの実施例では、リンカーの長さは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個以上のアミノ酸である。

一実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインの後は、１つ以上の「スペーサードメイン」であり、前記スペーサードメインは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離れるように移動させて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を実現する領域である。スペーサードメインは、天然、合成、半合成又は組換えに由来することができる。いくつかの実施例では、スペーサードメインは、免疫グロブリンの一部であり、ＣＨ２及びＣＨ３などの１つ以上の重鎖不変領域を含む。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンのヒンジ領域又は変更された免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３を含む。

ＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含み、膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成又は組換えに由来してもよい。一実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα又はβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４及びＰＤ－１の群の１つ以上の膜貫通ドメインを含むか又はそれらから誘導する１つ以上の膜貫通ドメインを含むことができる。

ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達してエフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲと結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合に伴って引き出される他の細胞応答を含め、活性化、サイトカイン産生、増殖および細胞傷害活性を引き出す。

細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」及び１つの「一次シグナル伝達ドメイン」を含み、適切な一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄを含む。

「共刺激シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。適切な共刺激分子は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ及びＺＡＰ７０を含む。

発明の詳細な説明：
一態様では、本発明は、細胞内のＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行う方法を提供し、前記方法は、ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを用いてＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行うステップを含み、前記ｓｇＲＮＡはヌクレアーゼを誘導してＰＰＤ１遺伝子を切断して切断部位を形成する。

さらに、ＰＤ１を標的とする前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～６のうちの１本又は任意の複数本に示す配列を含む。

さらに、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１から選択される１つ又は任意の複数である。

好ましい実施形態では、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり、好ましくは、前記Ｃａｓ９は、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌又はストレプトコッカス・サーモフィルスに由来するＣａｓ９から選択される。

一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、塩基の化学修飾をさらに含む。好ましい実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、５’末端の１～ｎ番目の塩基の任意の１つ、任意のいくつか又は任意の連続的ないくつかの塩基の化学修飾、及び／又は３’末端の１～ｎ番目の塩基の任意の１つ、任意のいくつか又は任意の連続的ないくつかの塩基の化学修飾を含み、前記ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される。好ましくは、ｓｇＲＮＡは、５’末端の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの塩基の化学修飾、及び／又は３’末端の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの塩基の化学修飾を含む。たとえば、ｓｇＲＮＡの５’末端の１番目の塩基、２番目の塩基、３番目の塩基、４番目の塩基、５番目の塩基又は１～２番目の塩基、１～３番目の塩基、１～４番目の塩基、１～５番目の塩基に対して化学修飾を行い、及び／又は、ｓｇＲＮＡの３’末端の１番目の塩基、２番目の塩基、３番目の塩基、４番目の塩基、５番目の塩基又は１～２番目の塩基、１～３番目の塩基、１～４番目の塩基、１～５番目の塩基に対して化学修飾を行う。好ましい実施形態では、前記化学修飾は、メチル化修飾、メトキシ修飾、フッ素化修飾又はチオ修飾のうちの１つ又は任意の複数である。

前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４～５の１つ又は任意の複数本を含む。

さらに好ましくは、標的配列の５’末端の前の３つの塩基に対して２－メトキシ修飾及び／又はチオ修飾を行い、さらに好ましくは、標的配列の５’末端の前の３つの塩基に対して全て２－メトキシ修飾及びチオ修飾を行う。

さらに、前記方法は、ドナー修復テンプレートを提供するステップをさらに含む。

さらに、前記ドナー修復テンプレートは、相同アームを含み、前記相同アームは、５’相同アーム及び／又は３’相同アームを含み、好ましくは、前記５’相同アームの長さは１００ｂｐ～３０００ｂｐ、前記３’相同アームの長さは１００ｂｐ～３０００ｂｐである。

さらに、前記ドナー修復テンプレートは、外因性配列をさらに含む。

さらに、前記ドナー修復テンプレートは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。

さらに、前記ＣＡＲは、特異的標的抗原に結合される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

さらに、前記細胞外ドメイン標的の抗原は、α葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｋａｐｐａ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２及びＷＴ－１から選択される１つ又は任意の複数である。

さらに、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα又はβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４から選択される任意の１つ又は任意の複数の膜貫通ドメインである。

さらに、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む。

好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞である。

さらに、ヌクレアーゼ、ｓｇＲＮＡ及びドナー修復テンプレートを細胞に導入する方式は、ベクター転換、マイクロ注射、トランスフェクション、脂質トランスフェクション、熱ショック、エレクトロポレーション、形質転換、遺伝子銃を含む。ここでのベクターは、ヌクレアーゼ、ｓｇＲＮＡ又はドナー修復テンプレートをベクターに組換え、その後、ベクターを細胞に形質転換するものとして理解すべきである。好ましくは、エレクトロポレーションの方式を用いることができる。さらに好ましくは、ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを複合体とし、又はヌクレアーゼ、ｓｇＲＮＡ及びドナー修復テンプレートを複合体とし、さらにエレクトロポレーションする方式によって複合体を細胞に導入する。

他の態様では、本発明は、細胞内のＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行うためのｓｇＲＮＡをさらに提供する。

他の態様では、本発明は、上記ｓｇＲＮＡの、細胞内のＰＤ１遺伝子に対する遺伝子編集における使用をさらに提供する。

他の態様では、本発明は、上記遺伝子編集方法で製造された遺伝子編集細胞をさらに提供する。

他の態様では、本発明は、上記方法で製造された遺伝子編集細胞の、腫瘍免疫治療又はがん免疫治療製品の製造における使用をさらに提供する。

一実施形態では、上記製造された遺伝子編集細胞を用いて腫瘍免疫治療又はがん免疫治療製品を製造する場合、細胞は、好ましくはＴ細胞であり、好ましい実施形態では、上記遺伝子編集されたＴ細胞を製造する際に、ドナー修復テンプレートは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

さらに、前記腫瘍又はがんは、メラノーマ、バーキットリンパ腫、白血病、肉腫、リンパ腫、多発性骨髄腫、脳がん、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳がん、膵臓がん、肺がん、胃がん、甲状腺がん、肝臓がん、前立腺がん、食道がん、腎臓がん、膀胱がん及び胆嚢がんから選択される１つ又は任意の複数である。

本発明に係るｓｇＲＮＡは、ＰＤ１遺伝子座の効率的な切断、外因性配列のＰＤ１の特定の部位での効率的な組み込みを実現し、外因性配列のＰＤ１の特定の部位での組換え効率を効果的に高め、ｓｇＲＮＡの細胞内での安定性を高め、ｓｇＲＮＡによる細胞自然免疫反応を低下させ、細胞の生存率を高める。

Ｔ７Ｅ１法でＰＤ１をスクリーニングしてｓｇＲＮＡ配列を効率的に切断する。ＰＤ１を標的とする６本の異なるｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ４、ｓｇＲＮＡ７、ｓｇＲＮＡ９及びｓｇＲＮＡ１０）をそれぞれＣａｓ９タンパク質と混合し、ヒトＴ細胞に導入し、７２ｈ後に細胞を収集してＴ７Ｅ１検出を行う。 フロー法でＰＤ１をスクリーニングしてｓｇＲＮＡ配列を効率的に切断する。ＰＤ１を標的とする２本のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ７及びｓｇＲＮＡ９）をそれぞれＣａｓ９タンパク質と混合し、ヒトＴ細胞に導入し、７２ｈ後に細胞を収集し、ＰＤ１発現をフロー検出してノックアウト率を計算する。 蛍光タンパク質レポーター遺伝子を外因性配列として使用し、部位特異的挿入効率を検出する。ＰＤ１を標的とする２本のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ７及びｓｇＲＮＡ９）をそれぞれＣａｓ９タンパク質及び蛍光タンパク質レポーター遺伝子の外因性ＤＮＡ配列と混合し、ヒトＴ細胞に導入し、７日後に細胞を収集してレポーター遺伝子の組み込み率をフロー検出する。 ＰＤ１－ｓｇＲＮＡ９部位でＰＤ１遺伝子の効率的なノックアウト及び外因性配列の効率的な組み込みを同時に実現することができる。ＰＤ１を標的とする１本の効率的なｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ９）をＣａｓ９タンパク質及び蛍光タンパク質レポーター遺伝子の外因性ＤＮＡ配列と混合し、ヒトＴ細胞に導入し、３日後に細胞を収集してレポーター遺伝子の組み込み率及びＰＤ１ノックアウト率をフロー検出する。 ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴの陽性率をフロー検出する。ＰＤ１を標的とする１本の効率的なｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ９）をＣａｓ９タンパク質及びＣＤ１９－ＣＡＲＴの外因性ＤＮＡ配列と混合し、異なる個体由来の２つのヒトＴ細胞に導入し、７日後に細胞を収集してＣＤ１９－ＣＡＲＴ組み込み率をフロー検出する。 ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴの増幅及び生存。ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞と、従来のレンチウイルスで製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞とのインビトロ増幅レート及び生存率を比較する。 ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴのＴ細胞の活性化検出。ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞及びレンチウイルスで製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞をそれぞれＰＤＬ１を過剰発現したＲａｊｉ腫瘍標的細胞と共培養し、２４ｈ後に細胞を収集し、Ｔ細胞活性化ｍａｒｋｅｒの発現をフロー検出し、本発明のｓｇＲＮＡを用いて、ＰＤ１がノックアウトされ部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴを構築することができ、従来のレンチウイルス方法で製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴと比較すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化度が高い。 ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴのインビトロ殺傷検出。ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞及びレンチウイルスで製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞をそれぞれＰＤＬ１を過剰発現したＲａｊｉ腫瘍標的細胞と共培養し、インビトロ殺傷をＬＤＨ法で検出し、本発明のｓｇＲＮＡを用いて、ＰＤ１がノックアウトされ部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴを構築することができ、従来のレンチウイルス方法で製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴと比較すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞はより高いインビトロ抗腫瘍能力を有する。

以下の特定の実施例および図を参照して、本発明をさらに詳細に説明し、本発明の請求内容は、以下の実施例に限定されない。本発明の概念の要旨および範囲から逸脱することなく、当業者が考えることができる変更および利点はすべて本発明に含まれ、添付の特許請求の範囲は保護範囲である。本発明を実施するための過程、条件、試薬、実験方法等は、以下に具体的に述べる内容を除いて、すべて当分野の知識および周知常識であり、本発明に特別な制限はない。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローン、実験室手帳（New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989）の記載、またはメーカーの推奨条件に従う。

１、ｓｇＲＮＡの設計：
（１）ＮＣＢＩによってヒトＰＤ１ゲノム配列を照会し、エクソンＮｏ．１、エクソンＮｏ．２又は重要なタンパク質コード領域を選択してｓｇＲＮＡ設計を行い、設計したｓｇＲＮＡの標的配列は次のとおりである。
ｓｇＲＮＡ１： ｔｇｔａｇｃａｃｃｇｃｃｃａｇａｃｇａｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）
ｓｇＲＮＡ３： ｇｔｃｔｇｇｇｃｇｇｔｇｃｔａｃａａｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）
ｓｇＲＮＡ４： ａｇｇｃｇｃｃｃｔｇｇｃｃａｇｔｃｇｔｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
ｓｇＲＮＡ７： ｇｇｇｃｇｇｔｇｃｔａｃａａｃｔｇｇｇｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）
ｓｇＲＮＡ９： ｃｇａｃｔｇｇｃｃａｇｇｇｃｇｃｃｔｇｔ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）
ｓｇＲＮＡ１０： ｃｔａｃａａｃｔｇｇｇｃｔｇｇｃｇｇｃｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）

（２）各ｓｇＲＮＡのｏｌｉｇｏを合成し、アニーリングし、ＰＸ４５８ベクターに連結する。

２、標的部位のスクリーニング：
２－１ Ｔ７Ｅ１酵素切断：
（１）Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡを細胞に形質導入し、ゲノムＤＮＡを抽出する。

（２）ｓｇＲＮＡ標的部位位置に対してＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ後に標的部位を含むＤＮＡ断片を取得し、ＤＮＡゲル抽出キットを使用して精製する。

（３）Ｔ７Ｅ１酵素切断・分析：精製後のＰＣＲ生成物をアニーリング処理し、アニーリングプロセスは、以下のとおりである。

アニーリング後の生成物にＴ７Ｅ１酵素を加えて処理し、３７℃で３０分間インキュベートし、ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えして反応を停止する。

（４）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：サンプルをポリアクリルアミドゲルに加え、電気泳動タンクに１ｘＴＢＥ溶液を加え、ブロモフェノールブルーがポリアクリルアミドゲルの底部に移動するまで、定電圧１００Ｖで電気泳動する。ゲルを取り出し、ＥＢを含むＴＢＥ溶液に１０分間浸し、ポリアクリルアミドゲルを取り出し、紫外線下で結像する。

（５）切断率をグレースケール分析し、その中から効率的な標的部位を選択する。

２－２ ノックアウト率のフロー検出：
（１）Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡを細胞に形質導入し、２～３日後に細胞を収集する。

（２）フロー緩衝液にて細胞を１回洗浄した後、ＰＤ１抗体をインキュベートして染色し、氷上で３０分間インキュベートする。

（３）フロー緩衝液にて細胞を２回洗浄する。

（４）適切な体積のフロー緩衝液にて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。

（５）ＰＤ１発現量の変化を検出し、ノックアウト率を計算し、その中から効率的な標的部位を選択する。

２－３外因性配列の組換え率検出：
（１）Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ及び外因性ＤＮＡを細胞に形質導入し、７日後に細胞を収集する。

（２）フロー緩衝液にて細胞を１回洗浄した後、外因性タンパク質の発現を検出できる抗体等をインキュベートして染色し、氷上で３０分間インキュベートする。

（３）フロー緩衝液にて細胞を２回洗浄する。

（４）適切な体積のフロー緩衝液にて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。

（５）外因性タンパク質が発現した細胞の割合を検出し、その中から高い組換え率の標的部位を選択する。

ＰＤ１遺伝子に対する６本のｓｇＲＮＡとして、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ４、ｓｇＲＮＡ７、ｓｇＲＮＡ９及びｓｇＲＮＡ１０を利用してノックアウト効率の検証を行い、図１に示すように、Ｔ７Ｅ１法を利用してノックアウト率を検出した結果、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ７及びｓｇＲＮＡ９は高いノックアウト率を有する（図１）。

さらにフロー法を用いて、ｓｇＲＮＡ７及びｓｇＲＮＡ９のノックアウト率を検証する。その結果、両者がいずれも高いノックアウト率を有し、図２に示すように、結果は、Ｔ７Ｅ１と一致している。

その後、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２蛍光タンパク質レポーター遺伝子を外因性ドナー配列とし、ｓｇＲＮＡ７及びｓｇＲＮＡ９を部位特異的に挿入する効率を検出する。その結果、ｓｇＲＮＡ７及びｓｇＲＮＡ９は、いずれも高い部位特異的組み込み効率を示し、図３に示すように、そのうち、ｓｇＲＮＡ７の部位特異的挿入効率は１５．２％に達し、ｓｇＲＮＡ９の部位特異的挿入効率は２３．９％に達する。

引き続き、ｓｇＲＮＡ９の部位特異的挿入をフロー検出し、その結果、ｓｇＲＮＡ９に部位特異的に組み込む蛍光タンパク質陽性細胞はいずれもＰＤ１陰性の細胞であり（図４に示す）、さらに、この方法が外因性配列の部位特異的組み込みを実現できることが実証される。

３、ＰＤ１がノックアウトされた強化ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の構築：
以下、ｓｇＲＮＡ９を例としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を組み合わせ、ＰＤ１がノックアウトされた強化ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞をワンステップで構築する。

３－１、ｓｇＲＮＡ９の用意：
ｓｇＲＮＡ９を合成し、最終濃度１０ｕｇ／ｕＬになるまで、ＴＥ緩衝液に溶解する。

３－２、エレクトロポレーション法を採用してＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴを製造する。

機器と材料：
１ Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ^TM Ｓｙｓｔｅｍ ニュークリアフェクター
２ キットは、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ^TM Ｘ Ｋｉｔ、Ｌｏｎｚａ、 Ｖ４ＸＰ－３０２４
３ ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで２～３日刺激された後のＴ細胞
４ 商品化されたｓｐＣａｓ９タンパク質（１０ｕｇ／ｕｌ）（Ａｌｔ－Ｒ(R) Ｓ．ｐ． Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ３ＮＬＳ、ＩＤＴ）
５ 合成されたｓｇＲＮＡ９

具体的な操作ステップ：
１００μｌ仕様のエレクトロポレーションカップに適用：
（１）８２μｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＋１８μｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ／各エレクトロポレーションカップで、エレクトロポレーショントータルに応じて、エレクトロポレーション液ｍｉｘを調製し、均一に混合し、室温で放置。

（２）Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ９を共インキュベートし、室温で１０ｍｉｎ放置し、ＲＮＰを形成する。

（３）ＲＮＰに「ｄｏｎｏｒ」外因性ドナーＤＮＡ（相同アームを含む外因性ＣＤ１９－ＣＡＲＴ ＤＮＡ）を加え、室温で２ｍｉｎインキュベートする。

前記ＣＤ１９－ＣＡＲＴは、ＣＤ１９を標的とする細胞外ドメイン、ＣＤ８αから選択される膜貫通ドメイン、及び、ＣＤ３ζ及びＣＤ１３７から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含み、また、ＣＤ１９－ＣＡＲＴの５’及び３’末端に相同アームが設けられ、上下流の相同アーム配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８に示すとおりである。

（４）活性化状態のＴ細胞を収集し、５×１０^６カウントするごとにエレクトロポレーション反応を１回行う。

（５）細胞と「ＲＮＰ＋ｄｏｎｏｒ」を十分に混合し再懸濁し、エレクトロポレーションカップに加える。

（６）エレクトロポレーション装置を開き、エレクトロポレーションカップをスロットホールに入れ、対応するプログラム（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ）を選択してエレクトロポレーションを行う。

（７）細胞を予熱された細胞培地に添加し、セルインキュベータで培養する。

３－３、ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の評価
上記「ｄｏｎｏｒ」外因性ドナーＤＮＡを外因性ＤＮＡ配列とし、２つの異なるドナー（Ｄｏｎｏｒ－１及びＤｏｎｏｒ－２）のＴ細胞において、ＰＤ１－ｓｇＲＮＡ９部位のいずれでも高い部位特異的組み込み率を有することを証明し、図５に示すように、部位特異的組み込み効率は２０％～３０％に達する。

また、ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴの細胞（ＰＤ１－ＣＤ１９－ＣＡＲＴ）を従来のレンチウイルスで製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ１９－ＣＡＲＴ（Ｌｅｎｔｉ））と比較すると、細胞増幅レートが等しいが、図６に示すように、ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴの細胞は、従来のレンチウイルスで製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞と比較して、より高い細胞生存率を示している。

ＰＤＬ１を過剰発現したＲａｊｉ腫瘍細胞（バーキットリンパ腫細胞）と共培養し、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９及びＣＤ１３７の発現をフロー検出した結果、図７に示すように、ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞（ＰＤ１－ＣＤ１９－ＣＡＲＴ）は、従来のレンチウイルスで製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ１９－ＣＡＲＴ（Ｌｅｎｔｉ））と比較して、類似するＣＤ６９発現及びより高いＣＤ１３７発現を有する。

ＬＤＨ法を利用してインビトロ殺傷を検出したところ、図８に示すように、ＰＤ１に部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞（ＰＤ１－ＣＤ１９－ＣＡＲＴ）は、従来のレンチウイルスで製造されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ１９－ＣＡＲＴ（Ｌｅｎｔｉ））と比較して、ＰＤＬ１を過剰発現したＲａｊｉ腫瘍細胞をより強く殺傷する能力を有する。

以上のように、本発明のｓｇＲＮＡを使用し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を組み合わせると、ＰＤ１がノックアウトされ部位特異的に組み込まれたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞をワンステップで構築することができる。この方法は、従来のレンチウイルス法と比較すると、ＣＡＲ－Ｔ製造過程においてウイルスを使用することによるコストを低減し、ＣＡＲ－Ｔ療法の治療費用を大幅に低減することができる。一方、この方法は、ＣＡＲ－ＴエレメントをＰＤ１遺伝子座の特定部位に指向的に挿入することで、ウイルスのランダム挿入による潜在的な安全リスクを減少させることができる。また、この方法は、ＰＤ１がノックアウトされた強化ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞をワンステップで構築し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍能力を高めることができる。この実施例は、本発明が保護するｓｇＲＮＡの重要性及び価値を証明するが、ＰＤ１の特定部位にＣＤ１９－ＣＡＲＴ外因性配列を指向的に挿入することに限定されず、他のＣＡＲＴ配列や免疫治療他の療法の開発まで広げることができる。

Claims (13)

1. 細胞内のＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行う方法であって、
   ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを細胞に導入することにより、ＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行うステップを含み、前記ｓｇＲＮＡはヌクレアーゼによるＰＰＤ１遺伝子の切断を誘導して切断部位を形成し、
   ＰＤ１を標的とする前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～６のいずれかに示す配列を含み、好ましくは、ＰＤ１を標的とする前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４及び／又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示す配列を含む、ことを特徴とする方法。
2. 前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１から選択される１つ又は任意の複数であり、好ましくは、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり、さらに好ましくは、前記Ｃａｓ９は、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌又はストレプトコッカス・サーモフィルスに由来するＣａｓ９から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ｓｇＲＮＡは塩基の化学修飾をさらに含み、好ましくは、前記化学修飾は、メチル化修飾、メトキシ修飾、フッ素化修飾又はチオ修飾のうちの１つ又は任意の複数である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. ドナー修復テンプレートを提供し、ドナー修復テンプレートを細胞に導入するステップをさらに含み、好ましくは、前記ドナー修復テンプレートは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 前記ＣＡＲは、特異的標的抗原に結合される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記細胞外ドメインが標的とする抗原は、α葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＬＡ－Ａ３＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｋａｐｐａ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２及びＷＴ－１から選択される１つ又は任意の複数であり、
   好ましくは、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα又はβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４から選択される任意の１つ又は任意の複数の膜貫通ドメインであり、
   さらに好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含み、
   さらに好ましくは、前記一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ６６ｄのうちの１つ又は任意の複数を含み、
   さらに好ましくは、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ又はＺＡＰ７０から選択される１つ又は任意の複数である、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 前記ヌクレアーゼ、ｓｇＲＮＡ又はドナー修復テンプレートを細胞に導入する方式は、ベクター転換、トランスフェクション、熱ショック、エレクトロポレーション、形質転換、遺伝子銃、マイクロ注射を含み、好ましくは、エレクトロポレーションの方式を用い、さらに好ましくは、ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを複合体とし、又はヌクレアーゼ、ｓｇＲＮＡ及びドナー修復テンプレートを複合体とし、さらにエレクトロポレーションの方式によって複合体を細胞に導入する、ことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. 請求項１～８のいずれかに記載の方法で製造された遺伝子編集細胞。
10. 請求項９に記載の細胞の、腫瘍免疫治療又はがん免疫治療製品の製造における使用。
11. 細胞内のＰＤ１遺伝子に対して遺伝子編集を行うｓｇＲＮＡであって、
    ＰＤ１を標的とする前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～６のいずれかに示す配列を含み、好ましくは、ＰＤ１を標的とする前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４及び／又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示す配列を含む、ことを特徴とするｓｇＲＮＡ。
12. 前記ｓｇＲＮＡは、塩基の化学修飾をさらに含み、好ましくは、前記化学修飾は、メチル化修飾、メトキシ修飾、フッ素化修飾又はチオ修飾のうちの１つ又は任意の複数である、ことを特徴とする請求項１１に記載のｓｇＲＮＡ。
13. 請求項１１又は１２に記載のｓｇＲＮＡの細胞内のＰＤ１遺伝子に対する遺伝子編集における使用。

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