JP2022531637A - 子宮頸がんの早期検出のためのｄｎａメチル化バイオマーカー - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトゲノム（すなわち、ＣＧＩＤ）における絶妙なＤＮＡメチル化位置としてＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得するためのインビトロ方法を開示し、これは、特にまだアクセスできない初期段階で、「カテゴリー」的なＤＮＡメチル化変化の進行を前がん病変の３つステージ（子宮頸部上皮内腫瘍（CIN））、CIN1からCIN3への進行で調べることによって子宮頸がんを予測する。本発明は、それらのＤＮＡメチル化状態を測定し、子宮頸がんのバイオマーカーとして有用である「メチル化スコア」を導出することにより、子宮頸がんを高い特異性及び感度で検出するためのＣＧＩＤの組み合わせを開示する。マルチプレックス次世代シーケンシングメチル化アッセイ、パイロシーケンシングアッセイ及びメチル化特異的PCRを使用してそのようなCGIDを使用して子宮頸がんを予測するためのキットも開示されている。本発明に記載のＤＮＡメチル化マーカー（ＣＧＩＤ）は、子宮頸がんを検出するための当業者による子宮頸部のスクリーニング及び子宮頸がんの早期検出に有用である。【選択図】図１

Description

［関連出願に対する相互参照］
本願は、２０１８年１２月４日に出願された「子宮頸がんの早期検出のためのＤＮＡメチル化マーカー」と題された米国仮出願シリアル番号６２／７７４，９９４のセクション１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、それぞれの内容は参照により本明細書に援用する。

［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用する。２０２０年１月１２日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＴＰＣ５３８１１ Ｓｅｑ Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で、サイズは３６，８６４バイトである。

［技術分野］
本発明は、一般には、特に分子診断の分野における、ヒトＤＮＡにおけるＤＮＡメチル化シグネチャーに関する。より具体的には、本発明は、パネルの形態のＤＮＡメチル化バイオマーカー、子宮頸がんの早期検出ならびにスクリーニングのためのポリジーンＤＮＡメチル化バイオマーカー（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）の一個及び組み合わせ、ならびに子宮頸がんの早期かつ正確な検出のための診断キットとしてのそれらの使用である。

がんは人間の主要な死因になった。がんの早期検出は、治癒率を大幅に改善し、患者、その家族及び医療システムに対するものすごい個人的及び経済的コストを削減することができる。同時に、前がんステージのバイオマーカーの発現とその変化を評価するための健康な個体のスクリーニングは、集団ワイドスクリーニング方法論に有用であり、リスクが発生しやすく、がんにかかりやすい健康な個人を特定するのに役に立つ。子宮頸がんも例外ではない。スクリーニングは、がんが症状を引き起こす前に、早期にがんを特定することができる。子宮頸がんが最も早いステージで発見された場合、生存の可能性は約９３％であり、最も遅いステージでは１５％まで低下するｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｅｒｖｉｃａｌ－ｃａｎｃｅｒ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ｄｉａｇｎｏｓｉｓ－ｓｔａｇｉｎｇ／ｓｕｒｖｉｖａｌ．ｈｔｍｌ。現在のスクリーニング方法には、パップスメア（Ｐａｐ ｓｍｅａｒ）、液体ベースの細胞診、ＨＰＶ検査及び目視検査が含まれるが、子宮頸がんの早期検出のための安定した高精度で高感度の方法が不足している。

バイオマーカーは、がん診断において最も重要な分野の１つである。がんバイオマーカーは、疾患の早期検出または診断に特に有用である。バイオマーカーは、患者のスクリーニング、がんのさまざまな病期またはグレードの分類、及び予後と治療への耐性の予測に使用できる。

子宮頸部異形成の原因物質としてのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の確立された発見は、二次（分子ＨＰＶ検査）の観点からこの婦人科疾患の予防と管理のモダリティに革命をもたらした（１）。ＨＰＶ １６及び／または１８型は、他の発がん性型よりも病変進行のリスクが高いため、ＨＰＶ遺伝子型の知識は臨床予測に実際に役立つ。ただし、発がん性ＨＰＶ遺伝子型による持続感染は、子宮頸がん発生に必要な前駆体及び駆動者である。後者は、前がんステージ（子宮頸部上皮内腫瘍（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐ
ｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、ＣＩＮ）から浸潤性子宮頸がんへの段階的な進行を表している。低悪性度ＣＩＮ（ＣＩＮ１）は非常に可逆的であるが、グレード２及び３の高悪性度ＣＩＮ（つまり、それぞれＣＩＮ２及びＣＩＮ３）は、浸潤、すなわち子宮頸がんに進行するリスクを無視できない。これは特にＣＩＮ３に当てはまる。

クリニックでＣＩＮ病状のある女性を管理することは、婦人科医にとって重大なジレンマを引き起こし続ける。積極的な切除または切除治療は、女性患者が妊娠を決定したときに、即時の合併症を引き起こしたり、その後流産や早産のリスクを高めたりする可能性があるためである。最近の証拠は、特定の遺伝子の後成的変化が発がん性の進行を媒介または予測する可能性があることを示唆している。がんの早期検出バイオマーカーは、後成的なレベルでの生化学的変化を含む顕著な変化により、無症候性及び前がんステージで病変を有するまれな細胞を分類的に区別することができる。バイオマーカーとしてのこれらの後成的変化は、がん性組織で異常に大量に生成されることが非常に多く、疾患自体の発現を妨げることがよくある。病気の発症と進行のかなり前に、分子の変化を特定するには、分子バイオマーカーの開発が非常に重要である。そのような後成的なバイオマーカーの１つである、ウイルス及び宿主遺伝子の特定のＣｐＧサイト（ｓｉｔｅ）のＤＮＡメチル化レベルは、根底にある子宮頸部病変の重症度とともに増加することが示された（２－７）。

子宮頸がんとその前駆体に関連する後成的な変化を伴う最も研究され、標的とされている宿主遺伝子は、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）；死亡関連プロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１）；ミエリンとリンパ球、Ｔ細胞分化タンパク質（ＭＡＬ）；ペアボックス１（ＰＡＸ１）；テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）；赤血球膜タンパク質バンド４．１－様３（ＥＰＢ４１Ｌ３）、Ｒａｓアソシエーションドメインファミリーメンバー１（ＲＡＳＳＦ１）；ＳＲＹ－ボックス１（ＳＯＸ１）；カドヘリン１（ＣＤＨ１）；ＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ）；サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）；配列類似性１９メンバーＡ４、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン様（ＦＡＭ１９Ａ４）のファミリー；及びレチノイン酸受容体ベータ（ＲＡＲβ）８である。２つ（すなわち、ＣＡＤＭ１とＭＡＬ（３，４，１０）、ＭＡＬとｍｉＲ１２４－２（１１－１４）、３つ（すなわち、ＣＡＤＭ１、ＭＡＬ、及びｍｉＲ１２４－２）（１３，１５）、４つ（すなわち、ＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＴＥＲＴ、及びＣ１３０ＲＦ１８）（１６，１７）、及び５つ（すなわち、ＰＡＸ１、ＤＡＰＫ１、ＲＡＲβ、ＷＩＦＩ、及びＳＬＩＴ２）（１４）のマーカーパネル、並びにＳＯＸ１、ＰＡＸ１、ＬＭＸ１Ａ、及びＮＫＸ６－１マーカーのさまざまな組み合わせを含むパネルに加えて、単一（９）のメチル化マーカーを調査し、進行した病変に対して十分に高い感度を達成した（１８）。

しかし、唯一のこれまでの研究は、ゲノムワイドのメチル化のアプローチを使用して子宮頸部試料中のＣＩＮ２＋の検出のための最高の組み合わせ診断精度で三つのメチルパネル（ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、及びＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ）を同定した。感度はそれぞれ７２％、７４％、７３％と報告されており、対応する特異性は７９％、７６％、７７％である（２）。したがって、ＤＮＡメチル化バイオマーカーの同定方法の改善、子宮頸がんの早期検出とリスク予測に関連するＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネル、並びにそのようなバイオマーカーに基づく、子宮頸がんの早期検出と感受性及び前がん病状のある女性のリスク評価のための明らかに健康な女性の集団ワイドスクリーニングのためのキットが必要である。

現在、初期の子宮頸がんのリスク予測に適切な診断性能を備えた単一または複合メチル化マーカーが不足しているため、本発明は、単一の、組み合わせのならびにパネルベースのバイオマーカーとするＤＮＡメチル化バイオマーカーを使用することによって、子宮頸
がんの早期検出マーカーの欠如に関連する問題に対する解決策を提供する。本発明は、前がん病変から子宮頸がんへの進行の初期バイオマーカーを取得するための方法を開示し、これは、無症候性ならびにＣＩＮ１からＣＩＮ３の病状を示す女性における一般的なスクリーニングに使用できる。

［発明の目的］
本発明の主な目的は、ヒト子宮頸がんの早期検出及び診断のためのバイオマーカーに関する。

本発明のさらなる目的は、「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）（ＡＰＤＭＡ）」と呼ばれる本明細書に開示されるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法に関し、この方法は、本明細書に開示されている線形回帰モデルを使用して、ＤＮＡメチル化バイオマーカーとして組み合わせたときに子宮頸がんの公知のメチル化プロファイルにおいて子宮頸がんを９５％を超える感度と特異性で予測するＣＧＩＤを取得するために、女性からの健康なコントロール標本と比較して、異なるＣＩＮグレードの病状（ＣＩＮ１からＣＩＮ３）を有する女性からの標本のＤＮＡメチル化のゲノムワイドのプロファイルを調べるステップを含む。

本発明の別の目的は、子宮頸がんの早期検出のための、ならびにＣＩＮ１からＣＩＮ３の病状を有する女性のリスク評価のための女性の集団ワイドスクリーニングの指標としての分子バイオマーカーに関する。

本発明のさらに別の目的は、子宮頸がんの早期検出及び診断に有用なチップ／アレイに関する。

本発明のさらに別の目的は、当業者が使用できるヒト子宮頸がんの正確な早期診断のための、より安価で、正確で、安定して、高感度で、特異的で、そして高処理能力の診断キットを提供することである。

したがって、本発明は、ＤＮＡメチル化の変化を調べるのに有用で、ヒト子宮頸癌の早期検出及び診断のためのＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーに関連する方法及び材料を提供し、ここで、前がん性子宮頸部病変（子宮頸部上皮内腫瘍、ＣＩＮグレード１～３）の進行は、本明細書に開示される「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析」（ＡＰＤＭＡ）のインビトロ法を使用して得られるイルミナプローブＩＤまたはＤＮＡメチル化番号またはＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）の形でヒトゲノムのＣＧ位置でのＤＮＡメチル化の頻度の増加と相関する。以下で詳細に説明するように、通常、これらのバイオマーカーは変数に基づいており、これらの変数は、ＣＩＮ１からＣＩＮ３の病状を有する女性のリスクを予測するのに役立ち、同様に発症している子宮頸がんのための集団ワイドスクリーニングにも役立ち、結果として、これらのバイオマーカーは早期検出及び診断バイオマーカーとして有用である。本開示は、前記ＣＧＩＤバイオマーカーの位置が、子宮頸がんではほぼ均一にメチル化され、正常な子宮頸部標本ではほぼ均一に非メチル化されることを提供する。したがって、本発明は、これらのＣＧＩＤサイト（ｓｉｔｅ）でのＤＮＡメチル化の形態で子宮頸がんと非悪性組織との間のバイナリー分化を作り出す前記一連の「カテゴリー的に」区別されるＤＮＡメチル化プロファイルを開示し、それによりこれらのサイトは子宮頸がんにおいてのみメチル化され、非悪性組織では完全にメチル化されていない。さらに、本明細書に開示されるように、これらのバイオマーカーサイトは、ＣＩＮ１からＣＩＮ３へ前がん性子宮頸部病変の進行とともに、ＤＮＡメチル化の頻度の増加を示す。したがって、本発明は、前記ＣＧＩＤバイオマーカーの標的増幅及びディープ次世代バイサルファ
イトシーケンシングを使用して、子宮頸がん細胞の数分子でさえ、またはほとんど正常な子宮頸細胞プロファイルの背景にある前がん病変から子宮頸がんへ変わる途中である細胞でさえも検出する、インビトロでの早期検出及び診断の方法を提供する。したがって、本発明は、非悪性組織の高いバックグラウンドで、特に当業者が使用できる早期検出の簡単でユーザーフレンドリーな方法として、パップスメアなどの子宮頸部標本を使用することで、未だに子宮頸がん細胞の到達できない早期検出に有用である。

本発明の一実施形態は、ＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーシグネチャーの形で得られた、ＭｅＤＩＰアレイ、ＭｅＤＩＰシーケンシングなどを含む次世代シーケンシングによって導出されたゲノムワイドＤＮＡメチル化データの異なるソースを使用する「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）法」と呼ばれる、無症候性及び前がんステージでさえ早期検出のための子宮頸がんの高度に予測可能なサイトを取得するためのインビトロ法に関する。本発明は、ＣＩＮ１からＣＩＮ３に至る進行性前がん病変の標本からのゲノムワイドデータの発見セットにおいて子宮頸がんを検出するための「カテゴリー的な」ＣＧＩＤバイオマーカーの組み合わせを提供する。

古典的な「ケースコントロール」設計とロジスティック回帰を使用した本発明以前の前の分析は、より低い感度と特異性でがんを検出するＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーを明らかにした。したがって、本発明の別の実施形態は、がん状態に主要かつ必須でありそして本明細書の開示で試験されたすべての子宮頸がん標本に存在するがんの最も初期のメチル化プロファイルを明らかにするＡＰＤＭＡ法と呼ばれる、子宮頸がん診断のための早期検出のための候補ＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得するためのコンピューター実装方法に関連する。

本発明の一実施形態は、ターゲット特異的プライマーに続きバーコードプライマーによる連続増幅そして単一の次世代Ｍｉｓｅｑシーケンシング反応でのマルチプレックスシーケンシング、データ抽出、及びメチル化の定量化を用いて、数百人のＣＧＩＤバイオマーカーのポリジーンセット（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｓｅｔ）におけるＤＮＡメチル化を同時に測定することにより、子宮頸がんを正確に検出するインビトロ方法を開示している。

本発明の一実施形態は、パイロシーケンシングアッセイまたはメチル化特異的ＰＣＲを使用して、前記ＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーのメチル化を測定するインビトロの方法を開示する。本発明は、子宮頸がんを予測するポリジーン加重メチル化スコア（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）の計算を開示する。

本発明の一実施形態は、子宮頸部標本からの子宮頸がんの他の臨床的証拠を有さない女性を含む女性からの標本から単離されたＤＮＡのサンプルにおける子宮頸がんのスクリーニング、診断、早期検出及び予測のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルを開示する。

本発明の一実施形態は、子宮頸部標本からの子宮頸がんの他の臨床的証拠を有さない女性を含む女性からの標本から単離されたＤＮＡのサンプルにおける子宮頸がんのスクリーニング、診断、早期検出及び予測のためのチップの形態のＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルを開示する。

本発明の一実施形態は、子宮頸部標本からの子宮頸がんの他の臨床的証拠を有さない女性を含む女性からの標本から単離されたＤＮＡのサンプルにおける子宮頸がんのスクリーニング、診断、早期検出及び予測のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルを使用するインビトロ非侵襲的方法を開示する。

本発明の一実施形態は、子宮頸部標本からの子宮頸がんの他の臨床的証拠を有さない女性を含む女性からの標本から単離されたＤＮＡのサンプルにおける子宮頸がんのスクリーニング、診断、早期検出及び予測のための本明細書に開示されるＤＮＡメチル化バイオマーカーの使用を開示する。

本発明は、ヒトゲノムのＣＧＩＤ位置を使用して同定された安定したＤＮＡメチル化バイオマーカーを提供し、無症候性及び前がん性段階の女性においてさえ子宮頸がんの早期介入及び治療を導くことができる非常に正確で特異的かつ高感度のリスク評価を提供する。本発明は、子宮頸がんを検出するために当業者によって使用され得る、容易であるが効率的な方法を提供する。本発明は、子宮頸がんのための健康な女性の集団ワイドスクリーニング、ならびにＨＰＶ感染及びＣＩＮ前がん病変を有する女性におけるがんリスクのモニタリング及び評価のための、本明細書に記載されたＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーの使用に関する。本発明は、本明細書に開示されたＤＮＡメチル化測定方法に基づくポリジーンスコア（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｓｃｏｒｅ）を使用して、ＣＩＮサンプル中の子宮頸がんを検出する際の開示されたＤＮＡメチル化バイオマーカーの有用性を実証する。本発明はまた、次世代バイサルファイトシーケンシング、ＭｅＤｉｐシーケンシング、イオントレントシーケンシング、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）４５０Ｋアレイ、エピックマイクロアレイ（Ｅｐｉｃ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）などのゲノムワイドバイサルファイトシーケンシングに続いて、本明細書に開示されているＡＰＤＭＡ法を行うための当業者が利用できる任意の方法を使用して、子宮頸がんのための「ポリジーン」カテゴリーＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーを得るための開示された方法の有用性を開示する。該ＡＰＤＭＡ法は、健康なコントロール標本とＣＩＮ１からＣＩＮ３の前がん段階の標本から進行するときに頻度が増加するグラデーションがある子宮頸がん標本との間のＤＮＡメチル化プロファイルのカテゴリーが違うため、子宮頸がんの早期及び非常に早期の検出に有用な特異的かつ高感度のマーカーを発見するためのものである。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の例は、本発明のいくつかの実施形態を示しているが、限定ではなく例示として与えられていることを理解されたい。本発明の範囲内の多くの変更及び修正は、その精神から逸脱することなく行うことができ、本発明は、そのようなすべての修正を含む。

図１は、早期検出ＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得するための進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）法を開発するためのロードマップを示す。該ロードマップは、子宮頸がんの早期検出、診断、及びスクリーニングのための「カテゴリー」ＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーを取得するため、子宮頸がん標本のＤＮＡメチル化プロファイルから子宮頸標本の正常プロファイルをカテゴリー的に区別するイルミナアッセイプローブ同定（ＣＧＩＤ）を使用して、ＤＮＡメチル化プロファイルに基づくＡＰＤＭＡ法を開発するための分析手順を示す。ステップ１では、健康なコントロール標本と比較して、前がん病変のＣＩＮ１からＣＩＮ３ステージの子宮頸標本から、ＤＮＡメチル化測定を取得する。該ＤＮＡメチル化測定は、標本から抽出されたＤＮＡのイルミナビーズチップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｂｅａｄｃｈｉｐ）４５０Ｋまたは８５０Ｋアッセイを実行するか、またはサンプルから抽出されたＤＮＡのＤＮＡパイロシーケンシングを実行するか、または質量分析ベース（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（登録商標））またはＰＣＲベースのメチル化アッセイ、及びバイサルファイト変換されたＤＮＡから本明細書に開示された標的ＣＧＩＤにまたがる領域の標的増幅と、それに続く第２セットでのバーコード増幅及びイルミナの次世代シーケンサーでのインデックス付きマルチプレックスシーケンスを実行することによって取得される。ステップ２では、統計分析法は、ステップ１のＤＮＡメチル化測定に対して実行される。該統計分析は、受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイ、階層的クラスタリング分析アッセイ、またはニューラルネットワークＣ Ｋ分析を含む。ステップ３では、現在開発及び開示されている「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析」（ＡＰＤＭＡ）法を実行して、メチル化レベルが子宮頸がんの早期予測因子またはバイオマーカーであるＣＧＩＤ位置を特定する。ステップ４において、本開示は、ポリジーンＤＮＡメチル化ＣＧＩＤの組み合わせを、１６個のＣＧＩＤのバイオマーカーセットとしてさらに絞り込み、ショートリストに載せる。この方法では、正常細胞と子宮頸がん細胞の間のメチル化プロファイルの量的差異ではなく「カテゴリー的」な差異を取得できる。結果として、子宮頸がんの早期検出、診断及びスクリーニングに利用されるＤＮＡメチル化バイオマーカーとして提供される選択されたＣＧＩＤでのＤＮＡメチル化プロファイルのスイッチ特性により、早期検出が可能になる。これらは、女性、特に無症候性または前がん病変のある女性の子宮頸がんを早期に発見するための候補ＣＧＩＤバイオマーカーのパネルとして機能する。 図２は、メチル化の頻度が前がんＣＩＮステージを経て漸進的に増加するサイトを取得する方法である。ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、及びＣＩＮ３の組織学的個体からの標本からの子宮頸部標本から調製されたＤＮＡ；及び形質転換(ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ)されていない健康なコントロール標本は、イルミナエピックアレイでゲノムワイドのＤＮＡメチル化分析の対象になる。７７１５ ＣＧＩＤのメチル化のレベルは、ＣＩＮ１からＣＩＮ３への前がんＣＩＮステージの進行と有意に相関していた（ｑ＞０．０５）。Ａ．ＩＧＶブラウザから、コントロールの子宮頸部標本からゲノム全体にわたるこれらのサイトのメチル化の違いが見られる。上部のトラックは染色体の位置を示す。２番目のトラックは、ゲノム全体でのＲｅｆｓｅｑ遺伝子の位置を示す。次のトラック（_△ＣＩＮ１－Ｃｔｒｌ、_△ＣＩＮ２－Ｃｔｒｌ、_△ＣＩＮ３－Ｃｔｒｌ）は、各ＣＩＮステージとコントロール間の平均メチル化の違いを示す。ステージを経て進行性の高メチル化が観察される。 図３は、ＡＰＤＭＡ法によって導出されたサイトは、正常な子宮頸部標本と子宮頸がんの間でカテゴリー的に異なることを示す。Ａ．２７０人の患者（ＧＳＥ６８３３９）からのＤＮＡメチル化データを使用して、子宮頸部前がん期の進行中にメチル化の頻度が増加する７９の上位ＣＧＩＤが子宮頸がんを検出することを示すヒートマップである。ＣＧＩＤは、がんと正常な子宮頸部の間でカテゴリー的に異なるメチル化プロファイルを示す。それらは正常組織では完全にメチル化されておらず、がん組織では高度にメチル化されている。Ｂ．正常、前がんステージ、及び子宮頸がん（ＣＩＮ１からＣＩＮ３）の各グループの平均メチル化（青は０％のメチル化を示し、濃い赤は１００％のメチル化を示す）。 図４は、特異性と独立したコホートで子宮頸がんＤＮＡを検出するためのＡＰＤＭＡ法を使用して発見されたバイジェニック（ｂｉ－ｇｅｎｉｃ）ＤＮＡメチル化スコアの特異性を示す。Ａ．効果量の計算、ペナルティ付き回帰、及び２つのＣＧＩＤのサブセットが短くリストされた多変量線形回帰、及び計算された頸部がんの予測のための線形回帰方程式。Ｂ．ＲＯＣによって計算されたがん検出の閾値。Ｃ．このしきい値を使用すると、このマーカーの組み合わせセットの感度と特異性は１であり、ＡＵＣは１である。 図５はコントロール、ＣＩＮ１からＣＩＮ３及び子宮頸がん患者の個々の標本におけるがんメチル化スコアを示す。Ａ．コントロール、ＣＩＮ１からＣＩＮ３、及び進行した前がん病変におけるメチル化スコアの増加を示す子宮頸がんからの個々の標本のそれぞれについて、図４Ａに示される式を使用して計算されたメチル化スコア（子宮頸がん予測）。Ｂ．コントロールグループ、前がんグループ、及びがんグループの平均メチル化スコアを示す散布図。 図６はバイジェニックメチル化スコアとコントロールから前がんステージを経て子宮頸がんへの進行との相関を示す。子宮頸がんのサンプルはＧＳＥ６８３３９からのものである。ＣＩＮ１からＣＩＮ３は、この出願で説明されているＭｃＧｉｌｌコホート（ｃｏｈｏｒｔ）からのものである（割り当てられたスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）の順位：コントロール：０、ＣＩＮ１からＣＩＮ３：１－３、子宮頸がん：４）。 図７は、ＴＣＧＡからのＤＮＡメチル化データを使用した子宮頸がんのメチル化マーカーの検証（ｎ＝３１２）を示す。ＴＣＧＡでは１つのＣＧＩＤ（ｃｇｌ３９４４１７５）のみの子宮頸部のデータが利用可能であったため、ＣＧＩＤ ｃｇｌ３９４４１７５のみのＤＮＡメチル化データを使用した線形回帰方程式を使用して子宮頸がんのメチル化スコアを計算した。ピアソン相関（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）は、がんへの進行ステージとメチル化スコアの間で計算された（Ａの統計とＢの相関チャートを参照）。ＣＩＮ１からＣＩＮ３は、該出願で説明されているＭｃＧｉｌｌコホートからのものである。割り当てられたスケール：コントロール：０、ＣＩＮ１からＣＩＮ ３：１－３、子宮頸がん：４。 図８は、本発明の有用性：ＣＩＮ１からＣＩＮ３標本における子宮頸がんの予測を示す。すべてのＣＩＮ１－３患者が子宮頸がんを発症するわけではないが、ＣＩＮ１患者よりもＣＩＮ３患者の割合が高くなっている。本発明は、図３で開発されたメチル化スコアが、本発明の有用性の実証として、子宮頸がんのメチル化スコアを示す個々の患者を特定するために使用されるかどうかを試験した。Ａ．Ｘ軸は個々の患者を並べ、グループはＸ軸の下の線で示される。Ｙ軸は、がんの予測（１）、がんなしの予測（０）を示す。Ｂ．各グループのがん予測のある個人の数。がんの予測は予想通りＣＩＮ１からＣＩＮ３に増加する。

発明の詳細な発明
実施形態の説明において、実施形態の一部を形成する添付の図を参照することができ、その図には、本発明を実施することができる特定の実施形態が例示として示されている。他の実施形態を利用されること、構造変更を行うことが本発明の範囲から逸脱していないことは理解されたい。本明細書に記載または参照される技術及び手順の多くは、当業者によって十分に理解され、一般的に使用されている。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、及び他の科学用語または用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解されている意味を持つ用語は、明確にするため、及び／またはすぐに参照できるように本明細書で定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野で一般に理解されているものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。

図面のすべての図は、本発明の選択されたバージョンを説明することを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書で言及されるすべての刊行物は、引用された刊行物に関連する態様、方法、及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。

ＤＮＡメチル化とは、ＤＮＡ分子の化学修飾を指す。イルミナインフィニウムマイクロアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）やＤＮＡシーケンシングベースの方法などの技術プラットフォームは、ヒトのＤＮＡメチル化レベルの非常に安定した再現性のある測定につながることがわかった。ヒトゲノムには２８００万以上のＣｐＧ遺伝子座がある。その結果、特定の遺伝子座には、イルミナのＣｐＧ遺伝子座データベースにあるような唯一の識別子が与えられる（例えば、テクニカルノート：エピジェネティクス、ＣｐＧ遺伝子座の識別ＩＬＬＵＭＩＮＡ Ｉｎｃ．２０１０を参照）。これらのＣＧ遺伝子座指定識別子は、本明細書で使用される。

定義：
本明細書で使用されるように、交換可能に使用される「ＣＧ」または「ＣｐＧ」という用語は、シトシン及びグアノシン塩基を含むＤＮＡ中のジヌクレオチド配列を指す。これらのジヌクレオチド配列は、ヒト及び他の動物のＤＮＡでメチル化される可能性がある。
該ＣＧＩＤは、イルミナ４５０Ｋマニフェスト（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ４５０Ｋ ｍａｎｉｆｅｓｔ）またはイルミナエピックマニフェスト（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＥＰＩＣ ｍａｎｉｆｅｓｔ）によって定義されているように、ヒトゲノムにおけるその位置を明らかにする（ここにリストされているＣＧの注釈は、次のＵＲＬで公開されていって（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｄａｔａ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｈｔｍｌ／ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ｋ．ｄｂ．ｈｔｍｌまたはｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｄａｔａ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｈｔｍｌ／ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣｍａｎｉｆｅｓｔ．ｈｔｍｌ）、ＲパッケージＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ｋ．ｄｂ（Ｒパッケージバージョン２．０．９．）またはＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣｍａｎｉｆｅｓｔ（Ｒパッケージバージョン０．３．０．）としてインストールされる。

本明細書で使用するように、「ベータ値」という用語は、メチル化プローブと非メチル化プローブの強度比及び式：ベータ値＝メチル化Ｃ強度／（メチル化Ｃ強度＋非メチル化Ｃ強度）を使用して、イルミナ４５０Ｋまたはエピックアレイの正規化及び定量化によって導出されたＣＧＩＤ位置でのメチル化レベルの計算を指す。ベータ値は０と１の間で、０は完全にメチル化されておらず、１は完全にメチル化されている。

本明細書で使用されるように、「ペナルティ付き回帰」という用語は、例えば、Ｒ統計パッケージにおける、「ペナルティ付き」が、Ｇｏｅｍａｎ Ｊ．Ｊ．、Ｃｏｘ比例ハザードモデルでのＬ１ペナルティ付き推定 Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ５２（１），７０－８４で説明されているように、実施されるバイオマーカーのより大きなリストから結果を予測するために必要な予測因子の最小数を特定することを目的とした統計的方法を指す。

本明細書で使用されるように、「クラスタリング」という用語は、同じグループ（クラスターと呼ばれる）内の対象が、他のグループ（クラスター）より（ある意味では）互いに類似するように、対象のセットをグループ化することを指す。

本明細書で使用するように、「階層的クラスタリング」という用語は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｌ．；Ｒｏｕｓｓｅｅｕｗ，Ｐ．Ｊ．（１９９０）データ内のグループの検索：クラスター分析の概要（１版）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ．ＩＳＢＮ ０－４７１－８７８７６－６で説明されているように、互いにクラスターがどの程度類似（近い）または類似しない（遠い）かに基づいて「クラスター」の階層を構築する統計的方法を指す。

本明細書で使用されるように、「受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイ」という用語は、予測因子の性能を例示するグラフィカルプロットを作成する統計的方法を指す。例えば、Ｈａｎｌｅｙ，Ｊａｍｅｓ Ａ．、ＭｃＮｅｉｌ，Ｂａｒｂａｒａ Ｊ．（１９８２）「受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の面積の意味と使用」Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３（１）：２９－３６で説明されているように、予測の真の陽性率は、予測因子のさまざまな閾値設定（すなわち、メチル化の異なる％）での偽陽性率に対してプロットされる。

本明細書で使用される「多変量またはポリジーン線形回帰」という用語は、複数のＣＧＩＤのメチル化の割合などの複数の「独立変数」または「予測値」と、がんなどの「従属変数」の間の関係を推定する統計的方法を指す。この方法は、ＣＧＩＤなどのいくつかの「独立変数」がモデルに含まれている場合の「結果」（がんなどの従属変数）を予測する際に、各ＣＧＩＤの「重み（ｗｅｉｇｈｔ）」または係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を
決定する。

本明細書で使用されるように、「エピジェネティック」という用語は、ＤＮＡ分子の化学的修飾である、ＤＮＡ分子の化学的修飾に関連するまたは関与することを意味する。エピジェネティックな要因には、ＤＮＡメチル化レベルの変化をもたらすメチル基の追加または削除が含まれる。ＣＧＩＤベースのバイオマーカーとして本明細書に開示されているものなど、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンを観察する子宮頸がんの早期検出または診断または予測の新しい分子バイオマーカーにより、女性が無症候性またはＣＩＮ１からＣＩＮ３に進行する前がんステージである非常に早い段階でも子宮頸がんのリスクと易感染性を予測することができ、そしてクリニックにおいて、疫学者、医療専門家にとって有用であり、そして該新しい分子バイオマーカーは本開示であり、本開示は任意の当業者がアクセス及び使用することを可能にする。もっぱらパップスメア、組織学的同定などの臨床バイオマーカーは、子宮頸がんの診断において長く成功した歴史があるが、それらは非常に多様であり、子宮頸がんの早期検出に使用することができない。それと対照的に、ＤＮＡメチル化バイオマーカーの形のエピジェネティックマーカーなどの分子バイオマーカーは、まだほとんど使用されていない。

本明細書で使用されるように、「ＤＮＡメチル化バイオマーカー」という用語は、潜在的にメチル化されているＣｐＧ位置を指す。メチル化は通常、ＣｐＧを含有する核酸で発生する。ＣｐＧ含有核酸は、例えば、遺伝子のＣｐＧアイランド、ＣｐＧダブレット、プロモーター、イントロン、またはエキソンに存在し得る。例えば、本明細書で提供される遺伝子領域において、潜在的なメチル化部位は、示された遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域を包含する。したがって、該領域は、遺伝子プロモーターの上流で始まり、転写された領域の下流に伸びることができる。

現在開示されている方法は、子宮頸がんのＤＮＡメチル化プロファイルを示す細胞の頻度がＣＩＮ１からＣＩＮ３病状への進行とともに増加し、これらのメチル化プロファイルが最も初期の子宮頸がんに特徴的であると表明する。第二に、がんに変換する細胞は早期の悪性腫瘍ではまれであるため、ＤＮＡメチル化プロファイルは、最も早い段階でほとんどが非悪性細胞のバックグラウンドで検出されるように、子宮頸部細胞の通常のプロファイルとはカテゴリー的に異なる必要がある。第三に、これらのＤＮＡメチル化プロファイルは、子宮頸がんの主要及び重要な特徴である場合、完全に発達したすべての子宮頸がん標本に存在する必要がある。前述の３つの前提条件を考慮して、現在開示されている「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）」と呼ばれるインビトロの方法は、インフィニウムメチル化エピックアレイ（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＥＰＩＣ ａｒｒａｙ）を使用して、よく特徴付けられたＨＰＶジェノタイピング（ＨＰＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）後の健康な、非形質転換の、健康なコントロール子宮頸部標本と比較して、異なるＣＩＮグレードの病状（ＣＩＮ１からＣＩＮ３）を持つ女性から得られて単離された標本のＤＮＡメチル化のゲノム全体のプロファイルを調べるステップが含まれる。本発明は、本明細書に開示された線形回帰モデルを使用して、ＤＮＡメチル化バイオマーカーとして組み合わせたときに子宮頸がんの公知のメチル化プロファイルにおいて子宮頸がんを＞９５％の感度と特異性で予測する、イルミナのプローブＩＤまたはＤＮＡメチル化数またはＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）を取得するためのインビトロ方法を開示している。本発明はまた、子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルを提供し、パネルはそれぞれ、以下に開示されるように、表２にリストされる表１配列のショートリストされたサブセット及び表３にリストされるＣＧＩＤのより短いサブセットのような、表１にリストされた配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１から配列番号７９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を有するＣＧＩＤを含む。したがって、本発明は、１に近い感度及び特異性で、公表されているＤＮＡメチル化データにおいて子宮頸がんを検出するのに最低限十分な２つのＣＧＩＤを提供す
る。本発明はまた、子宮頸がんの早期検出及びＣＩＮ１からＣＩＮ３の病状を有する女性のリスク評価のための女性の集団ワイドスクリーニングに使用される、子宮頸部標本から単離されたＤＮＡ中の開示されたＣＧＩＤのＤＮＡメチル化レベルとして、ＤＮＡメチル化バイオマーカーをインビトロで測定するためのキットを開示する。

本明細書に開示される発明は、多くの実施形態を有する。一実施形態において、本発明は、子宮頸がんの早期検出のための子宮頸部塗抹標本における子宮頸がんのポリジーンＤＮＡメチル化ＣＧＩＤバイオマーカーを提供し、前記ポリジーンＤＮＡメチル化バイオマーカーパネルは、イルミナ４５０Ｋまたは８５０Ｋアレイ、さまざまな次世代シーケンシングプラットフォームを使用したゲノムワイドバイサルファイトシーケンシング、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）シーケンシング、オリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションなどのマッピング方法によって導出されたゲノムワイドＤＮＡメチル化に関する本発明で開示される「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）方法」を使用して導出される。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんを検出するためのＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得する方法を提供し、その方法は統計分析を実行するステップと、前がん病変ＣＩＮ１ からＣＩＮ３の子宮頸部標本から得られたＤＮＡメチル化測定に関して本発明に開示される「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）」方法とを含む。

一実施形態において、本開示の方法は、子宮頸部標本から得られたＤＮＡメチル化測定における統計分析及び「進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）」方法を実行することを含み、前記ＤＮＡメチル化測定は、標本から抽出したＤＮＡのイルミナビーズチップ４５０Ｋまたは８５０Ｋアッセイを実行することによって得られる。別の実施形態において、前記ＤＮＡメチル化測定は、以下によって取得される。つまり、サンプルから抽出されたＤＮＡのＤＮＡパイロシーケンシングの実行、または質量分析ベース（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（登録商標））またはＰＣＲベースのメチル化アッセイ及びバイサルファイト変換されたＤＮＡから本明細書に開示された標的ＣＧＩＤにまたがる領域の標的増幅と、それに続く第２セットでのバーコード増幅及びイルミナの次世代シーケンサーでのインデックス付きマルチプレックスシーケンスによって取得される。さらなる実施形態において、前記統計分析は、受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを含む。さらに別の実施形態では、前記統計分析は、階層的クラスタリング分析アッセイを含む。追加の実施形態では、前記統計分析は、ニューラルネットワーク分析を含む。

本発明の一実施形態では、子宮頸がんの早期予測因子を得るためのインビトロ方法を開示しており、この方法は、以下のステップを含む：（ａ）子宮頸部標本サンプルからのＤＮＡメチル化の測定、（ｂ）ステップａで得られたＤＮＡメチル化測定の統計分析の実行、（ｃ）ステップｂで得られたゲノムワイドＤＮＡメチル化プロファイルの進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）の分析を実行することにより、ＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）と呼ばれる多数の独立したゲノムＣＧ位置のＤＮＡメチル化状態の決定、（ｄ）子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づくＣＧＩＤの分類、（ｅ）子宮頸がんの早期予測因子をＤＮＡメチル化バイオマーカーとして取得するために、ステップｄの分類から候補ＣＧＩＤの取得。

本発明の別の実施形態では、子宮頸がんの早期予測因子を得るためのインビトロ法を開示しており、この方法は以下のステップを含む：（ａ）子宮頸部標本サンプルからのＤＮＡメチル化の測定、（ｂ）ステップａで得られたＤＮＡメチル化測定の統計分析の実行、（ｃ）ステップｂで得られたゲノムワイドＤＮＡメチル化プロファイルの進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）の分析を実行することにより、ＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）と呼ばれる多数の独立したゲノムＣＧ位置のＤＮＡメチル化状態の決定、（ｄ）子宮頸がんの前
がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づくＣＧＩＤの分類、（ｅ）子宮頸がんの早期予測因子をＤＮＡメチル化バイオマーカーとして取得するために、ステップｄの分類から候補ＣＧＩＤの取得。ここで、上記ＤＮＡメチル化の測定は、イルミナ２７Ｋ、４５０Ｋまたは８５０Ｋアレイ、ＨｉＳｅｑ、ＭｉｎｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑシーケンサーを含むプラットフォームでのゲノムワイドバイサルファイトシーケンシング、トレントシーケンシング、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）シーケンシング、オリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーション、ＤＮＡパイロシーケンシング、質量分析ベース（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（登録商標））またはＰＣＲベースのメチル化アッセイを含む方法を使用して行われる。

本発明のさらに別の実施形態では、子宮頸がんの早期予測因子を得るためのインビトロ法を開示しており、この方法は以下のステップを含む：（ａ）子宮頸部標本サンプルからのＤＮＡメチル化の測定、（ｂ）ステップａで得られたＤＮＡメチル化測定の統計分析の実行、（ｃ）ステップｂで得られたゲノムワイドＤＮＡメチル化プロファイルの進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）の分析を実行することにより、ＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）と呼ばれる多数の独立したゲノムＣＧ位置のＤＮＡメチル化状態の決定、（ｄ）子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づくＣＧＩＤの分類、（ｅ）子宮頸がんの早期予測因子をＤＮＡメチル化バイオマーカーとして取得するために、ステップｄの分類から候補ＣＧＩＤの取得。ここで、ＤＮＡメチル化の測定に関する前記統計分析は、ピアソン相関、受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイ、及び階層的クラスタリング分析を含む。

本発明のさらなる実施形態において、子宮頸がんの早期予測因子を得るためのインビトロ法を開示しており、この方法は以下のステップを含む：（ａ）子宮頸部標本サンプルからのＤＮＡメチル化の測定、（ｂ）ステップａで得られたＤＮＡメチル化測定の統計分析の実行、（ｃ）ステップｂで得られたゲノムワイドＤＮＡメチル化プロファイルの進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）の分析を実行することにより、ＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）と呼ばれる多数の独立したゲノムＣＧ位置のＤＮＡメチル化状態の決定、（ｄ）子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づくＣＧＩＤの分類、（ｅ）子宮頸がんの早期予測因子をＤＮＡメチル化バイオマーカーとして取得するために、ステップｄの分類から候補ＣＧＩＤの取得。ここで、上記子宮頸がんの前がんステージの進行は、ステージＣＩＮ１、ＣＩＮ２、及びＣＩＮ３の子宮頸部上皮内腫瘍性病変を含む。

本発明の別の実施形態では、子宮頸がんの早期予測因子を得るためのインビトロ法を開示しており、この方法は以下のステップを含む：（ａ）子宮頸部標本サンプルからのＤＮＡメチル化の測定、（ｂ）ステップａで得られたＤＮＡメチル化測定の統計分析の実行、（ｃ）ステップｂで得られたゲノムワイドＤＮＡメチル化プロファイルの進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）の分析を実行することにより、ＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）と呼ばれる多数の独立したゲノムＣＧ位置のＤＮＡメチル化状態の決定、（ｄ）子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づくＣＧＩＤの分類、（ｅ）子宮頸がんの早期予測因子をＤＮＡメチル化バイオマーカーとして取得するために、ステップｄの分類から候補ＣＧＩＤの取得。ここで、子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づく前記ＣＧＩＤは、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるＣＧＩＤ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明の補足的な実施形態において、７９個のＣＧＩＤサイトは、子宮頸がんの早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーとして描写され、子宮頸がんの早期予測因子として単独でまたは組み合わせて有用である。

表１：本発明の実施形態において有用なＣＧメチル化サイト（ＣＧＩＤ）を有する選択さ
れた７９個のポリヌクレオチド。
本明細書の様々な実施形態で使用される選択された７９個のＣＧＩＤに対するイルミナプローブＩＤの配列は、本出願に含まれる表１に見られ、下記を含む。
配列番号１に記載するcg08272731
（GAAGGAGGCTGCGCGCCAGCCCGCCCGCGGCGCCCGGGCTCAGGCGCCGTGACGGCTGCACGCGCTGCCCCGCACTCTGAGGGCCTTCATTAGCTCGCTCCCCGCGCCGAGGCTGGGGCGGG）、
配列番号２に記載するcg19598567
(CCTCCCGCAGCTCATTGCAGCCCCGAGGAAATCACCGGGGGAGGGCTCGGGAGTGCGGCGCGGCAGCCCCATAATTTCCAGGGCCCTTCTCCTACACTGACACGTAATTGTCAGATTGTTTT)、
配列番号３に記載するcg13944175
(CCGCCGCGGGTTCCCAGGGCTGGTGGTAGTTGCCGTCCCACACGTACGTGGCGGGGTCCTCGTCAGCGAAGACCTCGCGGAACATGTCGACCATGTAGAGGTCCTCGGCGCGGTTGCCATCC)、
配列番号４に記載するcg19717586
(GGGGAGGAATATTAGACTCGGAGGAGTCTGCGCGCTTTTCTCCTCCCCGCGCCTCCCGGTCGCCGCGGGTTCACCGCTCAGTCCCCGCGCTCGCTCCGCACCCCACCCACTTCCTGTGCTCG)、
配列番号５に記載するcg22721334
(CAGGCCGGTCCCAGCCGCCCGGAGCCCCAGTGCGCGATGGCGGCCGGCAAACTGCGCCTGCGCACTGGGCCTCACCGCGGACTACGACTCCCACAATGCCGCGAGGCTGTGCCGCGCACCGG)、
配列番号６に記載するcg13985485
(GTGACGCGCGGCCGCAGCTGCCCGCGGGCGGAGCGCTCTCAGACCCCGGAGCGCACACCGCGGGGCCATCGGTGCCATCGCGGATCTCCAGGCTCCTCATCAGTCCGCCGGGGCCGCAGCAG)、
配列番号７に記載するcg11358689
(GAGGAATATTAGACTCGGAGGAGTCTGCGCGCTTTTCTCCTCCCCGCGCCTCCCGGTCGCCGCGGGTTCACCGCTCAGTCCCCGCGCTCGCTCCGCACCCCACCCACTTCCTGTGCTCGCCC)
配列番号８に記載するcg01944624
(ATCTACCGTCTCCAATCTCCATCTCCGAAGTTATGCCCACTTCCTCGAAGTTTGGAGCCACGCGAACTACACTGCCCAGAAGGCGCCGCGCCGTGAGCCGCGAT
GCTTGGCCAATGAAAAGA)、
配列番号９に記載するcg04864807
(GGGAGGGCTCGTGAGAGCCAATGAGAGCGCGGAAGGCGGCGAGCGAGCCAATGGACGCGGCGGTGGGGCAGGGGGCGGGGCCTGGGCGAGGCCGGGGGCGGAATGGGCTGAGTGCCCTGTCT)、
配列番号１０に記載するcg13849378
(CGGCAAGCGGAGCAGCGAGGCAGGGTAGCTTCATCACACTCGCGGCGGATGCGGATTCCGCGCCGCCCCGGCTCTAGCTGCTCAGGCGACCGCCACCCTCGCCTCGCCGCCGCCCGTGCACA)
配列番号１１に記載するcg19274890
(GCGGACGGCGGCTCCATCCGCGGCAATCACCGTAGTGCTTGTTTGTGGAAGCCGAGCGTGCGTGCGCCGCGCGCGCACCCAGTCCAGCGCGGAGTGGGCGTCTACCCGAGGAGGGGTGTCTG)、
配列番号１２に記載するcg06783737
(TGGGGAATTAGCTCAGGCGGTGGAGCGCTCGCTTAGCTATGCGAGAGGTAGCGAGATCGACGCCCGCATTCTCCAGTTTCTTGTCTGGTTTATGTCTCTTAGTTTGTATTCCCCGTTGTTTC)、
配列番号１３に記載するcg19429281
(GAAGTCCCAGGGACCTGCGGAGCGCAGACATAACACAACACAGAGCAAAACTCACCGCTGCGGTGACTTTCACTCCACGCGATCCGCTTCCCGGTTTACGCTAAACTGGGCGCTCGGGACAG)、
配列番号１４に記載するcg00064733
(GGCTGCGGACGGCGGCTCCATCCGCGGCAATCACCGTAGTGCTTGTTTGTGGAAGCCGAGCGTGCGTGCGCCGCGCGCGCACCCAGTCCAGCGCGGAGTGGGCGTCTACCCGAGGAGGGGTG)、
配列番号１５に記載するcg25258740
(CCCCCGCCGGCCGCCGGCCGCGCTCCCCGCCTTCATTCTGTGATCTGCGGATTTGCCAGTCGCCAACCTCCGCGCCCAGAGTCACCATCGCGCAGGGTTGGGCAAACCATGGAGCTCGGGGC)、
配列番号１６に記載するcg08087594
(AACTCCTGCACAAATCATTTCAAACGCGGTCGGCTTCTAATCGGGAAGTAATCTCAGTGACGCTGGCGGTGCAGAGAACCGAGTCTGGACGCACACACACAAACACACCGCGGGCCTCCGCA)、
配列番号１７に記載するcg17233763
(GTGTGCTCAGCCTCAGCGTGAGGGGCACCTGCTCGTCTGGGCTCACAGCGAAGGCAGCCTCGCCGCGAGCTGCCGCTGCCGCTGCTGCCGCCACTGGTGTTGCCGCTCTCAGGCGCCAGGCT)、
配列番号１８に記載するcg11372636
(GCCGGGAGCCTGACGTCACCACGCCCTGCCTGTCAATCTGCAGCGCGCGCCGCTCGCAGCCGCCTTTTCTGCCACCAACTGTATCTCTCACTCGCGGAGCCGGCACAGCGACAGGCGCCCCG)、
配列番号１９に記載するcg01650149
(GCGGCGGCGGGCGGGGAGCCAGGCCCGAGCTGCGTTCTGCGCAGCCATTGGTGGGCGCCGCGCTCTGCACTGAGCATGTTCGCGCCCCGCCGGCCCCTAGCCGCAGCCGCAGCCGCAGCGAC)、
配列番号２０に記載するcg17445666
(CAACCGGTTCCGCCGCGTTTGTGGGCTGGTAGCCCGGAATACATTTCCCAGAGGCCTTCGCGGCCGACGTGCTTCGCGCAGGAACGCAGCCGCCTCCCGACTGGAGGACGCGGTAGCGGAGC)
配列番号２１に記載するcg24415208
(GCTGCCCGTGGTCAAACTGGAGTCGCTGAAGCGCTGGAACGAAGAGCGGGGCCTCTGGTGCGAGAAGGGGGTGCAGGTGCTGCTGACGACGGTGGGCGCCTTCGCCGCCTTCGGCCTCATGA)、
配列番号２２に記載する、cg24221648
(CTTCCCGGCTCCCCGCGGTGCGCACCCGCTGGCCACTCTGCGCACGCGCGCCGGGTGCCCCGGCCTAAGGCCGTTGACCTCGGGTTCTCCCCGGCACAGTCGAATCCACGCCAGGGCCCTCA)、
配列番号２３に記載するcg09017434
(GCGGGGGAGGTTGCGGGGGAGGCTCGGCGTCCCCGCTCTCCGCCCCGCGACACCGACTGCCGCCGTGGCCGCCCTCAAAGCTCATGGTTGTGCCGCCGCCGCCCTCCTGCCGGCCCGGCTGG)、
配列番号２４に記載するcg15814717
(TGTACTACTTCCTCTGCCACCTGGCCTTGGTAGACGCGGGCTTCACTACTAGCGTGGTGCCGCCGCTGCTGGCCAACCTGCGCGGACCAGCGCTCTGGCTGCCGCGCAGCCACTGCACGGCC)、
配列番号２５に記載するcg23619365
(AAAAAAAAAAAAAAGCAATGAGCCGCAAGCCTTGGACTCGCAGAGCTGCCGGTGCCCGTCCGAGAGCCCCACCAGCGCGGCTCACGCCTCAGTCTCGCCGCCCCAAGGTGGGATCCGACGCC)、
配列番号２６に記載するcg20457275
(CGAGAGGGCCCGGTCCAGCAGCCTCTGGGGCCCAGTGCGCAGGGCACTGCGGGCCGATTGCGCCCCGGGGCCAGGAGGCGCCGAGAAAGCAAAAGCAAAAGCCGGCGGCGGGTGGAGGTCAA)、
配列番号２７に記載するcg22305167
(CGGCCGCAGTGTGCCGCCCGCTGCGCTATGCGGGGCTCGTCTCCCCGCGCCTATGTCGCACGCTGGCCAGCGCCTCCTGGCTAAGCGGCCTCACCAACTCGGTTGCGCAAACCGCGCTCCTG)、
配列番号２８に記載するcg16664405
(CCTGGCGCGACCGCCAGCAGCACCCAGCGCGGGGCCGGGAGCTGCTGGGGGCCCAGGCTCCGCTCTCCCCACCGCTCTGCACCGCTGCCGGCTGCGGACAGACCCGATGCGCCACCACCACC)、
配列番号２９に記載するcg16585333
(CCGGAGCGCGCTGCTGCCCTCTACCGGTCATCCGTGCGGCCGGACACCGTGTCAGGCCCGCGAGGAGGGCTCTGCCGCAGTCCCGGGGAACAGCACCCAGCAGCGCCACTGGGAGAGGAAAC)、
配列番号３０に記載するcg05057720
(AGTCCAGAGCGGCGCTGTGCAGCTGGAAGGGCGCGCGATAGCTCAAGTTAGAGGCGGCCCCGGGGCGCGGCGCAGGACACAAGACCTCAAACTGGTACTTGCACAGGTAGCCGTTGGCGCGC)、
配列番号３１に記載するcg03419058
(GGCGGTGCGAGCTCCCCGCCTGCGGGACGCACGGAGACCGCGGTCAGCGCGCCGCCTGGCCGGCCCAGCGCGCCCAGCCCGCGCCCAGCCCCGTCCACTCCCGTCCAGCCCCGCCGCCCGGC)、
配列番号３２に記載するcg02473540
(CGGTAGAGTTTCCAACACGAAAGCCCGTGTGGTCGCGCCGGGAGCTCACGGCGTTCCAAGCGGCACTTATCCCGCGTTGATGCCCAGGCACCCCGCGCGCCCTGTTTCACCAGGCCCAGTCA)、
配列番号３３に記載するcg01758512
(CCAGCGGCAGTAGCTGTAGCAGCTTCAGCGAAGCCGGAGATGGGCAGAGAGCGCGCGCGGCGCAGCAGCTCCAGATTCACTGCTCTCCCCTGCAGCTCCCCGCGCCCCCGCCGCTGTCGCTG)、
配列番号３４に記載するcg18897632
(GTGTTCTCTGCGGCGGGCCGCGTCCCCGCTGAGCCTCGCGGTGACAGCCGCCTTTGGCAGCGAGCGCTCGGGGCACTTCTATCCCCGCCTCTCAAAGGGTGGGGACAGCCGTTTCCAGATTT)、
配列番号３５に記載するcg09568464
(CGGCCGCGCCCCCGGCAGCCCAGGGCGCGCTTCCACCACGGTACCGGTGGATTCGCCGTGCGCAGCCGGAAGATGGCGCAGACGCACAAAGCACACCGATGCTGCGCCATGATAGGGCCGGC)、
配列番号３６に記載するcg15811515
(TCTCGCGGCGCAGGCGGCGGCGGCAGAGGTGGGGTCGCGCAGCGGAGGCAGCTCGAGCTTCGGGATGCGCGCTCGCTTCTTGGGCTCCTCGCTCGATCTTACTGCCCCCTTTTTTCTCTCCC)、
配列番号３７に記載するcg00884040
(TCCTCCAGCCAGAGTCGGTGGGACTGGCTGCGCTGCCCTGAAGTGGTTCTCCAAGCAGCGCGGAGGGTGGCGGACGGCGGACGGAGCCCAGGGGCCGCGTCGGGTGGGGAAACCCGAACTCG)、
配列番号３８に記載するcg21632158
(TGCGCATCGCTGGCTCTGGGTTCCGCCGAATGCGTCCTCCTGGCGGTGATGGCTCTGGACCGCGCGGCCGCAGTGTGCCGCCCGCTGCGCTATGCGGGGCTCGTCTCCCCGCGCCTATGTCG)、
配列番号３９に記載するcg18343957
(AGGGGAGCTGCGAGGCGAAGTGTTCTTCAGGGAAGCGGGCTCGAGTCTCCGCAGCTGCGGCGGCGGCGGCGGCGCGCTGGGCCGGCGGCGGGCGCGGGCAGGGGGCCGGGGGTGCCGCGCGG)、
配列番号４０に記載するcg23883696
(CCTCCACCCCCGGGGGGTTCCTGCGCACTGAAAGACCGTTCTCCGGCAGGTTTTGGGATCCGGCGACGGCTGACCGCGCGCCGCCCCCACGCCCGGTTCCACGATGCTGCAATACAGAAAGT)、
配列番号４１に記載するcg24403845
(AGAGAGGGGTCCCAGAACGAAGGTGGCGGCACGAGCTCTGCGCTGGCGGCTGTGGGGGGCCGGCGCTCAGGACCCCAACTCCATCCAAGTTGCGCCGCGGTGGGGGCGGGCGGAGGCGGCGC)、
配列番号４２に記載するcg20405017
(AATCTCCCCTCGGGCTCGACGGATGTGCGCCCCAGATGTGCTGACACATGTCCGATGCCTCGCTGCCTTGGAGGTCTCCCCGCTCGCGTGTCTCTTCTCTTCGCACCAGCGGCGGAAACCGC)、
配列番号４３に記載するcg21678377
(GCTCCGCTTCTCCGGGTTTTAGCGGAAGCCTGCGGGGGGCGGGGTAACCGCGGAAGCCGGCGGCCGTGGGCGCGCGGGTTGGGGGCTCTCGCGCCGCTCCGGGCTCTCCCCCCCCCCGGCTG)、
配列番号４４に記載するcg03753331
(CGCGCTCCGCTTCTCCGGGTTTTAGCGGAAGCCTGCGGGGGGCGGGGTAACCGCGGAAGCCGGCGGCCGTGGGCGCGCGGGTTGGGGGCTCTCGCGCCGCTCCGGGCTCTCCCCCCCCCCGG)、
配列番号４５に記載するcg16587616
(GCGAGGGATCTCTGTGCGTCCTCACTGGCCCATGCACCCAGCACCTGCGACTCCCGCCGTCGGGCTGCGTGGCCCCGCGCCCACACCTGCCCGTCCCTTCCGTCGTCCCTCGCTCGCGCAGA)、
配列番号４６に記載するcg25730685
(GGGGAGGTGTGGGGAGCGGAAGGCCGCAGGAGCATCTTTGCGGAGAAAGTACTTTGGCTGCGGCGGGCGCAGGGCGGGCCGGCTAGCCCCGCGCCCCACCTGTTCTGTGCGTCGCGCTCGCC)、
配列番号４７に記載するcg20019985
(TAGGGCTGGAAACCCGCCGCCACAGCGGGCTAGAGGTCGTCCCCGCCCGCAACATATGCGCGAAGGAAAGTGCTACGAACGTCAAATGGCCGCCCCCCGCCGACGCCATCTGCTCTGCGAAG)、
配列番号４８に記載するcg03730428
(CGCCCGCAACATATGCGCGAAGGAAAGTGCTACGAACGTCAAATGGCCGCCCCCCGCCGACGCCATCTGCTCTGCGAAGCAGAAACGGCGGCAGCTGCGCGCCCAGTCCCTCCGCCCGCGCC)、
配列番号４９に記載するcg18384778
(CCCCCTGTTCAAGGTCTGTCACCGTAGGGGGCGGGGGGGCGCGTGGAGCCGCTGGGGGTTCGGCCCACCCCGCGAACCG
AGCTCCCGGCCCTGTGCGCCCTCAGCTCTGCCGCGGGCGTTGG)、
配列番号５０に記載するcg22010052
(GCTGTGGCCGCAGCTGAGGCCCGACGAGCTTCCGGCCGGGTCTTTGCCCTTCACTGGCCGCGTGAACATCACGGTGCGCTGCACGGTGGCCACCTCTCGACTGCTGCTGCATAGCCTCTTCC)、
配列番号５１に記載するcg19688250
(GTGTGCGTGTGCGTGTGCTCAGCCTCAGCGTGAGGGGCACCTGCTCGTCTGGGCTCACAGCGAAGGCAGCCTCGCCGCGAGCTGCCGCTGCCGCTGCTGCCGCCACTGGTGTTGCCGCTCTC)、
配列番号５２に記載するcg04701034
(TGGGGCAGCGGCGTTGCAGGAGATGAGCTCAGCGCAAAGGGAACCCCGCAGCGGCGAGTGCGGCTGCTGGCCTGCGCGCTGTGGCCCCAACAGGCTGGCAGGGCGCGGGCGGGTGGCGGGGT)、
配列番号５３に記載するcg20505704
(AGAGTCGGTGGGACTGGCTGCGCTGCCCTGAAGTGGTTCTCCAAGCAGCGCGGAGGGTGGCGGACGGCGGACGGAGCCCAGGGGCCGCGTCGGGTGGGGAAACCCGAACTCGCGGAGGGGAA)、
配列番号５４に記載するcg15124215
(AAAGCCCTGGCAGGTAAAGAGAGGACCCGCGCAGGCTGGGAGCTCCCACTCCTCCTCCAGCGTCACGCTCGCCCTCCGCCGCTGCCTCGCGTCCGGGTCTGTTTATATAGCGTCTGGAGGCC)、
配列番号５５に記載するcg07143083
(CTGGCCAAGTGCCGGCCCATCGCGGTGCGCAGCGGAGACGCCTTCCACGAGATCCGGCCGCGCGCCGAGGTGGCCAACCTCAGCGCGCACAGCGCCAGCCCCATCCAGGATGCGGTCCTGAA)、
配列番号５６に記載するcg00688962
(GGCGCCGGCAGCTTCGCGCCGGCGGCTGGAAGCGGGCGGGCTGCACGGGCGGCTCGAGTGCGGGGACCCCAGCCCCTCGCCCTCGTGAGCGCCGCCCCTGCCACCTGCTGCCAAGTCACCGG)、
配列番号５７に記載するcg00027083
(CCCCGGCCGCGCCGGGCGCGGGGCTCGGGATTCGGGAGACCGCGCGGCGCCGAAGCCACGCGTCAGCCCCACTGTCCCGCGCGCCTCGCCCCAGGCCTCGGGCTCTTCCTCCGCACCTCGTA)、
配列番号５８に記載するcg08305436
(ACGCGGGGACTGGAAAGGGCGCCTGGGTGGGAAGAGGCGCTGGCGGGTGATCGTCCCCACCGGGCCAGTCCCCGGGATCTGCTGCCGCCCCTCTCCGAAATTCACAGCCAGAGCGGGCGCAC)、
配列番号５９に記載するcg1463883
(TCTGAGAAGTGTCCTCCTCGCTCTCTTATAAAAACAGGACTTGTTGCCGAGGTCAGCGCGCGCATCGAGTGTGCCAGGCGTGTGCGTGGTTTCTGCTGTGTCATTGCTTTCACGGAAGGTGG)、
配列番号６０に記載するcg09907509
(GCGCCCAGACTGCGCGCCGCGCCGCTGCGCCCAACATTCCCGAGGACGGCTTCGCGGGCGCGTATCGTCCAGACCGGAGCACCGCCCCACCGCTAGCGCAGGAGACCTGCCGGGGAAGTCGC)、
配列番号６１に記載するcg20707222
(AAAGGCCGTACTCTGCCCCCCGCGGGACCCAGGTCCCCGCCTGCTGCAGAGCGCACTCTGCGCACGTCGAGCCGCGAAAGGTTCACAGAAGAAAACAAGAGAAAGAAGTAGCAGGCACTGAG)、
配列番号６２に記載するcg17056618
(GGAATCCATTCTTTTAAGCCAGGGTTTAAAACTCTTCAAGCAAGTCATCTGCAAAGGTACCGCTTCTACCATTTTAAAGATAGGATTATGTTCCCTAGGACAACTGGATGAGCCCTAGGAAC)、
配列番号６３に記載するcg18058689
(GAGGAGCGCGCCGCTGCCTCTGGCGGGCTTTCGGCTTGAGGGGCAAGGTGAAGAGCGCACCGGCCGTGGGGTTTACCGAGCTGGATTTGTATGTTGCACCATGCCTTCTTGGATCGGGGCTG)、
配列番号６４に記載するcg22620221
(CCCTGTGCGTGCCGCCGCGCTGTTGCTCGCAGTGTGCTGGCGCCGAGCTCGGTGGACACGCGCGCAGTCAGAGCTGCCTCTCGCCCTCGCTAGCTGGGCTCGCAGCCTCTTCCTCCCTCCCT)、
配列番号６５に記載するcg02547394
(CTCTTTGGCAAGTGGTTTGTGCATCAGGAGAAACTTTCCACCTGCGAGCCGAACCGGCGCCGAGTGCGTGTGTTTCTGCCTTTTTTTGTTGTCGTTGCCTCCACCCCTCCCCATTCTTCTCT)、
配列番号６６に記載するcg09469566
(TGGCTGCCAGAGCGAGTGAGGGGCGCAGAGGCGGCAGAGAGCGGAGAGCCCCGGTGTCTCCGCGAGGGCGGCGGCGGCCAGCAGACGGCGATCGAGGCGCGCGCCACGGCACGGCCAGCGCA)、
配列番号６７に記載するcg26609631
(AAGCGCGTGGAGAGCCGAAAGGTGCGGTGGGCGCAGAGGGCGGGCTGGCTGCGGGGCGACCGCGCGCCGGGGCCATGCCGCGCTCCTTCCTGGTGGACTCGCTAGTGCTGCGCGAGGCGGGC)、
配列番号６８に記載するcg10132208
(GGGGTCGCCATGACCGAGTGGCCCAGGCCCGAGCGAAGCCCGCGCGCGGTGAGTCCGCCGCGGCCCATCCGTCCCTCCGCCCGCCAGAGCGTCCATCGGGACGCCCACCCGGGAGGGTCTCG)、
配列番号６９に記載するcg06000994
(CCGAGCGCTGCCCCCGCCGGCCCGCGGCTGCCAGCCGGCCCTGCCCGCGCCCGGGCCCCGCGAGCGGCCGCACTTCACCTTACGGAGGGGAGATAATGAGATCAATTAGAGGCGCCGTCACC)、
配列番号７０に記載するcg10182317
(GGCAACCCTGACTCGGACCGCTCGGGAGAGCCCCAGGAGAGGCCAGCGCCGCGCAGCAGCCGCCCCGCTGCGCCCACCTCCCCGGCTGCTCCCGGAGGGCTCACAAAGGCGGTGGCCGCCCG)、
配列番号７１に記載するcg14222229
(GCGGGCGGCAGCCGCAAGCGAGGAATCCAGCGCAGGGAAAGTAGCCCCAGTGGGGCCCGGCGCGTCAGCCCCACTCGCGTGGCAAAACTTGCGGGGGCCCCCGCGTGCCGCGCCTCAGCCCA)、
配列番号７２に記載するcg04596005
(TCCTCGCCGTCGGGGTCCTCCTCCTCTGCCGACGAGTTGTCACTGGGCGAGGCGTAGCTGCGCTCTACGCCGCGGAGGGGCGGCCTCTTGGAGGCGGGGACCGGGTACTCCCGCTGCAGCCC)、
配列番号７３に記載するcg11592503
(GCTGCTCGCGCTCCGCCGCCCGGGAGATGCTTCCTCGCGCGGCGCAGCGCTGAGGCCGTGCGTGCGCCCCGGCTGCGCTGCGCGCTCCCCACATACACAAGCTCTCCATGTGAGCTGACAGG)、
配列番号７４に記載するcg05008595
(CTTCTCTTGAAAAGGAGGAGAATCAACACTGGGCTCACAACTCATCAGAGCTGAGTCATACGTACATCAGCAGGACCTACGTGGGAACCAAATAGCAAACTCAAATTGGGAAATTTGAGGAA)、
配列番号７５に記載するcg04999026
(CCGAGAGCCCCGCCTGCAGGCGGTGTAGATACATGTAGATACTGTAGATACTGTAGATACCGCCCCGGCGCCGACTTGATAAACGGTTTCGCCTCTTTTGGAAGCCGCCTGCGTGTCCATTT)、
配列番号７６に記載するcg04546413
(TGAGGAGTGAGGAGGCAGAAAGGACCGAGAACAAGGGGACCCGGTTCCATTTCTGGACCCCGTCCGCAGGCTGCTCGCCCGACTTGGGGTCGCTCTGCCCCGGACGATCAGGACAGCTGCGT)、
配列番号７７に記載するcg27254667
(CAAATCTATATGAAGGATCGAATTGCATTGAACTAGCAAACACACACACACACACGCACACGCAAAAACTGATGAAAGCTGAACAAGGTCTGTAGTCTAGTCAACAGTACTGCACTATGTGA)、
配列番号７８に記載するcg18902440
(ACAGTCTCTCGCCTCAAAGATCTCCGCCATTAGTGGTAGCCATTTAAGAAAACAGAATTACGATGAATAATGATTTGAAGCCAAAAAGTCAAAATATCTTATTTCGCAACTGTAATTGCTGG)、及び
配列番号７９に記載するcg01315092
(CCACACAGGCCTCTCCCTCGGTGCGGTAGCGAGGGTTGCGGGCCCAAACGCCCGCGCCCACGGAGGCGCCTGCGACGACTAGAAGCTTCCACAGCCATATGGGGGCAAAGACGGCCCAGTAG)。
前記のバイオマーカーは、本明細書に開示されるＡＰＤＭＡ方法の仮定を使用し、正常細胞のバックグラウンドメチル化（１０％未満）を伴い、ＣＩＮ１からＣＩＮ３ステージへの移行中のメチル化の平均増加が１０％または１０％以上減少する漸進的メチル化ＣＧＩＤとしてショートリストに入れられた。イルミナの方法は、ＣＧ遺伝子座に隣接する配列を利用して、ｄｂＳＮＰのＮＣＢＩ の ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ （ｒｓ＃）と同様の方法で一意的なＣＧ遺伝子座クラスター（ＣＧ ｌｏｃｕｓ ｃｌｕｓｔｅｒ）ＩＤを生成する。

本発明の一実施形態では、子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルを開示しており、該パネルは、配列番号１乃至配列番号７９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を有するＡＰＤＭＡ法によって導出されたＣＧＩＤを含み、そして任意に、該パネルは、子宮頸がんの早期予測因子として他のバイオマーカーと組み合わせて使用される。

本発明の一実施形態において、ポリジーンＤＮＡメチル化バイオマーカーは、子宮頸がんの早期検出及びＣＩＮ１からＣＩＮ３の前がん病変を有する女性における子宮頸がんのリスクのための、下記表２のリストにあるＣＧＩＤの組み合わせまたは下記表３にリストされる例のようなこのリストの短いサブセットである。

したがって、本発明の追加の実施形態では、子宮頸がんの早期予測因子を得るためのインビトロ方法を開示する。この方法は、以下のステップを含む：（ａ）子宮頸部標本サンプルからのＤＮＡメチル化の測定、（ｂ）ステップａで得られたＤＮＡメチル化測定の統計分析の実行、（ｃ）ステップｂで得られたゲノムワイドＤＮＡメチル化プロファイルの進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）の分析を実行することにより、ＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）と呼ばれる多数の独立したゲノムＣＧ位置のＤＮＡメチル化状態の決定、（ｄ）子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づくＣＧＩＤの分類、（ｅ）子宮頸がんの早期予測因子をＤＮＡメチル化バイオマーカーとして取得するために、ステップｄの分類から候補ＣＧＩＤの取得。ここで、ＤＮＡメチル化バイオマーカーとしての子宮頸がんの早期予測因子としての前記候補ＣＧＩＤは、該ＣＧＩＤが以下に記載されているグループから選択される。
配列番号３
(CCGCCGCGGGTTCCCAGGGCTGGTGGTAGTTGCCGTCCCACACGTACGTGGCGGGGTCCTCGTCAGCGAAGACCTCGCGGAACATGTCGACCATGTAGAGGTCCTCGGCGCGGTTGCCATCC)、
配列番号４
(GGGGAGGAATATTAGACTCGGAGGAGTCTGCGCGCTTTTCTCCTCCCCGCGCCTCCCGGTCGCCGCGGGTTCACCGCTCAGTCCCCGCGCTCGCTCCGCACCCCACCCACTTCCTGTGCTCG)、
配列番号７
(GAGGAATATTAGACTCGGAGGAGTCTGCGCGCTTTTCTCCTCCCCGCGCCTCCCGGTCGCCGCGGGTTCACCGCTCAGTCCCCGCGCTCGCTCCGCACCCCACCCACTTCCTGTGCTCGCCC)、
配列番号１７
(GTGTGCTCAGCCTCAGCGTGAGGGGCACCTGCTCGTCTGGGCTCACAGCGAAGGCAGCCTCGCCGCGAGCTGCCGCTGCCGCTGCTGCCGCCACTGGTGTTGCCGCTCTCAGGCGCCAGGCT)、
配列番号１９
(GCGGCGGCGGGCGGGGAGCCAGGCCCGAGCTGCGTTCTGCGCAGCCATTGGTGGGCGCCGCGCTCTGCACTGAGCATGTTCGCGCCCCGCCGGCCCCTAGCCGCAGCCGCAGCCGCAGCGAC)、
配列番号３１
(GGCGGTGCGAGCTCCCCGCCTGCGGGACGCACGGAGACCGCGGTCAGCGCGCCGCCTGGCCGGCCCAGCGCGCCCAGCCCGCGCCCAGCCCCGTCCACTCCCGTCCAGCCCCGCCGCCCGGC)、
配列番号３４
(GTGTTCTCTGCGGCGGGCCGCGTCCCCGCTGAGCCTCGCGGTGACAGCCGCCTTTGGCAGCGAGCGCTCGGGGCACTTCTATCCCCGCCTCTCAAAGGGTGGGGACAGCCGTTTCCAGATTT)、
配列番号３９
(AGGGGAGCTGCGAGGCGAAGTGTTCTTCAGGGAAGCGGGCTCGAGTCTCCGCAGCTGCGGCGGCGGCGGCGGCGCGCTGGGCCGGCGGCGGGCGCGGGCAGGGGGCCGGGGGTGCCGCGCGG)、
配列番号４２
(AATCTCCCCTCGGGCTCGACGGATGTGCGCCCCAGATGTGCTGACACATGTCCGATGCCTCGCTGCCTTGGAGGTCTCCCCGCTCGCGTGTCTCTTCTCTTCGCACCAGCGGCGGAAACCGC)、
配列番号４３
(GCTCCGCTTCTCCGGGTTTTAGCGGAAGCCTGCGGGGGGCGGGGTAACCGCGGAAGCCGGCGGCCGTGGGCGCGCGGGTTGGGGGCTCTCGCGCCGCTCCGGGCTCTCCCCCCCCCCGGCTG)、
配列番号４９
(CCCCCTGTTCAAGGTCTGTCACCGTAGGGGGCGGGGGGGCGCGTGGAGCCGCTGGGGGTTCGGCCCACCCCGCGAACCGAGCTCCCGGCCCTGTGCGCCCTCAGCTCTGCCGCGGGCGTTGG)、
配列番号５６
(GGCGCCGGCAGCTTCGCGCCGGCGGCTGGAAGCGGGCGGGCTGCACGGGCGGCTCGAGTGCGGGGACCCCAGCCCCTCGCCCTCGTGAGCGCCGCCCCTGCCACCTGCTGCCAAGTCACCGG)、
配列番号５７
(CCCCGGCCGCGCCGGGCGCGGGGCTCGGGATTCGGGAGACCGCGCGGCGCCGAAGCCACGCGTCAGCCCCACTGTCCCGCGCGCCTCGCCCCAGGCCTCGGGCTCTTCCTCCGCACCTCGTA)、
配列番号５８
(ACGCGGGGACTGGAAAGGGCGCCTGGGTGGGAAGAGGCGCTGGCGGGTGATCGTCCCCACCGGGCCAGTCCCCGGGATCTGCTGCCGCCCCTCTCCGAAATTCACAGCCAGAGCGGGCGCAC)、
配列番号６５
(CTCTTTGGCAAGTGGTTTGTGCATCAGGAGAAACTTTCCACCTGCGAGCCGAACCGGCGCCGAGTGCGTGTGTTTCTGCCTTTTTTTGTTGTCGTTGCCTCCACCCCTCCCCATTCTTCTCT)、及び
配列番号７０
(GGCAACCCTGACTCGGACCGCTCGGGAGAGCCCCAGGAGAGGCCAGCGCCGCGCAGCAGCCGCCCCGCTGCGCCCACCTCCCCGGCTGCTCCCGGAGGGCTCACAAAGGCGGTGGCCGCCCG)。

表２：本発明の実施形態において有用なＣｐＧメチル化サイトを有する、表１から選択されたポリヌクレオチドのサブセット。
本明細書で議論される１６のＣＧＩＤバイオマーカーは、本出願に含まれる表２に見られる。これらの１６の候補に挙げられたＤＮＡメチル化バイオマーカーは、ＣＩＮ３から
ＣＩＮ１及びコントロールの範囲で高メチル化され、ＣＩＮ３とコントロールとの間で最大の効果サイズ（コーエンＤ＞１．３）、及びＣＩＮフェーズの進行で最大のスピアマン相関ｒ＞０．４を有する。

本発明の一実施形態において、子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーの組み合わせを開示し、該組み合わせは、子宮頸部標本に由来するＤＮＡ中のＣＧＩＤのＤＮＡメチル化レベルを測定することによって子宮頸がんを検出し、そして、線形回帰方程式及び受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを使用して「子宮頸がんのメチル化予測因子」を導出するためのＡＰＤＭＡ法を使用して導出された上記ＣＧＩＤを含む。ここで、該ＣＧＩＤは配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６５、配列番号７０に記載されるもの及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

表３：本発明の実施形態において有用なＣｐＧメチル化サイトを有する、表２から選択されたポリヌクレオチドのサブセット。
２つのＣＧＩＤバイオマーカー、すなわち本明細書で論じる配列番号３(CCGCCGCGGGTTCCCAGGGCTGGTGGTAGTTGCCGTCCCACACGTACGTGGCGGGGTCCTCGTCAGCGAAGACCTCGCGGAACATGTCGACCATGTAGAGGTCCTCGGCGCGGTTGCCATCC）に記載のｃｇｌ３９４４１７５及び配列番号３１（GGCGGTGCGAGCTCCCCGCCTGCGGGACGCACGGAGACCGCGGTCAGCGCGCCGCCTGGCCGGCCCAGCGCGCCCAGCCCGCGCCCAGCCCCGTCCACTCCCGTCCAGCCCCGCCGCCCGGC）に記載のｃｇ０３４１９０５８は、本出願に含まれる表３に見られる。表３のサブセットは、ＣＧＩＤの数を５に減らしたペナルティ付き回帰、続いてこれらの５つのＣＧＩＤを独立変数とし、ＣＩＮ３状態を従属変数とする多変数線形回帰を使用して識別されたコントロールからＣＩＮ３の前がん病変を区別するＣＧＩＤバイオマーカーの最小数を表す。これらの２つのサイトの加重メチル化レベルで構成される線形回帰式は、ＣＩＮ３の予測に対して非常に有意であった（ｐ＜５ｘ１０^－１５）。

本発明の一実施形態において、子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーの組み合わせを開示し、該組み合わせは、子宮頸部標本に由来するＤＮＡ中のＣＧＩＤのＤＮＡメチル化レベルを測定することによって子宮頸がんを検出し、そして、線形回帰方程式及び受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを使用して「子宮頸がんのメチル化予測因子」を導出するためのＡＰＤＭＡ法を使用して導出された前記ＣＧＩＤを含む。ここで、該ＣＧＩＤは配列番号３及び配列番号３１に記載されるものである。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんのポリジーンＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルのＤＮＡメチル化測定を検出するための手段及び試薬を含む、子宮頸がんを検出するためのキット及びプロセスを提供する。

一実施形態において、本発明は、表１のＣＧＩＤバイオマーカー及びそれらの組み合わせのＤＮＡメチル化測定のための手段及び試薬を含む、子宮頸がんを検出するためのキットを提供する。

一実施形態において、本発明は、ＣＧＩＤのＤＮＡメチル化測定及び子宮頸がんのＤＮＡメチル化予測因子を導出するための手段及び試薬、並びに取扱説明書を含む、子宮頸がんを検出するためのキットを提供する。ここで、ＣＧＩＤは、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんを検出するためのチップの形態のＣＧＩＤのパネルを含むキットを提供する。ここで、ＣＧＩＤのパネルは、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである。

一実施形態において、本発明は、本発明において開示されるＣＧＩＤバイオマーカーを使用するキットを提供する。

一実施形態において、本発明は、ＣＧＩＤのＤＮＡメチル化を測定することにより子宮頸がんを予測するためのＤＮＡパイロシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットを提供する。ここで、ＣＧＩＤは、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである。

一実施形態において、本発明は、上記のＣＧＩＤバイオマーカーを使用して子宮頸がんを予測するためのＤＮＡパイロシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットを提供する。例えば、以下に開示されるプライマー及び製造業者（Ｐｙｒｏｍａｒｋ、Ｑｉａｇｅｎ）が推奨するパイロシーケンシング反応の標準条件を使用する：
ｃｇ０３４１９０５８の場合：
GGTTTTTGGGTAGGAAGGATAGTAGのポリヌクレオチド配列を有する配列番号８０に記載のフォワード（ビオチン化）プライマーである。
AAACAAATCTAACCCCTAAAAAAACのポリヌクレオチド配列を有する配列番号８１に記載のリバースプライマーである。
CAAACTAAACACACTAAACCのポリヌクレオチド配列を有する配列番号８２に記載のパイロシーケンシングプライマーである。
ｃｇｌ３９４４１７５の場合：
GGGTTTTTAGGGTTGGTGGTAのポリヌクレオチド配列を有する配列番号８３に記載のフォワードプライマーである。
TCCTCATAATAATAAATAACAACCのポリヌクレオチド配列を有する配列番号８４に記載のリバース（ビオチン化）プライマーである。
TATGTATGTGGTGGGGTTのポリヌクレオチド配列を有する配列番号８５に記載のパイロシーケンシングプライマーである。

一実施形態において、本発明は、ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化を測定することにより子宮頸がんを予測するためのＤＮＡパイロシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットを提供する。ここで、フォワード、ビオチン化プライマーは配列番号８０に記載されるものであり、リバースプライマーは配列番号８１に記載されるものであり、パイロシーケンシングプライマーは配列番号８２に記載されるものである。

一実施形態において、本発明は、ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化を測定することにより子宮頸がんを予測するためのＤＮＡパイロシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットを提供する。ここで、フォワード、ビオチン化プライマーは配列番号８３に記載されるものであり、リバースプライマーは設定配列番号８４に記載されるものであり、パイロシーケンシングプライマーは配列番号８５に記載されるものである。

一実施形態において、本発明は、上記のＣＧＩＤバイオマーカーを使用することにより、子宮頸部標本のＤＮＡにおける子宮頸がんを予測するための、ポリジーン多重アンプリコンバイサルファイトシークエンシングＤＮＡメチル化アッセイ（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｍｐｌｉｃｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を使用するキットを提供する。例えば、バイサルファイト変換を含む以下に開示するプライマー及び標準条件を使用し、標的特異的プライマー（ＰＣＲ１）とそれに続くバーコーディングプライマー（ＰＣＲ２）による連続増幅、及び単一の次世代Ｍｉｓｅｑシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での多重シーケンシング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、イルミナソフトウェアを使用した逆多重化、メチル化キット（Ｍｅｔｈｙｌｋｉｔ）などの標準的なメチル化分析方法を使用したデータ抽出及びメチル化の定量化、その後の加重ＤＮＡメチル化スコアの計算とがんの予測である。
最初のＰＣＲは次のように実行される：
ＣＧＩＤ ｃｇ０３４１９０５８の場合：
5’ GGTTTTTGGGTAGGAAGGATAGTAG 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号８０に記載のフォワードプライマーである。
5’ AAACAAATCTAACCCCTAAAAAAAC 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号８１に記載のリバースプライマーである。
ＣＧＩＤ ｃｇ１３９４４１７５の場合：
5’ GGGTTTTTAGGGTTGGTGGTA 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号８３に記載のフォワードプライマーである。
5’ TCCTCATAATAATAAATAACAACC 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号８４に記載のリバースプライマーである。
サンプルをバーコード（インデックス）するために、本発明は、以下のプライマーを用い
た第２のＰＣＲ反応を使用した。
5’AATgATACggCgACCACCgAgATCTACACTCTTTCCCTACACgAC 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号８６に記載のフォワードプライマーである。
5’CAAgCAgAAgACggCATACgAgATAGTCATCGgTgACTggAgTTCAgACgTg 3’のポリヌクレオチド配列を有する、配列番号８７に記載のバーコーディング（リバース）プライマーである。（ここで、赤いベースはインデックスであり、このインデックスの１２００のバリエーションが使用されている。)

一実施形態において、本発明は、ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化レベルを測定することにより子宮頸がんを検出するための次世代シーケンサーでの多重標的増幅バイサルファイトシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットを提供する。ここで、ＣＧＩＤは、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである。

別の実施形態において、本発明は、ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化レベルを測定することにより子宮頸がんを検出するための次世代シーケンサーでの多重標的増幅バイサルファイトシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットを提供する。ここで、ＣＧＩＤは、配列番号３に記載されるものであり、
フォワードプライマーとして5’
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGGGTTTTTAGGGTTGGTGGTA 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号８８に記載されるプライマー、及びリバースプライマーとして5’
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCATAATAATAAATAA CAACC 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号８９に記載されるプライマーを有する。

別の実施形態において、本発明は、ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化レベルを測定することにより子宮頸がんを検出するための次世代シーケンサーでの多重標的増幅バイサルファイトシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットを提供する。ここで、前記ＣＧＩＤは、配列番号３１に記載されるものであり、フォワードプライマーとして5’ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGGTAGGTTTTTGGGTAGGAAGGATAGTAG 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号９０に記載されるプライマー、及びリバースプライマーとして5’
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAACAAATCTAACCCCTAAAAAAAC 3’のポリヌクレオチド配列を有する配列番号９１に記載されるプライマーを有する。

一実施形態では、本発明は、表１のＣＧＩＤバイオマーカー及びそれらの組み合わせの加重ＤＮＡメチル化測定、または例として表２のようなこれらのＣＧＩＤのサブセット及びそれらの組み合わせの加重ＤＮＡメチル化測定を使用して、子宮頸がんと正常子宮頸部との閾値を定義することにより、がんを検出するための受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイの使用を提供する。閾値を超えるサンプルはがんとして分類される。

一実施形態において、本発明は、表１にリストされたＣＧＩＤバイオマーカー及びそれらの組み合わせのメチル化の測定を使用することにより、がん陽性の早期検出を得る際に使用されるがんを予測するための階層的クラスタリング分析アッセイの使用を提供する。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんのスクリーニングと早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルに記載されるＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化レベルを測定することによりがんを検出するためのサンプルから抽出されたＤＮＡの質量分析法に基づく（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（登録商標））またはＰＣＲベースのメチル化アッセイを使用するキットを提供する。ここで、該パネルは、配列番号１乃至配列番号７９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を有するＡＰＤＭＡ法によって導出さ
れたＣＧＩＤを含み、そして、任意で、該パネルは、子宮頸がんの早期予測因子として他のバイオマーカーと組み合わせて使用される。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんのスクリーニングと早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルに記載されるＤＮＡメチル化ＣＧＩＤの組み合わせの測定を使用することにより、子宮頸がんを予測するメチル化スコアを計算するための多変数線形回帰方程式またはニューラルネットワーク分析の使用を提供する。ここで、該パネルは、配列番号１乃至配列番号７９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を有するＡＰＤＭＡ法によって導出されたＣＧＩＤを含み、そして、任意で、該パネルは、子宮頸がんの早期予測因子として他のバイオマーカーと組み合わせて使用される。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーの組み合わせに記載されるＤＮＡメチル化ＣＧＩＤの組み合わせの測定を使用することにより、子宮頸がんを予測するメチル化スコアを計算するための多変数線形回帰方程式またはニューラルネットワーク分析の使用を提供する。ここで、該組み合わせは、子宮頸部標本に由来するＤＮＡ中の前記ＣＧＩＤのＤＮＡメチル化レベルを測定することそして線形回帰方程式及び受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを使用して「子宮頸がんのメチル化予測因子」を導出することによって子宮頸がんを検出するための、ＡＰＤＭＡ法を使用して導出されたＣＧＩＤを含む。ここで、該ＣＧＩＤは配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号：４９、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：６５、配列番号７０に記載されるもの及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

代替の実施形態において、本発明は、ＤＮＡメチル化バイオマーカーの組み合わせに記載される、ＤＮＡメチル化ＣＧＩＤの組み合わせの測定を使用することにより、子宮頸がんを予測するメチル化スコアを計算するための多変数線形回帰方程式またはニューラルネットワーク分析の使用を提供する。ここで、該ＣＧＩＤは、配列番号３、及び配列番号３１に記載されるものである。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルに記載されるＤＮＡメチル化組み合わせの測定を使用することにより、子宮頸がんを非がん性子宮頸部組織から区別する「メチル化スコア」閾値を定義するため受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイの使用を提供する。ここで、該パネルは、配列番号１乃至配列番号７９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を有するＡＰＤＭＡ法によって導出されたＣＧＩＤを含み、任意で、該パネルは子宮頸がんの早期予測因子としての他のバイオマーカーと組み合わせて使用される。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーの組み合わせに記載されるＤＮＡメチル化組み合わせの測定を使用することにより、子宮頸がんを非がん性子宮頸部組織と区別する「メチル化スコア」閾値を定義する受信者動作特性（ＲＯＣ）あっせいの使用を提供する。ここで、該組み合わせは、子宮頸部標本に由来するＤＮＡ中の前記ＣＧＩＤのＤＮＡメチル化レベルを測定すること、そして、線形回帰方程式及び受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを使用して「子宮頸がんのメチル化予測因子」を導出することによって子宮頸がんを検出するためのＡＰＤＭＡ法を使用して導出されたＣＧＩＤを含む。ここで、該ＣＧＩＤは配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号：４９、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号： ６５、配列番号７０に記載されるもの及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

代替の実施形態において、本発明は、ＤＮＡメチル化組み合わせの測定を使用することにより、子宮頸がんを非がん性子宮頸部組織と区別する「メチル化スコア」閾値を定義する受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイの使用を提供する。ここで、該ＣＧＩＤは、配列番号３及び配列番号３１に記載されるものである。

一実施形態において、本発明は、子宮頸がん診断の早期検出のための候補ＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得するためのコンピューター実施方法を提供し、この方法は、多数の独立したゲノムＣＧ位置のゲノムワイドＤＮＡメチル化データ、ヒトゲノムのＣＧＩＤを提供すること；正規化によってゲノムワイドＤＮＡメチル化データを処理し、正規化されたＤＮＡメチル化ベータ値を導出すること；正規化されたＤＮＡメチル化ベータ値を用いて、前がんの進行ステージと非形質転換子宮頸細胞との間のスピアマン相関を計算すること；子宮頸がん診断の早期検出のための候補ＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得するための進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）の分析による候補ＣＧＩＤを取得することを含む。

以下の実施例は、本発明の例示として与えられており、したがって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１：メチル化レベルが子宮頸がんの早期予測因子であるＣＧ位置（ＣＧＩＤ）を特定及び取得するための進行性ＤＮＡメチル化変化方法の分析（ＡＰＤＭＡ）。
本発明は、早期介入及び治療を導くことができる、リスクの非常に正確で感度の高い評価を提供する安定したバイオマーカーを見つけるための、子宮頸がんスクリーニングにおける未解決の課題の１つに取り組む。一般的なアプローチは、ゲノムワイドＤＮＡメチル化データのケースコントロールロジスティック回帰を使用して、がん細胞とコントロールのどちらかで多かれ少なかれメチル化されているサイトを特定することである。しかし、標本中のがん細胞の頻度が低いときに希釈されるため、これらの方法で検出されたがんにおける統計的に有意なＤＮＡメチル化の変化の多くは不均一であり、そして多くはがんの進行の後半に進化するため、早期検出では非常に限られた価値しかないことは知られている。さらに、正常細胞とがん細胞の混合物では、カテゴリーの違いではなく、メチル化プロファイルの量的な違いを消去する可能性がある。よく理解されているように、ＤＮＡのメチル化はバイナリプロパティであり、つまり、与えられた細胞がゲノムの特定のＣＧ位置でメチル化されているか、メチル化されていないかのいずれかである。

この例では、本発明は、子宮頸癌標本全体でほぼ均一にメチル化されるが、正常組織では決してメチル化されず、子宮頸がんに分類されるが、子宮頸癌のカテゴリーであるにもかかわらず、それらは正常細胞の環境で前癌段階の非常に早い段階で出現し、子宮頸がんに向かって進行するＣＩＮ１からＣＩＮ３ステージへと頻度が徐々に増加する、子宮頸がんの基本的特徴として選択されたメチル化ＣＧＩＤに関する。正常組織とがん組織でカテゴリー的に異なるメチル化ＣＧＩＤは、単一ＤＮＡ分子分解を提供するバイサルファイト変換ＤＮＡのディープシーケンシングにより、標本でがん細胞が低頻度で検出された場合でも検出されることがわかっている。メチル化されたＣＧＩＤを持つ分子の頻度は、サンプル中のがん細胞の割合を表す。他の方法によるそのようなＣＧＩＤのメチル化測定もまた、標本中のがん細胞の発生率を決定し、サンプル中の子宮頸がんのリスクと予測のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーとして有用である。

ＣＩＮ前がん病変の一部が子宮頸がんに発展することが臨床的に知られており、したがって、それらはがんにおける初期のＤＮＡメチル化変化を検出するための特にユニークな方法（ｗｉｎｄｏｗ）を提供する。子宮頸がんを発症する人を早期に予測することは、臨
床的に最も重要である。本発明は、以下の技術的特徴を特徴とするそのような早期検出ＤＮＡメチル化バイオマーカーを得るための方法を提供する：まず、初期のがん細胞にカテゴリー的に特徴的なメチル化されたＣＧＩＤは、正常な子宮頸部組織では均一にメチル化されていない；第二に、これらのＣＧＩＤは、まれに初期の前がん標本でメチル化される；第三に、これらの重要なメチル化ＣＧＩＤの頻度は、ＣＩＮ３病変のある女性の子宮頸がんリスクが増加すると予測されるように、前がんステージがＣＩＮ１からＣＩＮ３に進行するにつれて増加するはずである；そして第四に、これらのＣＧＩＤのメチル化は子宮頸がんの主要な特徴であるため、これらのＣＧＩＤは子宮頸がん標本に均一に豊富に含まれている必要がある。この例では、ＣＩＮ１からＣＩＮ３へのＣＩＮステージの進行とともにメチル化が増加する特定のＣＧＩＤは、子宮頸がん標本で遍在的にメチル化されていることが分かったが、ここで説明するように、正常組織では均一にメチル化されていないことが分かった。したがって、本発明の現在開示されている方法は、女性、特に前がん病変を有する女性における子宮頸がんの早期検出のための候補ＣＧＩＤバイオマーカーのパネルを提供する。

図１に要約されているように、メチル化の状態が早期子宮頸がんを検出するＣＧＩＤバイオマーカーを描写するために、進行性ＤＮＡメチル化変化（ＡＰＤＭＡ）法の次のステップが実行された。

子宮頸部標本
本発明は、子宮頸がんのスクリーニング結果が異常であるためマギル大学付属病院でコルポスコープ検査（ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｉｃ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）のために、または子宮頸部病変の初期治療のために、紹介された女性から収集された子宮頸部標本を使用した（１９）。簡単に説明すると、２０１５年６月から２０１６年４月の間に１６～７０歳の６４３人の女性が登録された。ＨＰＶ１とＨＰＶ１８を別々に検出するＲｏｃｈｅ ｃｏｂａｓ（登録商標） ４８００ＨＰＶテスト、及びプールされた結果として他の１２種の高リスクタイプ（ＨＰＶ ３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、及び６８）を使用して、発がん性タイプのＨＰＶ ＤＮＡの存在について標本をテストした。細胞診は、ベセスダ分類に従って下記のように分類された。ＮＩＬＭ：上皮内病変または悪性腫瘍に対して陰性；ＡＳＣ－ＵＳ：異型扁平上皮細胞－意義不明；ＡＳＣ－Ｈ：異型扁平上皮細胞－ＨＳＩＬを除外できない；ＬＳＩＬ：低扁平上皮内病変；ＨＳＩＬ：高扁平上皮内病変；ＡＧＣ：異型腺細胞；と癌（２０）。子宮頸部の異常を生検し、組織学的結果をマギルの上級病理医が正常、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、または浸潤がんとして評価した。この研究は、マギル大学とユダヤ人総合病院の施設内審査委員会から倫理的承認を受けた。研究参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。

サンプルセットは、ランダムに選択された１８６人の医師が収集した女性の標本で構成されていた。これらの検体のうち、５０標本はＣＩＮ１、４０標本はＣＩＮ２、４２標本はＣＩＮ３だったが、５４標本は正常な生検結果であった。

ＤＮＡ抽出とゲノムワイドメチル化分析
ＤＮＡは、元の剥離した子宮頸部細胞標本から抽出され、液体ベースの細胞診ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ、ホロジック株式会社（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）、ミシサガ）に懸濁された。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ抽出キットを使用して抽出されたＤＮＡは、モントリオールのゲノムケベックイノベーションセンター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｂｅｃ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）での製造元が説明した標準的な手順を使用して、バイサルファイト処理とイルミナエピック（ＩｌｌｕｍｉｎａＥｐｉｃ）アレイへのハイブリダイゼーションにかけられた。エピックアレイは、転写を調節するすべての既知の領域を表す、ヒトプロモーター及びエンハンサーレパートリーの優れたカバ
レッジを提供する（２１）。

すべてのサンプルの正規化及び正規化されたＤＮＡメチル化値（ベータ）の導出
イルミナインフィニウムＨＤテクノロジーユーザーガイドに従って、マギルゲノムケベックイノベーションセンターが推奨するように、サンプルをスライドとアレイ上の位置に関してランダム化し、すべてのサンプルをハイブリダイズして同時にスキャンし、バッチ効果を軽減した。イルミナアレイのハイブリダイゼーションとスキャンは、製造元のガイドラインに従ってマギルゲノムケベックイノベーションセンターによって実行された。イルミナアレイは、Ｍｏｒｒｉｓ等、２０１４（２５）によるＲのＣｈＡＭＰバイオコンダクターパッケージを使用して分析された。ＩＤＡＴファイルは、ｍｉｎｆｉ品質管理及び正規化オプションを使用してｃｈａｍｐ．ｌｏａｄ関数の入力として使用された。生データは、少なくとも１つのサンプルでＰ＞０．０１の検出値を持つプローブについてフィルタリングされた。現在の方法では、性的影響を軽減するためにＸまたはＹ染色体上のプローブ、Ｍａｒｚｏｕｋａ等、２０１５（２４）で特定されたＳＮＰを含むプローブ、及びＭａｒｚｏｕｋａ等、２０１５（２４）で特定された複数の場所に整列するプローブを除外した。関数ｃｈａｍｐ．ｓｖｄを使用して、正規化されていないデータについてバッチ効果を分析した。最初の６つの主成分のうち５つは、グループとバッチ（スライド）に関連付けられていた。インフィニウムタイプ２プローブ設計によって導入されたバイアスのデータを調整するためのアレイ内正規化は、関数ｃｈａｍｐ．ｎｏｒｍ（ｎｏｒｍ＝_“ＢＭＩＱ_”）を使用したベータ混合物分位点正規化（ＢＭＩＱ）を使用して実行された（２５）。次に、ｃｈａｍｐ．ｒｕｎｃｏｍｂａｔ関数を使用してＢＭＩＱを正規化した後、バッチ効果が修正された。

メチル化の頻度がＣＩＮの進行と相関するＣＧＩＤの発見
次に、現在の方法では、バッチ修正された正規化データのベータ値を使用して、Ｒのスピアマンｃｏｒｒ関数を使用し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ Ｈｏｃｈｂｅｒｇの「ｆｄｒ」方法を使用して多重検定を修正して、ＣＩＮステージ（非形質転換の健康なコントロール子宮頸部細胞の場合はステージコード０、ＣＩＮ１からＣＩＮ３までのＣＩＮステージの場合はステージコード１～３）間のスピアマン相関を計算した（＜０．０５の調整済みＰ値（Ｑ））。７７１５ ＣＧＩＤのメチル化レベルは、前がんＣＩＮステージの１から３への進行と有意に相関していた（ｑ＞０．０５）（図２を参照）。前がん病変が正常からＣＩＮ１乃至ＣＩＮ３のステージに進行するにつれて、ほとんどの部位が高メチル化されたが、ごく一部が低メチル化された（図２を参照）。

候補ＣＧＩＤのショートリスト
ＡＰＤＭＡ法の仮定に対応するＣＧＩＤの位置を特定するために、正常細胞におけるバックグラウンドメチル化（メチル化は１０％未満）を有し、ＣＩＮ１からＣＩＮ３への移行中に１０％の平均増加または１０％を超える減少したメチル化を有する、７９の漸進的にメチル化されたＣＧＩＤはショートリストされた（上記の表１を参照）。次に、本方法では、これらのＣＧＩＤが、２７０の子宮頸がん標本（ＧＳＥ６８３３９を参照）から公開されているイルミナ４５０ＫゲノムワイドＤＮＡメチル化データで子宮頸がんを均一に識別するかどうかをテストした（ＧＳＥ６８３３９を参照）。次に、テストされたＣＧＩＤ ＤＮＡメチル化に基づいて、本方法は、現在開示されているＡＰＤＭＡ法によって取得された子宮頸部前がん期の進行中にメチル化の頻度が増加したこれらの７９のＣＧＩＤでヒートマップを生成した。前記のヒートマップは、これらの７９のＣＧＩＤが、子宮頸がんと正常な子宮頸部の間でカテゴリー的に異なるＤＮＡメチル化プロファイルを示すことを明らかにした。明らかに大多数のサイトは正常組織では完全にメチル化されておらず、がん組織では高度にメチル化されていたが、少数のサイトは正常組織ではメチル化され、子宮頸がんではメチル化されていなかった（図３を参照）。したがって、本発明の方法は、低頻度のメチル化でさえ完全にメチル化されていない分子のバックグラウンドで明ら
かに検出可能であるため、好ましいバイオマーカーとしてこれらの高メチル化ＣＧＩＤに関連している。

実施例２：子宮頸がんの早期検出のためのポリジーンＤＮＡメチル化バイオマーカーセットの発見。
本開示は、実施例１及び表１で得られ、開示されたリストから１６個のＣＧＩＤをさらにショートリストし、前記１６個のＣＧＩＤは、ＣＩＮ３からＣＩＮ１及びコントロールの範囲で高メチル化され、ＣＩＮ３とコントロールとの間で最大の効果サイズ（コーエンＤ＞１．３）、及びＣＩＮフェーズの進行で最大のスピアマン相関ｒ＞０．４を有する。（上記の表２を参照）。

次に、ＣＩＮ３前がん病変をコントロールから区別するために必要な最小数のＣＧＩＤを取得するために、本方法はペナルティ回帰を実行し、ＣＧＩＤの数を５に減らした。次に、本方法では、これら５つのＣＧＩＤを独立変数として、ＣＩＮ３状態を従属変数として多変数線形回帰を実行した。残り２つのＣＧＩＤは重要であった（上記の表３を参照）。これら２つのサイトの加重メチル化レベルで構成される線形回帰方程式は、ＣＩＮ３の予測にとって非常に重要であった（ｐ＜５ｘ１０^－１５）。

実施例３：子宮頸がんを検出するためのバイジェニックＤＮＡメチル化マーカーの有用性。
次に、本開示は、最初に、子宮頸がんの４５０Ｋ ＤＮＡメチル化の公的に利用可能なデータベース（ＧＳＥ６８３３９を参照）上のバイジェニックＤＮＡメチル化マーカー（ｃｇ０３４１９０５８； ｃｇｌ３９４４１７５）を検証した。子宮頸がんを従属変数とし、２つのＣＧＩＤ（ｃｇ０３４１９０５８；ｃｇｌ３９４４１７５）のメチル化レベルを独立変数とする二変量線形回帰モデルは、非常に有意（ｐ＜２．２ｘ１０－１６、Ｆ＝８７０３、Ｒ＝０．９８７３）であることが観察された。メチル化スコア（図４Ａに開示されている線形回帰方程式を使用して計算）のＲＯＣは、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって比較された（図４Ｂを参照）。子宮頸がんを正常な子宮頸部組織から区別するためのバイジェニックメチル化スコアの感度と特異性は１であることが観察された（図４Ｃを参照）。

したがって、上記のＤＮＡメチル化バイオマーカーと計算されたメチル化スコアは、リスクのある女性だけでなく、定期的な婦人科検診パップスメアで収集された子宮頸部検体を使用する女性の一般的な健康集団の子宮頸がんのスクリーニングと早期検出に役立つ。

実施例４：健康なコントロール、ＣＩＮ１からＣＩＮ３及び子宮頸がん患者からの個々の標本における子宮頸がんメチル化スコアを測定するためのバイジェニックＤＮＡメチル化バイオマーカーの有用性。
メチル化スコア（子宮頸がんの予測）は、コントロール、ＣＩＮ１からＣＩＮ３（上記の実施例１で説明したＭｃＧｉｌｌコホートから）及び子宮頸がん（ＧＳＥ６８３３９を参照）の個々の標本のそれぞれについて、図４Ａに示す方程式を使用して計算した（図５Ａを参照）（さまざまなグループの平均値については、図５Ｂを参照）。結果は、ＣＩＮステージの進行に伴う子宮頸がんのリスク増加の臨床観察から予想されるように、進行した前がん病変におけるメチル化スコアの増加を示している。メチル化スコアは、子宮頸がんのリスクについてＣＩＮ病変のある女性のスクリーニングに使用できる。

実施例５：メチル化スコアと前がん子宮頸がんから子宮頸がんへの進行のスピアマン相関。
スピアマン相関分析は、健康状態、前がんステージのＣＩＮ１からＣＩＮ３、及び子宮頸がんからの子宮頸部標本のメチル化スコアの間で実行された（コントロール、ｎ＝５４
；ＣＩＮ１、ｎ＝５０；ＣＩＮ２、ｎ＝４０；ＣＩＮ３、ｎ＝４２；子宮頸がん、ｎ＝２７０）。結果は、バイジェニックマーカーのメチル化スコアと前がんからがん状態への進行との間に非常に有意な相関関係（ｐ＜２．２ｘ１０^－１６及びｒ ＝ ０．８８）を示している（図６を参照）。

実施例６：子宮頸がんを検出するためのメチル化バイオマーカー（ｃｇｌ３９４４１７５）の検証。
ＴＣＧＡ子宮頸癌データでは１つのＣＧＩＤバイオマーカーのみのデータが利用可能であったので、本開示は、前記ＣＧＩＤ、ｃｇｌ３９４４１７５のみのＤＮＡメチル化データを用いた線形回帰方程式を使用して子宮頸がんのメチル化スコアを計算した。スピアマンの相関は、がんへの進行ステージとメチル化スコアの間で計算された（図７Ａの統計と図７Ｂの相関チャートを参照）。この開示では、ＣＩＮ１からＣＩＮ３は、該出願の実施例１ですでに説明したように、ＭｃＧｉｌｌコホートからのものであり、スコアの割り当ては、割り当てられたスケール：コントロール：０、ＣＩＮ１－３：それぞれ１－３、及び子宮頸がん：４に基づいている。

実施例７：前がん子宮頸部標本における子宮頸がんを検出するためのバイジェニックメチル化バイオマーカーの有用性。
バイジェニックメチル化バイオマーカーを使用して、ＣＩＮ１からＣＩＮ３のどのサンプルが子宮頸がんに進行するかを予測した。メチル化スコアは、エピックアレイデータから取得した２つのＣＧサイトのメチル化値に基づいて各標本について計算された。子宮頸がんと健康な子宮頸部標本の比較から計算されたがんの閾値を使用して（図３を参照）、各サンプルについて予測が行われた（図８Ａを参照）。がん性になると予測された標本の割合は、予想通り、ＣＩＮ１標本の数％からＣＩＮ３標本の６０％に増加した（図８Ｂを参照）。

本発明は、その好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の多くの可能な修正及び変形を行うことができることを理解されたい。

これらの新しいＤＮＡメチル化バイオマーカーは、ヒト子宮頸がんの早期かつ正確な診断のための診断キットとして開発されることができる。それらは、子宮頸がんの開始及び発症中の細胞変化の直接的な指標であり、子宮頸がん標本全体でほぼ均一にメチル化されるが、正常組織ではメチル化されず、ＣＩＮ１からＣＩＮ３前がんステージへの頻度が徐々に増加する子宮頸がんの基本的な特徴を示す。これらのバイオマーカーは、ＣＩＮ病変における子宮頸がんの正確な早期検出のための病理学を補完するだけでなく、無症候性の女性における早期検出及びリスク予測バイオマーカーとしても機能する。これらのバイオマーカーは、診断のツールとしてＣＧＩＤの形で使用できる、遺伝子調節において主要な役割を果たす既存のエピジェネティックなＤＮＡメチル化マーカーに有用な視点を提供した。これらのバイオマーカーは、まだアクセスできない前がんステージでのヒト子宮頸がんの正確で早期かつまだ実行不可能な診断のための、高速で、安価で、正確で安定した、ハイスループットな診断キットを提供することができる。

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Claims (21)

1. 子宮頸がんの早期予測因子を取得するためのインビトロ方法であって、該方法は、以下のステップを含む方法：（ａ）子宮頸部標本サンプルからのＤＮＡメチル化測定、（ｂ）ステップａで得られたＤＮＡメチル化測定の統計分析の実行、（ｃ）ステップｂで得られたゲノムワイドＤＮＡメチル化プロファイルの進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）を実行することによる、ＣＧ識別子（ＣＧＩＤ）と呼ばれる多数の独立したゲノムＣＧ位置のＤＮＡメチル化状態の決定、（ｄ）子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づくＣＧＩＤの分類、（ｅ）子宮頸がんの早期予測因子をＤＮＡメチル化バイオマーカーとして取得するための、ステップｄの分類から候補ＣＧＩＤの取得。
2. 前記ＤＮＡメチル化測定が、イルミナ２７Ｋ、４５０Ｋまたは８５０Ｋアレイ、ＨｉＳｅｑ、ＭｉｎｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑシーケンサーを含むプラットフォームでのゲノムワイドバイサルファイトシーケンシング、トレントシーケンシング、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）シーケンシング、オリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーション、ＤＮＡパイロシーケンシング、質量分析ベース（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（登録商標））またはＰＣＲベースのメチル化アッセイを含む方法を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＤＮＡメチル化測定の統計分析が、ピアソン相関、受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイ、及び階層的クラスタリング分析を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記子宮頸がんの前がんステージの進行が、ステージＣＩＮ１、ＣＩＮ２及びＣＩＮ３での子宮頸部上皮内腫瘍性病変を含む、請求項１に記載の方法。
5. 子宮頸がんの前がんステージの進行に関連するそれらのＤＮＡメチル化の頻度に基づく前記ＣＧＩＤが、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるＣＧＩＤ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. ＤＮＡメチル化バイオマーカーとしての子宮頸がんの早期予測因子とする前記候補ＣＧＩＤが、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６５、配列番号７０に記載されるもの、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーのパネルであって、該パネルは、配列番号１乃至配列番号７９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を有するＡＰＤＭＡ法によって導出されたＣＧＩＤを含み、
   任意で、前記パネルは、子宮頸がんの早期予測因子として他のバイオマーカーと組み合わせて使用される。
8. 子宮頸がんのスクリーニング及び早期検出のためのＤＮＡメチル化バイオマーカーの組み合わせであって、前記組み合わせは、子宮頸部標本に由来するＤＮＡ中のＣＧＩＤのＤＮＡメチル化レベルを測定することそして線形回帰方程式及び受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを使用して「子宮頸がんのメチル化予測因子」を導出することによって子宮頸がんを検出するための、ＡＰＤＭＡ法を使用して導出された前記ＣＧＩＤを含み、ここで、該ＣＧＩＤは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６５、配列番号７０に記載され
   るもの及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
9. 前記ＣＧＩＤが、配列番号３及び配列番号３１に記載される、請求項９に記載のＤＮＡメチル化バイオマーカーの組み合わせ。
10. ＣＧＩＤのＤＮＡメチル化測定及び子宮頸がんのＤＮＡメチル化予測因子を導出するための手段及び試薬、並びに取扱説明書を含み、ここで、前記ＣＧＩＤは、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである、子宮頸がんを検出するためのキット。
11. 子宮頸がんを検出するためのチップ形態のＣＧＩＤのパネルを含むキットであって、該ＣＧＩＤのパネルが、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである、キット。
12. ＣＧＩＤのＤＮＡメチル化を測定することにより子宮頸がんを予測するためのＤＮＡパイロシーケンシングメチル化法を使用するキットであって、該ＣＧＩＤが、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである、キット。
13. ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化を測定することにより子宮頸がんを予測するためのＤＮＡパイロシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットであって、フォワード、ビオチン化プライマーが配列番号８０に記載されるものであり、リバースプライマーが配列番号８１に記載されるものであり、パイロシーケンシングプライマーが配列番号８２に記載されているものである、キット。
14. ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化を測定することにより子宮頸がんを予測するためのＤＮＡパイロシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットであって、フォワード、ビオチン化プライマーが配列番号８３に記載されるものであり、リバースプライマーが配列番号８４に記載されるものであり、パイロシーケンシングプライマーが配列番号８５に記載されるものである、キット。
15. ＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化レベルを測定することにより子宮頸がんを検出するための次世代シーケンサーでの多重標的増幅バイサルファイトシーケンシングメチル化アッセイを使用するキットであって、ここで、該ＣＧＩＤは、配列番号１乃至配列番号７９に記載されるもの及びそれらの組み合わせである、キット。
16. 配列番号３に記載のＣＧＩＤが、配列番号８８に記載のフォワードプライマー及び配列番号８９に記載のリバースプライマーを有する、請求項１６に記載の多重標的増幅バイサルファイトシーケンシングメチル化アッセイを使用するキット。
17. 配列番号３１に記載のＣＧＩＤが、配列番号９０に記載のフォワードプライマー及び配列番号９１に記載のリバースプライマーを有する、請求項１６に記載の多重標的増幅バイサルファイトシーケンシングメチル化アッセイを使用するキット。
18. 請求項７に記載のＣＧＩＤの組み合わせのＤＮＡメチル化レベルを測定することによりがんを検出するためのサンプルから抽出されたＤＮＡの質量分析ベース（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（登録商標））またはＰＣＲベースのメチル化アッセイを使用するキット。
19. 請求項７乃至９のいずれか一項に記載のＤＮＡメチル化ＣＧＩＤの組み合わせの測定値を使用することにより子宮頸がんを予測するメチル化スコアを計算するための多変数線形回帰方程式またはニューラルネットワーク分析の使用。
20. 請求項７乃至９のいずれか一項に記載のＤＮＡメチル化の組み合わせの測定値を使用することにより、子宮頸がんを非がん性子宮頸組織から区別する「メチル化スコア」閾値を定義するための受信者動作特性（ＲＯＣ）アッセイの使用。
21. 子宮頸がん診断の早期検出のための候補ＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得するためのコンピューター実装方法であって、多数の独立したゲノムＣＧ位置のゲノムワイドＤＮＡメチル化データ、ヒトゲノムのＣＧＩＤを提供すること；正規化によってゲノムワイドＤＮＡメチル化データを処理し、正規化されたＤＮＡメチル化ベータ値を導出すること；正規化されたＤＮＡメチル化ベータ値を用いて、前がんの進行ステージと非形質転換子宮頸細胞との間のスピアマン相関を計算すること；子宮頸がん診断の早期検出のための候補ＤＮＡメチル化バイオマーカーを取得するための進行性ＤＮＡメチル化変化の分析（ＡＰＤＭＡ）による候補ＣＧＩＤを取得すること、を含む、方法。

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