JP2024509851A - 子宮頸癌の検出 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、子宮頸癌スクリーニングのための技術が提供される。詳細には、本明細書では、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部組織）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）から、子宮頸癌、子宮頸部前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）、及び子宮頸癌サブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）の有無を検出するための、または子宮頚癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜、及び卵巣癌）から判別するための、方法、組成物、及び関連する使用が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月５日出願の米国仮特許出願第６３／１５７，４３７号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりその全容を本明細書に援用するものである。
本明細書では、子宮頸癌スクリーニングのための技術が提供される。詳細には、本明細書では、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部組織）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）から、子宮頸癌、子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）、及び子宮頸癌サブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）の有無を検出するための、または子宮頚癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜、及び卵巣癌）から判別するための、方法、組成物、及び関連する使用が提供される。
子宮頸癌（ＣＣ）スクリーニング方法は進化し続けており、子宮頸部異形成及びＣＣの存在に対して高感度である。しかしながら、現在の分子ベースの検査の特異性（すなわち、高リスクのＨＰＶのみ）は、腫瘍性形質転換を伴わずに消失する高リスクＨＰＶ感染の有病率を考慮すると限定的である。したがって、単一の生体試料から子宮頸癌を検出するための改良された診断ツールが与えられることが喫緊の課題となっている。
本発明は、この要請に応えるものである。
本明細書では、子宮頸癌スクリーニングのための技術、詳細には、これらに限定されるものではないが、子宮頸癌、子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）、及び子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）の有無を検出するための、ならびに子宮頸部癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜癌、及び卵巣癌）から判別するための方法、組成物、及び関連する使用を提供する。
実際、実施例Ｉ及びＩＩに記載されるように、本発明の実施形態を特定する過程で行われた実験によって、子宮頸部の癌及び前癌由来のＤＮＡを非腫瘍性のコントロールＤＮＡから、また、他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜癌、及び卵巣癌）から判別するための新規なメチル化可変領域（ＤＭＲ）群が特定された。
このような実験では、子宮頸癌（子宮頸癌のサブタイプ）及び前癌を良性の子宮頸部試料から判別する（表Ｉ～ＩＶ、ＶＩ～ＶＩＩＩ、実施例Ｉを参照）、また、子宮頸癌を他の種類の婦人科癌（子宮内膜癌、卵巣癌など）から判別する（表ＸＩ及びＸＩＩ、実施例ＩＩを参照）ための４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーを列挙して説明している。
これらの４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーから、さらなる実験により、子宮頸癌を良性の子宮頸部試料から判別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが特定された：
●表Ｉに記載されるマーカーのいずれか（実施例Ｉを参照）；
●表ＩＩＩに記載されるマーカーのいずれか（実施例Ｉを参照）；
●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５ （実施例Ｉ）；
●Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＺＮＦ７７３、ＮＥＵＲＯＧ３、ＡＳＣＬ１、ＮＩＤ２、ＺＮＦ７８１、ＣＲＨＲ２、及びＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８（表ＶＩ及び実施例Ｉを参照）；ならびに
●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８（表ＶＩＩＩ、実施例Ｉ）。
これらの４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーから、さらなる実験により、子宮頸部腺癌を良性の子宮頸部試料から判別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが特定された：
●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、Ｃ２ｏｒｆ４０、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、ＫＣＮＱ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＰＲＤＭ１２、ＳＬＣ９Ａ３、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉを参照）。
これらの４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーから、さらなる実験により、子宮頸部扁平上皮癌を良性の子宮頸部試料から判別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが特定された：
●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＡＴＰ１０Ａ、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉを参照）。
これらの４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーから、さらなる実験により、子宮頸部関連上皮内腺癌（ＡＩＳ）を良性の子宮頸部試料から判別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが特定された：
●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＣＲＨＲ２、及びＮＩＤ２ （表ＶＩ及び実施例Ｉを参照）；ならびに
●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、Ｃ２ｏｒｆ４０、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、ＫＣＮＱ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＰＲＤＭ１２、ＳＬＣ９Ａ３、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉを参照）。
これらの４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーから、さらなる実験により、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を良性の子宮頸部試料から判別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが特定された：
●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＣＲＨＲ２、及びＮＩＤ２ （表ＶＩ及び実施例Ｉを参照）；ならびに
●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＡＴＰ１０Ａ、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉを参照）。
これらの４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーから、さらなる実験により、子宮頸癌を子宮内膜癌及び／または卵巣癌から判別することができる以下のマーカー及び／またはマーカーのパネルが特定された：
●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８（表ＶＩＩＩ、実施例Ｉ）；
●表Ｘに記載されるマーカーのいずれか（実施例Ｉを参照）；ならびに
●ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１（表Ｘ及びＸＩ、実施例ＩＩを参照）。
本本明細書に記載されるように、本技術は、子宮頸癌、各種の子宮頸癌（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、各種の子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）の高い判別率を有し、子宮頸癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜癌及び卵巣癌）から判別するための多数のメチル化ＤＮＡマーカー（ＭＤＭ）及びそのサブセット（例えば、２、３、４、５、６、７、８、２０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、４２３個のマーカーのセット）を提供する。子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）は、子宮頸部上皮の厚さの約１／３を冒す異常細胞を指すＣＩＮ１、子宮頸部上皮の厚さの約２／３～２／３を冒す異常細胞を指すＣＩＮ２、及び子宮頸部上皮の２／３超を冒す異常な細胞を指すＣＩＮ３として特徴付けることができる。
特定の実施形態では、本開示は、生体試料を特徴付けるための方法であって、前記生体試料中の表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸから選択される１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することを含み、前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で前記生体試料由来のＤＮＡを処理することを含む、前記方法を提供する。
いくつかの実施形態では、生体試料はヒト由来である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、子宮頸癌、子宮頸癌サブタイプ、及び／または子宮頸癌前癌を有するかまたは有することが疑われる。
いくつかの実施形態では、生体試料は、組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、唾液試料、尿試料、及び便試料から選択される。いくつかの実施形態では、組織試料は、子宮頸部組織試料である。いくつかの実施形態では、子宮頸部組織試料は、膣組織、膣細胞、子宮内膜組織、子宮内膜細胞、卵巣組織、及び卵巣細胞のうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、分泌物試料は子宮頸部分泌物試料である。いくつかの実施形態では、子宮頸部分泌物試料は、膣分泌物、子宮内膜分泌物、及び卵巣分泌物のうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、身体領域と接触させられる際に生体試料を採取することができる吸収部材を有する採取装置で採取される。いくつかの実施形態では、吸収部材は、身体開口部に挿入するのに適した形状及びサイズを有するスポンジである。いくつかの実施形態では、採取装置はタンポン（例えば、標準的なタンポン）、膣内に液体を放出して液体を再回収する洗浄器（例えば、Ｐａｎｔａｒｈｅｉスクリーナー）、子宮頸部ブラシ（例えば、膣に挿入して回転させることで細胞を採取するブラシ）、フルニエ子宮頸部自己採取装置（タンポン状のプラスチック製の棒）、または綿棒である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーの測定されたメチル化レベルは、子宮頸癌のないコントロール試料中の対応する１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルと比較される。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のメチル化マーカーで測定されたメチル化レベルがそれぞれのコントロール試料中で測定されたメチル化レベルよりも高い場合に、個体が子宮頸癌を有すると判定することをさらに含む。方法が、個体が子宮頸癌を有すると判定することをさらに含むいくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーは、以下の群のうちの１つから選択される：
●表Ｉ及び／または表ＩＩＩに記載されるメチル化マーカー；
●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５ （実施例Ｉ）；
●Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＺＮＦ７７３、ＮＥＵＲＯＧ３、ＡＳＣＬ１、ＮＩＤ２、ＺＮＦ７８１、ＣＲＨＲ２、及びＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８（表ＶＩ及び実施例Ｉを参照）；ならびに
●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８（表ＶＩＩＩ、実施例Ｉ）。
いくつかの実施形態では、方法は、個体が子宮頸癌のサブタイプを有すると判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、子宮頸癌のサブタイプは、子宮頸部腺癌及び子宮頸部扁平上皮癌から選択される。方法が、個体が子宮頸癌のサブタイプを有すると判定することをさらに含むいくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーは、以下の群のうちの１つから選択される：
●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、Ｃ２ｏｒｆ４０、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、ＫＣＮＱ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＰＲＤＭ１２、ＳＬＣ９Ａ３、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉを参照）。
いくつかの実施形態では、方法は、個体が子宮頸癌前癌を有すると判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、子宮頸癌前癌は、子宮頸部関連上皮内腺癌及び子宮頸部上皮内腫瘍から選択される。方法が、個体が子宮頸癌前癌を有すると判定することをさらに含むいくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーは、以下の群のうちの１つから選択される：
●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＣＲＨＲ２、及びＮＩＤ２（表ＶＩ及び実施例Ｉを参照）；ならびに
●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、Ｃ２ｏｒｆ４０、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、ＫＣＮＱ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＰＲＤＭ１２、ＳＬＣ９Ａ３、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉを参照）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーの測定されたメチル化レベルは、子宮内膜癌試料及び卵巣癌試料中の対応する１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルと比較される。いくつかの実施形態では、方法は、子宮頸癌を子宮内膜癌及び／または卵巣癌から判別することをさらに含む。方法が、子宮内膜癌及び／または卵巣癌から子宮頸癌を判別することをさらに含むいくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーは、以下の群のうちの１つから選択される：
●表Ｘに記載されるマーカー；
●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８（表ＶＩＩＩ、実施例Ｉ）；ならびに
●ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１（表Ｘ及びＸＩ、実施例ＩＩを参照）。
いくつかの実施形態では、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬は、ボラン還元剤である。いくつかの実施形態では、ボラン還元剤は２－ピコリンボランである。いくつかの実施形態では、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬は、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬は、亜硫酸水素塩試薬であり、前記処理することは、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡを生成する。
いくつかの実施形態では、処理されたＤＮＡは、１つ以上のマーカーに対して特異的なプライマーのセットを使用して増幅される。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的なプライマーのセットは、表Ｖ及びＸＩＩに記載される群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的なプライマーのセットは、表Ｖ及びＸＩＩに記載される特定のメチル化マーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンに結合することができ、表Ｖ及びＸＩＩに記載されるメチル化マーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載されるメチル化マーカーの遺伝子領域の少なくとも一部である。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的なプライマーのセットは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載されるメチル化マーカーの染色体座標を含む遺伝子領域の少なくとも一部に特異的に結合するプライマーのセットである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、マルチプレックス増幅を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシークエンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及び亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、１つ以上のメチル化マーカーのＣｐＧ部位のメチル化を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位はコード領域または調節領域に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるゲノム座標によって記述される。
特定の実施形態では、本開示は、１つ以上の染色体異常に関与する１つ以上の遺伝子座を分析するうえで有用な生体試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）画分を調製するための方法であって、
（ａ）生体試料からゲノムＤＮＡを抽出することと、
（ｂ）
（ｉ）前記抽出されたゲノムＤＮＡを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で処理することと、
（ｉｉ）前記処理されたゲノムＤＮＡを、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載される１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な別々のプライマーを使用して増幅することと、
によって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの画分を生成することと、
（ｃ）前記１つ以上のメチル化マーカーのそれぞれについてメチル化レベルを測定することによって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの前記生成された画分中の１つ以上の遺伝子座を分析することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬は、ボラン還元剤である。いくつかの実施形態では、ボラン還元剤は２－ピコリンボランである。いくつかの実施形態では、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬は、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬は、亜硫酸水素塩試薬であり、前記処理することは、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡを生成する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的なプライマーのセットは、表Ｖ及びＸＩＩに記載される群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的なプライマーのセットは、表Ｖ及びＸＩＩに記載される特定のメチル化マーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンに結合することができ、表Ｖ及びＸＩＩに記載されるメチル化マーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載されるメチル化マーカーの遺伝子領域の少なくとも一部である。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的なプライマーのセットは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載されるメチル化マーカーの染色体座標を含む遺伝子領域の少なくとも一部に特異的に結合するプライマーのセットである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、マルチプレックス増幅を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシークエンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及び亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、１つ以上のメチル化マーカーのＣｐＧ部位のメチル化を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位はコード領域または調節領域に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるゲノム座標によって記述される。
いくつかの実施形態では、生体試料は、組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、唾液試料、尿試料、及び便試料から選択される。いくつかの実施形態では、組織試料は、子宮頸部組織試料である。いくつかの実施形態では、子宮頸部組織試料は、膣組織、膣細胞、子宮内膜組織、子宮内膜細胞、卵巣組織、及び卵巣細胞のうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、分泌物試料は子宮頸部分泌物試料である。いくつかの実施形態では、子宮頸部分泌物試料は、膣分泌物、子宮内膜分泌物、及び卵巣分泌物のうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、身体領域と接触させられる際に組織及び／または細胞を採取することができる吸収部材を有する採取装置で採取される。いくつかの実施形態では、吸収部材は、身体開口部に挿入するのに適した形状及びサイズを有するスポンジである。いくつかの実施形態では、採取装置はタンポン（例えば、標準的なタンポン）、膣内に液体を放出して液体を再回収する洗浄器（例えば、Ｐａｎｔａｒｈｅｉスクリーナー）、子宮頸部ブラシ（例えば、女性が膣に挿入して回転させることで細胞を採取するブラシ）、フルニエ子宮頸部自己採取装置（タンポン状のプラスチック製の棒）、または綿棒である。
いくつかの実施形態では、生体試料はヒト由来である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、子宮頸癌、子宮頸癌サブタイプ、及び／または子宮頸癌前癌を有するかまたは有することが疑われる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカーは、以下の群のうちの１つから選択される：
●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５（実施例Ｉ）；
●Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＺＮＦ７７３、ＮＥＵＲＯＧ３、ＡＳＣＬ１、ＮＩＤ２、ＺＮＦ７８１、ＣＲＨＲ２、及びＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８（表ＶＩ及び実施例Ｉを参照）；
●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、Ｃ２ｏｒｆ４０、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、ＫＣＮＱ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＰＲＤＭ１２、ＳＬＣ９Ａ３、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉを参照）；
●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８（表ＶＩＩＩ、実施例Ｉ）；ならびに
●ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１（表Ｘ及びＸＩ、実施例ＩＩを参照）。
特定の実施形態では、本技術は、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の本明細書に記載されるＭＤＭのうちの１つ以上の存在及びメチル化状態を評価することに関する。これらのＭＤＭは、例えば表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示される、本明細書で検討される１つ以上のメチル化可変領域（ＤＭＲ）を含む。メチル化状態は本技術の実施形態で評価される。したがって、本明細書で提供される技術は、遺伝子のメチル化状態を測定する方法において制限されず、したがって、遺伝子のメチル化状態は当該技術分野では周知のいずれの方法によって測定することもできる。
本明細書では、これらの方法を実施するための組成物及びキットも提供される。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＤＭに愛して特異的な試薬（例えば、プライマー、プローブ）が、単独で、またはセット（例えば、複数のマーカーを増幅するためのプライマーペアのセット）で提供される。検出アッセイを行うための追加の試薬も提供され得る（例えば、ＱｕＡＲＴＳ、ＰＣＲ、配列決定を行うための酵素、バッファー、ポジティブ及びネガティブコントロール、亜硫酸水素塩、テン－イレブン転座（ＴＥＴ）酵素（例えば、ヒトＴＥＴ１、ヒトＴＥＴ２、ヒトＴＥＴ３、マウスＴＥＴ１、マウスＴＥＴ２、マウスＴＥＴ３、ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、コプリノプシス・シネレア（ＣｃＴＥＴ））、またはこれらのバリアント）、有機ボラン、または他のアッセイ）。いくつかの実施形態では、キットは、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬）（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、テン－イレブン転座（ＴＥＴ）酵素 （例えば、ヒトＴＥＴ１、ヒトＴＥＴ２、ヒトＴＥＴ３、マウスＴＥＴ１、マウスＴＥＴ２、マウスＴＥＴ３、ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、コプリノプシス・シネレア（ＣｃＴＥＴ））、またはそれらのバリアント）、有機ボラン）を含む。いくつかの実施形態では、方法を実施するために必要な、十分な、または有用な１つ以上の試薬を含むキットが提供される。これらの試薬を含む反応混合物も提供される。互いに、及び／または試験試料に加えられて反応混合物を完成させることができる、複数の試薬を含むマスターミックス試薬セットもさらに提供される。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＭＲ１～４２３（表Ｉ、ＩＩＩＩ、及びＸから）の１つ以上の配列を含み、子宮頸癌、子宮頸癌サブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）を有する対象に関連したメチル化状態を有するコントロール核酸を含む。いくつかの実施形態では、キットは、対象から試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、及び便試料）を得るための試料採取器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。
定義
本技術の理解を促進するために、いくつかの用語及び語句が以下に定義される。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて、以下の用語は、文脈によってそうでない旨が明確に示されない限り、本明細書において明示的に関連する意味を有する。「一実施形態において」という語句は、本明細書で使用される場合、同じ実施形態を指す場合もあるが、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、本明細書に使用されるような語句「別の実施形態において」は、必ずしも異なる実施形態を指さないが、そうである場合もある。したがって、下記のように、本発明のさまざまな実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わされることができる。
加えて、本明細書で使用されるように、文脈によってそうでない旨が明確に示されない限り、「または」という用語は、包括的な「または」の演算詞であり、「及び／または」という用語と同等である。「に基づく」という用語は、文脈により別途明確に指示されない限り、排他的なものではなく、記載されていない追加の因子に基づくことを可能にする。さらに、本明細書全体にわたって、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味には、複数の言及物が含まれる。「中に（ｉｎ）」の意味には、「中に（ｉｎ）」及び「上に（ｏｎ）」が含まれる。
「から本質的になる」という移行句は、本出願の特許請求の範囲において使用する場合、Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１９０ ＵＳＰＱ ４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）に述べられているように、特許請求の範囲を、特許請求された発明の特定の物質またはステップ「及び基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼすことのないもの」に限定する。例えば、列挙された要素「から本質的になる」組成物は、列挙されていない混入物を、純粋な組成物、すなわち列挙された成分「からなる」組成物と比較した場合に、存在はするが、列挙された組成物の機能を変化させないようなレベルで含有する場合がある。
本明細書で使用される「１つ以上」という用語は、１より大きい数を指す。例えば、「１つ以上」という用語は、以下のいずれかを包含する：２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、又はより多く、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、５０以上、１００以上、またはそれ以上の数。
「１以上であるがより大きな数未満」、「２以上であるがより大きな数未満」、「３以上であるがより大きな数未満」、「４以上であるがより大きな数未満」、「５以上であるがより大きな数未満」、「６以上であるがより大きな数未満」、「７以上であるがより大きな数未満」、「８以上であるがより大きな数未満」、「９以上であるがより大きな数未満」、「１０以上であるがより大きな数未満」、「１１以上であるがより大きな数未満」、「１２以上であるがより大きな数未満」、「１３以上であるがより大きな数未満」、「１４以上であるがより大きな数未満」、または「１５以上であるがより大きな数未満」は、あるより大きな数に限定されない。例えば、より大きな数は １０，０００、１，０００、１００、５０などであってよい。例えば、より大きな数は約６４であってよい（例えば、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５） 、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３２ 、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６ 、５、４、３、または２）。例えば、より大きな数は約４２３であってよい。
用語「１つ以上のメチル化マーカー」または「１つ以上のＤＭＲ」または「１つ以上の遺伝子」または「１つ以上のマーカー」または「複数のメチル化マーカー」または「複数のマーカー」または「複数の遺伝子」または「複数のＤＭＲ」も同様に、特定の数の組み合わせに限定されない。実際、メチル化マーカーの任意の数の組み合わせが想到される（例えば、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２、１～１３、１～１４、１～１５、１～１６、１～１７、１～１８、１～１９、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～２６、１～２７、１～２８、１～２９、１～３０、１～３１、１～３２、１～３３、１～３４、１～３５、１～３６、１～３７、１～３８、１～３９、１～４０、１～４１、１～４２、１～４３、１～４４、１～４５、１～４６、１～４７、１～４８、１～４９、１～５０、１～５１、１～５２、１～５３、１～５４、１～５５、１～５６、１～５７、１～５８、１～５９、１～６０、１～６１、１～６２、１～６３、１～６４個のメチル化マーカー）（例えば、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１１、２～１２、２～１３、２～１４、２～１５、２～１６、２～１７、２～１８、２～１９、２～２０、２～２１、２～２２、２～２３、２～２４、２～２５、２～２６、２～２７、２～２８、２～２９、２～３０、２～３１、２～３２、２～３３、２～３４、２～３５、２～３６、２～３７、２～３８、２～３９、２～４０、２～４１、２～４２、２～４３、２～４４、２～４５、２～４６、２～４７、２～４８、２～４９、２～５０、２～５１、２～５２、２～５３、２～５４、２～５５、２～５６、２～５７、２～５８、２～５９、２～６０、２～６１、２～６２、２～６３、２～６４）（例えば、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１１、３～１２、３～１３、３～１４、３～１５、３～１６、３～１７、３～１８、３～１９、３～２０、３～２１、３～２２、３～２３、３～２４、３～２５、３～２６、３～２７、３～２８、３～２９、３～３０、３～３１、３～３２、３～３３、３～３４、３～３５、３～３６、３～３７、３～３８、３～３９、３～４０、３～４１、３～４２、３～４３、３～４４、３～４５、３～４６、３～４７、３～４８、３～４９、３～５０、３～５１、３～５２、３～５３、３～５４、３～５５、３～５６、３～５７、３～５８、３～５９、３～６０、３～６１、３～６２、３～６３、３～６４）（例えば、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、４～１１、４～１２、４～１３、４～１４、４～１５、４～１６、４～１７、４～１８、４～１９、４～２０、４～２１、４～２２、４～２３、４～２４、４～２５、４～２６、４～２７、４～２８、４～２９、４～３０、４～３１、４～３２、４～３３、４～３４、４～３５、４～３６、４～３７、４～３８、４～３９、４～４０、４～４１、４～４２、４～４３、４～４４、４～４５、４～４６、４～４７、４～４８、４～４９、４～５０、４～５１、４～５２、４～５３、４～５４、４～５５、４～５６、４～５７、４～５８、４～５９、４～６０、４～６１、４～６２、４～６３、４～６４）（例えば、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１１、５～１２、５～１３、５～１４、５～１５、５～１６、５～１７、５～１８、５～１９、５～２０、５～２１、５～２２、５～２３、５～２４、５～２５、５～２６、５～２７、５～２８、５～２９、５～３０、５～３１、５～３２、５～３３、５～３４、５～３５、５～３６、５～３７、５～３８、５～３９、５～４０、５～４１、５～４２、５～４３、５～４４、５～４５、５～４６、５～４７、５～４８、５～４９、５～５０、５～５１、５～５２、５～５３、５～５４、５～５５、５～５６、５～５７、５～５８、５～５９、５～６０、５～６１、５～６２、５～６３、５～６４）（例えば、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１１、６～１２、６～１３、６～１４、６～１５、６～１６、６～１７、６～１８、６～１９、６～２０、６～２１、６～２２、６～２３、６～２４、６～２５、６～２６、６～２７、６～２８、６～２９、６～３０、６～３１、６～３２、６～３３、６～３４、６～３５、６～３６、６～３７、６～３８、６～３９、６～４０、６～４１、６～４２、６～４３、６～４４、６～４５、６～４６、６～４７、６～４８、６～４９、６～５０、６～５１、６～５２、６～５３、６～５４、６～５５、６～５６、６～５７、６～５８、６～５９、６～６０、６～６１、６～６２、６～６３、６～６４）（例えば、７～８、７～９、７～１０、７～１１、７～１２、７～１３、７～１４、７～１５、７～１６、７～１７、７～１８、７～１９、７～２０、７～２１、７～２２、７～２３、７～２４、７～２５、７～２６、７～２７、７～２８、７～２９、７～３０、７～３１、７～３２、７～３３、７～３４、７～３５、７～３６、７～３７、７～３８、７～３９、７～４０、７～４１、７～４２、７～４３、７～４４、７～４５、７～４６、７～４７、７～４８、７～４９、７～５０、７～５１、７～５２、７～５３、７～５４、７～５５、７～５６、７～５７、７～５８、７～５９、７～６０、７～６１、７～６２、７～６３、７～６４）（例えば、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、８～１３、８～１４、８～１５、８～１６、８～１７、８～１８、８～１９、８～２０、８～２１、８～２２、８～２３、８～２４、８～２５、８～２６、８～２７、８～２８、８～２９、８～３０、８～３１、８～３２、８～３３、８～３４、８～３５、８～３６、８～３７、８～３８、８～３９、８～４０、８～４１、８～４２、８～４３、８～４４、８～４５、８～４６、８～４７、８～４８、８～４９、８～５０、８～５１、８～５２、８～５３、８～５４、８～５５、８～５６、８～５７、８～５８、８～５９、８～６０、８～６１、８～６２、８～６３、８～６４）（例えば、９～１０、９～１１、９～１２、９～１３、９～１４、９～１５、９～１６、９～１７、９～１８、９～１９、９～２０、９～２１、９～２２、９～２３、９～２４、９～２５、９～２６、９～２７、９～２８、９～２９、９～３０、９～３１、９～３２、９～３３、９～３４、９～３５、９～３６、９～３７、９～３８、９～３９、９～４０、９～４１、９～４２、９～４３、９～４４、９～４５、９～４６、９～４７、９～４８、９～４９、９～５０、９～５１、９～５２、９～５３、９～５４、９～５５、９～５６、９～５７、９～５８、９～５９、９～６０、９～６１、９～６２、９～６３、９～６４）（例えば、１０～１１、１０～１２、１０～１３、１０～１４、１０～１５、１０～１６、１０～１７、１０～１８、１０～１９、１０～２０、１０～２１、１０～２２、１０～２３、１０～２４、１０～２５、１０～２６、１０～２７、１０～２８、１０～２９、１０～３０、１０～３１、１０～３２、１０～３３、１０～３４、１０～３５、１０～３６、１０～３７、１０～３８、１０～３９、１０～４０、１０～４１、１０～４２、１０～４３、１０～４４、１０～４５、１０～４６、１０～４７、１０～４８、１０～４９、１０～５０、１０～５１、１０～５２、１０～５３、１０～５４、１０～５５、１０～５６、１０～５７、１０～５８、１０～５９、１０～６０、１０～６１、１０～６２、１０～６３、１０～６４）（例えば、１１～１２、１１～１３、１１～１４、１１～１５、１１～１６、１１～１７、１１～１８、１１～１９、１１～２０、１１～２１、１１～２２、１１～２３、１１～２４、１１～２５、１１～２６、１１～２７、１１～２８、１１～２９、１１～３０、１１～３１、１１～３２、１１～３３、１１～３４、１１～３５、１１～３６、１１～３７、１１～３８、１１～３９、１１～４０、１１～４１、１１～４２、１１～４３、１１～４４、１１～４５、１１～４６、１１～４７、１１～４８、１１～４９、１１～５０、１１～５１、１１～５２、１１～５３、１１～５４、１１～５５、１１～５６、１１～５７、１１～５８、１１～５９、１１～６０、１１～６１、１１～６２、１１～６３、１１～６４）（例えば、１２～１３、１２～１４、１２～１５、１２～１６、１２～１７、１２～１８、１２～１９、１２～２０、１２～２１、１２～２２、１２～２３、１２～２４、１２～２５、１２～２６、１２～２７、１２～２８、１２～２９、１２～３０、１２～３１、１２～３２、１２～３３、１２～３４、１２～３５、１２～３６、１２～３７、１２～３８、１２～３９、１２～４０、１２～４１、１２～４２、１２～４３、１２～４４、１２～４５、１２～４６、１２～４７、１２～４８、１２～４９、１２～５０、１２～５１、１２～５２、１２～５３、１２～５４、１２～５５、１２～５６、１２～５７、１２～５８、１２～５９、１２～６０、１２～６１、１２～６２、１２～６３、１２～６４）（例えば、１３～１４、１３～１５、１３～１６、１３～１７、１３～１８、１３～１９、１３～２０、１３～２１、１３～２２、１３～２３、１３～２４、１３～２５、１３～２６、１３～２７、１３～２８、１３～２９、１３～３０、１３～３１、１３～３２、１３～３３、１３～３４、１３～３５、１３～３６、１３～３７、１３～３８、１３～３９、１３～４０、１３～４１、１３～４２、１３～４３、１３～４４、１３～４５、１３～４６、１３～４７、１３～４８、１３～４９、１３～５０、１３～５１、１３～５２、１３～５３、１３～５４、１３～５５、１３～５６、１３～５７、１３～５８、１３～５９、１３～６０、１３～６１、１３～６２、１３～６３、１３～６４）（例えば、１４～１５、１４～１６、１４～１７、１４～１８、１４～１９、１４～２０、１４～２１、１４～２２、１４～２３、１４～２４、１４～２５、１４～２６、１４～２７、１４～２８、１４～２９、１４～３０、１４～３１、１４～３２、１４～３３、１４～３４、１４～３５、１４～３６、１４～３７、１４～３８、１４～３９、１４～４０、１４～４１、１４～４２、１４～４３、１４～４４、１４～４５、１４～４６、１４～４７、１４～４８、１４～４９、１４～５０、１４～５１、１４～５２、１４～５３、１４～５４、１４～５５、１４～５６、１４～５７、１４～５８、１４～５９、１４～６０、１４～６１、１４～６２、１４～６３、１４～６４）（例えば、１５～１６、１５～１７、１５～１８、１５～１９、１５～２０、１５～２１、１５～２２、１５～２３、１５～２４、１５～２５、１５～２６、１５～２７、１５～２８、１５～２９、１５～３０、１５～３１、１５～３２、１５～３３、１５～３４、１５～３５、１５～３６、１５～３７、１５～３８、１５～３９、１５～４０、１５～４１、１５～４２、１５～４３、１５～４４、１５～４５、１５～４６、１５～４７、１５～４８、１５～４９、１５～５０、１５～５１、１５～５２、１５～５３、１５～５４、１５～５５、１５～５６、１５～５７、１５～５８、１５～５９、１５～６０、１５～６１、１５～６２、１５～６３、１５～６４）（例えば、１６～１７、１６～１８、１６～１９、１６～２０、１６～２１、１６～２２、１６～２３、１６～２４、１６～２５、１６～２６、１６～２７、１６～２８、１６～２９、１６～３０、１６～３１、１６～３２、１６～３３、１６～３４、１６～３５、１６～３６、１６～３７、１６～３８、１６～３９、１６～４０、１６～４１、１６～４２、１６～４３、１６～４４、１６～４５、１６～４６、１６～４７、１６～４８、１６～４９、１６～５０、１６～５１、１６～５２、１６～５３、１６～５４、１６～５５、１６～５６、１６～５７、１６～５８、１６～５９、１６～６０、１６～６１、１６～６２、１６～６３、１６～６４）（例えば、１７～１８、１７～１９、１７～２０、１７～２１、１７～２２、１７～２３、１７～２４、１７～２５、１７～２６、１７～２７、１７～２８、１７～２９、１７～３０、１７～３１、１７～３２、１７～３３、１７～３４、１７～３


５、１７～３６、１７～３７、１７～３８、１７～３９、１７～４０、１７～４１、１７～４２、１７～４３、１７～４４、１７～４５、１７～４６、１７～４７、１７～４８、１７～４９、１７～５０、１７～５１、１７～５２、１７～５３、１７～５４、１７～５５、１７～５６、１７～５７、１７～５８、１７～５９、１７～６０、１７～６１、１７～６２、１７～６３、１７～６４）（例えば、１８～１９、１８～２０、１８～２１、１８～２２、１８～２３、１８～２４、１８～２５、１８～２６、１８～２７、１８～２８、１８～２９、１８～３０、１８～３１、１８～３２、１８～３３、１８～３４、１８～３５、１８～３６、１８～３７、１８～３８、１８～３９、１８～４０、１８～４１、１８～４２、１８～４３、１８～４４、１８～４５、１８～４６、１８～４７、１８～４８、１８～４９、１８～５０、１８～５１、１８～５２、１８～５３、１８～５４、１８～５５、１８～５６、１８～５７、１８～５８、１８～５９、１８～６０、１８～６１、１８～６２、１８～６３、１８～６４）（例えば、１９～２０、１９～２１、１９～２２、１９～２３、１９～２４、１９～２５、１９～２６、１９～２７、１９～２８、１９～２９、１９～３０、１９～３１、１９～３２、１９～３３、１９～３４、１９～３５、１９～３６、１９～３７、１９～３８、１９～３９、１９～４０、１９～４１、１９～４２、１９～４３、１９～４４、１９～４５、１９～４６、１９～４７、１９～４８、１９～４９、１９～５０、１９～５１、１９～５２、１９～５３、１９～５４、１９～５５、１９～５６、１９～５７、１９～５８、１９～５９、１９～６０、１９～６１、１９～６２、１９～６３、１９～６４）（例えば、２０～２１、２０～２２、２０～２３、２０～２４、２０～２５、２０～２６、２０～２７、２０～２８、２０～２９、２０～３０、２０～３１、２０～３２、２０～３３、２０～３４、２０～３５、２０～３６、２０～３７、２０～３８、２０～３９、２０～４０、２０～４１、２０～４２、２０～４３、２０～４４、２０～４５、２０～４６、２０～４７、２０～４８、２０～４９、２０～５０、２０～５１、２０～５２、２０～５３、２０～５４、２０～５５、２０～５６、２０～５７、２０～５８、２０～５９、２０～６０、２０～６１、２０～６２、２０～６３、２０～６４）（例えば、２１～２２、２１～２３、２１～２４、２１～２５、２１～２６、２１～２７、２１～２８、２１～２９、２１～３０、２１～３１、２１～３２、２１～３３、２１～３４、２１～３５、２１～３６、２１～３７、２１～３８、２１～３９、２１～４０、２１～４１、２１～４２、２１～４３、２１～４４、２１～４５、２１～４６、２１～４７、２１～４８、２１～４９、２１～５０、２１～５１、２１～５２、２１～５３、２１～５４、２１～５５、２１～５６、２１～５７、２１～５８、２１～５９、２１～６０、２１～６１、２１～６２、２１～６３、２１～６４）（例えば、２２～２３、２２～２４、２２～２５、２２～２６、２２～２７、２２～２８、２２～２９、２２～３０、２２～３１、２２～３２、２２～３３、２２～３４、２２～３５、２２～３６、２２～３７、２２～３８、２２～３９、２２～４０、２２～４１、２２～４２、２２～４３、２２～４４、２２～４５、２２～４６、２２～４７、２２～４８、２２～４９、２２～５０、２２～５１、２２～５２、２２～５３、２２～５４、２２～５５、２２～５６、２２～５７、２２～５８、２２～５９、２２～６０、２２～６１、２２～６２、２２～６３、２２～６４）（例えば、２３～２４、２３～２５、２３～２６、２３～２７、２３～２８、２３～２９、２３～３０、２３～３１、２３～３２、２３～３３、２３～３４、２３～３５、２３～３６、２３～３７、２３～３８、２３～３９、２３～４０、２３～４１、２３～４２、２３～４３、２３～４４、２３～４５、２３～４６、２３～４７、２３～４８、２３～４９、２３～５０、２３～５１、２３～５２、２３～５３、２３～５４、２３～５５、２３～５６、２３～５７、２３～５８、２３～５９、２３～６０、２３～６１、２３～６２、２３～６３、２３～６４）（例えば、２４～２５、２４～２６、２４～２７、２４～２８、２４～２９、２４～３０、２４～３１、２４～３２、２４～３３、２４～３４、２４～３５、２４～３６、２４～３７、２４～３８、２４～３９、２４～４０、２４～４１、２４～４２、２４～４３、２４～４４、２４～４５、２４～４６、２４～４７、２４～４８、２４～４９、２４～５０、２４～５１、２４～５２、２４～５３、２４～５４、２４～５５、２４～５６、２４～５７、２４～５８、２４～５９、２４～６０、２４～６１、２４～６２、２４～６３、２４～６４）（例えば、２５～２６、２５～２７、２５～２８、２５～２９、２５～３０、２５～３１、２５～３２、２５～３３、２５～３４、２５～３５、２５～３６、２５～３７、２５～３８、２５～３９、２５～４０、２５～４１、２５～４２、２５～４３、２５～４４、２５～４５、２５～４６、２５～４７、２５～４８、２５～４９、２５～５０、２５～５１、２５～５２、２５～５３、２５～５４、２５～５５、２５～５６、２５～５７、２５～５８、２５～５９、２５～６０、２５～６１、２５～６２、２５～６３、２５～６４）（例えば、２６～２７、２６～２８、２６～２９、２６～３０、２６～３１、２６～３２、２６～３３、２６～３４、２６～３５、２６～３６、２６～３７、２６～３８、２６～３９、２６～４０、２６～４１、２６～４２、２６～４３、２６～４４、２６～４５、２６～４６、２６～４７、２６～４８、２６～４９、２６～５０、２６～５１、２６～５２、２６～５３、２６～５４、２６～５５、２６～５６、２６～５７、２６～５８、２６～５９、２６～６０、２６～６１、２６～６２、２６～６３、２６～６４）（例えば、２７～２８、２７～２９、２７～３０、２７～３１、２７～３２、２７～３３、２７～３４、２７～３５、２７～３６、２７～３７、２７～３８、２７～３９、２７～４０、２７～４１、２７～４２、２７～４３、２７～４４、２７～４５、２７～４６、２７～４７、２７～４８、２７～４９、２７～５０、２７～５１、２７～５２、２７～５３、２７～５４、２７～５５、２７～５６、２７～５７、２７～５８、２７～５９、２７～６０、２７～６１、２７～６２、２７～６３、２７～６４）（例えば、２８～２９、２８～３０、２８～３１、２８～３２、２８～３３、２８～３４、２８～３５、２８～３６、２８～３７、２８～３８、２８～３９、２８～４０、２８～４１、２８～４２、２８～４３、２８～４４、２８～４５、２８～４６、２８～４７、２８～４８、２８～４９、２８～５０、２８～５１、２８～５２、２８～５３、２８～５４、２８～５５、２８～５６、２８～５７、２８～５８、２８～５９、２８～６０、２８～６１、２８～６２、２８～６３、２８～６４）（例えば、２９～３０、２９～３１、２９～３２、２９～３３、２９～３４、２９～３５、２９～３６、２９～３７、２９～３８、２９～３９、２９～４０、２９～４１、２９～４２、２９～４３、２９～４４、２９～４５、２９～４６、２９～４７、２９～４８、２９～４９、２９～５０、２９～５１、２９～５２、２９～５３、２９～５４、２９～５５、２９～５６、２９～５７、２９～５８、２９～５９、２９～６０、２９～６１、２９～６２、２９～６３、２９～６４）（例えば、３０～３１、３０～３２、３０～３３、３０～３４、３０～３５、３０～３６、３０～３７、３０～３８、３０～３９、３０～４０、３０～４１、３０～４２、３０～４３、３０～４４、３０～４５、３０～４６、３０～４７、３０～４８、３０～４９、３０～５０、３０～５１、３０～５２、３０～５３、３０～５４、３０～５５、３０～５６、３０～５７、３０～５８、３０～５９、３０～６０、３０～６１、３０～６２、３０～６３、３０～６４）（例えば、３１～３２、３１～３３、３１～３４、３１～３５、３１～３６、３１～３７、３１～３８、３１～３９、３１～４０、３１～４１、３１～４２、３１～４３、３１～４４、３１～４５、３１～４６、３１～４７、３１～４８、３１～４９、３１～５０、３１～５１、３１～５２、３１～５３、３１～５４、３１～５５、３１～５６、３１～５７、３１～５８、３１～５９、３１～６０、３１～６１、３１～６２、３１～６３、３１～６４）（例えば、３２～３３、３２～３４、３２～３５、３２～３６、３２～３７、３２～３８、３２～３９、３２～４０、３２～４１、３２～４２、３２～４３、３２～４４、３２～４５、３２～４６、３２～４７、３２～４８、３２～４９、３２～５０、３２～５１、３２～５２、３２～５３、３２～５４、３２～５５、３２～５６、３２～５７、３２～５８、３２～５９、３２～６０、３２～６１、３２～６２、３２～６３、３２～６４）（例えば、３３～３４、３３～３５、３３～３６、３３～３７、３３～３８、３３～３９、３３～４０、３３～４１、３３～４２、３３～４３、３３～４４、３３～４５、３３～４６、３３～４７、３３～４８、３３～４９、３３～５０、３３～５１、３３～５２、３３～５３、３３～５４、３３～５５、３３～５６、３３～５７、３３～５８、３３～５９、３３～６０、３３～６１、３３～６２、３３～６３、３３～６４）（例えば、３４～３５、３４～３６、３４～３７、３４～３８、３４～３９、３４～４０、３４～４１、３４～４２、３４～４３、３４～４４、３４～４５、３４～４６、３４～４７、３４～４８、３４～４９、３４～５０、３４～５１、３４～５２、３４～５３、３４～５４、３４～５５、３４～５６、３４～５７、３４～５８、３４～５９、３４～６０、３４～６１、３４～６２、３４～６３、３４～６４）（例えば、３５～３６、３５～３７、３５～３８、３５～３９、３５～４０、３５～４１、３５～４２、３５～４３、３５～４４、３５～４５、３５～４６、３５～４７、３５～４８、３５～４９、３５～５０、３５～５１、３５～５２、３５～５３、３５～５４、３５～５５、３５～５６、３５～５７、３５～５８、３５～５９、３５～６０、３５～６１、３５～６２、３５～６３、３５～６４）（例えば、３６～３７、３６～３８、３６～３９、３６～４０、３６～４１、３６～４２、３６～４３、３６～４４、３６～４５、３６～４６、３６～４７、３６～４８、３６～４９、３６～５０、３６～５１、３６～５２、３６～５３、３６～５４、３６～５５、３６～５６、３６～５７、３６～５８、３６～５９、３６～６０、３６～６１、３６～６２、３６～６３、３６～６４）（例えば、３７～３８、３７～３９、３７～４０、３７～４１、３７～４２、３７～４３、３７～４４、３７～４５、３７～４６、３７～４７、３７～４８、３７～４９、３７～５０、３７～５１、３７～５２、３７～５３、３７～５４、３７～５５、３７～５６、３７～５７、３７～５８、３７～５９、３７～６０、３７～６１、３７～６２、３７～６３、３７～６４）（例えば、３８～３９、３８～４０、３８～４１、３８～４２、３８～４３、３８～４４、３８～４５、３８～４６、３８～４７、３８～４８、３８～４９、３８～５０、３８～５１、３８～５２、３８～５３、３８～５４、３８～５５、３８～５６、３８～５７、３８～５８、３８～５９、３８～６０、３８～６１、３８～６２、３８～６３、３８～６４）、（例えば、３９～４０、３９～４１、３９～４２、３９～４３、３９～４４、３９～４５、３９～４６、３９～４７、３９～４８、３９～４９、３９～５０、３９～５１、３９～５２、３９～５３、３９～５４、３９～５５、３９～５６、３９～５７、３９～５８、３９～５９、３９～６０、３９～６１、３９～６２、３９～６３、３９～６４）、（例えば、４０～４１、４０～４２、４０～４３、４０～４４、４０～４５、４０～４６、４０～４７、４０～４８、４０～４９、４０～５０、４０～５１、４０～５２、４０～５３、４０～５４、４０～５５、４０～５６、４０～５７、４０～５８、４０～５９、４０～６０、４０～６１、４０～６２、４０～６３、４０～６


４）、（例えば、４１～４２、４１～４３、４１～４４、４１～４５、４１～４６、４１～４７、４１～４８、４１～４９、４１～５０、４１～５１、４１～５２、４１～５３、４１～５４、４１～５５、４１～５６、４１～５７、４１～５８、４１～５９、４１～６０、４１～６１、４１～６２、４１～６３、４１～６４）、（例えば、４２～４３、４２～４４、４２～４５、４２～４６、４２～４７、４２～４８、４２～４９、４２～５０、４２～５１、４２～５２、４２～５３、４２～５４、４２～５５、４２～５６、４２～５７、４２～５８、４２～５９、４２～６０、４２～６１、４２～６２、４２～６３、４２～６４）（例えば、４３～４４、４３～４５、４３～４６、４３～４７、４３～４８、４３～４９、４３～５０、４３～５１、４３～５２、４３～５３、４３～５４、４３～５５、４３～５６、４３～５７、４３～５８、４３～５９、４３～６０、４３～６１、４３～６２、４３～６３、４３～６４）（例えば、４４～４５、４４～４６、４４～４７、４４～４８、４４～４９、４４～５０、４４～５１、４４～５２、４４～５３、４４～５４、４４～５５、４４～５６、４４～５７、４４～５８、４４～５９、４４～６０、４４～６１、４４～６２、４４～６３、４４～６４）（例えば、４５～４６、４５～４７、４５～４８、４５～４９、４５～５０、４５～５１、４５～５２、４５～５３、４５～５４、４５～５５、４５～５６、４５～５７、４５～５８、４５～５９、４５～６０、４５～６１、４５～６２、４５～６３、４５～６４）（例えば、４６～４７、４６～４８、４６～４９、４６～５０、４６～５１、４６～５２、４６～５３、４６～５４、４６～５５、４６～５６、４６～５７、４６～５８、４６～５９、４６～６０、４６～６１、４６～６２、４６～６３、４６～６４）（例えば、４７～４８、４７～４９、４７～５０、４７～５１、４７～５２、４７～５３、４７～５４、４７～５５、４７～５６、４７～５７、４７～５８、４７～５９、４７～６０、４７～６１、４７～６２、４７～６３、４７～６４）（例えば、４８～４９、４８～５０、４８～５１、４８～５２、４８～５３、４８～５４、４８～５５、４８～５６、４８～５７、４８～５８、４８～５９、４８～６０、４８～６１、４８～６２、４８～６３、４８～６４）（例えば、４９～５０、４９～５１、４９～５２、４９～５３、４９～５４、４９～５５、４９～５６、４９～５７、４９～５８、４９～５９、４９～６０、４９～６１、４９～６２、４９～６３、４９～６４）（例えば、５０～５１、５０～５２、５０～５３、５０～５４、５０～５５、５０～５６、５０～５７、５０～５８、５０～５９、５０～６０、５０～６１、５０～６２、５０～６３、５０～６４）（例えば、５１～５２、５１～５３、５１～５４、５１～５５、５１～５６、５１～５７、５１～５８、５１～５９、５１～６０、５１～６１、５１～６２、５１～６３、５１～６４）（例えば、５２～５３、５２～５４、５２～５５、５２～５６、５２～５７、５２～５８、５２～５９、５２～６０、５２～６１、５２～６２、５２～６３、５２～６４）（例えば、５３～５４、５３～５５、５３～５６、５３～５７、５３～５８、５３～５９、５３～６０、５３～６１、５３～６２、５３～６３、５３～６４）（例えば、５４～５５、５４～５６、５４～５７、５４～５８、５４～５９、５４～６０、５４～６１、５４～６２、５４～６３、５４～６４）（例えば、５５～５６、５５～５７、５５～５８、５５～５９、５５～６０、５５～６１、５５～６２、５５～６３、５５～６４）（例えば、５６～５７、５６～５８、５６～５９、５６～６０、５６～６１、５６～６２、５６～６３、５６～６４）（例えば、５７～５８、５７～５９、５７～６０、５７～６１、５７～６２、５７～６３、５７～６４）（例えば、５８～５９、５８～６０、５８～６１、５８～６２、５８～６３、５８～６４）（例えば、５９～６０、５９～６１、５９～６２、５９～６３、５９～６４）（例えば、６０～６１、６０～６２、６０～６３、６０～６４）（例えば、６１～６２、６１～６３、６１～６４）（例えば、６２～６３、６２～６４）（例えば、６３～６４）（例えば、１～４２３、１０～４２３、２０～４２３、４１～４２３、５０～４２３、６２～４２３、６４～４２３、１００～４２３、１５０～４２３、２００～４２３、３００～４２３、３２０～４２３、３６１～４２３、４００～４２３、４１０～４２３、４１５～４２３、４２０～４２３、４２１～４２３、４２２～４２３）（例えば、４２３以下、４００以下、３５０以下、３６１以下、３２０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下、１００以下、７５以下、７０以下、６５以下、６４以下、６２以下；６１以下；６０以下；５９以下；５８以下；５７以下；５６以下；５５以下；５４以下；５３以下；５２以下；５１以下；５０以下；４９以下；４８以下；４７以下；４６以下；４５以下；４４以下；４３以下；４２以下；４１以下；４０以下；３９以下；３８以下；３７以下；３６以下；３５以下；３４以下；３３以下；３２以下；３１以下；３０以下；２９以下；２８以下；２７以下；２６以下；２５以下；２４以下；２３以下；２２以下；２１以下；２０以下；１９以下；１８以下；１７以下；１６以下；１５以下；１４以下；１３以下；１２以下；１１以下；１０以下；９以下；８以下；７以下；６以下；５以下；４以下；３以下；２または１）。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、一般に任意のリボ核酸またはデオキシリボ核酸を指し、非修飾または修飾ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。「核酸」には、一本鎖及び二本鎖核酸が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に使用される場合、用語「核酸」は、１つ以上の修飾塩基を含む上述されるようなＤＮＡをも含む。したがって、安定性または他の理由で骨格が修飾されたＤＮＡは「核酸」である。本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された核酸の形態、ならびに例えば、単細胞及び複雑細胞を含む、ウイルス及び細胞のＤＮＡ特性の化学的形態を包含する。
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「核酸」は、２個以上、好ましくは３個よりも多い、及び通常１０個よりも多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子を指す。この正確なサイズは多くの因子に依存し、これらの因子は今度はオリゴヌクレオチドの根本的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む、任意の方法で生成することができる。ＤＮＡの典型的なデオキシリボヌクレオチドは、チミン、アデニン、シトシン、及びグアニンである。ＲＮＡの典型的なリボヌクレオチドは、ウラシル、アデニン、シトシン、及びグアニンである。
本明細書で使用される場合、核酸の用語「遺伝子座」または「領域」は、核酸の小領域、例えば、染色体上の遺伝子、単一のヌクレオチド、ＣｐＧアイランドなどを指す。
用語「相補的な」及び「相補性」とは、塩基対合規則によって関連付けられるヌクレオチド（例えば１個のヌクレオチド）またはポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド配列）を指す。例えば、配列５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’は、配列３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸塩基の一部のみが塩基対合則に従って一致する。または、核酸間の「完全な」または「全体の」相補性があることができる。核酸の鎖間の相補性の程度は、核酸の鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度をもたらす。これは、増幅反応において、及び核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
用語「遺伝子」は、ＲＮＡ、またはポリペプチドもしくはその前駆体の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。機能ポリペプチドは、ポリペプチドの所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、完全長のコード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。遺伝子への参照に使用されるときに、用語「部分」は、その遺伝子のフラグメントを指す。これらのフラグメントは、数個のヌクレオチドから、遺伝子全体の配列より１個のヌクレオチドを引いたもののサイズに及ぶことができる。したがって、「遺伝子の少なくとも一部を含むヌクレオチド」は、遺伝子のフラグメントまたは遺伝子全体を含むことができる。
用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域も含み、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、５’末端及び３’末端の両方にコード領域に隣接して、例えば、どちらの末端においても約１ｋｂの距離に位置する配列を含む（例えば、コード配列、制御配列、構造配列及び他の配列を含む）。コード領域の５’側に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）または非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列と称される。コード領域の３’側または下流に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）または非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムの形態の両方を包含する。特定の生物（例えば、真核生物）では、遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で中断されたコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサー等の制御要素を含有してもよい。イントロンは、核または一次転写産物から除去されるかまたは「スプライシングにより出される」ため、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物には存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチドにおいてアミノ酸の配列または順序を特定するように翻訳中に機能する。
イントロンを含有することに加えて、ゲノム形態の遺伝子はまた、ＲＮＡ転写物に存在する配列の５’末端及び３’末端の両方に位置する配列を含んでもよい。これらの配列は、「フランキング」配列または「フランキング」領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物に存在する非翻訳配列の５’側または３’側に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するか、またはそれに影響を与えるプロモーター及びエンハンサー等の調節配列を有し得る。３’フランキング領域は、転写終結、転写後切断、及びポリアデニル化を指示する配列を有し得る。
遺伝子を言及する場合、用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離される遺伝子の特性を有する遺伝子を指す。遺伝子産物について言う場合、用語「野生型」とは、天然に存在する由来源から単離される遺伝子産物の特性を有する遺伝子産物を指す。遺伝子について言う場合、用語「野生型」とは、天然に存在する由来源から単離される遺伝子の特性を有する遺伝子を指す。「天然に存在する」という用語は、ある対象に適用される場合、対象を天然に見出すことができるという事実を指す。例えば、天然の由来源から単離され得、かつ研究室において人間の手によって意図的に修飾されていないかある生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。野生型遺伝子はしばしば、集団内で最も高頻度で観察され、したがって遺伝子の「正常」または「野生型」形態と任意に称されるその遺伝子またはアレルである。対照的に、遺伝子または遺伝子産物を言及する場合、用語「修飾された」または「変異の」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列及び／または機能特性における修飾（すなわち、改変された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物をそれぞれ指す。天然に存在する変異体を単離することができることに留意し、これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、それらが特徴を変化させたという事実により特定される。
用語「アレル」は、遺伝子のバリアントを指し、これらのバリアントは、バリアント及び変異体、多型遺伝子座、ならびに一塩基多型遺伝子座、フレームシフト、及びスプライス変異を含むが、これらに限定されない。アレルは、集団に天然に存在することができる、またはそれは、この集団のいずれかの特定の個体の生存期間中に生じることができる。
したがって、ヌクレオチド配列を参照して使用される場合、用語「バリアント」及び「変異体」は、別の、通常に関連した、ヌクレオチド配列から１つ以上のヌクレオチドで異なる核酸配列を指す。「変異」は、２つの異なるヌクレオチド配列間の差異であり、一般的に一方の配列は基準配列である。
用語「プライマー」は、精製された制限消化物由来の核酸フラグメントとして天然に存在するかまたは合成されるかによらず、核酸の鋳型鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に（例えば、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、適切な温度及びｐＨで）置かれる際に合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅の効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、まずその鎖を分離するために処理され、その後伸長産物の調製に使用される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー供給源、及び方法の使用を含む、多くの要因に依存する。いくつかの実施形態では、プライマーペアは、特定のＭＤＭ（例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸのＭＤＭ）に対して特異的であり、ＭＤＭを含む遺伝子領域（例えば、表Ｉ、ＩＩＩ及び／またはＸの染色体座標）の少なくとも一部に特異的に結合する。
「プローブ」という用語は、精製された制限消化物と同様に天然に生じるか、または合成により、組換えにより、もしくはＰＣＲ増幅により生成されるかのいずれかであるオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの配列）を指し、これは目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。プローブは、一本鎖または二本鎖であることができる。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、及び単離に有用である（例えば、「捕捉プローブ」）。本発明に使用されるいずれかのプローブがいくつかの実施形態において、いずれかの「レポーター分子」によってラベル付けされることができるため、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び酵素に基づく組織化学的アッセイ）、蛍光、放射性、及び発光システムを含むが、これらに限定されない、いずれかの検出システムにおいて検出可能であることを企図する。本発明がいずれかの特定の検出システムまたはラベルに限定されることを意図しない。
本明細書で使用される「標的」という用語は、例えばプローブ結合、増幅、単離、捕捉などによって他の核酸から選別しようとする核酸を指す。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用される場合、「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーによって結合された核酸の領域を指す一方で、標的ＤＮＡが増幅されないアッセイに使用される場合、例えば、侵入切断アッセイのいくつかの実施形態では、標的は、プローブ及び侵入オリゴヌクレオチド（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）が結合して侵入切断構造を形成する部位を含み、これにより、標的核酸の存在を検出することができる。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。
したがって、本明細書で使用される「非標的」とは、例えば、ＤＮＡなどの核酸を記述するために使用される場合、反応中に存在する可能性があるが、反応による検出または特性評価の対象ではない核酸を指す。いくつかの実施形態では、非標的核酸は、例えば標的配列を含まない試料中に存在する核酸を指し得るが、いくつかの実施形態では、非標的とは、外因性核酸、すなわち、標的核酸を含むかまたは含むことが疑われる試料に由来せず、例えば、反応における酵素（例えば、ポリメラーゼ）の性能のばらつきを低減するため、酵素の活性を正常化するために反応に添加される核酸を指す場合もある。
本明細書で使用される場合、「メチル化」は、シトシンのＣ５位もしくはＮ４位でのシトシンメチル化、アデニンのＮ６位、または他のタイプの核酸メチル化を指す。インビトロ増幅ＤＮＡは、典型的なインビトロＤＮＡ増幅方法が増幅鋳型のメチル化パターンを保持しないため、通常メチル化されない。しかしながら、「メチル化されていないＤＮＡ」または「メチル化されたＤＮＡ」は、それぞれ元の鋳型がメチル化されていなかった、またはメチル化された増幅ＤＮＡをも指すことが可能である。
本明細書で使用する「増幅試薬」という用語は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素を除く、増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液など）を指す。通常、増幅試薬は他の反応成分とともに反応容器内に配置及び収容される。
本明細書で使用される場合、「コントロール」という用語は、核酸の検出または分析に関して使用される場合、実験標的（例えば、濃度が不明な核酸など）との比較に用いられる既知の特徴（例えば、既知の配列、既知の細胞当たりのコピー数）を有する核酸を指す。コントロールは、アッセイ中の試験核酸または標的核酸をそれに対して正規化することができる内因性の、好ましくは不変遺伝子であってよい。このような正規化により、例えば試料のプロセシング、アッセイ効率などで生じ得る試料間のばらつきが抑制され、正確な試料間のデータ比較が可能となる。ヒト試料における核酸検出アッセイを正規化するために使用される遺伝子としては、例えば、β－アクチン、ＺＤＨＨＣ１、及びＢ３ＧＡＬＴ６が挙げられる（例えば、本明細書に参照によりそれぞれを援用する米国特許出願第１４／９６６，６１７号、及び同第６２／３６４，０８２号を参照）。本明細書で使用する場合、「ＺＤＨＨＣ１」は、ヒトＤＮＡの第１６番染色体（１６ｑ２２．１）上に位置する、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ＤＨＨＣ－ｔｙｐｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １として特徴付けられる、ＤＨＨＣパルミトイルトランスフェラーゼファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子を指す。
コントロールは外部の場合もある。例えば、ｑＰＣＲ、ＱｕＡＲＴＳなどの定量アッセイにおいて、「キャリブレーター」または「キャリブレーションコントロール」とは、既知の配列の核酸、例えば、実験標的核酸の一部と同じ配列、及び既知の濃度または一連の濃度（例えば、定量的ＰＣＲの検量線を生成するための段階希釈されたコントロールターゲット）を有する核酸である。通常、キャリブレーションコントロールは、実験ＤＮＡで使用されるものと同じ試薬及び反応条件を使用して分析される。特定の実施形態では、キャリブレーターの測定は、実験的アッセイと同時に、例えば同じサーマルサイクラー内で行われる。好ましい実施形態では、異なるキャリブレーター配列が等モル量で容易に与えられるように、複数のキャリブレーターを単一のプラスミドに含めることができる。特に好ましい実施形態では、プラスミドキャリブレーターは、例えば１つ以上の制限酵素で消化されて、プラスミドベクターからキャリブレーター部分を放出する。例えば、参照により本明細書に援用するＷＯ２０１５／０６６６９５を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「メチル化されたヌクレオチド」または「メチル化されたヌクレオチド塩基」は、ヌクレオチド塩基上のメチル部分の存在を指し、このメチル部分は、認識された典型的なヌクレオチド塩基中に存在しない。例えば、シトシンは、そのピリミジン環上にメチル部分を含まないが、５－メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含む。したがって、シトシンはメチル化ヌクレオチドではなく、５－メチルシトシンはメチル化ヌクレオチドである。別の例では、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有するが、チミンはＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるため、本明細書の目的において、ＤＮＡ中に存在する場合にチミンはメチル化ヌクレオチドであるとは見なされない。
本明細書に使用される場合に、「メチル化された核酸分子」は、１つ以上のメチル化されたヌクレオチドを含む核酸分子を指す。
本明細書で使用する場合、核酸分子の「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化ステータス」とは、核酸分子中の１つ以上のメチル化されたヌクレオチド塩基の存在または非存在を指す。例えば、メチル化シトシンを含む核酸分子は、メチル化されていると見なされる（例えば、核酸分子のメチル化状態は、メチル化されている）。いかなるメチル化されたヌクレオチドも含まない核酸分子は、メチル化されていないとみなされる。
本明細書で使用する場合、メチル化マーカーに適用される「メチル化レベル」という用語は、特定のメチル化マーカー内のメチル化の量を指す。メチル化レベルは、確立された標準またはコントロールと比較した、特定のメチル化マーカー内のメチル化の量を指す場合もある。メチル化レベルは、ＣｐＧコンテキストに存在する１つ以上のシトシン残基がメチル化基を有するか否かを指す場合もある。メチル化レベルは、そのようなシトシンにメチル化基を有するかまたは有さない試料中の細胞の割合を指す場合もある。メチル化レベルは、単一のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているかどうかを表す場合もある。
特定の核酸配列のメチル化状態（例えば、本明細書に記載されるような、遺伝子マーカー、またはＤＮＡ領域）は、この配列中のすべての塩基のメチル化状態を示すことが可能である、またはこの配列内のこれらの塩基の（例えば、１つ以上のシトシンの）１サブセットのメチル化状態を示すことが可能である、またはメチル化が生じる配列内の位置の正確な情報を提供しながら、もしくは提供しなくても、この配列内の領域のメチル化密度についての情報を示すことが可能である。
核酸分子中のヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態は、核酸分子中の特定の遺伝子座においてメチル化されたヌクレオチドの存在または非存在を指す。例えば、核酸分子中の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが５－メチルシトシンである場合に、メチル化されている。同様に、核酸分子中の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドがシトシンである（かつ５－メチルシトシンではない）場合には、メチル化されていない。
メチル化状態は、「メチル化値」（例えば、メチル化頻度、分画、割合、パーセントなどを表す）によって任意選択で表される、または示されることが可能である。メチル化値は、例えば、メチル化依存型制限酵素による制限消化後に存在するインタクトな核酸の量を定量化することによって、または亜硫酸水素塩反応後の増幅プロファイルを比較することによって、または亜硫酸水素塩処理した核酸の配列と非処理の核酸の配列を比較することによって、またはＴＥＴ処理された核酸と非処理の核酸とを比較することによって生成することができる。したがって、値、例えば、メチル化値は、メチル化状況を表し、これにより遺伝子座の複数のコピーにわたりメチル化状況の定量的指標として使用することができる。これは、試料中の配列のメチル化状態を閾値または基準値と比較することが望ましいときの特定の用途のものである。
本明細書に使用される場合、「メチル化頻度」または「メチル化パーセント（％）」は、分子または遺伝子座がメチル化されていない場合の数と比較した、分子または遺伝子座がメチル化される場合の数を指す。
本明細書で使用される「メチル化スコア」という用語は、対象となる特定の腫瘍を有さない哺乳動物のランダム集団（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、または５００匹の哺乳動物哺乳動物のランダム集団）由来のマーカーまたはマーカーのパネルにおけるメチル化事象の中央値と比較した、マーカーまたはマーカーのパネルで検出されたメチル化事象を示すスコアである。マーカーまたはマーカーのパネルにおける高いメチル化スコアとは、そのスコアが対応する参照スコアより大きい限り、任意のスコアであり得る。例えば、マーカーまたはマーカーのパネルにおける高いメチル化スコアとは、基準メチル化スコアよりも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはそれ以上大きくてよい。
したがって、メチル化状態は、核酸（例えば、ゲノム配列）のメチル化の状態を表す。加えて、メチル化状態は、メチル化に関連する特定のゲノム遺伝子座における核酸セグメントの特性を指す。そのような特徴は、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されるか否か、メチル化Ｃ残基（複数可）の位置、核酸の任意の特定領域全体にわたるメチル化Ｃの頻度またはパーセンテージ、及び例えば、対立遺伝子の起源の差に起因するメチル化の対立遺伝子差を含むが、これらに限定されない。また用語「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化状態」は、相対的な濃度、絶対的な濃度、または生物学的試料中の核酸のいずれかの特定の領域全体を通してメチル化されたＣもしくはメチル化されていないＣのパターンを指す。例えば、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されている場合、「高メチル化された」または「高いメチル化」を有すると言うことができるのに対して、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されていない場合には「低メチル化された」または「低いメチル化」を有すると言うことができる。同様に、ある核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が別の核酸配列（例えば、異なる領域からの、または異なる個体からのなど）と比較してメチル化されている場合、その配列は、他の核酸配列と比較して高メチル化されている、または高いメチル化を有するとみなされる。あるいは、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が別の核酸配列（例えば、異なる領域からの、または異なる個体からのなど）と比較してメチル化されていない場合、その配列は、他の核酸配列と比較して低メチル化されている、または低いメチル化を有するとみなされる。加えて、本明細書に使用される場合、用語「メチル化パターン」とは、核酸領域にわたるメチル化されたヌクレオチド、及びメチル化されていないヌクレオチドの集合部位を指す。２個の核酸は、同一の、または同様のメチル化頻度またはメチル化パターンを有することができるが、メチル化されたヌクレオチド、及びメチル化されていないヌクレオチドの数が領域全体を通して同一である、または同様であるが、メチル化されたヌクレオチド、及びメチル化されていないヌクレオチドの位置が異なるときに異なるメチル化パターンを有する。配列は、それらがメチル化の、程度（例えば、一方が他方と比較して増加したメチル化、または減少したメチル化を有する）、頻度、またはパターンにおいて異なるときに、「可変メチル化」と、または「メチル化における差異」を有すると、または「異なるメチル化状態」を有すると称される。用語「可変メチル化」は、がん陰性試料中の核酸メチル化のレベルまたはパターンと比較して、がん陽性試料中の核酸メチル化のレベルまたはパターンにおける差異を指す。手術後のがんの再発を有する患者と、再発を有さない患者との間のベレルまたはパターンにおける差異をも指すことができる。可変メチル化、及びＤＮＡメチル化の特異的なレベルまたはパターンは、例えば、正確なカットオフまたは予測特性を定義されれば、予後及び予測バイオマーカーとなる。
メチル化状態の頻度を用いて、個人の集団または単一の個人からの試料を説明することができる。例えば、５０％のメチル化状態の頻度を有するヌクレオチド遺伝子座は、その５０％でメチル化され、その５０％はメチル化されていない。このような頻度を使用して、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が個体集団または核酸集合体中でメチル化される程度を説明することが可能である。したがって、核酸分子の第一集団またはプール中のメチル化が核酸分子の第二集団またはプール中のメチル化と異なるときに、第一集団またはプールのメチル化状態の頻度は、第二集団またはプールのメチル化状態の頻度と異なる。そのような頻度はまた、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が単一個体中でメチル化される程度を記述するために使用することができる。例えば、そのような頻度を使用して、組織試料からの細胞群がヌクレオチド遺伝子座または核酸領域でメチル化されている程度、またはメチル化されていない程度を記述することができる。
典型的に、ヒトＤＮＡのメチル化は、シトシンがグアニンの５’側に位置している隣接するグアニン及びシトシンを含むジヌクレオチド配列上で起こる（ＣｐＧジヌクレオチド配列とも称される）。ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンの多くはヒトゲノム中でメチル化されているが、いくつかは、ＣｐＧアイランドとして知られる特定のＣｐＧジヌクレオチドリッチゲノム領域中でメチル化されないままである（例えば、Ａｎｔｅｑｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：５０３－５１４を参照されたい）。
本明細書に使用される場合、「ＣｐＧアイランド」または「シトシン－リン酸－グアニン－アイランド」とは、全ゲノムＤＮＡと比較してより多くのＣｐＧジヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡのＧ：Ｃリッチ領域を指す。ＣｐＧアイランドは、少なくとも１００、２００塩基対、またはそれよりも長い塩基対長であり得、この場合、領域のＧ：Ｃ含量は少なくとも５０％であり、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比は０．６であり、場合によっては、ＣｐＧアイランドは、少なくとも５００塩基対長であり得、この場合、領域のＧ：Ｃ含量は少なくとも５５％であり、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比は０．６５である。予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：２６１－２８１で提供される方法に従って算出することができる。例えば、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度は、式Ｒ＝（Ａ×Ｂ）／（Ｃ×Ｄ）に従って算出することができ、式中、Ｒは、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比であり、Ａは、分析された配列中のＣｐＧジヌクレオチド数であり、Ｂは、分析された配列中のヌクレオチドの総数であり、Ｃは、分析された配列中のＣヌクレオチドの総数であり、Ｄは、分析された配列中のＧヌクレオチドの総数である。メチル化状態は通常、ＣｐＧアイランド中で、例えば、プロモーター領域で判定される。しかしながら、ＣｐＡ及びＣｐＴなどのヒトゲノム中の他の配列もＤＮＡメチル化を受ける点は理解されよう（Ｒａｍｓａｈｏｙｅ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５２３７－５２４２；Ｓａｌｍｏｎ ａｎｄ Ｋａｙｅ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２０４：３４０－３５１；Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２８２７－２８４２；Ｎｙｃｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４３５３－４３６７；Ｗｏｏｄｃｏｃｋ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．１４５： ８８８－８９４を参照）。
本明細書に使用される場合、「メチル化特異的試薬」とは、核酸分子のメチル化状態の機能として核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬を指し、またはメチル化特異的試薬は、化合物または組成物、または核酸分子のメチル化状態を反映する形で核酸分子のヌクレオチド配列を変えることが可能である他の薬剤を指す。核酸分子をこのような試薬によって処理する方法は、核酸分子を試薬と接触させることを含んでよく、必要に応じて、追加のステップと組み合わせて、ヌクレオチド配列の所望の変化を得ることができる。そのような方法は、非メチル化ヌクレオチド（例えば、各非メチル化シトシン）が、異なるヌクレオチドへと修飾される形で適用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、そのような試薬は、非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化してデオキシウラシル残基を生成することができる。そのような試薬の例としては、これらに限定されるものではないが、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、亜硫酸水素塩試薬、ＴＥＴ酵素、及びボラン還元剤が挙げられる。
メチル化特異的試薬による核酸ヌクレオチド配列の変化はまた、各メチル化ヌクレオチドが異なるヌクレオチドへと修飾される核酸分子をもたらし得る。
用語「メチル化アッセイ」は、核酸配列内の１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するためのいずれかのアッセイを指す。
「ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ」（メチル化感受性任意プライムポリメラーゼ連鎖反応）という用語は、ＣＧリッチプライマーを使用してゲノムを全スキャンし、ＣｐＧジヌクレオチドを含有する可能性が最も高い領域に集中することを可能にする、当該技術分野において認識されている技術を指し、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４－５９９によって記載されている。
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」という用語は、Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６によって記載されている、当該技術分野において認識されている蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ技術を指す。
用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」は、増幅プライマー間のＣｐＧ位置を網羅する、または増幅プライマーによって網羅されるメチル化特異的阻害プローブ（本明細書において阻害剤とも称される）が核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にするアッセイを指す。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという用語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指し、これはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形であり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイが、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされる。
用語「Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性一塩基プライマー伸長）は、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ２５２９－２５３１に記載される当該技術分野で認識されたアッセイを指す。
用語「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）は、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６により、また米国特許第５，７８６，１４６号に記載される当該技術分野で認識されたメチル化アッセイを指す。
用語「ＣＯＢＲＡ」（複合亜硫酸水素塩制限分析）は、Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４に記載される当該技術分野で認識されたメチル化アッセイを指す。
用語「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧアイランド増幅）は、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９： ２３０７－１２及びＷＯ００／２６４０１Ａ１に記載されるメチル化アッセイを指す。
本明細書に使用される場合、「選択されたヌクレオチド」は、核酸分子中に典型的に存在する４個のヌクレオチド（ＤＮＡについてのＣ、Ｇ、Ｔ、及びＡ、ならびにＲＮＡについてのＣ、Ｇ、Ｕ、及びＡ）のうちの１個のヌクレオチドを指し、典型的に存在するヌクレオチドのメチル化誘導体（例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドであるとき、メチル化されたＣ及びメチル化されていないＣの両方は選択されたヌクレオチドの意味に含まれる）を含むことが可能であるが、メチル化され選択されたヌクレオチドは、メチル化された典型的に存在するヌクレオチドを特異的に指し、メチル化されていない選択されたヌクレオチドは、メチル化されていない典型的に存在するヌクレオチドを特異的に指す。
用語「メチル化特異的制限酵素」とは、その認識部位のメチル化状態に依存して核酸を選択的に消化する制限酵素を指す。認識部位がメチル化されていないかまたはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素（メチル化感受性酵素）では、切断は、認識部位が一方または両方の鎖でメチル化されている場合には行われない（または大幅に低い効率で行われる）。認識部位がメチル化されている場合にのみ特異的に切断する制限酵素（メチル化依存型酵素）では、切断は、認識部位がメチル化されていない場合には行われない（または大幅に低い効率で行われる）。好ましくは、メチル化特異的制限酵素であり、この酵素の認識配列は、ＣＧジヌクレオチドを含む（例えば、ＣＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＧなどの認識配列）。いくつかの実施形態にさらに好ましいのは、このジヌクレオチド中のシトシンが炭素原子Ｃ５でメチル化される場合には切断しない制限酵素である。
本明細書に使用される場合、特定のマーカー（または併用されるマーカーのセット）の「感度」は、新生物と非新生物試料を区別する閾値を上回るＤＮＡメチル化値を報告する試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態において、陽性は、閾値（例えば、疾患と関連する範囲）を上回るＤＮＡメチル化値を報告する組織学的に確認された新生物として定義され、偽陰性は、閾値（例えば、非疾患と関連する範囲）を下回るＤＮＡメチル化値を報告する組織学的に確認された新生物として定義される。したがって、感度の値は、既知の罹患試料から得られた所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が、疾患関連測定値の範囲内にあるであろう確率を反映する。本明細書で定義される場合、算出された感度値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有する対象に適用される場合、その臨床状態の存在を検出する確率の推定を表す。
本明細書に使用される場合、特定のマーカー（または併用されるマーカーのセット）の「特異性」とは、腫瘍と非腫瘍試料を区別する閾値を下回るＤＮＡメチル化値を報告する非腫瘍試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陰性は、閾値未満のＤＮＡメチル化値（例えば、疾患と関連しない範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料として定義され、偽陽性は、閾値を超えるＤＮＡメチル化値（例えば、疾患と関連する範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料として定義される。したがって、特異性の値は、既知の非腫瘍性試料から得られた所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が、非疾患関連測定値の範囲内にあるであろう確率を反映する。本明細書で定義される場合、算出された特異性値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有しない患者に適用される場合、その臨床状態の欠如を検出する確率の推定を表す。
本明細書で使用される「ＡＵＣ」という用語は、「曲線下面積」の略語である。特に、ＡＵＣは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を指す。ＲＯＣ曲線は、診断検査の異なる可能性があるカットポイントについての偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。ＲＯＣ曲線は、選択されたカットポイントに応じた感度と特異性との間のトレードオフを示す（感度のあらゆる上昇は、特異性の低下を伴うことになる）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断試験の精度の尺度である（面積が大きいほどより良好であり、１が最適であり、ランダム試験は対角線上に位置するＲＯＣ曲線を有し、面積は０．５である。参照：Ｊ．Ｐ．Ｅｇａｎ．（１９７５）Ｓｉｇｎａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ＲＯＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、組織のあらゆる新たな異常な増殖を指す。したがって、腫瘍は前がん状態の腫瘍または悪性腫瘍であり得る。
本明細書で使用される「腫瘍特異的マーカー」という用語は、腫瘍の存在を示すために使用できる任意の生体物質または要素を指す。生体物質の例は、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分（例えば、細胞膜及びミトコンドリア）、ならびに全細胞を含むが、これらに限定されない。場合によっては、マーカーは、特定の核酸領域（例えば、遺伝子、遺伝子内領域、特定の遺伝子座など）である。マーカーである核酸の領域は、例えば、「マーカー遺伝子」、「マーカー領域」、「マーカー配列」、「マーカー遺伝子座」などと称される場合がある。
本明細書に使用される場合、用語「腺腫」は、腺起源の良性腫瘍を指す。これらの増殖は良性であるが、経時的にそれらは進行して悪性となるおそれがある。
用語「前がん性」または「前腫瘍性」及びそれらの同等表現は、悪性形質転換を起こしているいずれかの細胞増殖性疾患を指す。
腫瘍、腺腫、がんなどの「部位」は、腫瘍、腺腫、がんなどが位置している対象中の組織、器官、細胞型、解剖学的領域、身体部位などである。
本明細書に使用される場合、「診断」検査の適用は、対象の疾患状態または状況の検出または同定を含み、対象が所与の疾患または状態を罹患する尤度を決定すること、疾患または状態を有する対象が治療に応答する尤度を決定すること、疾患または状態を有する対象の予後（またはその進行もしくは退行の可能性）を決定すること、及び疾患または状態を有する対象についての処置の効果を決定することを含む。例えば、診断は、新生物を罹患する被検体の存在もしくは尤度、またはこのような被検体が化合物（例えば、医薬品、例えば、薬物）もしくは他の処置に順調に応答する尤度を検出するために使用されることが可能である。
用語「単離された」は、「単離されたオリゴヌクレオチド」のように、核酸に関して使用されるときに、その天然の供給源に通常関連付けられる少なくとも１つの混入物の核酸から特定され、分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然にみられる形態または状況にあるものと異なる形態または状況に存在する。対照的に、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見出される。単離されていない核酸の例としては、隣接する遺伝子に近接する宿主細胞染色体上で見出される所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）、ＲＮＡ配列、例えば、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見出される、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などが挙げられる。しかしながら、特定のタンパク質をコードする単離された核酸は、タンパク質を通常発現細胞中の核酸などの例として含み、そこで核酸は、天然細胞のものと異なる染色体位置にある、またはその他の点で天然に見出されるものと異なる核酸配列と隣接している。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、このオリゴヌクレオチドは、センス鎖またはコード鎖を最低限含む（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であってよい）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。単離された核酸は、その天然の、または通常の環境からの単離後、他の核酸または分子と組み合わされ得る。例えば、単離された核酸は、例えば異種発現のために入れられた宿主細胞中に存在する場合もある。
「精製された」という用語は、核酸またはアミノ酸配列のいずれかの分子であって、これらの天然環境から除去されたか、単離されたか、または分離された分子を指す。したがって「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列であることができる。「実質的に精製された」分子は、それらが自然に付随している他の成分を少なくとも６０％含まず、好ましくは少なくとも７５％含まず、より好ましくは少なくとも９０％含まない。本明細書に使用される場合、用語「精製された」または「精製する」は、試料からの混入物の除去をも指す。混入するタンパク質の除去は、試料中の対象となるポリペプチドまたは核酸のパーセントにおける上昇をもたらす。別の例において、組換えポリペプチドを植物、細菌、酵母、または哺乳類の宿主細胞中で発現し、これらのポリペプチドを宿主細胞タンパク質の除去によって精製することにより、組換えポリペプチドのパーセントを試料中で上昇させる。
所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド「を含む組成物」という用語は、所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを含むいずれかの組成物を広く指す。組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、及び他の成分（例えば、デンハルト液、粉乳、サケ精子ＤＮＡなど）を含有する水溶液を含み得る。
用語「試料」は、その最も広義に使用される。ある意味において、それは、動物細胞または組織を指すことが可能である。別の意味では、それは、任意の供給源から得られた標本または培養物、ならびに生体サンプル及び環境サンプルを指す。生物学的試料は、植物または動物（ヒトを含む）から得られ、流体、固体、組織、及び気体含むことができる。環境試料は、表面物質、土壌、水、及び工業用試料などの環境物質を含む。これらの例は、本発明に適用可能な試料のタイプを限定すると解釈されるべきではない。
本明細書に使用される場合、いくつかの文脈において使用されるような「遠隔試料」は、細胞、組織、または器官の試料供給源ではない部位から間接的に採取される試料を指す。例えば、糞便試料中の子宮頸部に由来する試料物質を評価する場合、この試料は、遠隔試料である。
本明細書に使用される場合、用語「患者」または「対象」は、本技術によって提供されるさまざまな検査の対象となる生物を指す。「対象」という用語は、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物を含む。好ましい実施形態では、対象は霊長類である。より一層好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに診断方法に関して、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は温血であり、好ましい温血脊椎動物は哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書に使用される場合、用語「対象」は、ヒト及び動物対象の両方を含む。したがって、獣医学的な治療的使用が本明細書で提供される。このようなものとして、本発明の技術は、ヒトなどの哺乳類、及びアムールトラなどの絶滅の危機に瀕しているために重要な、ヒトによる消費のために農場で育てられる動物などの経済的に重要なこれらの哺乳類、及び／またはペットとして、または動物園に飼われている動物など、ヒトにとって社会的に重要な動物の診断のために提供される。これらのような動物の例は、ネコ及びイヌなどの肉食動物；ブタ（ｐｉｇ）、ブタ（ｈｏｇ）、及びイノシシを含むブタ（ｓｗｉｎｅ）；ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなどの反芻動物及び／または有蹄動物；鰭脚類；ならびにウマを含むが、これらに限定されない。したがって、また提供されるのは、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬を含む）、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、家畜の診断及び処置である。本明細書に開示される主題には、対象の子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）を診断するためのシステムがさらに含まれる。このシステムは、生体試料が採取された対象における子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）のリスクをスクリーニングするために、または子宮頸癌、子宮頸癌サブタイプ、及び／または子宮頸癌前癌を診断するために使用することができる市販のキットとして提供することができる。本技術に従って提供される例示的なシステムは、本明細書に記載のマーカーのメチル化状態を評価することを含む。
本明細書で使用される、用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの文脈において、それらのような送達システムは、ある場所から別の場所への反応試薬（例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）及び／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための書面による説明書など）の保管、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／または支持材料を収容する１つ以上の密封部材（例えば、箱）を含む。本明細書で使用される、用語「断片化キット」は、各々が全キット構成要素の副次的部分を収容する２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、一緒にまたは別個に意図されるレシピエントに送達されることができる。例えば、第１の容器は、アッセイで使用するための酵素を含有し得、一方で第２の容器は、オリゴヌクレオチドを含有する。用語「断片化キット」は、連邦食品医薬品化粧品法のセクション５２０（ｅ）により規定される、分析物特定試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含することが意図されるが、これらに限定されない。実際に、各々がキット全体の構成要素の一部分を収容する２つ以上の別個の容器を備える任意の送達システムは、「断片化キット」という用語に含まれる。対照的に、「複合キット」は、反応アッセイの全ての構成要素を単一容器中に（例えば、所望の構成要素の各々を収容する単一の箱中に）含有する送達システムを指す。用語「キット」は、断片化及び複合キットの両方を含む。
本明細書で使用される場合、「情報」という用語は、事実またはデータの任意の集合を指す。限定されないが、インターネットを含むコンピュータシステム（複数可）を使用して記憶または処理される情報に関して、この用語は、任意のフォーマット（例えば、アナログ、デジタル、光学など）で記憶される任意のデータを指す。本明細書で使用される場合、「対象に関する情報」という用語は、対象（例えば、ヒト、植物、または動物）に関する事実またはデータを指す。「ゲノム情報」という用語は、核酸配列、遺伝子、メチル化率、対立遺伝子頻度、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型に相関する表現型などを含むがこれらに限定されない、ゲノムに関する情報を指す。「対立遺伝子頻度情報」は、対立遺伝子の同一性、対立遺伝子の存在と対象（例えば、ヒト対象）の特徴との間の統計的相関、個体または集団における対立遺伝子の存在または非存在、１つ以上の特定の特徴を有する個体に存在する対立遺伝子の可能性のパーセンテージなどを含むが、これらに限定されない、対立遺伝子頻度に関する事実またはデータを指す。
本明細書では、子宮頸癌をスクリーニングするための技術、詳細にはこれらに限定されるものではないが、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、及び便試料）から、子宮頸癌及び／または特定の形態の子宮頸癌（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）の存在を検出するための、または子宮頸癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜癌、及び卵巣癌）から判別するための方法、組成物、及び／または関連する使用を提供する。
実際、実施例Ｉ及びＩＩに記載されるように、本発明の実施形態を特定する過程で行われた実験によって、子宮頸部の癌由来のＤＮＡを非腫瘍性のコントロールＤＮＡから判別するための、また、子宮頸癌組織を子宮内膜癌及び卵巣癌から判別するための新規なメチル化可変領域（ＤＭＲ）群が特定された。このような実験では、子宮頸癌、子宮頸癌サブタイプ、及び子宮頸癌前癌組織を良性の子宮頸部組織から判別する（表Ｉ～ＩＶ、ＶＩ～ＶＩＩＩ、実施例Ｉを参照）、また、子宮頸癌を他の種類の婦人科癌（子宮内膜癌、卵巣癌など）から、また、子宮頸癌組織を子宮内膜癌及び卵巣癌組織から判別するための（表ＸＩ及びＸＩＩ、実施例ＩＩを参照）４２３個の新規ＤＮＡメチル化マーカーを列挙して説明している。
特定の態様では、本技術は、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）などのがんを特定、判定、及び／または分類するための組成物及び方法を提供する。本方法は、対象から単離された生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部組織）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の少なくとも１つのメチル化マーカーのメチル化状態を決定することを含み、マーカーのメチル化状態の変化は、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）の存在、クラス、または部位を示す。特定の実施形態は、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ、及び／または子宮頸前癌を診断（例えば、スクリーニング）するため、または子宮頸癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜癌及び卵巣癌）から判別するために使用されるメチル化可変領域（ＤＭＲ、例えば、ＤＭＲ１～４２３、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸを参照）を含むマーカーに関する。
本技術の特定の実施形態では、以下のステップ、すなわち、
１）対象から得られた生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を、１つ以上のメチル化マーカー内のメチル化されたジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧジヌクレオチド）と非メチル化ジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させるステップと、
２）子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）を検出するか、または子宮頸癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜癌及び卵巣癌）から判別する（例えば、８０％以上の感度及び８０％以上の特異性が与えられる）ステップと、を含む方法が提供される。
本技術の特定の実施形態では、以下のステップ、すなわち、
１）ヒト個体の生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の１つ以上の遺伝子またはメチル化マーカーのメチル化レベルを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で前記生体試料中のゲノムＤＮＡを処理することにより測定するステップと、
２）前記選択された１つ以上の遺伝子またはメチル化されたマーカーに対するプライマーのセットを使用して、前記処理されたゲノムＤＮＡを増幅するステップと、
３）前記１つ以上の遺伝子またはメチル化されたマーカーのメチル化レベルを決定するステップと、を含む方法が提供される。
本技術の特定の実施形態では、以下のステップ、すなわち、
１）生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）由来のＤＮＡ中の１つ以上のメチル化されたマーカー遺伝子の量を測定するステップと、
２）前記ＤＮＡ中の少なくとも１つの参照マーカーの量を測定するステップと、
３）前記ＤＮＡ中で測定された前記少なくとも１つのメチル化されたマーカー遺伝子の量の値を、前記ＤＮＡ中で測定された前記参照マーカー遺伝子の量のパーセンテージとして計算するステップであって、前記値が、前記生体試料中で測定された前記少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量を示す、前記ステップと、を含む方法が提供される。
本技術の特定の実施形態では、以下のステップ、すなわち、
１）ヒト個体の生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬である亜硫酸水素塩で前記生体試料中のゲノムＤＮＡを処理することにより測定するステップと、
２）前記選択された１つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、前記修飾されたゲノムＤＮＡを増幅するステップと、
３）前記選択された１つ以上の遺伝子の前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを決定するステップと、を含む方法が提供される。
特定の実施形態では、本技術は、生体試料を特徴付けるための方法であって、
（ａ）ヒト個体の生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを、亜硫酸水素塩で前記生体試料中のゲノムＤＮＡを処理することにより測定することとと、前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを決定することと、
（ｂ）前記１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを、子宮頸癌のないコントロール試料中の対応する遺伝子のセットのメチル化レベルと比較することと、
（ｃ）前記１つ以上の遺伝子で測定されたメチル化レベルが、前記それぞれのコントロール試料中で測定されたメチル化レベルよりも高い場合に、前記個体が、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）を有すると判定することと、を含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態では、本技術は、生体試料中の子宮頸癌を他の種類の婦人科癌（例えば、子宮内膜癌及び卵巣癌）から判別するための方法であって、
（ａ）ヒト個体の生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の１つ以上の遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化レベルを、亜硫酸水素塩で前記生体試料中のゲノムＤＮＡを処理することにより測定することとと、前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを決定することと、
（ｂ）前記１つ以上の遺伝子の前記メチル化レベルを、子宮内膜癌試料及び／または卵巣癌試料中の対応する遺伝子のセットのメチル化レベルと比較することと、
（ｃ）前記１つ以上の遺伝子中で測定されたメチル化レベルが前記それぞれの子宮内膜癌試料及び／または卵巣癌試料中で測定されたメチル化レベルよりも高い場合に、前記個体が子宮頸癌を有すると判定すること、を含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態では、本技術は、対象から得られた生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）をスクリーニングする方法であって、
１）１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすることと、
２）前記マーカーの前記メチル化状態が、子宮頸癌を有さない対象でアッセイされた前記マーカーのメチル化状態と異なる場合に、前記対象を、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ（例えば、子宮頸部腺癌、子宮頸部扁平上皮癌）、及び／または子宮頸癌前癌（例えば、子宮頸部関連上皮内腺癌、子宮頸部上皮内腫瘍）を有するものとして特定することと、を含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態では、本技術は、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）を特徴付けるための方法であって、前記生体試料から抽出されたＤＮＡ中の１つ以上のメチル化されたマーカーの量を測定することと、前記生体試料中のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することと、前記亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡを、各マーカー遺伝子のＣｐＧ部位に対して特異的なプライマーを使用して増幅することであって、前記各マーカー遺伝子に対して特異的な前記プライマーが、前記マーカー遺伝子に対するプライマー配列（例えば、表Ｖ及び／またはＸＩＩに記載されるプライマー）が結合するアンプリコンに結合することができ、前記マーカー遺伝子に対する前記プライマー配列が結合する前記アンプリコンが、表Ｉ、ＩＩＩ、及び／またはＸに記載される前記メチル化されたマーカー遺伝子の遺伝子領域の少なくとも一部である、前記増幅することと、１つ以上の遺伝子の前記ＣｐＧ部位の前記メチル化レベルを決定することと、を含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態では、本技術は、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）から抽出されたＤＮＡ中の１つ以上のメチル化されたマーカー遺伝子のメチル化レベルを、がんを有することが疑われるかまたはがんを有するヒト個体の生体試料からゲノムＤＮＡを抽出することにより測定することと、前記抽出されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することと、前記亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡを前記１つ以上の遺伝子に対して特異的なプライマーで増幅することであって、前記１つ以上の遺伝子に対して特異的なプライマーが、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載される前記マーカーの染色体領域において前記亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡの少なくとも一部に結合することができる、前記増幅することと、１つ以上のメチル化されたマーカー遺伝子のメチル化レベルを測定することと、を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本技術は、１つ以上の染色体異常に関与する１つ以上の遺伝子座を分析するうえで有用なＤＮＡ画分を、ヒト個体の生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）から調製するための方法であって、
（ａ）ヒト個体の生体試料からゲノムＤＮＡを抽出することと、
（ｂ）
（ｉ）前記抽出されたゲノムＤＮＡを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で処理することと、
（ｉｉ）１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な別々のプライマーを使用して前記亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡを増幅することと、
によって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの画分を生成することと、
（ｃ）前記１つ以上のメチル化マーカーのそれぞれの前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定することによって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの前記生成された画分中の１つ以上の遺伝子座を分析することと、を含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態では、本技術は、１つ以上の染色体異常に関与する１つ以上のＤＮＡフラグメントを分析するうえで有用なＤＮＡ画分を、ヒト個体の生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）から調製するための方法であって、
（ａ）ヒト個体の生体試料からゲノムＤＮＡを抽出することと、
（ｂ）
（ｉ）前記抽出されたゲノムＤＮＡを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で処理することと、
（ｉｉ）１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な別々のプライマーを使用して前記亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡを増幅することと、
によって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの画分を生成することと、
（ｃ）前記１つ以上のメチル化マーカーのそれぞれの前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定することによって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの前記生成された画分中の１つ以上のＤＮＡフラグメントを分析することと、を含む、前記方法を提供する。
好ましくは、そのような方法の感度は、約７０％～約１００％、または約８０％～約９０％、または約８０％～約８５％である。好ましくは、特異性は、約７０％～約１００％、または約８０％～約９０％、または約８０％～約８５％である。
このような方法は、特定のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるＤＭＲ１～４２３からなる群から選択されるＤＭＲ中の塩基を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、表Ｉ及び／またはＩＩＩから選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５（実施例Ｉ）から選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＺＮＦ７７３、ＮＥＵＲＯＧ３、ＡＳＣＬ１、ＮＩＤ２、ＺＮＦ７８１、ＣＲＨＲ２、及びＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８（表ＶＩ及び実施例Ｉを参照）から選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、Ｃ２ｏｒｆ４０、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、ＫＣＮＱ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＰＲＤＭ１２、ＳＬＣ９Ａ３、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１（表ＶＩＩ、実施例Ｉ）から選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８ （表ＶＩＩＩ、実施例Ｉを参照）から選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、表Ｘから選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーは、ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１（表Ｘ及びＸＩ、実施例ＩＩ）から選択される。
このような方法は、特定の試料または生体試料の種類に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、生体試料は、組織試料（例えば、子宮頸部組織）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料である。
さまざまながん（例えば、子宮頸癌及び子宮頸癌のサブタイプ）及び前がん（例えば、子宮頸癌前癌）が、例えば、特異性及び予測の感度に関する統計的手法によって特定されるように、マーカーのさまざまな組み合わせによって予測される。本技術は、いくつかのがんに関する予測組み合わせ及び検証された予測組み合わせを同定するための方法をさらに提供する。
このような方法は、対象の種類に限定されない。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
このような方法は、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーのメチル化の特徴付け、測定、またはアッセイを決定するための特定の方法または技術に限定されない。いくつかの実施形態では、そのような技法は、ＤＭＲを含む少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基のメチル化状態（例えば、ＣｐＧのメチル化状態）の分析に基づく。
いくつかの実施形態では、試料中のメチルマーカーのメチル化状態を測定することは、１塩基のメチル化状態を決定することを含む。いくつかの実施形態では、試料中のマーカーのメチル化状態を測定することは、複数の塩基におけるメチル化の程度を決定することを含む。さらに、いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態に対するマーカーのメチル化の増加を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態に対するマーカーのメチル化の減少を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と比較したマーカーのメチル化の異なるパターンを含む。
さらに、いくつかの実施形態において、このマーカーは、１００以下の塩基の１領域である、このマーカーは、５００以下の塩基の１領域である、このマーカーは、１０００以下の塩基の１領域である、このマーカーは、５０００以下の塩基の１領域である、またはいくつかの実施形態において、このマーカーは、１塩基である。いくつかの実施形態において、このマーカーは、高いＣｐＧ密度のプロモーター中にある。
特定の実施形態では、５－メチルシトシンの存在について核酸を分析する方法は、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬によるＤＮＡの処理を含む。そのような試薬の例としては、これらに限定されるものではないが、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、亜硫酸水素塩試薬、ＴＥＴ酵素、及びボラン還元剤が挙げられる。
５－メチルシトシンの存在について核酸を分析するために頻繁に使用される方法は、ＤＮＡ中の５ーメチルシトシンの検出（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－３１、その全体があらゆる目的のために参照より本明細書に明示的に組み込まれる）またはそれらの多様性の検出に関する、Ｆｒｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．によって記載されている亜硫酸水素塩法に基づく。５－メチルシトシンをマッピングする亜硫酸水素塩法は、シトシンが亜硫酸水素イオン（亜硫酸水素塩としても知られる）と反応する（ただし５－メチルシトシンは反応しない）という知見に基づく。この反応をつぎのステップに従い通常実施する。第一に、シトシンは、亜硫酸水素塩と反応し、スルホン化されたシトシンを形成する。つぎに、スルホン化反応中間体の自発的脱アミノ化は、スルホン化されたウラシルをもたらす。最後に、スルホン化ウラシルが、アルカリ条件下で脱スルホン化され、ウラシルを形成する。ウラシルがアデニンと塩基対合する（このため、チミンのように挙動する）のに対して、５－メチルシトシンはグアニンと塩基対合する（したがって、シトシンのように挙動する）ことから、検出が可能である。これにより、例えば、亜硫酸水素塩ゲノムシークエンシング（Ｇｒｉｇｇ Ｇ，＆ Ｃｌａｒｋ Ｓ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ （１９９４） １６：４３１－３６；Ｇｒｉｇｇ Ｇ，ＤＮＡ Ｓｅｑ．（１９９６）６：１８９－９８）、米国特許第５，７８６，１４６号に開示されるようなメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、または例えばＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼアッセイ（例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０） “Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：Ａ１９９；ならびに米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号を参照）などの配列特異的切断を含むアッセイを使用して、メチル化シトシンを非メチル化シトシンから判別することが可能となる。
いくつかの従来の技術は、アガロースマトリックス中に分析されるＤＮＡを封入することにより、ＤＮＡの拡散及び再生を妨げる（亜硫酸水素塩は一本鎖ＤＮＡのみと反応する）ことと、沈殿及び精製ステップを高速透析に置き換えることと、を含む方法に関する（Ｏｌｅｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６） “Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０６４－６）。したがって、メチル化状況について個々の細胞を分析し、方法の有用性及び感度を示すことが可能である。５－メチルシトシンを検出するための従来の方法の概要は、Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２２５５により提供される。
亜硫酸水素塩法では、一般的に、亜硫酸水素塩処理に続いて、既知の核酸の短い、特定のフラグメントを増幅し、その後、シーケンシングによる生成物のアッセイ（Ｏｌｅｋ ＆ Ｗａｌｔｅｒ（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１７：２７５－６）またはプライマー伸長反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ２５２９－３１；ＷＯ ９５／００６６９；米国特許第６，２５１，５９４）を行って個々のシトシン位置を分析する。いくつかの方法は、酵素消化を使用する（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－４）。またハイブリダイゼーションによる検出は、当該技術分野において記載されている（Ｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９９／２８４９８）。さらに、個々の遺伝子に関するメチル化検出のための亜硫酸水素塩技術の使用が記載されている（Ｇｒｉｇｇ ＆ Ｃｌａｒｋ（１９９４）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １６：４３１－６；Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．６：３８７－９５；Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２： ６９５；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５７：２６１－４；ＷＯ９７４６７０５；ＷＯ９５１５３７３）。
さまざまなメチル化アッセイ手法を、本発明の技術に従う亜硫酸水素塩処理と併用することができる。これらのアッセイは、核酸配列内の１つの、または複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧアイランド）のメチル化状態の決定を可能にする。このようなアッセイは、他の技法の中でも、亜硫酸水素塩処理された核酸のシーケンシング、ＰＣＲ（配列特異的増幅のため）、サザンブロット分析、及びメチル化特異的酵素、例えば、メチル化感受性またはメチル化依存型酵素の使用を伴う。
例えば、ゲノムシーケンシングは、亜硫酸水素塩処置を使用することによって、メチル化パターン及び５ーメチルシトシン分布の分析のために単純化されている（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１）。さらに、亜硫酸水素塩変換されたＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化を、例えば、Ｓａｄｒｉ ＆ Ｈｏｒｎｓｂｙ （１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８－５０５９に記載されるように、またはＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ （１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４）として知られる方法で実現されているように、メチル化状態の評価に使用することができる。
ＣＯＢＲＡ（商標）分析は、少量のゲノムＤＮＡ中の特異的遺伝子座にＤＮＡメチル化レベルを決定するために有用な定量的メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４，１９９７）。簡潔に、制限酵素消化を使用して、亜硫酸水素ナトリウムに処置されたＤＮＡのＰＣＲ生成物におけるメチル化依存性配列の差異を明らかにする。メチル化依存性配列の差異は、Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１，１９９２）により記載される手法に従い標準亜硫酸水素塩処置によってゲノムＤＮＡに最初に導入される。対象となるＣｐＧアイランドに特異的なプライマーを使用して、つぎに亜硫酸水素塩に変換されるＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施した後に、制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動法、及び特異的にラベル付けされたハイブリダイゼーションプローブを伴う。元のＤＮＡ試料中のメチル化レベルは、ＤＮＡメチル化レベルの広範囲にわたる直線的な定量手法で、消化されたＰＣＲ産物及び未消化のＰＣＲ産物の相対量によって表される。加えて、この手法は、顕微解剖されたパラフィンに包埋された組織試料から得られるＤＮＡに確実に適用されることが可能である。
ＣＯＢＲＡ（商標）分析用の一般的な試薬（例えば、一般的なＣＯＢＲＡ（商標）ベースのキットにみられるような）としては、これらに限定されるものではないが、特異的遺伝子座（例えば、特異的遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）についてのＰＣＲプライマー；制限酵素及び適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド；コントロールハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドプローブ用のキナーゼラベル付けキット；及びラベル付けヌクレオチドが挙げられる。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回復試薬またはキット（例えば、沈殿、限外ろ過、親和性カラム）；脱スルホン化緩衝液；及びＤＮＡ回復成分を含むことができる。
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」（蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ 技術）（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）、Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１，１９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」；Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６；米国特許第５，７８６，１４６号）及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」；Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２，１９９９）などのアッセイが、単独で、またはこれらの方法の１つ以上と組み合わせて使用される。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイ、技法は、亜硫酸水素塩に処置されたＤＮＡのメチル化特異性増幅に基づきメチル化の差異を評価する定量的な方法である。増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、または増幅プライマーによりカバーされるメチル化特異的阻害プローブ（「阻害剤」）は、拡散試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという用語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指し、これはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形であり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイが、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされる。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイはまた、メチル化特異的増幅プライマーと組み合わせて使用することができる。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキットに見られるような）としては、これらに限定されるものではないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド、または亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；ブロッキングオリゴヌクレオチド；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼが挙げられる。
ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）により、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位の実質的に任意の群のメチル化状況を評価することができる（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６、米国特許第５，７８６，１４６号）。簡潔に、ＤＮＡは、メチル化されたシトシンではなく、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換する、亜硫酸水素ナトリウムによって修飾された後に、これらの生成物は、メチル化されたＤＮＡ対メチル化されていないＤＮＡに特異的なプライマーによって増幅される。ＭＳＰは、少量のＤＮＡのみを必要とし、所与のＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化対立遺伝子に対して感受性があり、パラフィン包埋試料から抽出されたＤＮＡで実施することができる。ＭＳＰ分析用の一般的な試薬（例えば、一般的なＭＳＰに基づくキットに見られるような）としては、これらに限定されるものではないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するメチル化されたＰＣＲプライマー及びメチル化されていないＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ならびに特異的プローブが挙げられる。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、高スループット定量的メチル化アッセイであり、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を利用し、ＰＣＲステップ後にさらなる操作を必要としない（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）。簡潔に、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、亜硫酸水素ナトリウム反応において、標準手法に従いメチル化依存性配列の差異の混合されたプールに変換されるゲノムＤＮＡの混合された試料により開始する（亜硫酸水素塩プロセスはメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換する）。次いで、蛍光ベースのＰＣＲは、例えば、既知のＣｐＧジヌクレオチドにオーバーラップするＰＣＲプライマーを用いて「偏った」反応で実施される。配列判別は、増幅プロセスのレベル、及び蛍光検知プロセスのレベルの両方に起こる。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンについての定量的試験として使用され、その中で配列判別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。定量版では、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位にオーバーラップする蛍光プローブの存在下でメチル化特異的増幅がもたらされる。インプットＤＮＡ量に偏りのないコントロールは、プライマーもプローブも一切のＣｐＧジヌクレオチドに重なることのない反応によってもたらされる。代替に、ゲノムメチル化についての定量的試験は、既知のメチル化部位をカバーしないコントロールオリゴヌクレオチド（例えば、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技法の蛍光に基づくバージョン）、または潜在的メチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれか一方によって、偏ったＰＣＲプールを探索することにより達成される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、任意の適当なプローブ（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ）とともに使用される。例えばいくつかの用途において、二本鎖ゲノムＤＮＡは、亜硫酸水素ナトリウムで処理され、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＭＳＰプライマーと、及び／またはＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ阻害剤オリゴヌクレオチド及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用する、ＰＣＲ反応の２セットのうちの１セットに供される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「リポーター」及び「クエンチャー」分子によって二重ラベル付けされ、相対的にＧＣ含有量の多い領域に特異的であるように設計されるため、それは、順方向プライマーまたは逆方向プライマーより高い温度の約１０℃でＰＣＲサイクル中に融解する。これにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中に完全にハイブリダイズしたままにすることが可能である。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新規鎖を酵素的に合成するため、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに最終的に達することになる。つぎにＴａｑポリメラーゼ５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化することによってこのプローブを置換し、ここでそのクエンチされていないシグナルの定量的検知のために、リアルタイム蛍光検知システムを使用して蛍光レポーター分子を放出させる。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）分析用の一般的な試薬（例えば、一般的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）に基づくキットに見られるような）としては、これらに限定されるものではないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼが挙げられる。
ＱＭ（商標）（定量的メチル化）アッセイは、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンについての代替の定量的試験であり、その中で配列判別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量版では、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位にオーバーラップする蛍光プローブの存在下で偏りのない増幅がもたらされる。インプットＤＮＡ量に偏りのないコントロールは、プライマーもプローブも一切のＣｐＧジヌクレオチドに重なることのない反応によってもたらされる。代替に、ゲノムメチル化についての定量的試験は、既知のメチル化部位を網羅しないコントロールオリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技法の蛍光に基づくバージョン）、または潜在的メチル化部位を網羅するオリゴヌクレオチドのいずれか一方によって、偏ったＰＣＲプールを探索することにより達成される。
ＱＭ（商標）プロセスは、増幅プロセスにおいて、いずれかの適切なプローブ、例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブなどによって使用されることが可能である。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡは、亜硫酸水素ナトリウムによって処置され、偏っていないプライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを受ける。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「リポーター」及び「クエンチャー」分子によって二重ラベル付けされ、相対的にＧＣ含有量の多い領域に特異的であるように設計されるため、それは、順方向プライマーまたは逆方向プライマーより高い温度の約１０℃でＰＣＲサイクル中に融解する。これにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中に完全にハイブリダイズしたままにすることが可能である。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新規鎖を酵素的に合成するため、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに最終的に達することになる。つぎにＴａｑポリメラーゼ５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを消化することによってこのプローブを置換し、ここでそのクエンチされていないシグナルの定量的検知のために、リアルタイム蛍光検知システムを使用して蛍光レポーター分子を放出させる。ＱＭ（商標）分析用の一般的な試薬（例えば、一般的なＱＭ（商標）に基づくキットに見られるような）としては、これらに限定されるものではないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）に対するＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼが挙げられる。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）技法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処置に基づき特異的ＣｐＧ部位におけるメチル化の差異を評価した後、一塩基プライマー伸長を伴う定量的方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：２５２９－２５３１，１９９７）。簡潔に、５－メチルシトシンを変化させないままで、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させ、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換する。つぎに亜硫酸水素塩に変換されたＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して、所望の標的配列の増幅を実施し、得られた生成物を単離して、対象となるＣｐＧ部位におけるメチル化分析についての鋳型として使用する。少量のＤＮＡを分析することができ（例えば、顕微解剖病理切片）、これによりＣｐＧ部位でメチル化状況を判定するための制限酵素の利用が回避される。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）分析用の一般的な試薬（例えば、一般的な Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）に基づくキットに見られるような）としては、これらに限定されるものではないが、特定の遺伝子座に対するＰＣＲプライマー（例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩に処置されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性コントロールプライマー；特定の遺伝子座に対するＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー；反応バッファー（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ反応用の）；ならびにラベル付けされたヌクレオチドが挙げられる。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回復試薬またはキット（例えば、沈殿、限外ろ過、親和性カラム）；脱スルホン化緩衝液；及びＤＮＡ回復成分を含むことができる。
減少表現亜硫酸水素塩シーケンシング（ＲＲＢＳ）は、核酸の亜硫酸水素塩処置によって開始し、すべてのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換した後に、制限酵素消化（例えば、ＭｓｐｌなどのＣＧ配列を含む部位を認識する酵素による）を伴い、アダプターリガンドにカップリングした後にフラグメントの配列決定を完了する。制限酵素の選択により、ＣｐＧ高密度領域の断片が濃縮され、分析中に複数の遺伝子位置にマッピングされる可能性のある冗長配列の数が低減される。このようなものとして、ＲＲＢＳは、シーケンシングについての１サブセットの制限フラグメントを選択することによって（例えば、調製用ゲル電気泳動を使用するサイズ選択によって）、核酸試料の複雑性を減少させる。全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシングに対抗して、制限酵素消化によって生成されたすべてのフラグメントは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドについてのＤＮＡメチル化情報を含む。このようなものとして、ＲＲＢＳは、プロモーター、ＣｐＧアイランド、及び高頻度でこれらの領域中の制限酵素切断部位の他のゲノム特徴について試料を濃縮させるので、１つ以上のゲノム遺伝子座のメチル化状態を評価するアッセイを提供する。
ＲＲＢＳについての典型的なプロトコルは、ＭｓｐＩなどの制限酵素によって核酸試料を消化させるステップ、オーバーハング及びＡテーリングに充填させるステップ、アダプターの連結ステップ、亜硫酸水素塩変換ステップ、ならびにＰＣＲステップを備える。例えば、（２００５）“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１３３－６；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５） “Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３： ５８６８－７７を参照。
いくつかの実施形態において、定量的アレル特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅（ＱｕＡＲＴＳ）アッセイを使用して、メチル化状態を評価する。各ＱｕＡＲＴＳアッセイでは３つの反応が連続して生じ、一次反応には増幅（反応１）及び標的プローブ切断（反応２）が、二次反応にはＦＲＥＴ切断及び蛍光シグナル生成（反応３）が含まれる。標的核酸が特定のプライマーで増幅される場合、フラップ配列を有する特定の検出プローブが、アンプリコンに緩く結合する。標的結合部位における特異的侵襲性オリゴヌクレオチドの存在は、５’ヌクレアーゼ、例えばＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼに、検出プローブとフラップ配列との間で切断することにより、フラップ配列を放出させる。フラップ配列は、対応するＦＲＥＴカセットの非ヘアピン部分に相補的である。したがって、フラップ配列は、ＦＲＥＴカセット上で侵入オリゴヌクレオチドとして機能し、ＦＲＥＴカセットフルオロフォアとクエンチャーとの間に切断をもたらし、蛍光シグナルを生成する。切断反応は、標的ごとに複数のプローブを切断することができ、それによりフラップごとに複数のフルオロフォアを放出して指数関数的なシグナル増幅をもたらす。ＱｕＡＲＴＳは、異なる色素を含むＦＲＥＴカセットを使用することによって、単一反応ウェルにおいて複数の標的を検出することが可能である。例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：Ａ１９９）、ならびに、あらゆる目的で本明細書に参照によりそれぞれを援用するところの米国特許第８，３６１，７２０号、同第８，７１５，９３７号、同第８，９１６，３４４号、及び同第９，２１２，３９２号を参照されたい。
「亜硫酸水素塩試薬」という用語は、本明細書に開示されるように、メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを区別するのに有用な、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｔｅ）、またはそれらの組み合わせを含む試薬を指す。前記処理の方法は、当該技術分野で既知である（例えば、各々が、その全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５及びＷＯ２０１３／１１６３７５）。いくつかの実施形態において、亜硫酸水素塩処理は、限定するものではないが、ｎ－アルキレングリコールもしくはジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などの変性溶媒の存在下、またはジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で行われる。いくつかの実施形態において、変性溶媒は、１％～３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。いくつかの実施形態において、亜硫酸水素塩反応は、限定するものではないが、クロマン誘導体、例えば、６－ヒドロキシ－２，５，７，８、－テトラメチルクロマン２－カルボン酸またはトリヒドロキシベンゾン酸等のスカベンジャー、及びそれらの誘導体、例えば、ガリン酸の存在下で行われる（本明細書に参照によりその全容を援用するＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照）。特定の好ましい実施形態では、亜硫酸水素塩反応は、例えば、ＷＯ２０１３／１１６３７５に記載の通りに、亜硫酸水素アンモニウムによる処理を含む。
いくつかの実施形態では、処理されたＤＮＡの断片は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドのセット（例えば、表Ｖ及びＶＩＩを参照されたい）ならびに増幅酵素を使用して増幅される。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅を１つの反応容器、及び同一の反応容器中で同時に実施することが可能である。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施される。アンプリコンは、通常１００～２０００塩基対長である。
本方法の別の実施形態では、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１～４２３、表Ｉ、ＩＩＩ及び表Ｘ）を含むマーカー内の、またはその近傍のＣｐＧ位置のメチル化状態は、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドを使用して検出することができる。この技術（ＭＳＰ）は、Ｈｅｒｍａｎの米国特許第６，２６５，１７１号に記載されている。亜硫酸水素塩に処置されたＤＮＡの増幅のためのメチル化状態特異的プライマーの使用は、メチル化された核酸とメチル化されていない核酸との間の分化を可能にする。ＭＳＰプライマー対は、亜硫酸水素塩に処置されたＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、該プライマーの配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。メチル化されていないＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧ中のＣ位の位置に「Ｔ」を含む。
このような方法は、１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカーに関連する特定のタイプまたは種類のプライマーまたはプライマーペアに限定されない。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプライマーペアは表Ｖ（配列番号１～７６）に記載されている。いくつかの実施形態では、各メチル化マーカー遺伝子に特異的なプライマーまたはプライマーペアは、表Ｖ及びＸＩＩに記載されるマーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンに結合することができ、ここで、表Ｖ及びＸＩＩに記載されるマーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載されるメチル化マーカーの遺伝子領域の少なくとも一部である。いくつかの実施形態では、メチル化マーカーに対するプライマーまたはプライマーペアは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載される特定のメチル化マーカーの染色体座標を含む遺伝子領域の少なくとも一部に特異的に結合するプライマーのセットである。
別の実施形態では、本発明は、無細胞ＤＮＡの酸化型５－メチルシトシン残基をジヒドロウラシル残基に変換するための方法を提供する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７，ｐｐ．４２４－４２９；米国特許出願公開第２０２０００３７０１１４号を参照）。この方法は、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシメチルシトシン（５ｃａＣ）、及びそれらの組み合わせから選択される酸化型５ｍＣ残基とボラン還元剤との反応を含む。酸化型５ｍＣ残基は、天然に存在するか、またはより典型的には、５ｍＣまたは５ｈｍＣ残基の事前の酸化、例えば、ＴＥＴファミリーの酵素（例えば、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、またはＴＥＴ３）による５ｍＣまたは５ｈｍＣの酸化、または例えば、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）またはペルオキソタングステン酸塩などの無機ペルオキソ化合物または組成物及び過塩素酸銅（ＩＩ）／２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）の組み合わせ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１７） Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５３ ：５７５６－５９を参照）を用いた、５ｍＣまたは５ｈｍＣの化学的酸化（例えば、Ｏｋａｍａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４７ ：１１２３１－３３を参照）の結果として生じるものであってよい。
ボラン還元剤は、ボランと、窒素複素環及び第三級アミンから選択される窒素含有化合物との錯体として特徴付けることができる。窒素複素環は、単環式、二環式、または多環式であり得るが、典型的には、窒素ヘテロ原子と、場合によりＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上の追加のヘテロ原子とを含む５員環または６員環の形態の単環式である。窒素複素環は芳香族であっても脂環族であってもよい。本明細書における好ましい窒素複素環としては、２－ピロリン、２Ｈ－ピロール、１Ｈ－ピロール、ピラゾリジン、イミダゾリジン、２－ピラゾリン、２－イミダゾリン、ピラゾール、イミダゾール、１，２，４－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、１，２，４－トリアジン、及び１，３，５－トリアジンが挙げられ、それらのいずれも非置換であるかまたは１つ以上の非水素置換基で置換されていてよい。典型的な非水素置換基は、アルキル基、特にメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチルなどの低級アルキル基である。例示的な化合物としては、ピリジンボラン、２－メチルピリジンボラン（２－ピコリンボランとも呼ばれる）、及び５－エチル－２－ピリジンが挙げられる。
ボラン還元剤と無細胞ＤＮＡの酸化型５ｍＣ残基との反応は、無毒性の試薬と穏やかな反応条件を用いることができる限り有利であり、硫酸水素塩も、ＤＮＡを分解する可能性のある他の試薬も必要としない。さらに、ボラン還元剤による酸化型５ｍＣ残基のジヒドロロウラシルへの変換は、中間体の単離を必要とせずに、「ワンポット」または「ワンチューブ」反応で行うことができる。このことは、この変換には複数のステップ、すなわち、（１）酸化型５ｍＣのＣ－４とＣ－５をつなぐアルケン結合の還元、（２）脱アミノ化、及び（３）酸化型５ｍＣが５ｃａＣである場合は脱炭酸、酸化型５ｍＣが５ｆＣである場合は脱ホルミル化のいずれかが含まれることから、極めて重要である。
無細胞ＤＮＡ中の酸化型５－メチルシトシン残基をジヒドロウラシル残基に変換する方法に加えて、本発明はまた、前述の方法に関連する反応混合物も提供する。反応混合物は、５ｃａＣ、５ｆＣ、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酸化型５－メチルシトシン残基を含む無細胞ＤＮＡの試料と、少なくとも１つの酸化型５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、及び脱炭酸または脱ホルミル化するうえで効果的なボラン還元剤と、を含む。上記に説明したように、ボラン還元剤は、ボランと、窒素複素環及び第三級アミンから選択される窒素含有化合物との錯体である。好ましい実施形態では、反応混合物は実質的に亜硫酸水素塩を含まず、これは亜硫酸水素イオン及び亜硫酸水素塩を実質的に含まないことを意味する。理想的には、反応混合物には亜硫酸水素塩は含まれない。
本発明の関連する態様では、無細胞ＤＮＡ中の５ｍＣ残基をジヒドロウラシル残基に変換するためのキットが提供され、キットは、５ｈｍＣ残基をブロックするための試薬、５ｍＣ残基をヒドロキシメチル化を超えて酸化して酸化型５ｍＣ残基を与えるための試薬、及び、酸化型５ｍＣ残基を還元、脱アミノ化、及び脱炭酸または脱ホルミル化するうえで効果的なボラン還元剤を含む。キットはまた、上記の方法を実施するための構成要素を使用するための説明書を含んでもよい。
別の実施形態では、上記の酸化反応を利用する方法が提供される。この方法は、無細胞ＤＮＡ中の５－メチルシトシン残基の存在と位置を検出することを可能とし、以下のステップを含む：
（ａ）フラグメント化され、アダプターがライゲートされた無細胞ＤＮＡ中の５ｈｍＣ残基を修飾して、残基にアフィニティータグを与えるステップであって、アフィニティータグは、無細胞ＤＮＡからの修飾された５ｈｍＣ含有ＤＮＡの除去を可能にする、ステップと、
（ｂ）修飾された５ｈｍＣ含有ＤＮＡを無細胞ＤＮＡから除去し、非修飾の５ｍＣ残基を含むＤＮＡを残すステップと、
（ｃ）非修飾の５ｍＣ残基を酸化して、５ｃａＣ、５ｆＣ、及びそれらの組み合わせから選択される酸化型５ｍＣ残基を含むＤＮＡを得るステップと、
（ｄ）酸化型５ｍＣ残基を含むＤＮＡを、酸化型５ｍＣ残基を還元、脱アミノ化、及び脱炭酸または脱ホルミル化するうえで有効なボラン還元剤と接触させ、それによって酸化型５ｍＣ残基の代わりにジヒドロウラシル残基を含むＤＮＡを与えるステップと、
（ｅ）ジヒドロウラシル残基を含むＤＮＡを増幅し、配列決定するステップと、
（ｆ）（ｅ）の配列決定の結果から５－メチル化のパターンを決定するステップ。
別の実施形態では、標的核酸中の５－メチルシトシン（５ｍＣ）または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を特定するための方法であって、以下のステップを含む方法が提供される：
標的核酸を含む生体試料を与えるステップと、
標的核酸を修飾するステップであって、
核酸試料をＴＥＴ酵素と接触させて１つ以上の５ｃａＣまたは５ｆＣ残基を生成させることにより、核酸試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換するステップと、
標的核酸をボラン還元剤で処理することによって５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロロウラシル（ＤＨＵ）に変換して、修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を与えるステップと、を含む、前記標的核酸を修飾するステップと、
修飾標的核酸の配列を検出するステップであって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列中のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化またはシトシン（Ｃ）からＤＨＵへの変化が、標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣの位置を与える、ステップ。
いくつかの実施形態では、ボラン還元剤は２－ピコリンボランである。
いくつかの実施形態では、修飾標的核酸の配列を検出するステップは、チェーンターミネーションシークエンシング、マイクロアレイ、ハイスループットシークエンシング、及び制限酵素分析のうちの１つ以上のものを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＥＴ酵素は、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２、及びＴＥＴ３；マウスＴｅｔ１、Ｔｅｔ２、及びＴｅｔ３。ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）；ならびにＣｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（ＣｃＴＥＴ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の修飾シトシンをブロックするステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ブロックするステップは、５ｈｍＣに糖を付加することを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の核酸配列のコピー数を増幅するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、酸化剤は、過ルテニウム酸カリウムまたはＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル）である。
無細胞ＤＮＡは対象の身体試料から抽出され、身体試料は通常、全血、血漿、または血清、最も一般的には血漿であるが、試料は組織（例えば、子宮頸部組織）、分泌物（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物、ＣＳＦ、尿、唾液、粘膜排泄物、痰、便、または涙液であってもよい。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは腫瘍に由来する。他の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、疾患または他の病的状態を有する患者に由来する。無細胞ＤＮＡは腫瘍に由来するものでもしないものでもよい。ステップ（ａ）では、５ｈｍＣ残基が修飾される無細胞ＤＮＡは精製され、フラグメント化された形態であり、アダプターがライゲートされている点に留意されたい。この関連でのＤＮＡ精製は、当業者には周知の、及び／または関連文献に記載されている任意の適切な方法を使用して行うことができ、無細胞ＤＮＡ自体は高度にフラグメント化されていてもよいが、例えば、米国特許公開第２０１７／０２５３９２４号に記載されるように、場合によってはさらなるフラグメント化が望ましい場合もある。無細胞ＤＮＡフラグメントは、一般に、約２０ヌクレオチド～約５００ヌクレオチドのサイズ範囲であり、より典型的には、約２０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチドの範囲である。ステップ（ａ）で修飾された精製された無細胞ＤＮＡフラグメントは、フラグメントが各３’及び５‘末端に平滑末端を有するように、従来の手段（例えば、制限酵素）を使用して末端修復されている。好ましい方法では、ＷＯ２０１７／１７６６３０に記載されるように、平滑末端処理されたフラグメントに、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼを使用して、１個のアデニン残基を含む３’オーバーハングが付与される。これにより、選択されたユニバーサルアダプター、すなわち、無細胞ＤＮＡ断片の両端にライゲートされる、少なくとも１つの分子バーコードを含むＹアダプターまたはヘアピンアダプターなどのアダプターのその後のライゲーションが容易となる。アダプターの使用により、アダプターがライゲートされたＤＮＡフラグメントの選択的ＰＣＲ濃縮も可能となる。
したがって、ステップ（ａ）において、「精製されたフラグメント化された無細胞ＤＮＡ」は、アダプターがライゲートされたＤＮＡフラグメントを含む。これらの無細胞ＤＮＡフラグメントの５ｈｍＣ残基のアフィニティータグによる修飾は、ステップ（ａ）に記載したように、その後の無細胞ＤＮＡからの修飾５ｈｍＣ含有ＤＮＡの除去を可能にするために行われる。一実施形態では、アフィニティータグは、ビオチン、デスチオビオチン、オキシビオチン、２－イミノビオチン、ジアミノビオチン、ビオチンスルホキシド、ビオシチンなどのビオチン部分を含む。アフィニティータグとしてビオチン部分を使用することで、ストレプトアビジン、例えばストレプトアビジンビーズ、磁気ストレプトアビジンビーズなどによる除去が容易となる。
ビオチン部分または他のアフィニティータグによる５ｈｍＣ残基のタグ付けは、ＤＮＡフラグメント中の５ｈｍＣ残基に化学選択基を共有結合させることによって行われ、化学選択基は、官能化されたアフィニティータグと反応してアフィニティータグを５ｈｍＣ残基に結合させることができる。一実施形態では、化学選択基はＵＤＰグルコース－６－アジドであり、アルキン官能化されたビオチン部分と１，３－環化付加反応を行う（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ４１１（１）：４０－３、米国特許第８，７４１，５６７号、及びＷＯ ２０１７／１７６６３０に記載）。したがって、アルキン官能基化ビオチン部分の付加は、各 ５ｈｍＣ残基へのビオチン部分の共有結合をもたらす。
これにより、アフィニティータグ付きＤＮＡフラグメントは、一実施形態では、ストレプトアビジンビーズ、磁気ストレプトアビジンビーズなどの形態のストレプトアビジンを使用してステップ（ｂ）で取り除くことができ、必要に応じて後の分析のために取っておくことができる。アフィニティータグ付きフラグメントを除去した後に残る上清には、非修飾の５ｍＣ残基を有し、５ｈｍＣ残基は有さないＤＮＡが含まれている。
ステップ（ｃ）では、任意の適切な手段を使用して、非修飾の５ｍＣ残基が酸化されて、５ｃａＣ残基及び／または５ｆＣ残基が得られる。酸化剤は、ヒドロキシメチル化を超えて５ｍＣ残基を酸化するように、すなわち、５ｃａＣ及び／または５ｆＣ残基を与えるように選択される。酸化は、触媒活性を有するＴＥＴファミリー酵素を使用して酵素的に行うことができる。「ＴＥＴファミリー酵素」または「ＴＥＴ酵素」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に参照によりその開示内容を援用するところの米国特許第９，１１５，３８６号に定義される触媒活性を有する「ＴＥＴファミリータンパク質」または「ＴＥＴ触媒活性フラグメント」を指す。これに関連して好ましいＴＥＴ酵素にＴＥＴ２がある（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４７）：１３００－１３０３）。酸化は、前のセクションで説明したように、化学酸化剤を使用して化学的に行うこともできる。。適切な酸化剤の例としては、これらに限定されるものではないが、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）などの過ルテニウム酸金属、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（ＴＰＡＰ）及び過ルテニウム酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＰ）などの過ルテニウム酸テトラアルキルアンモニウム、及びポリマー支持過ルテニウム酸塩（ＰＳＰ）を含む、無機または有機過ルテニウム酸塩の形態の過ルテニウム酸アニオン；ならびにペルオキソタングステン酸塩または過塩素酸銅（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯの組み合わせなどの無機ペルオキソ化合物及び組成物が挙げられる。プロセスの次のステップであるステップ（ｅ）で５ｆＣ残基と５ｃａＣ残基の両方がジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される限り、この時点で５ｆＣ含有フラグメントを５ｃａＣ含有フラグメントから分離する必要はない。
いくつかの実施形態では、５－ヒドロキシメチルシトシン残基はβ－グルコシルトランスフェラーゼ（β３ＧＴ）でブロックされ、一方、５－メチルシトシン残基は、５－ホルミルシトシンと５－カルボキシメチルシトシンの混合物を与えるうえで有効なＴＥＴ酵素で酸化される。これらの酸化型種の両方を含む混合物を２－ピコリンボランまたは別のボラン還元剤と反応させて、ジヒドロウラシルを得ることができる。この実施形態の変形例では、５ｈｍＣ含有フラグメントはステップ（ｂ）で除去されない。代わりに、「ＴＥＴ－支援ピコリンボランシークエンシング（ＴＡＰＳ）」により、５ｍＣ含有フラグメント及び５ｈｍＣ含有フラグメントが一緒に酵素的に酸化されて、５ｆＣ含有フラグメント及び５ｃａＣ含有フラグメントが得られる。２－ピコリンボランとの反応により、５ｍＣ及び５ｈｍＣ残基がもともと存在していた場所にＤＨＵ残基が生じる。「化学支援ピコリンボランシークエンシング（ＣＡＰＳ）」では、５ｈｍＣ含有フラグメントが過ルテニウム酸カリウムで選択的に酸化され、５ｍＣ残基は変化しない。
この実施形態の方法には多くの利点がある。すなわち、亜硫酸水素塩が不要であり、非毒性の試薬及び反応物質が使用され、プロセスは穏やかな条件下で進行する。さらに、プロセス全体を１本の試験管内で行うことができ、中間体を分離する必要がない。
関連する実施形態では、上記の方法は、さらなるステップとして、（ｇ）ステップ（ｂ）で無細胞ＤＮＡから除去された５ｈｍＣ含有ＤＮＡのヒドロキシメチル化パターンを特定するステップを含む。これは、ＷＯ２０１７／１７６６３０号に詳細に記載される技術を使用して行うことができる。このプロセスは、ワンチューブ法で中間体の除去または単離を行わずに行うことができる。例えば、最初に、無細胞ＤＮＡフラグメント、好ましくはアダプターをライゲートしたＤＮＡフラグメントをβＧＴ触媒ウリジンジホスホグルコース６－アジドによる官能化に供し、その後、化学選択的アジド基を介してビオチン化する。この手順により、各５ｈｍＣ部位にビオチンが共有結合する。次のステップでは、ビオチン化鎖と非修飾（天然）５ｍＣを含む鎖が同時に取り除かれ、さらなる処理が行われる。天然の５ｍＣ含有鎖は、当業者には周知であるように、抗５ｍＣ抗体またはメチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質を使用して取り除かれる。次いで、５ｈｍＣ残基をブロックした状態で、本明細書の他の箇所で説明するように、５ｍＣを５ｆＣ及び／または５ｃａＣに変換するための任意の適切な技術を使用して非修飾の５ｍＣ残基を選択的に酸化する。
増幅によって得られたこれらのフラグメントは、直接的に、または間接的に検出可能なラベルを有することができる。いくつかの実施形態において、これらのラベルは、質量分析計において検出されることが可能である典型的な質量を有する、蛍光ラベル、放射性核種、または脱離可能な分子フラグメントである。これらのラベルが質量ラベルである場合、いくつかの実施形態は、ラベル付けされたアンプリコンが単一の正または負の有効電荷を有し、質量分析計におけるより良い検出可能性を可能にすることを提供する。例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって、またはエレクトロンスプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して、この検出を実施して、可視化することができる。
これらのアッセイ技術に適当なＤＮＡを単離する方法は当該技術分野では周知のものである。詳細には、いくつかの実施形態は、その全体を参照により本明細書に援用するところの米国特許出願第１３／４７０，２５１号（「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」）に記載されるような核酸の単離を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマーカーは、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）で行われるＱＵＡＲＴＳアッセイで使用することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料を生成するための方法、詳細には、少量（例えば、１００マイクロリットル未満、６０マイクロリットル未満）で高度に精製された低存在量の核酸を含み、ＤＮＡ試料を試験するために使用されるアッセイ（例えば、ＰＣＲ、ＩＮＶＡＤＥＲ、ＱｕＡＲＴＳアッセイなど）を阻害する物質を実質的に及び／または効果的に含まないＤＮＡ試料を生成するための方法が提供される。そのようなＤＮＡ試料は、患者から採取した試料中に存在する遺伝子、遺伝子バリアント（例えば、アレル）、または遺伝子修飾（例えば、メチル化）の存在を定性的に検出するか、またはその活性、発現もしくは量を定量的に測定する診断アッセイで使用することができる。例えば、一部のがんは、特定の変異アレルまたは特定のメチル化状態の存在と相関しており、したがって、そのような変異アレルまたはメチル化状態の検出及び／または定量化は、がんの診断及び治療において予測的価値を有する。
多くの有用な遺伝子マーカーは試料中に極めて少量しか存在せず、また、そのようなマーカーを生成する事象の多くは稀である。したがって、ＰＣＲのような高感度の検出方法であっても、アッセイの検出閾値を満たすか、それを上回るのに十分な低存在量の標的を与えるには大量のＤＮＡが必要である。さらに、少量であっても阻害物質の存在は、そのような少量の標的の検出を目的としたこれらのアッセイの正確度及び精度を損なう。したがって、本明細書では、そのようなＤＮＡ試料を生成するための、体積及び濃度の必要な管理を提供する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、試料は、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液、血漿、血清、全血、分泌物（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物、ＣＳＦ、唾液、尿、または便を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。これらのような試料は、当業者に明らかであるような、当該技術分野において知られている、任意の数の手段によって得られることが可能である。例えば、尿及び糞便試料は、容易に達成可能であるが、血液、腹水、血清、または膵液試料は、例えば、ニードル及びシリンジを使用することによって、非経口的に得られることが可能である。無細胞の試料、または実質的に無細胞の試料は、遠心分離及びろ過を含むが、これらに限定されない、さまざまな技法に試料を供することによって得ることができる。非侵襲的技術を使用して試料を得ることが一般的に好ましいが、組織ホモジネート、組織切片、及び生検試料などの試料を得ることが好ましい場合もある。
いくつかの実施形態では、試料は、所望の試料タイプを得ることができる任意のタイプまたは種類の採取装置を用いて得られる例えば、採取装置は、子宮頸部組織試料を得ることができる装置であってよい。特定の実施形態では、採取装置は、子宮頸部から、または子宮頸部付近から組織または細胞を得ることができる装置である。いくつかの実施形態では、子宮頸部組織試料としては、例えば、あらゆる子宮頸部組織または子宮頸部細胞を含む試料が挙げられ、子宮頸部の組織または細胞に加えて、解剖学的に子宮頸部の近傍の領域（例えば、膣組織、膣細胞、子宮内膜組織、子宮内膜細胞、卵巣組織、卵巣細胞など）からの組織または細胞を含み得る。別の実施形態では、子宮頸部分泌物試料としては、例えば、解剖学的に子宮頸部の近傍の領域からの分泌物（例えば、膣分泌物、子宮内膜分泌物、及び卵巣分泌物など）を含むあらゆる子宮頸部分泌物（複数可）を含む試料が挙げられる。いくつかの実施形態では、採取装置は、身体領域（例えば、子宮頸部、膣管）と接触させる際に試料（例えば、組織、分泌物、及び／または細胞）を採取することができる吸収部材を有する。いくつかの実施形態では、吸収部材は、身体の開口部（例えば、子宮頸部、膣管）への挿入に適した形状及びサイズを有するスポンジであり、例えば円筒形の形状を有するものである。いくつかの実施形態では、採取装置はタンポン（例えば、標準的なタンポン）、膣内に液体を放出して液体を再回収する洗浄器（例えば、Ｐａｎｔａｒｈｅｉスクリーナー）、子宮頸部ブラシ（例えば、膣に挿入して回転させることで細胞を採取するブラシ）、フルニエ子宮頸部自己採取装置（タンポン状のプラスチック製の棒）、または綿棒である。いくつかの実施形態では、吸収部材は、所望の試料を採取できる材料で作製される。いくつかの実施形態では、吸収部材は、レーヨン及び／または綿などのスポンジ材料である。
無細胞の試料、または実質的に無細胞の試料は、遠心分離及びろ過を含むが、これらに限定されない、さまざまな技法に試料を供することによって得ることができる。非侵襲的技術を使用して試料を得ることが一般的に好ましいが、組織ホモジネート、組織切片、及び生検試料などの試料を得ることが好ましい場合もある。本技術は、試料を調製するため、及び試験用の核酸を提供するために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、米国特許第８，８０８，９９０号及び第９，１６９，５１１号、ならびにＷＯ２０１２／１５５０７２、または関連する方法に詳細に述べられるように、直接的な遺伝子捕捉を用いて、試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部組織）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）から単離される。
マーカーの分析は、１つの試験試料内で追加のマーカーと別個にまたは同時に実施され得る。例えば、複数の試料の効率的な処理を行うために、またより高い診断及び／または予後精度を潜在的に提供するために、１つの試験にいくつかのマーカーを組み合わせることが可能である。さらに、当業者は、同じ対象からの複数の試料を（例えば、連続的な時点で）試験する価値を認識するであろう。このような連続した試料の試験により、経時的なマーカーのメチル化状態における変化の特定が可能である。メチル化状態における変化、及びメチル化状態における変化の非存在は、この事象の発生からのおよその時間、回収可能な組織の存在及び量、薬物療法の適合性、さまざまな療法の有効性、ならびに将来の事象のリスクを含む、対象の転帰の特定を明らかにすることを含むが、これに限定されない、疾患状態についての有用な情報を提供することが可能である。
多様な物理的形式において、バイオマーカーの分析を実施することが可能である。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の用途を用いて、多数の試験試料の処理を容易にすることが可能である。あるいは、単一の試料形式は、適時に、例えば、外来搬送または緊急救命室の状況において即時の治療及び診断を容易にするために開発され得る。
ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む、任意の手段によって単離することができる。簡潔に述べると、目的のＤＮＡが細胞膜によって被包されている場合、生体試料を酵素的、化学的または機械的手段によって破壊し溶解しなければならない。次いで、例えば、プロテイナーゼＫで消化することにより、タンパク質及び他の混入物をＤＮＡ溶液から除去することができる。次いで、ゲノムＤＮＡを溶液から回収する。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのＤＮＡの結合を含む、多様な方法によって実施されることができる。方法の選択は、時間、費用、及び必要とされるＤＮＡ量を含む、いくつかの要因に影響される。腫瘍性物質または前腫瘍性物質を含むすべての種類の臨床試料、例えば、組織（例えば、子宮頸部組織）、細胞株、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、分泌物（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、体液、糞便、組織、結腸排出物、尿、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞、及びこれらの組み合わせが本方法における使用に好適である。
本技術は、試料を調製するため、及び試験用の核酸を提供するために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、米国特許出願公開第６１／４８５３８６号、または関連する方法に詳細に述べられるように、直接的な遺伝子捕捉を用いて、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部組織）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）から単離される。
次いで、ゲノムＤＮＡ試料を、ＤＭＲ（例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示される通りの、例えば、ＤＭＲ１～４２３）を含む少なくとも１つのマーカー内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する、少なくとも１つの試薬、または一連の試薬で処理する。
いくつかの実施形態では、試薬は、５’位でメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる別の塩基に変換する。しかしながら、いくつかの実施形態において、試薬は、メチル化感受性制限酵素であることができる。
いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ試料は、５’位でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動の点でシトシンと異なる別の塩基に変換するような方式で処置される。いくつかの実施形態において、この処置は、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（亜硫酸水素塩（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｔｅ）、二亜硫酸塩）により実施された後に、アルカリ加水分解を伴う。
次いで、処理した核酸を分析し、標的遺伝子配列（ＤＭＲ、例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示される通りの、例えば、ＤＭＲ１～４２３から選択される少なくとも１箇所のＤＭＲを含むマーカーからの少なくとも１つの遺伝子、ゲノム配列、またはヌクレオチド）のメチル化状態を判定する。本明細書に列挙される分析方法、例えば、本明細書に記載されるようなＱｕＡＲＴＳ及びＭＳＰを含む、当該技術分野において知られているものから、分析方法を選択することができる。
異常なメチル化、より具体的には、ＤＭＲ（例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示される通りの、例えば、ＤＭＲ１～４２３）を含むマーカーの高メチル化は、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ、及び子宮頸癌前癌に関連している。
いくつかの実施形態において、この技術は、患者（例えば、子宮頸癌及び／または子宮頸癌のサブタイプを有する患者）を治療する方法であって、１）本明細書に提供されるような１つ以上のメチル化マーカーのメチル化状態の一方または両方を判定することと、メチル化状態を判定することの結果に基づき患者に治療を投与することと、を含む方法に関する。治療は、医薬化合物の投与、ワクチンの投与、外科手術の実施、患者のイメージング、別の試験の実施であり得る。好ましくは、該使用は、臨床スクリーニングの方法、予後評価の方法、療法の結果をモニタリングする方法、特定の治療的処置に応答する可能性が最も高い患者を同定する方法、患者または対象をイメージングする方法、ならびに薬物のスクリーニング及び開発のための方法におけるものである。
本技術のいくつかの実施形態では、対象における特定の種類のがん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）及び／または前がん（例えば、子宮頸癌前癌）を診断するための方法が提供される。「診断する」及び「診断」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が所与の疾患もしくは状態に罹患しているか否か、または将来的に所与の疾患もしくは状態を発症する可能性があるか否かを、当業者が推定し、さらに判定することができる方法を指す。当業者は、１つ以上の診断指標、例えば、１つ以上のバイオマーカー（例えば、本明細書マーカーに開示されるような１つ以上のメチル化マーカー、メチル化マーカー遺伝子、遺伝子、ＤＭＲ、及び／またはＤＮＡメチル化マーカー）などに基づき診断を行うことが多く、このバイオマーカーのメチル化状態は、状態の存在、重症度、または非存在を示す。
診断に加えて、臨床的ながん予後は、がんの攻撃性及び腫瘍再発の可能性を判定し、最も効果的な療法を計画することに関する。さらに正確な診断を行うことが可能である場合、またはがんを患う潜在的なリスクを評価することが可能である場合でさえ、適切な治療、及びいくつかの例において患者にそれほど過酷ではない治療を選択することが可能である。がんバイオマーカーの評価（例えば、メチル化状態を決定する）は、良好な予後を有する対象、及び／または治療を必要としないがん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）を患うリスクの低い対象、またはがんを患う可能性がさらに高い対象から治療の限られた対象、またはさらに集中的な処置から利益を受ける可能性があるがんの再発を受ける対象に分けるために有用である。
このようなものとして、「診断を行うこと」、または「診断すること」は、本明細書に使用される場合、がん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）を患うリスクを決定すること、または予後を決定することをさらに含み、これらは、本明細書に開示される診断バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）の測定値に基づき、臨床転帰（医学的処置の有り無しで）を予測するか、適切な処置（または処置が有効であるかどうか）を選択するか、または現在の処置を監視して処置を可能性として変更するかのために提供されることが可能である。さらに、本明細書に開示される主題のいくつかの実施形態では、診断及び／または予後を容易にするために、経時的なバイオマーカーの複数の判定を行うことができる。バイオマーカーの時間的変化を使用して、臨床転帰を予測し、がんまたはがんのサブタイプ（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）の進行をモニタリングし、及び／またはがんを対象とする適切な療法の有効性をモニタリングすることができる。このような実施形態では、有効な療法の過程において経時的な生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、及び便試料）中の本明細書に開示される１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）（及び、モニタリングされている場合、場合により１つ以上の追加のバイオマーカー）のメチル化状態の変化が見られることが期待される場合がある。
本明細書で開示される主題は、いくつかの実施形態では、対象のがん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）の予防または治療を開始または継続するか否かを判定するための方法をさらに提供する。その期間における任意の変化を用いて、がん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）を患うリスクを予測すること、臨床回帰を予測すること、がんの予防または治療を開始するか、継続するかどうか、また現在の治療ががんを効率的に処置しているかどうかを判定することが可能である。例えば、第１の時点は、治療の開始前に選択することができ、第２の時点は、治療開始後のある時点で選択することができる。メチル化状態は、異なる時点で採取された試料の各々で測定することができ、定性的及び／または定量的な差を記録する。異なる試料からのバイオマーカーレベルのメチル化状態における変化は、対象における特定のがん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）のリスク、予後、治療有効性の判定、及び／またはがんの進行と相関し得る。
好ましい実施形態では、本発明の方法及び組成物は、早期での、例えば、疾患（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）の症状が現れる前の疾患の治療または診断のためのものである。いくつかの実施形態において、本発明のこれらの方法及び組成物は、臨床病期における疾患の処置または診断のためのものである。
記述されるように、いくつかの実施形態において、１つ以上の診断または予後バイオマーカーの複数の決定を行うことが可能であり、このマーカーにおける経時的な変化を使用して、診断または予後を決定することが可能である。例えば、診断マーカーを初回に、そして再度２回目に判定することが可能である。これらのような実施形態において、初回から２回目へのマーカーにおける増加は、がん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）の特定のタイプもしくは重症度の診断、または所与の予後であることが可能である。同様に、初回から二回目へのマーカーにおける減少は、がんの特定のタイプもしくは重症度、または所与の予後を示すことが可能である。さらに、１つ以上のマーカーの変化の程度は、がんの重症度、及び将来の有害事象に関連することが可能である。当業者は、ある特定の実施形態において、同一のバイオマーカーの相対的な測定を複数の時点で行うことが可能であり、また特定のバイオマーカーを１つの時点で、また第２のバイオマーカーを第２の時点で測定することが可能であり、これらのマーカーの比較が診断情報を提供することが可能であることを理解する。
本明細書に使用されるように、語句「予後を決定すること」は、当業者が対象における状態の経過または転帰を予測することが可能である方法を指す。用語「予後」は、１００％の精度を有する状態の経過または転帰を予測する能力、または所与の経過または転帰がバイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）のメチル化状態に基づき起こる予測可能な多少の可能性である能力さえ指さない。その代わりに、当業者は、「予後」という用語が、ある特定の経過または転帰が生じる確率、すなわち、経過または転帰が、所与の状態を呈する対象において、その状態を呈さないそれらの個体と比較した場合に生じる可能性がより高いという確率の上昇を指すと理解するであろう。例えば、状態を呈さない（例えば、１つ以上のＤＭＲの正常なメチル化状態を有する）個体では、所与の転帰（例えば、特定の種類のがん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）に罹患すること）の可能性が極めて低い場合がある。
いくつかの実施形態において、統計分析は、予後指標を有害転帰への素因と関連付ける。例えば、いくつかの実施形態では、がん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）を有さない患者から得られた正常コントロール試料におけるものとは異なるメチル化状態は、統計的有意性のレベルによって判定した場合、対象が、コントロール試料におけるメチル化状態により類似したレベルを有する対象よりも、がんに罹患する可能性が高いことを示し得る。さらに、ベースライン（例えば、「正常」）レベルからのメチル化状態の変化は、対象の予後を反映し得、メチル化状態における変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、２つ以上の母集団を比較して信頼区間及び／またはｐ値を決定することによって決定されることが多い。例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＤｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照されたい。本主題の例示的な信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％及び９９．９９％であり、一方、例示的なｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、及び０．０００１である。
他の実施形態では、本明細書に開示される予後または診断バイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）のメチル化状態における変化の閾値の程度を確立することができ、生体試料中のバイオマーカーのメチル化状態における変化の程度は、メチル化状態における変化の閾値の程度と単に比較される。本明細書で提供されるバイオマーカーのメチル化状態における好ましい閾値の変化は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、及び約１５０％である。さらに他の実施形態において、「計算図表」を確立することが可能であり、この計算図表によって、予後または診断指標（バイオマーカー、またはバイオマーカーの組み合わせ）のメチル化状態は、所与の転帰に対して関連した性質に直接に関係する。当業者は、このような計算図表の用途として、母集団の平均値ではなく、個々の試料測定値を反映するので、この測定値における不確かさがマーカー濃度における不確かさと同一であることを理解することと、２つの数値を関連させることを認知する。
いくつかの実施形態では、コントロール試料は、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）と同時に分析されることにより、その生体試料から得られた結果をコントロール試料から得られた結果と比較することができる。さらに、標準曲線を提供することができ、標準曲線と生体試料のアッセイ結果を比較することができることが企図される。そのような標準曲線は、アッセイ単位に応じたバイオマーカーのメチル化状態、例えば、蛍光標識が使用される場合、蛍光シグナル強度を提示する。複数のドナーから採取した試料を使用して、正常組織における１つ以上のバイオマーカーのコントロールメチル化状態について、及び特定の種類のがん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）または前がん（例えば、子宮頸癌前癌）を有するドナーから採取した血漿中の１つ以上のバイオマーカーの「リスクがある」レベルについて、標準曲線を得ることができる。本方法の特定の実施形態では、対象は、対象から得られた生体試料において、本明細書で提供される１つ以上のＤＭＲの異常なメチル化状態が特定される場合に、がん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）または前がん（例えば、子宮頸癌前癌）を有するものと特定される。この方法の他の実施形態において、対象から得られた生物学的試料中にこれらのようなバイオマーカーのうちの１つ以上の異常なメチル化状態が検出された場合、対象はがん（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）または前がん（例えば、子宮頸癌前癌）を有するものと特定される。
マーカーの分析は、１つの試験試料内で追加のマーカーと別個にまたは同時に実施され得る。例えば、複数の試料の効率的な処理を行うために、またより高い診断及び／または予後精度を潜在的に提供するために、１つの試験にいくつかのマーカーを組み合わせることが可能である。さらに、当業者は、同じ対象からの複数の試料を（例えば、連続的な時点で）試験する価値を認識するであろう。このような連続した試料の試験により、経時的なマーカーのメチル化状態における変化の特定が可能である。メチル化状態における変化、及びメチル化状態における変化の非存在は、この事象の発生からのおよその時間、回収可能な組織の存在及び量、薬物療法の適合性、さまざまな療法の有効性、ならびに将来の事象のリスクを含む、対象の転帰の特定を明らかにすることを含むが、これに限定されない、疾患状態についての有用な情報を提供することが可能である。
多様な物理的形式において、バイオマーカーの分析を実施することが可能である。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の用途を用いて、多数の試験試料の処理を容易にすることが可能である。あるいは、単一の試料形式は、適時に、例えば、外来搬送または緊急救命室の状況において即時の治療及び診断を容易にするために開発され得る。
いくつかの実施形態では、対象は、コントロールメチル化状態と比較した場合に試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態に測定可能な差が存在する場合、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ、及び／または子宮頸癌前癌を有すると診断される。逆に、生体試料中のメチル化状態に変化がないと特定される場合、対象は、子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ、及び／または子宮頸癌前癌を有していないか、がんまたは前がんのリスクがないか、またはがんまたは前がんのリスクが低いものとして特定することができる。これに関して、がんまたはそのリスクを有する対象は、がんまたはそのリスクが低い対象からそれらを実質的に有しない対象と区別され得る。子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ、及び／または子宮頸癌前癌を発症するリスクを有する対象は、より集中的及び／または定期的なスクリーニングスケジュールに置くことができる。他方、リスクが低い対象から実質的にリスクを有しない対象は、将来のスクリーニング、例えば、本技術に従って実施されるスクリーニングによりがんのリスクがそれらの対象に現れたことが示されるまで、がんのリスクに関する追加試験（例えば、侵襲的手順）に供されるのを回避することができる。
前述の通り、本技術の方法の実施形態に応じて、１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態における変化を検出することは、定性的判定であり得るか、またはそれは定量的判定であり得る。したがって、対象を子宮頸癌または子宮頸癌サブタイプに罹患しているかまたは発症するリスクがあると診断するステップは、特定の閾値測定が行われることを示し、例えば、生体試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態が所定のコントロールメチル化状態から変化している。本方法のいくつかの実施形態では、コントロールメチル化状態は、バイオマーカーのいずれかの検出可能なメチル化状態である。コントロール試料が生体試料と同時に試験される方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、コントロール試料におけるメチル化状態である。本方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、標準曲線に基づいている、及び／または標準曲線によって特定される。本方法の他の実施形態では、所定のメチル化は、特異的な状態または状態の範囲である。したがって、所定のメチル化状態は、当業者には明らかとなる許容可能な限度内で、実施される方法の実施形態及び所望の特異性などに一部基づいて選択され得る。
特定の実施形態では、本技術は、ＤＭＲを含む核酸を、メチル化特異的な形で核酸を修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬）（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、テン－イレブン転座（ＴＥＴ）酵素 （例えば、ヒトＴＥＴ１、ヒトＴＥＴ２、ヒトＴＥＴ３、マウスＴＥＴ１、マウスＴＥＴ２、マウスＴＥＴ３、ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、コプリノプシス・シネレア（ＣｃＴＥＴ））、またはそれらのバリアント）と反応させて、例えば、メチル化特異的な形で修飾された核酸を生成するステップ、メチル化特異的な形で修飾された核酸をシーケンシングし、メチル化特異的な形で修飾された核酸のヌクレオチド配列を得るステップ、メチル化特異的な形で修飾された核酸のヌクレオチド配列を、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプを有さない対象からのＤＭＲを含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列間の差を同定するステップ、ならびに差が存在する場合、対象が子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプを有するものと特定するステップを提供する。
本技術はさらに組成物を提供する。特定の実施形態では、本技術は、ＤＭＲを含む核酸と、亜硫酸水素塩試薬とを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、ＤＭＲを含む核酸と、配列番号１～７６に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチドとを含む組成物が提供される。特定の実施形態では、ＤＭＲを含む核酸と、メチル化感受性制限酵素とを含む組成物が提供される。特定の実施形態では、ＤＭＲを含む核酸と、ポリメラーゼとを含む組成物が提供される。
本技術はさらにキットを提供する。キットは、本明細書に記載される組成物、デバイス、装置などの実施形態、及びキットの使用説明書を含む。このような使用説明書には、試料から検体を調製するための、例えば、試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）を採取し、試料から核酸を調製するための適切な方法が記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、子宮頸部または子宮頸部近傍から試料（例えば、組織、分泌物、及び／または細胞）を得ることができる１つ以上の採取装置（例えば、タンポン（例えば、標準的なタンポン）、膣内に液体を放出して液体を再回収する洗浄器（例えば、Ｐａｎｔａｒｈｅｉスクリーナー）、子宮頸部ブラシ（例えば、膣に挿入して回転させることで細胞を採取するブラシ）、フルニエ子宮頸部自己採取装置（タンポン状のプラスチック製の棒）、または綿棒）を含む。キットの個々の構成要素は、適切な容器及び包装（例えば、バイアル、箱、ブリスターパック、アンプル、瓶、ボトル、チューブなど）に包装され、各構成要素は、キットのユーザーによる保管、輸送、及び／または使用に都合よいように適切な容器（例えば、１乃至複数の箱）に一緒に包装される。液体構成要素（例えば、緩衝液）は、ユーザーによって再構成される凍結乾燥形態で提供されてもよいことが理解される。キットには、キットの性能を評価、検証、及び／または保証するためのコントロールまたは参照が含まれてもよい。例えば、試料中に存在する核酸の量をアッセイするためのキットは、比較用の既知濃度の同じまたは別の核酸を含むコントロール、さらにいくつかの実施形態では、コントロール核酸に特異的な検出試薬（例えば、プライマー）を含むことができる。キットは、臨床現場での使用に、及びいくつかの実施形態では、ユーザーの自宅での使用に適している。キットの構成要素は、いくつかの実施形態では、試料から核酸溶液を調製するためのシステムの機能を提供する。いくつかの実施形態では、システムの特定の構成要素は、ユーザーによって提供される。
特定の実施形態では、本技術は、組成物（例えば、反応混合物）の実施形態に関する。いくつかの実施形態では、ＤＭＲを含む核酸と、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾することができる試薬（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬）（例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、テン－イレブン転座（ＴＥＴ）酵素 （例えば、ヒトＴＥＴ１、ヒトＴＥＴ２、ヒトＴＥＴ３、マウスＴＥＴ１、マウスＴＥＴ２、マウスＴＥＴ３、ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、コプリノプシス・シネレア（ＣｃＴＥＴ））、またはそれらのバリアント）、ボラン還元剤）とを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸と本明細書に記載のオリゴヌクレオチドとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸とメチル化感受性制限酵素とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含む核酸とポリメラーゼとを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載されるこれらの方法によって提供されるような、算術演算または論理演算の配列を実行するように設計される、プログラム可能なマシンと関連する。例えば、技術のいくつかの実施形態は、コンピュータソフトウェア及び／またはコンピュータハードウェアと関連する（例えば、これらに実装される）。一態様では、本技術は、メモリの形態、算術演算及び論理演算を実施するための要素、ならびにデータを読み取り、操作し、保存するための一連の命令（例えば、本明細書で提供される方法）を実行するための処理要素（例えば、マイクロプロセッサ）を含むコンピュータに関する。いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサは、（例えば、１つ以上のＤＭＲ、例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるＤＭＲ１～４２３の）メチル化状態を判定し、メチル化状態を比較し、標準曲線を生成し、Ｃｔ値を判定し、メチル化の割合、頻度、またはパーセンテージを算出し、ＣｐＧアイランドを同定し、アッセイまたはマーカーの特異性及び／または感度を判定し、ＲＯＣ曲線及び関連するＡＵＣを算出し、配列分析を行うためのシステムの一部であり、これらはいずれも本明細書に記載されるかあるいは当該技術分野では周知のものである。いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサは、（例えば、１つ以上のＤＭＲ、例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるＤＭＲ１～４２３の）メチル化状態を判定し、メチル化状態を比較し、標準曲線を生成し、Ｃｔ値を判定し、メチル化の割合、頻度、またはパーセンテージを算出し、ＣｐＧアイランドを同定し、アッセイまたはマーカーの特異性及び／または感度を判定し、ＲＯＣ曲線及び関連するＡＵＣを算出し、配列分析を行うためのシステムの一部であり、これらはいずれも本明細書に記載されるかあるいは当該技術分野では周知のものである。
いくつかの実施形態では、ソフトウェアまたはハードウェアコンポーネントは、複数のアッセイの結果を受信し、複数のアッセイの結果に基づいてがんリスク（例えば、子宮頸癌または子宮頸癌のサブタイプ）または前がんリスク（例えば、子宮頸癌前癌）を示す単一の値の結果を判定しユーザーに報告する（例えば複数のＤＭＲ（例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示される）のメチル化状態を判定する）。関連実施形態は、例えば、複数のアッセイ（例えば、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示される複数のＤＭＲのメチル化状態を判定する）からの結果の数学的組み合わせ（例えば、重み付けされた組み合わせ、線形組み合わせ）に基づいてリスク因子を算出する。いくつかの実施形態では、ＤＭＲのメチル化状態は次元を規定し、かつ多次元空間における値を有する可能性があり、複数のＤＭＲのメチル化状態によって規定される座標は、例えば、ユーザーに報告するための、例えば、がんリスクに関連する結果である。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される科学技術は、協調して動作し、本明細書に記載されるような方法を実行する複数のプログラマブルデバイスと関連する。例えば、いくつかの実施形態において、複数のコンピュータ（例えば、ネットワークによって接続される）は、例えば、イーサネット、光ファイバなどの従来のネットワークインタフェースによって、または無線ネットワーク技術によって、ネットワーク（プライベート、パブリック、またはインターネット）に接続される完全なコンピュータ（オンボードＣＰＵ、ストレージ、電源、ネットワークインタフェースなど）に依存する、クラスタコンピュータまたはグリッドコンピューティングまたはいくつかの他の分散コンピュータアーキテクチャの実装において、並列して作動し、データを収集して処理することができる。
例えば、いくつかの実施形態は、コンピュータ可読媒体を含むコンピュータを提供する。実施形態は、プロセッサに結合されるランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む。プロセッサは、メモリに格納されたコンピュータ実行可能プログラムインストラクションを実行する。これらのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、ＡＳＩＣ、ステートマシン、または他のプロセッサを含むことができ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＩｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ、ＩｌｌｉｎｏｉｓのＭｏｔｏｒｏｌａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのプロセッサなどの複数のコンピュータプロセッサのいずれかであることが可能である。これらのようなプロセッサは、コンピュータ可読媒体などの媒体を含む、または媒体と通信することができ、この媒体は、例えば、このプロセッサによって実行されるときに、プロセッサに本明細書に記載されるステップを実行させるインストラクションを格納する。
コンピュータは、いくつかの実施形態においてネットワークに接続される。またコンピュータは、マウス、ＣＤーＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、または他の入力もしくは出力デバイスなどの、複数の外部または内部デバイスを含むことができる。コンピュータの例は、パーソナルコンピュータ、デジタルアシスタント、パーソナルデジタルアシスタント、セルラーホン、モバイルフォン、スマートフォン、ポケットベル、デジタルタブレット、ラップトップコンピュータ、インターネットアプライアンス、及び他のプロセッサベースのデバイスである。一般に、本明細書に提供される科学技術の態様に関連するこれらのコンピュータは、いずれかのタイプのプロセッサベースのプラットフォームであることができ、このプラットフォームは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ、Ｌｉｎｕｘ、ＵＮＩＸ、Ｍａｃ ＯＳ Ｘなどのいずれかのオペレーティングシステム上で動作し、本明細書に提供される科学技術を含む１つ以上のプログラムを支援することができる。いくつかの実施形態は、他のアプリケーションプログラム（例えば、アプリケーション）を実行するパーソナルコンピュータを含む。アプリケーションはメモリに格納することができ、これらとしては、例えば、ワードプロセッシングアプリケーション、スプレッドシートアプリケーション、電子メールアプリケーション、インスタントメッセンジャーアプリケーション、プレゼンテーションアプリケーション、インターネットブラウザアプリケーション、カレンダー／オーガナイザーアプリケーション、及びクライアントデバイスによって実行可能な任意の他のアプリケーションを挙げることができる。
本技術に関連するものとして本明細書に記載されるそのようなすべてのコンポーネント、コンピュータ、及びシステムは、論理的または仮想的であり得る。
特定の実施形態では、本技術は、対象から得られた試料中の子宮頸癌、子宮頸癌のサブタイプ、及び／または子宮頸癌前癌をスクリーニングするためのシステムを提供する。システムの例示的な実施形態には、例えば、対象から得られた試料（例えば、組織試料（例えば、子宮頸部試料）、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料（例えば、子宮頸部分泌物、膣分泌物）、臓器分泌物試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、尿試料、または便試料）中の子宮頸癌または子宮頸癌サブタイプをスクリーニングするためのシステムであって、
試料中の１つ以上のメチル化されたマーカーのメチル化状態の決定の一方または両方を行うように構成された分析コンポーネントと、
試料中の１つ以上のメチル化されたマーカーのメチル化状態を、データベースに記録されたコントロール試料または参照試料と比較するように構成されたソフトウェアコンポーネントと、
がんに関連する状態をユーザーに警告するように構成された警告コンポーネントと、を含むシステムが含まれる。
いくつかの実施形態では、警告は、複数のアッセイ（例えば、１つ以上のメチル化されたマーカーのメチル化状態を判定する）からの結果を受信し、複数の結果に基づいて報告される値または結果を計算するソフトウェアコンポーネントによって決定される。
いくつかの実施形態は、値もしくは結果の算出及び／またはユーザー（例えば、医師、看護師、臨床医など）に報告する警告に使用するための、本明細書で提供される各メチル化マーカーと関連する重み付けパラメータのデータベースを提供する。いくつかの実施形態では、複数のアッセイからのすべての結果が報告される。いくつかの実施形態では、１つ以上の結果を使用して、対象のがんリスクを示す複数のアッセイからの１つ以上の結果の複合的結果に基づき、スコア、値、または結果を提供する。このような方法は、特定のメチル化マーカーに限定されない。
このような方法及びシステムでは、１つ以上のメチル化マーカーは、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるＤＭＲ１～４２３からなる群から選択されるＤＭＲ中の塩基を含む。
さまざまな実施形態のこの詳細な説明では、説明目的のために、開示される実施形態の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が述べられている。しかしながら、当業者は、これらのさまざまな実施形態がこれらの具体的な詳細があってもなくても実施され得ることを理解するであろう。他の場合では、構造及び機構は、ブロック図形式で示される。さらに、当業者は、方法が提示かつ実施される特定の順序は例示的なものであると容易に理解することができ、また、順序は変更することができるが、依然として本明細書に開示される様々な実施形態の趣旨及び範囲内であることが企図される。
実施例Ｉ．
本実施例では、子宮頸癌を検出するためのメチル化ＤＮＡマーカー（ＭＤＭ）のパネルの標的化アッセイの実現性を評価するために行った実験について説明する。
試料調製、シーケンシング、分析パイプライン、及びフィルターの独自の方法体系を用いて、メチル化可変領域（ＤＭＲ）を特定し、子宮頸癌を正確に示す、臨床試験環境において優れるＤＭＲに絞り込んだ。組織ごとの分析により、３２０個の高メチル化された子宮頸癌（ＣＣ）のＤＭＲが特定された（表Ｉ）。表ＩＩは、表Ｉに記載されるマーカーについて、子宮頸癌組織と良性の子宮頸部組織の曲線下面積（ＡＵＣ）、倍率変化、及びｐ値を示している。特定された３２０個の高メチル化ＣＣ ＤＭＲには、ＣＣに特異的な領域及びＣＣサブタイプに特異的な領域が含まれていた。
組織対白血球（バフィーコート）の分析により、ＷＢＣ中のノイズが１％未満である４１個の高メチル化された子宮頸部組織のＤＭＲを得た（表ＩＩＩ、表ＩＶ）。
これらのマーカー群から、初期パイロットとして以下の２９個の候補を選択した：ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５。定量的メチル化特異的ＰＣＲアッセイを開発し、独立した試料で試験を行った。短いアンプリコンプライマー（１５０ｂｐ未満）を、ＤＭＲ内の最も判別性の高いＣｐＧを標的とするように設計し、コントロールで試験して、完全にメチル化されたフラグメントが安定的かつ直線的に増幅され、非メチル化断片及び／または非変換断片は増幅されないようにした。６０個のプライマー配列を表Ｖに示す。
２９個のＭＤＭ（ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５）のそれぞれは、１０個のＭＤＭで曲線下面積（ＡＵＣ）＞０．９０であり、ＣＣを良性の頸膣部（ＢＣＶ）組織から高度に判別した（表ＶＩ）。ＣＣ ＭＤＭはまた、上皮内腺癌（ＡＩＳ）もＢＣＶから高度に判別したが、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）２／３及びＣＩＮ１ではうまく機能しなかった（表ＶＩ）。
過去の研究より、ある臓器内の各がんサブタイプのエピジェネティクスは異なっており、最良のパネルはサブタイプマーカーの組み合わせから導き出されることが認識されている。結果を表ＶＩＩに示す。各マーカーアッセイの判別強度を数値で示してある。多くのアッセイは、腺癌及び扁平上皮癌の両方を良性組織からほとんど完全に判別した。上皮内腺癌試料は、いくつかのマーカーアッセイによって、ＡＵＣが８０台後半、ＣＩＮ２／３が８０台前半で検出された。がんに対するコントロールのメチル化ＦＣ（％）は２～３４０の範囲であった。
婦人科悪性腫瘍を判別するＣＣ ＭＤＭアッセイの可能性を調べる実験も行った。タンポンを用いた臨床試験において重要となるアッセイの臓器部位特異性を評価した。表ＶＩＩＩは、試験した異なるコホートにおける２７個の選択されたＭＤＭのメチル化率（％）を示している。２７個のＭＤＭは子宮頸癌コホートでは高度にメチル化されていたが、子宮内膜癌では一般に５％未満であった。
全メチロームシーケンシング、ストリンジェントなフィルタリング基準、及び生物学的検証により、子宮頸癌に対する優れた候補ＭＤＭが得られた。一部のＭＤＭは比較的高い感度で両方のＣＣ組織型を良性子宮頸部から判別するが、他のＭＤＭはサブタイプに選択性を示している。
試料：
組織及び血液を、施設のＩＲＢの監視下でＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃの生物標本リポジトリより得た。試料を、対象研究承認及び組み入れ／除外基準に厳格に準拠して選択した。子宮頸部のサブタイプには、１）腺癌、及び２）扁平上皮癌が含まれた。コントロールには、良性の頸膣部（ＢＣＶ）組織及び全血由来の白血球が含まれた。子宮内膜癌及びコントロールも実施した。組織をマクロ解剖し、専門の婦人科病理医が組織を精査した。試料は、年齢、性別を一致させ、ランダム化し、盲検化した。凍結組織１１３個（グレード１／２類内膜（Ｇ１／２Ｅ）１６個、グレード３類内膜（Ｇ３Ｅ）１６個、漿液性１１個、明細胞ＥＣ１１個、子宮癌肉腫１５個、良性子宮内膜（ＢＥ）組織４４個（増殖性１４個、萎縮性１２個、不整増殖１８個）、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）子宮頸癌（ＣＣ）７０個（扁平上皮細胞３６個、腺癌３４個）、及びがんのない女性から得た１８個のバフィーコート由来のＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（凍結組織）、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ組織キット（ＦＦＰＥ組織）、及びＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（バフィーコート試料）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を使用して精製した。ＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ ＣＡ）で再精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）で定量した。ＤＮＡの完全性を、ｑＰＣＲを使用して評価した。
シークエンシング：
ＲＲＢＳシーケンシングライブラリーを、変更を加えたＭｅｉｓｓｎｅｒプロトコル（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１１）に従って調製した。各試料を、４プレックスフォーマットで加え合わせ、Ｍａｙｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＦａｃｉｌｉｔｙによりＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）でシーケンシングした。読み取り値は、画像分析及び塩基呼び出し用のＩｌｌｕｍｉｎａパイプラインモジュールによって処理した。二次分析を、Ｍａｙｏが開発したバイオインフォマティクススイートであるＳＡＡＰ－ＲＲＢＳを使用して実施した。簡潔に述べると、Ｔｒｉｍ－Ｇａｌｏｒｅを使用してリードをクリーンアップし、ＢＳＭＡＰで構築したＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９参照ゲノムにアラインメントさせた。カバレッジ１０倍以上、塩基品質スコア２０以上のＣｐＧについて、Ｃ／（Ｃ＋Ｔ）、または逆に、逆鎖へのリードマッピングの場合はＧ／（Ｇ＋Ａ）を算出することによりメチル化率を判定した。
バイオマーカーの選択：
個々のＣｐＧを、高メチル化率、すなわち、所与の遺伝子座における、その場所の総シトシン数に対するメチル化シトシンの数によってランク付けした。症例の場合、比率は≧０．２０（２０％）；ＢＣＶ組織コントロールの場合、≦０．０５（５％）；バフィーコートコントロールの場合、≦０．０１（１％）である必要があった。これらの基準を満たさなかったＣｐＧを廃棄した。続いて候補ＣｐＧを、ゲノム位置によって、１領域あたり５ＣｐＧの最小カットオフで約６０～２００ｂｐの範囲のＤＭＲ（可変メチル化領域）にビニングした。検証段階におけるＧＣ関連の増幅問題を回避するために、ＣｐＧ密度が過度に高い（＞３０％）ＤＭＲを除外した。各候補領域について、症例とコントロールの両方について個々のＣｐＧを試料ごとに比較する２Ｄマトリックスを作成した。すべての良性子宮内膜及び／または非がんバフィーコートに対するＣＣ全体、ならびにサブタイプの比較を分析した。次いで、これらのＣｐＧマトリックスを参照配列と比較して、ゲノム的に連続するメチル化部位が最初のフィルタリングの際に廃棄されたか否かを評価した。この領域のサブセットから、最終的な選択には、試料ごとのレベルで、ＤＭＲ配列全体の個々のＣｐＧの協調的かつ連続的な（症例における）高メチル化が必要であった。逆に、コントロール試料は、症例の少なくとも１０分の１のメチル化が必要であり、ＣｐＧパターンはよりランダムで協調性が低くなければならなかった。サブタイプコホート内のがん試料の少なくとも１０％は、ＤＭＲ内の全てのＣｐＧ部位に少なくとも５０％の高メチル化率を有している必要があった。
別の分析では、独自のＤＭＲ同定パイプライン及び回帰パッケージを利用して、ＣｐＧの平均メチル化値に基づいてＤＭＲを導出した。平均メチル化パーセンテージの差を、ＣＣ症例、組織コントロール、及びバフィーコートコントロールの間で比較し、マッピングしたＣｐＧの各々の１００塩基対内のタイル状に並べたリーディングフレームを使用して、コントロールのメチル化が５％未満のＤＭＲを同定した。カバレッジ深度の合計が１対象あたり平均１０リードであり、サブグループ間の分散が０を超える場合にのみＤＭＲを分析した。生物学的に関連するオッズ比の増加が３倍を超え、かつカバレッジ深度が１０リードであると仮定すると、有意水準５％の両側検定で８０％の検出力を達成し、二項分散拡大係数（ｂｉｎｏｍｉａｌ ｖａｒｉａｎｃｅ ｉｎｆｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を１と仮定するには、１群あたり１８個以上の試料が必要であった。
回帰後、ＤＭＲを、症例と全てのコントロールとの間のｐ値、受信者動作特性曲線下の面積（ＡＵＣ）、及び倍率変化の差によってランク付けした。独立した検証を事前に計画していたことから、この段階において誤検出の調整は行わなかった。
バイオマーカーの検証：
子宮頸癌のＤＭＲのサブセットを、さらなる展開のために選択した。基準は主に、領域の判別可能性の性能評価を提供する、ロジスティックに導出された（ｌｏｇｉｓｔｉｃ－ｄｅｒｉｖｅｄ）ＲＯＣ曲線下面積尺度であった。症例とコントロール組織の比較カットオフとして、０．８５のＡＵＣを選択した。０．９５を症例と血液の比較のカットオフとした。さらに、メチル化倍率変化率（平均がん高メチル化率／平均コントロール高メチル化率）を算出し、組織対組織の比較には下限２０を使用し、組織対バフィーコートの比較には下限５０を使用した。Ｐ値はそれぞれ０．０５及び／または０．００１未満である必要があった。ＤＭＲは、平均及び個別のＣｐＧ選択プロセスの両方に記載しなければならなかった。定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）プライマーを、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ （Ｌｉ ＬＣ ａｎｄ Ｄａｈｉｙａ Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００２ Ｎｏｖ；１８（１１）：１４２７－３１を参照）を使用して候補領域用に設計し、２０ｎｇ（６２５０当量）の陽性及び陰性のゲノムメチル化コントロールをＱＣ検査した。最適な判別のために、複数のアニーリング温度を試験した。検証は、独立した組織試料の同等のセットに対してｑＭＳＰによって行った。追加のコホートには、上皮内腺癌（ＡＩＳ）及び子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ１－３）が含まれた。患者の人口統計を表ＩＸに示す。
これらの組織を、専門家の臨床的及び病理学的精査により、前と同様に同定した。ＤＮＡ精製を前述のように実施した。バイサルファイト変換ステップには、ＥＺ－９６ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）を使用した。Ｒｏｃｈｅ ４８０ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ検出を使用して、１０ｎｇの変換したＤＮＡ（マーカーあたり）を増幅した。連続希釈したユニバーサルメチル化ゲノムＤＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を定量標準として使用した。ＣｐＧに依存しないＡＣＴＢ（β－アクチン）アッセイをインプット参照及び正規化コントロールとして使用した。結果を、メチル化されたコピー（特異的マーカー）／ＡＣＴＢのコピーとして表した。
統計学：
結果を、個々のＭＤＭ（メチル化ＤＮＡマーカー）の性能についてロジスティックに分析した。マーカーの組み合わせについては、ランダムフォレスト回帰（ｒＦｏｒｅｓｔ）を使用して、元のデータのブートストラップ試料（トレーニング用のデータのおよそ２／３）に適合する５００個の個別のモデルを生成して、ＭＤＭパネル全体の交差検証誤差（試験用のデータの１／３）を推定し、これを、真の交差検定尺度を過小評価または過大評価する偽のスプリット（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｓｐｌｉｔ）を回避するため５００回繰り返した。次いで、５００回の繰り返しにわたって結果を平均した。
実施例ＩＩ．
本実施例では、子宮頸癌を子宮内膜癌及び卵巣癌から判別できるメチル化マーカーの特定について説明する。
３つの婦人科癌（子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌など）とそのそれぞれのサブタイプ間の臓器特異的な過剰メチル化領域を明らかにすることを目的として、これらのがんの固有の以前に生成、検証、開示された組織ＲＲＢＳ（縮小表示亜硫酸水素塩シーケンス）データセットを結合または統合する実験を行った。３つの試験すべてに共通するＣｐＧのみを分析した。領域には、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに少なくとも６個の連続したＣｐＧが含まれている必要があった。発見試料には、子宮頸部腺癌３４個、子宮頸部扁平上皮癌３６個、グレード１または２の子宮類内膜癌１５個、グレード３の子宮類内膜癌１６個、漿液性子宮癌１１個及び明細胞子宮癌１１個、子宮癌肉腫１５個、ならびに漿液性卵巣癌１８個、明細胞卵巣癌１５個、粘液性卵巣癌６個、類内膜性卵巣癌１８個が含まれた。良性のコントロールには、子宮頸部膣試料１８個、子宮内膜組織４４個（増殖性１４個、萎縮性１２個、不整増殖１８個、分泌性１０個）、卵管試料２０個、及び非がん性バフィーコートまたは末梢血白血球試料３６個が含まれた。
この応用のため、子宮頸癌（腺癌及び扁平上皮細胞の各種がんの両方）に特異的なマーカーに着目した実験を行った。最初のステップとして、良性の子宮頸膣細胞及び組織では、可変メチル化のすべての領域のバックグラウンドまたはノイズは極めて低い（＜１％）必要があった。この組織タイプ由来のＤＮＡは、タンポン上に見出される核酸の中で群を抜いて最も高い割合を占める。第二に、炎症からの潜在的なシグナルを回避するため、白血球ＤＮＡ内のメチル化が１％未満である領域を除外した。残りのＣｐＧを用いて子宮頸癌と子宮内膜癌及び卵巣癌とを総合的に比較した。腺癌と扁平上皮癌を別々に分析した。以下の３つの指標を評価した：１）子宮頸癌のメチル化と子宮内膜癌及び卵巣癌のメチル化との比、２）子宮頸癌試料で観察された高メチル化の強度、頻度、及び連続性（読み取りレベル）、及び３）子宮頸癌の絶対メチル化率。１番目については、ＣＣ／ＥＣ＞２０及びＣＣ／ＯＣ＞５０のカットオフ値を用いた。これらの値は、ＤＭＲ候補の数を数千から数百に減らすために経験的に選択されたものである。３番目については、２０％未満のカットオフ値を使用した。これにより候補の数は１００を下回った。２番目の指標に関しては、スコアリングシステムを用いてＤＭＲ全体にわたって一致する高メチル化を特定した。確率的に不一致なＣｐＧメチル化を有する領域は除外した。この分析の結果、表Ｘに示す６４個のＤＭＲパネルが特定された。表ＸＩは、表Ｘに記載されるマーカーについて、子宮頸癌のメチル化と子宮内膜癌、卵巣癌、及び白血球（バフィーコート）のメチル化との比を示す。
これらの中から、ＤＮＡ量の制限のため、ｑＭＳＰ（定量的メチル化特異的ＰＣＲ）アッセイに変換して独立した試料セットで検証するために以下の８つのＤＭＲ、すなわち、ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１を選択した。８つのＤＭＲ（ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１）に対するプライマー配列を表ＸＩＩに示す。
試料には、子宮頸部腺癌３８個、子宮頸部扁平上皮癌３６個、グレード１または２の子宮類内膜癌１８個、グレード３の子宮類内膜癌２４個、漿液性子宮癌１６個及び明細胞子宮癌７個、子宮癌肉腫１８個、ならびに漿液性卵巣癌３６個、明細胞卵巣癌２１個、粘液性卵巣癌４個、類内膜性卵巣癌２１個が含まれた。良性のコントロールには、子宮頸部膣試料２９個、子宮内膜組織１４個（増殖性８個、萎縮性２個、不整増殖３個、分泌性１個）、及び卵管試料２９個が含まれた。総合的な子宮頸癌を、総合的な子宮内膜癌及び卵巣癌とロジスティック的に比較した。
個々のＭＤＭ（メチル化ＤＮＡマーカー）の成績は、９８％の特異性での感度３０％～９９％の特異性での感度７３％の範囲であった。２～３個のＭＤＭのパネルは補完的であった。例えば、ＡＫ５とＲＡＢＣ３とを組み合わせると９８％の特異性で感度８０％であった。したがって、マーカーの組み合わせにより、特定の子宮頸癌メチル化が４／５の確率で検出され、偽陽性率は２％であった。
結論として、これら８個のＭＤＭ（ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１）と残りの５６個のＤＭＲは、腺癌サブタイプか扁平上皮サブタイプかにかかわらず、他の２つの婦人科臓器癌と異なる子宮頸癌の存在を高精度で示すことができる。
上記明細書に引用したすべての刊行物及び特許は、あらゆる目的においてそれらの全体を参照により本明細書に援用する。記載される技術の組成、方法、及び用途のさまざまな改変形態ならびに変形形態は、記載される技術の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者には自明であろう。かかる技術を特定の例示的な実施形態に関連して記載したが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不要に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、薬理学、生化学、医学、または関連分野における当業者には明らかである、本発明を実施するための記載された態様のさまざまな改変形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (60)

  1. 生体試料を特徴付ける方法であって、
    前記生体試料中の表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸから選択される１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することを含み、前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することは、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で前記生体試料由来のＤＮＡを処理することを含む、前記方法。
  2. 前記生体試料が、組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料、臓器分泌物試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、唾液試料、尿試料、及び便試料から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記組織試料が子宮頸部組織試料である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記子宮頸部組織試料が、膣組織、膣細胞、子宮内膜組織、子宮内膜細胞、卵巣組織、及び卵巣細胞のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記分泌物試料が、子宮頸部分泌物試料である、請求項２に記載の方法。
  6. 前記子宮頸部分泌物試料が、膣分泌物、子宮内膜分泌物、及び卵巣分泌物のうちの１つ以上をさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記１つ以上のメチル化マーカーの前記測定されたメチル化レベルが、子宮頸癌のないコントロール試料中の対応する１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルと比較される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記１つ以上のメチル化マーカーで測定された前記メチル化レベルが前記それぞれのコントロール試料中で測定されたメチル化レベルよりも高い場合、前記個体が子宮頸癌を有すると判定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記１つ以上のメチル化マーカーが、以下の群のうちの１つから選択される、請求項８に記載の方法：
    ●表Ｉ及び／または表ＩＩＩに記載されるメチル化マーカー；
    ●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５；
    ●Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＺＮＦ７７３、ＮＥＵＲＯＧ３、ＡＳＣＬ１、ＮＩＤ２、ＺＮＦ７８１、ＣＲＨＲ２、及びＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８；ならびに
    ●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８。
  10. 前記個体が子宮頸癌のサブタイプを有すると判定することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  11. 前記子宮頸癌のサブタイプが、子宮頸部腺癌及び子宮頸部扁平上皮癌から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記１つ以上のメチル化マーカーが、以下の群のうちの１つから選択される、請求項１０に記載の方法：
    ●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＡＴＰ１０Ａ、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１。
  13. 前記個体が子宮頸癌前癌を有すると判定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  14. 前記子宮頸癌前癌が、子宮頸部関連上皮内腺癌及び子宮頸部上皮内腫瘍から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記１つ以上のメチル化マーカーが、以下の群のうちの１つから選択される、請求項１３に記載の方法：
    ●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＣＲＨＲ２、及びＮＩＤ２；ならびに
    ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＡＴＰ１０Ａ、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１。
  16. 前記１つ以上のメチル化マーカーの前記測定されたメチル化レベルが、子宮内膜癌試料及び卵巣癌試料中の対応する１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルと比較される、請求項１に記載の方法。
  17. 子宮頸癌を子宮内膜癌及び／または卵巣癌から判別することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記１つ以上のメチル化マーカーが、以下の群のうちの１つから選択される、請求項１６に記載の方法：
    ●表Ｘに記載されるマーカー；
    ●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８；ならびに
    ●ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１。
  19. 前記メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬が、ボラン還元剤である、請求項１に記載の方法。
  20. 前記ボラン還元剤が、２－ピコリンボランである、請求項１に記載の方法。
  21. 前記メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬が、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬が、亜硫酸水素塩試薬であり、前記処理することが、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡを生成する、請求項１に記載の方法。
  23. 前記処理されたＤＮＡが、前記１つ以上のマーカーに特異的なプライマーのセットを使用して増幅される、請求項１に記載の方法。
  24. 前記１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な前記プライマーのセットが、表Ｖ及びＸＩＩに記載される群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な前記プライマーのセットが、表Ｖ及びＸＩＩに記載される特定のメチル化マーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンに結合することができ、前記表Ｖ及びＸＩＩに記載される前記メチル化マーカー遺伝子に対する前記プライマー配列が結合する前記アンプリコンは、表Ｉ、ＩＩＩ及びＸに記載される前記メチル化マーカーの遺伝子領域の少なくとも一部である、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な前記プライマーのセットが、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載のメチル化マーカーの染色体座標を含む遺伝子領域の少なくとも一部に特異的に結合するプライマーのセットである、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することが、マルチプレックス増幅を含む、請求項１に記載の方法。
  28. 前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することが、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシークエンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及び亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
  29. 前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することが、前記１つ以上のメチル化マーカーのＣｐＧ部位のメチル化を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
  30. 前記ＣｐＧ部位が、コーディング領域または調節領域中に存在する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記１つ以上のメチル化マーカーが、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるゲノム座標によって記述される、請求項１に記載の方法。
  32. 前記生体試料がヒト対象に由来する、請求項１に記載の方法。
  33. 前記ヒト対象が、子宮頸癌、子宮頸癌サブタイプ、または子宮頸癌前癌を有するかまたは有することが疑われる、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記生体試料が、身体領域と接触させられる際に前記生体試料を採取することができる吸収部材を有する採取装置で採取される、請求項２に記載の方法。
  35. 前記吸収部材が、身体開口部に挿入するのに適した形状及びサイズを有するスポンジである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記採取装置が、タンポン、液体を膣内に放出して液体を再採取する洗浄器、子宮頸部ブラシ、フルニエ子宮頸部自己採取装置、及び綿棒から選択される、請求項３４に記載の方法。
  37. １つ以上の染色体異常に関与する１つ以上の遺伝子座を分析するうえで有用な生体試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）画分を調製するための方法であって、
    （ａ）生体試料からゲノムＤＮＡを抽出することと、
    （ｂ）
    （ｉ）前記抽出されたゲノムＤＮＡを、メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬で処理することと、
    （ｉｉ）前記処理されたゲノムＤＮＡを、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載される１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な別々のプライマーを使用して増幅することと、
    によって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの画分を生成することと、
    （ｃ）前記１つ以上のメチル化マーカーのそれぞれについてメチル化レベルを測定することによって、前記抽出されたゲノムＤＮＡの前記生成された画分中の１つ以上の遺伝子座を分析することと、を含む、前記方法。
  38. 前記メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬が、ボラン還元剤である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ボラン還元剤が、２－ピコリンボランである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬が、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存型制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬のうちの１つ以上を含む、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記メチル化特異的な形でＤＮＡを修飾する試薬が、亜硫酸水素塩試薬であり、前記処理することが、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡを生成する、請求項３７に記載の方法。
  42. 前記１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な前記プライマーのセットが、表Ｖ及びＸＩＩに記載される群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  43. 前記１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な前記プライマーのセットが、表Ｖ及びＸＩＩに記載される特定のメチル化マーカー遺伝子に対するプライマー配列が結合するアンプリコンに結合することができ、前記表Ｖ及びＸＩＩに記載される前記メチル化マーカー遺伝子に対する前記プライマー配列が結合する前記アンプリコンは、表Ｉ、ＩＩＩ及びＸに記載される前記メチル化マーカーの遺伝子領域の少なくとも一部である、請求項３７に記載の方法。
  44. 前記１つ以上のメチル化マーカーに対して特異的な前記プライマーのセットが、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに記載のメチル化マーカーの染色体座標を含む遺伝子領域の少なくとも一部に特異的に結合するプライマーのセットである、請求項３７に記載の方法。
  45. 前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することが、マルチプレックス増幅を含む、請求項３７に記載の方法。
  46. 前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することが、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシークエンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲ－フラップアッセイ、及び亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む、請求項３７に記載の方法。
  47. 前記１つ以上のメチル化マーカーのメチル化レベルを測定することが、前記１つ以上のメチル化マーカーのＣｐＧ部位のメチル化を測定することを含む、請求項３７に記載の方法。
  48. 前記ＣｐＧ部位が、コーディング領域または調節領域中に存在する、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記１つ以上のメチル化マーカーが、表Ｉ、ＩＩＩ、及びＸに示されるゲノム座標によって記述される、請求項３７に記載の方法。
  50. 前記生体試料が、組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、全血試料、分泌物試料、臓器分泌物試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、唾液試料、尿試料、及び便試料から選択される、請求項３７に記載の方法。
  51. 前記組織試料が子宮頸部組織試料である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記子宮頸部組織試料が、膣組織、膣細胞、子宮内膜組織、子宮内膜細胞、卵巣組織、及び卵巣細胞のうちの１つ以上をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記分泌物試料が、子宮頸部分泌物試料である、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記子宮頸部分泌物試料が、膣分泌物、子宮内膜分泌物、及び卵巣分泌物のうちの１つ以上をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記生体試料が、身体領域と接触させられる際に前記生体試料を採取することができる吸収部材を有する採取装置で採取される、請求項３７に記載の方法。
  56. 前記吸収部材が、身体開口部に挿入するのに適した形状及びサイズを有するスポンジである、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記採取装置が、タンポン、液体を膣内に放出して液体を再採取する洗浄器、子宮頸部ブラシ、フルニエ子宮頸部自己採取装置、及び綿棒から選択される、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記生体試料がヒト対象に由来する、請求項３７に記載の方法。
  59. 前記ヒト対象が、子宮頸癌、子宮頸癌サブタイプ、または子宮頸癌前癌を有するかまたは有することが疑われる、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記１つ以上のメチル化マーカーが、以下の群のうちの１つから選択される、請求項３７に記載の方法：
    ●ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、Ｃ１ＯＲＦ１１４、ＡＳＣＬ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＺＮＦ７７３、ＴＴＹＨ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＺＮＦ７８１、ＮＸＰＨ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＩＤ２、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＡＢＣＢ１、ＺＮＦ６９、ＡＴＰ１０Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７２５－７３１６７８１７、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＺＮＦ３８２、ＢＡＲＨＬ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９５８－９８５１１０４９、Ｃ２ＯＲＦ４０、ＳＬＣ９Ａ３、ＰＲＤＭ１２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、及びＫＣＮＱ５；
    ●Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＺＮＦ７７３、ＮＥＵＲＯＧ３、ＡＳＣＬ１、ＮＩＤ２、ＺＮＦ７８１、ＣＲＨＲ２、及びＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８；
    ●ＡＢＣＢ１、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＨＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、Ｃ２ｏｒｆ４０、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＲＨＲ２、ＨＯＰＸ＿Ｃ、ＫＣＮＱ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．９８５１０９６８－９８５１１０４９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１８．７３１６７７５１－７３１６７７９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ２．１２７７８３１８３－１２７７８３４０３、ＭＡＸ．ｃｈｒ４．８８５９８５３－８８５９９３９、ＭＡＸ．ｃｈｒ６．５８１４７６８２－５８１４７７７１、ＭＡＸ．ｃｈｒ９．３６７３９８１１－３６７３９８６８、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＩＤ２、ＮＸＰＨ１、ＰＲＤＭ１２、ＳＬＣ９Ａ３、ＴＭＥＭ２００Ｃ、ＴＴＹＨ１、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ７７３、及びＺＮＦ７８１；
    ●ＡＢＣＢ１、ｃ１ｏｒｆ９５、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＧ８、ＣＨＳＴ２、ＥＬＭＯ１、ＥＭＩＤ２、ＦＢＮ１＿Ｂ、ＦＬＴ３＿Ａ、ＦＬＴ３＿Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＧＰＣ６、ＧＲＥＭ２、ＪＡＭ２、ＫＣＮＫ１２＿Ａ、ＬＯＣ１００１２９６２０、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．７８１１２４０４－７８１１２６９２、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４５８４９０７－４５８５０８８、ＭＡＸ．ｃｈｒ３．６９５９１６８９－６９５９１７８４、ＮＣＡＭ１、ＮＴ５Ｃ１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＮＦ３８２、ＺＮＦ４１９、ＺＮＦ６９、及びＺＳＣＡＮ１８；ならびに
    ●ＡＫ５、ＲＡＢＣ３、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＣ３＿Ｂ、及びＥＬＭＯＤ１。

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