JP2022518440A - 非晶質シアル化オリゴ糖 - Google Patents

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Abstract

ｉ）向上した化学的安定性および／または物性を有する、非晶質炭水化物、ｉｉ）向上した化学的安定性および／または物質を有する、非晶質炭水化物を製造するための方法、並びにｉｉｉ）非晶質炭水化物の化学的安定性および／または物性を向上させる方法が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、非晶質、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥されたシアル化オリゴ糖、有利にはヒトミルクオリゴ糖、並びに非晶質シアル化オリゴ糖の安定性を向上させる方法に関する。
近年、天然に分泌されるオリゴ糖などの複雑な炭水化物の製造および販売は、生きている生物で発生する多くの生物学的プロセスにおけるそれらの役割に起因して、著しく増加している。ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）などの分泌型オリゴ糖は、近年大きな関心を集めている炭水化物であり、栄養および治療の産業の重要な商業的ターゲットとなっている。特に、これらのＨＭＯの合成は、ヒトにおいて生じる様々な生物学的プロセスにおけるＨＭＯの役割に起因して、著しく増加している。ＨＭＯの非常に重要なことは、抗菌、抗ウイルス、免疫および認知発達促進機能などの、独自の生物学的機能に直接関連していることである。ヒトミルクオリゴ糖は、ヒトの腸システムにおいてプレバイオティクスとして機能し、腸内フローラの発達および維持を助けることがわかっている。さらに、これらはまた抗炎症性であることが示されており、そのため、これらの化合物は、合成によって構成される、および天然に存在する化合物、並びにその塩の両方として、例えば、乳児用調合乳、乳児用シリアル、臨床用乳児栄養製品、幼児用調合乳の製造に関して、あるいは子供、成人、高齢者、または授乳中の女性のための栄養補助食品もしくは健康機能食品として、栄養産業において魅力的な成分である。同様に、当該化合物はまた、免疫調整剤として予測的使用のために、治療薬の製造のための医薬品業界においても関心が高い。現在までに、１４０を超えるＨＭＯの構造が決定されており（Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)を参照されたい）、おそらく母乳にはさらに多くのＨＭＯが存在する。シアル化ＨＭＯは、病原体に対する耐性、腸の成熟、免疫機能、および認知発達を補助する役割に起因して、新生児に対して有意な健康上の利点があると考えられている（ten Bruggencate et al. Nutr. Rev. 72, 377 (2014)）。
シアル化ヒトミルクオリゴ糖は、主に単離された形態で非晶質固体として生じ、例えば、Fierfort et al. J. Biotechnol. 134, 261 (2008)、Drouillard et al. Carbohydr. Res. 345, 1394 (2010)、WO 2017/152918、またはUS 2018/0002363を参照されたい。６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）のいくつかの塩、および３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）のナトリウム塩のみが、結晶物質として記載されている（WO 2010/116317、EP-A-3378868、WO 2017/195743を参照されたい）。
結晶および非晶質物質の性質は異なる。物質の非晶質形態は、一般に、より優れた溶解度およびバイオアベイラビリティを示すことが期待されているが、その結晶対応物は、化学的および物理的にさらに安定であり、吸湿性が低い（Bauer J. Valid. Technol. 63 (Summer 2009)）。
ＷＯ２０１３／１８５７８０は、６’－ＳＬの安定性を向上させる方法を開示し、それによって６’－ＳＬの水溶液を噴霧乾燥させ、８４℃のガラス転移点（Ｔｇ）を有する６’－ＳＬを提供する。
それでもなお、その有益な性質を維持しながら、非晶質シアル化オリゴ糖、好ましくはシアル化ＨＭＯの化学的安定性および／または物性を向上させる必要がある。
本発明の目的は、ｉ）向上した化学的安定性および／または物性を有する、非晶質シアル化オリゴ糖、ｉｉ）向上した化学的安定性および／または物性を有する、シアル化オリゴ糖を製造するための方法、並びにｉｉｉ）シアル化オリゴ糖の化学的安定性および／または物性を向上させる方法を提供することである。
そのため、本発明のある局面は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、シアル化オリゴ糖のｐＨが約３．９～６．０であり、好ましくは３．９～５．３である、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩に関する。また好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖は噴霧乾燥または凍結乾燥された物質である。
本発明の別の局面は、以下のステップ：
ａ）前記シアル化オリゴ糖の水溶液を調製すること、
ｂ）必要に応じて、ｐＨが５．６以下である、好ましくは５．０未満となるように、ステップａ）において得られた水溶液に酸性または塩基性非炭水化物成分を添加すること、次いで
ｃ）ステップａ）において得られた水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥すること、あるいはステップｂ）において得られた溶液のｐＨを調整することによって、非晶質シアル化オリゴ糖を得ること
を含む、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩の製造方法に関し、ここで、前記シアル化オリゴ糖のｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６．０以下であり、好ましくは約５．３以下である。
本発明の別の局面は、非晶質シアル化オリゴ糖の化学的安定性および／または物性を向上させる方法であって、シアル化オリゴ糖またはその塩の水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥することを含む方法に関し、当該水溶液のｐＨは３．６以上かつ５．６以下であり、好ましくは５．０未満である。上記方法は、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩を提供し、そのｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約３．９～６．０であり、好ましくは約３．９～５．３であり、向上した化学的安定性および／または物性を示す。
本発明の別の局面は、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩の、アルドースからケトースへの異性化を防止する、または軽減する方法であって、シアル化オリゴ糖水溶液を噴霧乾燥または凍結乾燥することを含む方法であり、当該水溶液のｐＨは５．６未満であり、好ましくは５．０未満である。上記方法は、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩を提供し、そのｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６．０以下であり、好ましくは約５．３以下であり、軽減されたアルドース－ケトース異性化を示す。
本発明の別の局面は、以下のステップ：
ａ）前記シアル化オリゴ糖水溶液を調製すること、
ｂ）必要に応じて、ｐＨが５．６以下、好ましくは５．０未満となるように、ステップａ）において得られた水溶液に酸性または塩基性非炭水化物成分を添加すること、次いで
ｃ）ステップａ）において得られた水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥すること、あるいはステップｂ）において得られた溶液のｐＨを調整することによって、非晶質シアル化オリゴ糖を得ること
を含む方法によって得られた、または得ることのできる、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩であり、ここで、前記シアル化オリゴ糖のｐＨが、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６．０以下、好ましくは約５．３未満である。
好ましくは、ｐＨは、３．６以上かつ５．６以下、好ましくは３．６以上かつ５．０以下となるように、ステップｂ）において調整する。
本発明は、加速熱安定性試験中に様々なｐＨを有する、凍結乾燥した６’－ＳＬサンプルにおいて形成された６’－シアリルラクツロースの量を示す、添付の図１を参照することによって、以下でさらに詳細に記載される。
本発明の詳細な説明
用語および定義
用語「シアル化オリゴ糖」は、少なくとも２つ、好ましくは３～８個、さらに好ましくは３～６個の単糖単位から成り、その少なくとも１つがシアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎｅｕ５Ａｃ）である、糖重合体を意味する。シアル化における、シアル酸以外の単糖単位は、アルドース（例えば、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロースなど）、ケトース（例えば、Ｄ－フルクトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－タガトースなど）、デオキシ糖（例えば、Ｌ－ラムノース、Ｌ－フコースなど）、デオキシ－アミノ糖（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルマンノサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンなど）、ウロン酸、ケトアルドン酸（例えば、シアル酸）、または遊離アミノ基を有するデオキシアミノ糖（例えば、グルコサミン）である、５～９個の炭素原子の糖であり、ただし、シアル化オリゴ糖の還元末端における単糖単位はアルドースである。三糖以上のオリゴ糖は、グリコキシド間結合によって互いに結合された単糖単位を含む、直鎖または分岐鎖構造を有しうる。
用語「シアル化ヒトミルクオリゴ糖」、「シアル化ＨＭＯ」、または「酸性ＨＭＯ」は、ヒト母乳において見られる、シアル酸を含む複雑な炭水化物（Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Medical Books, NY, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)）を意味する。ＨＭＯは、１つ以上のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニルおよび／または１つ以上のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長された還元末端において、ラクトース単位であるコア構造を有し、そのコア構造はα－シアリル基および適宜α－Ｌ－フコピラノシルによって置換されている。シアル化ＨＭＯにおいて、シアリル基は、α２，３－またはα２，６－結合によって末端ガラクトースに結合するか、α２，６－結合によってＮ－アセチルグルコサミンに結合する：
Figure 2022518440000001
酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、ＬＳＴ ａ（ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｆｕｃα１－４］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ＬＳＴ ｂ（Ｇａｌβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ＬＳＴ ｃ（ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－３］Ｇｌｃ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６］Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース Ｉ（ＳＬＮｎＨ－Ｉ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６］Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース ＩＩ（ＳＬＮｎＨ－ＩＩ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３［Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６］Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、およびジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳ－ＬＮＴ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）が挙げられる。
用語「シアル化オリゴ糖の酸付加塩」、「シアル化ＨＭＯの酸付加塩」、「シアル化オリゴ糖の塩」、または「シアル化ＨＭＯの塩」は、任意の化学量論比のシアル化オリゴ糖またはＨＭＯの負に帯電した酸残基とカチオンから成る、関連するイオン対を意味する。カチオンは一般に、無機（金属）カチオンである。シアル化オリゴ糖の酸付加塩において、好ましくはシアル化ＨＭＯであり、さらに好ましくは３’－ＳＬまたは６’－ＳＬであり、塩形成カチオンは、ある実施態様において、アルカリ金属イオン（Ｍ＋）、アルカリ土類金属イオン（Ｍ２＋）、またはそれらの混合物、例えばＮａ＋、Ｋ＋、またはＣａ２＋、好ましくはＮａ＋である。
用語「約」は、ある実施態様において、示される値から±１０％の偏差を意味し、あるいは別の実施態様において、±５％の偏差を意味する。
ｐＨ値に言及する場合、従来のｐＨ測定器で測定する。
向上した特性を有する非晶質シアル化オリゴ糖
非晶質化合物、特に親水性化合物は、一般に、より優れた水溶性、より高い溶解速度、およびより優れたバイオアベイラビリティを示し、これは医薬および食品業界における製品開発の重要な特徴であるが、その保存可能期間は、対応する結晶形態よりも短くなることが予想される。非晶質化合物は、結晶形態よりも化学分解／変換を受ける傾向が高く、それらの外観は、例えば凝集によって、不利に変化する可能性がある。本発明者らは、アルドース還元末端を有する非晶質（噴霧乾燥または凍結乾燥）シアル化オリゴ糖の特定のサンプルにおいて、長期保存時に、新たな炭水化物の種類の副生成物が出現し、サンプル中のその量は時間の関数として増加することに気付いた。
慎重に分析した結果、この夾雑物は、還元性アルドースオリゴ糖の転移型ケトース誘導体であることが判明し、この転移はアルドヘキソース上で以下のように説明することができる：
Figure 2022518440000002
本発明者らは、驚くべきことに、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥した、非晶質シアル化オリゴ糖が、ｐＨを注意深く調整した水溶液から調製した場合、シアル化オリゴ糖の非晶質形態において、上記の転移は生じないか、少なくとも著しく低くまたは低下した程度において生じることを発見した。これに関して、噴霧乾燥または凍結乾燥した物質の化学的安定性を実質的に向上させることができる。
したがって、本発明の第１の局面は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、前記非晶質シアル化オリゴ糖のｐＨが、６以下である、好ましくは約３．９～６．０、さらに好ましくは５．３以下、より好ましくは３．９～５．３である、非晶質シアル化オリゴ糖を提供することである。
ある実施態様において、非晶質シアル化オリゴ糖は、噴霧乾燥物質であり、他の実施態様において、凍結乾燥物質である。
好ましくは、ある実施態様において、シアル化オリゴ糖の還元末端における単糖単位はグルコースであり、より好ましくは、ガラクトース単位は、ラクトース部分を形成するβ１－４グリコシド間結合によって、前記グルコースに結合している。
好ましい実施態様において、シアル化オリゴ糖は、３個以上のオリゴ糖であり、有利には、還元末端にラクトース基を有する。
特に、還元末端においてラクトース部分を含む３糖以上のシアル化オリゴ糖は、シアル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。シアル化ＨＭＯは、好ましくは３～８糖のＨＭＯであり、さらに好ましくは３、４、５、または６糖のＨＭＯである。さらに好ましくは、３糖シアル化ＨＭＯは、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）および６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）から成る群から選択することができ；４糖シアル化ＨＭＯは、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）であり；５糖シアル化ＨＭＯは、ＬＳＴ ａ（ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ＬＳＴ ｂ（Ｇａｌβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、およびＬＳＴ ｃ（ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）から成る群から選択することができ；６糖シアル化ＨＭＯは、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３［Ｆｕｃα１－４］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－３］Ｇｌｃ）、およびジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳ－ＬＮＴ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３［ＮｅｕＡｃα２－６］ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）から成る群から選択することができる。
ある実施態様において、非晶質、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥した、本発明に記載のシアル化オリゴ糖は、１つより多いシアル化オリゴ糖またはＨＭＯ、例えば、２、３、４、または５個のシアル化オリゴ糖またはＨＭＯを含みうる。
別の実施態様において、非晶質、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥した、本発明に記載のシアル化オリゴ糖は、１つ以上の非シアル化中性オリゴ糖を含んでもよく；好ましくは、非晶質、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥した、本発明に記載のシアル化ＨＭＯは、１つ以上の非シアル化中性ＨＭＯ、例えば１つ以上の２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、およびＬＮｎＴなどを含んでもよい。好ましい実施態様において、非晶質、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥した、本発明に記載のシアル化オリゴ糖は、１または２個のシアル化オリゴ糖から成る、または実質的に成り；さらに好ましくは、噴霧乾燥または凍結乾燥した、本発明のシアル化ＨＭＯは、１または２個のシアル化ＨＭＯから成る、または実質的に成る。
高温における強制安定性比較試験は、シアル化オリゴ糖、好ましくはシアル化ＨＭＯの水溶液のｐＨを注意深く調整することによって、非晶質物質に固体化する前に、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥によって、固体（非晶質）状態において転位したウロースの形成が著しく減少することを示した。５ｗ／ｗ％水溶液中の、特許請求の範囲に記載される非晶質、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥した、シアル化オリゴ糖またはＨＭＯのｐＨは、約６．０以下であるべきである。これより高いｐＨは中性領域に非常に近く、比較試験によると、その領域においてアルドース－ケトース転位がさらに簡単に生じうる。そのため、前記シアル化オリゴ糖が生成されて、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥によって固体化したシアル化オリゴ糖が、５ｗ／ｗ％水溶液中で６．０以下のｐＨを有する場合、例えば、約４．５、５．１、または５．６以下など、例えば、約３．５～６、３．５～５．６、３．５～５．１、３．５～４．５、３．９～６、３．９～５．６、３．９～５．１、３．９～４．５、４．２～５．６、４．５～５．６、４．５～６．０、４．２～５．１、４．５～５．１、５．１～６．０、５．１～５．６、または５．６～６．０の間である場合、非晶質シアル化オリゴ糖におけるアルドース－ケトース異性化は減少するか、最小化されるか、あるいは防止することができる。好ましくは、５ｗ／ｗ％水溶液中の、特許請求の範囲に記載される非晶質、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥した、シアル化オリゴ糖またはＨＭＯのｐＨは、約５．３以下であるべきであり、例えば、約４．５または５．１以下など、例えば、約３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．１、または４．５～４．８の間である。さらに好ましくは、５ｗ／ｗ％水溶液中の、特許請求の範囲に記載される非晶質、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥した、シアル化オリゴ糖またはＨＭＯのｐＨは、約５．１以下であるべきであり、例えば、約４．５または４．８以下など、例えば、約３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．１、または４．５～４．８の間である。さらにより好ましくは、５ｗ／ｗ％水溶液中の、特許請求の範囲に記載される非晶質、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥した、シアル化オリゴ糖またはＨＭＯのｐＨは、約４．８以下であるべきであり、例えば、約４．５以下など、例えば、約３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～４．８、４．２～４．５、または４．５～４．８の間である。
さらに、高温における強制安定性比較試験は、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液のｐＨが低いほど、固体（非晶質）状態における構造からシアリル基が除かれる可能性が高いことを示した。これに関して、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥によって非晶質物質に固体化する前に、シアル化オリゴ糖の水溶液のｐＨを注意深く調節することによって、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの固体（例えば噴霧乾燥または凍結乾燥した、非晶質）状態において、全体的に副生成物（すなわち、転位ウロースおよび加水分解生成物）の生成が最小化される。したがって、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥した非晶質のシアル化オリゴ糖またはＨＭＯのｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約３．９より以上であることが望ましい。固体状態であっても、ｐＨが約３．９未満であると、少なくとも１つのグリコシド間結合、好ましくはシアロシド結合が加水分解されることによって、オリゴ糖の酸触媒による分解が開始すると考えられる。そのため、例えば、長期保存下で非晶質シアル化オリゴ糖中の分解（例えば、加水分解）および／または変換（例えば、ウロース転位などの転位）副生成物の含有量を減少または最小化することによって、前記非晶質シアル化オリゴ糖の化学的安定性および／または物性を向上させるために、非晶質物質に固体化した後のシアル化オリゴ糖の５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは、約３．９～６．０の間、例えば、３．９～５．６、３．９～５．１、４．２～５．６、４．５～５．６、４．５～６．０、４．２～５．１、４．５～５．１、５．１～６．０、５．１～５．６、または５．６～６．０の間など、さらに好ましくは、約３．９～５．３の間、例えば、３．９～５．１、４．２～５．１、４．５～５．１、４．８～５．１、４．２～５．３、４．５～５．３、４．８～５．３、３．９～４．８、４．２～４．８、４．５～４．８、３．９～４．５、４．２～４．５、または３．９～４．２の間など、よりさらにより好ましくは、約３．９～５．１の間、例えば、４．２～５．１、４．５～５．１、４．８～５．１、３．９～４．８、４．２～４．８、４．５～４．８、３．９～４．５、４．２～４．５、または３．９～４．２の間など、特に約３．９～４．８の間、例えば、４．２～４．８、４．５～４．８、３．９～４．５、４．２～４．５、または３．９～４．２の間などであることが好ましい。
本発明の第二の局面は、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの製造方法であって、好ましくは、第一の局面に記載されるように、以下のステップ：
ａ）前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液を調製すること、
ｂ）必要に応じて、ｐＨが５．６以下、好ましくは５．０未満となるように、ステップａ）において得られた水溶液に酸性または塩基性非炭水化物成分を添加すること、次いで
ｃ）ステップａ）において得られた水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥すること、あるいはステップｂ）において得られた溶液のｐＨを調整すること
によって、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯを得ること
を含む、製造方法に関し、ここで、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯのｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６．０以下であり、好ましくは約５．３以下である。
ステップｂ）において、語句「必要に応じて」は、ステップａ）において得られた溶液のｐＨが５．６より高く、酸成分を添加することによって、ｐＨを５．６以下に下げなければならない状況をいい；好ましくは、ｐＨが５．０以上である場合は、ｐＨは５．０未満に下げなければならない。さらに、ステップａ）において得られた溶液が酸性すぎる場合、塩基の添加が必要でありうる。したがって、ステップａ）において得られた溶液のｐＨが５．６よりも高い場合、ステップｂ）は必須であり、ステップｃ）はステップｂ）の後に得られた溶液を固体化し、それ以外の場合はステップｂ）は任意であり；好ましくは、ステップａ）において得られた溶液のｐＨが５．０以上である場合、ステップｂ）は必須であり、ステップｃ）はステップｂ）の後で得られた溶液を固体化し、それ以外の場合はステップｂ）は任意である。ステップａ）において得られた溶液のｐＨが５．６以下、好ましくは５．０未満である場合、ステップｂ）は飛ばしてもよく、ステップｃ）はステップａ）において得られた溶液を固体化する。
この点に関して、第二の局面に記載される方法は、以下のステップ：
ｉ）シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液を調製すること、
ｉｉ）ステップｉ）において得られた溶液のｐＨを確認すること、
ｉｉｉａ）前記ｐＨが５．６よりも高い場合、酸性非炭水化物成分を加えて、ｐＨを５．６以下に下げ、好ましくは前記ｐＨが５．０以上である場合、酸性非炭水化物成分を加えて、ｐＨを５．０以下に下げること、
ｉｉｉｂ）前記ｐＨが５．６以下である場合、酸性または塩基性非炭水化物成分を適宜加えて、ｐＨを５．６以下に維持してもよく；好ましくは、前記ｐＨが５．０未満である場合、酸性または塩基性非炭水化物成分を適宜加えて、ｐＨを５．０未満に維持してもよく、
ｉｖ）ステップｉｉｉａ）またはステップｉｉｉｂ）で得られた水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥すること
を含む。
ある実施態様において、第一の局面に記載される非晶質シアル化オリゴ糖を製造することができ、ここで
－ステップｂ）において必要に応じて、ｐＨが３．６以上かつ５．６以下、好ましくは５．０未満となるように、酸性または塩基性非炭水化物成分をステップａ）で得られた水溶液に加える、
－ステップｉｉｉａ）において、酸性非炭水化物成分を加えて、ｐＨを３．６から５．６の間、好ましくは３．６から５．０未満の間に設定する、あるいは
－ステップｉｉｉｂ）において、酸性または塩基性非炭水化物成分を適宜加えて、ｐＨを３．６から５．６の間、好ましくは３．６から５．０未満の間に維持または設定してもよい。
当該方法のステップａ）またはステップｉ）において、シアル化オリゴ糖の水溶液は従来の方法で合成される。溶液が透明で、シアル化オリゴ糖が完全に溶解しているのが好ましい。水を添加する／または水に添加する前に、シアル化オリゴ糖は、任意の固体形態（例えば、結晶、非晶質［沈殿、凍結乾燥、噴霧乾燥］、またはそれらの混合物）、シロップ状、または水溶液であってもよい。シアル化オリゴ糖は、ステップａ）またはステップｉ）を行う前に、いくらかのまたは残留量の（揮発性）有機溶媒を含んでもよく、なぜなら、これらの溶媒は、当該方法のステップｃ）またはステップｉｖ）において実質的に除去されるか、あるいは除去することができ、最終的に得られる非晶質物質には含まれないためである。ステップａ）またはステップｉ）において得られたシアル化オリゴ糖水溶液の濃度は重要ではなく、ｐＨが酸性の場合、広い濃度間隔の範囲になりうる。水溶液中のシアル化オリゴ糖またはＨＭＯの濃度は、測定したｐＨには実際に影響しないが、ｐＨの濃度依存性は、約±０．３ｐＨ単位範囲内であり、シアル化オリゴ糖のｐＫａ値に近づくほど、予想される変化は小さくなる。使用するのに便利な濃度範囲は、希釈しすぎず、濃縮しすぎない範囲であり、例えば、１～６０ｗ／ｗ％である。
当該方法のステップｂ）またはステップｉｉｉｂ）において、ステップａ）またはステップｉ）において得られた溶液のｐＨ調整が、それぞれ必要でありうる。シアル化オリゴ糖自体は酸性化合物であり、そのため、その水溶液は実際には７未満のｐＨを有し、より正確には、溶液中の酸性および相補的な塩基性（塩）形態の比によって変化する。そのため、化合物の元のｐＨから逸脱したい場合は、酸性物質、好ましくは酸性非炭水化物成分、または塩基性物質、好ましくは塩基性非炭水化物成分のいずれかを添加して、必要なｐＨに設定することができる。
ステップｂ）、ｉｉｉａ）、またはｉｉｉｂ）のいずれかの場合において、好ましくは撹拌しながら、酸性または塩基性物質をシアル化オリゴ糖水溶液にゆっくりと加え、ｐＨを、例えばｐＨメーターによって連続的に確認する。必要なｐＨに達したら、酸または塩基の添加を終了する。ｐＨ調節が行われる場合、水溶液中のシアル化オリゴ糖の濃度は、実用的な理由から、好ましくは１～６０ｗ／ｗ％の間である。
ステップｉｉｉａ）において添加される、またはステップｂ）またはｉｉｉｂ）において適宜添加される、酸性非炭水化物成分は一般に、無機酸、または炭水化物とは異なり、酸性の性質を有する有機化合物である。好ましくは、適切な無機酸および有機酸は、製薬および食品業界において用いられる場合、安全性の懸念がないことが既知であるもの、例えば、一般に、塩基性を有する活性な医薬成分の薬学的に許容可能な酸付加塩を製造するために用いられるものである。無機酸は、例えば硫酸およびそのモノタール（monotal）（硫酸一ナトリウムなど）、ＨＣｌ、ＨＢｒ、硝酸、リン酸およびそのモノおよびジ塩（リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウムなど）、または過塩素酸から選択することができる。また好ましくは、適切な有機酸は、ギ酸、酢酸、またはプロピオン酸などのアルカノン酸、シュウ酸、マロン酸、またはコハク酸などのアルカノン二酸、酒石酸、乳酸またはリンゴ酸などのヒドロキシ酸、クエン酸などのトリカルボン酸である。
ステップｂ）またはｉｉｉｂ）において任意に添加される塩基性非炭水化物成分は、一般に、金属（例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属）、ヒドロキシド、炭酸塩または重炭酸塩、有利には、ヒドロキシド、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、またはＣａ（ＯＨ）２、好ましくはＮａＯＨなどの無機塩基である。
ステップａ）またはｉ）において得られる水溶液、またはステップｂ）、ｉｉｉａ）、またはｉｉｉｂ）において調製される水溶液のｐＨは、上記ステップｃ）またはｉｖ）によって固体化した後の非晶質シアル化オリゴ糖の５ｗ／ｗ％水溶液中で測定されうるｐＨ値と必ずしも同じでなくてもよく、最大で約＋０．２～０．５ｐＨ単位で異なっていてもよく、約０．２～０．５ｐＨ単位で高くてもよい。考えられる原因としては、ｐＨ電極の順番を間違えたことを除いて、固体化の条件下でサンプルの組成がわずかに変化すること（例えば、揮発性酸成分の蒸発、後のｐＨに影響を与えるわずかな分解など）、および／または緩衝容量がわずかに変化することが考えられる。経験的に、ステップａ）またはｉ）において得られた水溶液、またはステップｂ）、ｉｉｉａ）、またはｉｉｉｂ）において調製した水溶液のｐＨは３．１～５．６の間であると測定された場合、ステップｃ）またはｉｖ）において固体化した結果として得られた非晶質シアル化オリゴ糖のｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約３．４～６．０である。
ステップｃ）において、ステップａ）またはｂ）において得られた水溶液を、いずれの場合においても、従来の方法：例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、または沈殿によって、非晶質物質に固体化する。同様に、ステップｉｖ）において、ステップｉｉｉａ）またはｉｉｉｂ）において得られた水溶液を、いずれの場合においても、従来の方法：例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、または沈殿によって、非晶質物質に固体化する。
本発明の第３の局面は、第二の局面に記載された方法によって得られる、または得ることができる、非晶質シアル化オリゴ糖に関する。
非晶質シアル化オリゴ糖の化学的安定性および／または物性を向上させるための方法
本発明の第四の局面は、アルドースからケトースへの非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの異性化を防止する、または軽減するための方法であって、シアル化オリゴ糖の水溶液を噴霧乾燥または凍結乾燥させることを含む方法であり、そのｐＨは５．６以下、好ましくは５．０未満である。上記方法は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合のｐＨが、約６．０以下、好ましくは５．３である、非晶質シアル化オリゴ糖を提供し、これは軽減されたアルドース－ケトース異性化を示す。
本発明者らは、驚くべきことに、非晶質状態において、非晶質、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥された、シアル化オリゴ糖またはＨＭＯが、ｐＨを注意深く調整した水溶液から調製された場合に、上記転位は起こらない、または少なくとも著しく低い、または軽減された程度で起こることが分かった。これに関して、噴霧乾燥または凍結乾燥した物質の化学的安定性を、実質的に向上させることができる。これは、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯが前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液から製造される場合に達成され、当該水溶液のｐＨは５．６以下、例えば、４．１、５．１、または５．６以下など、例えば、３．１～５．６、３．１～５．１、３．１～４．６、３．１～４．１、３．６～５．６、３．６～５．１、３．６～４．６、３．６～４．１、３．９～５．１、４．１～５．１、４．１～５．６、３．９～４．６、４．１～４．６、４．６～５．６、４．６～５．１、または５．１～５．６の間である。そのように製造された非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６．０以下、例えば、約４．５、５．１、または５．６以下など、例えば、約３．５～６、３．５～５．６、３．５～５．１、３．５～４．５、３．９～６、３．９～５．６、３．９～５．１、３．９～４．５、４．２～５．６、４．５～５．６、４．５～６．０、４．２～５．１、４．５～５．１、５．１～６．０、５．１～５．６、または５．６～６．０の間のｐＨを有する。
好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯは、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液から製造され、当該水溶液のｐＨは５．０未満、例えば、４．１または４．８以下など、例えば、３．１～４．８、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．０、４．２～４．８、または４．２～４．５の間である。
そのように製造された非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．３以下、例えば、約４．５または５．１以下など、例えば、約３．５～５．３、３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．３、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．３、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．３、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。
さらに好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯは、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液から製造され、水溶液のｐＨは４．８以下、例えば、３．１～４．８、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～４．８、または４．２～４．５の間である。そのように製造された非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．１以下、例えば、約４．５または４．８以下など、例えば、約３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。
さらにより好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯは、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液から製造され、当該水溶液のｐＨは、４．５以下、例えば、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．５、３．９～４．２、または４．２～４．５の間である。そのように製造された非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約４．８以下、例えば、約４．５以下など、例えば、約３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～４．８、４．２～４．５、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。
ある実施態様において、シアル化オリゴ糖は、３’－ＳＬ、その塩、好ましくはナトリウム塩、またはそれらの混合物である。非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物はその水溶液から製造され、そのｐＨは５．６以下、例えば、４．１、５．１、または５．６以下など、例えば、３．２～５．６、３．２～５．１、３．２～４．６、３．２～４．１、３．６～５．６、３．６～５．１、３．６～４．６、３．６～４．１、３．９～５．１、４．１～５．１、４．１～５．６、３．９～４．６、４．１～４．６、４．６～５．６、４．６～５．１、または５．１～５．６の間である。そのように製造した非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６．０以下、例えば、約４．５、５．１、または５．６以下など、例えば、約３．９～６、３．９～５．６、３．９～５．１、３．９～４．５、４．２～５．６、４．５～５．６、４．５～６．０、４．２～５．１、４．５～５．１、５．１～６．０、５．１～５．６、または５．６～６．０の間のｐＨを有する。好ましくは、非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは５．０未満、例えば、４．１または４．８以下など、例えば、３．１～４．８、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．０、４．２～４．８、または４．２～４．５の間である。そのように製造される非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．３以下、例えば、約４．５または５．１以下など、例えば、約３．５～５．３、３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．３、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．３、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．３、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。さらに好ましくは、非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは４．８以下、例えば、３．１～４．８、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～４．８、または４．２～４．５の間である。そのように製造される非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．１以下、例えば、約４．５または４．８以下など、例えば、約３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。さらにより好ましくは、非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは４．５以下、例えば、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．５、３．９～４．２、または４．２～４．５の間である。そのように製造される非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約４．８以下、例えば、約４．５以下など、例えば、約３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～４．８、４．２～４．５、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。別の実施態様において、シアル化オリゴ糖は、６’－ＳＬ、その塩、好ましくはナトリウム塩、またはそれらの混合物である。非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは５．２以下、例えば、４．０または４．８以下など、例えば、３．１～５．２、３．１～４．８、３．１～４．０、３．６～５．２、３．６～４．８、３．６～４．０、４．０～５．２、４．０～４．８、または４．８～５．２の間である。そのように製造された非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．６以下、例えば、約４．３または５．１以下など、例えば、約３．４～４．３、３．４～５．１、３．４～５．６、３．９～５．６、３．９～５．１、３．９～４．３、４．３～５．６、４．３～５．１、または５．１～５．６の間のｐＨを有する。好ましくは、非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは５．０未満であり、例えば、４．１または４．８以下など、例えば、３．１～４．８、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．０、４．２～４．８、または４．２～４．５の間である。そのように製造される非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．３以下、例えば、約４．５または５．１以下など、例えば、約３．５～５．３、３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．３、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．３、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．３、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。さらに好ましくは、非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは４．８以下、例えば、３．１～４．８、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～４．８、または４．２～４．５の間である。そのように製造される非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．１以下、例えば、約４．５または４．８以下など、例えば、約３．５～５．１、３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。さらにより好ましくは、非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは４．５以下、例えば、３．１～４．５、３．１～４．１、３．１～３．９、３．１～３．６、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．５、３．９～４．２、または４．２～４．５の間である。そのように製造された非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約４．８以下、例えば、約４．５以下など、例えば、約３．５～４．８、３．５～４．５、３．５～４．２、３．５～３．９、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～４．８、４．２～４．５、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。
本発明の第五の局面は、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの化学的安定性および／または物性を向上させるための方法であって、ｐＨが３．６以上、例えば３．９などであり、５．６以下、５．０未満である、シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥することを含む方法に関する。上記方法は、向上した化学的安定性および／または物性を示す、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯを提供し、そのｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、３．９以上であり、約６．０以下である、好ましくは５．３である。
用語「非晶質シアル化オリゴ糖の向上した化学的安定性」は、好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖が製造される水溶液のｐＨが上記範囲である場合、上記に開示される範囲外のｐＨの水溶液から製造される非晶質シアル化オリゴ糖と比べて、非晶質シアル化オリゴ糖の化学的分解または転位反応が生じにくいことを意味する。したがって、物質の保存可能期間に影響する化学的安定性が改善される。化学的分解の例は、少なくとも１つのグリコシド間結合、一般にはシアル酸結合の破壊による加水分解であり；化学的転位の例は、アルドースからケトースへの転位である。
用語「非晶質シアル化オリゴ糖の物性の向上」は、好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖が製造される水溶液のｐＨが上記範囲内である場合、上記に開示される範囲外のｐＨの水溶液から製造される非晶質シアル化オリゴ糖と比べて、非晶質シアル化オリゴ糖がより良好な物性を示すことを意味する。改善された物性の例は、相変化（例えば、ガラス化、結晶化）の傾向の低下、または凝集度の低下である。
本発明者らは、驚くべきことに、前記シアル化オリゴ糖の固体（例えば噴霧乾燥または凍結乾燥された、非晶質）状態において、全体的な副生成物（すなわち、転位したウロースおよび加水分解生成物）の生成が最小化されうることを発見した。これは、非晶質シアル化オリゴ糖が前記シアル化オリゴ糖の水溶液から製造され、そのｐＨが３．６以上かつ５．６以下、例えば、３．６～５．１、３．６～４．６、３．９～５．１、４．１～５．１、４．１～５．６、３．９～４．６、４．１～５．６、４．６～５．６、４．６～５．１、または５．１～５．６などである場合に達成される。そのように製造される非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、３．９以上かつ６．０以下、例えば、３．９～５．６、３．９～５．１、４．２～５．６、４．５～５．６、４．５～６．０、４．２～５．１、４．５～５．１、５．１～６．０、５．１～５．６、または５．６～６．０などのｐＨを有する。
好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯは、水溶液のｐＨが３．６以上かつ５．０未満、例えば、３．６～４．６、３．６～４．２、３．６～３．９、３．９～４．６、３．９～４．２、または４．１～４．６の間である、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液から製造される。そのように製造される非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、３．９以上かつ約５．３以下、例えば、約３．９～５．３、３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．２、４．２～５．３、４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．３、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。
さらに好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯは、水溶液のｐＨが３．９以上かつ５．０未満、例えば、３．９～４．６、３．９～４．２、または４．１～４．６の間である、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液から製造される。そのように製造される非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、４．２以下かつ約５．３以下、例えば、約４．２～５．１、４．２～４．８、４．２～４．５、４．５～５．３、４．５～５．１、または４．５～４．８の間のｐＨを有する。
さらにより好ましくは、非晶質シアル化オリゴ糖またはＨＭＯは、前記シアル化オリゴ糖またはＨＭＯの水溶液から製造され、その水溶液のｐＨは３．９以上かつ４．５以下、例えば３．９～４．２の間である。そのように製造される非晶質シアル化オリゴ糖は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、４．２以上かつ約４．８以下、例えば約４．２～４．５または４．５～４．８の間のｐＨを有する。
ある実施態様において、シアル化オリゴ糖は、３’－ＳＬ、その塩、好ましくはナトリウム塩、またはそれらの混合物である。非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物はその水溶液から製造され、そのｐＨは３．９以上かつ５．６以下、例えば、３．６～５．６、３．６～５．１、３．６～４．６、３．６～４．１、３．９～５．１、４．１～５．１、４．１～５．６、３．９～４．６、４．１～４．６、４．６～５．６、４．６～５．１、または５．１～５．６などである。そのように製造される非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約４．２～６．０、例えば、約４．２～５．６、４．５～５．６、４．５～６．０、４．２～５．１、４．５～５．１、５．１～６．０、５．１～５．６、または５．６～６．０のｐＨを有する。好ましくは、非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは３．９以上かつ５．０未満であり、例えば、３．９～４．６、３．９～４．１、または４．１～４．６の間である。そのように製造される非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、４．２以上かつ約５．３以下、例えば、約４．２～４．９、４．２～４．５、４．５～５．３、または４．５～４．９の間のｐＨを有する。さらに好ましくは、非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは３．９以上かつ４．６以下、例えば、３．９～４．１または４．１～４．６の間である。そのように製造される非晶質３’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、４．２以上かつ約４．９以下、例えば、約４．２～４．５または４．５～４．９の間のｐＨを有する。
別の実施態様において、シアル化オリゴ糖は、６’－ＳＬ、その塩、好ましくはナトリウム塩、またはそれらの混合物である。非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは３．６以上かつ５．２以下、例えば、３．６～５．２、３．６～４．８、３．６～４．０、４．０～５．２、４．０～４．８、または４．８～５．２の間などである。そのように製造された非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約３．９～５．６、例えば、約３．９～５．１、３．９～４．３、４．３～５．６、４．３～５．１、または５．１～５．６の間のｐＨを有する。好ましくは、非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは３．６以上かつ４．８以下、例えば、４．０または４．４以下など、例えば、３．６～４．４、３．６～４．０、４．０～４．８、４．０～４．４、または４．４～４．８の間である。そのように製造される非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約３．９～５．１、３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．３、４．３～５．１、４．３～４．８、または４．３～４．５のｐＨを有する。さらに好ましくは、非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、その水溶液から製造され、そのｐＨは３．６以上かつ４．４未満、例えば、４．０以下など、例えば、３．６～４．０または４．０～４．４の間である。そのように製造される非晶質６’－ＳＬ、その塩、またはそれらの混合物は、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約３．９～４．８、３．９～４．５、３．９～４．３、４．３～４．８、または４．３～４．５のｐＨを有する。
上記に開示される全ての局面に関して、ある実施態様において、シアル化オリゴ糖は、シアル化ＨＭＯ、その酸付加塩、またはそれらの混合物である。好ましい実施態様において、シアル化ＨＭＯは３’－ＳＬ、その酸付加塩、またはそれらの混合物、好ましくはナトリウム塩である。別の好ましい実施態様において、シアル化ＨＭＯは６’－ＳＬ、その酸付加塩、またはそれらの混合物、好ましくはナトリウム塩である。
実施例１
３’－ＳＬ Ｎａ塩は細菌発酵によって製造し、例えば、ＷＯ２０１７／１５２９１８に従って単離した。濃度が５．３ｇ／１００ｇ、ｐＨ：４．８である、ストック水溶液を作成した。
シリーズＡ：１Ｍ ＨＣｌ溶液の添加によって、上記ストック水溶液の一部をｐＨ３．６に調整した。そのように得られた溶液を凍結乾燥させて、白色の非晶質粉末を得た。５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは３．９であった。
シリーズＢ：１Ｍ ＮａＯＨ溶液の添加によって、上記ストック水溶液の一部をｐＨ５．１に調整した。そのように得られた溶液を凍結乾燥させて、白色の非晶質粉末を得た。５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは５．６であった。
シリーズＣ：１Ｍ ＮａＯＨ溶液の添加によって、上記ストック水溶液の一部をｐＨ６．８に調整した。そのように得られた溶液を凍結乾燥させて、白色の非晶質粉末を得た。５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは６．７であった。
各シリーズから７ｘ１グラムを別々に、４ｍｌのガラスバイアルに入れ、テフロンインライナーを含むスクリュー蓋で閉じた（合計２１サンプル）。各シリーズの３つのサンプルを６０℃のオーブンに入れ、各シリーズの他の３つのサンプルを８０℃のオーブンに入れた。各シリーズの１つのサンプルは、以下に示す時間の後、オーブンから取り出し、解析まで冷凍庫で保管した。ｔ＝０サンプル（各シリーズから１つのサンプル）は、全試験の期間、冷凍庫で保管した。
サンプルは、目視検査に基づく調査の間、相変化を示さなかった。
定組成７５ｍＭ ＮａＯＨ＋３７．５ｍＭ ＮａＯＡｃ溶出液を用いて、Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ－２００（３ｘ２５０ｍｍ）カラムにおけるＨＰＡＥＣ－ＰＡＤによって、最長のインキュベーションが完了した後、サンプルを一緒に解析した。
以下の表は、サンプル中の３’－Ｏ－シアリル－ラクツロース、３’－ＳＬのケトース転位誘導体の含有量を示す（面積％、量に比例）。
Figure 2022518440000003
データは、ｐＨが高いほど、強制条件下で転位した副生成物の量が増えることを示す。これは、固体サンプルにおいて、環境温度で保管した場合に、有意な量の３’－Ｏ－シアリル－ラクツロースの生成を防止／減少させるために、非晶質３’－ＳＬのｐＨが、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６以下でなければならないことを示唆する。
さらに、同じ研究により、ｐＨが低いほど、強制条件下で加水分解された副生成物（ラクトースおよびシアル酸）の量が増えることが明らかになった（データは示されていない）。この点について、シリーズＢからのサンプルには、副生成物（転位ケトース＋加水分解生成物）の総量が最小で含まれていた。これは、環境温度で保管した場合に、非晶質サンプルにおいて有意な総量の配位および加水分解副生成物の生成を最小化するために、非晶質３’－ＳＬのｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約６以下かつ約４．２以上であるべきであることを示唆している。
実施例２
６’－ＳＬ Ｎａ塩は細菌発酵によって製造し、例えば、ＵＳ２０１８／０００２３６３に従って単離した。濃度が９．１ｇ／１００ｇであり、ｐＨ：５．４である、ストック水溶液を作成した。
シリーズＡ：１Ｍ ＨＣｌ溶液の添加によって、上記ストック水溶液の一部をｐＨ３．１に調整した。そのように得られた溶液を凍結乾燥させて、白色の非晶質粉末を得た。５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは３．５であった。
シリーズＢ：１Ｍ ＨＣｌ溶液の添加によって、上記ストック水溶液の一部をｐＨ４．０に調整した。そのように得られた溶液を凍結乾燥させて、白色の非晶質粉末を得た。５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは４．３であった。
シリーズＣ：１Ｍ ＨＣｌ溶液の添加によって、上記ストック水溶液の一部をｐＨ４．８に調整した。そのように得られた溶液を凍結乾燥させて、白色の非晶質粉末を得た。５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは５．１であった。
シリーズＤ：１Ｍ ＮａＯＨ溶液の添加によって、上記ストック水溶液の一部をｐＨ６．８に調整した。そのように得られた溶液を凍結乾燥させて、白色の非晶質粉末を得た。５ｗ／ｗ％溶液のｐＨは６．２であった。
各シリーズから４ｘ１グラムを別々に、４ｍｌのガラスバイアルに入れ、テフロンインライナーを含むスクリュー蓋で閉じた（合計１６サンプル）。各シリーズの３つのサンプルを８０℃のオーブンに入れた。１週間後、２週間後、および４週間後にそれぞれ、各シリーズから１つのサンプルをオーブンから取り出し、解析まで冷凍庫で保管した。ｔ＝０サンプルは、安定性試験の全期間、冷凍庫で保管した。
サンプルは、目視検査に基づく検査の間、相変化を示さなかった。
定組成７５ｍＭ ＮａＯＨ＋３７．５ｍＭ ＮａＯＡｃ溶出液を用いて、Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ－２００（３ｘ２５０ｍｍ）カラムにおけるＨＰＡＥＣ－ＰＡＤによって、最長のインキュベーションが完了した後、サンプルを一緒に解析した。
図１は、サンプル中の６’－シアリル－ラクツロース、６’－ＳＬのケトース転位誘導体の含有量、およびその生成傾向を示す（面積％、量に比例）。
データは、ｐＨが高いほど、強制条件下で転位した副生成物の量が増えることを示す。これは、固体サンプルにおいて、環境温度で保管した場合に、有意な量の６’－Ｏ－シアリル－ラクツロースの生成を防止／減少させるために、非晶質６’－ＳＬのｐＨが、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．５以下でなければならないことを示唆する。
さらに、同じ研究により、ｐＨが低いほど、強制条件下で加水分解された副生成物（ラクトースおよびシアル酸）の量が増えることが明らかになった（データは示されていない）。この点について、シリーズＢおよびＣからのサンプルには、副生成物（転位ケトース＋加水分解生成物）の総量が最小で含まれていた。これは、環境温度で保管した場合に、非晶質サンプルにおいて有意な総量の転位および加水分解副生成物の生成を最小化するために、非晶質６’－ＳＬのｐＨは、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約５．５以下かつ約３．９以上であるべきことを示唆している。

Claims (15)

  1. 非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩の、アルドースからケトースへの異性化を防止する、または軽減する方法であって、シアル化オリゴ糖水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥することを含む方法であって、前記水溶液のｐＨが５．０未満である、方法。
  2. 水溶液のｐＨが４．８以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 水溶液のｐＨが４．５以下である、請求項２に記載の方法。
  4. シアル化オリゴ糖が、シアル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、好ましくは３’－ＳＬまたは６’－ＳＬである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩の化学的安定性および／または物性を向上させる方法であって、シアル化オリゴ糖水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥することを含む方法であって、前記水溶液のｐＨが３．６以上かつ５．０未満である、方法。
  6. 化学的安定性の向上によって、アルドースからケトースへの異性化および加水分解が防止または軽減される、請求項５に記載の方法。
  7. 水溶液のｐＨが３．９以上かつ５．０未満である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 水溶液のｐＨが３．９以上かつ４．５以下である、請求項７に記載の方法。
  9. シアル化オリゴ糖がシアル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. シアル化ＨＭＯが、
    －３’－ＳＬまたはその塩であり、水溶液のｐＨが３．９以上である、または
    －６’－ＳＬまたはその塩であり、水溶液のｐＨが３．６以上である、
    請求項９に記載の方法。
  11. 非晶質シアル化オリゴ糖のｐＨが、５ｗ／ｗ％の水溶液中で測定した場合、約３．９～５．３である、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩。
  12. シアル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、好ましくは３’－ＳＬまたは６’－ＳＬである、請求項１１に記載の非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩。
  13. 以下：
    ａ）前記シアル化オリゴ糖水溶液を調製すること、
    ｂ）必要に応じて、ｐＨが３．６以上かつ５．０未満となるように、ステップａ）において得られた水溶液に酸性または塩基性非炭水化物成分を添加すること、次いで
    ｃ）ステップａ）において得られた水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥すること、あるいはステップｂ）において得られた溶液のｐＨを調整すること
    によって、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩を得る方法によって得られる、または得ることができる、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩であって、前記シアル化オリゴ糖のｐＨが、５ｗ／ｗ％水溶液中で測定した場合、約３．９～５．３未満である、非晶質シアル化オリゴ糖またはその塩。
  14. 以下のステップ：
    ａ）前記シアル化オリゴ糖水溶液を調製すること、
    ｂ）必要に応じて、ｐＨが３．６以上かつ５．０未満となるように、ステップａ）において得られた水溶液に酸性または塩基性非炭水化物成分を添加すること、次いで
    ｃ）ステップａ）において得られた水溶液を固体化すること、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥すること、あるいはステップｂ）において得られた溶液のｐＨを調整すること
    を含む、請求項１１に記載の非晶質シアル化オリゴ糖の製造方法。
  15. シアル化オリゴ糖が、シアル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、好ましくは３’－ＳＬまたは６’－ＳＬである、請求項１４に記載の方法。
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