JP2022508775A - 抗BCMA一本鎖抗体scFv、並びにその作製方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:28)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:30)であるCDR2と、配列がQQALVVTPFT (SEQ ID NO:32)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:35)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:37)であるCDR2と、配列がARFGMLDN (SEQ ID NO:39)であるCDR3と、を含み、
又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:42)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:44)であるCDR2と、配列がQQRLTPSPFT (SEQ ID NO:46)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:49)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:51)であるCDR2と、配列がARNTALLDN (SEQ ID NO:53)であるCDR3と、を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLAWTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 4)であり、
前記重鎖可変領域(VH)は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRG HSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSIFNGYDVLDNWGQG TLVTVSS (SEQIDNO: 3)であり、又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVVTPFTFGQGTKLEIKR (SEQ IDNO: 8)であり、
前記重鎖可変領域(VH)は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRG HSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGMLDNWGQGTLVTV SS (SEQIDNO: 7)であり、又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRLTPSPFTFGQGTKLEIK (SEQIDNO: 12)であり、
前記重鎖可変領域(VH)は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRG HSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNTALLDNWGQGTLVT VSS (SEQIDNO: 11)である。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLAWTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSIFNGYDVLD NWGQGTLVTVSS (SEQIDNO: 1)であり、又は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVVTPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGMLDNWGQG TLVTVSS (SEQIDNO: 5)であり、又は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRLTPSPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNTALLDNWGQ GTLVTVSS (SEQIDNO: 9)である。
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 28、 SEQ ID NO: 30及びSEQ ID NO: 32をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 35、SEQ ID NO: 37及びSEQ ID NO: 39をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 42、SEQ ID NO: 44及びSEQ ID NO: 46をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域配列SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 51及びSEQ ID NO: 53をコードするヌクレオチド配列とを含む。
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 8をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 7をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 12をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 11をコードするヌクレオチド配列とを含む。
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGG TGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCGCATG GACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAGG AGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCCA GAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAG CGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGC CTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAGT TCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACT GAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGGGTTCTATTTTC AACGGTTACGACGTTCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC (SEQIDNO: 2);であり、又は、
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGG TGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCTCTTGTGGTGACGCC GTTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGA GGAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTC CAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGG GCCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGA AGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGA ACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGTTTTAGGGT ATGCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO: 6);であり、又は、
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGG TGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCGTTTGACGCCGTCTCCG TTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAG GAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCC AGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCA GCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAA CTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGAATACGGCTT TGCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO: 10) である。
上記方法で獲得された3株の抗BCMAのscFv抗体のアミノ酸とヌクレオチドの配列情報は、表1に示すとおりである。
単鎖抗体をランダムに合成するファージ提示ライブラリーの構築
(1)CDR3領域突然変異の設計
それぞれ抗BCMAのヒト化scFvの重鎖と軽鎖配列を基礎として、突然変異プライマーを設計し、重鎖と軽鎖のCDR3領域に突然変異をそれぞれ導入し、人工合成の二次ライブラリー(部位特異的変異用)とランダムライブラリー(ランダム部位変異用)を構築する。突然変異プライマーの配列は、表3に示すとおりである。
BCMA抗体の重鎖と軽鎖可変領域遺伝子を合成し、遺伝子座Sfi IからpComb3XSSベクター(武漢▲みょう▼霊生物科技有限公司から購入)に挿入する。抗体フラグメント増幅のプライマー情報は、表4に示すとおりである。
各プライマー乾燥粉末を100μM希釈標準溶液に調製し、ランダムライブラリープライマーを重鎖プライマーH3-211(H3-2、H3-4、H3-9、H3-11各5μL)と軽鎖プライマーL3-459(L3-4、L3-5、L3-9各5μL)に混合した。
90℃、5分間;75℃、45秒;70℃、1分間;65℃、1分間;60℃、1分間;55℃、5 分間;50℃、5分間;45℃、30秒;37℃、10分間;30℃、45秒;25℃、45秒;22℃、90秒;20℃、5分間;1サイクル。
各系にT4リガーゼを5μL加え、室温でライゲーション2時間。
二次ライブラリーとランダムライブラリーにそれぞれ15μLの3MNaAc(pH5.5)を加えてpHを調節し、ライゲーション生成物をPCR Purification Kit(QIAGEN)で精製した後、Nanodropを用いて精製生成物を定量した。それぞれ1μLの精製後の二次ライブラリーとランダムライブラリーを取って高効率TGコンピテント細胞(Lucigen、米国)形質転換、37℃で1時間蘇生し、106に段階希釈し、塗抹プレートをそれぞれ300μL取り、37℃で一夜培養した。翌日、プレート上のクローン数をカウントし、式「ライブラリー容量=クローン数X希釈度X1000/30 」によって計算した。
ステップ(4)の二次ライブラリーとランダムライブラリーの36個のクローンをそれぞれランダムに採取し、鋳型としてクローン(done) PCRを行い、1.5%のアガロースゲル電気泳動を用いてPCR生成物を検出し、図2に示すように、二次ライブラリー(クローン1-36)とランダムライブラリー(クローン37-72)の組換え率は、94%と100%であった。ランダムに56個のクローンを選んでSangerシークエンシングに送り、ファージ提示ライブラリーの多様性を分析した;scFv配列の分析結果によると、二級ライブラリーにおける26本の配列のうちの11本には、突然変異があり、ランダムライブラリーにおける25本の配列のうちの14本には、突然変異があり、多様性がそれぞれ42%と56%に達し、次の新規抗体のスクリーニングに応用できる。
上記で得られた二次ライブラリーとランダムライブラリーのファージ提示を増殖とバクテリオファージレスキューし、ステップ(4)で保存されたファージライブラリー1mlをそれぞれ100ml培地にアクセスして対数増殖期まで培養し、MOI(multiplicity of infection、多重感染度)が20である補助ファージM13K0を加え、室温、30分間静置し、低速遠心後、沈殿用培地で懸濁させ、300m培地にアクセスし、一夜培養した。翌日、3000遠心30分間、上清を収集し、PEG沈殿ファージを加え、氷上で30分間静置し、3000遠心30分間、沈殿、BCMAを持つscFvのファージライブラリーとなり、PBSで懸濁沈殿した後、その力価を測定し、測定結果、二次ライブラリーは、2.6X1012pfu/mlであり、ランダムライブラリーは、3.3X1012pfu/mlであった。
ファージ提示法によりBCMAの高親和性抗体のスクリーニング
(1)ファージのアフィニティー・パニング
100ngBCMA-his抗原をそれぞれ取り、ELISAプレートをコーティングしてサンプル孔とし、100μL Na2CO3を陰性対照孔とし、4℃、一夜インキュベートした。翌日、実施例1のステップ(6)でレスキューされた二次ライブラリーとランダムライブラリーのファージライブラリーをそれぞれ加え、室温、2時間インキュベートした;孔をPBSTで10回洗浄し、100μLトリエチルアミンを加え、室温、30分間インキュベートし、収集されたファージは、アフィニティー・パニングにより得られた抗BCMAのscFvのファージライブラリーである;感染TG細胞を10μL採取し、プレート塗抹、翌日、親和性ファージのパニング結果を観察し、残りのファージを増幅およびレスキューに利用した。
増幅及びレスキュー方法は、実施例1のステップ(6)と同様に、得られたPBS懸濁液は、増幅された1回目のパニング後のファージであり、4℃で保存し、次回のスクリーニングに用いられる。実施例2のステップ(1)のパニングステップに従い、ラウンド毎に抗原量を逐次減少させ、3~4ラウンドのバニングを行った。
100ngBCMA-his抗原を取り、4℃、一夜放置した;翌日、2%のBSAを加えて室温で1時間閉鎖した;実験群に各ラウンドのバニング後に増幅したファージをそれぞれ加え、対照群に等量の野生型ファージを加え、室温で2時間インキュベートした;PBSTで10回洗浄し、結合できないファージを除去した。HRP標識抗M13抗体を加え、室温で1時間インキュベートした;呈色液を加え、遮光反応10~30分間、吸光値OD450を測定し、ELISAの結果は、図3に示すように、吸光値が1回目ラウンドから3回目のパニング時に安定の方へ向かい、新規の特異性を有する抗体が濃縮されたことを表した。
2回目ラウンドと3回目ラウンドのバニングで得られたファージ塗抹プレートを取り、それぞれランダムライブラリーと二次ライブラリーから36及び20個のクローンを選択してクローン(done) PCRを行った後、その結果が図4に示すように、そのうちの変位を有するクローンを選んで配列測定を行った;配列測定結果を分析すると、CDR3領域に変異を有するscFv単クローン株5本(図中矢印)が発見された。
ステップ(4)で得られた3株の陽性クローンは、生配列と比較すると、重鎖CDR3領域及び軽鎖CDR 3領域に顕著な変異が認められた。この3株のscFvモノクローナルは、それぞれscFv_20、scFv_43とscFv_46と名付けられ、当該ヌクレオチドとアミノ酸の配列は、以下の通りである。
5’-GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAG GGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGC AGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCGCATGG ACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAGGA GGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCCAG AGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGC GGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCC TGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAGTT CAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTG AGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGGGTTCTATTTTCAA CGGTTACGACGTTCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC-3’ (SEQIDNO: 2)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFAT YYCQQYRKL AWTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGAT YRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSIFNGYDVLDNWG QGTLVTVSS (SEQIDNO: 1)。
5’-GAC ATCC AGATGACCC AGAGCCCTAGCTC ACTGAGCGCC AGCGTGGGCGAC AG GGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGC AGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCTCTTGTGGTGACGCCG TTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAG GAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCC AGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCA GCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAG TTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAAC TGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGTTTTAGGGTATG CTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC-3’ (SEQIDNO: 6)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFAT YYCQQALVVTPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGMLDNWGQGT LVTVSS (SEQIDNO: 5)。
5’ -GAC ATCC AGATGACCC AGAGCCCTAGCTC ACTGAGCGCC AGCGTGGGCGAC AG GGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGC AGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCGTTTGACGCCGTCTCCG TTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAG GAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCC AGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCA GCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAG TTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAAC TGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGAATACGGCTTTG CTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC-3’ (SEQIDNO: 10)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRLTPSPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGAT YRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNTALLDNWGQGTL VTVSS (SEQIDNO: 9)。
Claims (12)
- 軽鎖可変領域(VL)と、重鎖可変領域(VH)とを含む一本鎖抗体scFvであって、
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:14)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:16)であるCDR2と、配列がQQYRKLAWT (SEQ ID NO:18)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:21)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:23)であるCDR2と、配列がARGAIYNGYDVLDN (SEQ ID NO:25)であるCDR3と、を含み、
又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:28)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:30)であるCDR2と、配列がQQALVVTPFT (SEQ ID NO:32)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:35)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:37)であるCDR2と、配列がARFGMLDN (SEQ ID NO:39)であるCDR3と、を含み、
又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:42)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:44)であるCDR2と、配列がQQRLTPSPFT (SEQ ID NO:46)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:49)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:51)であるCDR2と、配列がARNTALLDN (SEQ ID NO:53)であるCDR3と、を含む、
ことを特徴とする抗BCMA一本鎖抗体scFv。 - 前記軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:4であり、前記重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:3であり、又は、
前記軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:8であり、前記重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:7であり、又は、
前記軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:12であり、前記重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:11である、ことを特徴とする請求項1に記載の一本鎖抗体scFv。 - 前記一本鎖抗体scFvの配列が、SEQ ID NO:1、又は、SEQ ID NO:5、又はSEQ ID NO:9である、ことを特徴とする請求項1に記載の一本鎖抗体scFv。
- 前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及びSEQ ID NO: 18をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23及びSEQ ID NO: 25をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 28、 SEQ ID NO: 30及びSEQ ID NO: 32をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 35、SEQ ID NO: 37及びSEQ ID NO: 39をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 42、SEQ ID NO: 44及びSEQ ID NO: 46をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域配列SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 51及びSEQ ID NO: 53をコードするヌクレオチド配列とを含む、
ことを特徴とする請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvをコードするポリヌクレオチド配列。 - 前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQ ID NO: 4をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 3をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 8をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 7をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 12をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 11をコードするヌクレオチド配列とを含む、
ことを特徴とする請求項4に記載のポリヌクレオチド配列。 - 前記ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 2、又はSEQ ID NO: 6、又は SEQ ID NO: 10である、ことを特徴とする請求項4に記載のポリヌクレオチド配列。
- 請求項3~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターを含み、抗BCMA一本鎖抗体scFvを発現可能である、ことを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、ことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項3~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現宿主細胞に形質転換し、培養し、前記抗BCMA一本鎖抗体scFvの大量発現及び純化を行うことを含む、ことを特徴とする請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvを作製する方法。
- 前記発現ベクターがpComb3XSSベクターであり、前記宿主細胞が大腸菌XL1-Blue及びTG1株である、ことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- BCMA標的薬の製造における、又は非疾患診断治療目的での免疫学的BCMA検定における、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvの使用。
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