JP2022508775A - 抗BCMA一本鎖抗体scFv、並びにその作製方法及びその使用 - Google Patents

抗BCMA一本鎖抗体scFv、並びにその作製方法及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗BCMA一本鎖抗体scFv、並びにその作製方法を提供する。当該作製方法は、部位特異的変異導入法と、ランダム部位変異導入法とを結合して、BCMAを標的とするファージ提示ライブラリーを人工的に合成することと、ファージ提示法を結合して、BCMAを標的とする抗体とすることができる3株のBCMAを標的とする抗原の新規scFv株を得ることとを含む。【選択図】図5

Description

本発明は、抗体技術の分野に関し、特に、抗BCMA一本鎖抗体scFv、並びにその作製方法及びその使用に関する。
過去数年間に、養子免疫T細胞療法は、がん免疫療法として、既に最も有望な策略の一つになっているものとする。CAR-T療法は、誕生の以来、研究者の高い関心を引き起こし、特に2011年に白血病末期患者に応用し、治療において巨大な成功を得て、2012年に約80%のリンパ腫に対して緩和を実現した後に、急速な発展を遂げた。現在のCAR-T療法は、第2世代CARを主とし、治療手法として、患者の体内からT細胞を分離し、工学的な手法を用いて修飾遺伝子を有するキメラ抗原受容体(CAR)をT細胞に導入することである。CARは、複合膜受容体分子であり、細胞外と細胞内の2つの機能部分を含み、且つ標的分子を特異的に局在する機能と、T細胞を活性化させる機能とを有する。CARの細胞外部分は、単鎖抗体可変フラグメントからなる組換え受容体(ScFv)であり、ScFvの介在を介して、抗原抗体特異的結合方式で標的分子を特異的に局在し、T細胞を活性化させることにより、腫瘍の殺傷作用を発揮する。
血液病治療成功後、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膠腫、大腸がん、転移性肝がん、中皮腫、腎臓がん、肉腫、神経内分泌がん及び胸膜中皮腫などを含む固形腫瘍領域が注目されている。2017年は細胞治療の元年と呼ばれ、3月、フランスの生物技術会社Cellectisは、自社研究開発された汎用型CAR-T療法UCART123が米国の研究新薬(IND)の一期臨床試験の承認を得たことを発表した。これは、FDAによって承認された世界初のCD123を標的とした同種異体方法のCAR-T臨床試験であった。同年8月、Novartisの標的CD19のCAR-T製品Kymriahは、米国FDAによって承認されており、10月、Kiteの特定タイプ大細胞型B細胞腫成人患者治療用製品Yescartaが発売され、これらの成果は、細胞免疫療法の研究開発に対する研究者の情熱を非常に激励した。免疫療法の最新技術として、CAR-Tは、応用範囲が広く、市場の見込み巨大、中国における1000億人民元以上の市場規模が見込まれる。
B細胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen,BCMA、CD269)は、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバーであり、185アミノ酸からなる非グリコシル化III型内在性膜タンパク質である。BCMAと、B細胞活性化因子(BAFF、BLys、THANK、TALL-1とも呼ばれる)及び増殖誘導リガンド(APRIL)との結合は、B細胞の成熟及びB細胞の形質細胞への分化の管理過程に重要な役割を果たしている。研究により、BCMAの過剰発現は、プロテインキナーゼB、MAPKとNF-kBシグナルの発生をもたらし、それにより骨髄腫細胞の増殖と生存を強化する。最初、BCMAは、成熟したBリンパ細胞表面に発見され、他の組織細胞にはほとんど発現せず、悪性増殖したBリンパ細胞(例えば、骨髄腫細胞、白血病細胞)には高度に発現し、そして、介在する下流シグナル経路が細胞の生存、増殖、転移と薬剤耐性に重要な役割を果たしており、これらの特性により、多発性骨髄腫(Multiple Myeloma)の診断と免疫治療において、1つの新規薬物の標的分子になっている。
MMと他のB細胞関連疾患の発病率の上昇に伴い、臨床上に短時間でB細胞に対する特異的療法が開発されることが期待された。近年、BCMAに対する新型腫瘍免疫治療法は、日増しに成熟し、主にCAR-T治療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)、二重特異性抗体(Bispecific antibody,BsAb)と抗体-薬物複合体(Antibody-drug coupling,ADC)を含む。2017年4月の米国がん学会年会(AACR)において、BCMAは一躍スター標的になり、国内外の会社も競ってBCMAを標的とするCAR-T療法を研究開発し、現在、すでに4種類の薬物がI期臨床試験に入り、主にKITE-585、bb 2121、LCAR-B 38などがある。LCAR-B38は、南京伝奇生物会社が2017年12月に中国国内の臨床申請を提出し、中国国内で初めて臨床申請を提出したBCMA-CARTであり、35例の再発或いは薬剤耐性多発性骨髄腫患者が参加した臨床試験データによると、当該療法の客観的奏功率は100%に達し、早期4ケ月の中位経過観察期間中に、19人の患者のうち、14人が完全奏功診断標準に達した。現在、CAR-T療法は、BCMAを標的とするためのMMの研究が始まったばかりの段階にあるが、臨床前及びI期臨床試験の結果から見れば、BCMAに対する分子標的薬は、有効に腫瘍細胞を標的とすることができ、そして免疫細胞や小分子の細胞毒性作用により腫瘍細胞を殺傷し、薬効が顕著で、副作用が制御可能であり、発展の潜在力が極めて大きい腫瘍標的治療の新規標的分子である。
多発性骨髄腫と他のB細胞関連疾患の蔓延に伴い、医薬界は、急にB細胞に対する特効治療法の開発が必要になったが、従来の技術によれば、BCMA抗体薬物の開発に関して、まだマウス由来の伝統的な抗体技術に集中しており、伝統的な抗体の大量発現にも、抗体ヒト化改造にも比較的困難であり、時間がかかり、コストが高く、しかも有効な抗体の獲得率が低く、有効な分子標的薬の開発を厳重に制限した。
本発明は、抗BCMA一本鎖抗体scFv、並びにその作製方法及びその使用を提供する。
本発明の一態様によれば、一つの実施例において、軽鎖可変領域(VL)と、重鎖可変領域(VH)とを含む抗BCMA一本鎖抗体scFvが提供される。
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:14)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:16)であるCDR2と、配列がQQYRKLAWT (SEQ ID NO:18)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:21)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:23)であるCDR2と、配列がARGAIYNGYDVLDN (SEQ ID NO:25)であるCDR3と、を含み、
又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:28)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:30)であるCDR2と、配列がQQALVVTPFT (SEQ ID NO:32)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:35)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:37)であるCDR2と、配列がARFGMLDN (SEQ ID NO:39)であるCDR3と、を含み、
又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:42)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:44)であるCDR2と、配列がQQRLTPSPFT (SEQ ID NO:46)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:49)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:51)であるCDR2と、配列がARNTALLDN (SEQ ID NO:53)であるCDR3と、を含む。
好ましくは、前記軽鎖可変領域(VL)は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLAWTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 4)であり、
前記重鎖可変領域(VH)は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRG HSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSIFNGYDVLDNWGQG TLVTVSS (SEQIDNO: 3)であり、又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVVTPFTFGQGTKLEIKR (SEQ IDNO: 8)であり、
前記重鎖可変領域(VH)は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRG HSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGMLDNWGQGTLVTV SS (SEQIDNO: 7)であり、又は、
前記軽鎖可変領域(VL)は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRLTPSPFTFGQGTKLEIK (SEQIDNO: 12)であり、
前記重鎖可変領域(VH)は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRG HSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNTALLDNWGQGTLVT VSS (SEQIDNO: 11)である。
好ましくは、前記一本鎖抗体scFvの配列は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLAWTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSIFNGYDVLD NWGQGTLVTVSS (SEQIDNO: 1)であり、又は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVVTPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGMLDNWGQG TLVTVSS (SEQIDNO: 5)であり、又は、
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRLTPSPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNTALLDNWGQ GTLVTVSS (SEQIDNO: 9)である。
本発明の二態様によれば、一つの実施例において、一態様に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvをコードするポリヌクレオチド配列が提供される。
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及びSEQ ID NO: 18をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23及びSEQ ID NO: 25をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 28、 SEQ ID NO: 30及びSEQ ID NO: 32をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 35、SEQ ID NO: 37及びSEQ ID NO: 39をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 42、SEQ ID NO: 44及びSEQ ID NO: 46をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域配列SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 51及びSEQ ID NO: 53をコードするヌクレオチド配列とを含む。
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQ ID NO: 4をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 3をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 8をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 7をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 12をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 11をコードするヌクレオチド配列とを含む。
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGG TGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCGCATG GACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAGG AGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCCA GAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAG CGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGC CTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAGT TCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACT GAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGGGTTCTATTTTC AACGGTTACGACGTTCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC (SEQIDNO: 2);であり、又は、
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGG TGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCTCTTGTGGTGACGCC GTTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGA GGAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTC CAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGG GCCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGA AGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGA ACTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGTTTTAGGGT ATGCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO: 6);であり、又は、
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGG TGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCGTTTGACGCCGTCTCCG TTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAG GAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCC AGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCA GCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAA CTGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGAATACGGCTT TGCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO: 10) である。
本発明の三態様によれば、一つの実施例において、二態様に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。
本発明の四態様によれば、一つの実施例において、三態様に記載の発現ベクターを含み、抗BCMA一本鎖抗体scFvを発現可能である宿主細胞が提供される。
本発明の五態様によれば、一つの実施例において、一態様に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の六態様によれば、一つの実施例において、二態様に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現宿主細胞に形質転換し、培養し、前記抗BCMA一本鎖抗体scFvの大量発現及び純化を行うことを含む、一態様に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvを作製する方法が提供される。
好ましくは、前記発現ベクターがpComb3XSSベクターであり、前記宿主細胞が大腸菌XL1-Blue及びTG1株である。
本発明の七態様によれば、一つの実施例において、BCMA標的薬の製造における、又は非疾患診断治療目的での免疫学的BCMA検定における、一態様に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvの使用が提供される。
本発明は、部位特異的変異導入と、ランダム部位変異導入とを結合して、BCMAを標的とするファージ提示ライブラリーを人工的に合成し、ファージ提示法を結合して、BCMAを標的とする抗体とすることができる3株のBCMAを標的とする抗原の新規scFv株が得られ、BCMAを標的とする抗体として深く研究開発を進めることが可能である。
本発明の実施例1に係る部位特異的変異導入の二次ライブラリー及びランダムライブラリーの電気泳動検出結果図である。 本発明の実施例1に係るクローンPCR検証により構築されたファージ提示ライブラリーにおけるscFvフラグメントの組み換え効率結果図であり、ただし、クローン1-36が二次ライブラリーのクローンであり、クローン37-72がランダムライブラリーのクローンである。 本発明の実施例2に係るELISAにおける4ラウンドのアフィニティー・パニング後のファージライブラリーによりBCMAを標的とする親和性測定結果図である。 本発明の実施例2に係るBCMAを標的とするscFvモノクローナルPCRのスクリーニング結果図であり、ただし、クローン1-36がランダムライブラリーからスクリーニングされたクローンであり、クローン37-56が二次ライブラリーからスクリーニングされたクローンである。矢印は、配列に変異が生じたクローンを表す。 本発明の実施例2に係るELISAにおけるscFv候補株のBCMAを標的とする親和性を検証した結果図である。
以下、具体的な実施形態及び図面を参照して、本発明について詳細に説明する。以下の実施形態では、理解を容易にするためにその中には本発明の実施形態の様々な詳細を含んでおり、それらは単なる例示するものと見なされるべきである。したがって、当業者は、一部分の特徴を異なる場合には省略されてもよく、又は他の要素、材料、方法に置き換えることができることを容易に認識するだろう。
また、明細書に記述された特点、取り扱い又は特徴は、任意の適切な形で組み合わされて実施化することができる。同時に、方法説明で記述されたステップ又は動作を並べ替え、又は調整することができることは、当業者に認められるであろう。したがって、明細書及び図面で記述された様々なステップは、一つの実施形態を明確に説明するためのものであり、別段の規定がない限り、ある順序で実行されなければならないことを限定することを意図していない。
本発明は、抗BCMAのヒト化scFv配列を基礎した上で、その重鎖及び軽鎖のCDR3に対して部位特異的変異導入と、ランダム部位変異導入とを行い、抗BCMAのscFvファージライブラリーを人工的に合成する。その後、ファージ提示法を結合して、BCMA抗原に対して複数回のアフィニティー・パニング及びスクリーニングを行い、最後にスクリーニングにより得られた抗体モノクローナル株に対して配列分析と親和性測定を行い、獲得した新規抗BCMAのscFv株は、BCMAを標的とする薬の抗体として、下流の免疫治療法の治療薬物の開発に使用される。
本発明は、ヒト化scFv配列をフレームワークとし、そのCDR3領域のみを人工改造し、後期の抗体ヒト化の改造難度を大幅に下げることができ、同時に、改造による抗体標的抗原親和性に対する影響を減少させることができる。また、本発明は、ファージ提示法を結合して利用することにより、抗体の親和性情報を比較的迅速に直感的に獲得することができ、さらに、複数株の新規の高親和性を有するscFvを比較的短時間に獲得することができ、BCMAを標的とする免疫治療法の開発により多くの手段を提供し、継続開発の価値がある。
本発明は、BCMAのscFv配列を基礎とした上で、その重鎖及び軽鎖のCDR3領域に対して変異導入を行い、さらにファージ提示法を結合して、BCMAを標的とする新規scFv株を3株開発した。
上記方法で獲得された3株の抗BCMAのscFv抗体のアミノ酸とヌクレオチドの配列情報は、表1に示すとおりである。
Figure 2022508775000002
Figure 2022508775000003
Figure 2022508775000004
上記方法で獲得された3株のscFvの軽鎖(L chain)及び重鎖(H chain)のフレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)のアミノ酸の配列は、表2に示すとおりである。
Figure 2022508775000005
Figure 2022508775000006
本発明によって得られたscFv抗体は、BCMA抗原を高効率的に標的結合することができ、BCMAを標的とする診断又は治療に使用することが可能である。
なお、抗体の特異的結合特性は、相補性決定領域によって決定されることが知られている。したがって、本発明の1つの態様によれば、権利出張される主題は、軽鎖可変領域(VL)と、重鎖可変領域(VH)とを含み、軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:14)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:16)であるCDR2と、配列がQQYRKLAWT (SEQ ID NO:18)であるCDR3と、を含み、重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:21)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:23)であるCDR2と、配列がARGAIYNGYDVLDN (SEQ ID NO:25)であるCDR3と、を含み、又は、軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:28)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:30)であるCDR2と、配列がQQALVVTPFT (SEQ ID NO:32)であるCDR3と、を含み、重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:35)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:37)であるCDR2と、配列がARFGMLDN (SEQ ID NO:39)であるCDR3と、を含み、又は、軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:42)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:44)であるCDR2と、配列がQQRLTPSPFT (SEQ ID NO:46)であるCDR3と、を含み、重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:49)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:51)であるCDR2と、配列がARNTALLDN (SEQ ID NO:53)であるCDR3と、を含む、抗BCMA一本鎖抗体scFvである。
好ましい技術案では、抗BCMA一本鎖抗体scFvは、軽鎖可変領域(VL)と、重鎖可変領域(VH)とを含み、ここで、軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:4であり、重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:3であり、又は、軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:8であり、重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:7であり、又は、軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:12であり、重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:11である。
さらなるより好ましい技術案では、抗BCMA一本鎖抗体scFvの配列が、SEQ ID NO:1、又は、SEQ ID NO:5、又はSEQ ID NO:9である。
遺伝子コードの縮重性を考慮して、同時に抗体の特異的結合特性が相補性決定領域によって決定されることを考慮している。したがって、本発明の1つの態様によれば、権利出張される主題は、軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及びSEQ ID NO: 18をコードするヌクレオチドヌクレオチド配列と、重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23及びSEQ ID NO: 25をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 28、 SEQ ID NO: 30及びSEQ ID NO: 32をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 35、SEQ ID NO: 37及びSEQ ID NO: 39をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 42、SEQ ID NO: 44及びSEQ ID NO: 46をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域配列SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 51及びSEQ ID NO: 53をコードするヌクレオチド配列とを含む、本発明に係る抗BCMA一本鎖抗体scFvをコードするポリヌクレオチド配列である。このようなポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重性により塩基配列を変化してもよく、それぞれに対応する相補性決定領域をコードできる配列であればよい。
好ましい技術案では、ポリヌクレオチド配列は、軽鎖可変領域(VL)の配列SEQ ID NO: 4をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 3をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 8をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 7をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 12をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 11をコードするヌクレオチド配列とを含む。
さらなるより好ましい技術案では、ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 2、又はSEQ ID NO: 6、又は SEQ ID NO: 10である。
本発明の1つの実施例では、本発明のポリヌクレオチド配列を含むファージ発現ベクターが提供される。当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、多数のベクターpComb3XSS,pComb3XTT,pComb3HSSなどが、本発明のポリヌクレオチド配列の発現ベクターとすることができることを理解するであろう。好ましい実施例では、発現ベクターは、ファージ提示ベクターpComb3XSSベクターである(武漢▲みょう▼霊生物科技有限公司から購入)。
本発明の1つの実施例では、本発明の発現ベクターを含み、ファージの表面に抗BCMA一本鎖抗体scFvを発現可能である宿主細胞が提される。本発明の精神から逸脱することなく、多数の細胞ER2738、SS320、TG1、XL1-Blueなどが、本発明の発現ベクターの宿主細胞とすることができることを理解するであろう。好ましい実施例では、宿主細胞は、大腸菌のXLl-Blue株(TAKARAから購入)とTG1株である(米国、Lucigenから購入)。
本発明の1つの実施例では、本発明の抗BCMA一本鎖抗体scFvと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において公知である方法によって作製することができ(例えば、Re分間gton: The Science and Practice of Pharmacy 、 19th ed . (1995)、A . Gennaro ら、Mack Publishing Co .)、且つ、本発明で開示される抗BCMA一本鎖抗体scFvと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む。
本発明の1つの実施例では、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現宿主細胞に形質転換し、培養し、抗BCMA一本鎖抗体scFvの大量発現及び純化を行うことを含む、本発明の抗BCMA一本鎖抗体scFvを作製する方法が提供される。好ましい実施例では、発現ベクターは、ファージ提示ベクターpComb3XSSベクターであり、宿主細胞は、大腸菌のXLl-Blue株とTG1株である。
本発明の抗BCMA一本鎖抗体scFvは、抗BCMAタンパク質モノクローナル抗体薬物を作製するために使用することができ、免疫学的検定BCMAにも使用することができる。したがって、本発明の一実施例では、BCMA標的薬の製造における、又は非疾患診断治療目的での免疫学的BCMA検定における、本発明の抗BCMA一本鎖抗体scFvの使用が提供される。
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、以下に記載する実施例の説明は、単なる例示するものと見なされるべき、本発明の保護範囲を制限するものとして解釈されないものとする。
(実施例1)
単鎖抗体をランダムに合成するファージ提示ライブラリーの構築
(1)CDR3領域突然変異の設計
それぞれ抗BCMAのヒト化scFvの重鎖と軽鎖配列を基礎として、突然変異プライマーを設計し、重鎖と軽鎖のCDR3領域に突然変異をそれぞれ導入し、人工合成の二次ライブラリー(部位特異的変異用)とランダムライブラリー(ランダム部位変異用)を構築する。突然変異プライマーの配列は、表3に示すとおりである。
Figure 2022508775000007
(注:合併塩基 K = G/T、M = A/C、 R=A/G、S = G/C、W = A/T、Y=C/T)
(2)鋳型の作製
BCMA抗体の重鎖と軽鎖可変領域遺伝子を合成し、遺伝子座Sfi IからpComb3XSSベクター(武漢▲みょう▼霊生物科技有限公司から購入)に挿入する。抗体フラグメント増幅のプライマー情報は、表4に示すとおりである。
Figure 2022508775000008
構築した鋳型プラスミドを1μL取り、XL 1-Blueコンピテント細胞(TAKARAから購入)形質転換、37℃で1時間蘇生し、塗抹プレートを200μL取り、37℃で一夜培養した。
アミノベンジルペニシリン(Amp)M13K07(補助ファージ)(実験室調製)を含むLB培地にモノクローナルをピックアップし、37℃で一夜培養した。
菌液を遠心し、上清を収集し、1/5体積のPEG/NaClを加え、混合し、氷上で30分間インキュベートし、ファージ粒子を沈殿させ、12000rpm30分間遠心し、上清を捨て、ファージ粒子をPBSで再懸濁し、再度12000rpm5分間遠心し、上清を収集して培養したCJ236菌液(TAKARAから購入)に加え、dU-ssDNA(ウラシルを含む一本鎖鋳型DNA、uracil-containing single-stranded template DNA)形成するために用いられた。37℃で30分間培養し、M13KO7を加え、1時間培養を継続し、菌液をAmp+、カナマイシン(Kan)及びウラシル(Uridine)を含む300ml培地に移し、37℃で一夜培養した。
菌液を遠心し、上清を収集し、1/4体積のPEG/NaClを加え、混合し、氷上で30分間インキュベートし、ファージ粒子を沈殿させ、12000rpm25分間遠心し、上清を捨て、ファージ粒子を収集し、DNA抽出キットを用いてdU-ssDNAを抽出し、定量した。
(3)ライブラリーの構築
各プライマー乾燥粉末を100μM希釈標準溶液に調製し、ランダムライブラリープライマーを重鎖プライマーH3-211(H3-2、H3-4、H3-9、H3-11各5μL)と軽鎖プライマーL3-459(L3-4、L3-5、L3-9各5μL)に混合した。
二次ライブラリーとランダムライブラリーの各プライマーに対して、リン酸化反応をそれぞれ行い、各ライブラリーに対して2回の反応を行い、各反応系は20μLとした。取扱は次のとおりである:
プライマー(100μM)2μL、10 XT4Buffer2μL、T4polynucleotide kinase(T4ポリヌクレオチドキナーゼ)2μL、脱イオン水14μL。37℃で水浴1.5時間。
二次ライブラリーとランダムライブラリーに対応するリン酸化変異プライマーをそれぞれ混合した後、dU-ssDNA鋳型とアニール反応を行い、各ライブラリーは1回の反応を行い、各反応系は250μLとした。取扱は次のとおりである:
プライマー(各ライブラリーは、軽鎖および重鎖という2つのプライマーを含む)40μL、10XT4Buffer25μL、dU-ssDNA鋳型20μL、脱イオン水で250μLに補充した。
PCR器にて次のアニールプログラムを設定した。
90℃、5分間;75℃、45秒;70℃、1分間;65℃、1分間;60℃、1分間;55℃、5 分間;50℃、5分間;45℃、30秒;37℃、10分間;30℃、45秒;25℃、45秒;22℃、90秒;20℃、5分間;1サイクル。
各アニール反応に、10XT4Buffer10μL、dNTP(各種10 mM)25μL、DTT(100 MM)5μL、T7DNApolymerase(T7DNAポリメラーゼ)3μLを加えた。37℃で伸長反応4時間。
各系にT4リガーゼを5μL加え、室温でライゲーション2時間。
ライゲーション生成物をDNA電気泳動検証により、図1に示すように、バンドは、鋳型と比較して明らかな変位がある場合、scFvを担体上に構築に成功したことを示した。
(4)ファージ提示ライブラリーの構築
二次ライブラリーとランダムライブラリーにそれぞれ15μLの3MNaAc(pH5.5)を加えてpHを調節し、ライゲーション生成物をPCR Purification Kit(QIAGEN)で精製した後、Nanodropを用いて精製生成物を定量した。それぞれ1μLの精製後の二次ライブラリーとランダムライブラリーを取って高効率TGコンピテント細胞(Lucigen、米国)形質転換、37℃で1時間蘇生し、10に段階希釈し、塗抹プレートをそれぞれ300μL取り、37℃で一夜培養した。翌日、プレート上のクローン数をカウントし、式「ライブラリー容量=クローン数X希釈度X1000/30 」によって計算した。
計算得られた二次ライブラリとランダムライブラリのライブラリー容量は、10/mlより大きい。すべてのクローンをLBで溶出し、5000g、5分間遠心し、沈殿が2mlLBで懸濁し、等体積の30%甘油を加え、-80℃で凍結保存した。
(5)ファージ提示ライブラリーの多様性検出
ステップ(4)の二次ライブラリーとランダムライブラリーの36個のクローンをそれぞれランダムに採取し、鋳型としてクローン(done) PCRを行い、1.5%のアガロースゲル電気泳動を用いてPCR生成物を検出し、図2に示すように、二次ライブラリー(クローン1-36)とランダムライブラリー(クローン37-72)の組換え率は、94%と100%であった。ランダムに56個のクローンを選んでSangerシークエンシングに送り、ファージ提示ライブラリーの多様性を分析した;scFv配列の分析結果によると、二級ライブラリーにおける26本の配列のうちの11本には、突然変異があり、ランダムライブラリーにおける25本の配列のうちの14本には、突然変異があり、多様性がそれぞれ42%と56%に達し、次の新規抗体のスクリーニングに応用できる。
(6)ファージ増幅とレスキュー
上記で得られた二次ライブラリーとランダムライブラリーのファージ提示を増殖とバクテリオファージレスキューし、ステップ(4)で保存されたファージライブラリー1mlをそれぞれ100ml培地にアクセスして対数増殖期まで培養し、MOI(multiplicity of infection、多重感染度)が20である補助ファージM13K0を加え、室温、30分間静置し、低速遠心後、沈殿用培地で懸濁させ、300m培地にアクセスし、一夜培養した。翌日、3000遠心30分間、上清を収集し、PEG沈殿ファージを加え、氷上で30分間静置し、3000遠心30分間、沈殿、BCMAを持つscFvのファージライブラリーとなり、PBSで懸濁沈殿した後、その力価を測定し、測定結果、二次ライブラリーは、2.6X1012pfu/mlであり、ランダムライブラリーは、3.3X1012pfu/mlであった。
(実施例2)
ファージ提示法によりBCMAの高親和性抗体のスクリーニング
(1)ファージのアフィニティー・パニング
100ngBCMA-his抗原をそれぞれ取り、ELISAプレートをコーティングしてサンプル孔とし、100μL NaCOを陰性対照孔とし、4℃、一夜インキュベートした。翌日、実施例1のステップ(6)でレスキューされた二次ライブラリーとランダムライブラリーのファージライブラリーをそれぞれ加え、室温、2時間インキュベートした;孔をPBSTで10回洗浄し、100μLトリエチルアミンを加え、室温、30分間インキュベートし、収集されたファージは、アフィニティー・パニングにより得られた抗BCMAのscFvのファージライブラリーである;感染TG細胞を10μL採取し、プレート塗抹、翌日、親和性ファージのパニング結果を観察し、残りのファージを増幅およびレスキューに利用した。
(2)パニングされたファージの増幅とレスキュー
増幅及びレスキュー方法は、実施例1のステップ(6)と同様に、得られたPBS懸濁液は、増幅された1回目のパニング後のファージであり、4℃で保存し、次回のスクリーニングに用いられる。実施例2のステップ(1)のパニングステップに従い、ラウンド毎に抗原量を逐次減少させ、3~4ラウンドのバニングを行った。
(3)ELISAにより特異性抗体の濃縮程度の評価
100ngBCMA-his抗原を取り、4℃、一夜放置した;翌日、2%のBSAを加えて室温で1時間閉鎖した;実験群に各ラウンドのバニング後に増幅したファージをそれぞれ加え、対照群に等量の野生型ファージを加え、室温で2時間インキュベートした;PBSTで10回洗浄し、結合できないファージを除去した。HRP標識抗M13抗体を加え、室温で1時間インキュベートした;呈色液を加え、遮光反応10~30分間、吸光値OD450を測定し、ELISAの結果は、図3に示すように、吸光値が1回目ラウンドから3回目のパニング時に安定の方へ向かい、新規の特異性を有する抗体が濃縮されたことを表した。
(4)BCMAを標的とする高親和性のscFv陽性クローンの同定
2回目ラウンドと3回目ラウンドのバニングで得られたファージ塗抹プレートを取り、それぞれランダムライブラリーと二次ライブラリーから36及び20個のクローンを選択してクローン(done) PCRを行った後、その結果が図4に示すように、そのうちの変位を有するクローンを選んで配列測定を行った;配列測定結果を分析すると、CDR3領域に変異を有するscFv単クローン株5本(図中矢印)が発見された。
100ng BCMA-Fc抗原でELISAプレートをコーティングし、4℃で一夜インキュベートした;この5個のモノクローナルを1ml培地に採取し、37℃で対数期まで培養し、1mMIPTGを加えて一夜誘導した;翌日、遠心で菌沈殿を収集し、破砕後、5000g離心15分間、上清を収集した。同時に、ELISAプレートを取り、2%のBSAを加えて室温で1時間閉鎖した;実験群に、各孔に単クローンの破砕上清を加え、対照群に、空白TGの破砕上清を加え、室温、2時間インキュベートした;PBSTで10回洗浄、マウス抗HA標識抗体を加え、室温1時間;PBSTで洗浄3~5回、AP標識抗マウスIgG抗体を加え、室温1時間;基質を加え、10~20分間反応し、マイクロプレートリーダーから吸光値を読み取った。吸光値と対照孔との比が2.1(基準線)より大きい場合、陽性クローンと判定し、ELISA検証結果によると、それぞれクローン20、クローン43とクローン46である3個の陽性クローンが得られた(図5)。
(5)陽性クローン配列情報
ステップ(4)で得られた3株の陽性クローンは、生配列と比較すると、重鎖CDR3領域及び軽鎖CDR 3領域に顕著な変異が認められた。この3株のscFvモノクローナルは、それぞれscFv_20、scFv_43とscFv_46と名付けられ、当該ヌクレオチドとアミノ酸の配列は、以下の通りである。
scFv_20ヌクレオチド配列:
5’-GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCACTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAG GGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGC AGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCGCATGG ACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAGGA GGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCCAG AGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGC GGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGCC TGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAGTT CAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTG AGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGGGTTCTATTTTCAA CGGTTACGACGTTCTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC-3’ (SEQIDNO: 2)。
scFv_20アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFAT YYCQQYRKL AWTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGAT YRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSIFNGYDVLDNWG QGTLVTVSS (SEQIDNO: 1)。
scFv_43ヌクレオチド配列:
5’-GAC ATCC AGATGACCC AGAGCCCTAGCTC ACTGAGCGCC AGCGTGGGCGAC AG GGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGC AGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCTCTTGTGGTGACGCCG TTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAG GAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCC AGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCA GCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAG TTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAAC TGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGTTTTAGGGTATG CTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC-3’ (SEQIDNO: 6)。
scFv_43アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFAT YYCQQALVVTPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMG ATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGMLDNWGQGT LVTVSS (SEQIDNO: 5)。
scFv_46ヌクレオチド配列:
5’ -GAC ATCC AGATGACCC AGAGCCCTAGCTC ACTGAGCGCC AGCGTGGGCGAC AG GGTGACCATTACCTGCTCCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGC AGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCTCCAACCTGCACTCCGGC GTGCCCAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCA GCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCGTTTGACGCCGTCTCCG TTCACTTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTGGTGGAGGAGGTAGCGGAG GAGGCGGGAGCGGTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTCC AGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCA GCGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGCGCCACCTACAGGGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAG TTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAAC TGAGCAGCCTCAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGAATACGGCTTTG CTGGACAACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC-3’ (SEQIDNO: 10)。
scFv_46アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRLTPSPFTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGAT YRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNTALLDNWGQGTL VTVSS (SEQIDNO: 9)。
以上、具体的な実施例を応用して本発明について説明したが、本発明がよりよく理解されるためのものであり、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の範囲と技術思想から逸脱することなく、演繹、変形又は代替を若干行うことが可能である。

Claims (12)

  1. 軽鎖可変領域(VL)と、重鎖可変領域(VH)とを含む一本鎖抗体scFvであって、
    前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:14)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:16)であるCDR2と、配列がQQYRKLAWT (SEQ ID NO:18)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:21)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:23)であるCDR2と、配列がARGAIYNGYDVLDN (SEQ ID NO:25)であるCDR3と、を含み、
    又は、
    前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:28)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:30)であるCDR2と、配列がQQALVVTPFT (SEQ ID NO:32)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:35)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:37)であるCDR2と、配列がARFGMLDN (SEQ ID NO:39)であるCDR3と、を含み、
    又は、
    前記軽鎖可変領域(VL)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がQDISNY (SEQ ID NO:42)であるCDR1と、配列がYTS (SEQ ID NO:44)であるCDR2と、配列がQQRLTPSPFT (SEQ ID NO:46)であるCDR3と、を含み、前記重鎖可変領域(VH)は、フレームワーク領域(FR)と相補性決定領域(CDR)を含み、ここで、相補性決定領域(CDR)は、配列がGGTFSNYW (SEQ ID NO:49)であるCDR1と、配列がTYRGHSDT (SEQ ID NO:51)であるCDR2と、配列がARNTALLDN (SEQ ID NO:53)であるCDR3と、を含む、
    ことを特徴とする抗BCMA一本鎖抗体scFv。
  2. 前記軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:4であり、前記重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:3であり、又は、
    前記軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:8であり、前記重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:7であり、又は、
    前記軽鎖可変領域(VL)の配列が、SEQ ID NO:12であり、前記重鎖可変領域(VH)の配列が、SEQ ID NO:11である、ことを特徴とする請求項1に記載の一本鎖抗体scFv。
  3. 前記一本鎖抗体scFvの配列が、SEQ ID NO:1、又は、SEQ ID NO:5、又はSEQ ID NO:9である、ことを特徴とする請求項1に記載の一本鎖抗体scFv。
  4. 前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及びSEQ ID NO: 18をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23及びSEQ ID NO: 25をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 28、 SEQ ID NO: 30及びSEQ ID NO: 32をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 35、SEQ ID NO: 37及びSEQ ID NO: 39をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の相補性決定領域の配列SEQID NO: 42、SEQ ID NO: 44及びSEQ ID NO: 46をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の相補性決定領域配列SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 51及びSEQ ID NO: 53をコードするヌクレオチド配列とを含む、
    ことを特徴とする請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvをコードするポリヌクレオチド配列。
  5. 前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQ ID NO: 4をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 3をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 8をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 7をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域(VL)の配列SEQID NO: 12をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域(VH)の配列SEQID NO: 11をコードするヌクレオチド配列とを含む、
    ことを特徴とする請求項4に記載のポリヌクレオチド配列。
  6. 前記ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 2、又はSEQ ID NO: 6、又は SEQ ID NO: 10である、ことを特徴とする請求項4に記載のポリヌクレオチド配列。
  7. 請求項3~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする発現ベクター。
  8. 請求項7に記載の発現ベクターを含み、抗BCMA一本鎖抗体scFvを発現可能である、ことを特徴とする宿主細胞。
  9. 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、ことを特徴とする医薬組成物。
  10. 請求項3~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現宿主細胞に形質転換し、培養し、前記抗BCMA一本鎖抗体scFvの大量発現及び純化を行うことを含む、ことを特徴とする請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvを作製する方法。
  11. 前記発現ベクターがpComb3XSSベクターであり、前記宿主細胞が大腸菌XL1-Blue及びTG1株である、ことを特徴とする請求項10に記載の方法。
  12. BCMA標的薬の製造における、又は非疾患診断治療目的での免疫学的BCMA検定における、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗BCMA一本鎖抗体scFvの使用。
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