JP2022508775A - 抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖ、並びにその作製方法及びその使用 - Google Patents

抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖ、並びにその作製方法及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖ、並びにその作製方法を提供する。当該作製方法は、部位特異的変異導入法と、ランダム部位変異導入法とを結合して、ＢＣＭＡを標的とするファージ提示ライブラリーを人工的に合成することと、ファージ提示法を結合して、ＢＣＭＡを標的とする抗体とすることができる３株のＢＣＭＡを標的とする抗原の新規ｓｃＦｖ株を得ることとを含む。【選択図】図５

Description

本発明は、抗体技術の分野に関し、特に、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖ、並びにその作製方法及びその使用に関する。
過去数年間に、養子免疫Ｔ細胞療法は、がん免疫療法として、既に最も有望な策略の一つになっているものとする。ＣＡＲ－Ｔ療法は、誕生の以来、研究者の高い関心を引き起こし、特に２０１１年に白血病末期患者に応用し、治療において巨大な成功を得て、２０１２年に約８０％のリンパ腫に対して緩和を実現した後に、急速な発展を遂げた。現在のＣＡＲ－Ｔ療法は、第２世代ＣＡＲを主とし、治療手法として、患者の体内からＴ細胞を分離し、工学的な手法を用いて修飾遺伝子を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞に導入することである。ＣＡＲは、複合膜受容体分子であり、細胞外と細胞内の２つの機能部分を含み、且つ標的分子を特異的に局在する機能と、Ｔ細胞を活性化させる機能とを有する。ＣＡＲの細胞外部分は、単鎖抗体可変フラグメントからなる組換え受容体（ＳｃＦｖ）であり、ＳｃＦｖの介在を介して、抗原抗体特異的結合方式で標的分子を特異的に局在し、Ｔ細胞を活性化させることにより、腫瘍の殺傷作用を発揮する。
血液病治療成功後、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膠腫、大腸がん、転移性肝がん、中皮腫、腎臓がん、肉腫、神経内分泌がん及び胸膜中皮腫などを含む固形腫瘍領域が注目されている。２０１７年は細胞治療の元年と呼ばれ、３月、フランスの生物技術会社Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓは、自社研究開発された汎用型ＣＡＲ－Ｔ療法ＵＣＡＲＴ１２３が米国の研究新薬（ＩＮＤ）の一期臨床試験の承認を得たことを発表した。これは、ＦＤＡによって承認された世界初のＣＤ１２３を標的とした同種異体方法のＣＡＲ－Ｔ臨床試験であった。同年８月、Ｎｏｖａｒｔｉｓの標的ＣＤ１９のＣＡＲ－Ｔ製品Ｋｙｍｒｉａｈは、米国ＦＤＡによって承認されており、１０月、Ｋｉｔｅの特定タイプ大細胞型Ｂ細胞腫成人患者治療用製品Ｙｅｓｃａｒｔａが発売され、これらの成果は、細胞免疫療法の研究開発に対する研究者の情熱を非常に激励した。免疫療法の最新技術として、ＣＡＲ－Ｔは、応用範囲が広く、市場の見込み巨大、中国における１０００億人民元以上の市場規模が見込まれる。
Ｂ細胞成熟抗原（Ｂ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ，ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーであり、１８５アミノ酸からなる非グリコシル化ＩＩＩ型内在性膜タンパク質である。ＢＣＭＡと、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、ＢＬｙｓ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ－１とも呼ばれる）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）との結合は、Ｂ細胞の成熟及びＢ細胞の形質細胞への分化の管理過程に重要な役割を果たしている。研究により、ＢＣＭＡの過剰発現は、プロテインキナーゼＢ、ＭＡＰＫとＮＦ－ｋＢシグナルの発生をもたらし、それにより骨髄腫細胞の増殖と生存を強化する。最初、ＢＣＭＡは、成熟したＢリンパ細胞表面に発見され、他の組織細胞にはほとんど発現せず、悪性増殖したＢリンパ細胞（例えば、骨髄腫細胞、白血病細胞）には高度に発現し、そして、介在する下流シグナル経路が細胞の生存、増殖、転移と薬剤耐性に重要な役割を果たしており、これらの特性により、多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ）の診断と免疫治療において、１つの新規薬物の標的分子になっている。
ＭＭと他のＢ細胞関連疾患の発病率の上昇に伴い、臨床上に短時間でＢ細胞に対する特異的療法が開発されることが期待された。近年、ＢＣＭＡに対する新型腫瘍免疫治療法は、日増しに成熟し、主にＣＡＲ－Ｔ治療法（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＢｓＡｂ）と抗体－薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｕｐｌｉｎｇ，ＡＤＣ）を含む。２０１７年４月の米国がん学会年会（ＡＡＣＲ）において、ＢＣＭＡは一躍スター標的になり、国内外の会社も競ってＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ－Ｔ療法を研究開発し、現在、すでに４種類の薬物がＩ期臨床試験に入り、主にＫＩＴＥ－５８５、ｂｂ ２１２１、ＬＣＡＲ－Ｂ ３８などがある。ＬＣＡＲ－Ｂ３８は、南京伝奇生物会社が２０１７年１２月に中国国内の臨床申請を提出し、中国国内で初めて臨床申請を提出したＢＣＭＡ－ＣＡＲＴであり、３５例の再発或いは薬剤耐性多発性骨髄腫患者が参加した臨床試験データによると、当該療法の客観的奏功率は１００％に達し、早期４ケ月の中位経過観察期間中に、１９人の患者のうち、１４人が完全奏功診断標準に達した。現在、ＣＡＲ－Ｔ療法は、ＢＣＭＡを標的とするためのＭＭの研究が始まったばかりの段階にあるが、臨床前及びＩ期臨床試験の結果から見れば、ＢＣＭＡに対する分子標的薬は、有効に腫瘍細胞を標的とすることができ、そして免疫細胞や小分子の細胞毒性作用により腫瘍細胞を殺傷し、薬効が顕著で、副作用が制御可能であり、発展の潜在力が極めて大きい腫瘍標的治療の新規標的分子である。
多発性骨髄腫と他のＢ細胞関連疾患の蔓延に伴い、医薬界は、急にＢ細胞に対する特効治療法の開発が必要になったが、従来の技術によれば、ＢＣＭＡ抗体薬物の開発に関して、まだマウス由来の伝統的な抗体技術に集中しており、伝統的な抗体の大量発現にも、抗体ヒト化改造にも比較的困難であり、時間がかかり、コストが高く、しかも有効な抗体の獲得率が低く、有効な分子標的薬の開発を厳重に制限した。
本発明は、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖ、並びにその作製方法及びその使用を提供する。
本発明の一態様によれば、一つの実施例において、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖが提供される。
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＹＲＫＬＡＷＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）であるＣＤＲ３と、を含み、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）であるＣＤＲ３と、を含み、
又は、
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＡＬＶＶＴＰＦＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）であるＣＤＲ３と、を含み、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＦＧＭＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）であるＣＤＲ３と、を含み、
又は、
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＲＬＴＰＳＰＦＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）であるＣＤＲ３と、を含み、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＮＴＡＬＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）であるＣＤＲ３と、を含む。
好ましくは、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＡＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）であり、
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧ ＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＩＦＮＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ３）であり、又は、
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＬＶＶＴＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ （ＳＥＱ ＩＤＮＯ： ８）であり、
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧ ＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＧＭＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶ ＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ７）であり、又は、
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＲＬＴＰＳＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ （ＳＥＱＩＤＮＯ： １２）であり、
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧ ＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＴＡＬＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴ ＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： １１）である。
好ましくは、前記一本鎖抗体ｓｃＦｖの配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＡＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ ＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＩＦＮＧＹＤＶＬＤ ＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： １）であり、又は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＬＶＶＴＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ ＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＧＭＬＤＮＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ５）であり、又は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＲＬＴＰＳＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ ＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＴＡＬＬＤＮＷＧＱ ＧＴＬＶＴＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ９）である。
本発明の二態様によれば、一つの実施例において、一態様に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列が提供される。
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ２８、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３をコードするヌクレオチド配列とを含む。
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ３をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ８をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ７をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は
前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １２をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １１をコードするヌクレオチド配列とを含む。
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧ ＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡ ＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＣ ＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＧＣＡＴＧ ＧＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧ ＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡ ＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧ ＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ ＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴ ＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴ ＧＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣ ＡＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ２）；であり、又は、
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧ ＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡ ＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＣ ＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣ ＧＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡ ＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣ ＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣ ＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧ ＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡ ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡ ＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴ ＡＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）；であり、又は、
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧ ＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡ ＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＣ ＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＡＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＧ ＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧ ＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣ ＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡ ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧ ＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡ ＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡ ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＴＴ ＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０） である。
本発明の三態様によれば、一つの実施例において、二態様に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。
本発明の四態様によれば、一つの実施例において、三態様に記載の発現ベクターを含み、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖを発現可能である宿主細胞が提供される。
本発明の五態様によれば、一つの実施例において、一態様に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の六態様によれば、一つの実施例において、二態様に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現宿主細胞に形質転換し、培養し、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖの大量発現及び純化を行うことを含む、一態様に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖを作製する方法が提供される。
好ましくは、前記発現ベクターがｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターであり、前記宿主細胞が大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ及びＴＧ１株である。
本発明の七態様によれば、一つの実施例において、ＢＣＭＡ標的薬の製造における、又は非疾患診断治療目的での免疫学的ＢＣＭＡ検定における、一態様に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖの使用が提供される。
本発明は、部位特異的変異導入と、ランダム部位変異導入とを結合して、ＢＣＭＡを標的とするファージ提示ライブラリーを人工的に合成し、ファージ提示法を結合して、ＢＣＭＡを標的とする抗体とすることができる３株のＢＣＭＡを標的とする抗原の新規ｓｃＦｖ株が得られ、ＢＣＭＡを標的とする抗体として深く研究開発を進めることが可能である。
本発明の実施例１に係る部位特異的変異導入の二次ライブラリー及びランダムライブラリーの電気泳動検出結果図である。 本発明の実施例１に係るクローンＰＣＲ検証により構築されたファージ提示ライブラリーにおけるｓｃＦｖフラグメントの組み換え効率結果図であり、ただし、クローン１－３６が二次ライブラリーのクローンであり、クローン３７－７２がランダムライブラリーのクローンである。 本発明の実施例２に係るＥＬＩＳＡにおける４ラウンドのアフィニティー・パニング後のファージライブラリーによりＢＣＭＡを標的とする親和性測定結果図である。 本発明の実施例２に係るＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖモノクローナルＰＣＲのスクリーニング結果図であり、ただし、クローン１－３６がランダムライブラリーからスクリーニングされたクローンであり、クローン３７－５６が二次ライブラリーからスクリーニングされたクローンである。矢印は、配列に変異が生じたクローンを表す。 本発明の実施例２に係るＥＬＩＳＡにおけるｓｃＦｖ候補株のＢＣＭＡを標的とする親和性を検証した結果図である。
以下、具体的な実施形態及び図面を参照して、本発明について詳細に説明する。以下の実施形態では、理解を容易にするためにその中には本発明の実施形態の様々な詳細を含んでおり、それらは単なる例示するものと見なされるべきである。したがって、当業者は、一部分の特徴を異なる場合には省略されてもよく、又は他の要素、材料、方法に置き換えることができることを容易に認識するだろう。
また、明細書に記述された特点、取り扱い又は特徴は、任意の適切な形で組み合わされて実施化することができる。同時に、方法説明で記述されたステップ又は動作を並べ替え、又は調整することができることは、当業者に認められるであろう。したがって、明細書及び図面で記述された様々なステップは、一つの実施形態を明確に説明するためのものであり、別段の規定がない限り、ある順序で実行されなければならないことを限定することを意図していない。
本発明は、抗ＢＣＭＡのヒト化ｓｃＦｖ配列を基礎した上で、その重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３に対して部位特異的変異導入と、ランダム部位変異導入とを行い、抗ＢＣＭＡのｓｃＦｖファージライブラリーを人工的に合成する。その後、ファージ提示法を結合して、ＢＣＭＡ抗原に対して複数回のアフィニティー・パニング及びスクリーニングを行い、最後にスクリーニングにより得られた抗体モノクローナル株に対して配列分析と親和性測定を行い、獲得した新規抗ＢＣＭＡのｓｃＦｖ株は、ＢＣＭＡを標的とする薬の抗体として、下流の免疫治療法の治療薬物の開発に使用される。
本発明は、ヒト化ｓｃＦｖ配列をフレームワークとし、そのＣＤＲ３領域のみを人工改造し、後期の抗体ヒト化の改造難度を大幅に下げることができ、同時に、改造による抗体標的抗原親和性に対する影響を減少させることができる。また、本発明は、ファージ提示法を結合して利用することにより、抗体の親和性情報を比較的迅速に直感的に獲得することができ、さらに、複数株の新規の高親和性を有するｓｃＦｖを比較的短時間に獲得することができ、ＢＣＭＡを標的とする免疫治療法の開発により多くの手段を提供し、継続開発の価値がある。
本発明は、ＢＣＭＡのｓｃＦｖ配列を基礎とした上で、その重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域に対して変異導入を行い、さらにファージ提示法を結合して、ＢＣＭＡを標的とする新規ｓｃＦｖ株を３株開発した。
上記方法で獲得された３株の抗ＢＣＭＡのｓｃＦｖ抗体のアミノ酸とヌクレオチドの配列情報は、表１に示すとおりである。
Figure 2022508775000002
Figure 2022508775000003
Figure 2022508775000004
上記方法で獲得された３株のｓｃＦｖの軽鎖（Ｌ ｃｈａｉｎ）及び重鎖（Ｈ ｃｈａｉｎ）のフレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸の配列は、表２に示すとおりである。
Figure 2022508775000005
Figure 2022508775000006
本発明によって得られたｓｃＦｖ抗体は、ＢＣＭＡ抗原を高効率的に標的結合することができ、ＢＣＭＡを標的とする診断又は治療に使用することが可能である。
なお、抗体の特異的結合特性は、相補性決定領域によって決定されることが知られている。したがって、本発明の１つの態様によれば、権利出張される主題は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＹＲＫＬＡＷＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）であるＣＤＲ３と、を含み、重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）であるＣＤＲ３と、を含み、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＡＬＶＶＴＰＦＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）であるＣＤＲ３と、を含み、重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＦＧＭＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）であるＣＤＲ３と、を含み、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＲＬＴＰＳＰＦＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）であるＣＤＲ３と、を含み、重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＮＴＡＬＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）であるＣＤＲ３と、を含む、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖである。
好ましい技術案では、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、ここで、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であり、重鎖可変領域（ＶＨ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８であり、重鎖可変領域（ＶＨ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であり、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２であり、重鎖可変領域（ＶＨ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１である。
さらなるより好ましい技術案では、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖの配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９である。
遺伝子コードの縮重性を考慮して、同時に抗体の特異的結合特性が相補性決定領域によって決定されることを考慮している。したがって、本発明の１つの態様によれば、権利出張される主題は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８をコードするヌクレオチドヌクレオチド配列と、重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ２８、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３をコードするヌクレオチド配列とを含む、本発明に係る抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列である。このようなポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重性により塩基配列を変化してもよく、それぞれに対応する相補性決定領域をコードできる配列であればよい。
好ましい技術案では、ポリヌクレオチド配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ３をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ８をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ７をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １２をコードするヌクレオチド配列と、重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １１をコードするヌクレオチド配列とを含む。
さらなるより好ましい技術案では、ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、又は ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０である。
本発明の１つの実施例では、本発明のポリヌクレオチド配列を含むファージ発現ベクターが提供される。当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、多数のベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ，ｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ，ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳなどが、本発明のポリヌクレオチド配列の発現ベクターとすることができることを理解するであろう。好ましい実施例では、発現ベクターは、ファージ提示ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターである（武漢▲みょう▼霊生物科技有限公司から購入）。
本発明の１つの実施例では、本発明の発現ベクターを含み、ファージの表面に抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖを発現可能である宿主細胞が提される。本発明の精神から逸脱することなく、多数の細胞ＥＲ２７３８、ＳＳ３２０、ＴＧ１、ＸＬ１－Ｂｌｕｅなどが、本発明の発現ベクターの宿主細胞とすることができることを理解するであろう。好ましい実施例では、宿主細胞は、大腸菌のＸＬｌ－Ｂｌｕｅ株（ＴＡＫＡＲＡから購入）とＴＧ１株である（米国、Ｌｕｃｉｇｅｎから購入）。
本発明の１つの実施例では、本発明の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において公知である方法によって作製することができ（例えば、Ｒｅ分間ｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 、 １９ｔｈ ｅｄ ． （１９９５）、Ａ ． Ｇｅｎｎａｒｏ ら、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ ．）、且つ、本発明で開示される抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む。
本発明の１つの実施例では、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現宿主細胞に形質転換し、培養し、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖの大量発現及び純化を行うことを含む、本発明の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖを作製する方法が提供される。好ましい実施例では、発現ベクターは、ファージ提示ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターであり、宿主細胞は、大腸菌のＸＬｌ－Ｂｌｕｅ株とＴＧ１株である。
本発明の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖは、抗ＢＣＭＡタンパク質モノクローナル抗体薬物を作製するために使用することができ、免疫学的検定ＢＣＭＡにも使用することができる。したがって、本発明の一実施例では、ＢＣＭＡ標的薬の製造における、又は非疾患診断治療目的での免疫学的ＢＣＭＡ検定における、本発明の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖの使用が提供される。
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、以下に記載する実施例の説明は、単なる例示するものと見なされるべき、本発明の保護範囲を制限するものとして解釈されないものとする。
（実施例１）
単鎖抗体をランダムに合成するファージ提示ライブラリーの構築
（１）ＣＤＲ３領域突然変異の設計
それぞれ抗ＢＣＭＡのヒト化ｓｃＦｖの重鎖と軽鎖配列を基礎として、突然変異プライマーを設計し、重鎖と軽鎖のＣＤＲ３領域に突然変異をそれぞれ導入し、人工合成の二次ライブラリー（部位特異的変異用）とランダムライブラリー（ランダム部位変異用）を構築する。突然変異プライマーの配列は、表３に示すとおりである。
Figure 2022508775000007
（注：合併塩基 Ｋ ＝ Ｇ／Ｔ、Ｍ ＝ Ａ／Ｃ、 Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ ＝ Ｇ／Ｃ、Ｗ ＝ Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）
（２）鋳型の作製
ＢＣＭＡ抗体の重鎖と軽鎖可変領域遺伝子を合成し、遺伝子座Ｓｆｉ ＩからｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクター（武漢▲みょう▼霊生物科技有限公司から購入）に挿入する。抗体フラグメント増幅のプライマー情報は、表４に示すとおりである。
Figure 2022508775000008
構築した鋳型プラスミドを１μＬ取り、ＸＬ １－Ｂｌｕｅコンピテント細胞（ＴＡＫＡＲＡから購入）形質転換、３７℃で１時間蘇生し、塗抹プレートを２００μＬ取り、３７℃で一夜培養した。
アミノベンジルペニシリン（Ａｍｐ＋）Ｍ１３Ｋ０７（補助ファージ）（実験室調製）を含むＬＢ培地にモノクローナルをピックアップし、３７℃で一夜培養した。
菌液を遠心し、上清を収集し、１／５体積のＰＥＧ／ＮａＣｌを加え、混合し、氷上で３０分間インキュベートし、ファージ粒子を沈殿させ、１２０００ｒｐｍ３０分間遠心し、上清を捨て、ファージ粒子をＰＢＳで再懸濁し、再度１２０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を収集して培養したＣＪ２３６菌液（ＴＡＫＡＲＡから購入）に加え、ｄＵ－ｓｓＤＮＡ（ウラシルを含む一本鎖鋳型ＤＮＡ、ｕｒａｃｉｌ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ）形成するために用いられた。３７℃で３０分間培養し、Ｍ１３ＫＯ７を加え、１時間培養を継続し、菌液をＡｍｐ＋、カナマイシン（Ｋａｎ＋）及びウラシル（Ｕｒｉｄｉｎｅ）を含む３００ｍｌ培地に移し、３７℃で一夜培養した。
菌液を遠心し、上清を収集し、１／４体積のＰＥＧ／ＮａＣｌを加え、混合し、氷上で３０分間インキュベートし、ファージ粒子を沈殿させ、１２０００ｒｐｍ２５分間遠心し、上清を捨て、ファージ粒子を収集し、ＤＮＡ抽出キットを用いてｄＵ－ｓｓＤＮＡを抽出し、定量した。
（３）ライブラリーの構築
各プライマー乾燥粉末を１００μＭ希釈標準溶液に調製し、ランダムライブラリープライマーを重鎖プライマーＨ３－２１１（Ｈ３－２、Ｈ３－４、Ｈ３－９、Ｈ３－１１各５μＬ）と軽鎖プライマーＬ３－４５９（Ｌ３－４、Ｌ３－５、Ｌ３－９各５μＬ）に混合した。
二次ライブラリーとランダムライブラリーの各プライマーに対して、リン酸化反応をそれぞれ行い、各ライブラリーに対して２回の反応を行い、各反応系は２０μＬとした。取扱は次のとおりである：
プライマー（１００μＭ）２μＬ、１０ ＸＴ４Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ、Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）２μＬ、脱イオン水１４μＬ。３７℃で水浴１．５時間。
二次ライブラリーとランダムライブラリーに対応するリン酸化変異プライマーをそれぞれ混合した後、ｄＵ－ｓｓＤＮＡ鋳型とアニール反応を行い、各ライブラリーは１回の反応を行い、各反応系は２５０μＬとした。取扱は次のとおりである：
プライマー（各ライブラリーは、軽鎖および重鎖という２つのプライマーを含む）４０μＬ、１０ＸＴ４Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬ、ｄＵ－ｓｓＤＮＡ鋳型２０μＬ、脱イオン水で２５０μＬに補充した。
ＰＣＲ器にて次のアニールプログラムを設定した。
９０℃、５分間；７５℃、４５秒；７０℃、１分間；６５℃、１分間；６０℃、１分間；５５℃、５ 分間；５０℃、５分間；４５℃、３０秒；３７℃、１０分間；３０℃、４５秒；２５℃、４５秒；２２℃、９０秒；２０℃、５分間；１サイクル。
各アニール反応に、１０ＸＴ４Ｂｕｆｆｅｒ１０μＬ、ｄＮＴＰ（各種１０ ｍＭ）２５μＬ、ＤＴＴ（１００ ＭＭ）５μＬ、Ｔ７ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ）３μＬを加えた。３７℃で伸長反応４時間。
各系にＴ４リガーゼを５μＬ加え、室温でライゲーション２時間。
ライゲーション生成物をＤＮＡ電気泳動検証により、図１に示すように、バンドは、鋳型と比較して明らかな変位がある場合、ｓｃＦｖを担体上に構築に成功したことを示した。
（４）ファージ提示ライブラリーの構築
二次ライブラリーとランダムライブラリーにそれぞれ１５μＬの３ＭＮａＡｃ（ｐＨ５．５）を加えてｐＨを調節し、ライゲーション生成物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて精製生成物を定量した。それぞれ１μＬの精製後の二次ライブラリーとランダムライブラリーを取って高効率ＴＧコンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ、米国）形質転換、３７℃で１時間蘇生し、１０６に段階希釈し、塗抹プレートをそれぞれ３００μＬ取り、３７℃で一夜培養した。翌日、プレート上のクローン数をカウントし、式「ライブラリー容量＝クローン数Ｘ希釈度Ｘ１０００／３０ 」によって計算した。
計算得られた二次ライブラリとランダムライブラリのライブラリー容量は、１０８／ｍｌより大きい。すべてのクローンをＬＢで溶出し、５０００ｇ、５分間遠心し、沈殿が２ｍｌＬＢで懸濁し、等体積の３０％甘油を加え、－８０℃で凍結保存した。
（５）ファージ提示ライブラリーの多様性検出
ステップ（４）の二次ライブラリーとランダムライブラリーの３６個のクローンをそれぞれランダムに採取し、鋳型としてクローン（ｄｏｎｅ） ＰＣＲを行い、１．５％のアガロースゲル電気泳動を用いてＰＣＲ生成物を検出し、図２に示すように、二次ライブラリー（クローン１－３６）とランダムライブラリー（クローン３７－７２）の組換え率は、９４％と１００％であった。ランダムに５６個のクローンを選んでＳａｎｇｅｒシークエンシングに送り、ファージ提示ライブラリーの多様性を分析した；ｓｃＦｖ配列の分析結果によると、二級ライブラリーにおける２６本の配列のうちの１１本には、突然変異があり、ランダムライブラリーにおける２５本の配列のうちの１４本には、突然変異があり、多様性がそれぞれ４２％と５６％に達し、次の新規抗体のスクリーニングに応用できる。
（６）ファージ増幅とレスキュー
上記で得られた二次ライブラリーとランダムライブラリーのファージ提示を増殖とバクテリオファージレスキューし、ステップ（４）で保存されたファージライブラリー１ｍｌをそれぞれ１００ｍｌ培地にアクセスして対数増殖期まで培養し、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、多重感染度）が２０である補助ファージＭ１３Ｋ０を加え、室温、３０分間静置し、低速遠心後、沈殿用培地で懸濁させ、３００ｍ培地にアクセスし、一夜培養した。翌日、３０００遠心３０分間、上清を収集し、ＰＥＧ沈殿ファージを加え、氷上で３０分間静置し、３０００遠心３０分間、沈殿、ＢＣＭＡを持つｓｃＦｖのファージライブラリーとなり、ＰＢＳで懸濁沈殿した後、その力価を測定し、測定結果、二次ライブラリーは、２．６Ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌであり、ランダムライブラリーは、３．３Ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌであった。
（実施例２）
ファージ提示法によりＢＣＭＡの高親和性抗体のスクリーニング
（１）ファージのアフィニティー・パニング
１００ｎｇＢＣＭＡ－ｈｉｓ抗原をそれぞれ取り、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングしてサンプル孔とし、１００μＬ Ｎａ２ＣＯ３を陰性対照孔とし、４℃、一夜インキュベートした。翌日、実施例１のステップ（６）でレスキューされた二次ライブラリーとランダムライブラリーのファージライブラリーをそれぞれ加え、室温、２時間インキュベートした；孔をＰＢＳＴで１０回洗浄し、１００μＬトリエチルアミンを加え、室温、３０分間インキュベートし、収集されたファージは、アフィニティー・パニングにより得られた抗ＢＣＭＡのｓｃＦｖのファージライブラリーである；感染ＴＧ細胞を１０μＬ採取し、プレート塗抹、翌日、親和性ファージのパニング結果を観察し、残りのファージを増幅およびレスキューに利用した。
（２）パニングされたファージの増幅とレスキュー
増幅及びレスキュー方法は、実施例１のステップ（６）と同様に、得られたＰＢＳ懸濁液は、増幅された１回目のパニング後のファージであり、４℃で保存し、次回のスクリーニングに用いられる。実施例２のステップ（１）のパニングステップに従い、ラウンド毎に抗原量を逐次減少させ、３～４ラウンドのバニングを行った。
（３）ＥＬＩＳＡにより特異性抗体の濃縮程度の評価
１００ｎｇＢＣＭＡ－ｈｉｓ抗原を取り、４℃、一夜放置した；翌日、２％のＢＳＡを加えて室温で１時間閉鎖した；実験群に各ラウンドのバニング後に増幅したファージをそれぞれ加え、対照群に等量の野生型ファージを加え、室温で２時間インキュベートした；ＰＢＳＴで１０回洗浄し、結合できないファージを除去した。ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を加え、室温で１時間インキュベートした；呈色液を加え、遮光反応１０～３０分間、吸光値ＯＤ４５０を測定し、ＥＬＩＳＡの結果は、図３に示すように、吸光値が１回目ラウンドから３回目のパニング時に安定の方へ向かい、新規の特異性を有する抗体が濃縮されたことを表した。
（４）ＢＣＭＡを標的とする高親和性のｓｃＦｖ陽性クローンの同定
２回目ラウンドと３回目ラウンドのバニングで得られたファージ塗抹プレートを取り、それぞれランダムライブラリーと二次ライブラリーから３６及び２０個のクローンを選択してクローン（ｄｏｎｅ） ＰＣＲを行った後、その結果が図４に示すように、そのうちの変位を有するクローンを選んで配列測定を行った；配列測定結果を分析すると、ＣＤＲ３領域に変異を有するｓｃＦｖ単クローン株５本（図中矢印）が発見された。
１００ｎｇ ＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一夜インキュベートした；この５個のモノクローナルを１ｍｌ培地に採取し、３７℃で対数期まで培養し、１ｍＭＩＰＴＧを加えて一夜誘導した；翌日、遠心で菌沈殿を収集し、破砕後、５０００ｇ離心１５分間、上清を収集した。同時に、ＥＬＩＳＡプレートを取り、２％のＢＳＡを加えて室温で１時間閉鎖した；実験群に、各孔に単クローンの破砕上清を加え、対照群に、空白ＴＧの破砕上清を加え、室温、２時間インキュベートした；ＰＢＳＴで１０回洗浄、マウス抗ＨＡ標識抗体を加え、室温１時間；ＰＢＳＴで洗浄３～５回、ＡＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を加え、室温１時間；基質を加え、１０～２０分間反応し、マイクロプレートリーダーから吸光値を読み取った。吸光値と対照孔との比が２．１（基準線）より大きい場合、陽性クローンと判定し、ＥＬＩＳＡ検証結果によると、それぞれクローン２０、クローン４３とクローン４６である３個の陽性クローンが得られた（図５）。
（５）陽性クローン配列情報
ステップ（４）で得られた３株の陽性クローンは、生配列と比較すると、重鎖ＣＤＲ３領域及び軽鎖ＣＤＲ ３領域に顕著な変異が認められた。この３株のｓｃＦｖモノクローナルは、それぞれｓｃＦｖ＿２０、ｓｃＦｖ＿４３とｓｃＦｖ＿４６と名付けられ、当該ヌクレオチドとアミノ酸の配列は、以下の通りである。
ｓｃＦｖ＿２０ヌクレオチド配列：
５’－ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧ ＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣ ＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＣ ＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＧＣＡＴＧＧ ＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡ ＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣ ＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣ ＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴ ＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧ ＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡ ＣＧＧＴＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ－３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ２）。
ｓｃＦｖ＿２０アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦ ＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ ＳＬＱＰＥＤＦＡＴ ＹＹＣＱＱＹＲＫＬ ＡＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧ ＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴ ＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＩＦＮＧＹＤＶＬＤＮＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： １）。
ｓｃＦｖ＿４３ヌクレオチド配列：
５’－ＧＡＣ ＡＴＣＣ ＡＧＡＴＧＡＣＣＣ ＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣ ＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣ ＡＧ ＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣ ＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＣ ＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧ ＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧ ＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣ ＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡ ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧ ＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧ ＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣ ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴＡＴＧ ＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ－３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ６）。
ｓｃＦｖ＿４３アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦ ＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ ＳＬＱＰＥＤＦＡＴ ＹＹＣＱＱＡＬＶＶＴＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ ＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＧＭＬＤＮＷＧＱＧＴ ＬＶＴＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ５）。
ｓｃＦｖ＿４６ヌクレオチド配列：
５’ －ＧＡＣ ＡＴＣＣ ＡＧＡＴＧＡＣＣＣ ＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣ ＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣ ＡＧ ＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣ ＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＣ ＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＡＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＧ ＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧ ＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣ ＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡ ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧ ＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧ ＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣ ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＴＴＴＧ ＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ－３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ： １０）。
ｓｃＦｖ＿４６アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＲＬＴＰＳＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧ ＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴ ＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＴＡＬＬＤＮＷＧＱＧＴＬ ＶＴＶＳＳ （ＳＥＱＩＤＮＯ： ９）。
以上、具体的な実施例を応用して本発明について説明したが、本発明がよりよく理解されるためのものであり、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の範囲と技術思想から逸脱することなく、演繹、変形又は代替を若干行うことが可能である。

Claims (12)

  1. 軽鎖可変領域（ＶＬ）と、重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む一本鎖抗体ｓｃＦｖであって、
    前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＹＲＫＬＡＷＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）であるＣＤＲ３と、を含み、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）であるＣＤＲ３と、を含み、
    又は、
    前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＡＬＶＶＴＰＦＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）であるＣＤＲ３と、を含み、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＦＧＭＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）であるＣＤＲ３と、を含み、
    又は、
    前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＱＤＩＳＮＹ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）であるＣＤＲ１と、配列がＹＴＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）であるＣＤＲ２と、配列がＱＱＲＬＴＰＳＰＦＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）であるＣＤＲ３と、を含み、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列がＧＧＴＦＳＮＹＷ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）であるＣＤＲ１と、配列がＴＹＲＧＨＳＤＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）であるＣＤＲ２と、配列がＡＲＮＴＡＬＬＤＮ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）であるＣＤＲ３と、を含む、
    ことを特徴とする抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖ。
  2. 前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であり、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、又は、
    前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８であり、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であり、又は、
    前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２であり、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１である、ことを特徴とする請求項１に記載の一本鎖抗体ｓｃＦｖ。
  3. 前記一本鎖抗体ｓｃＦｖの配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９である、ことを特徴とする請求項１に記載の一本鎖抗体ｓｃＦｖ。
  4. 前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ２８、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３をコードするヌクレオチド配列とを含む、
    ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列。
  5. 前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ３をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は、
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ８をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ７をコードするヌクレオチド配列とを含み、又は
    前記ポリヌクレオチド配列は、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １２をコードするヌクレオチド配列と、前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １１をコードするヌクレオチド配列とを含む、
    ことを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド配列。
  6. 前記ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、又は ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０である、ことを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド配列。
  7. 請求項３～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする発現ベクター。
  8. 請求項７に記載の発現ベクターを含み、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖを発現可能である、ことを特徴とする宿主細胞。
  9. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、ことを特徴とする医薬組成物。
  10. 請求項３～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現宿主細胞に形質転換し、培養し、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖの大量発現及び純化を行うことを含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖを作製する方法。
  11. 前記発現ベクターがｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターであり、前記宿主細胞が大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ及びＴＧ１株である、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. ＢＣＭＡ標的薬の製造における、又は非疾患診断治療目的での免疫学的ＢＣＭＡ検定における、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体ｓｃＦｖの使用。
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