KR20160083493A - 항체 라이브러리 및 그의 제작방법 - Google Patents

항체 라이브러리 및 그의 제작방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 항체 라이브러리 및 그의 제작방법에 관한 것이다. 본 발명은 내용물(repertoire)이 풍부한 항체 라이브러리를 제공한다. 본 발명에 따르면, 항체 특히 CDR에서의 서열 다양성 또는 서열 다양성과 길이 다양성을 부여함으써, 항체 라이브러리의 다양성을 확보함께 동시에 활성(functionality)이 우수한 항체 라이브러리를 제공할 수 있다. 본 발명에 따르면, 항체 다양성을 부여하면서 불필요한 다양성 변화를 감소시켜, 매우 효율적으로 항체 라이브러리를 제작할 수 있다.

Description

항체 라이브러리 및 그의 제작방법{Antibody Libraries and Methods for Preparation of Them}
본 발명은 신규한 항체 라이브러리 및 그의 제작방법에 관한 것이다.
인간 항체는 다양한 질환에서 유용한 치료제로 이용되고 있다. 예컨대, HER-2에 대한 인간화 항체는 암의 치료 및 진단에 이용되고 있고, 항-INF-γ는 크론씨 질환과 같은 면역질환에 이용되고 있다.
한편, 파아지 디스플레이 라이브러리는 면역화된 인간, 비-면역화 인간, 생식선 서열 또는 나이브(naive) B 세포 Ig 내용물(repertoires)로부터 인간 항체를 제조하는데 이용되고 있다(EP 0368684).
파아지 디스플레이 라이브러리를 제조함에 있어서, 우수한 서열 다양성 또는 길이 다양성을 확보하는 것은 항체 치료제를 개발하는데 첫 번째 단계에서 매우 중요하다. 이에, 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 다양한 방법들이 제시되고 있다.
예를 들어, 미국 특허 제8841238호는 적절하게 폴딩되는 scFv 항체를 효율적으로 생산할 수 있는 라이브러리 기술을 개시하고 있으며, VH CDR3를 위하여 13종의 스파이크/축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 이용하고, VH CDL3를 위하여 5종의 스파이크/축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법을 개시하고 있다.
미국 특허 제8735331호는 VH CDR2의 52번째 잔기가 Asn 또는 Tyr으로 생식선 변이되고 VH CDR3를 인위적으로 변이시킨 라이브러리를 개시하고 있다. 미국 특허 제8404445호는 특정 서열의 프라이머를 이용하여 가변성 영역 유전자를 증폭하며, 라이브러리를 구축하는 방법을 개시하고 있다.
미국 특허 제8178320호는 VH 유전자를 셔플링 하여, 유전자의 다양성을 확보함으로써, 라이브러리를 구축하는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 제7985840호는 치우침(bias)가 있는 랜덤 프라이머를 이용하여 라이브러리를 구축하는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 제7067284호는 특정 서열의 프라이머를 이용하여 경쇄 유전자를 변이시켜 라이브러리를 구축하는 방법을 개시하고 있다.
기존의 대부분의 항체 라이브러리 구축 기술들은 가변성 부위의 CDR의 각 위치에서 20개의 아미노산 잔기로 램덤화하여 항체 라이브러리 다양성을 확보하고 있다(Barbas, PNAS 91:3809(1994)). 그러나, 이러한 접근은 서열의 다양성을 확보할 수 있지만, 불필요한 서열 다양성이 초래되어 전체적으로 항체 라이브러리의 질(quality)을 감소시키는 문제점이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 항체, 특히 CDR에서의 서열 다양성 또는 서열 다양성과 길이 다양성을 부여함으써, 항체 라이브러리의 다양성을 확보함께 동시에 활성(functionality)이 우수한 항체 라이브러리를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 다양성을 부여할 CDR의 특정 위치에 삽입(incorporation)될 아미노산 종류를 몇 개로 선택하고 이들 선택된 아미노산들의 조성 비율을 조절하는 신규한 항체 라이브러리 제작방법을 개발하였고, 이 제작방법에 따르면 상술한 장점을 갖는 항체 라이브러리가 제작됨은 물론 불필요한 다양성 변화를 감소시켜, 매우 효율적으로 항체 라이브러리를 제작할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 항체 라이브러리의 제작방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 중쇄 가변영역의 CDRH1의 라이브러리를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 중쇄 가변영역의 CDRH2의 라이브러리를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 중쇄 가변영역의 CDRH3의 라이브러리를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체 라이브러리를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 항체 라이브러리의 제작방법을 제공한다:
(a) 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 준비하는 단계;
(b) 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 어닐링하는 프라이머를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭하여 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 수득하는 단계; 상기 프라이머는 DI-프라이머(Diversity Imparting-primer)이고; 상기 DI-프라이머는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩되는 항체 가변영역의 CDR(complementarity determining region)의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성(diversity)이 도입되도록 하는 프라이머의 조합이고; 상기 DI-프라이머는 상기 아미노산 잔기 다양성이 발생되는 위치에 오는 복수의 아미노산을 코딩하는 복수의 코돈에 대응하는 서열을 포함하고; 및
(c) 상기 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득하는 단계.
본 발명자들은 항체, 특히 CDR에서의 서열 다양성 또는 서열 다양성과 길이 다양성을 부여함으써, 항체 라이브러리의 다양성을 확보함께 동시에 활성(functionality)이 우수한 항체 라이브러리를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 다양성을 부여할 CDR의 특정 위치에 삽입(incorporation)될 아미노산 종류를 몇 개로 선택하고 이들 선택된 아미노산들의 조성비율을 조절하는 신규한 항체 라이브러리 제작방법을 개발하였고, 이 제작방법에 따르면 상술한 장점을 갖는 항체 라이브러리가 제작됨은 물론 불필요한 다양성 변화를 감소시켜, 매우 효율적으로 항체 라이브러리를 제작할 수 있음을 규명하였다.
본 명세서에서, 용어 “항체”는 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 항체 분자의 항원 결합 단편은 scFv, di-scFv, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 및 sdAb(single-domain antibody) 항체를 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 완전한 항체, Fab 및 scFv의 제조에 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로 완전한 항체 및 Fab의 제조에 이용될 수 있다. 본 발명은 포유동물 항체, 보다 구체적으로 인간 항체의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 준비
우선, 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 준비한다.
항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는, 구체적으로 자연계에 존재하는(natural-occurring) 인간 항체의 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 예를 들어, 자연계에 존재하는 인간 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 DP47의 뉴클레오타이드 서열(Tomlinson I. M. et al., J. Mol. Biol. 227:776798(1992)), 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 DPK22의 경쇄 가변영역(Cox J. P. L. et al., Eur. J. Immunol. 24:827836(1994)) 또는 DPL3의 경쇄 가변영역(Eskil Soderlind et al., Nature Biotechnology 18:852-856 (2000))의 뉴클레오타이드 서열을 이용할 수 있다. 표 1 및 서열목록 제1서열 내지 제6서열은 DP47, DPK22 및 DPL3의 가변영역의 CDR3의 예시적인 서열을 보여준다.
본 발명에서 이용되는 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 인위적으로 합성하여 이용할 수 있으며, 단계 (b)에서의 유전자 증폭 과정에서 주형으로서 이용된다.
본 발명은 항체의 가변영역만으로 구성된 scFv(single-chain variable fragment) 항체의 제조에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 Fab 항체를 제조하는데 이용될 수 있다. 이 경우, 단계 (a)에서 항체 가변영역과 불변영역 CH1 및 CL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 준비한다. 상기 불변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는, 구체적으로 자연계에 존재하는 인간 항체의 불변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 예를 들어, 자연계에 존재하는 인간 항체의 중쇄 불변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 DP47의 뉴클레오타이드 서열, 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 카파(κ) 경쇄 불변영역의 DPK22 또는 람다(λ) 경쇄 불변영역의 DPL3의 뉴클레오타이드 서열을 이용할 수 있다. 표 2 및 서열목록 제7서열 내지 제12서열은 DP47의 불변영역(CH1), DPK22 및 DPL3의 불변영역(CL)의 예시적인 서열을 보여준다.
인위적으로 합성된 항체 가변영역 또는 항체 가변영역과 불변영역 CH1 및 CL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 그대로 이용할 수 있지만, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자의 카피 수를 증가시키기 위하여 증폭하여 이용할 수 있다.
유전자 증폭은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으며, 구체적으로 PCR(polymerase chain reaction) 방법(미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., Science 230:1350-1354(1985))으로 증폭하며, 보다 구체적으로 오버랩핑 PCR 방법(Higuchi R et al., Nucleic Acids Res 16(15):735167(1988))으로 증폭한다.
항체 주형 유전자의 증폭에 이용되는 프라이머는 서열목록 제13서열 내지 제26서열에 예시되어 있다. 사용되는 프라이머의 향후의 클로닝 과정을 고려하여 제한효소 위치를 포함할 수 있다.
(b) 폴리뉴클레오타이드 라이브러리의 제작
이어, 상기 항체 가변영역 또는 항체 가변영역과 불변영역 CH1 및 CL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 주형으로 하고, DI-프라이머(Diversity imparting-primer)를 이용하여 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 제작한다.
DI-프라이머의 이용은 본 발명의 가장 큰 특징이며, 이에 의해 CDR의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성(diversity)이 도입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드 (dNTPs)와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 프라이머는, 중합효소의 존재 하에서 연장산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머가 주형에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 DI-프라이머는 크게 3개의 부위(portion)로 구성되어 있다: 5‘-혼성화 및 비다양성 부위 I-다양성-도입 부위-비다양성 부위 II-3'.
DI-프라이머에서 5‘-말단쪽에 있는 “혼성화 및 비다양성 부위 I(hybridizing and non-diversity portion I)”는 항체 유전자 주형에 상보적인 서열을 가지는 부위로서 주형과 혼성화(즉, 어닐링)하는 부위이며, 다양성이 도입되지 않는 주형과 동일한 아미노산 서열을 생성시키는 부위이다.
“다양성-도입 부위(diversity-imparting portion)” 및 "비다양성 부위 II(non-diversity portion II)”는 주형과 혼성화 하지 않는 부위이다.
“다양성-도입 부위(diversity-imparting portion)”는 CDR의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성이 발생되도록 하는 부위로서, 아미노산 잔기 다양성이 발생되는 위치에 오는 복수의 아미노산을 코딩하는 복수의 코돈에 대응하는 서열을 포함한다. 예를 들어, CDRH1의 특정 위치에 Tyr, Ser 및 Gly 3 종류의 아미노산이 각각 40%, 30% 및 30%의 조성비(composition ratio)로 도입되어 아미노산 잔기의 다양성이 발생된 라이브러리를 제작하고자 하는 경우, 다양성-도입 부위에 Tyr, Ser 및 Gly을 코딩하는 코돈을 포함하는 DI-프라이머의 조합이 이용된다. 이 경우, 다양성-도입 부위에 Tyr을 코딩하는 코돈을 포함하는 DI-프라이머는 전체 프라이머 중에서 40%를 차지하며, 다양성-도입 부위에 Ser을 코딩하는 코돈을 포함하는 DI-프라이머는 30%를 차지하고, 다양성-도입 부위에 Gly을 코딩하는 코돈을 포함하는 DI-프라이머는 30%를 차지한다. 이러한 DI-프라이머의 조합을 이용함으로써, 최종적으로 생성되는 항체의 CDR의 특정 부위에 서열 다양성이 부여된다.
DI-프라이머의 "비다양성 부위 II(non-diversity portion II)”는 항체 유전자 주형에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 동일한 서열을 코딩하는 부위이다. 비다양성 부위 II는 대체적으로, 주형에 대해 상보적인 서열을 갖지만, 다양성-도입 부위가 주형에 혼성화 되지 않기 때문에, 비다양성 부위 II도 주형에 대해 혼성화 되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CDR의 특정 위치에서의 아미노산 잔기의 다양성의 도입은 상기 특정 위치에서 2-10 종류의 소정(predetermined)의 아미노산 잔기가 소정의 조성비(composition ratio)로 위치할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명의 특징은, 다양성 도입에 이용될 복수의 아미노산의 종류와 조성비를 미리 정하는 것이다. 본 발명자들은 다양성이 도입될 CDR의 종류에 따라, 다양성 도입에 이용될 적합한 아미노산이 있음을 규명하였고, 더욱이 이들 적합한 아미노산들의 적합한 조성비가 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CDR의 특정 위치(즉, 서열 다양성이 도입되는 위치)는 중쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 1: CDRH1), CDRH2, CDRH3, 경쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 1: CDRL1), CDRL2 및 CDRL3로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR의 특정 위치이고; 상기 CDR의 특정 위치는 1-20 위치이며; 상기 다양성 도입에 이용되는 소정의 아미노산 잔기는 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg으로 구성된 군으로부터 선택되는 3-8 종류의 아미노산 잔기이며; 상기 다양성 도입에 이용되는 소정의 아미노산 잔기가 3 종류 이상인 경우에는 Tyr, Ser 및 Gly이 필수적으로 이용된다.
보다 구체적으로, 서열 다양성이 도입되는 CDR의 특정 위치는 (i) CDRH3, (ii) CDRL3, (iii) CDRH3와 CDRL3, (iv) CDRH1, CDRH2, CDRH3와 CDRL3, 또는 (v) CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2와 CDRL3이다.
보다 구체적으로, 서열 다양성 도입에 이용되는 아미노산 잔기는, CDRH1의 경우에는 Tyr, Ser 및 Gly, CDRH2의 경우에는 Tyr, Ser 및 Gly, 그리고 CDRH3의 경우에는 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg이며, CDRL1의 경우에는 Tyr, Ser 및 Gly, CDRL2의 경우에는 Tyr, Ser 및 Gly, 그리고 CDRL3의 경우에는 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg이다.
보다 구체적으로, 서열 다양성이 도입되는 CDRH1의 특정 위치는 1-10 위치, 보다 더 구체적으로 1-5 위치, 보다 더욱 더 구체적으로 1-3 위치, 가장 구체적으로 2 위치이다.
보다 구체적으로, 서열 다양성이 도입되는 CDRH2의 특정 위치는 1-13 위치, 보다 더 구체적으로 2-12 위치, 보다 더욱 더 구체적으로 5-10 위치, 가장 구체적으로 7 위치이다.
보다 구체적으로, 서열 다양성이 도입되는 CDRH3의 특정 위치는 2-9 위치, 보다 더 구체적으로 3-9 위치, 보다 더욱 더 구체적으로 4-8 위치, 가장 구체적으로 5-7 위치이다.
보다 구체적으로, 서열 다양성이 도입되는 CDRL3의 특정 위치는 2-15 위치, 보다 더 구체적으로 3-13 위치, 보다 더욱 더 구체적으로 4-10 위치, 가장 구체적으로 5-7 위치이다. 선택적으로, 서열 다양성이 도입되는 CDRL3의 특정 위치는 2-10 위치, 보다 더 구체적으로 2-8 위치, 보다 더욱 더 구체적으로 2-6 위치, 가장 구체적으로 2-4 위치이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열 다양성 도입에 이용되는 아미노산 잔기가 Tyr, Ser 및 Gly인 경우에는, 서열 다양성 도입 위치에 대응되는 DI-프라이머의 다양성-도입 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다. 이 경우, Ser과 Gly은 실질적으로 동일한 조성비로 존재할 수 있다. 용어 “실질적으로 동일”은 1-2% 정도의 차이가 있을 수 있는 동일을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열 다양성 도입에 이용되는 아미노산 잔기가 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg인 경우에는, 서열 다양성 도입 위치에 대응되는 DI-프라이머의 다양성-도입 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재한다. 이 경우, Ser과 Gly은 실질적으로 동일한 조성비로 존재할 수 있고, 상기 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg은 실질적으로 동일한 조성비로 존재할 수 있다.
상술한 바와 같이, 최종적으로 생성되는 항체의 CDR의 다양성 부위에 소정의 아미노산이 소정의 조성비로 위치하도록, 다양성-도입 부위가 조절된 DI-프라이머의 조합을 이용한다. 예를 들어, CDRH1의 특정 위치에 Tyr, Ser 및 Gly 3 종류의 아미노산이 각각 40%, 30% 및 30%의 조성비로 도입되어 아미노산 잔기의 다양성이 발생된 라이브러리를 제작하기 위하여, 다양성-도입 부위에 Tyr, Ser 및 Gly을 코딩하는 코돈들이 40%, 30% 및 30%의 조성비로 포함된 DI-프라이머의 조합을 이용하면, 이론적으로는 항체의 CDR의 다양성 부위에 Tyr, Ser 및 Gly이 각각 40%, 30% 및 30%의 조성비로 도입된 항체 라이브러리를 얻는다. 그러나, 실제적으로 항체 라이브러리를 얻는 경우, DI-프라이머의 조합에 반영된 다양성-도입 부위에서의 Tyr, Ser 및 Gly의 40%, 30% 및 30%의 조성비는 그대로 항체 라이브러리에 적용되지 않으며, 조금은 차이가 있게 된다. 본 명세서에서, 이러한 차이는 무시(neglect)되어 동일한 것으로 판단될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “조성비”는 다양성을 부여하기 위하여 선택된 아미노산들(또는 코돈들) 중에서 특정 아미노산(또는 코돈)이 차지하는 비율을 의미한다. 예를 들어, CDRH1의 특정 위치에 Tyr, Ser 및 Gly 3 종류의 아미노산이 각각 40%, 30% 및 30%의 조성비로 도입되어 아미노산 잔기의 다양성이 발생된 라이브러리를 제작한다는 것은, 다양성이 발생되는 CDRH1의 특정 위치에 Tyr, Ser 및 Gly 3 종류의 아미노산이 위치하는 전체 항체의 개수를 “100”이라고 하였을 때, 다양성이 발생되는 CDRH1의 특정 위치에 Tyr이 위치하는 항체의 개수가 40이라는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 중쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 1: CDRH1)을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRH1의 다양성이 부여된다:
일반식 1
Phe-Tyr-Phe-Ser-X1-Tyr-X2-Met-Ser-Trp
상기 일반식에서, X1 및 X2는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하고; X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
CDRH1에 다양성을 부여하기 위하여 사용된 DI-프라이머 조합의 구체적인 예는 서열목록 제27서열에 기재되어 있다. 서열목록 제27서열에서, "n"으로 표시된 6개의 뉴클레오타이드는 2개의 코돈에 해당되며, 이 2개의 코돈에는 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 위치할 수 있다. DI-프라이머 조합을 고려하였을 때, 상기 2개의 코돈에 Tyr, Ser 및 Gly이 위치하는 DI-프라이머는 각각 40%, 30% 및 30%의 조성비로 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 중쇄 가변영역의 CDR2(complementarity determining region 2: CDRH2)을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRH2의 다양성이 부여된다:
일반식 2
Trp-Val-Ser-X1-Ile-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Thr-Tyr-Tyr
상기 일반식에서, X1 내지 X7는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하고; X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X3는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X4는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X4 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X5는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X5 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X6는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X6 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X7는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X7 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%(구체적으로, 35-45%, 보다 구체적으로 38-42%), 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%) 및 20-40%(구체적으로, 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%)의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
CDRH2에 다양성을 부여하기 위하여 사용된 DI-프라이머 조합의 구체적인 예는 서열목록 제28서열에 기재되어 있다. 서열목록 제27서열에서, "n"으로 표시된 21개의 뉴클레오타이드는 7개의 코돈에 해당되며, 이 2개의 코돈에는 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 위치할 수 있다. DI-프라이머 조합을 고려하였을 때, 상기 7개의 코돈에 Tyr, Ser 및 Gly이 위치하는 DI-프라이머는 각각 40%, 30% 및 30%의 조성비로 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 중쇄 가변영역의 CDR3(complementarity determining region 3: CDRH3)을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRH3의 다양성이 부여된다:
일반식 3
X1-X2-X3-X4-X5-X6-Phe-Asp-Tyr
상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X4 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X5 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X6가 1-15개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X6 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; 상기 X6가 보이드(void)인 경우, X5는 Phe에 직접 연결된다.
CDRH3에 다양성을 부여하기 위하여 사용된 DI-프라이머 조합의 구체적인 예는 서열목록 제29서열 내지 제40서열에 기재되어 있다. 서열목록 제29서열에서, "n"으로 표시된 15개의 뉴클레오타이드는 5개의 코돈에 해당되며, 이 5개의 코돈에는 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 위치할 수 있다. DI-프라이머 조합을 고려하였을 때, 상기 5개의 코돈에 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 위치하는 DI-프라이머는 각각 30%, 20%, 20%, 6%, 6%, 6%, 6% 및 6%의 조성비로 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 경쇄 가변영역의 CDR3(complementarity determining region 3: CDRL3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRL3의 다양성이 부여된다:
일반식 4
Val-Tyr-Tyr-Cys-Gln-Gln-X1-X2-X3-X4-X5-X6-Thr-Phe-Gly
상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X4 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X5 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void) 고; X6가 1-10개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X6 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; 상기 X6가 보이드(void) 경우, X5는 Thr에 직접 연결된다.
CDRL3에 다양성을 부여하기 위하여 사용된 DI-프라이머 조합의 구체적인 예는 서열목록 제41서열 내지 제45서열에 기재되어 있다. 서열목록 제41서열에서, "n"으로 표시된 15개의 뉴클레오타이드는 5개의 코돈에 해당되며, 이 5개의 코돈에는 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 위치할 수 있다. DI-프라이머 조합을 고려하였을 때, 상기 5개의 코돈에 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 위치하는 DI-프라이머는 각각 30%, 20%, 20%, 6%, 6%, 6%, 6% 및 6%의 조성비로 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 경쇄 가변영역의 CDR3(complementarity determining region 3: CDRL3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRL3의 다양성이 부여된다:
일반식 5
Asp-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Ala-X1-X2-X3-Tyr-Val-Phe
상기 일반식에서, X1 내지 X3는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X3은 1-10개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void) 고; X3가 1-10개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%(구체적으로 25-35%, 보다 구체적으로 28-32%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 10-30%(구체적으로 15-25%, 보다 구체적으로 18-22%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%), 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%) 및 3-12%(구체적으로 4-10%, 보다 구체적으로 5-7%)의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; 상기 X3가 보이드(void) 경우, X2는 Tyr에 직접 연결된다.
CDRL3에 다양성을 부여하기 위하여 사용된 DI-프라이머 조합의 구체적인 예는 서열목록 제46서열 내지 제50서열에 기재되어 있다. 서열목록 제46서열에서, "n"으로 표시된 6개의 뉴클레오타이드는 2개의 코돈에 해당되며, 이 2개의 코돈에는 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 위치할 수 있다. DI-프라이머 조합을 고려하였을 때, 상기 2개의 코돈에 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 위치하는 DI-프라이머는 각각 30%, 20%, 20%, 6%, 6%, 6%, 6% 및 6%의 조성비로 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 DI-프라이머 조합은 서열 다양성뿐만 아니라, 길이 다양성도 부여할 수 있다. 예를 들어, 상기 CDRH3의 다양성 부여와 관련하여 일반식 3으로 설명한 내용에서, X6 위치가 길이 다양성을 부여할 수 있는 부분이다. X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기일 수 있는데, 아미노산 잔기의 개수를 조절함으로써, 길이 다양성을 부여할 수 있다. 이러한 길이 다양성을 통하여, 본 발명에 의해 제작된 항체 라이브러리의 내용물(genetic repertoire)을 더욱 높일 수 있다.
단계 (b)에서의 폴리뉴클레오타이드 분자의 증폭은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으며, 구체적으로 PCR(polymerase chain reaction) 방법, 보다 구체적으로 변이유발 PCR(mutagenesis PCR)에 따라 실시한다(Braman, Jeff, ed. (2002). In Vitro Mutagenesis Protocols. Methods in Molecular Biology 182 (2nd ed.) Humana Press). 변이유발 PCR은 상술한 본 발명의 전략에 의해 구축된 DI_프라이머의 조합을 이용하여 PCR 반응을 실시하는 것이다. 변이유발 PCR에서 다양한 열 안정성 중합효소가 이용될 수 있으며, 구체적으로 Pfu DNA 중합효소가 이용될 수 있다.
본 발명에서 최종적으로 얻고자 하는 항체 라이브러리의 종류에 따라, 단계 (b)에서 증폭되는 폴리뉴클레오타이드 분자의 종류가 결정된다. 예를 들어, 본 발명에서 최종적으로 얻고자 하는 항체 라이브러리가 Fab 항체인 경우에는, 항체 가변영역과 불변영역 CH1 및 CL 모두 증폭된다. 이 경우, 증폭산물은 VH-CH1 및 VL-CL이다. 본 발명에서 최종적으로 얻고자 하는 항체 라이브러리가 scFv 항체인 경우에는, 항체 가변영역만 증폭된다. 이 경우, 증폭산물은 VH-VL이다.
단계 (c): 항체 라이브러리의 수득
상기 단계 (b)에서 제작된 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득한다.
폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 얻는 과정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.
본 발명을 항체 파아지 디스플레이(antibody phage display: APD) 방식으로 실시하는 경우, 단계 (c)는 다음의 단계를 포함한다: (c-1) 단계 (b)에서 제작된 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 파아지미드 벡터에 삽입하고 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및 (c-2) 상기 숙주세포에서 항체를 발현시켜 항체 라이브러리를 수득하는 단계.
APD에서 이용될 수 있는 파아지미드 벡터는 당업계에 공지된 어떠한 파아지미드 벡터도 포함한다. 예를 들어, pComb3 시리즈의 벡터(예컨대, pComb3XSS 벡터)를 이용할 수 있다. 파아지미드 벡터는 “-프로모터-리더 서열-항체-항체 유전자-코트 단백질 코딩 유전자”의 발현 컨스트럭트를 포함할 수 있으며, 또한 6X His tag 또는 HA(hemagglutin) tag을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 발현 컨스트럭트에서 적합한 프로모터는 예컨대, LacZ 프로모터(lacZ), 알칼라인 포스파타아제 phoA 프로모터(Ap), 박테리오파아지 λPL 프로모터, tac 프로모터, 트립토판 프로모터 및 T7 프로모터를 포함한다. 상기 리더 서열은 예컨대, OmpA, LamB, OmpF, MalE 및 PhoA 리더 서열을 포함한다. 상기 코트 단백질 코딩 유전자는 gIII, PIII, PVIII, p3, Soc(T4), Hoc(T4), gpD, 6(pVI) 및 P8 코딩 유전자를 포함한다.
APD에서 이용될 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 세포도 포함하며, 예를 들어 Escherichia coli (E. coli)를 이용할 수 있으며, 구체적으로 전기천공(electroporation) 역량(competent) E. coli를 이용할 수 있다. 파아지미드 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시할 수 있으며, 예를 들어 전기천공 방법으로 실시할 수 있다.
숙주세포에서 항체를 발현시키는 것은, 예컨대 프로모터로서 LacZ 프로모터를 이용하는 경우 적합한 발현 유도체(예컨대, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside))를 배지에 첨가하여 항체를 대량 발현시킬 수 있다.
항체의 발현 후, 타겟으로 하는 항원과 발현된 항체를 이용하여 패닝 과정을 실시할 수 있다(Ehrlich GK, et al., Phage display technology. Affinity selection by biopanning. Methods in molecular biology., 147:195-208(2000). 패닝 과정에 의해 타겟으로 하는 항원과 친화도를 나타내는 항체 라이브러리를 본 발명의 항체 라이브러리로 선택한다.
본 발명에 따르면, 단계 (c)에서 제작된 항체 라이브러리의 다양성은 최소 107, 108, 109 또는 1010이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDRH1의 라이브러리를 제공한다:
일반식 1
Phe-Tyr-Phe-Ser-X1-Tyr-X2-Met-Ser-Trp
상기 일반식에서, X1 및 X2는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며; X1 및 X2 각각에서 상기 Tyr, Ser 및 Gly는 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDRH2의 라이브러리를 제공한다:
일반식 2
Trp-Val-Ser-X1-Ile-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Thr-Tyr-Tyr
상기 일반식에서, X1 내지 X7는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X3는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X4는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X5는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X6는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X7는 Tyr, Ser 또는 Gly이며; X1 내지 X7 각각에서 상기 Tyr, Ser 및 Gly는 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDRH3의 라이브러리를 제공한다:
일반식 3
X1-X2-X3-X4-X5-X6-Phe-Asp-Tyr
상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X6가 1-15개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 X6가 보이드(void)인 경우, X5는 Phe에 직접 연결되며; X1 내지 X6 각각에서 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg은 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리를 제공한다:
일반식 4
Val-Tyr-Tyr-Cys-Gln-Gln-X1-X2-X3-X4-X5-X6-Thr-Phe-Gly
상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X6가 1-15개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 X6가 보이드(void)인 경우, X5는 Thr에 직접 연결되며; X1 내지 X6 각각에서 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg은 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리를 제공한다:
일반식 5
Asp-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Ala-X1-X2-X3-Tyr-Val-Phe
상기 일반식에서, X1 내지 X3는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X3은 1-10개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X3가 1-10개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고; X3가 보이드(void)인 경우, X2는 Tyr에 직접 연결되며; X1 내지 X3 각각에서 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg은 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 상기 중쇄 가변영역의 CDRH1의 라이브러리, (ii) 상기 중쇄 가변영역의 CDRH2의 라이브러리, (iii) 상기 중쇄 가변영역의 CDRH3의 라이브러리, 그리고 (iv) 상기 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리를 포함하는 항체 라이브러리를 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 내용물(repertoire)이 풍부한 항체 라이브러리를 제공한다.
(b) 본 발명에 따르면, 항체 특히 CDR에서의 서열 다양성 또는 서열 다양성과 길이 다양성을 부여함으써, 항체 라이브러리의 다양성을 확보함께 동시에 활성(functionality)이 우수한 항체 라이브러리를 제공할 수 있다.
(c) 본 발명에 따르면, 항체 다양성을 부여하면서 불필요한 다양성 변화를 감소시켜, 매우 효율적으로 항체 라이브러리를 제작할 수 있다.
도 1은 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 4 종류의 골격항체의 제조를 위한 오버랩핑 PCR의 개요를 보여준다. 도 1에서, 번호로 표시된 프라이머는 표 1의 프라이머와 동일하다.
도 2는 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 라이게이션 및 형질전환의 효율을 보여주는 분석 결과이다.
도 3a-3c는 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라 제작된 항체 라이브러리의 길이 다양성 및 서열 다양성을 보여주는 그래프이다. 도 3a의 좌측 그래프는 본 발명에 따라 제작된 DPK22의 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리의 길이 다양성을 나타낸다. 우측 그래프는 DPK22의 경쇄 가변영역의 CDRL3에서 X1(Tyr), X2(Ser), X3(Gly), X4(Asp), X5(Asn), X6(Ala), X7(Pro) 및 X8(Arg)이 다양성을 부여한 위치에서의 발견 비율을 나타낸 것이다. P1, P2, P3 및 P4는 CDRL3에서 다양성을 부여한 부위의 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 표 3의 IL-1a에 대한 항체의 DPK22 L3에서, P1은 첫 번째 볼드체의 Tyr을 나타낸다. 도 3b의 좌측 그래프는 본 발명에 따라 제작된 DPL3의 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리의 길이 다양성을 나타낸다. 우측 그래프는 DPL3의 경쇄 가변영역의 CDRL3에서 X1(Tyr), X2(Ser), X3(Gly), X4(Asp), X5(Asn), X6(Ala), X7(Pro) 및 X8(Arg)이 다양성을 부여한 위치에서의 발견 비율을 나타낸 것이다. P1, P2, P3 및 P4는 CDRL3에서 다양성을 부여한 부위의 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 표 3의 IL-1a에 대한 항체의 DPL3 L3에서, P1은 첫 번째 볼드체의 Gly을 나타낸다. 도 3c의 좌측 그래프는 본 발명에 따라 제작된 DP47의 중쇄 가변영역의 CDRH3의 라이브러리의 길이 다양성을 나타낸다. 우측 그래프는 DP47의 중쇄 가변영역의 CDRH3에서 X1(Tyr), X2(Ser), X3(Gly), X4(Asp), X5(Asn), X6(Ala), X7(Pro) 및 X8(Arg)이 다양성을 부여한 위치에서의 발견 비율을 나타낸 것이다. P1, P2, P3 및 P4는 CDRH3에서 다양성을 부여한 부위의 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 표 3의 IL-1a에 대한 항체의 중쇄 CHRH3에서, P1은 첫 번째 볼드체의 Tyr을 나타낸다.
도 3d-3e는 본 발명에 따라 제작된 Fab 항체 라이브러리의 서열 다양성을 보여주는 그래프이다. 도 3d는 DP47의 중쇄의 가변영역과 CH1 및 DPK22 경쇄 가변영역과 Cκ로 제작된 Fab 라이브러리 Rz-Fab(k)에 대한 것이다. 도 3d에서, 좌측 그래프에서 P1-P5는 DPK22 LCDR3에서 다양성을 부여한 부위의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 표 3의 IL-1a에 대한 항체의 DPK22 L3에서, P1은 첫 번째 볼드체의 Tyr을 나타낸다. 도 3d에서, 우측 그래프에서 P1-P5는 HCDR3에서 다양성을 부여한 부위의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 예를 들어, 표 3의 IL-1a에 대한 항체의 중쇄 CHRH3에서, P1은 첫 번째 볼드체의 Tyr을 나타낸다. 도 3e는 DP47의 중쇄 가변영역과 CH1 및 DPL3 경쇄 가변영역과 Ck로 제작된 Fab 라이브러리 Rz-Fab(λ)-κ에 대한 것이다. 도 3e에서, 좌측 그래프에서 P1-P2는 DPL3 LCDR3에서 다양성을 부여한 부위의 첫 번째 및 두 번째 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 표 3의 IL-1a에 대한 항체의 DPL3 L3에서, P1은 첫 번째 볼드체의 Gly을 나타낸다. 도 3e에서, 우측 그래프에서 P1-P5는 HCDR3에서 다양성을 부여한 부위의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어, 예를 들어, 표 3의 IL-1a에 대한 항체의 중쇄 CHRH3에서, P1은 첫 번째 볼드체의 Tyr을 나타낸다.
도 3f-3g는 상기 도 3d-3e의 결과를 다르게 표현한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제작된 항체 라이브러리의 Fab 항체 발현을 dot-blot으로 분석한 결과를 보여주는 이미지이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 골격항체 제작
Fab 형태의 인간항체 라이브러리 제작을 위해서 중쇄사슬 1종류 그리고 경쇄사슬 3종류 총 4종류의 골격항체를 제작하였다. 먼저 골격항체의 가변영역 유전자로 중쇄사슬은 DP47을 그리고 경쇄사슬은 DPK22와 DPL3를 선정하였다(서열목록 제1서열 내지 제6서열). 선정한 3종류의 유전자는 IMGT 데이터베이스를 참고하여 GenScript사에 의뢰하여 합성 제작하였다. 제작한 가변영역 유전자에 중쇄서열은 CH1을 그리고 경쇄서열은 카파(κ)와 람다(λ) 두 종류의 불변영역 유전자(서열목록 제7서열 내지 제12서열)를 14종의 프라이머(표 1, 서열목록 제13서열 내지 제26서열)를 이용하여 오버랩핑 PCR 방법으로 4종류의 골격항체를 제작하였다(도 1).
프라이머명 서열(5’ to 3’) 제한효소 위치
1 TTTggcccaggcggccGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGG SfiI
2 GCCCTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGAC -
3 GTCACCGTGAGCTCAGCCTCCACCAAGGGC -
4 TTTggccggcctggccACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG SfiI
5 TTTggcccaggcggccGAGCTCGAAATTGTCCTGACGCAGTCGCCG SfiI
6 GTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCACTTTG -
7 CAAAGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCAC -
8 TTTggccggcctggccACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC SfiI
9 TTTggcccaggcggccGAGCTCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCC SfiI
10 GTGCAGCCACAGTTCGTAGGACCGTCAGCTTG -
11 CAAGCTGACGGTCCTACGAACTGTGGCTGCAC -
12 GGCGGCTTTCGGCTGTAGGACCGTCAGCTTG -
13 CAAGCTGACGGTCCTACAGCCGAAAGCCGCC -
14 TTTggccggcctggccGCTACATTCCGTCGGGGCAACCG SfiI
제작된 가변영역과 불변영역 유전자 20 ng에 적합한 프라이머(10 pmole/μL) 4 μL 사용하여 Pfu 중합효소(Thermo scientific) 1 μL, 2.5 μM dNTP 5 μL, 10x 완충액(Thermo scientific) 5 μL를 넣고 마지막으로 총 반응액부피가 50 μL가 되도록 증류수로 부피를 맞춘 다음 94℃ 5 min, 94℃ 30 sec, 57℃ 30 sec, 72℃ 30 sec, 72℃ 5 min, 30 사이클 조건으로 PCR 증폭하였다. 증폭된 유전자는 젤 용출 키트(QIAGEN)을 이용하여 아가로오스 젤에서 추출하였다. 추출된 가변영역과 불변영역 유전자 20 ng을 사용하여 SfiI 위치가 포함된 프라이머를 이용해 PCR 방법으로 연결하였다. PCR 반응 조건은 가변영역과 불변영역을 증폭할 때와 동일하게 진행하였다. 연결된 유전자는 SfiI(NEB)으로 절단한 다음 아가로오스 젤 용출 후 , pComb3XSS 벡터(Barbas laboratory, The Scripps Research Institute) 내의 SfiI 위치에 리가아제(NEB)를 이용하여 클로닝 하였다.
실시예 2: CDR 서열 다양성 생성을 위한 PCR 프라이머 제작
골격항체의 CDR 서열에 다양성을 생성하기 위한 프라이머는 TriLink BioTechnology사에 의뢰하여 합성제작 하였다. 프라이머의 종류는 스캐폴드 항체 DP47의 CDR1와 CDR2 영역에 각각 1종류 그리고, CDR3에 12종류를 제작하였고, DPK22와 DPL3는 CDR3 영역에만 각각 5종류를 제작하였다. CDR1과 2 영역을 위한 프라이머는 아미노산 다양성을 Tyr, Ser 및 Gly 3종류의 아미노산이 각각 40%, 30% 및 30%가 되도록 디자인 하였으며, 길이의 변화는 주지 않았다. CDR3 영역 프라이머는 Tyr, Ser 및 Gly이 각각 30%, 20% 및 20% 그리고 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg이 각각 6%씩 되도록 디자인하였다. 길이의 변화는 중쇄사슬 CDR3의 경우 5-16개, 경쇄사슬의 경우 카파는 5-9개, 람다는 2-6개의 길이 다양성이 생성되도록 디자인하였다(표 2).
영역 아미노산
조성비		 서열(5' to 3')
HCDR1 A TCT GGA TTC ACC TTT AGC XXX TAT XXX ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA
HCDR2 A GGG CTG GAG TGG GTC TCA XXX ATC XXX XXX XXX XXX XXX XXX ACG TATT ACG CTG ATT CTG TAA AA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
HCDR3 B GTG TAT TAC TGT GCG CGT XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX TTC GAC TAC TGG GGC CAG GGT ACA
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상기 표 2에서, 아미노산 조성비 A는 40% Tyr, 30% Ser 및 30% Gly이고, 아미노산 조성비 B는 30% Tyr, 20% Ser, 20% Gly, 그리고 Asp, Asn, Ala, Phe 및 Arg 각각 6%이다. 서열에서, “X"로 표시된 부분은 상기 아미노산 조성비를 얻기 위하여 다양한 뉴클레오타이드가 위치할 수 있다.
다양성을 부여하는 방법으로 아미노산에 해당하는 트리뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드 합성의 최소 단위로 사용하는 트리뉴클레오타이드 변이유발 기술(TRIM: Pack, P et al., Immunotechnology, 2(1):70(1996))을 적용하였다. 일반적인 축퇴성 코돈 프라이머(degenerated codon primer)를 사용하는 방법은 유전적 리던던시와 원하지 않는 정지코돈이 생성되는 문제가 있다.
CDR 서열 다양성을 위해 제작된 프라이머는 PCR 어닐링 과정에서 주형에 결합하는 염기서열의 길이는 동일하지만, 어닐링하지 않는 나머지 부분은 길이의 차이가 있기 때문에, 프라이머 사이에 PCR 효율에 차이가 있는지 확인하였다. 동일량의 주형과 프라이머를 사용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 진행하였다. 주형DNA 20 ng, 프라이머 각각 40 pmole, dNTP 200 nM, MgSO4 20 mM,10 X 완충액 5 μL 및 Pfu 중합효소 2.5 unit(Thermo scientific)을 혼합한 다음 총 부피 50 μL가 되도록 증류수를 첨가하였다. PCR반응 조건은 94℃ 5분 1 사이클과 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초 20 사이클, 그리고 72℃ 5분 1 사이클로 진행하였다. 생성된 PCR 산물의 양을 확인한 결과, 길이의 다양성을 주지 않은 DPK22와 DPL3의 CDR3 다양성 프라이머들 간의 PCR 효율은 동일한 것으로 확인되었고, 길이의 다양성을 준 DP47 CDR3 다양성 프라이머 간에는 PCR 효율이 프라이머의 길이가 길어질수록 떨어지는 차이를 보였다. PCR 효율 결과를 바탕으로 경쇄사슬인 DPK22와 DPL3의 CDR3의 경우 프라이머간 PCR 효율의 차이가 크지 않아 혼합물 형태로 다양성 PCR을 진행하였으며, 중쇄사슬인 DP47의 CDR3의 경우 프라이머 간 PCR 효율 차이가 어느 정도 있어서 프라이머를 개별로 사용하는 방법으로 라이브러리를 제작하였다.
실시예 3: 라이게이션 및 형질전환 효율
다양성이 높은 라이브러리 제작을 위해서는 고효율의 라이게이션 및 형질전환 조건으로 진행되어야 하기 때문에, 라이게이션 및 형질전환의 효율을 확인하였다.
라이게이션 효율은 라이브러리 제작에 사용할 pComb3XSS 벡터를 이용하여 분석하였으며, 일반적으로 이용되는 CaCl2 열충격 형질전환 방법으로 진행하였다. pComb3XSS 1 μg을 SfiI 제한효소(NEB)로 50℃에서 1시간 동안 절단한 다음, 아가로오스 젤에 전기영동하여 벡터와 stuffer DNA를 분리한 한 후, 젤 용출 키트(QIAGEN, cat. # 28706)로 분리된 두 종류의 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA를 1 kb 래더 DNA 마커를 기준으로 아가로오스 젤 상에서 정량한 다음, 벡터 40 ng, stuffer 40 ng를 총 부피 10 μL로 T4 리가아제(NEB) 10 unit을 처리하여 4℃ 하룻밤 인큐베이션 조건으로 라이게이션을 진행하였다. 라이게이션한 DNA를 CaCl2방법으로 ER2537 역량(competent) 세포에 형질전환 한 다음 암피실린(100 μg/ml) 플레이트로 선별한 결과, 3000개 이상의 형질전환체가 생성되었다. 자기-라이게이션 비율은 전체 형질전환체 수의 5% 미만으로 유지되었다(도 2). 라이게이션에 사용한 벡터의 양을 40 ng으로 계산하면 라이게이션 효율은 1.2E+05 콜로니/μg로 확인되었다. 일반적으로 전기천공 방법이 CaCl2방법에 비해 형질전환 효율이 1.0E+03배 정도 좋기 때문에 전기천공 효율로 환산하면 현재의 라이게이션 방법은 1.0E+07 콜로니/μg 이상 얻을 수 있는 조건이다. 동일한 조건으로 진행된 반복 라이게이션 테스트 결과에서 지속적으로 3000 콜로니 이상의 형질전환체가 얻어져, 현재의 라이게이션 조건이 이후 라이브러리 제작에 적합하다고 판단하였다.
전기천공 방법은 Phage Display A Laboratory Manual(Barbas et al ., 2004)의 프로토콜을 참고하여 아래와 같이 진행하였으며, pUC19(Invitrogen)와 라이게이션된 pComb3XSS DNA를 사용하여 형질전환 효율의 적합성을 판단하였다. E. coli strain ER2537(NEB)을 SB 배지(MOPS 10 g, 효모 추출물 20 g, 트립톤 30 g/1 L) 10 mL에 접종한 다음, 37℃에서 200 rpm으로 하룻밤 쉐이킹 인큐베이션 하였다. 배양된 ER2537을 글루코오스와 MgCl2가 각각 5 mM과 1 mM 농도로 포함된 400 mL의 SB 배지에 1/100 비율로 희석하여 접종한 후, 37℃에서 200 rpm으로 쉐이킹 인큐베이션 하였다. OD600이 0.8에 도달한 ER2537 배양 플라스크를 얼음에서 15분 동안 인큐베이션 하여 세포를 차갑게 유지한 다음 4℃에서 4000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 배지에 존재하는 염은 전기천공 과정에서 방전을 일으켜 형질전환 효율을 떨어뜨리므로 염 성분을 제거하기 위하여 배지를 제거한 다음 차갑게 유지된 10% 글라이세롤 용액 400 mL로 세포 펠릿을 재현탁하는 방법으로 세포를 세척하였다. 이 세척 과정을 3회 반복한 후, 마지막으로 세포 펠릿을 새로운 10% 글라이세롤 용액 2 mL로 재현탁하여 전기천공을 위한 역량 세포를 준비하였다. 준비된 ER2537 전기천공-역량 세포 50 μL를 pUC19 10 pg와 섞어준 다음 0.2 mm 큐벳(BIO-RAD)에 옮긴 후, 전기천공기 (BIO-RAD)를 이용하여 2.5 kV, 25 μF, 그리고 200 Ω 조건으로 형질전환을 진행하였다. 형질전환된 ER2537을 SOC 배지 10 mL로 옮긴 후, 37℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 쉐이킹 인큐베이션하여 세포 회수를 진행하였다. 회수된 ER2537을 카베니실린(100 μg/mL) 플레이트에 스프레딩 하여 형질전환체 수를 타이트레이션 하였다. pUC19 DNA를 전기천공 하였을 때, 형질전환체 수는 μg당 4.0E+10으로 Phage Display Manual에서 추천하는 수준 이상의 전기천공 효율을 나타내었다. Manual 추천 조건은 supercoiled 대조군 플라스미드를 사용하였을 때 형질전환체 수는 3.0E+09이다. pComb3XSS를 1.2 μg을 사용한 라이게이션된 DNA로 전기천공 효율을 확인한 조건실험 결과 전기천공 반응 당 5.0E+09의 형질전환체 수를 지속적으로 얻을 수 있었다. 따라서, 본 실시예에서 실시하고 있는 전기천공 조건은 이후 라이브러리 제작에 적합하다고 판단하였다.
실시예 4: 주형 항체 라이브러리의 제작 및 서열분석
Fab 라이브러리 제작을 위해 CDR 영역에 다양성을 생성한 중쇄사슬과 경쇄사슬을 각각 pComb3XSS에 클로닝 하여 주형 라이브러리를 먼저 제작한 다음, 이 주형 DNA를 PCR로 증폭하여 중쇄사슬과 경쇄사슬을 얻은 후, 이를 링커 DNA로 연결하는 오버랩핑 PCR 방법으로 진행하였다. 주형 DNA는 DP47+CH1, DPK22+CK, DPL3+CK, 그리고 DPL3+CL 형태로 4종류를 제작하였으며, 라이브러리는 각각 Rz-DP47, Rz-DPK22, Rz-DPL3(κ), 그리고 Rz-DPL3(λ)로 명명하였다. 각 주형 라이브러리 에서 30 클론씩 시퀀싱 의뢰하여 항체 서열을 분석한 결과 아래와 같이 경쇄사슬 주형인 Rz-DPL3와 Rz-DPK22의 경우 디자인된 다양성인 3.0E+05과 1.5E+08 이상의 다양성을 나타냄을 확인하였다. 6.3E+18으로 다양성이 가장 많은 Rz-DP47은 4회 라이게이션 및 전기천공을 수행하여 최종 2.3E+10의 다양성을 확인하였다.
자체적으로 분석한 인간 항체서열 데이터를 토대로 아미노산의 종류와 각각의 비율을 고려하여 CDR3 서열에 다양성이 나타나도록 하였다. 제작한 Rz-DPL3(κ)와 Rz-DPL3(λ) 라이브러리의 클론을 각각 96개 그리고 95개 시퀀싱하여 CDR3 서열의 다양성이 의도한 대로 나타나는지 분석하였다. 분석결과 3번째 종류의 아미노산의 비율이 의도한 20%에 아래로 나타났으며, 원하지 않았던 종류의 아미노산 이 관찰되었지만, 전체적인 아미노산의 분포를 보면 의도한 비율대로 라이브러리 내에 존재하는 것을 확인하였다(도 3a 및 3b).
중쇄사슬의 CDR3는 길이를 아미노산 5개부터 16개까지 다양성을 부과하였으며, 2종류의 경쇄사슬 중 kappa 사슬은 5개에서 9개, lambda 사슬은 2개에서 6개까지 나타나도록 프라이머를 디자인 하였다(표 2). 길이의 다양성을 부과한 프라이머 5종을 이용하여 라이브러리를 제작하였을 때, 실제로 의도한 비율에 맞게 각 길이의 CDR3 영역을 가지고 있는 항체가 라이브러리에 존재하는지를 시퀀싱으로 확인하였다. 제작된 주형 라이브러리 중 Rz-DPL3(κ)와 Rz-DPL3(λ) 클론 각각 96개와 95개에 대하여 시퀀싱으로 CDR3 서열을 분석하였다. CDR3 길이의 다양성에 의도한 비율은 길이가 2-6 아미노산 순서대로 2%, 6%, 8%, 56% 및 28%이었고, 실제로 제작된 라이브러리 내의 비율도 의도한 것과 일치함을 확인하였다(도 3c). Rz-DPK47의 경우는 디자인 했던 것과는 차이를 보였다.
실시예 5: Fab 라이브러리의 제작, 항체서열분석 그리고 항체발현
Fab 형태의 라이브러리는 앞서 제작한 주형 라이브러리를 사용하여 링커 DNA를 이용한 오버랩핑 PCR 방법으로 경쇄사슬과 중쇄사슬을 연결한 다음, 생성된 Fab PCR 산물을 SfiI 제한효소로 pComb3XSS에 라이게이션 하는 방법으로 진행하였다. 3종류의 Fab 라이브러리는 라이게이션과 전기천공 반응을 각각 4 배치씩 진행하여 형질전환체를 1.0E+10 이상을 확보하였다.
Rz-DP47과 Rz-DPK22를 주형으로 사용하여 제작한 Fab 라이브러리는 Rz-Fab(k)로 명명하였으며, Rz-DP47과 Rz-DPL3(k)를 주형으로 사용한 Fab 라이브러리는 Rz-Fab(λ)-κ 로 Rz-DP47과 Rz-DPL3(λ)를 주형으로 사용한 Fab 라이브러리는 Rz-Fab(λ)- λ로 각각 명명하였다.
제작된 Fab 라이브러리의 CDR3의 아미노산 조성비가 디자인 하였던대로 구축되었는지 확인하기 위하여, 각 라이브러리 제작을 위한 전기천공 후 얻은 콜로니들을 시퀸싱 분석하였다. Rz-Fab(κ)는 117개, Rz-Fab(λ)-κ는 103개의 콜로니에 대하여 중쇄사슬과 경쇄사슬의 서열을 분석하였다. 중쇄사슬 CDR3의 아미노산의 길이 다양성이 5개에서 15개로 나타나도록 디자인 하였기 때문에 서열분석을 위해 선택된 모든 콜로니들은 위치 1에서 5까지는 동일하게 변이다양성을 보인다. 위치 1에서 5까지의 아미노산 조성비를 분석한 결과, 디자인한 조성비와 실제 분석된 조성비가 실질적으로 동일하게 라이브러리가 제작되었음을 확인하였다(도 4d-4g). 경쇄사슬은 Rz-Fab(κ)의 경우 CDR3의 아미노산이 길이 다양성이 5개에서 9개까지 나타나도록 디자인 되었으므로 모든 콜로니들이 가지고 있는 위치 1에서 5까지 아미노산 조성비를 분석하였고, Rz-Fab(λ)-κ의 경우 CDR3의 아미노산의 길이 다양성이 2개에서 6개이므로 위치 1과 2까지 아미노산 조성비를 분석한 결과, 중쇄사슬과 마찬가지로 디자인된 조성비와 실질적으로 동일하게 나타났다(도 3d-3g).
Rz-Fab(κ) 96개 클론에 대하여 IPTG 유도와 TES 완충액을 사용한 페리플라즘 단백질 추출방법으로 Fab 단백질을 발현하고 추출한 다음, Fab 항체의 발현을 anti-HA HRP 항체(Roche)를 이용한 dot-blot으로 확인하였다. 그 결과, 발현이 확인된 클론 수는 총 96개 중 50개로 Rz-Fab(k) 라이브러리의 발현율은 50% 정도도 확인되었다. 발현정도는 정량된 Fab 단백질을 대조군으로 대비하여 확인한 결과, Fab 항체의 발현량은 L 당 5-20 mg으로 분석되었다(도 4).
실시예 6: 항원에 대한 항체 라이브러리 스크리닝
제작된 항체라이브러리를 이용하여 EGFR, HER2, HER3, CD80, CD86, CD152, IL-1A, IL-1B, TNF-a, PDL-1, EPO, VEGFR2 및 BCMA 총 13종의 항원에 대하여 항체선별과정인 패닝을 진행하였다. 1차 라운드 패닝에는 10 μg의 항원을 사용하였으며, 1차 이후 라운드에서는 항체선별 효율을 높이기 위해 항원양을 줄여가며 진행하였다. 클론 선별은 항원에 대한 ELISA를 진행하여 대조군 시그널 클론을 기준으로 하였으며, 최종 선별된 클론은 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 총 13종 항원에 대하여 패닝을 진행한 결과, 양성 클론을 선별한 경우가 7종류로 선별 50% 정도로 확인되었다. 하기 표 3은 선별된 양성 클론 중에서, 일부에 대한 아미노산 서열이다.
항원 중쇄 경쇄
CDRH1 CDRH2 CDRH3 DPK22 _ L3 DPL3 _ L3
IL-1a FTFSSYYMSW WVSSISYSYSTYY YSPYSFDY 　- DYYCAAGYPGSYVF
FTFSSYYMSW WVSSISYSYSTYY YSPYSFDY VYYCQQYGYGSSTFG　 -
IL-1b FTFSYYYMSW WVSSIGYYGTYY YRRYGYFDY 　- DYYCAASDYYARYVF
CD86 FTFSSYGMSW WVSGIGSSYYSTYY YRGYRSGSPRYFDY - DYYCAASYRSNYVF
FTFSSYGMSW WVSSISSSSYTYY YYGGGFDY - DYYCAARYPGYNYVF
FTFSSYYMSW WVSYISYYGSTYY YSYSYSFDY - DYYCAAGSNRYYVF
PDL-1 FTFSSYYMSW WVSSISYYYGYTYY YYYYGGFDY VYYCQQGNYYYSTFG -
EGFR-D4 FTFSGYSMSW WVSHISGGYYYTYY YSDYYYSFDY 　- DYYCAAHYYGYVF
FTFSGYYMSW WVSHISGGYYYTYY YSDYYYSFDY 　- DYYCAAHYYGYVF
FTFSGYSMSW WVSYIGSYSSYTYY YDSAYFDY 　- DYYCAANYYGYVF
HER3 FTFSYYSMSW WVSYISYYGGYTYY YAYGAYDRYYSGAFDY VYYCQQYAYYNHSTFG -
FTFSSYYMSW WVSSIYYYYYGTYY GSNYRYNAYYGPYFDY - DYYCAAPYSSGYVF
상기 표 3에서, 볼드체로 표시한 아미노산은 다양성을 부여한 아미노산 잔기이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> ABCLON INC. <120> Antibody Libraries and Methods for Preparaton of Them <130> PN140629 <160> 98 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> human <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattattcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttatg ataatggtaa taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat actattgcgc caaagatggt 300 ctgtattttc cttaagattg gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> human <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Leu Tyr Phe Pro Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPK22 <400> 3 gaaattgtcc tgacgcagtc gccgggtacg ctgtcgctgt ctccgggtga acgtgctacg 60 ctgagttgtc gtgcctccca gtcggtcagc tctagttatc tggcatggta ccagcaaaaa 120 ccgggtcagg ctccgcgtct gctgatttat ggtgcatcct cacgtgcaac cggtatcccg 180 gatcgctttt cgggcagcgg ttctggcacg gacttcaccc tgacgatttc ccgcctggaa 240 ccggaagatt ttgccgtgta ttactgtcaa cagtatggct cgtccccgta aaccttcggt 300 cagggcacca aagtggaaat caaa 324 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DPK22 <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPL3 <400> 5 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc tctaattatg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agaaataacc agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggccgacta ctattgtgct gcttgggatt cttaactgaa tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtc 327 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DPL3 <400> 6 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 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Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser 100 105 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK <400> 9 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CK <400> 10 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 11 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL <400> 11 ggtcagccga aagccgcccc gagtgttacc ctgttcccgc cgtcgtctga agaactgcaa 60 gcaaataaag ccaccctggt ctgcctgatt agtgattttt atccgggcgc ggtgacggtt 120 gcatggaaag ctgacagctc tccggtcaaa gcaggtgttg aaaccacgac cccgagcaaa 180 cagtctaaca ataaatatgc ggccagttcc tacctgtccc tgaccccgga acaatggaaa 240 agccatcgtt catactcgtg tcaggtcacg cacgaaggta gcacggttga aaaaacggtt 300 gccccgacgg aatgtagc 318 <210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL <400> 12 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tttggcccag gcggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg 40 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcccttggtg gaggctgagc tcacggtgac 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 <400> 15 gtcaccgtga gctcagcctc caccaagggc 30 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4 <400> 16 tttggccggc ctggccacta gttttgtcac aagatttggg 40 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 <400> 17 tttggcccag gcggccgagc tcgaaattgt cctgacgcag tcgccg 46 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 <400> 18 gtgcagccac agttcgtttg atttccactt tg 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7 <400> 19 caaagtggaa atcaaacgaa ctgtggctgc ac 32 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8 <400> 20 tttggccggc ctggccacac tctcccctgt tgaagctc 38 <210> 21 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9 <400> 21 tttggcccag gcggccgagc tccagtctgt gctgactcag ccaccc 46 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10 <400> 22 gtgcagccac agttcgtagg accgtcagct tg 32 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11 <400> 23 caagctgacg gtcctacgaa ctgtggctgc ac 32 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12 <400> 24 ggcggctttc ggctgtagga ccgtcagctt g 31 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13 <400> 25 caagctgacg gtcctacagc cgaaagccgc c 31 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14 <400> 26 tttggccggc ctggccgcta cattccgtcg gggcaaccg 39 <210> 27 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> n is nucleotide encoding 40% of Tyr, 30% of Ser and 30% Gly <220> <221> misc_feature <222> (25)..(27) <223> n is nucleotide encoding 40% of Tyr, 30% of Ser and 30% Gly <400> 27 tctggattca cctttagcnn ntatnnnatg agctgggtcc gccaggctcc a 51 <210> 28 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(21) <223> n is nucleotide encoding 40% of Tyr, 30% of Ser and 30% Gly <220> <221> misc_feature <222> (25)..(42) <223> n is nucleotide encoding 40% of Tyr, 30% of Ser and 30% Gly <400> 28 gggctggagt gggtctcann natcnnnnnn nnnnnnnnnn nnacgtatta cgctgattct 60 gtaaaa 66 <210> 29 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(33) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 29 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnttcgact actggggcca gggtaca 57 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(36) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 30 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnttcg actactgggg ccagggtaca 60 60 <210> 31 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(25) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 31 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tcgactactg gggccagggt 60 aca 63 <210> 32 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(26) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 32 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnttcgacta ctggggccag 60 ggtaca 66 <210> 33 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(27) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 33 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnttcga ctactggggc 60 cagggtaca 69 <210> 34 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(28) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 34 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt cgactactgg 60 ggccagggta ca 72 <210> 35 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(29) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 35 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttcgactac 60 tggggccagg gtaca 75 <210> 36 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(30) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 36 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttcgac 60 tactggggcc agggtaca 78 <210> 37 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(31) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 37 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnttc 60 gactactggg gccagggtac a 81 <210> 38 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(32) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 38 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt 60 cgactactgg ggccagggta ca 82 <210> 39 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(33) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 39 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt 60 tcgactactg gggccagggt aca 83 <210> 40 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(34) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 40 gtgtattact gtgcgcgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 ttcgactact ggggccaggg taca 84 <210> 41 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(23) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 41 gtgtattact gtcaacagnn nnnnnnnnnn nnnaccttcg gtcagggcac caaagtg 57 <210> 42 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(23) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 42 gtgtattact gtcaacagnn nnnnnnnnnn nnnnnnacct tcggtcaggg caccaaagtg 60 60 <210> 43 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(25) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 43 gtgtattact gtcaacagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna ccttcggtca gggcaccaaa 60 gtg 63 <210> 44 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(26) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 44 gtgtattact gtcaacagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnaccttcgg tcagggcacc 60 aaagtg 66 <210> 45 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(27) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 45 gtgtattact gtcaacagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnacctt cggtcagggc 60 accaaagtg 69 <210> 46 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 46 gattattact gtgctgctnn nnnntatgtc ttcggcggag gcaccaag 48 <210> 47 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 47 gattattact gtgctgctnn nnnnnnntat gtcttcggcg gaggcaccaa g 51 <210> 48 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(22) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 48 gattattact gtgctgctnn nnnnnnnnnn tatgtcttcg gcggaggcac caag 54 <210> 49 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(23) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 49 gattattact gtgctgctnn nnnnnnnnnn nnntatgtct tcggcggagg caccaag 57 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(24) <223> n is nucleotide encoding 30% of Tyr, 20% of Ser, 20% Gly, 6% of Asp, 6% of Asn, 6% of Ala, 6% of Pro and 6% of Arg <400> 50 gattattact gtgctgctnn nnnnnnnnnn nnnnnntatg tcttcggcgg aggcaccaag 60 60 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-IL-1a antibody <400> 51 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-IL-1a antibody <400> 52 Trp Val Ser Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-IL-1a antibody <400> 53 Tyr Ser Pro Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-IL-1a antibody <400> 54 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Tyr Pro Gly Ser Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-IL-1a antibody <400> 55 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-IL-1a antibody <400> 56 Trp Val Ser Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-IL-1a antibody <400> 57 Tyr Ser Pro Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 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Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-CD86 antibody <400> 64 Trp Val Ser Gly Ile Gly Ser Ser Tyr Tyr Ser Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-CD86 antibody <400> 65 Tyr Arg Gly Tyr Arg Ser Gly Ser Pro Arg Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-CD86 antibody <400> 66 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Tyr Arg Ser Asn Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-CD86 antibody <400> 67 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-CD86 antibody <400> 68 Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-CD86 antibody <400> 69 Tyr Tyr Gly Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-CD86 antibody <400> 70 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Tyr Pro Gly Tyr Asn Tyr Val Phe 1 5 10 15 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-CD86 antibody <400> 71 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-CD86 antibody <400> 72 Trp Val Ser Tyr Ile Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-CD86 antibody <400> 73 Tyr Ser Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-CD86 antibody <400> 74 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser Asn Arg Tyr Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-PDL-1 antibody <400> 75 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp 1 5 10 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XXX <400> 76 Trp Val Ser Ser Ile Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XXX <400> 77 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-PDL-1 antibody <400> 78 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Tyr Tyr Tyr Ser Thr Phe Gly 1 5 10 15 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 79 Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ser Met Ser Trp 1 5 10 <210> 80 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 80 Trp Val Ser His Ile Ser Gly Gly Tyr Tyr Tyr Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 81 Tyr Ser Asp Tyr Tyr Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 82 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala His Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 83 Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Tyr Met Ser Trp 1 5 10 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 84 Trp Val Ser His Ile Ser Gly Gly Tyr Tyr Tyr Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 85 Tyr Ser Asp Tyr Tyr Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 86 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala His Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 87 Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ser Met Ser Trp 1 5 10 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 88 Trp Val Ser Tyr Ile Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 89 Tyr Asp Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 90 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-EGFR-D4 antibody <400> 90 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Asn Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-HER3 antibody <400> 91 Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Ser Met Ser Trp 1 5 10 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-HER3 antibody <400> 92 Trp Val Ser Tyr Ile Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-HER3 antibody <400> 93 Tyr Ala Tyr Gly Ala Tyr Asp Arg Tyr Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-HER3 antibody <400> 94 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Tyr Tyr Asn His Ser Thr Phe Gly 1 5 10 15 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti-HER3 antibody <400> 95 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp 1 5 10 <210> 96 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti-HER3 antibody <400> 96 Trp Val Ser Ser Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 97 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti-HER3 antibody <400> 97 Gly Ser Asn Tyr Arg Tyr Asn Ala Tyr Tyr Gly Pro Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 98 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti-HER3 antibody <400> 98 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala 65

Claims (14)

  1. 다음 단계를 포함하는 항체 라이브러리의 제작방법:
    (a) 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 준비하는 단계;
    (b) 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 어닐링하는 프라이머를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭하여 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 수득하는 단계; 상기 프라이머는 DI-프라이머(Diversity imparting-primer)이고; 상기 DI-프라이머는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩되는 항체 가변영역의 CDR(complementarity determining region)의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성(diversity)이 도입되도록 하는 프라이머의 조합이고; 상기 DI-프라이머는 상기 아미노산 잔기 다양성이 발생되는 위치에 오는 복수의 아미노산을 코딩하는 복수의 코돈에 대응하는 서열을 포함하고; 및
    (c) 상기 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 CDR의 특정 위치에서의 아미노산 잔기의 다양성의 도입은 상기 특정 위치에서 2-10 종류의 소정(predetermined)의 아미노산 잔기가 소정의 조성비(composition ratio)로 위치할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 CDR의 특정 위치는 중쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 1: CDRH1), CDRH2, CDRH3, 경쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 1: CDRL1), CDRL2 및 CDRL3로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR의 특정 위치이고; 상기 CDR의 특정 위치는 1-20 위치이며; 상기 다양성 도입에 이용되는 소정의 아미노산 잔기는 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg으로 구성된 군으로부터 선택되는 3-8 종류의 아미노산 잔기이며; 상기 다양성 도입에 이용되는 소정의 아미노산 잔기가 3 종류 이상인 경우에는 Tyr, Ser 및 Gly이 필수적으로 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 중쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 1: CDRH1)을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRH1의 다양성이 부여되는 것을 특징으로 하는 방법:
    일반식 1
    Phe-Tyr-Phe-Ser-X1-Tyr-X2-Met-Ser-Trp
    상기 일반식에서, X1 및 X2는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하고; X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 중쇄 가변영역의 CDR2(complementarity determining region 2: CDRH2)을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRH2의 다양성이 부여되는 것을 특징으로 하는 방법:
    일반식 2
    Trp-Val-Ser-X1-Ile-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Thr-Tyr-Tyr
    상기 일반식에서, X1 내지 X7는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하고; X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X3는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X4는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X4 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X5는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X5 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X6는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X6 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재하며; X7는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, 상기 DI-프라이머에서 X7 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser 및 Gly의 코돈이 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하고, 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 중쇄 가변영역의 CDR3(complementarity determining region 3: CDRH3)을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRH3의 다양성이 부여되는 것을 특징으로 하는 방법:
    일반식 3
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-Phe-Asp-Tyr
    상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X4 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X5 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X6가 1-15개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X6 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; 상기 X6가 보이드(void)인 경우, X5는 Phe에 직접 연결된다.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 경쇄 가변영역의 CDR3(complementarity determining region 3: CDRL3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRL3의 다양성이 부여되는 것을 특징으로 하는 방법:
    일반식 4
    Val-Tyr-Tyr-Cys-Gln-Gln-X1-X2-X3-X4-X5-X6-Thr-Phe-Gly
    상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X4 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X5 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void) 고; X6가 1-10개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X6 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; 상기 X6가 보이드(void) 경우, X5는 Thr에 직접 연결된다.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 경쇄 가변영역의 CDR3(complementarity determining region 3: CDRL3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하고, 상기 DI-프라이머는 하기 일반식 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 코돈에 해당하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머에 의해 상기 항체 라이브러리에서 CDRL3의 다양성이 부여되는 것을 특징으로 하는 방법:
    일반식 5
    Asp-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Ala-X1-X2-X3-Tyr-Val-Phe
    상기 일반식에서, X1 내지 X3는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X1 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X2 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; X3은 1-10개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void) 고; X3가 1-10개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 DI-프라이머에서 X3 위치에 대응되는 부위는 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg의 코돈이 각각 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며, 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재하며; 상기 X3가 보이드(void) 경우, X2는 Tyr에 직접 연결된다.
  9. 다음 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDRH1의 라이브러리:
    일반식 1
    Phe-Tyr-Phe-Ser-X1-Tyr-X2-Met-Ser-Trp
    상기 일반식에서, X1 및 X2는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며; X1 및 X2 각각에서 상기 Tyr, Ser 및 Gly는 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
  10. 다음 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDRH2의 라이브러리:
    일반식 2
    Trp-Val-Ser-X1-Ile-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Thr-Tyr-Tyr
    상기 일반식에서, X1 내지 X7는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser 또는 Gly이고, X2는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X3는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X4는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X5는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X6는 Tyr, Ser 또는 Gly이며, X7는 Tyr, Ser 또는 Gly이며; X1 내지 X7 각각에서 상기 Tyr, Ser 및 Gly는 각각 30-50%, 20-40% 및 20-40%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 Ser 및 Gly보다 높은 조성비로 존재한다.
  11. 다음 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDRH3의 라이브러리:
    일반식 3
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-Phe-Asp-Tyr
    상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X6가 1-15개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 X6가 보이드(void)인 경우, X5는 Phe에 직접 연결되며; X1 내지 X6 각각에서 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg은 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재한다.
  12. 다음 일반식 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리:
    일반식 4
    Val-Tyr-Tyr-Cys-Gln-Gln-X1-X2-X3-X4-X5-X6-Thr-Phe-Gly
    상기 일반식에서, X1 내지 X6는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X3은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X4은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X5은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X6은 1-15개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X6가 1-15개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, 상기 X6가 보이드(void)인 경우, X5는 Thr에 직접 연결되며; X1 내지 X6 각각에서 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg은 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재한다.
  13. 다음 일반식 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리:
    일반식 5
    Asp-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Ala-X1-X2-X3-Tyr-Val-Phe
    상기 일반식에서, X1 내지 X3는 다양성 아미노산 잔기이고; X1은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X2은 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고, X3은 1-10개의 다양성 아미노산 잔기이거나 또는 보이드(void)이고; X3가 1-10개의 다양성 아미노산 잔기인 경우, 상기 다양성 아미노산 잔기 각각 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 또는 Arg이고; X3가 보이드(void)인 경우, X2는 Tyr에 직접 연결되며; X1 내지 X3 각각에서 상기 Tyr, Ser, Gly, Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg은 20-40%, 10-30%, 10-30%, 3-12%, 3-12%, 3-12%, 3-12% 및 3-12%의 조성비로 존재하며; 상기 Tyr은 다른 아미노산보다 높은 조성비로 존재하고, 상기 Ser 및 Gly은 Asp, Asn, Ala, Pro 및 Arg보다 높은 조성비로 존재한다.
  14. (i) 상기 제 9 항의 중쇄 가변영역의 CDRH1의 라이브러리, (ii) 제 10 항의 중쇄 가변영역의 CDRH2의 라이브러리, (iii) 제 11 항의 중쇄 가변영역의 CDRH3의 라이브러리, 그리고 (iv) 제 12 항의 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리 또는 제 13 항의 경쇄 가변영역의 CDRL3의 라이브러리를 포함하는 항체 라이브러리.

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