JP2022507741A

JP2022507741A - アンタゴニストｃｄ４０モノクローナル抗体およびその使用

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Publication number: JP2022507741A
Application number: JP2021527208A
Authority: JP
Inventors: ヤムニウク，アーロン; ストラザーズ，メアリー; アール，ジュニアクリステック，スタンリー; ナイーム，アクバル; レイクストロー，ジンジャー
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: US11261258B2; TWI800694B; JP2023106402A; US20220144962A1; BR112021009140A2; US11773178B2; CN113164781B; AR117091A1; PE20211293A1; WO2020106620A1; US11795231B2; US20240124597A1; US20210054090A1; KR20210093968A; IL283104A; JP7271666B2; ZA202103353B; CA3120358C; US20220153856A1; CN116003608A

Abstract

本開示はヒト化抗体を含む、ＣＤ４０に結合する抗体を提供する。該抗体はＣＤ４０に結合するがＣＤ４０アゴニスト活性を示さない。該抗体は変更ＩｇＧ１Ｆｃドメインを含んでいてよく、および最小限の未成熟な樹状細胞の活性化を示す。抗体を含む組成物、ＣＤ４０活性に関連する疾患の処置のための使用の方法、およびＣＤ４０活性に関連する疾患の処置のための医薬品の調製における使用が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は２０１８年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６２／７６９，５１４号の利益を主張するものであり、仮出願はあらゆる目的のためにその全体が本明細書中に組み込まれている。

配列表
本願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年１１月１３日に作成された該ＡＳＣＩＩの複製は、２００８９６－００１５－００－ＷＯ－５９２４１７＿ＳＬ．ｔｘｔというファイル名で、サイズは１７０，１１１バイトである。

本開示はＣＤ４０に結合する抗体を提供する。該抗体ポリペプチドはＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０アゴニスト活性を示さない。該抗体は修飾ＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、および最小限の未成熟な樹状細胞の活性化を示し得る。抗体を含む組成物、ＣＤ４０活性に関与する疾患の処置のための使用の方法、ＣＤ４０活性に関連する疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。

ＣＤ４０は樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する副刺激分子である。ＡＰＣはＣＤ４０がそのリガンド、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）にＴ_Ｈ細胞上で結合した際に活性化される。ＣＤ４０を介したＡＰＣの活性化はサイトカイン産生、副刺激分子（例えば、ＣＤ８６）の増加、および抗原提示の増強およびＢ細胞の増殖を含む様々な免疫反応に関与する。ＣＤ４０はまた、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および上皮細胞においても発現し得る。

ＣＤ４０の活性化はまた、例えば自己免疫、移植拒絶反応またはアレルギー反応に関連する様々な望ましくないＴ細胞反応に関与する。望ましくないＴ細胞反応を制御する１つの戦略はＣＤ４０をアンタゴニスト抗体の標的とすることである。例えば、以前はＣｈｉｒｏｎ１２１２として知られていたモノクローナル抗体ＨＣＤ１２２（ルカツムマブ）は現在、特定のＣＤ４０介在性炎症性疾患の処置のための臨床試験段階にある。インターネット上のハイパーテキスト転送プロトコル:clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209（最終更新日２０１１年１月１１日）の“Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40⁺ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma”, Clinical Trials Feeds)を参照。しかし、モノクローナル抗体はアゴニスト活性を示し得る。例えば、抗ＣＤ４０抗体であるＣｈｉ２２０の有用性はその弱い刺激性能によって制限されている。Adams, et al., “Development of a chimeric anti-CD40 monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival”J. Immunol. 174: 542-50 (2005)を参照。

最初の実施形態では、本発明はヒトＣＤ４０に特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合部位を提供し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域を含む第１ポリペプチド部位および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、
該重鎖可変領域は（ｉ）ＳＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号２）を含むＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３；ならびに（ｉｉ）ＳＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＱＩＮＰＳＱＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３の内一つを含む；および
該軽鎖可変領域はＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）を含むＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）を含むＣＤＲ２、ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）を含むＣＤＲ３を含む。

本発明はさらにヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部位を提供し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域を含む第１ポリペプチド部位および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、
該重鎖可変領域は（ｉ）ＳＹＷＭＨ（配列番号１）からなるＣＤＲ１、ＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号２）からなるＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）からなるＣＤＲ３；ならびに（ｉｉ）ＳＹＷＭＨ（配列番号１）からなるＣＤＲ１、ＱＩＮＰＳＱＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号１２）からなるＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）からなるＣＤＲ３の内一つを含む；および
該軽鎖可変領域はＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）からなるＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）からなるＣＤＲ２、ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）からなるＣＤＲ３を含む。

本発明はさらにヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部位を提供し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域を含む第１ポリペプチド部位および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、
該重鎖可変領域はＳＹＷＭＨ（配列番号１）からなるＣＤＲ１、ＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号２）からなるＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）からなるＣＤＲ３を含む；および
該軽鎖可変領域はＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）からなるＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）からなるＣＤＲ２、ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）からなるＣＤＲ３を含む。

本発明はさらにヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部位を提供し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域を含む第１ポリペプチド部位および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、
該重鎖可変領域はアミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４）を含む、
および該軽鎖可変領域はアミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０）を含む。

本発明はさらにヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部位を提供し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域を含む第１ポリペプチド部位および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、該重鎖可変領域はアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＳＱＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）を含む、
および該軽鎖可変領域はアミノ酸配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１６）を含む。

本発明はさらにヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部位を提供し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域を含む第１ポリペプチド部位および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、該重鎖可変領域はアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４）を含む、
および該軽鎖可変領域はアミノ酸配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１６）を含む。

特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部位はヒト重鎖定常領域を含む第１ポリペプチド部位；およびヒト軽鎖定常領域を含む第２ポリペプチド部位を含む。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位は（１）Ｆｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減するｋａｂａｔの２３８位の変異であって、ここでプロリン２３８（Ｐ２３８）がリジン、セリン、アラニン、アルギニン、トリプトファンからなる群より選択された一つの残基への変異であって、およびここで、抗体またはその抗原結合部位が低減されたＦｃγＲ結合を有する、変異；または（２）ｋａｂａｔの２９７位におけるアラニン置換、の何れかを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含み得る。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はＦｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減するｋａｂａｔの２３８位の変異であって、ここでプロリン２３８（Ｐ２３８）がリジン、セリン、アラニン、アルギニン、トリプトファンからなる群より選択された一つの残基への変異であって、およびここで、抗体またはその抗原結合部位が低減されたＦｃγＲ結合を有する変異を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含み得る。特定の実施形態では、Ｐ２３８はリジンに変異される。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位は以下より選択されたアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み得る。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２２；ＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋ（－Ｃ末端リジン））、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２３；ＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋ）、

ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２６；ＩｇＧ１ｆ－Ｐ２３８Ｋ（－Ｃ末端リジン））、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２７；ＩｇＧ１ｆ－Ｐ２３８Ｋ）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２８；ＣＨ１－ＩｇＧ１ｆ－Ｐ２３８Ｋ（－Ｃ末端リジン））、
または
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２９；ＣＨ１－ＩｇＧ１ｆ－Ｐ２３８Ｋ）。

特定の実施形態では、本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位は、
（１）Ｆｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減するｋａｂａｔの２３８位の変異であって、ここで、２３８位のプロリン（Ｐ２３８）のリジン、セリン、アラニン、アルギニン、トリプトファンからなる群より選択された一つの残基への変異であって、およびここで、抗体またはその抗原結合部位が低減されたＦｃγＲ結合を有する変異；または
（２）ｋａｂａｔの２９７位におけるアラニン置換、の何れかを含む、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含み、ＳＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号２）を含むＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；およびＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）を含むＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）を含むＣＤＲ２、ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む。

単離された抗体およびその抗原結合部位は配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含み得る。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位についてのいくつかの実施形態においては、第１ポリペプチド部位は以下からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むか、または、それからなる：

、および

；および
第２ポリペプチド部位は以下のアミノ酸配列を含むか、または、それからなる：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１１；ＬＣ＿Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－ＣＬ）。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位についてのいくつかの実施形態においては、第１ポリペプチド部位は以下のアミノ酸配列を含むか、または、それからなる:

および
第２ポリペプチド部位は以下のアミノ酸配列を含むか、または、それからなる:

特定の実施形態では、本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はｋａｂａｔの２９７位におけるアラニン置換を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はＣＤ４０の活性に拮抗し得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はキメラ抗体であり得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はヒト化抗体であり得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含み得る。

本明細書で開示される抗体およびその抗原結合部位は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重抗体、およびｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群より選択された抗原結合部位である。本明細書で開示される抗体およびその抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－Ｆｃである。

本明細書で開示される抗体およびその抗原結合部位は治療剤と連結し得る。

本明細書で開示される抗体およびその抗原結合部位は、該抗体および抗原結合部位とは異なる結合特異性を有する第2の機能部分と連結し得る。

本明細書で開示される抗体およびその抗原結合部位はさらに追加の部分を含み得る。

単離された抗体またはその抗原結合部位をコードする核酸分子は本明細書で開示される。該核酸分子を含む発現ベクターは本明細書で開示される。該発現ベクターによって形質転換した細胞についてもまた考慮する。抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部位を調製する方法であって、
ａ）本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部位をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された細胞において、抗体またはその抗原結合部位を発現すること；および
ｂ）細胞から抗体またはその抗原結合部位を単離すること、
を含む方法についてもまた開示する。

以下を含む医薬品組成物もまた提供される：ａ）本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部位；およびｂ）医薬的に許容できる担体。

本明細書で開示される抗体、またはその抗原結合部位の対象への投与を含む、対象における免疫反応を処置または予防する方法を提供する。さらに本明細書で開示される抗体、またはその抗原結合部位の対象への投与を含む、対象における自己免疫または炎症性疾患を処置または予防する方法を提供する。任意に、抗体、またはその抗原結合部位は、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と共に投与される。投与は同時または逐次的であってよい。例となる薬剤は、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ－Ｉｇ（ベラタセプト）などのＣＴＬＡ４変異分子である。対象における免疫反応を処置または予防するかかる方法において、およびこのような対象における自己免疫または炎症性疾患を処置または予防する方法において、好ましくは、対象は以下からなる群より選択された疾患を有する：アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、動脈硬化、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、目の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠状動脈性心臓病、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、遺伝子組み換え医薬品に対する免疫反応（例えば、血友病患者における第ＶＩＩ因子）、ループス腎炎、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スポンディ関節症、甲状腺炎、移植拒絶反応、血管炎、および潰瘍性大腸炎。

医薬品としての使用のための本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部位についても考慮する。さらに、それを必要とする対象における処置に使用するための本明細書で開示される抗体、もしくはその抗原結合部位、または抗体、もしくはその抗原結合部位を含む医薬品についても考慮する。さらに、免疫反応の処置または予防に使用するための、治療有効量の本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部位であって、それを必要とする患者への投与のための抗体またはその抗原結合部位についても考慮する。

図１は図１Ａ－１Ｄを含み、抗体のヒトＦｃγＲに対する結合のＳＰＲセンサーグラムデータを示す。図１Ａはコントロール抗体、コントロールＩｇＧ１のデータを示す。図１ＢはＹ１２ＸＸ－ｈｘ２８－ＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋ、コントロールＩｇＧ１のデータを示す。図１Ｃはコントロール抗体、抗体Ｂのデータを示す。図１Ｄは抗体／ＦｃγＲ相互作用のＫＤ値をまとめた表である。ＫＤ値は１：１ラングミュア適合（ｈＣＤ６４）または１：１定常状態適合（ｈＣＤ３２ａ－Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ－Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ－Ｖ１５８、およびｈＣＤ１６ａ－Ｆ１５８）のどちらかから得た。同上

図２は図２Ａ－２Ｃを含み、ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞を添加、または非添加の場合において、ｉＤＣをヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体またはコントロール抗体で処置した際のｉＤＣの活性化データを示す。細胞培養液由来のＩＬ－６（インターロイキン－６）の増加、および抗ＣＤ８６抗体および抗ＣＤ５４抗体を用いて染色した、フローサイトメトリー蛍光平均値で示される細胞表面マーカーの発現を評価した。図２ＡはＩＬ－６のデータを示す。図２ＢはＣＤ８６のデータを示す。図２ＣはＣＤ５４のデータを示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、図２Ｂおよび図２Ｃで両方のＹ軸に示す。各シンボルは個人ドナー由来のｉＤＣのデータを表す。Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４２－Ｐ２３８Ｋは４人のドナー由来の細胞において試験し、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０－Ｐ２３８Ｋは６人のドナー由来の細胞で試験し、およびＹ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋは１０人のドナー由来の細胞で試験した。抗体の濃度をμｇ／ｍｌで示した（１０、３０、または１００μｇ／ｍｌ）。本アッセイにおけるＣＨＯ－３２ａ細胞の含有はＦｃγＲを介してクロスリンクまたはクラスタリングを仲介することを示す。Ｌｙ６－ＩｇＧはネガティブコントロールとして用いた。パーシャルＣＤ４０アゴニスト２１４１およびＢＭＳ９８６０９０－１００はポジティブコントロールとして用いた。同上同上

図３は図３Ａおよび図３Ｂを含み、ヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体、ＣＤ４０抗体、およびコントロール抗体の補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）解析から得た例示的データを示す。ＣＤＣアッセイは２度行った。２回目のアッセイでは新鮮に解凍されたヒト補体血清を用いた。図３Ａはアッセイの第１反復のデータを示し、図３Ｂはアッセイの第２反復のデータを示す。

図４は図４Ａおよび図４Ｂを含み、２人の異なるドナー由来のＣＤ１４＋単球をエフェクター細胞として使用し、ヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体またはコントロール抗体の抗体依存細胞貪食（ＡＤＣＰ）解析から得た例示的データを示す。図４Ａはドナー＃８のＣＤ１４＋単球をエフェクター細胞として用いることで得たデータを示す。図４Ｂはドナー＃６５のＣＤ１４＋単球をエフェクター細胞として用いることで得たデータを示す。

図５は図５Ａおよび５Ｂを含み、２人の異なるドナー由来のＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用し、ヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体またはコントロール抗体の抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）解析から得た例示的データを示す。図５Ａはドナー＃３８のＮＫ細胞をエフェクター細胞として用いることで得たデータを示す。図５Ｂはドナー＃５５のＮＫ細胞をエフェクター細胞として用いることで得たデータを示す。

図６は図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄを含み、異なる抗ＣＤ４０抗体で刺激した際のＲａｍｏｓＢｌｕｅｓ細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１誘導性ＳＥＡＰ活性を評価するように設計されたアッセイから得たデータを示す。ＣＤ４０ｍＡｂｓの活性に関する３つの独立した研究からの代表的な結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。図６Ｃおよび６Ｄは、ポジティブコントロールであるＣＤ４０Ｌ－ＩＺのデータを示す。ＡＩＭＶ：ＡＩＭＶ^（商標）培地（１×）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。同上

本開示は抗ＣＤ４０抗体、および特にアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体に関する。ＣＤ４０などの治療標的においては、ＦｃγＲを介した抗ＣＤ４０抗体のクロスリンクは望まないアゴニスト性シグナル伝達および毒性の可能性をもたらす可能性を有する。本開示はまた、「低親和性」ＦｃγＲ：ｈＣＤ３２ａ／ＦｃγＲＩＩａ、ｈＣＤ３２ｂ／ＦｃγＲＩＩｂおよびｈＣＤ１６ａ／ＦｃγＲＩＩＩａと低減した会合を有し、および「高親和性」のＦｃγＲｈＣＤ６４とも低減した会合を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体について記載する。低親和性ＦｃγＲとの会合の低減は望ましくないアゴニスト性シグナル伝達および望ましくない毒性の可能性の見込みを低減することが期待される。

定義および略語
さらに略語と定義を以下に示す。

この詳細な記載に従って、以下の略語と定義が適用される。本明細書で使用される限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、たとえば、「抗体（ａｎａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は複数のそのような抗体が含まれ、および「その用量（ｔｈｅｄｏｓａｇｅ）」への言及は１以上の投与量および当業者に公知の均等物への言及を含む。

ここで使用する場合、「約」という用語は、当業者に理解される、および、使用される文脈によってある程度変化するものである。一般に、「約」は、本明細書で別段の指示がない限り、参照値のプラス／マイナス10％の値の範囲を包含する。

設定された範囲の間の何れかのおよびすべての全整数または部分整数が本明細書に含まれることが理解される。

ＣＤ４０はＢ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｂｐ５０、ＣＤ４０Ｌ受容体、ＣＤｗ４０、ＣＤＷ４０、ＭＧＣ９０１３、ｐ５０、ＴＮＦＲＳＦ５、および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５としても知られる、および言及されている。「ヒトＣＤ４０」とは以下のアミノ酸配列を含むＣＤ４０のことを指す：
ＭＶＲＬＰＬＱＣＶＬＷＧＣＬＬＴＡＶＨＰＥＰＰＴＡＣＲＥＫＱＹＬＩＮＳＱＣＣＳＬＣＱＰＧＱＫＬＶＳＤＣＴＥＦＴＥＴＥＣＬＰＣＧＥＳＥＦＬＤＴＷＮＲＥＴＨＣＨＱＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣＴＣＥＥＧＷＨＣＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰＧＦＧＶＫＱＩＡＴＧＶＳＤＴＩＣＥＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷＴＳＣＥＴＫＤＬＶＶＱＱＡＧＴＮＫＴＤＶＶＣＧＰＱＤＲＬＲＡＬＶＶＩＰＩＩＦＧＩＬＦＡＩＬＬＶＬＶＦＩＫＫＶＡＫＫＰＴＮＫＡＰＨＰＫＱＥＰＱＥＩＮＦＰＤＤＬＰＧＳＮＴＡＡＰＶＱＥＴＬＨＧＣＱＰＶＴＱＥＤＧＫＥＳＲＩＳＶＱＥＲＱ（配列番号２０）．

本明細書で使用する場合、「可変ドメイン」という用語はKabat, et al., Sequences of Immunological Interest、第五版、U.S. Dept. Health & Human Services、Washington、D.C. (1991) において定義される免疫グロブリン可変ドメインを指す。可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸残基のナンバリングおよびポジショニングはよく知られたＫａｂａｔのナンバリング規則に則る。ＶＨ、「可変重鎖」および「可変重鎖ドメイン」は重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬ、「可変軽鎖」および「可変軽鎖ドメイン」は軽鎖の可変ドメインを指す。

「ヒト」という用語は、抗体において適用される場合は、抗体がヒト免疫グロブリン由来の配列、例えば、ＦＲおよび／または、ＣＨドメインを持つことを意味する。配列がヒト免疫グロブリンコーディング配列に「由来する」とは、該配列が以下の何れかの場合である：（ａ）ヒト個人からもしくはヒト個人から得た細胞または細胞株から単離された；（ｂ）クローン化されたヒト抗体遺伝子配列またはヒト抗体可変ドメイン配列のライブラリーから単離された；または（ｃ）１以上の上記のポリペプチドから、変異および選別によって多様化された。

本明細書で使用する「単離された」化合物とは化合物が天然に関連している少なくとも１つの成分から取り除かれていることを意味する。

本開示の抗ＣＤ４０抗体は可変重鎖および可変軽鎖を含み、このそれぞれが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含有し、アミノ末端からカルボキシル末端へと以下の順番で並べられている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＣＤＲは抗原と特異的な相互作用を形成する残基のほとんどを含有し、抗原認識に主として関与する。

本開示の抗ＣＤ４０抗体にはヒト化抗体Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８（Ｖｈ－ｈｚ１４；Ｖｋ－ｈｚ２）、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０（Ｖｈ－ｈｚ１２；Ｖｋ－ｈｚ３）、またはＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２（Ｖｈ－ｈｚ１４；Ｖｋ－ｈｚ３）のＣＤＲを含み得る。重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の概観を表１に提示する。この表は、各アミノ酸配列の短縮名と詳細名、および配列識別子を含む。

特定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ４０抗体はヒト化抗体Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８（Ｖｈ－ｈｚ１４；Ｖｋ－ｈｚ２）のＣＤＲを含む。Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８のアミノ酸配列の詳細を表２に示す。

特定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ４０抗体はヒト化抗体Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０（Ｖｈ－ｈｚ１２；Ｖｋ－ｈｚ３）のＣＤＲを含む。Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０のアミノ酸配列を表３に示す。

特定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ４０抗体はヒト化抗体Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４２（Ｖｈ－ｈｚ１４；Ｖｋ－ｈｚ３）のＣＤＲを含む。Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４２のアミノ酸配列の詳細を表４に示す。

一つの実施形態において本開示の抗体はヒト化Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８可変重鎖および軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含み得る（例えば、それぞれ配列番号４および１０）。モノクローナル抗体は６つすべてのＣＤＲ（Ｖ_Ｈに３つおよびＶ_Ｌに３つ）を含有する、例えば、可変重鎖ＣＤＲ１－３としてそれぞれＳＹＷＭＨ（配列番号：１）、ＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号２）、およびＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）、および可変軽鎖ＣＤＲ１－３としてそれぞれＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）、およびＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）。

一つの実施形態において、本開示の抗体はヒト化Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０可変重鎖および軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み得る（例えば、それぞれ配列番号１３および１６）。モノクローナル抗体は６つすべてのＣＤＲ（Ｖ_Ｈに３つおよびＶ_Ｌに３つ）を含有する、例えば、可変重鎖ＣＤＲ１－３としてそれぞれＳＹＷＭＨ（配列番号：１）、ＱＩＮＰＳＱＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号１２）、およびＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）、および可変軽鎖ＣＤＲ１－３としてそれぞれＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）、およびＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）。

一つの実施形態において、本開示の抗体はヒト化Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４２可変重鎖および軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み得る（例えば、それぞれ配列番号４および１６）。モノクローナル抗体は６つすべてのＣＤＲ（Ｖ_Ｈに３つおよびＶ_Ｌに３つ）を含有する、例えば、可変重鎖ＣＤＲ１－３としてそれぞれＳＹＷＭＨ（配列番号：１）、ＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号２）、およびＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）、および可変軽鎖ＣＤＲ１－３としてそれぞれＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）、およびＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）。

「抗体」には、限定されないが、特異的に抗原と結合する、およびジスルフィド結合で内部が結合している少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合部位を含む免疫グロブリンを含むべきである。各Ｈ鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つの定常ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は一つの定常ドメイン、Ｃ_Ｌを含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はさらに分割でき、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域が、フレームワーク領域（ＦＲ）とよばれる比較的保存された領域に点在する。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシル末端へと以下の順番に並んでいる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。

Ａｂの「抗原結合部位」（「抗原結合フラグメント」とも呼ばれる）またはその抗原結合部位とは、抗体の全長が結合する抗原に特異的に結合する能力を保持した抗体の１つ以上の配列（全長または全長抗体のフラグメント）を指す。抗原結合フラグメントの例にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびｓｃＦｖ－Ｆｃを含む。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＡｂのＣＤＲドメインの外側の一部、ほとんど、またはすべてのアミノ酸配列が対応するヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸配列と置き換えられたＡｂを指す。Ａｂのヒト化形成の一つの実施形態としては、ＣＤＲドメイン外側にある一部、ほとんど、またはすべてのアミノ酸配列はヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸配列と入れ替わるが、１つ以上のＣＤＲ領域の内側の一部、ほとんど、またはすべてのアミノ酸配列は不変である。アミノ酸の小規模な付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それらがＡｂの特異的抗原への結合能を損なわない限りにおいては許容される。「ヒト化」Ａｂは元のＡｂと近い抗原特異性を保持する。

「キメラ抗体」は可変領域が一つの種に由来している、および定常領域が他の種に由来するＡｂ、例えば、可変領域がマウスＡｂ由来である、および定常領域がヒトＡｂ由来であるＡｂ、を指す。

本明細書で使用する場合、「特異的な結合」とは、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される解離定数（Ｋｄ）が約１μＭまたはそれ以下である、抗体による抗原への結合を指す。適切なアッセイシステムとしては、ＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）表面プラズモン共鳴システム、およびＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）動態評価ソフトウェア（例えばヴァージョン２．１）を含む。

本抗体のＣＤ４０への結合は少なくとも一つのＣＤ４０の活性に拮抗的に働く。「ＣＤ４０活性」には、限定されないが、Ｔ細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン分泌の誘導）、マクロファージの活性化（例えば、マクロファージ内での活性酸素種および酸化窒素の誘導）、およびＢ細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞増殖、抗体アイソタイプ切り替え、または形質細胞への分化）を含む。ＣＤ４０の活性は他の分子との相互作用によって仲介され得る。「ＣＤ４０活性」にはＣＤ４０および、そのＵｎｉｐｒｏｔ識別番号が括弧内に記載された以下の分子との間の機能的な相互作用を含む。
ＣＡＬＲ（Ｐ２７７９７）；
ＥＲＰ４４（Ｑ９ＢＳ２６）；
ＦＢＬ（Ｐ２２０８７）；
ＰＯＬＲ２Ｈ（Ｐ５２４３４）；
ＲＦＣ５（Ｐ４０９３７）；
ＳＧＫ１（Ｏ００１４１）；
ＳＬＣ３０Ａ７（Ｑ８ＮＥＷ０）；
ＳＬＣ３９Ａ７（Ｑ９２５０４）；
ＴＲＡＦ２（Ｑ５Ｔ１Ｌ５）；
ＴＲＡＦ３（Ｑ１３１１４）；
ＴＲＡＦ６（Ｑ９Ｙ４Ｋ３）；
ＴＸＮ（Ｑ５Ｔ９３７）；
ＵＧＧＴ１（Ｑ９ＮＹＵ２）；および
ＵＳＰ１５（Ｑ９Ｙ４Ｅ８）。

例えば、ＣＤ４０「活性」にはＴＲＡＦ２との相互作用を含む。ＣＤ４０／ＴＲＡＦ２相互作用はＮＦ－κＢおよびＪＮＫを活性化する。Daviesら、Mol.CellBiol.25:9806-19(2005)を参照。したがって、このＣＤ４０活性は、参照と比較して、ＣＤ４０依存性の細胞ＮＦ－κＢおよびＪＮＫの活性化によって決定され得る。

本明細書で使用する場合、「活性化」、「活性化する」、および「活性化された」という用語は測定可能なＣＤ４０の活性が参照に比して少なくとも１０％の増加であって、例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％、またはそれ以上の増加を指す。ＣＤ４０活性が「拮抗される」とは、ＣＤ４０の活性がアンタゴニスト非存在下に比して少なくとも１０％低減する、例示的な実施形態においては少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、または１００％（すなわち活性が検出されない）低減する場合である。例えば、抗体はＣＤ４０を活性化せずに、一部のまたは全てのＣＤ４０活性と拮抗する可能性がある。例えば、該抗体はＢ細胞の増殖を活性化しなくてもよい。該抗体はＴ細胞によるサイトカイン分泌を活性化しなくてもよい、ここで、サイトカインはＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＮＦ－α、およびＩＮＦ－γからなる群より選択された少なくとも一つのサイトカインである。

可変ドメインには対応するヒト生殖系列型抗体遺伝子部分にコードされたフレームワーク領域と同じアミノ酸配列を持つ1つ以上のフレームワーク領域（FR）を含んでよい。本明細書に記載の抗体に使用するために好ましいフレームワーク配列は本明細書に記載の抗体に使用されるフレームワーク配列に構造的に近い配列である。Ｖ_ＨＣＤＲ１、２、および３配列、ならびにＶ_ＬＣＤＲ１、２、および３配列は、フレームワーク配列の由来となる生殖系列型免疫グロブリン遺伝子内に見つかる配列と一致した配列を有するフレームワーク領域内に融合され得る、またはＣＤＲ配列は生殖系列の配列と比して２０までの、好ましくは保存的である、アミノ酸置換を含有するフレームワーク領域に融合され得る。例えば、ある特定の例においてはフレームワーク領域内の残基の変異が抗体の抗原結合能の維持または増強に有益であることが見出された。(例えばＱｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；同第６，１８０，３７０号を参照）。

例示的なフレームワーク領域内として以下の表5および表6を含むが、以下に限定するものではない。

バリアント可変ドメインはヒト化Ｙ１２ＸＸ－２８、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０、またはＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２配列の可変ドメインと、最大１０アミノ酸、またはその間の何れかの整数値で異なっていてもよいが、ここで、該バリアント可変ドメインはＣＤ４０に特異的に結合する。あるいは、バリアント可変ドメインは、ヒト化Ｙ１２ＸＸ－２８、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０、またはＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２配列それぞれと比して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性）を有し得る。非同一なアミノ酸残基または二つの配列間で異なるアミノ酸はアミノ酸の置換、付加、または欠失を示す。二つの配列間で異なる残基は、ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}（米国国立医学図書館の登録商標）などの適切なアミノ酸配列アライメントアルゴリズムによって二つの配列を整列させたときに、非同一の位置として現れる。

例示的な本発明のＣＤ４０抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部位を含み、ここで、該抗体は重鎖可変領域を含む第1ポリペプチド部位および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、
該重鎖可変領域は（ｉ）ＳＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号２）を含むＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３；ならびに（ｉｉ）ＳＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＱＩＮＰＳＱＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ２、ＷＧＬＱＰＦＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３、の内の一つを含む；および
該軽鎖可変領域はＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号７）を含むＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号８）を含むＣＤＲ２、ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号９）を含むＣＤＲ３を含む。

単離された抗体またはその抗原結合部位は１以上のＣＤ４０の活性に拮抗し得る。単離された抗体またはその抗原結合部位はキメラ抗体であり得る。例示的なキメラ抗体のための可変重鎖および可変軽鎖は実施例の表８に示す。単離された抗体またはその抗原結合部位はヒト化抗体であり得る。例示的なヒト化可変重鎖および可変軽鎖を実施例の表１０に示す。単離された抗体またはその抗原結合部位はヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含み得る。

Ｆｃドメインおよび定常領域
重鎖のカルボキシル末端側の「半分」は定常領域（Ｆｃ）と定義されており、エフェクター機能に主に関与する。本明細書で使用する場合、「Ｆｃドメイン」という用語はKabat, et al., Sequences of Immunological Interest、第5版、U.S. Dept. Health & Human Services、Washington、D.C. (1991)において定義されたＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む定常領域抗体配列を指す。Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ由来であってもよい。例えばＦｃ領域はヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域に由来してもよい。重鎖可変ドメインはＦｃドメインと融合し得る。可変ドメインのカルボキシル末端はＦｃＣＨ２ドメインのアミノ末端と連結または融合してもよい。あるいは、可変ドメインのカルボキシル末端は、それ自身がＦｃドメインのアミノ末端と融合するリンカーアミノ配列のアミノ末端と連結または融合してもよい。あるいは可変ドメインのカルボキシル末端は、それ自身がＦｃＣＨ２ドメインと融合するＣＨ１ドメインのアミノ末端と連結または融合してもよい。任意には、タンパク質は、ＣＨ１ドメインの後にヒンジ領域の全体または一部を含んでいてもよい。任意にはアミノ酸リンカー配列は可変ドメインおよびＦｃドメインの間に存在している。軽鎖可変ドメインのカルボキシル末端はＣＬドメインのアミノ末端と連結または融合してもよい。

重鎖ＣＨ１の例示的な配列は配列番号５の１１８－２１５のアミノ酸である（ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ；配列番号１８）。
軽鎖ＣＬの例示的な配列は配列番号１１の１０８－２１４のアミノ酸である（ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；配列番号１９）。

抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合する第１可変ドメイン、およびＦｃドメインを含む第２ドメインを含む融合抗体であり得る。

融合タンパク質に使用される例示的なＦｃドメインにはヒトＩｇＧドメインを含み得る。例示的なヒトＩｇＧＦｃドメインにはＩｇＧ４ＦｃドメインおよびＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む。ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子はＣ末端にリジンをコードしているが、血液循環中の切断の結果として内在性抗体からはこのリジンはしばしば消失している。哺乳類培養細胞で発現した場合には、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ重鎖を有する抗体も、C末端リジンの存在は変化的なレベルであり得る(Cai et al., 2011, Biotechnol Bioeng. 108(2): 404-12)。したがって、本明細書で開示される何れのＩｇＧ重鎖ＦｃドメインのＣ末端リジンも除外され得る。

本明細書に記載の単離された抗体または抗原結合部位は以下のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み得る。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（Ｐ／Ｋ）ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹ（Ｎ／Ａ）ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（Ｄ／Ｅ）Ｅ（Ｌ／Ｍ）ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（Ｋ／非存在）（Ｆｃコンセンサス；配列番号２１）。括弧内の表記はその位置であり得るアミノ酸の識別子を示す。例えば、ｋａｂａｔの２３８位は（Ｐ／Ｋ）と記載されており、プロリン（Ｐ）またはリジン（Ｋ）何れかであり得る。付加的な例として、非制限コンセンサス配列を配列番号１１８－１２０に示す。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合する残基であるｋａｂａｔの２３８位に変異を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含み得る、ここで、プロリン２３８（Ｐ２３８）はリジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択された残基の一つに変異しており、およびここで、抗体またはその抗原結合部位は低減したＦｃγＲとの結合を有する。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン中にＰ２３８のリジンへの変異を有し得る。

単離された抗体またはその抗原結合部位は配列番号２２－２９から選択されたアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。

上記ＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む例示的な配列は：配列番号５、配列番号６、配列番号３０、および配列番号３１を含む。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位はｋａｂａｔの２９７位にアラニンの置換を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含み得る。例えば、単離された抗体またはその抗原結合部位は配列番号３２－３９から選択されたアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位は、（１）実施例中の表８もしくは表１０から選択された可変重鎖（Ｖ_Ｈ）、またはそのＣＤＲ、および／または（２）実施例中の表８もしくは表１０から選択された可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）、またはそのＣＤＲを、含んでもよい。

本明細書で開示される単離された抗体またはその抗原結合部位はＶｈ－ｈｚ１２（配列番号１３）およびＶｈ－ｈｚ１４（配列番号４）から選択される重鎖アミノ酸配列を含んでもよい。

本明細書で開示される単離された抗体またはその抗原結合部位はＶｋ－ｈｚ２（配列番号１０）およびＶｋ－ｈｚ３（配列番号１６）から選択される軽鎖アミノ酸配列を含んでもよい。

本明細書で開示される単離された抗体またはその抗原結合部位は以下からなる群より選択された抗体であってもよい：
ａ）配列番号５または６の重鎖および配列番号１１の軽鎖を有するＹ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋ；
ｂ）配列番号１４または１５の重鎖および配列番号１７の軽鎖を有するＹ１２ＸＸ－ｈｚ４０－Ｐ２３８Ｋ；および
ｃ）配列番号５または６の重鎖および配列番号１７の軽鎖を有するＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２－Ｐ２３８Ｋ。

抗原結合部位がＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ダイアボディ、およびｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群より選択された、本明細書で開示される単離された抗体またはその抗原結合部位。

本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部位は、抗体またはその抗原結合部位が治療剤と連結する、免疫コンジュゲートであり得る。

本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部位は二重特異性抗体であり得、ここで、抗体またはその抗原結合部位が、抗体またはその抗原結合部位と異なる結合特異性を有する第2の機能部分と連結する。

本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部位はさらに付加的な部分を含み得る。

本抗体の可変領域は「アミノ酸リンカー」、または「リンカー」によってＦｃドメインと任意に連結してもよい。例えば、可変重鎖ドメインのＣ末端はアミノ酸リンカーのＮ末端と融合してもよく、およびＦｃドメインはリンカーのＣ末端と融合してもよい。アミノ酸リンカーは任意の長さおよび、任意のアミノ酸の組み合わせの構成からなり得るが、連結したドメイン間の相互作用を低減するためには、リンカー長は比較的短くてもよい（例えば５またはそれ以下のアミノ酸）。リンカーのアミノ酸組成もまた、かさの大きい側鎖をもつアミノ酸、または二次構造をとりやすいアミノ酸の数を減らすために調節されてよい。適切なアミノ酸リンカーには長さが３、４、５、６、７、１０、１５、２０、または２５アミノ酸までのものが含まれるが、これらに限定されない。代表的なアミノ酸リンカー配列には、ＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、およびＧＧＧＧＳの２、３、４、または５コピー（配列番号４１～４４それぞれ）を含むリンカーが含まれる。表７に本開示における使用に適したリンカーの配列を示す。

抗体の調製
抗体は通常の技術を用いて、ＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ、ＮＳＯなどの適切な哺乳類の宿主細胞株で生産、および精製し、その後プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、逆相技術などを含む方法の一つ、または組み合わせを用いて精製され得る。

当業者によく知られているように、複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る。よってタンパク質をコードする核酸はコドンの縮退を有する核酸を含む。本明細書で開示するポリペプチド配列は様々な種類の核酸でコードされ得る。遺伝暗号は世界的に共通でありよく知られている。本明細書で開示される任意のポリペプチド配列をコードする核酸は当分野の従来の知識に基づいて容易に着想および生産のために最適化され得る。該ポリペプチドをコードする可能性のある核酸の数は多いものの、遺伝子暗号の標準的な表と、コンピューターの補助があれば、通常の技術をもつ技術者は該ポリペプチドをコードする核酸配列のあり得るすべての組み合わせを容易に生成し得る。

定常領域ＣＨ１およびＦｃドメインＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋを含むＹ１２ＸＸ－ｈｚ２８のＹ１２ＸＸ重鎖可変ドメインをコードする代表的な核酸配列は以下である：
ＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＴＣＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＧＡ（配列番号４９）。この配列内において、核酸１～５１はシグナルペプチド（任意）をコードし、核酸５２～４０２は重鎖可変領域をコードする、このうち、核酸１４１～１５５、核酸１９８～２４９、および核酸３４６～３６９は、重鎖のＹ１２ＸＸ可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をコードする。核酸４０３～６９６はＣＨ１ドメインをコードし、および核酸６９７～１３９９はＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋをコードする。核酸１４００～１４０２は終止コドンである。

定常領域ＣＬを含むＹ１２ＸＸ－ｈｚ２８のＹ１２ＸＸ軽鎖可変ドメインをコードする代表的な核酸配列を以下に示す：
ＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ（配列番号５０）。この配列において、核酸１～５１はシグナルペプチド（任意）をコードし、核酸５２～３７２は軽鎖可変領域をコードする、このうち核酸１２１～１５３はＣＤＲ１、核酸１９９～２１９はＣＤＲ２、核酸３１６～３４２はＣＤＲ３をコードする。核酸３７３～６９３はＣＬをコードする。核酸６９４～６９６は終止コドンである。

重鎖および／または軽鎖のコーディング配列はコーディング配列の５’末端に、例えばＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ（配列番号５１）などのシグナルペプチドを任意にコードしてもよい。上記のように、このシグナルペプチドの例示的な核酸コーディング配列はＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＴＣＧＣＡ（配列番号５２）である。

したがって、本明細書で開示される抗体をコードする核酸についてもまた考慮する。かかる核酸はベクター、例えば、ｐＨＥＮ－１(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) などの、適切な発現ベクターに挿入されてよい。該ベクターおよび／または該核酸を含む単離された宿主細胞をさらに提供する。

本開示の抗体は、適切な哺乳類の宿主細胞株、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、２９３（ヒト胎児腎２９３細胞）、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞など、において通常の技術のみを用いて生産および精製され、その後プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、逆相技術などを含む方法の一つ、または組み合わせを用いて精製され得る。

医薬組成物および処置方法
医薬組成物は治療有効量の１以上の抗体および任意の医薬的に許容できる担体を含む。医薬的に許容できる担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせが含まれる。医薬的に許容できる担体はさらに微量の補助物質、例えば、融合タンパク質の保存性や有効性を高める湿潤剤、乳化剤、保存剤、または緩衝剤を含み得る。組成物は投与後に活性のある成分の迅速な、持続的な、または遅延した放出を提供するために製剤化され得る。適切な医薬組成物およびそれらを調製する工程は当業者に知られている。例えば、Remington、THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY、A. Gennaro、et al.、eds.、21st ed., Mack Publishing Co. (2005)を参照。

医薬組成物は単独で、または併用治療において（すなわち同時に、または順次に）、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と共に、投与されてよい。例示的な薬剤の種類の１つは細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）変異分子である。ＣＴＬＡ４変異分子の１例が修飾したＣＴＬＡ４－ＩｇであるＬ１０４ＥＡ２９Ｙ－Ｉｇ（ベラタセプト）である。異なる免疫疾患は、患者ごとの基準に基づいて決定される免疫疾患の治療に有効な特異的な補助化合物の使用を要求し得る。例えば、医薬組成物は１以上の適切なアジュバント、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３）または他の免疫刺激物質、例えば、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドとの併用によって投与されてよい。適切なアジュバントは当業者に知られている。

かかる処置を必要とする患者における免疫疾患を処置する方法は治療有効量の本明細書で記載する抗体、またはその抗原結合部位の患者への投与を含み得る。さらに、治療有効量の本明細書で記載する抗体、またはその抗原結合部位の患者への投与を含む、かかる処置を必要とする患者における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防する方法を提供する。かかる処置を必要とする患者における免疫疾患の処置のための、および／または、かかる処置を必要とする患者における自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の処置または予防のための、本開示の抗体またはその抗原結合部位、または医薬品として許容できるその塩の使用をまた提供し、その使用には治療有効量の抗体またはその抗原結合部位の患者への投与を含んでもよい。ＣＤ４０を介したＴ細胞活性化への拮抗は、例えば自己免疫反応、移植拒絶反応、またはアレルギー反応の間に発生する望ましくないＴ細胞の反応を阻害し得るだろう。ＣＤ４０を介したＴ細胞活性化の阻害はこれらの疾患の進行および／または重症度を緩和し得るだろう。

かかる処置を必要とする患者における免疫疾患の処置のための、および/または、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の処置または予防のための、本開示の抗体およびその抗原部位、または医薬的に許容できるその塩の医薬品の調製における使用をまた、提供する。該医薬品は例えば免疫抑制剤/免疫調節剤、および/または抗炎症剤と併用して投与され得る。

本明細書で使用する場合、「患者」とは動物、例えば哺乳類を意味し、ヒトを含む。患者は免疫疾患を持つと診断され得る。「処置」または「処置する」または「処置の」とは症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度の軽減に関連する工程を指す。「免疫疾患」とは、細胞性および／または液性免疫反応を含む、個体における免疫反応の発生に関連する任意の疾患を指す。免疫疾患の例には、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、または移植片関連疾患を含むが、これらに限定しない。よって患者は自己免疫疾患または炎症性疾患を持つと診断され得る。「自己免疫疾患」とは細胞性および／または液性の免疫反応を含む、個体における自己免疫反応の発生に関連する任意の疾患を指す。自己免疫疾患の例として潰瘍性大腸炎やクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）があるが、これらに限定しない。その他の自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、乾癬、強皮症、およびアテローム性動脈硬化症を含む。移植片関連疾患には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植拒絶反応、および慢性移植拒絶反応を含む。

本開示の抗体の投与によって処置され得る疾患は、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、目の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠状動脈性心臓病、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え医薬品に対する免疫反応（例えば、血友病患者の第ＶＩＩ因子）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶反応、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択され得る。

医薬組成物は単独で、または併用治療として（すなわち同時にまたは順次に）、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と共に、投与されてよい。異なる免疫疾患は、患者ごとの基準に基づいて決定される免疫疾患の処置に有効な特異的な補助化合物の使用を要求し得る。例えば、医薬組成物は１以上の適切なアジュバント、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３）または他の免疫刺激物質、例えば、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドの併用によって投与されてよい。適切なアジュバントは当業者に知られている。

抗体、またはその抗原結合部位、または医薬品組成物を投与するために、任意の適切な方法または経路が使用され得る。投与経路としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与を含む。抗体の治療有効投与用量は、非常に多くの要因に依存しており、例えば、処置される免疫疾患の種類や重症度、併用治療の使用、抗体またはその抗原結合部位または医薬品組成物の投与経路、および患者の体重、を含む。ドメイン抗体の治療有効量の非制限範囲は患者の体重に対して、０．１－２０ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）であり、一態様では、１－１０ｍｇ／ｋｇである。

キット
ヒト患者の免疫疾患の処置に有用なキットが提供される。ヒト患者の自己免疫疾患または炎症性疾患の処置または予防に有用なキットもまた提供される。該キットは（a)本開示の抗体、またはその抗原結合部位の投与量、および（ｂ）抗体またはその抗原結合部位を免疫疾患の処置方法において使用するための説明書、もしくは抗体またはその抗原結合部位を患者の自己免疫疾患や炎症性疾患の治療または予防方法において使用するための説明書を含む。

本明細書で使用する「説明書」という用語は、キットにおいて、本発明の組成物および/または化合物の有用性を伝達するために使用され得る、出版物、録画、図、その他任意の表現媒体を含む。キットの説明書は、例えば、本発明の化合物および／または組成物を含む容器に貼付するか、または化合物および／または組成物を含む容器と一緒に出荷することができる。あるいは、受領者が説明書および化合物を共同で使用することを意図して、説明書を容器とは別に出荷してもよい。説明書の配達は、例えば、キットの有用性を伝達する出版物または他の表現媒体を物理的に配送する方法であってよい、もしくは、その代わりに電子的な送信、例えば、コンピューターを用いた電子メールまたはウェブサイトからのダウンロードによって取得されてもよい。

実施例１：マウス抗ヒトＣＤ４０抗体のヒトＣＤ４０への結合
マウスの抗ヒトＣＤ４０抗体を生産し、ヒトＣＤ４０との結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。各抗体のＶｈおよびＶｋ配列を表８に示す。

ヒトＣＤ４０モノマーの、プロテインＡセンサーチップ表面に捕捉化されたマウス抗ヒトＣＤ４０抗体への結合における、ＣＤ４０の動態および親和性のデータをＳＰＲによって評価した。データを表９に示す。示されたデータは、ＣＤ４０アナライトの単一濃度（１μＭ）におけるものであり、よって見かけの値（ａｐｐ）として報告する。

ＳＰＲデータおよび配列データに基づいて、３つの抗体、ＡＤＸ＿Ｙ１２５８．ＺＺ０－１、ＡＤＸ＿Ｙ１２６２．ＺＺ０－１、およびＡＤＸ＿Ｙ１２６８．ＺＺ０－１をヒト化のために選択した。

実施例２：ヒト化およびＹ１２ＸＸヒト化バリアントの選択
ヒト化の背景／手順はＷＯ２０１７００４００６内のセクションＩＩ「改変および修飾抗体」で議論されており、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。この解析に基づいて、９つのヒト化Ｖｈ配列（Ｖｈ－ｈｚ１、Ｖｈ－ｈｚ２、Ｖｈ－ｈｚ３、Ｖｈ－ｈｚ４、Ｖｈ－ｈｚ５、Ｖｈ－ｈｚ６、Ｖｈ－ｈｚ９、Ｖｈ－ｈｚ１０、およびＶｈ－ｈｚ１１）および３つのヒト化Ｖκ配列（Ｖｋ－ｈｚ１、Ｖｋ－ｈｚ２、およびＶｋ－ｈｚ３），が試験のために選択された。さらに、５つのヒト化Ｖｈ配列（Ｖｈ－ｈｚ７、Ｖｈ－ｈｚ８、Ｖｈ－ｈｚ１２、Ｖｈ－ｈｚ１３、Ｖｈ－ｈｚ１４）は、設計された化学物質の責任リスクの軽減を意図した変異を含むように設計された。そのような変異には、Ｙ１２６２＿ＩＧＨＶ１．６９０８における潜在的な加水分解のリスクを軽減するためのＤ１００Ｑ（Ｙ１２６２＿ＩＧＨＶ１．６９０８－Ｄ１００Ｑ）およびＰ１０１Ａ変異（Ｙ１２６２＿ＩＧＨＶ１．６９０８－Ｐ１０１Ａ）を含む。そのような変異はまた、Ｙ１２６８＿ＩＧＨＶ１．６９０８．における潜在的な脱アミド化リスクを軽減するためのＮ５５Ｑ（Ｙ１２６８＿ＩＧＨＶ１．６９０８－Ｎ５５Ｑ）、Ｇ５６Ａ（Ｙ１２６８＿ＩＧＨＶ１．６９０８－Ｇ５６Ａ）、およびＳ５４Ｔ－Ｎ５５Ｔ２重変異（Ｙ１２６８＿ＩＧＨＶ１．６９０８－Ｓ５４Ｔ－Ｎ５５Ｔ）を含む。Ｓ５４Ｔ－Ｎ５５Ｔ２重変異はADX_Y1262.ZZ0-1-Vhのこれらの位置において見つかる対応するアミノ酸残基に基づいて設計された。表10を参照。

これらのバリアントの配列を表１０に示した。

表１０はＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたＣＤ４０結合能解析およびオクテットＢＬＩ力価解析（後述）のためのヒト化抗体の構築およびキメラ抗体コントロールの構築に使用する重鎖および可変軽鎖ドメインの配列を提供する。

Ｖｈ配列はＩｇＧ１－ｐ２３８Ｋアイソタイプ（ＣＨ１－ＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋ；配列番号２５）でフォーマットされた。Ｖκ配列は全長軽鎖として共通のＣＬ配列（配列番号１１の１０８～２１４アミノ酸）でフォーマットされた。表１１において、「Ｙ１２５８」および「Ｙ１２６２」はマウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ分子を指す。ヒト化ＨＣ構築物およびＬＣ構築物、ならびにキメラＹ１２５８およびＹ１２６２分子の様々な異なる組み合わせは、力価解析およびＣＤ４０結合能解析のために３ミリリットル（ｍｌ）の上清として発現された。この分子ファミリーは、異なる重鎖／軽鎖ペアを一意に識別するために、“Ｙ１２ＸＸ”という接頭語と“ｈｚ＃”という接尾語でまとめて識別された。

力価解析は、上清からプロテインＡセンサーチップを用いて抗体を捕捉する、および捕捉反応を測定し、コントロール抗体サンプルを用いて得られた標準曲線と比較することによる、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、ＯｃｔｅｔＲＥＤ装置（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）上で行った。ＳＰＲデータは、プロテインＡ表面上に抗体を捕捉、ならびに５００ｎＭおよび５０ｎＭ注入したヒトＣＤ４０アナライトの結合を試験することで、ＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）Ｔ２００装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて取得した。２つの濃度のｈＣＤ４０モノマーの動態データに１：１ラングミュアモデルを適合させ、これらの相互作用の動態および親和性の値の推定値を算出し、異なる分子の比較を行った。

オクテット力価およびＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）ＳＰＲＣＤ４０結合データを表１１に提供した。上清（「ｓｕｐ」）サンプルの試験に加えて、ヒト野生型ＩｇＧ１ｆアイソタイプ

を含む精製キメラＹ１２５８、Ｙ１２６２およびＹ１２６８抗体をコントロールとしてＳＰＲで試験した；これらは表１１中で「Ｙ１２５８－ｈＩｇＧ１ｆ」、「Ｙ１６３２－ｈＩｇＧ１ｆ」、および「Ｙ１２６８－ｈＩｇＧ１ｆ」と名付け、ならびにＶｈおよびＶｋ鎖を「Ｃｈｉｍ－Ｐ」として表示した。

ある重鎖構築物において、力価は一般的にＶｋ－ｈｚ３（配列番号１８）を含む軽鎖と対にした際に最も高く、Ｖｋ－ｈｚ２（配列番号１０）を含む軽鎖と対にした重鎖においてはより低く、軽鎖を含むＶｋ－ｈｚ１（配列番号１１６）と対にした重鎖においては最も低くなった。

ＳＰＲ解析データは抗体が様々な親和性でＣＤ４０と結合することを示し、ＫＤ値は１Ｅ－０７よりも大きい値から、１Ｅ－０９よりも小さい値の範囲をとった。いくつかの抗体では、解離速度が測定するには遅すぎたために、その親和性は本アッセイにおいて信頼を持って正確に決定するには強すぎた。表中ではイタリック体で示したこれらの値は、本アッセイの正確な定量限界を超えている。

より大きな規模での発現、精製、およびさらなる評価を行うために、抗体は配列、力価、およびＳＰＲ結合データに基づいて選択された。精製抗体を用いたＳＰＲ解析は、プロテインＡ上に抗体を捕捉し、２５℃または３７℃のどちらかでＰＢＳ－ＴｐＨ７．１緩衝液中において、５００－３．９ｎＭ（２：１）希釈系列のヒトＣＤ４０モノマーと結合させることで実行し、力価データは１：１ラングミュアモデルに適合させた。このデータを表１２に提供する。

これらのデータは、選択したＹ１２ＸＸ抗体が高い親和性で結合し、２５℃においてＫＤ＝１Ｅ－９Ｍの範囲のＫＤ値で結合することを示す。結合を他の抗ＣＤ４０抗体、抗体ＢＩ－ｍＡｂ－Ｂ（米国特許第９，０９０，６９６号、重鎖配列番号３２および軽鎖配列番号３１；本明細書で「抗体Ｂ」および「ＢＩ－ＬＡＬＡ」と称する）の結合と比較する。表１２のデータに示すように、抗体Ｂはヒト化Ｙ１２ＸＸ分子よりもかなり低い親和性でＣＤ４０と結合する。

３つのヒト化版Ｙ１２ＸＸ抗体は全て、ＣＤ４０－ＩＺ三量体アゴニストによって刺激されるＢ細胞増殖に対する強力なアンタゴニストであった。表１３を参照。

Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋはまた、ＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞由来の細胞性ＣＤ４０Ｌで刺激されるＢ細胞増殖に対する強力なアンタゴニストであった。表１４を参照。

*最高投与量試験（１－３μｇ/ｍｌ）における阻害率％

ヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体におけるデータと抗体Ｂのデータを比較すると、抗体Ｂは可溶性ＣＤ４０Ｌシグナルに駆動されるＢ細胞増殖の強力な阻害を示したが、細胞性ＣＤ４０Ｌ（ＣＨＯ細胞が過剰発現するＣＤ４０Ｌ）に駆動されるＢ細胞増殖の阻害においては大きく効果が低かった。対照的に、ヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体は細胞表面ＣＤ４０Ｌ刺激の阻害における効力に１０倍未満のシフトのみを示し、ＣＤ４０Ｌに対するＢ細胞応答のより強力な遮断を提供した。

ＦｃγＲへの結合親和性を低減する、およびＦｃγＲ介在性シグナル伝達を低減するために、ヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体をＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋアイソタイプ（ＣＨ１－ＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋ；配列番号２５）でフォーマットした。このＩｇＧ－Ｐ２３８Ｋアイソタイプを持つ代表的なヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体（Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－ＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋ）のＦｃγＲ結合を、野生型ＩｇＧ１アイソタイプでフォーマットされたコントロール抗体（コントロール－ＩｇＧ１）およびＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプを持つ抗体Ｂの結合と比較した。これらのＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ変異もまたＦｃγＲ結合の低減を誘導する。

ＦｃγＲ結合ＳＰＲの研究は、プロテインＡセンサーチップ表面上に抗体を捕捉し、精製したＨｉｓタグ融合ヒトＦｃγＲをアナライトとして結合させることで行った。ｈＣＤ６４結合は１０μＭ－１．５ｎＭｈＣＤ６４（２：１希釈系列）の滴定からなり、一方で低い親和性のＦｃγＲｈＣＤ３２ａ－Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ－Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ－Ｖ１５８、およびｈＣＤ１６ａ－Ｆ１５８におけるデータは１０μＭ－１３．７ｎＭＦｃγＲタンパク質の滴定からなった。

コントロールＩｇＧ１抗体は試験されたすべてのＦｃγＲとの結合を示した。図１Ａを参照。野生型と比較して、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－ＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋ抗体は、ｈＣＤ６４と１２５倍弱い結合を示し、および試験した低い親和性のＦｃγＲｈＣＤ３２ａ－Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ－Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ－Ｖ１５８、およびｈＣＤ１６ａ－Ｆ１５８の何れとも検出可能な結合がないことを示した。図１Ｂを参照。抗体Ｂもまた野生型ＩｇＧ１よりも弱いｈＣＤ６４との結合を示し、しかしまた、ｈＣＤ１６ａ－Ｖ１５８と明らかな結合（ＫＤ＝７μＭ）を示し、ならびにｈＣＤ３２ａ－Ｈ１３１およびｈＣＤ３２－Ｒ１３１といくらか弱い結合を示した。図１Ｃを参照。ＫＤ値を図１Ｄに提供する。

Ｆｃ領域にＰ２３８Ｋの変異を持つヒト化版の抗体Ｙ１２ＸＸについてさらに任意のアゴニスト活性を試験した。単球由来の未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）はＣＤ４０活性化に非常に敏感であり、ＣＤ４０刺激でサイトカイン産生（ＩＬ－６）が増加し、および活性化の細胞表面マーカー（ＣＤ８６およびＣＤ５４）の発現を促進する。よって最も有望なヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体について、そのｉＤＣ刺激能力を評価するために試験した。ＣＤ４０抗体のＣＤ４０作動能力は該分子のＦｃ部分の細胞表面のＦｃγＲへのクラスタリングまたはクロスリンク結合によって増強され得る。低親和性ＦｃγＲであるＣＤ３２ａを高く過剰発現するＣＨＯ細胞の添加は、ＦｃγＲを介したクラスタリング／クロスリンクの可能性を評価するために使用された。これらの実験におけるＣＨＯ細胞とｉＤＣの比は１：６であり、クラスタリング／クロスリンクのレベルが誇張されている可能性がある。ＢＭＳ－９８６０９０および２１４１をポジティブコントロールとして用いた。ＢＭＳ－９８６０９０はＩｇＧ４Ｆｃと融合した抗ＣＤ４０アンタゴニストドメイン抗体である（ＷＯ２０１２／１４５６７３の配列番号１２８７を参照）。２１４１（ｍＡｂ１３４－２１４１）はパーシャルＣＤ４０アゴニストである(Robert Vonderheide et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25(7): 876-883を参照)。Ｌ６－ＩｇＧ４はＣＤ４０結合能を持たない融合タンパクであり、ネガティブコントロールとして用いた。

図２のデータに示すように、パーシャルアゴニスト２１４１またはＢＭＳ－９８６０９０どちらを添加しても、ドナーのサブセットにおいてｉＤＣの弱い活性化が生じるのみであった。しかし、ＣＤ３２ａ発現ＣＨＯ細胞を２１４１またはＢＭＳ－９８６０９０のどちらかに添加すると、試験したほとんどすべてのドナーにおいて、強いＩＬ－６産生の増加（図２Ｂ）ならびにＣＤ８６およびＣＤ５４の発現の促進（それぞれ、図２Ｂおよび図２Ｃ）が起こり、これらの分子のＦｃ部分を介したＦｃγＲ介在性クラスタリングがＣＤ４０を活性化する事と一致する。一方で、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８ＫおよびＹ１２ＸＸ－ｈｚ４０－Ｐ２３８Ｋの単独またはＣＤ３２依存クラスタリングのいずれも、６から１０ドナー由来のｉＤＣ細胞を用いたネガティブコントロールにおいて観察される信号を超えるいかなるｉＤＣ活性化の信号も示さなかった。Ｙ１２ｘｘ－ｈｚ４２－Ｐ２３８Ｋは４ドナー由来の細胞で試験し、４ドナーのうちの唯１つにおいてＩＬ－６の産生ならびにＣＤ８６およびＣＤ５４の発現促進を含む弱い活性化の信号を示したが、２１４１またはＢＭＳ－９８６０９０で見られた活性化とは異なり、ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞の添加に依存しなかった。

実施例１および２のための材料と方法
ＦｃγＲ結合ＳＰＲ：ＦｃγＲ結合はｉｎｖｉｔｒｏで精製ＦｃγＲを使用し、ＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの方法を用いて測定され得る。１つの方法は、精製Ｈｉｓタグ融合ＦｃγＲタンパク質（ＦｃγＲ－Ｈｉｓ）の、標準的なエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学とエタノールアミンのブロッキングを用いて固定化されたプロテインＡを含むセンサー表面に捕捉される抗体への結合を試験する事である。これらの実験はＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）Ｔ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）装置を用いて、２５℃で行われた。例えば、はじめに３μｇ／ｍｌの濃度の精製抗体のサンプルを、１０μＬ／ｍｉｎの流速で、１５秒間の接触時間をおいて、固定化プロテインＡ表面上に捕捉した。この次に様々な濃度、例えば１０μＭ－１．５ｎＭ（２：１希釈系列）または１０μＭ－１３．７ｎＭ（２：１希釈系列）の精製ＦｃγＲ－Ｈｉｓタンパク質を、３０μＬ／ｍｉｎの流速で、１２０秒間の結合時間および解離時間を用いて結合させた。全行程は１０ｍＭＮａＰＯ_４、１３０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％ｐ２０（ＰＢＳ－Ｔ）ｐＨ７．１からなる泳動緩衝液中で行った。これらの研究で試験したＦｃγＲタンパク質には、「高親和性」ＦｃγＲであるＣＤ６４（ｈＦｃγＲＩ）、および「低親和性」ＦｃγＲであるＣＤ３２ａ－Ｈ１３１（ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１）、ＣＤ３２ａ－Ｒ１３１（ＦｃγＲＩＩａ－Ｒ１３１）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ１６ａ－Ｖ１５８（ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８）、およびＣＤ１６ａ－Ｆ１５８（ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆ１５８）が含まれ、これらは社内で発現、精製された。結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）、および解離定数（Ｋ_Ｄ）値を取得するために、ＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて、ＳＰＲデータに１：１ラングミュアモデル、または１：１定常状態モデルのどちらかを適合させた。

異なるＦｃγＲの結合応答を比較するために、ＳＰＲデータは、最大結合応答を、以下の等式を用いて理論的な最大結合応答の割合（％Ｒｍａｘ）として計算することにより解析され得る：

ここで「アナライト」はＦｃγＲであり、「リガンド」は捕捉された抗体である。この解析は、抗体またはＦｃｇＲのグリコシル化の質量を考慮しておらず、捕捉されたリガンドの１００％の分画活性率を仮定している。ＦｃγＲはグリコシル化されるため、典型的には、飽和状態において％Ｒｍａｘ値は１００％よりも大きくなる。

ＣＤ４０結合動態および親和性：
抗体分子の１価ＣＤ４０結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、２５℃または３７℃で、ＢｉＡｃｏｒｅ^（商標）Ｔ２００装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）上で測定したが、これは固定化プロテインＡセンサーチップ表面に抗体を捕捉し、そしてヒトＣＤ４０モノマータンパク質（社内で生産）を、例えば１８０秒の結合時間および１８０秒または３６０秒の解離時間を用いて、流速３０μＬ／ｍｉｎのＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．１中において結合させることによる。ＳＰＲデータは結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）、および解離定数（ＫＤ）値を取得するために、ＢＩＡｃｏｒｅ^（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて、１：１ラングミュアモデルに適合させた。

力価解析：力価解析は２５℃、Ｏｃｔｅｔ^{（登録商標）} ＲＥＤ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）上で、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて行った。抗体はプロテインＡセンサーチップを用いて１２０秒の結合時間を用いて上清から捕捉され、結合応答は計測され、および上清中の抗体濃度を決定するためにコントロール抗体サンプルを用いて取得された標準曲線と比較される。

初代細胞単離及び培養：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離法によってヘパリン化ヒト血液から単離された。単球はＭａｎｕａｌＥａｓｙＳｅｐ^（商標）プロトコル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ，ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）に従ってＰＭＢＣから単離された。１００万個の単離された単球を６ウェルプレートの各ウェルに対してＩＬ－４（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む６ｍｌずつの完全培地中（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニシリンーストレプトマイシン）に播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で、培地を１日おきに取り換え、同濃度のサイトカインを含む新鮮な培地と交換し、６日間インキュベートした。ｉＤＣ（未成熟樹状細胞）は６日目に採取し、十分に洗浄した後、完全培地中に再懸濁した。

ＦｃγＲクラスタリング／クロスリンクの存在または非存在下におけるｉＤＣの抗ＣＤ４０抗体処置：種々の生物学的薬剤の滴定を完全培地中で行い、９６ウェルプレートに２重に添加した。クロスリンクの場合、抗体を細胞に３０分間添加し、その後ＣＤ３２ａ発現ＣＨＯ細胞を１：６の割合で添加した。細胞は３７℃／５％ＣＯ_２において約１８－２０時間インキュベートし、各ウェルから回収した１５０μＬの上清を、１：５の割合で希釈し、そしてＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１２のタンパク質濃度を、製造者の指示を参照して市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて評価した。上清を回収したプレートに残った細胞は、２重の処置サンプルを１サンプルにまとめ、新しい丸底（ＲＢ）９６ウェルプレートに移し、４℃においた。細胞はＣＡ＋＋およびＭｇ＋＋無添加のＤ－ＰＢＳで洗浄され、細胞の生存率を測定するためにＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録標章）固定可能近赤外線死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて氷上で３０分間染色された。細胞はＣＡ＋＋およびＭｇ＋＋無添加のＤ－ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．１％ＮａＨ_３（染色緩衝液）で洗浄および再懸濁され、染色緩衝液中に添加した５μＬ／ウェルのＨｕｍａｎＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ^（商標）（Ｆｃ受容体ブロッキング溶液、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）でブロッキングされた。

ＤＣは以下を用いて免疫染色され、４℃で４５分間インキュベートされた：ＰｅｒＣｐＣｙ５．５を標識したαＣＤ３、αＣＤ１９、αＣＤ１４（Ｌｉｎ^ー）；ＢＵＶ３９５を標識したαＣＤ１１ｃ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＡＰＣを標識したαＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＰＥを標識したαＣＤ８３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＦＩＴＣを標識したαＣＤ５４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。細胞は染色緩衝液で２回洗浄され、１００μＬのＢＤＣｙｔｏｆｉｘ固定化緩衝液（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加することで固定された（室温で１５分間、遮光）。ＬＳＲＩＩ－ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、ＤＣのＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１およびＣＤ８３の発現を評価した。

ＣＤ４０Ｌ誘導性のヒトＢ細胞増殖の阻害：通常の扁桃摘出術中に小児患者からヒト扁桃Ｂ細胞を取得し、組織を細かく刻み、穏やかにすりつぶし、細胞をスクリーンに通し、ヒトＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ^{（登録商標）}－Ｈ分離用培地（ＣｅｄａｒｌａｎｅＬａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を用いた密度勾配分離により単核細胞を単離することによって単離した。単核細胞を界面から回収し、洗浄し、および羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ，ＣｏｌｏｒａｄｏＳｅｒｕｍＣｏｍｐａｎｙ；Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を用いて４℃で１時間ロゼット形成し、その後Ｔ細胞を除去するために密度勾配分離をおこなった。細胞は再度洗浄され、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ（完全培地）に再懸濁された。抗体の滴定は完全培地中で、９６ウェル丸底（ＲＢ）プレートに３重で添加された。１Ｘ１０^５個のヒト扁桃Ｂ細胞を添加し、可溶性ＩＺ－ｈＣＤ４０Ｌ（２μｇ／ｍＬ）、または１０，０００ｒａｄで照射し、ヒトＣＤ４０Ｌを安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－ｈＣＤ４０Ｌ）のいずれかで刺激し、各ウェルの最終容量が２００μＬとなるように２Ｘ１０^３細胞／ウェルで播種した。プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートし、ウェルあたり０．５μＣｉの^３［Ｈ］－チミジンで最後の６時間標識し、採取し、液体シンチレーションで計数した。Ｂ細胞増殖をチミジンの取り込みに基づいて定量化した。

実施例３：ＩｎＶｉｔｒｏＦｃ受容体アッセイ。
抗体はＦｃ領域が、免疫細胞表面上でＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）と結合する、または補体因子と結合することで、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を示し得る。抗体依存性細胞貪食は他の潜在的なＦｃエフェクター機能である。ヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体の性能をさらに評価するために、抗体の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）についてアッセイした。表１５はこの実施例でアッセイした抗体を示す。

ＣＤＣアッセイは以下のようにして行われた。「ＣＤＣアッセイ培地」は０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加した、Ｌ－グルタミン添加、フェノールレッド無添加（Ｈｙｃｌｏｎｅ）のロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）－１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を指す。５０μＬの標的細胞（５ｘ１０^５細胞／ｍＬ、ＣＤＣアッセイ培地中）を９６ウェルアッセイプレートに添加した。標的細胞は内因的にＣＤ４０を発現するＲａｊｉ細胞である（ＡＴＣＣより取得）。試験する抗体ごとに希釈系列（１３３から０．００２ｎＭ）を調製し、２５μＬの各濃度の抗体を各ウェルに添加した。２５μＬのヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌより取得、ＣＤＣアッセイ培地で１：３に希釈）を各ウェルに添加した。アッセイプレートは湿潤なインキュベーター内において３７℃で４時間インキュベートされた。インキュベート後、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^{（登録商標）} （Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに添加した。そして、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎＶｉｓｉｏｎ^{（登録商標）}プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて蛍光データを取得した。生存率をアイソタイプコントロール（１００％生存）と比較して計算した。抗体濃度に対する結果の値をプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄＩｎｃ．のＰｒｉｓｍｖ５．０１ソフトウェアを用いて細胞生存率を各抗体に対してプロットした。

ＣＤＣアッセイは２回行った。２回目のアッセイにおいて新鮮に解凍されたヒト補体血清を使用した。この結果を図３に示す。図３Ａはアッセイの１度目の繰り返しを示し、図３Ｂはアッセイの２度目の繰り返しを示す。ＣＤ２０ｈＩｇＧ１はポジティブコントロールであり細胞毒性を示す。アッセイした抗ＣＤ４０抗体に対して検出できるＣＤＣ活性は存在せず、特に、アッセイしたヒト化Ｙ１２ＸＸ抗体では補体依存性細胞毒性を誘導するものはなかった。

ＡＤＣＰアッセイは以下のように行われた。「ＡＤＣＰアッセイ培地」は１０％超低濃度ＩｇＧＦＣＳ（Ｇｉｂｌｏ）を追加したＬ－グルタミン、フェノールレッド無添加（ｈｙＣｌｏｎｅ）のＲＰＭＩ－１６４０培地を指す。エフェクター細胞は２人の異なる健康なヒトドナー由来の新鮮なＰＢＭＣから精製した初代ヒトＣＤ１４＋単球細胞を用いた。標的細胞は再度Ｒａｊｉ細胞であった。Ｒａｊｉ細胞は２．０μＭＰＫＨ２６（赤色蛍光色素；Ｓｉｇｍａ）で標識され、ＡＤＣＰアッセイ培地中に濃度が４×１０^６細胞／ｍｌになるように調製された。５０μＬ／ウェルの試験またはコントロール抗体を含むＶ字底９６ウェルプレートに標識した標的細胞（５０μＬ／ウェル）を添加することで標識した標的細胞を抗体で事前に被覆し、氷上で３０分間インキュベートした。標的細胞を洗浄し、そしてエフェクター細胞（ＣＤ１４＋単球細胞）を、最終的なエフェクター細胞と標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）が１：４になる、および最終的な抗体の濃度が３０ｎＭから０．１ｎＭの範囲になるように添加した（１００μＬ／ウェル）。そしてプレートは湿潤な３７℃インキュベーター内に１時間おいた。細胞をＡＰＣ－抗ＣＤ８９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて氷上で３０分間染色し、フローサイトメーター（ＢＤＣａｎｔｏ^（商標），ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で解析した。細胞はＣＤ８９＋細胞および、その後染色された食作用のあるエフェクター細胞（ＣＤ８９＋、ＰＫＨ２６＋）に選別された。貪食の割合を、全ＣＤ８９＋細胞中のＣＤ８９＋、ＰＫＨ２６＋細胞数として計算した。最終的な貪食の割合を得るためにアイソタイプのコントロールから算出したバックグラウンドの値を減算した。データをＦｒｏｗＪｏソフトウェアおよびＧｒａｐｈｐａｄＩｎｃ．のＰｒｉｓｍｖ５．０１ソフトウェアを用いて解析した。

２人の異なるドナー由来のＣＤ１４＋単球細胞を用いた例示的なデータを図４に示した。ＣＤ２０ｈＩｇＧ１はポジティブコントロールであり、期待されるようにＲａｊｉ細胞の貪食を誘導する。ＢＭＳ－９８６０９０も同様に貪食を誘導する。対照的に、本開示のヒト化Ｙ１２ＸＸ抗ＣＤ４０抗体を含む、試験した他の抗体で、このアッセイにおいて検出可能な貪食を誘導する抗体はなかった。

ＡＤＣＣアッセイは以下のように行われた。「ＡＤＣＣアッセイ培地」は１０％超低濃度ＩｇＧＦＢＳ（Ｇｉｂｌｏ）、および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＬ－グルタミン、フェノールレッド無添加のＲＰＭＩ－１６４０培地（ｈｙＣｌｏｎｅ）を指す。初代ヒトＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌ）細胞を２人の異なる社内のドナー由来の新鮮なＰＢＭＣから精製し、エフェクター細胞として用いた。ＰＢＭＣはヘパリン化された全血液サンプルから密度勾配遠心分離によって精製し、２％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）添加ＰＢＳで洗浄した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズを用いた分離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いたネガティブセレクションによってＰＢＭＣから単離した。ＮＫ細胞を活性化するために、精製ＮＫ細胞を１μＭヒドロコルチゾン（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５００ＩＵ／ｍｌ組み換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を追加したＭｙｅｌｏＣｕｌｔＨ５１００培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１ｘ１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し３７℃で一晩インキュベートした。次の日、活性化ＮＫエフェクター細胞をＡＤＣＣアッセイ培地で２回洗浄し、その濃度をＡＤＣＣアッセイ培地で５×１０^５細胞／ｍｌになるよう調製した。Ｒａｊｉ細胞（標的細胞）を以下のようにカルセインで標識した。カルセインＡＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）試薬を、５０μｇの乾燥凍結した試薬が入った試薬チューブに２０μＬの超高純度ＤＭＳＯを加えることで調製した。懸濁させたＲａｊｉ細胞、容量１ｍｌあたりに２μＬの再調製したカルセインＡＭを加えた；細胞をボルテックスし、湿潤なインキュベーターに３０分間置いた。インキュベーション時間終了後、標識した標的細胞をＡＤＣＣアッセイ培地で３回洗浄し，ＡＤＣＣ培地で濃度を１０^５細胞／ｍｌに調整した。標識した標的細胞（５０μＬ／ウェル）を５０μＬ／ウェルの試験またはコントロール抗体を含むＶ字底９６ウェルプレートに添加した。そして、活性化ＮＫ細胞を最終的なエフェクター細胞と標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）が１０：１となる、および最終的な抗体の濃度が０．０００２から１μｇ／ｍｌの範囲になるように添加した（１００μＬ／ウェル）。そして、プレートを湿潤な３７℃のインキュベーターに２時間置いた。上清（５０μＬ／ウェル）を光学９６ウェル黒色プレートに移し、カルセイン放出を４８５の励起光と５３５ｎｍの放出光のフィルターをセットしたＥｎＶｉｓｉｏｎ^{（登録商標）}プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて蛍光強度を読み取ることで計測した。

このアッセイにおいて、抗体の非存在下でエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞は、抗体非依存溶解（自発的な溶解）のバックグラウンドとしてのコントロールを提供し、一方で２０μＬ／ウェルの１０％Ｔｗｅｅｎ－２０溶解緩衝液で溶解させた標的細胞は、最大放出を表す。

抗体依存細胞溶解の割合を以下の式による平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて計算した。

標的細胞溶解割合を、ＧｒａｐｈＰａｄ．ＩｎｃのＰｒｉｓｍｖ５．０１ソフトウェアを用いて抗体ごとにプロットした。

２人の異なるドナー由来のＮＫ細胞を用いた例示的なデータを図５に示した。標的細胞はポジティブコントロールの抗ＣＤ２０抗体によって殺された。一方で、全ての抗ＣＤ４０抗体においてＡＤＣＣは低い値から負の値をとり、これらの抗体がＲａｊｉ細胞の抗体依存細胞毒性を誘導しないことを示し、これらの抗体がＣＤ４０のアンタゴニストであることを証明する。

まとめとして、この実施例において、本開示のヒト化Ｙ１２ＸＸ抗ＣＤ４０抗体、具体的には、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋ、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０－Ｐ２３８Ｋ、およびＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２－Ｐ２３８ＫのＡＤＣＣ（抗体依存細胞毒性）、ＡＤＣＰ（抗体依存細胞貪食）、またはＣＤＣ（補体依存細胞毒性）を仲介する可能性を、内在性ＣＤ４０発現Ｒａｊｉ細胞を標的として用いて試験した。抗ＣＤ２０抗体をポジティブコントロールとして用いた。ＡＤＣＣについて、ＮＫ細胞をエフェクター細胞として用いて、異なるドナー由来のエフェクター細胞を用いて２つの実験を行った。どちらの場合でも、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋ、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０－Ｐ２３８Ｋ、およびＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２－Ｐ２３８Ｋの何れもＲａｊｉ細胞の溶解を誘導しなかった。ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールの影響下で、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋ、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０－Ｐ２３８Ｋ、およびＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２－Ｐ２３８Ｋの何れもＲａｊｉ細胞のＣＤＣを誘導しなかった。ＡＤＣＰについて、ＣＤ１４＋単球細胞をエフェクター細胞として用いて、このシステムにおいて、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋ、Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ４０－Ｐ２３８Ｋ、およびＹ１２ＸＸ－ｈｚ４２－Ｐ２３８Ｋの何れも細胞貪食を促進しなかった。一方で、ＢＭＳ－９８６０９０は細胞貪食を示した。

実施例４：ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達アッセイ
この実施例の目的は、抗ＣＤ４０抗体による刺激の結果、Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１誘導性ＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリフォスファターゼ）の活性を評価することであった。

Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞は、ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１誘導性の分泌胚性アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現するヒトＢリンパ球レポーター細胞株である。Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞株はＮＦ－κＢ／ＡＰ－１シグナル伝達およびＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路のために用いられ、Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞は内因性にＣＤ４０を発現し、ＣＤ４０およびＴＬＲ感受性である。Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞株が刺激されると、それらは細胞培養上清中にＳＥＡＰを生産する。ＳＥＡＰはＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ^（商標）検出培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて検出することができる。ＳＥＡＰのレベルは視覚的に、または６２０ｎｍにおける分光光度計を用いて観察し得る。Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞はＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）を発現しない。

表１６にこの実施例でアッセイした試験物質（抗体および他のポリペプチド）を示した。全ての試験物質はＢＭＳ社内で調製された。

Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。このアッセイのために、本明細書でＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ細胞＃４として示す形質転換細胞株を、Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞にヒトＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）を形質転換することで調製した。両タイプのＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞をＲａｍｏｓ細胞培養培地中（イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭＬ－グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ，－１００μｇ／ｍｌ）、１００μｇ／ｍｌのノルモシン、および薬剤選択のためにゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加）で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。両タイプの細胞は３日おきに継代し、０．５×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で維持した。細胞は細胞継代回数＃２１（Ｐ２１）まで使用した。Ｐ２１以降、細胞を破棄した。

アッセイは以下のように行った。「ＡＩＭＶ^（商標）培地」はＬ－グルタミン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩を添加した血清無添加の培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を指す。Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞＃４における、ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１活性に対するＣＤ４０アンタゴニスト抗体を用いたＣＤ４０アゴニスト活性を評価するために、細胞を抗生物質ノルモシン／ゼオシンの入っていないＡＩＭＶ^（商標）培地で２回洗浄した。そして細胞を室温、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを損なわないように慎重に培地を吸い取った。１ｍｌのＡＩＭＶ^（商標）を細胞ペレットに加え、細胞ペレットを再懸濁し、追加の９ｍｌのＡＩＭＶ^（商標）を再懸濁後に加えた。２０μＬＶｉａＳｔａｉｎ^（商標）ＡＯＰＩ（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム）染色溶液（ＮｅｘｃｅｌｏｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）および、２０μＬのＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞懸濁液を加え、セルカウンターを用いて細胞を数えた。

Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞はＡＩＭＶ^（商標）血清無添加培地中に４×１０^６細胞／ｍｌとなるように調整した。平底組織培養プレートに１ウェル当たり４０万個、１００μＬのＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞を添加した。そして、１００μＬのＢＭＳ－９８６３２５，ＢＭＳ－９８６０９０，ｍＡｂ１３４－２１４１（ＣＤ４０－２１４２）、またはコントロールを各対応するウェルに添加した。ＣＤ４０Ｌ－ＩＺをポジティブコントロールとして用いた。ＡＩＭＶ^（商標）中のＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞（０．４×１０^６細胞／ウェル）はアッセイのネガティブコントロールとして含まれた。最終容量は２００μＬ／ウェルであった。

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で２０時間インキュベートした。２０時間の細胞培養後、プレートを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。

刺激されたＲａｍｏｓ細胞から採取した４０μＬの細胞培養上清を平底プレートのウェルに添加した。そして、１６０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ^（商標）溶液を各ウェルに添加した。最終容量は２００μＬ／ウェルであった。

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で１～６時間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルをＥｎＶｉｓｉｏｎ^{（登録商標）}光学リーダー（ＯＤ：６２０ｎｍ）を用いて、６２０ｎｍで６０分ごとに測定した。

例示的なデータを図６に示す。この実施例において、ＣＤ３２欠損Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞またはＣＤ３２形質転換Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞（Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ＃４）に対して、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を試験し、抗ＣＤ４０抗体で刺激されたＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１誘導性のＳＥＡＰ活性を評価した。

このアッセイにおいてＣＤ４０－２１４２の添加は顕著なシグナル応答を誘導した（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの結果は、ＣＤ４０－２１４２はこのアッセイシステムにおける完全アゴニストであることを示唆する。Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞（－ＣＤ３２）（図６Ａ）を用いたＢＭＳ－９８６０９０の添加では応答が見られなかったが、Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ細胞＃４（ＣＤ３２形質転換Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞）（図６Ｂ）を用いたアッセイでは部分的なアゴニスト性が見られた。この結果はＢＭＳ－９８６０９０の添加によって誘導されるアゴニスト性応答がＦｃγＲ依存的に仲介されることを示唆する。図６Ｃおよび図６Ｄに反映されるように、コントロールのポリペプチド、ＣＤ４０Ｌ－ＩＺ３量体はどちらのアッセイにおいても応答を誘導した。

一方で、ＢＭＳ－９８６３２５の添加は、Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ^（商標）細胞（ＣＤ３２^－）（図６Ａ）またはＲａｍｏｓ＃４（ＣＤ３２^＋）（図６Ｂ）のどちらを用いても、顕著なＮＦ－κＢ／ＡＰ－１応答を誘導しなかった。これらのデータは、ＢＭＳ－９８６３２５がＣＤ４０を作動させない、およびＣＤ３２（ＦｃγＲ）と会合しないことを示唆する。これらのデータは低親和性ＦｃγＲ、例えば、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）との会合を低減すると、望ましくないアゴニストシグナル伝達の可能性および望ましくない細胞毒性の可能性を低減することを補助する。

実施例７：ＢＭＳ－９８６３２５の非臨床的薬物動態評価のまとめ
マウスおよびカニクイザルにおけるＢＭＳ－９８６３２５（Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８－Ｐ２３８Ｋ）の薬物動態（ＰＫ）を評価した。ＢＭＳ－９８６３２５はマウスのＣＤ４０受容体とは交差反応しないため、マウスにおいて評価されたＰＫは内因的または非特異的なＰＫであった。ＢＭＳ－９８６３２５はサルのＣＤ４０受容体と交差反応するため、サルにおいて全ＰＫ（特異的および非特異的なＰＫ）を評価した。マウスにＢＭＳ－９８６３２５（単回１－および１０－ｍｇ／ｋｇ投与量）を静脈（ＩＶ）投与した後、ＢＭＳ－９８６３２５は０．５から１．０２ｍｌ／ｄ／ｋｇと低い総血清クリアランス「ＣＬＴ」、０．１２から０．１９Ｌ／ｋｇと限られた定常状態分布容積「Ｖｓｓ」、および１１８から１８３時間（～５から８日）と長い見かけの消失半減期「Ｔ－ＨＡＬＦ」を示した。

サルにおいて、ＢＭＳ－９８６３２５の単回皮下（ＳＣ）容量を投与した。投与量は、特異的なクリアランス（標的介在性薬物配置「ＴＭＤＤ」）が飽和しないような投与量である。単回ＳＣ投与後、ＢＭＳ－９８６３２５は絶対生物学的利用能が７０．４％と、十分に吸収された（同じＩＶ用量での曝露との比較）。サルへＢＭＳ－９８６３２５のＩＶ投与後（１０ｍｇ／ｋｇ単回用量）、ＢＭＳ－９８６３２５は０．４１ｍｌ／ｄ／ｋｇのＣＬＴ、０．０５Ｌ／ｋｇの限られたＶｓｓ、および１００時間（約４日）のＴ－ＨＡＬＦを示した。サルへのＢＭＳ－９８６３２５の単回ＳＣ投与（用量１、１０、および１００ｍｇ／ｋｇで投与）による最大血漿濃度到達時間「Ｔｍａｘ」は２４から５４時間であった。用量に比例する以上に曝露量が増加し（最大濃度「Ｃｍａｘ」および時間ゼロから無限大に外挿した濃度対時間曲線下面積「ＡＵＣ［ＩＮＦ］」）、および用量に応じてＴ－ＨＡＬＦが増加した（１、１０、１００ｍｇ／ｋｇでそれぞれ約３１時間、約１１９時間、約１９７時間）。これらのデータは非線形のＰＫおよびクリアランス機構の飽和を示唆している；これはＴＭＤＤを反映した、標的（ＣＤ４０）介在性クリアランスの結果だと思われる。この単回用量ＰＫ研究では、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成は～５０％のサルで検出されたが、ＰＫパラメーター全体に明らかな影響はなかった。

薬物動態学／薬物力学モデリング（準定常状態を仮定したＴＭＤＤモデル［ＴＭＤＤ－Ｑｓｓ］）はサルで見られた非線形ＰＫの記述や、血清中の薬物曝露とＣＤ４０受容体占有率（ＲＯ）との関係を確立すること、およびその後のヒトへの投与量予測に用いた。

上記のように実施例を参照して本実施形態を詳細に記載してきたが、これらの実施形態の精神から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ること、および当業者には容易に知られ得ることが理解される。

例示的な特定の処置方法、医薬品および本明細書に示す使用を含む、本明細書で開示されるこれらおよびその他の態様は本明細書に含まれる教示から明らかであるだろう。

Claims

ヒトＣＤ４０に特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合部位であって、該抗体が重鎖可変領域を含む第１ポリペプチド部位、および軽鎖可変領域を含む第２ポリペプチド部位を含み、ここで、
該重鎖可変領域が（ｉ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２、配列番号３を含むＣＤＲ３、または（ｉｉ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号１２を含むＣＤＲ２、配列番号３を含むＣＤＲ３、の内１つを含み、および
該軽鎖可変領域が配列番号７を含むＣＤＲ１、配列番号８を含むＣＤＲ２、および配列番号９を含むＣＤＲ３、を含む、単離された抗体またはその抗原結合部位。
該抗体およびその抗原結合部位がＣＤ４０活性に拮抗する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１からなるＣＤＲ１、配列番号２からなるＣＤＲ２、配列番号３からなるＣＤＲ３、または（ｉｉ）配列番号１からなるＣＤＲ１、配列番号１２からなるＣＤＲ２、配列番号３からなるＣＤＲ３、の内一つを含み、および該軽鎖可変領域が、配列番号７からなるＣＤＲ１、配列番号８からなるＣＤＲ２、および配列番号９からなるＣＤＲ３、を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該重鎖可変領域が、配列番号１からなるＣＤＲ１、配列番号２からなるＣＤＲ２、配列番号３からなるＣＤＲ３を含み、および該軽鎖可変領域が配列番号７からなるＣＤＲ１、配列番号８からなるＣＤＲ２、および配列番号９からなるＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を含む、および該軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該重鎖可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、および該軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を含み、および該軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該第１ポリペプチド部位がヒト重鎖定常領域を含み；および該第２ポリペプチド部位がヒト軽鎖定常領域を含む、請求項１～７の何れか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
請求項８に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位であって、該ヒト重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインであって、
（１）Ｆｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減するＫａｂａｔの２３８位における変異であって、ここで、プロリン２３８（Ｐ２３８）がリジン、セリン、アラニン、アルギニン、トリプトファンからなる群より選択された１つの残基への変異であって、およびここで、抗体またはその抗原結合部位が低減されたＦｃγＲ結合を有する、変異；または
（２）Ｋａｂａｔの２９７位におけるアラニン置換
のどちらかを含む、単離された抗体またはその抗原結合部位。
Ｆｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減させる、Ｋａｂａｔの２３８位における変異を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、請求項８から９の何れか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位であって、ここで、プロリン２３８（Ｐ２３８）の変異が、リジン、セリン、アラニン、アルギニン、およびトリプトファンからなる群より選択された１つの残基への変異であって、およびここで、抗体またはその抗原結合部位が低減されたＦｃγＲ結合を有する、単離された抗体またはその抗原結合部位。
Ｐ２３８がリジンに変異した、請求項１０に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
Ｆｃドメインが、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該重鎖可変領域が配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２、および配列番号３を含むＣＤＲ３、を含み、および
該軽鎖可変領域が配列番号７を含むＣＤＲ１、配列番号８を含むＣＤＲ２、および配列番号９を含むＣＤＲ３、を含む、請求項９に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインが配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
第１ポリペプチド部位が、配列番号５、配列番号６、配列番号３０、および配列番号３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それからなる、および
第２ポリペプチド部位が配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、または、それからなる、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
第１ポリペプチド部位が、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または、それからなる、および
第２ポリペプチド部位が配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、または、それからなる、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
該ヒト重鎖定常領域が、ｋａｂａｔの２９７位におけるアラニン置換を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む、請求項８に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
単離された抗体またはその抗原結合部位がヒト化されている、請求項１～１７の何れか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
抗原結合部位がｓｃＦｖ－Ｆｃである、請求項１～７の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合部位。
抗体またはその抗原結合部位が治療剤と連結される、請求項１～１９の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合部位。
抗体またはその抗原結合部位が該抗体またはその抗原結合部位とは異なる結合特異性を持つ第２の機能部分と連結される、請求項１～２０の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合部位。
さらに追加の部分を含む請求項１～２１の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合部位。
請求項１～２２の何れか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位をコードする核酸分子。
請求項２３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
請求項２４に記載の発現ベクター、または請求項２３に記載の核酸を用いて形質転換された細胞。
ａ）請求項２５に記載の細胞において抗体、またはその抗原結合部位を発現すること、および
ｂ）該細胞から該抗体、またはその抗原結合部位を単離すること、を含む、抗ヒトＣＤ４０抗体、またはその抗原結合部位を調製する方法。
ａ）請求項１～２２の何れか１項に記載の、抗体、またはその抗原結合部位；およびｂ）医薬的に許容できる担体、を含む医薬品組成物。
対象に請求項１～２２の何れか１項に記載の、抗体、またはその抗原結合部位を投与することを含む、対象における免疫反応を処置または予防する方法。
対象に請求項１～２２の何れか１項に記載の、抗体、またはその抗原結合部位を投与することを含む、対象における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防する方法。
該抗体、またはその抗原結合部位が免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と共に投与される、請求項２８または２９に記載の方法。
該免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤がＣＴＬＡ４変異分子である、請求項３０に記載の方法。
該ＣＴＬＡ４変異分子がＬ１０４ＥＡ２９Ｙ－Ｉｇ（ベラタセプト）である、請求項３１に記載の方法。
対象が、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、動脈硬化、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、目の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠状動脈性心臓病、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、遺伝子組み換え医薬品に対する免疫反応（例えば、血友病患者における第ＶＩＩ因子）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スポンディ関節症、甲状腺炎、移植拒絶反応、血管炎、および潰瘍性大腸炎、からなる群より選択される疾患を持つ、請求項２８または２９に記載の方法。
医薬品として使用するための請求項１～２２の何れか１項に記載の、抗体、またはその抗原結合部位。
それを必要とする対象における処置に使用するための請求項１～２２の何れか１項に記載の、抗体、またはその抗原結合部位。