JP2022172297A - 糸状菌の形質転換方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]下記工程:
コードする蛋白質の機能が欠損している選択マーカー遺伝子を含む宿主糸状菌を提供すること、
標的遺伝子の、コード領域、プロモーター及びターミネーターを含む発現カセット、及びプロモーターが改変された選択マーカー遺伝子を用いて、該宿主糸状菌を形質転換すること、
を含む、糸状菌の形質転換方法、
[2]
糸状菌が、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ムコール属、クモノスカビ属に属する糸状菌から選択される、[1]に記載の方法、
[3]
糸状菌が、アスペルギルス属に属する糸状菌から選択される、[1]又は[2]に記載の方法、
[4]
糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルウチウエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、又はアスペルギルス・サイトイである、[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法、
[5]
糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、又はアスペルギルス・オリゼである、[1]~[4]のいずれか1項に記載の方法、
[6]
プロモーターの改変が、プロモーターの一部の欠損である、[1]~[5]のいずれか1項に記載の方法、
[7]
選択マーカーが、pyrG遺伝子、pyrF遺伝子、adeA遺伝子、adeB遺伝子、argB遺伝子、niaD遺伝子、sC遺伝子、amdS遺伝子、trpC遺伝子、leu2遺伝子、bioDA遺伝子、ptrA遺伝子、又はbenA遺伝子である、[1]~[6]のいずれか1項に記載の方法、
[8]
選択マーカーが、pyrG遺伝子である、[1]~[6]のいずれか1項に記載の方法、
[9]
プロモーターの40%、60%又は80%の長さ以上の配列が欠損している、[1]~[8]のいずれか1項に記載の方法、
[10]
プロモーターの長さを250bp、200bp、150bp、100bp、80bp、又は60bp以下にまで欠損させた[1]~[8]のいずれか1項に記載の方法、
[11]
形質転換に用いる遺伝子が、発現カセット、そして選択マーカー遺伝子の順で連結されている、[1]~[10]のいずれか1項に記載の方法。
また、本発明は、上記の方法で取得した形質転換体、及びその形質転換体を用いて標的タンパク質を製造する方法にも関する。
また、本方法は、これまでに知られている糸状菌への遺伝子の多コピー挿入方法に比べて、汎用性が高く、実用性に優れる。
プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子とは、選択マーカーの機能発現に十分な転写活性を有するプロモーターから任意の領域の遺伝子配列を欠失、置換すること、あるいは任意の遺伝子配列を挿入すること等によって、プロモーターの機能を低下させ、それによってコード領域の遺伝子の転写量が低下することで、コード領域の発現量が低下した選択マーカー遺伝子のことである。ここでいう「選択マーカーの機能発現に十分な転写活性を有するプロモーター」とは、該選択マーカー遺伝子が染色体上へ1コピーのみ挿入されることにより選択培地での生育(選択マーカーの機能発現)が可能となるために必要な転写活性を有するプロモーターのことである。
ラーゼ等のレポータータンパク質を用いて、各プロモーター下で発現させたレポータータンパク質の活性を比較することで調べることができる(Eukaryot Cell.,7(1),28-37,2008)。
本発明で形質転換に用いる遺伝子は、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子、高発現させたい標的遺伝子、標的遺伝子を発現させるためのプロモーター及びターミネーターを連結することによって構成される。本発明で使用する標的遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されないが、高発現プロモーターであることが望ましく、例えば、プロモーターとしては、翻訳伸長因子であるTEF1遺伝子(tef1)のプロモーター領域、α-アミラーゼ遺伝子(amy)のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子(alp)のプロモーター領域、及びグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(gpd)のプロモーター領域などが挙げられる。また、本発明で使用する標的遺伝子を発現させるためのターミネーターは、その宿主で機能し得る限り特に限定されないが、例えば、α-アミラーゼ遺伝子(amy)のターミネーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子(alp)のターミネーター領域等が挙げられる。なお、標的遺伝子を発現させるための発現カセットには、標的遺伝子のコード領域、プロモーター、ターミネーター以外にも、分泌シグナル配列や翻訳エンハンサー配列、オルガネラ局在配列等の遺伝子も含みうる。
本発明で形質転換に使用できる宿主細胞は糸状菌であれば特に限定されないが、例えば、アスペルギルス属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ペニシリウム属(Penicillium)、フザリウム(Fusarium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ムコール(Mucor)属、クモノスカビ(Rhizopus)属などに属する糸状菌が挙げられる。
ルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルウチウエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・サイトイ等が挙げられる。
本発明における形質転換体は、使用する選択マーカー遺伝子がコードする蛋白質の機能が欠損している任意の糸状菌に対し、上記のプロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と、標的遺伝子の発現カセット等で構成された遺伝子を用いて形質転換を行うことによって取得できる。
目的としている蛋白質や2次代謝産物を製造するためには、本発明を用いて取得した、目的物質の生産に必要な遺伝子が多コピーで挿入された形質転換体を培養し、前記培養物から目的物質を抽出すればよい。
(1)プロモーターを短縮した改変型pyrG1~3遺伝子の取得
配列番号1は、従来Aspergillus sojaeにおいて使用されていたpyrGマーカー遺伝子の配列である(WO2014/126186参照)。配列番号1のpyrGマーカー遺伝子はプロモーター領域407bp、コード領域896bp及びターミネーターを含む535bpの領域で構成されており、この全長1838bpの配列が染色体上に1コピー挿入されることで、ウリジン/ウラシル要求性の形質を相補できることがわかっている。
染色体上にどのくらい遺伝子が挿入されたかを検証するためのレポーター遺伝子として、グルコース脱水素酵素(GDH)遺伝子(特許第4648993号公報の配列番号4参照)を用いた。糸状菌で発現させたGDHは後述の活性測定方法により容易にその活性を測定することができる。
WO2014/126186と同様にして、A.sojae NBRC4239株の染色体DNAを鋳型として、レポーター遺伝子(GDH遺伝子)を発現させるためのtef1プロモーター(Ptef)領域およびアルカリプロテアーゼ遺伝子alpのターミネーター(Talp)領域をPCR反応により増幅させた。また、レポーター遺伝子であるGDH遺伝子は特許文献WO2012/169512号公報のpYES2C-MpプラスミドDNAを鋳型にして、配列番号9、10のプライマーを用いてPCR反応により増幅させた。次に、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社)を用いて、キットに付属されている直鎖状pUC19、Ptef、GDH遺伝子、Talp、及びpyrG遺伝子(配列番号1)、pyrG1遺伝子(配列番号2)、pyrG2遺伝子(配列番号3)、pyrG3遺伝子(配列番号4)のDNA断片をそれぞれ連結した。これにより、pUC19のマルチクローニングサイトにPtef-GDH-Talp-pyrG、Ptef-GDH-Talp-pyrG1、Ptef-GDH-Talp-pyrG2、Ptef-GDH-Talp-pyrG3がそれぞれ挿入された形質転換用プラスミドp19-GDH-pyrG、p19-GDH-pyrG1、p19-GDH-pyrG2、p19-GDH-pyrG3を取得した。
上記で取得した形質転換用プラスミドp19-GDH-pyrG、p19-GDH-pyrG1、p19-GDH-pyrG2、p19-GDH-pyrG3を用いて、A.sojaeのpyrG遺伝子破壊株(pyrG遺伝子の上流48bp、コード領域896bp、下流240bp欠損株)に対しプロトプラストPEG法により形質転換を行い、A.sojae形質転換株As-pyrG株を48株、As-pyrG1株を23株、As-pyrG2株を26株、As-pyrG3株を18株取得した。
100mM リン酸緩衝液(pH7.0)2.05mL、1M D-グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液 0.15mLを混合し、37℃で5分間保温する。次いで、15mM PMS溶液 0.1mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD-グルコース存在下で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義する。
上述のように、プロモーターを短縮した選択マーカーを用いることで効率よく遺伝子を多コピーで挿入できることがA.sojaeにおいて確認された。そこで、本方法が他の糸状菌でも応用可能であるかどうかを検証するため、A.oryzae RIB40株のpyrG遺伝子破壊株に対し、上記のp19-GDH-pyrG、p19-GDH-pyrG3を用いて形質転換を行った。そして、取得した形質転換体Ao-pyrG株、Ao-pyrG3株をGPY培地において30℃で3日間培養した後、培養液中のペレット状の菌体をヒスコトロンでせん断し、マルチビーズショッカーによりさらに菌体を破砕した。この菌体破砕液を遠心し、上清を回収することでAo-pyrG株、Ao-pyrG3株の粗酵素液を取得した。そして、これらの粗酵素液のGDH活性を測定することで、Ao-pyrG株、Ao-pyrG3株におけるGDH生産量(U/mL culture)を算出した(表2)。
(1)プロモーターを短縮した改変型adeA1~3遺伝子の取得
上述のように、プロモーターを短縮し、転写量を低下させたpyrGマーカーを用いることで効率よく遺伝子を多コピーで挿入できることがA.sojae及びA.oryzaeにおいて確認された。そこで、pyrG以外の選択マーカーでも同様の効果が得られるかどうかを検証した。具体的には、pyrGマーカーと同様、糸状菌の選択マーカーとしてよく用いられているadeAマーカー(FEMS Microbiol Lett.,239(1),79-85,2004)を用いて、プロモーターを短縮し、選択マーカー遺伝子の発現量を低下させることによる標的遺伝子の多コピー挿入効果を検証することにした。配列番号11はA.sojae NBRC4239由来のadeAマーカー遺伝子の配列であり、プロモーター領域642bp、コード領域1128bp及びターミネーターを含む241bpで構成されている。この全長2011bpのadeAマーカー遺伝子の配列が染色体上に1コピー挿入されることで、アデニン要求性であるA.sojae NBRC4239のadeA遺伝子破壊株(adeA遺伝子の上流258bp、コード領域1128bp、下流83bp欠損株)の形質を相補できることがわかっている。
染色体上にどのくらい遺伝子が挿入されたかを検証するためのレポーター遺伝子としては上記と同様グルコース脱水素酵素(GDH)遺伝子を用いた。In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社)を用いて、上記と同様にして、pUC19、遺伝子、Ptef、遺伝子、GDH遺伝子、Talp遺伝子、adeA1遺伝子(配列番号12)、adeA2遺伝子(配列番号13)、adeA3遺伝子(配列番号14)のDNA断片をそれぞれ連結した。これにより、pUC19のマルチクローニングサイトにPtef-GDH-Talp-adeA1、Ptef-GDH-Talp-adeA2、Ptef-GDH-Talp-adeA3がそれぞれ挿入された形質転換用プラスミドp19-GDH-adeA1、p19-GDH-adeA2、p19-GDH-adeA3を取得した。
上記で取得した形質転換用プラスミドp19-GDH-adeA1、p19-GDH-adeA2、p19-GDH-adeA3を用いて、A.sojae NBRC4239のadeA遺伝子破壊株(adeA遺伝子の上流258bp、コード領域1128bp、下流83bp欠損株)に対しプロトプラストPEG法により形質転換を行い、As-adeA1株を19株、As-adeA2株を12株、As-adeA3株を7株取得した。
(1)レポーター遺伝子発現カセットとadeAマーカー由来のプロモーター領域を連結したpyrGマーカーを含む形質転換用ベクターの作製
上記のとおり、pyrGマーカー、adeAマーカーのどちらの選択マーカーにおいても、自身のプロモーター領域を短縮化することでプロモーター活性を低下させ、結果的に選択マーカータンパク質の発現量を低下させることで、任意の標的遺伝子を多コピー挿入できることがわかった。任意の標的遺伝子を多コピー挿入するためには、選択マーカータンパク質の発現量を低下させることが重要であり、そのための方策としては、該選択マーカー遺伝子自身のプロモーター領域を短縮化する方法以外にも、プロモーター活性が弱いことがわかっている別の遺伝子由来のプロモーターに置換する方法も考えうる。そこで、pyrGマーカー遺伝子のプロモーター領域(643bp)を全て欠損させ、pyrGマーカー遺伝子のコード領域の上流にAs-adeA3由来のプロモーター(80bp)を連結させた改変型pyrGマーカー遺伝子(pyrG4、配列番号19)を作製した。次に、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社)を用いて、上記と同様にして、pUC19、Ptef、GDH遺伝子、Talp、pyrG4遺伝子(配列番号19)のDNA断片をそれぞれ連結した。これにより、pUC19のマルチクローニングサイトにPtef-GDH-Talp-pyrG4が挿入された形質転換用プラスミドp19-GDH-pyrG4を取得した。
上記で取得した形質転換用プラスミp19-GDH-pyrG4を用いて、A.sojaeのpyrG遺伝子破壊株(pyrG遺伝子の上流48bp、コード領域896bp、下流240bp欠損株)に対しプロトプラストPEG法により形質転換を行い、As-pyrG4株を32株取得した。
トン、0.5%酵母エキス、0.5%リン酸2水素1カリウム、0.05%硫酸マグネシウム・7水和物)に植菌し、30℃で3日間培養した。培養後の菌体を濾紙で上に回収した後、よく吸引濾過により水分を取って取り除き、湿菌体重量50mgの菌体をチューブに入れた。これを、液体窒素で凍結させてマルチビーズショッカーにより破砕し、破砕した菌体に1mLの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を加え、遠心分離後の上清を回収することで菌体破砕液を調製した。この菌体破砕液のGDH活性を下記の測定方法に従って測定し、50mg菌体あたりのGDH活性を算出した。その後、上記と同様にして1コピー株のGDH活性値を基に、As-pyrG4株のコピー数を算出した。
(1)レポーター遺伝子発現カセットとaプロモーター領域を持たないpyrGマーカーを含む形質転換用ベクターの作製
実施例4より、プロモーター活性が著しく低いadeA3マーカーを用いても多コピー遺伝子の挿入が可能であった。このことから、プロモーター領域を持たない選択マーカー遺伝子も多コピー挿入のために使用できる可能性が考えられた。そこで、pyrGマーカー遺伝子のプロモーター領域(643bp)を全て欠損させた改変型pyrGマーカー遺伝子(pyrG5、配列番号20)を作製した。次に、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社)を用いて、上記と同様にして、pUC19、Ptef、GDH遺伝子、Talp、pyrG5遺伝子(配列番号20)のDNA断片をそれぞれ連結した。これにより、pUC19のマルチクローニングサイトにPtef-GDH-Talp-pyrG5が挿入された形質転換用プラスミドp19-GDH-pyrG5を取得した。
上記で取得した形質転換用プラスミp19-GDH-pyrG5を用いて、A.sojaeのpyrG遺伝子破壊株(pyrG遺伝子の上流48bp、コード領域896bp、下流240bp欠損株)に対しプロトプラストPEG法により形質転換を行い、As-pyrG5株を19株取得した。
Claims (11)
- 下記工程:
コードする蛋白質の機能が欠損している選択マーカー遺伝子を含む宿主糸状菌を提供すること、
標的遺伝子の、コード領域、プロモーター及びターミネーターを含む発現カセット、及びプロモーターを改変することで発現量を低下させた選択マーカー遺伝子を用いて、該宿主糸状菌を形質転換すること、
選択マーカー遺伝子を用いて選択培地で生育可能な形質転換体を選択することを含む、糸状菌の形質転換方法。 - 選択する形質転換体が、標的遺伝子が複数コピー挿入された形質転換体である、請求項1に記載の方法。
- 糸状菌が、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ムコール属、クモノスカビ属に属する糸状菌から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 糸状菌が、アスペルギルス属に属する糸状菌から選択される、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー 、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルウチウエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、又はアスペルギルス・サイトイである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、又はアスペルギルス・オリゼである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカーが、pyrG遺伝子、pyrF遺伝子、adeA遺伝子、adeB遺伝子、argB遺伝子、niaD遺伝子、sC遺伝子、amdS遺伝子、trpC遺伝子、leu2遺伝子、bioDA遺伝子、ptrA遺伝子、又はbenA遺伝子である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカーが、pyrG遺伝子もしくはadeA遺伝子である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子のプロモーターの長さを250bp以下にまで欠損させた請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の方法で取得した形質転換体。
- 請求項10に記載の形質転換体を用いて標的タンパク質を製造する方法。
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