JP2022104998A - アミロイド沈着疾患を治療するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】既存のアミロイド沈着物を除去するのに有効で、ＡＬＡ患者の予後を改善する治療方法、および医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明は、キメラ（例えば、マウス－ヒト）抗体を使用してアミロイド沈着疾患を治療する方法および医薬組成物に関し、キメラ抗アミロイド原線維抗体を含む医薬組成物を投与して、心臓関与を含むアミロイド沈着疾患を治療する方法を含む。該方法は、心臓関与を含む軽鎖アミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能を、処置から３週間以内に改善することができる。【選択図】図１

Description

［ＥＦＳ－ＷＥＢを介して提出された配列表の参照］
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含み、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。「８４４１－０００９－１＿ＳＴ２５」と題するこの配列表のＡＳＣＩＩファイルは、２０１８年６月１５日に作成され、その大きさは１７．４ｋｂである。

［政府の権利］
本発明は、米国食品医薬品局によって授与されたＦＤ－Ｕ－００５１１０の助成金の下、米国連邦政府の支援を受けてなされた。したがって、米国連邦政府は、本明細書および特許請求の範囲に記載の本発明において、一定の権利を有する。

［優先権の主張］
本出願は、２０１７年８月１日に出願された米国特許仮出願第６２／５３９，８２１号および２０１８年３月２日に出願された米国特許仮出願第６２／６３７，６０９号の優先権を主張するものであり、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、アミロイド沈着疾患、特に原発性アミロイドーシス（ＡＬ）を治療するのに有用なヒト化およびキメラ（例えば、マウス－ヒト）抗体およびその抗原結合断片、該抗体を含む医薬組成物、ならびに該抗体および医薬組成物を使用してアミロイド沈着疾患を治療する方法に関する。さらに、本発明は、アミロイド原線維反応性抗体でアミロイド沈着疾患を治療する方法に関する。特に、本発明は、心臓関与（すなわち、心臓内または心臓周囲のアミロイド沈着）を含むアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能を改善する方法に関する。このような患者は、軽鎖λアミロイドまたは軽鎖κアミロイドを含むＡＬＡ沈着物を有し得る。さらに、患者は、血液学的に制御されたまたは制御されていない疾患を有し得る。

以下の説明は、単に読者の理解を助けるために提供されるものであり、先行技術を説明または構成することを認めるものではない。

天然抗体は、通常、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド結合によって重鎖に連結している。重鎖間の追加のジスルフィド結合の数は、様々な抗体アイソタイプによって異なる。最も単純なアイソタイプはＩｇＧであり、これは２つの軽鎖および２つの重鎖のみを含み、２つの重鎖が２つのジスルフィド結合によって連結されている。各重鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、いくつかの隣接定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、他端に定常ドメインを有する。該抗体の軽鎖および重鎖の各可変ドメインは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントを含む。軽鎖の各ＣＤＲは、隣接重鎖の対応するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位を形成する。軽鎖には、その定常領域に応じて、κとλの２つの主要なタイプがある。κとλの両方の軽鎖は、様々な重鎖タイプのいずれかと結合し得る。

原発性アミロイドーシスとも呼ばれるアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬアミロイドーシス、ＡＬまたはＡＬＡ）は、米国で最も一般的な形の全身性アミロイドーシスである。「アミロイドーシス」という用語は、共通の特徴、すなわち臓器および組織における病的不溶性原線維タンパク質の細胞外沈着を共有する疾患のクラスターを指す（Ｒｏｄｎｅｙら、ＮＥＪＭ、２５：８９８）。アミロイドーシスは、人の抗体産生細胞の機能不全によって引き起こされ、異常なタンパク質線維の産生を引き起こし、これが凝集して臓器および組織に不溶性アミロイド沈着物を形成する。アミロイドーシスの種類は、原線維沈着物を形成する前駆体タンパク質の性質によって決定される。原発性アミロイドーシスでは、原線維が免疫グロブリン軽鎖の断片を含み、続発性アミロイドーシスでは、原線維がアミロイドＡタンパク質を含む。アミロイドーシスの現代の分類は、原線維沈着物を形成する前駆体血漿タンパク質の性質に基づいている。

前駆体血漿タンパク質は多様であり、無関係である。それにもかかわらず、全ての前駆体沈着物は、原線維沈着物の典型的な染色特性を担う共通の典型的なβプリーツシート構造を共有するアミロイド沈着物を生成する。アミロイドーシスの発症の最終段階は、患者の臓器へのアミロイド原線維の沈着である。アミロイドーシスの死亡率は高く、現在の５年生存率は約２８％である。

これまで、ＡＬの治療は、従来のまたは高用量の細胞傷害性化学療法を通して機能不全細胞を攻撃することにより、アミロイド形成前駆体軽鎖の合成を減らすことに向けられてきた。しかしながら、この治療法には２つの欠点がある。第一に、原線維沈着物は通常、かなりの沈着が起こるまで無症候性である。したがって、既にかなりの沈着物が生じてしまう前に治療が行われる可能性が低い。第二に、この治療はせいぜい前駆体異常タンパク質の産生を停止するのに最も有効なだけであり、既存の沈着物を除去するのに有効ではなく、ＡＬ患者の予後は病的沈着物の持続（または進行）のために非常に悪いままである（Ｓｏｌｏｍｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２：２６９）。

結果として、アミロイド沈着物の治療的標的化およびクリアランスは、医学的に極めて興味深い領域である。しかしながら、ＦＤＡはこれまでこのような治療用製品を承認していないため、未だに満たされていない重要な医学的必要性がある。本明細書に記載の組成物および方法は、この必要性を満たす。

本明細書に、アミロイド沈着疾患、特に原発性（ＡＬ）アミロイドーシスを治療するための組成物および方法を記載する。本明細書に記載の組成物および方法は、アミロイド原線維（例えば、アミロイド軽鎖原線維）に特異的に結合して免疫系によるクリアランスのために原線維を標的化するヒト化またはキメラ抗体またはその断片を使用する。

一態様において、本組成物および方法は、アミロイド沈着疾患、特に原発性（ＡＬＡ）アミロイドーシスの治療に有用なヒト化またはキメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号４７を含むＶ_Ｋ領域と配列番号４８を含むＶ_Ｈ領域とを有する。いくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、そのマウス同等物よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号３６のＶ_Ｋ領域および配列番号３５のＶ_Ｈ領域を含むマウス抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維のβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する。また、いくつかの実施形態において、該抗体は、インビボでκおよびλアミロイド原線維に結合する。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のヒト化またはキメラ抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。

本方法および医薬組成物で有用なキメラ抗体は、ベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００の哺乳動物細胞へのコトランスフェクション、またはスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４の哺乳動物細胞へのトランスフェクションによって産生されてもよい。いくつかの実施形態において、ベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションまたはスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４のトランスフェクションは、ＣＯＳ細胞で起こる。産生された抗体は、「キメラ１１－１Ｆ４抗体」と呼ぶ。

別の態様において、本発明は、アミロイド沈着疾患および／または疾患の症状を治療または改善する治療上有効量の本明細書に記載の抗体または断片の少なくとも１つを、該治療または改善を必要とするヒト患者に投与して、該治療を必要とするヒトの原発性（ＡＬ）アミロイドーシスなどのアミロイド沈着疾患を治療または改善するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体と薬学的に許容される担体とが投与されてもよい。

いくつかの実施形態において、アミロイド沈着疾患は、原発性アミロイドーシスである。いくつかの実施形態において、該抗体は、約５００ｍｇ／ｍ^２以下の用量で投与される。いくつかの実施形態において、キメラ１１－１Ｆ４抗体の有効用量は、約２２００ｍｇである。また、いくつかの実施形態において、有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである。

いくつかの実施形態において、原発性アミロイドーシスは、心臓、腎臓、肝臓、肺、消化管、神経系、筋肉骨格系、軟部組織および皮膚からなる群から選択される少なくとも１つの臓器または組織の関与を含む。

いくつかの実施形態において、アミロイドーシスが心臓に発症している場合、患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルは、該抗体の投与後にベースラインレベルと比較して少なくとも約３０％または約４０％低下し得る。いくつかの実施形態において、患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルは、該抗体の投与後に約９１００ｎｇ／Ｌ未満、約８０００ｎｇ／Ｌ未満、約７０００ｎｇ／Ｌ未満、約６０００ｎｇ／Ｌ未満、または約５０００ｎｇ／Ｌ未満に低下し得る。いくつかの実施形態において、患者は、該抗体の投与前にニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類クラスＩＩまたはＩＩＩに分類され、該抗体の投与後にクラスＩに分類される。

いくつかの実施形態において、アミロイドーシスが腎臓に発症している場合、患者の尿タンパク質レベルは、該抗体の投与後にベースラインレベルと比較して少なくとも約３０％または約４０％低下し得る。いくつかの実施形態において、患者の尿タンパク質は、該抗体の投与後に約７０００ｍｇ／２４時間未満、約６０００ｍｇ／２４時間未満、約５０００ｍｇ／２４時間未満、または約４０００ｍｇ／２４時間未満に減少し得る。

いくつかの実施形態において、該抗体の投与は、深刻な有害事象を引き起こさない。

本発明は、心臓関与を含むＡＬＡを治療する方法を提供する。本明細書に記載の方法は、治療開始の約３週間以内に、極めて短い平均余命のために治療不能と以前は考えられていた患者集団で、有益な臨床結果を独自に提供することができる。

一態様において、本発明は、心臓関与を含むアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能を改善する方法を提供する。本方法は、治療上有効量のヒト化またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を、心臓関与を含むＡＬＡと診断された患者に投与するステップを含む。該抗体または抗原結合断片は、配列番号５２を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１と、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２と、配列番号５４を含むＣＤＲＨ３とを有する可変重鎖（Ｖ_Ｈ）、および配列番号４９を含むＣＤＲＬ１と、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２と、配列番号５１を含むＣＤＲＬ３とを有する可変軽鎖（Ｖ_Ｋ）、を含む。これにより、該抗体またはその抗原結合断片の投与から約３週間以内に患者の心筋機能が改善する。

別の態様において、本発明は、心臓関与を含む軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能の改善を監視する方法を提供する。本方法は、治療上有効量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片の患者への投与から約３週間以内に、心臓関与を含むＡＬＡと診断された患者の心筋機能の改善を観察するステップを含む。

別の態様において、本発明は、患者の心臓関与を含むアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）を治療する方法を提供する。本方法において、ＡＬＡは、血液学的に制御されていない。本方法は、治療上有効量のヒト化またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を、心臓関与および血液学的制御の欠如を特徴とするＡＬＡを有する患者に投与するステップを含む。該抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５２を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１と、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２と、配列番号５４を含むＣＤＲＨ３とを有する可変重鎖（Ｖ_Ｈ）、および配列番号４９を含むＣＤＲＬ１と、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２と、配列番号５１を含むＣＤＲＬ３とを有する可変軽鎖（Ｖ_Ｋ）を含む。

上述した態様のいくつかの実施形態において、該抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体であってもよい。また、いくつかの実施形態において、該抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体であってもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、該抗体または抗原結合断片のＶ_Ｋ領域は、配列番号４７を含んでもよく、Ｖ_Ｈ領域は、配列番号４８を含んでもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、該抗体または抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を含んでもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、本方法は、該抗体またはその抗原結合断片の投与から少なくとも３ヶ月持続する心筋機能の改善を提供してもよい。いくつかの実施形態において、改善は、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、またはそれ以上の期間持続してもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、該抗体またはその抗原結合断片は、３ヶ月の期間内に１回、２回、３回、または４回以下で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、該抗体または抗原である断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｅｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、さらに少なく、例えば、２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回投与されてもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、本方法は、治療前の長軸方向のグローバルストレイン（ｇｌｏｂａｌ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ、ＧＬＳ）レベルと比較したＧＬＳの改善を含み得る心筋機能の改善を提供する。

上述した態様のいくつかの実施形態において、患者は、６５０ｐｇ／ｍＬ超の治療前ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルを示す。

上述した態様のいくつかの実施形態において、治療上有効用量または量の抗体または抗体断片は、患者の治療前ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルと比較して約３００ｐｇ／ｍＬ以上の治療後ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルの低下を引き起こすのに有効である。いくつかの実施形態において、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの減少量は、約４００ｐｇ／ｍＬ以上、約５００ｐｇ／ｍＬ以上、約６００ｐｇ／ｍＬ以上、約７００ｐｇ／ｍＬ以上、約８００ｐｇ／ｍＬ以上、約９００ｐｇ／ｍＬ以上、または約１０００ｐｇ／ｍＬ以上であり得る。

上述した態様のいくつかの実施形態において、本方法は、治療前ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルと比較して約３０％以上の治療後ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルの低下を含み得る心筋機能の改善を提供する。

上述した態様のいくつかの実施形態において、患者は、再発性または難治性ＡＬＡを患っていてもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、ＡＬＡは、軽鎖λアミロイド心臓関与を含むとしてさらに特徴付けられてもよい。また、いくつかの実施形態において、ＡＬＡは、軽鎖κアミロイド心臓関与を含むとしてさらに特徴付けられてもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、ＡＬＡは、血液学的に制御され得ない。例えば、対象の血清中の関与する遊離軽鎖と関与しない遊離軽鎖との差は、４０ｍｇ／Ｌ超であってもよく、または対象が血液もしくは血清中に検出可能なレベルの毒性アミロイド前駆体タンパク質を有してもよい。

上述した態様のいくつかの実施形態において、本方法は、化学療法化合物を患者に投与するステップをさらに含んでもよい。

別の態様において、本発明は、標識抗体またはその抗原結合断片を投与し、患者における標識の存在を検出して、アミロイド沈着疾患を有する疑いがある患者のアミロイド沈着疾患を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、標識は、^１２４Ｉなどの放射標識であってもよいが、当業者によって他の種類の標識が容易に想起され得る。

別の態様において、本発明は、アミロイド沈着疾患を有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、治療上有効量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片を、１ヶ月に１回よりも少ない頻度で患者に投与するステップを含む。例えば、いくつかの実施形態において、治療は、患者に治療上有効量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体または抗原結合断片を、２ヶ月に１回のみ、３ヶ月に１回のみ、４ヶ月に１回のみ、５ヶ月に１回のみ、６ヶ月に１回のみ、７ヶ月に１回のみ、８ヶ月に１回のみ、９ヶ月に１回のみ、１０ヶ月に１回のみ、１１ヶ月に１回のみ、または１年に１回のみ投与することを要してもよい。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を含む。

本態様のいくつかの実施形態において、アミロイド沈着疾患は、原発性軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスであり、疾患がλ軽鎖原線維の凝集体を含んでもよい。いくつかの実施形態において、λ軽鎖原線維の凝集体の存在は、該抗体の投与後に大幅に減少する。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体または抗原結合断片の治療上有効量は、５００ｍｇ／ｍ^２以下である。また、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体または抗原結合抗体断片の治療上有効量は、約２２００ｍｇである。また、いくつかの実施形態において、治療上有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである。

本態様のいくつかの実施形態において、治療上有効量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂまたは抗原結合断片は、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、または６ヶ月に１回投与される。いくつかの実施形態において、治療上有効量のキメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂまたは抗原結合断片は、半年ごとに、または１年に１回のみ投与される。

別の態様において、本発明は、心臓に関与する原発性軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、治療前レベルと比較してキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与後の患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルの少なくとも３０％の低下を引き起こすのに有効な用量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体を、患者に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、ＡＬアミロイドーシスは、難治性である。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を含む。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、１ヶ月に１回投与される。また、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、１週間に１回投与される。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の治療上有効量は、５００ｍｇ／ｍ^２以下である。また、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の治療上有効量は、約２２００ｍｇである。また、いくつかの実施形態において、有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである。

本態様のいくつかの実施形態において、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの減少は、キメラ１１－１Ｆ４抗体の投与から少なくとも約６ヶ月間患者で持続する。

別の態様において、本発明は、腎臓に関与する原発性軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、治療前レベルと比較してヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与後の患者のタンパク尿の少なくとも４０％の減少を引き起こすのに有効な用量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体または抗原結合抗体断片を、患者に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、ＡＬアミロイドーシスは、難治性である。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を含む。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、１ヶ月に１回投与される。また、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、１週間に１回投与される。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の治療上有効量は、５００ｍｇ／ｍ^２以下である。また、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の治療上有効量は、約２２００ｍｇである。また、いくつかの実施形態において、治療上有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである。

本態様のいくつかの実施形態において、タンパク尿の減少は、キメラ１１－１Ｆ４抗体の投与から少なくとも約６ヶ月間患者で持続する。

別の態様において、本発明は、κまたはλ軽鎖原線維凝集体沈着物の量の減少を必要とする患者の該量を減少させる方法を提供する。本方法は、（ａ）配列番号４７を含むＶ_Ｋ領域、（ｂ）配列番号４８を含むＶ_Ｈ領域、および（ｃ）ヒトＩｇＧ１定常領域を有する抗体を、ある用量で患者に投与するステップを含む。該用量は、抗体の投与は、患者のκまたはλ軽鎖原線維凝集体沈着物の量を減少させるのに有効である。

本態様のいくつかの実施形態において、原発性アミロイドーシスは、λ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる。また、いくつかの実施形態において、原発性アミロイドーシスは、κ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる。また、他の実施形態において、原発性アミロイドーシスは、κおよびλ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、１ヶ月に１回投与される。また、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、１週間に１回投与される。

本態様のいくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の治療上有効量は、５００ｍｇ／ｍ^２以下である。また、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の治療上有効量は、約２２００ｍｇである。また、いくつかの実施形態において、治療上有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである。

別の態様において、本発明は、ＡＬアミロイドーシスを治療する方法を提供する。本方法は、１１－１Ｆ４抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むモノクローナルを、ＡＬアミロイドーシスを有する患者に投与するステップを含む。本方法において、該抗体は、マウス１１－１４Ｆではない。

本態様のいくつかの実施形態において、該抗体は、マウス－ヒトキメラ抗体であってもよい。

本態様のいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。

上述した方法のいくつかの実施形態のいずれかにおいて、患者の臓器機能不全は、該抗体の投与後に減少する。上述した方法のいくつかの実施形態のいずれかにおいて、患者は、処置後５週間未満、時には処置後４週間未満、時には処置後３週間未満、時には処置後２週間未満で治療反応の徴候を示す。また、いくつかの他の実施形態において、患者は、処置後約１週間以内に治療反応の徴候を示す。

上述した一般的な説明および以下の詳細な説明は例示的および説明的であり、本発明のさらなる説明を提供することを意図している。

ハイブリドーマ細胞株からマウスＶ_ＨおよびＶ_Ｋ遺伝子をクローニングするために使用される戦略を概説する図である。 マウス１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｈ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号３９および配列番号３５）のリストである。 マウス１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｋ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号４０および配列番号３６）のリストである。 免疫グロブリンκ軽鎖発現ベクターｐＫＮ１００のマップである。これはｐＳＶ２ベクター断片からなり、ＳＶ４０初期プロモーターおよび不完全ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０複製起点およびＣｏ１Ｅ１複製起点を有する。これはまた、アンピシリン耐性遺伝子およびｎｅｏ遺伝子を有する。不完全ＳＶ４０後期プロモーターがｎｅｏ遺伝子を駆動する。これはまた、ＨＣＭＶｉプロモーター、免疫グロブリン可変領域遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイト（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む）、およびκ軽鎖発現カセットと同じ配向にあるｓｐａＣ２終結シグナル配列（「Ａｒｎｉｅ」）によって終結するヒトκ定常領域遺伝子のｃＤＮＡを有する。 免疫グロブリンγ１重鎖発現ベクターｐＧ１Ｄ２００のマップである。これはｐＳＶ２ｄｈｆｒベクター断片からなり、ＳＶ４０初期プロモーターおよび不完全ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０複製起点およびＣｏ１Ｅ１複製起点を有する。これはまた、アンピシリン耐性遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子を有する。不完全ＳＶ４０後期プロモーターがｄｈｆｒ遺伝子を駆動する。結果として、発現が低い。これにより、比較的低レベルのメトトレキサートを使用して、多重遺伝子／高発現レベルのクローンを選択することができる。これはまた、ＨＣＭＶｉプロモーター断片、マルチクローニングサイト、ヒトγ１定常領域遺伝子（イントロン（－））のｃＤＮＡ、続いてｓｐａＣ２終結シグナル配列（「Ａｒｎｉｅ」）を有する。 改変マウス１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｋ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号４２および配列番号４７）ならびにＶ_Ｋ遺伝子を改変するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列（それぞれ配列番号４１および配列番号４３）のリストである。 改変マウス１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｈ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号４５および配列番号４８）ならびにＶ_Ｈ遺伝子を改変するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列（それぞれ配列番号４４および配列番号４６）のリストである。 アミロイド原線維結合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。キメラ１１－１Ｆ４抗体を含有するｃｏｓ細胞上清を、精製マウス１１－１Ｆ４抗体と共に同じＥＬＩＳＡプレートで別々に試験した。吸光度をＯＤ４０５で読み取った。新ｓｖ＝ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４。新コトランスフェクション＝１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００＋１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００。 マウス１１－１Ｆ４で処置したマウスにおけるヒトＡＬκおよびヒトＡＬλアミロイドーマのクリアランスを示す図である。マウスをマウス１１－１Ｆ４の単回投与（パネルＡ）または複数回投与（パネルＢ）で処置した。結果は、マウス１１－１Ｆ４がＡＬκアミロイドーマを迅速に除去することを示しているが、ほとんどの例で、ＡＬλアミロイドーマをマウスから除去するには複数回投与が必要であった。 キメラ１１－１Ｆ４の第１ａ／ｂ相試験の投与／評価スキームを示す図である。パネルＡは、第１ａ相のスキームを示し、パネルＢは、第１ｂ相のスキームを示す。パネルＣは、これらの試験で使用した用量を示す。 キメラ１１－１Ｆ４の投与がほとんどの患者の心臓機能の改善を提供することを示す図である。パネルＡは、第１ａ／ｂ相試験の結果を棒グラフで示し、パネルＢは、結果を箱ひげ図として示す。 ｃ１１－１Ｆ４抗体の第１ａ／ｂ相臨床試験中の例示的な患者の心臓反応（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）を示す図である。 キメラ１１－１Ｆ４の投与がほとんどの患者の腎臓機能の改善を提供することを示す図である。パネルＡは、第１ａ／ｂ相試験の結果を棒グラフで示し、パネルＢは、結果を箱ひげ図として示す。 キメラ１１－１Ｆ４抗体の第１ａ／ｂ相臨床試験中の例示的な患者の腎臓反応（タンパク尿）を示す図である。

図１５は、キメラ１１－１Ｆ４モノクローナル抗体による長軸方向のグローバルストレインの変化を示すグラフである。

図１６は、キメラ抗体による処置前に臓器反応がなく且つ化学療法に対する部分的な血液学的反応を有した患者におけるキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置時の臓器反応（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）を示すグラフである。

図１７は、キメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂによる処置後０週目および１２週目の心臓関与を含むアミロイドーシス患者の心エコー図である。

本発明によれば、アミロイド沈着疾患または疾患の症状を治療または改善するための該疾患を患っているヒトへの投与に有用なヒト化抗体、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒト抗体）またはその抗原結合断片を含む方法および組成物が提供される。本発明の抗体および抗体断片は、アミロイド沈着物に結合し、患者の免疫系を活性化して、結合した物質を除去しながら、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応をほとんどまたは全く生じさせない。また、本発明は、該抗体または抗体断片の少なくとも１つと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、ならびにアミロイドーシスおよびアミロイドーシスの症状を治療または改善する方法を提供する。該治療または改善方法において、患者の臓器からアミロイド沈着物の少なくとも一部を除去するのに有効な量の抗体または抗体断片を患者に投与して、アミロイド沈着疾患およびその症状を治療または改善する。

さらに、本発明によれば、アミロイド沈着疾患を治療する方法が提供される。特に、本発明は、心臓関与を含むアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能を改善することに関する。本方法は、アミロイド原線維沈着物、循環アミロイド、および毒性アミロイド前駆体タンパク質に結合するヒト化またはキメラ抗体（例えば、マウス－ヒト抗体）またはその抗原結合断片を、患者に投与するステップを含む。特に、本発明は、本明細書に記載のアミロイド原線維結合抗体を、心臓関与を含むＡＬＡと診断された患者に投与すると、治療前の長軸方向のグローバルストレイン（ＧＬＳ）レベルと比較して改善したＧＬＳ、および／または治療前ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルと比較したＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルの低下が得られることを示す。さらに、疾患が血液学的に制御されていない場合（すなわち、患者が循環中に検出可能なレベルの毒性アミロイド前駆体タンパク質を有する、または関与する遊離軽鎖と関与しない遊離軽鎖との差が４０ｍｇ／Ｌ超である場合）でも、疾患がκまたはλタンパク質の原線維を含むかどうかにかかわらず、患者を有効に治療することができる。

［定義］
本方法は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するために使用されるものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本技術の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

本明細書において使用される一定の用語は、以下の定義された意味を有し得る。本明細書および特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明確にそうでないと示さない限り、単数参照および複数参照を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、単一細胞ならびに複数の細胞（これらの混合物を含む）を含む。

本明細書において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を排除することを意図していない。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、組成物または方法にとって本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲に定義する組成物および実質的な方法ステップにおいて、他の成分の微量元素を超えるものを排除することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲に含まれる。したがって、方法および組成物は、追加のステップおよび成分を含む（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、あるいは重要でないステップおよび組成物を含む（～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ））、あるいは本明細書に記載の方法ステップまたは組成物のみからなる（～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ））ことができることを意図している。

本明細書において使用される「約（ａｂｏｕｔ）」は、その値からプラスまたはマイナス１０％を意味する。

本明細書において使用される「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、以下に記載する事象または状況が発生してもしなくてもよく、記載が、その事象または状況が発生する場合と発生しない場合を含むことを意味する。

本明細書において使用される「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」または「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ウシ、イヌ、ネコもしくはウマ）、またはヒトであり得る。好ましい実施形態において、個体、患者または対象は、ヒトである。

本明細書において使用される「単離抗体（ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、アミロイド原線維に特異的に結合する単離抗体は、アミロイド原線維に結合しない抗体を実質的に含まない）。ただし、アミロイド軽鎖原線維（例えば、κおよび／またはλ原線維）のエピトープに特異的に結合する単離抗体は、アミロイドＡ原線維などの他のタンパク質に対して交差反応性を有する場合があるが、該抗体は、好ましくは常にヒトアミロイド軽鎖原線維に結合する。典型的には、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。

本明細書において使用される「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」および「治療レベル（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌ）」という用語は、上記のような治療を必要とする対象に抗体が投与されて具体的な薬理学的効果を提供する、すなわち、ＡＬアミロイドーシスなどのアミロイド沈着疾患の効果または症状を軽減、改善または排除する、抗体用量または対象中の血漿濃度をそれぞれ意味する。薬物の治療上有効量または治療レベルは、たとえこのような投与量が当業者によって治療上有効量であるとみなされるとしても、本明細書に記載の状態／疾患の治療に常に有効とは限らないことが強調される。治療上有効量は、数ある因子の中でも、投与経路および剤形、対象の年齢および体重、ならびに／あるいは治療開始時のアミロイドーシスの種類および病期を含む対象の状態に基づいて変化する場合がある。

ＡＬアミロイドーシスなどのアミロイド疾患に関して本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、アミロイド斑または沈着物のクリアランスまたは分解を含むアミロイドーシスの１つまたは複数の症状または効果を軽減、改善または排除すること、疾患の影響を受ける臓器（例えば、心臓、腎臓、肝臓等）の臓器機能を改善すること、および患者の寿命または５年生存を増加させることを指すが、これらに限定されるものではない。

「治療反応（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、既存のアミロイド沈着物もしくは斑のサイズの減少、アミロイド沈着の速度の低下、または標準的な技術によって測定される臓器機能の改善などの、アミロイド疾患の少なくとも１つの尺度の改善を意味する。例えば、心臓にアミロイド沈着物を有する患者では、臓器機能の改善（すなわち、治療反応）が、患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）のレベルの低下または患者のニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類レベルの低下によって示され得る。腎臓にアミロイド沈着物を有する患者では、臓器機能の改善（すなわち、治療反応）が、尿中のタンパク尿またはタンパク質排出率の減少によって示され得る。

本明細書において使用される「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体のＣＤＲ、ならびにヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含む抗体を指す。ヒト化抗体は、人体におけるヒト化抗体の抗原性が低下するため、本発明による治療薬の治療上有効成分として有用である。

本明細書において使用される「心臓関与（ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）」は、アミロイド疾患を患っている患者が心臓にアミロイド沈着物を有することを意味する。心臓のアミロイド沈着物は、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの放出および患者の血液中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベル上昇をもたらす。本明細書では、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰが６５０ｐｇ／ｍＬ超である場合、患者は、心臓関与を含む。

本明細書において使用されるＡＬアミロイドーシスに関する「血液学的に制御されていない（ｎｏｔ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）」という記載は、疾患が完全寛解でも非常に良好な部分寛解でもないことを意味する。例えば、患者が循環（すなわち、血液もしくは血清）中に検出可能なレベルの毒性アミロイド前駆体タンパク質を有する場合、または関与する遊離軽鎖と関与しない遊離軽鎖との差が患者の血液もしくは血清中で４０ｍｇ／Ｌ超である場合、疾患は、血液学的に制御されていない。

本明細書において使用される「深刻な有害事象（ｓｅｒｉｏｕｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ）」という用語は、連邦規則２１巻第３１２．３２（ａ）章で定義されるように、死に至る、生命を脅かす、入院患者の入院もしくは既存の入院の延長を要する、または永続的もしくは顕著な外観の低下もしくは能力低下をもたらす不都合な医学的事象を意味する。

本明細書において使用される「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ－ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語は、例えば「Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」第１０版（２０１４）に記載されているように、患者に投与するために医薬化合物（例えば、キメラ抗体）と混和するための材料を意味する。

［抗ＡＬ抗体］
［［マウス抗原線維抗体］］
近年の動物研究では、マウス１１－１Ｆ４抗体およびＡＬ原線維に存在するβプリーツシート構造に共通のエピトープに対する他のマウス抗ヒト軽鎖特異的抗体を投与すると、ヒトＡＬκおよびＡＬλアミロイド沈着物が完全に分解されることが示されている。これらのマウス抗体のいくつかは、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１０５，５９４号（以下「５９４号特許」）明細書に記載されている。

マウス抗体は一般に、受容種がマウス抗体を抗原性として認識し、それに対する抗体を産生するために、他の動物種（ヒトなど）への投与には不適切である。ある種に由来する抗体が別の種に注入された場合の抗原性は、通常、定常ドメインの一部によって引き起こされる。このような抗原性応答は、マウス抗体の所望の治療効果を妨害または防止する。ヒトでは、この抗原性応答がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）と呼ばれる。５９４号特許に記載されている抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を介して、ヒトで高度に免疫原性である可能性がある。ＨＡＭＡ応答は通常、ヒトのレシピエントからのマウス抗体の急速なクリアランスをもたらすので、ＨＡＭＡはマウス抗体が有し得る潜在的なヒト治療上の利益を厳しく制限する。そのため、これらのマウス抗体は、患者におけるアミロイド原線維の沈着を停止または逆転させるための患者への投与に適さない。よって、本発明は、投与後の患者で免疫原性ＨＡＭＡ応答を生じる可能性が低いアミロイド沈着疾患を治療するための組成物および方法を提供する。

［［ヒト化およびキメラ抗原線維抗体］］
本発明は、アミロイドーシスを治療するためのヒト化およびキメラ抗体またはその抗原結合断片を提供する。典型的には、抗体は、重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーと軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つのコピーとを含む４つのポリペプチドからなる。典型的には、各重鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ_Ｈ）領域および３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含み、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ_ＬまたはＶ_Ｋ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。また、該抗体の軽鎖および重鎖の各可変ドメインは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントを含む。軽鎖の各ＣＤＲは、隣接重鎖の対応するＣＤＲと共に、該抗体の抗原結合部位を形成する。軽鎖と重鎖の各ペアの可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。その一方で、定常領域は、構造的支持を提供し、抗原結合によって開始される免疫応答を調節する。

キメラ抗体は、非ヒト抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に組み込んでいる。例えば、キメラ１１－１Ｆ４は、ヒトＩｇＧ１などのヒト抗体のＦｃ領域と共にマウス可変領域を発現させることによって作成されてもよい。

非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、ヒト化型の非ヒト（例えばマウス）抗体を得ることができる。一般に、ヒト化抗体は、１つまたは２つ以上の可変ドメインを含んでもよい。ここで、可変領域が非ヒト免疫グロブリンに由来し、フレームワーク領域（ＦＲ）がヒト免疫グロブリン配列に対応する。よって、いくつかの実施形態において、ヒト化抗ＡＬ抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。該抗体は、既知の技術によって調製することができる。

マウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体は、アラン・ソロモン医学博士（米国テネシー州ノックスビル市のテネシー大学医療科学センター）に寄託されたＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞によって産生される抗ＡＬ抗体である。ハイブリドーマ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ－１０５）から入手可能である。１１－１Ｆ４抗体のＶ_Ｋ領域（配列番号３６）およびＶ_Ｈ領域（配列番号３５）を以下の表１に示す。重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列を表２に示す。

既知のヒト抗体配列を使用して、上述したＶ_ＨおよびＶ_Ｋ領域の遺伝子をクローニングして、キメラ１１－１Ｆ４抗体を作製することができる。キメラ１１－１Ｆ４抗体は、そのマウス対応物と同様に、アミロイドのβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する。驚くべきことに、以下の実施例６が示すように、キメラ抗体は、それが由来する１１－１Ｆ４マウス抗体よりも高い親和性でＡＬアミロイド原線維に結合する。

既知のヒト抗体配列を使用して、ＣＤＲ領域の遺伝子をクローニングして、ヒト化型の抗体を作製することもできる。キメラ型の１１－１Ｆ４抗体と同様に、ヒト化型も、マウス対応物よりも高いアミロイド原線維に対する結合親和性を有し得る。

当業者であれば、本明細書に記載のヒト化およびキメラ抗体が全ての異なるタイプのヒト定常領域および／またはフレームワーク領域を利用し得ることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載のヒト化およびキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＨ、またはＩｇＭの定常領域および／またはフレームワーク領域を含んでもよい。好ましい実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、アミロイド原線維（例えば、κおよび／またはλ軽鎖原線維）に結合する能力を維持する限り、１つまたは複数の置換、挿入または欠失を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のキメラ１１－１Ｆ４抗体は、アミロイド原線維に結合する能力を維持する限り、本明細書に記載の対応する重鎖および軽鎖配列と比較して約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有する重鎖および軽鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明のヒト化１１－１Ｆ４抗体は、アミロイド原線維に結合する能力を維持する限り、本明細書に記載の対応するＣＤＲ配列と比較して約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有するＣＤＲを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ抗体は、例えば実施例６に記載の直接結合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した場合、インビトロおよび／またはインビボでそのマウス同等物よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合する。本明細書に記載のヒト化およびキメラ１１－１Ｆ４抗体が沈着物または原線維をまだ形成していない毒性循環アミロイドタンパク質に結合してこれを中和することができ、本明細書に記載のヒト化およびキメラ抗体がアミロイド沈着物を溶解することができると考えられるが、この理論に限定されるものではない。実際、キメラ１１－１Ｆ４抗体は、原線維に結合し、マウスでヒトアミロイドーマを溶解することが実証された。前駆体軽鎖タンパク質は、心筋細胞に毒性であると考えられているため、臓器内に沈着した凝集したアミロイド原線維および循環毒性アミロイド前駆体タンパク質を標的化することができる治療アプローチが、たとえ患者の疾患が血液学的に制御されていない場合（すなわち、患者が患者の血液もしくは血清中に検出可能なレベルの毒性アミロイド前駆体タンパク質、または４０ｍｇ／Ｌ超の関与する遊離軽鎖と関与しない遊離軽鎖との差を有する場合）でも、心筋関与を含むＡＬアミロイドーシスを有する患者の心血管転帰を改善する可能性があることは、注目に値する。

［略語］
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、分（ｍｉｎ）、秒（ｓｅｃ）、トリス－ホウ酸緩衝液（ＴＢＥ）。

アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ略語によって次の通り表される：アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）。ヌクレオチドについても、同様に次の通り表される：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、アデニンまたはグアニン（Ｒ）、シトシンまたはチミン（Ｙ）、グアニンまたはシトシン（Ｓ）、アデニンまたはチミン（Ｗ）、グアニンまたはチミン（Ｋ）、アデニンまたはシトシン（Ｍ）、シトシンまたはグアニンまたはチミン（Ｂ）、アデニンまたはグアニンまたはチミン（Ｄ）、アデニンまたはシトシンまたはチミン（Ｈ）、アデニンまたはシトシンまたはグアニン（Ｖ）、および任意の塩基（Ｎ）。

［ヒト化またはキメラ抗体］
本発明のキメラ抗体を産生するために、米国特許第８，１０５，５９４号明細書に記載されているマウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲ改変して、哺乳動物細胞におけるキメラ１１－１Ｆ４抗体の発現を促進した。改変された可変領域遺伝子の詳細な配列分析を実施した。改変された可変領域遺伝子を適切な哺乳動物発現ベクターにクローニングし、構築物１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００および１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００を作製した。ＥｃｏＲＩ制限酵素消化およびライゲーションによって、１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００および１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００構築物から、単一スーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４を作製した。最後に、コトランスフェクションと単一スーパーベクタートランスフェクションの両方によって、キメラ１１－１Ｆ４抗体をＣＯＳ細胞で一過的に発現させた。便宜上、コトランスフェクションまたはトランスフェクションのためにＣＯＳ細胞を選択したが、当業者であれば他の哺乳動物細胞株を使用できることを認識するであろう。アミロイド原線維に対するキメラ１１－１Ｆ４抗体の結合能力の特性決定を、直接結合ＥＬＩＳＡによって決定した。予想外かつ有益なことに、キメラ１１－１Ｆ４抗体は、マウス１１－１Ｆ４抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合した。

典型的には、抗体は、重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーと軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つのコピーとを含む４つのポリペプチドからなる。典型的には、各重鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ_Ｈ）領域および３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含み、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ_ＬまたはＶ_Ｋ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。軽鎖と重鎖のペアのそれぞれの可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。

本発明の組成物および方法で有用な抗体は、配列番号４７のＶ_Ｋ領域および配列番号４８のＶ_Ｈ領域を含むキメラマウス－ヒトモノクローナル抗体、または配列番号４９～５４のＣＤＲ配列を含むヒト化モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、アミロイド原線維のβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する。さらに、驚くべきことに、これらの抗体は、配列番号３６のＶ_Ｋ領域および配列番号３５のＶ_Ｈ領域を含む、それらが由来する１１－１Ｆ４マウス抗体よりも高い親和性でこのエピトープに結合する。本発明は、アミロイド沈着疾患の治療を必要とするヒト患者の該疾患を治療する方法を含む。本方法は、薬学的に許容される担体中の上記抗体の１つを治療上有効用量で患者に投与するステップを含む。投与される抗体の量は、例えば、患者の組織に沈着したアミロイド原線維の量を減らすのに有効である。該抗体組成物は、任意の従来の投与経路によって投与されてもよいが、非経口投与（静脈内など）が好ましい。薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知であり、適切なものが医学分野の当業者によって選択され得る。アミロイド沈着疾患は、好ましくは原発性（ＡＬ）アミロイドーシスである。

本明細書に記載され、特許請求される組成物および方法に有用なキメラ抗体（ならびにキメラ抗体を作製する方法）は、同日付で提出され、全体が本明細書に組み込まれる、共同所有の特許協力条約出願＿＿＿＿＿＿＿＿＿（２０１７年６月２９日に出願された米国特許出願第６２／５２６８３５号に基づく優先権を有する明細書８４４１－０００４ＷＯ）に記載されている。本抗体を作製するのに有用な材料には、図５および図６にそれぞれ示す１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００からなる群から選択されるベクター構築物、ならびに上記２つのベクター構築物から作製された超構築物（ｓｕｐｅｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ｐＧ．１ＫＤ２００１１－１Ｆ４が含まれる。他の有用な材料には、改変マウス１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｋ領域遺伝子（配列番号４２）および改変１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｈ領域遺伝子（配列番号４５）、ならびにそれぞれのプライマーである配列番号４１、４３、４４および４６が含まれる。本抗体は、ベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００または超構築物ｐＧ．１ＫＤ２００１１－１Ｆ４のＣＯＳ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの適切な哺乳動物宿主細胞へのコトランスフェクションによって作製されてもよい。

ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体を作製、試験および使用する方法を、以下の実施例の節でさらに詳細に説明する。

［医薬製剤］
本明細書に記載の方法に使用するのに適した医薬組成物は、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体、ヒト化抗体、または抗原結合抗抗体断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含むことができる。

組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口、経鼻、肺、眼、膣または直腸投与用に製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、溶液、懸濁液、エマルジョン、リポソーム製剤等などの静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内投与用に製剤化される。医薬組成物は、当技術分野で知られている技術を使用して、即時放出組成物、持続放出組成物、遅延放出組成物等になるよう製剤化され得る。

種々の剤形のための薬理学的に許容される担体は、当技術分野で知られている。例えば、固形製剤用の賦形剤、潤滑剤、結合剤および崩壊剤が知られており、液体製剤用の溶媒、可溶化剤、懸濁化剤、等張剤、緩衝剤および無痛化剤が知られている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１種または複数の保存剤、抗酸化剤、安定化剤などの１種または複数の追加の成分を含む。

さらに、本明細書に記載の医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。いくつかの実施形態において、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。

滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上述した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に組み込み、次いで滅菌精密濾過によって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上述した他の成分のうちの必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を前に滅菌濾過した溶液から生じる真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。

本発明の医薬組成物は、アミロイドーシスおよびアミロイド疾患の現在の標準治療の一部である他の治療薬と組み合わせて投与することができる。あるいは、本明細書に記載の医薬組成物は、アミロイドーシスおよびアミロイド疾患の従来の治療を以前に受けたが、従来の治療に反応しなかった（すなわち、疾患が難治性である、または進行し続けている）患者に投与されてもよい。

［治療方法］
本発明では、少なくとも１つのキメラ抗体、ヒト化抗体またはその抗原結合抗体断片を、アミロイドーシスを患っている患者（例えば、ヒト患者）に投与して、患者の臓器に沈着したおよび／または患者の血流中を循環しているアミロイド原線維の少なくとも部分的分解および除去を促進する。いくつかの実施形態において、治療上有効量の抗体と、薬学的に許容される担体とを投与する。適切な薬学的に許容される担体は、以下に説明するように当技術分野で周知である。医学分野の当業者によく理解されているように、典型的な投与経路は非経口的（例えば静脈内、皮下または筋肉内）である。当然、他の投与経路も可能である。投与は、単回投与であってもよく、複数回投与であってもよい。投与される抗体の量および投与頻度は、特定の患者のために医師によって最適化されてもよい。

アミロイドーシスは、様々な人の様々な臓器に発症することができ、様々な種類のアミロイドが存在する。アミロイドーシスは、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、神経系および消化管に頻繁に発症する。重度のアミロイドーシスは、生命を脅かす臓器不全を引き起こし得る。

アミロイドーシスの徴候および症状には、足首および下肢の腫脹、重度の疲労および衰弱、息切れ、手足のしびれ、刺痛もしくは疼痛、特に手首の疼痛（手根管症候群）、おそらく出血を伴う下痢または便秘、意図しない大幅な体重減少、肥大した舌、肥厚もしくはあざができやすいなどの皮膚の変化、目の周りの紫斑、不規則な心拍、または嚥下困難が含まれるが、これらに限定されるものではない。

一般に、アミロイドーシスは、アミロイドと呼ばれる異常なタンパク質の蓄積によって引き起こされる。アミロイドは、骨髄で産生され、いずれの組織または臓器にも沈着し得る。この状態の具体的な原因は、アミロイドーシスの種類に依存する。

ＡＬアミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシスおよび遺伝性アミロイドーシスを含むいくつかのタイプのアミロイドーシスまたはアミロイド疾患がある。

ＡＬアミロイドーシス（免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシス）は、最も一般的なタイプで、心臓、腎臓、皮膚、神経および肝臓に発症し得る。以前は原発性アミロイドーシスとして知られていたＡＬアミロイドーシスは、骨髄が分解できない異常な抗体を産生すると発生する。抗体は、アミロイド斑として種々の組織に沈着し、組織または臓器の正常な機能を妨害する。

以前は続発性アミロイドーシスとして知られていたＡＡアミロイドーシスは、一般に腎臓に発症するが、消化管、肝臓または心臓に発症する場合もある。これは通常、関節リウマチまたは炎症性腸疾患などの慢性感染性または炎症性疾患と共に発生する。

遺伝性アミロイドーシス（家族性アミロイドーシス）は通常、肝臓、神経、心臓および／または腎臓に発症することが多い遺伝性障害である。出生時に存在する多くの異なるタイプの遺伝子異常が、アミロイド疾患または遺伝性アミロイドーシスのリスク増加と関連している。アミロイド遺伝子異常のタイプおよび場所は、一定の合併症のリスク、症状が最初に現れる年齢、および疾患の経時的進行に影響を及ぼし得る。

アミロイド疾患が心臓に発症すると、多数のタイプの合併症を引き起こし得る。アミロイド沈着物または斑は、心臓が心拍の間に血液で満たされる能力を低下させる。各拍動で送られる血液が少なくなり、これが息切れにつながり得る。また、心臓内または心臓周囲のアミロイド沈着物または斑は、数ある他の臓器機能障害の中でも、不規則な心拍およびうっ血性心不全を引き起こし得る。

アミロイド疾患が腎臓に発症すると、通常、腎臓の濾過能力が損なわれ、タンパク質が血液から尿に漏出することを可能にする（すなわち、タンパク尿）。さらに、腎臓が体から老廃物を除去する能力が低下し、最終的に腎不全につながり得る。

本明細書において、アミロイド沈着疾患の治療を必要とする患者（例えば、ヒト患者）の原発性（ＡＬ）アミロイドーシスなどの該疾患を治療する方法が提供される。本方法は、アミロイド沈着疾患を治療するのに有効な量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体と薬学的に許容される担体とを、患者に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態において、アミロイド沈着疾患（例えば、原発性アミロイドーシス）は、心臓、腎臓、肝臓、肺、消化管、神経系、筋肉骨格系、軟部組織および皮膚からなる群から選択される少なくとも１つの臓器または組織の関与を含む。

疾患が患者の心臓のアミロイド沈着物または斑を含む実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置は、患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）のレベルを、該抗体の投与前にとられたベースラインレベルと比較して少なくとも約３０％低下させ得る。いくつかの実施形態において、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰのレベルは、該抗体の投与前にとられたベースラインレベルと比較して少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％またはそれ以上低下され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヒトまたはキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置は、患者のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルを、該抗体の投与後に約９１００ｎｇ／Ｌ未満に低下させ得る。いくつかの実施形態において、患者のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルは、該抗体の投与後に約８０００ｎｇ／Ｌ未満、７０００ｎｇ／Ｌ未満、６０００ｎｇ／Ｌ未満、５０００ｎｇ／Ｌ未満、または４０００ｎｇ／Ｌ未満に低下され得る。いくつかの実施形態において、患者は、最初に該抗体の投与前にニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類クラスＩＩまたはクラスＩＩＩに分類され得るが、本明細書に記載のキメラ１１－１Ｆ４抗体による治療後に、患者は、ＮＹＨＡ分類スケールでクラスＩに分類され得る。

本明細書において、心臓関与を含むアミロイドーシスを患っている患者の心筋機能を改善する方法、ならびに心臓関与（すなわち、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰが６５０ｐｇ／ｍＬ超である）を有し、血液学的に制御されていないＡＬＡを有する患者などの特定の患者の亜集団を治療する方法が提供される。

アミロイド疾患が心臓に発症すると、多数のタイプの合併症を引き起こし、この心臓関与が予後不良の前兆になる。アミロイド沈着物または斑は、心臓が心拍の間に血液で満たされる能力を低下させる。各拍動で送られる血液が少なくなり、これが数ある他の深刻な悪化因子の中でも息切れにつながり得る。心臓内または心臓周囲のアミロイド沈着物または斑はまた、数ある他の臓器機能障害の中でも、不規則な心拍およびうっ血性心不全を引き起こし得る。

本明細書において、心臓関与を含むアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能を改善する方法が提供される。本方法は、治療上有効量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片を、ＡＬＡと診断された患者に投与するステップを含む。該抗体またはその抗原結合断片は、直接結合ＥＬＩＳＡによって決定した場合、マウス１１－１Ｆ４抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合し得る。さらに、心筋機能の改善は、抗体またはその抗原結合断片を投与した後に、約３週間以内に明らかになり得る。例えば、心筋機能の種々の尺度の改善は、治療開始の約１週間以内、約２週間以内、約３週間以内、約４週間以内、約５週間以内、約６週間以内、約７週間以内、約８週間以内、約９週間以内、約１０週間以内、約１１週間以内、約１２週間以内、約１３週間以内、約１４週間以内、または約１５週間以内に見られる。

心臓関与を含む患者の心筋機能は、Ｎ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルを測定することによって決定することができる。ＡＬＡ患者の心臓のアミロイド沈着物によって引き起こされる組織損傷は、患者のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルを上昇させる。いくつかの実施形態において、心臓関与を含むＡＬＡと診断された患者は、６５０ｐｇ／ｍＬ超の治療前のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルを示す。

ＳｍｉｓｅｔｈらによるＥｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ、３７：１１９６に記載されているように、心エコーを使用して長軸方向のグローバルストレイン（ＧＬＳ）を測定することで、心筋機能およびその改善を測定することができる。心エコーは、超音波を使用して心筋のセグメント内の平均変形を測定する。ＧＬＳは、全体的左室機能の尺度としてのこれらのセグメントの平均である。アミロイド沈着により、左右の心室壁が厚くなり、硬く非拡張型の心室となり、コンプライアンスに乏しい非拡張型の心室となり、心臓および血管系に「ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）」が生じ得る。心エコー用語では、「ストレイン」という用語は、心筋の変形を説明するために使用される。これには心筋の局所的な短縮、肥厚および／または延長が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。ストレインは、心室機能の尺度として使用され得る。当業者であれば、心エコーを使用してＧＬＳを決定する方法を知っており、これを様々な方法で計算できることを理解するであろう。例えば、ラグランジュの式（ε_Ｌ＝（Ｌ－Ｌ_０）／Ｌ_０＝ΔＬ／Ｌ_０（式中、Ｌ_０はベースライン長さであり、Ｌは得られた長さである））が、元の長さに対するストレインを無次元の尺度として定義する。短縮は負であり、伸長は正である。これは通常、パーセントで表される。代替定義であるオイラーストレインは、瞬間長さに関するストレインを定義する：ε_Ｅ＝ΔＬ／Ｌ。経時変化の場合、ラグランジュストレインは、ε_Ｌ＝ΣΔＬ／Ｌ_０となり、オイラーストレインは、ε_Ｅ＝Σ（ΔＬ／Ｌ）となる。この用語は、正常な心筋と虚血性心筋の変形の局所的な差を説明するために、ＭｉｒｓｋｙおよびＰａｒｍｌｅｙによって最初に使用された。

したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法における患者は、治療前ＧＬＳレベルと比較して長軸方向のグローバルストレイン（ＧＬＳ）の改善を示す。例えば、本明細書に記載のキメラ抗体で処置された１９人の患者の試験では、これらの患者のうちの１０人がＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルのスクリーニングにより心臓関与を含み、８人の患者がベースラインＮＴ－ｐｒｏＢＮＰにより心臓の評価が可能であり、心臓関与が６５０ｐｇ／ｍＬ超のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルを有することによって定義された。いくつかの実施形態において、心臓関与を含むＡＬＡを有する患者は、少なくとも６５０ｐｇ／ｍｌのベースラインＮＴ－ｐｒｏＢＮＰを有し得る。また、いくつかの実施形態において、心臓関与を含むＡＬＡを有する患者は、少なくとも７００ｐｇ／ｍｌ、７５０ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、８５０ｐｇ／ｍｌ、９００ｐｇ／ｍｌ、９５０ｐｇ／ｍｌ、１０００ｐｇ／ｍｌ、１０５０ｐｇ／ｍｌ、１１００ｐｇ／ｍｌ、１１５０ｐｇ／ｍｌ、１２００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、１３００ｐｇ／ｍｌ、１３５０ｐｇ／ｍｌ、１４００ｐｇ／ｍｌ、１４５０ｐｇ／ｍｌ、１５００ｐｇ／ｍｌ、１５５０ｐｇ／ｍｌ、１６００ｐｇ／ｍｌ、１６５０ｐｇ／ｍｌ、１７００ｐｇ／ｍｌ、１７５０ｐｇ／ｍｌ、１８００ｐｇ／ｍｌ、１８５０ｐｇ／ｍｌ、１９００ｐｇ／ｍｌ、１９５０ｐｇ／ｍｌ、２０００ｐｇ／ｍｌ、２０５０ｐｇ／ｍｌ、２１００ｐｇ／ｍｌ、２１５０ｐｇ／ｍｌ、２２００ｐｇ／ｍｌ、２２５０ｐｇ／ｍｌ、または２３００ｐｇ／ｍｌ以上のベースラインＮＴ－ｐｒｏＢＮＰを有し得る。

以下の実施例９に記載する心臓関与を含む１０人の患者のうちの９人は、図１５に示すように、本明細書に記載のキメラ抗体への曝露で心筋機能の改善を示した。したがって、いくつかの実施形態において、治療上有効量のキメラ抗体で処置された患者は、治療前ＧＬＳレベルと比較して長軸方向のグローバルストレイン（ＧＬＳ）の改善を示す。ＧＬＳ低下に付随して、本明細書に記載の抗体で処置された患者は、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベル低下も示す場合がある。

いくつかの実施形態において、ＧＬＳの改善は、治療開始の約１週間以内、約２週間以内、約３週間以内、約４週間以内、約５週間以内、約６週間以内、約７週間以内、約８週間以内、約９週間以内、約１０週間以内、約１１週間以内、約１２週間以内、約１３週間以内、約１４週間以内、または約１５週間以内に起こり得る。いくつかの実施形態において、ＧＬＳの改善は、ラグランジュの式によって計算した場合、ベースラインと比較して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、またはそれ以上のＧＬＳの減少によって表され得る。ベースラインと比較して約２％以上のＧＬＳレベルの低下は、臨床学的に関連があると見なされる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体またはその抗原結合断片による治療は、患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）のレベルを、該抗体の投与前にとられたベースラインレベルと比較して少なくとも約３０％低下させ得る。いくつかの実施形態において、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰは、該抗体の投与前にとられたベースラインレベルと比較して少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％またはそれ以上低下され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置は、患者のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルを、該抗体の投与後に約９１００ｎｇ／Ｌ未満に低下させ得る。いくつかの実施形態において、患者のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルは、該抗体の投与後に約８０００ｎｇ／Ｌ未満、約７０００ｎｇ／Ｌ未満、約６０００ｎｇ／Ｌ未満、約５０００ｎｇ／Ｌ未満、または約４０００ｎｇ／Ｌ未満に低下され得る。いくつかの実施形態において、患者は、最初に該抗体の投与前にニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類クラスＩＩまたはＩＩＩに分類され得るが、本明細書に記載のキメラ１１－１Ｆ４抗体による治療後に、患者は、ＮＹＨＡ分類スケールでクラスＩに分類され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、再発性または難治性ＡＬＡを患っている患者を治療することを含む。いくつかの実施形態において、患者は、κＡＬＡを有し得る。いくつかの実施形態において、患者は、λＡＬＡを有し得る。

免疫グロブリンは、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖の２つの軽鎖と、いくつかのタイプがある２つの重鎖とを含む４つのタンパク質鎖から構成される。ＡＬアミロイドーシスでは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかがミスフォールドされ、アミロイド原線維または斑を形成し得る。したがって、一部の患者では、κ断片とλ断片の両方がミスフォールドされ得る。サブグループ分析により、実施例８に示すように、λ心臓関与とκ心臓関与の両方を有する患者が、治療前レベルと比較してＧＬＳが低下したことで改善を示すことがわかった。したがって、いくつかの実施形態において、患者は、軽鎖λアミロイド心臓関与を含むとしてさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態において、患者は、軽鎖κアミロイド心臓関与を含むとしてさらに特徴付けられる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、毒性前駆体タンパク質を生成している機能不全細胞を殺傷することを意図され得る化学療法薬を投与するステップをさらに含んでもよい。場合によっては、このような治療が成功し、それによって機能不全細胞の減少、および患者の血液中の循環毒性アミロイド前駆体タンパク質の量の付随する減少をもたらし得る。しかしながら、化学療法が、機能不全細胞の数および／またはこれらの細胞が毒性アミロイド前駆体タンパク質を産生する能力を低下させるのに無効である場合がある。血液中の検出可能な循環毒性アミロイド前駆体タンパク質のレベルを有し続けている患者は、血液学的に制御されていないＡＬＡを有すると言われる。

本明細書に記載するヒト化およびキメラ１１－１Ｆ４抗体は、タンパク質が凝集してアミロイド沈着物を形成する前でさえ、循環中の毒性アミロイド前駆体タンパク質に結合し、これを中和することができると考えられている。そのため、本明細書に記載の治療方法は、血液学的に制御されていない（すなわち、完全寛解でも非常に良好な部分寛解でもない）患者に特に有益であり得る。完全寛解は、陰性の血清および尿免疫固ならびに遊離軽鎖（ＦＬＣ）アッセイにおける正常比として定義され、非常に良好な部分寛解は、４０ｍｇ／Ｌ未満の関与する遊離軽鎖と関与しない遊離軽鎖との差を有するものとして定義される。

［［改善の監視］］
心エコーは、非侵襲的であり、心臓関与を含む軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能の改善を監視するために使用することができる。この監視は、治療上有効量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体（ｃ１１－１Ｆ４ Ａｂ）またはその抗原結合断片の患者への投与から約３週間以内に心臓関与を含むＡＬＡと診断された患者の心筋機能の改善を観察することを含む。ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４ Ａｂまたはその抗原結合断片は、直接結合ＥＬＩＳＡによって決定した場合に、マウス１１－１Ｆ４抗体よりも高い、アミロイド原線維に対する結合親和性を有する。したがって、実施例８に示すように、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与から約３週間に、心筋機能の改善が観察され得る。いくつかの実施形態において、心筋機能の改善は、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４ Ａｂまたはその抗原結合断片の投与から少なくとも３ヶ月に及ぶ期間持続する。

疾患が患者の腎臓のアミロイド沈着物または斑を含む実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置は、患者の尿中のタンパク質（すなわち、タンパク尿）のレベルを、該抗体の投与前に決定されたベースラインレベルと比較して少なくとも約３０％低下させ得る。いくつかの実施形態において、患者の尿中のタンパク質は、該抗体の投与前に決定されたベースラインレベルと比較して少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％またはそれ以上低下され得る。いくつかの実施形態において、患者の尿タンパク質排出量は、該抗体の投与後に約７０００ｍｇ／２４時間未満、約６０００ｍｇ／２４時間未満、約５０００ｍｇ／２４時間未満、約４０００ｍｇ／２４時間未満、または約３０００ｍｇ／２４時間未満に減少し得る。

［［治療上有効用量および投与レジメン］］
いくつかの実施形態において、治療上有効用量の抗体は、３ヶ月の期間内に１回、２回、３回、または４回以下で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの減少またはＧＬＳの改善は、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与から少なくとも約３ヶ月間患者で持続する。

当業者によって容易に理解されるように、上述した方法の治療上有効用量および投与レジメンは、変化し得る。投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、アミロイド斑の治療反応クリアランスまたは沈着したアミロイド原線維の量の減少）を提供するよう調整されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において抗体が単回投与されてもよく、いくつかの実施形態において数回の分割用量が経時的に投与されてもよく、またはその後の投与において用量が状況に応じて比例的に減少もしくは増加されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、皮下、静脈内または筋肉内注射によって１週間に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、皮下、静脈内または筋肉内注射によって１ヶ月に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、皮下、静脈内または筋肉内注射によって１年に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、状況または患者の状態に応じて、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１０ヶ月に１回、１１ヶ月に１回、１年に２回、または１年に１回投与されてもよい。

さらに、本明細書に記載のデータは、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置に対する患者の反応が持続するだけでなく、迅速でもあることを示している。いくつかの実施形態において、患者は、１週間以下、２週間以下、３週間以下、４週間以下、５週間以下、６週間以下、７週間以下、８週間以下、９週間以下、１０週間以下、１１週間以下、１２週間以下、またはその間の任意の時間枠で、治療反応（すなわち、アミロイド沈着物もしくは斑のサイズの減少、斑形成速度の減少、または臓器機能の改善）を経験し得る。例えば、用量および投与レジメンに応じて、患者は、約１週間または約４．５週間に治療反応を経験し得る。

患者に投与される抗体の治療上有効用量（単回投与で投与されるか複数回投与で投与されるかにかかわらず）は、患者の沈着アミロイド原線維の量を減らすのに十分である必要がある。このような治療上有効量は、患者の症候性変化を評価することによって、または沈着アミロイド原線維の量の変化を評価することによって（例えば、^１２４Ｉタグ付き抗体を使用した沈着アミロイド沈着物の放射免疫検出によって）決定され得る。したがって、本発明の標識抗体を使用して、疾患を有する疑いがある患者のアミロイド沈着疾患の存在を検出すると同時に、治療の有効性を判定することができる。

例示的な用量は、治療されている個体のサイズおよび健康、ならびに治療されている状態によって変化し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の治療上有効量は、約５００ｍｇ／ｍ^２以下であってもよい。しかしながら、状況に応じて用量がそれよりも多くてもよい。いくつかの実施形態において、治療上有効用量は、１０ｍｇ／ｍ^２～１０００ｍｇ／ｍ^２、２５ｍｇ／ｍ^２～９００ｍｇ／ｍ^２、５０ｍｇ／ｍ^２～８００ｍｇ／ｍ^２、７５ｍｇ／ｍ^２～７００ｍｇ／ｍ^２、１００ｍｇ／ｍ^２～６００ｍｇ／ｍ^２、またはその間の任意の値であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、治療上有効量は、約１０００ｍｇ／ｍ^２、約９７５ｍｇ／ｍ^２、約９５０ｍｇ／ｍ^２、約９２５ｍｇ／ｍ^２、約９００ｍｇ／ｍ^２、約８７５ｍｇ／ｍ^２、約８５０ｍｇ／ｍ^２、約８２５ｍｇ／ｍ^２、約８００ｍｇ／ｍ^２、約７７５ｍｇ／ｍ^２、約７５０ｍｇ／ｍ^２、約７２５ｍｇ／ｍ^２、約７００ｍｇ／ｍ^２、約６７５ｍｇ／ｍ^２、約６５０ｍｇ／ｍ^２、約６２５ｍｇ／ｍ^２、約６００ｍｇ／ｍ^２、約５７５ｍｇ／ｍ^２、約５５０ｍｇ／ｍ^２、約５２５ｍｇ／ｍ^２、約５００ｍｇ／ｍ^２、約４７５ｍｇ／ｍ^２、約４５０ｍｇ／ｍ^２、約４２５ｍｇ／ｍ^２、約４００ｍｇ／ｍ^２、約３７５ｍｇ／ｍ^２、約３５０ｍｇ／ｍ^２、約３２５ｍｇ／ｍ^２、約３００ｍｇ／ｍ^２、約２７５ｍｇ／ｍ^２、約２５０ｍｇ／ｍ^２、約２２５ｍｇ／ｍ^２、約２００ｍｇ／ｍ^２、約１７５ｍｇ／ｍ^２、約１５０ｍｇ／ｍ^２、約１２５ｍｇ／ｍ^２、約１００ｍｇ／ｍ^２、またはそれ以下であってもよい。

同様に、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の有効量は、約２２００ｍｇである。しかしながら、状況に応じて用量がそれよりも多くても少なくてもよい。いくつかの実施形態において、治療上有効量は、５０ｍｇ～５０００ｍｇ、６０ｍｇ～約４５００ｍｇ、７０ｍｇ～４０００ｍｇ、８０ｍｇ～３５００ｍｇ、９０ｍｇ～３０００ｍｇ、１００ｍｇ～２５００ｍｇ、１５０ｍｇ～２０００ｍｇ、２００ｍｇ～１５００ｍｇ、２５０ｍｇ～１０００ｍｇ、またはその間の任意の用量であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、治療上有効量は、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２５００ｍｇ、約２６００ｍｇ、約２７００ｍｇ、約２８００ｍｇ、約２９００ｍｇ、約３０００ｍｇ、約３１００ｍｇ、約３２００ｍｇ、約３３００ｍｇ、約３４００ｍｇ、約３５００ｍｇ、約３６００ｍｇ、約３７００ｍｇ、約３８００ｍｇ、約３９００ｍｇ、約４０００ｍｇ、約４１００ｍｇ、約４２００ｍｇ、約４３００ｍｇ、約４４００ｍｇ、約４５００ｍｇ、約４６００ｍｇ、約４７００ｍｇ、約４８００ｍｇ、約４９００ｍｇ、約５０００ｍｇ、またはそれ以上であってもよい。

同様に、いくつかの実施形態において、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の有効量は、約２５ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、いくつかの実施形態において、濃度がそれよりも高くても低くてもよい。いくつかの実施形態において、有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、または約１５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、またはその間の任意の値であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、有効量は、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上であってもよい。

状況に応じて、本明細書に記載の治療方法を他の既知の治療方法と組み合わせてもよい。例えば、ＡＬアミロイドーシスの現在の標準治療は、一般に、自家造血幹細胞移植（ＡＳＣＴ）または自家骨髄移植を含む。多発性骨髄腫を治療する同じ化学療法薬の多くが、アミロイド／毒性アミロイド前駆体タンパク質を産生する異常または機能不全細胞の増殖を停止するためにＡＬアミロイドーシスで使用される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、他の既知の治療の前、後、またはこれと同時に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体は、他の治療選択肢が失敗した、または疾患が進行し続けた後にのみ投与されてもよい。換言すれば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、難治性ＡＬアミロイドーシスなどの難治性アミロイド疾患を治療するために使用される。

疾患が患者の腎臓のアミロイド沈着物または斑を含む実施形態において、本明細書に記載のキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置は、患者の尿中のタンパク質（すなわち、タンパク尿）のレベルを、該抗体の投与前に決定されたベースラインレベルと比較して少なくとも約３０％低下させ得る。いくつかの実施形態において、患者の尿中のタンパク質は、該抗体の投与前に決定されたベースラインレベルと比較して少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、またはそれ以上低下され得る。いくつかの実施形態において、患者の尿タンパク質排出量は、該抗体の投与後に約７０００ｍｇ／２４時間未満、約６０００ｍｇ／２４時間未満、約５０００ｍｇ／２４時間未満、約４０００ｍｇ／２４時間未満、または約３０００ｍｇ／２４時間未満に減少し得る。

本明細書において、アミロイド沈着疾患（例えば、ＡＬアミロイドーシス）を有する患者を治療する方法が提供される。本方法は、治療上有効量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体を、１ヶ月に１回よりも少ない頻度でそれを必要とする患者に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、ＡＬアミロイドーシスは、λ軽鎖原線維の凝集体を含む場合がある。この場合、λ軽鎖原線維の凝集体の存在は、該抗体の投与後に大幅に減少する。

いくつかの実施形態において、治療上有効用量の抗体は、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、または半年ごとに投与されてもよい。より具体的な投与レジメンを以下に記載する。

本明細書において、心臓に関与する原発性軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスを有する患者を治療する方法が提供される。本方法は、治療前レベルと比較してヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与後のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルの少なくとも３０％の低下を引き起こすのに有効な用量のヒト化キメラ１１－１Ｆ４抗体を、患者に投与するステップを含む。また、本明細書において、腎臓に関与する原発性軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスを有する患者を治療する方法も含まれる。本方法は、治療前レベルと比較してヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与後のタンパク尿の少なくとも４０％の減少を引き起こすのに有効な用量のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体を、患者に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態において、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰおよび／またはタンパク尿の減少は、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与から少なくとも約６ヶ月間患者で持続する。

上述したように、免疫グロブリンは、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖の２つの軽鎖と、いくつかのタイプがある２つの重鎖とを含む４つのタンパク質鎖で構成される。ＡＬアミロイドーシスでは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかがミスフォールドされ、アミロイド原線維または斑を形成し得る。一部の患者では、κ断片とλ断片の両方がミスフォールドされ得る。よって、本明細書において、κおよび／またはλ軽鎖原線維凝集体沈着物の量を減少させる必要がある患者の該量を減少させる方法が提供される。本方法は、患者のκまたはλ軽鎖原線維凝集体沈着物の量を減少させるのに有効な用量の、（ｉ）配列番号４７を含むＶ_Ｋ領域、配列番号４８を含むＶ_Ｈ領域、または（ｉｉ）配列番号４９～５４を含むＣＤＲ配列、およびヒトＩｇＧ１定常領域を含む抗体を、κまたはλ軽鎖原線維凝集体沈着物を含む原発性アミロイドーシスを有する患者に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態において、原発性アミロイドーシスは、λ軽鎖原線維沈着物または斑からなる。また、いくつかの実施形態において、原発性アミロイドーシスはκ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる。また、いくつかの実施形態において、原発性アミロイドーシスは、κおよびλ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる。

驚くべきことに、本明細書では、キメラ１１－１Ｆ４がλ軽鎖原線維の除去において予想外に有効であることが発見された。実際、実施例７で提供されるマウス試験などの前臨床実験は、λ原線維がクリアランスに耐性であり、沈着物を除去するために複数の反復処置が必要であることを示唆した。ただし、実施例８に示すように、キメラ１１－１Ｆ４抗体をヒトに投与した場合、処置により、単回投与後のλ鎖アミロイド沈着物の減少がもたらされた。この結果は、本明細書に記載の方法を実施する前は全く予想外であった。ヒト化１１－１Ｆ４抗体は、λ軽鎖原線維を除去する同様の能力を示すと考えられる。

上述した方法のいずれにおいても、本明細書に記載のヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体の投与は、臓器機能障害を減少させると予想される。さらに、上述した方法のいずれにおいても、該抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域であってもよい。より具体的には、いくつかの実施形態において、該抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であってもよい。

当業者によって容易に理解されるように、上述した方法の治療上有効用量および投与レジメンは変化し得る。投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、アミロイド斑の治療反応クリアランスまたは沈着したアミロイド原線維の量の減少）を提供するよう調整されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において抗体が単回ボーラス投与されてもよく、いくつかの実施形態において数回の分割用量が経時的に投与されてもよく、またはその後の投与において用量が状況に応じて比例的に減少もしくは増加されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、皮下、静脈内または筋肉内注射によって１週間に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または機能的断片は、皮下、静脈内または筋肉内注射によって１ヶ月に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または機能的断片は、皮下、静脈内または筋肉内注射によって１年に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、状況または患者の状態に応じて、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１０ヶ月に１回、１１ヶ月に１回、１年に２回、または１年に１回投与されてもよい。

さらに、本明細書に記載のデータは、ヒト化またはキメラ１１－１Ｆ４抗体による処置に対する患者の反応が持続するだけでなく、迅速でもあることを示している。いくつかの実施形態において、患者は、１週間以下、２週間以下、３週間以下、４週間以下、５週間以下、６週間以下、７週間以下、８週間以下、９週間以下、１０週間以下、１１週間以下、１２週間以下、またはその間の任意の時間枠で、治療反応（すなわち、アミロイド沈着物もしくは斑のサイズの減少、斑形成速度の減少、または臓器機能の改善）を経験し得る。例えば、用量および投与レジメンに応じて、患者は、約１週間または約４．５週間に治療反応を経験し得る。

以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。しかしながら、本発明は、これらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されるものではない。本明細書で参照される全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。

［マウス１１－１Ｆ４抗体のＰＣＲクローニングおよびＤＮＡ配列決定］
マウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲクローニングし、単離された全ての可変領域遺伝子（疑および機能性）の詳細な配列分析を実施した。マウス１１－１Ｆ４抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の詳細なＤＮＡおよびアミノ酸配列を得た。

［材料］
培地成分および他の全ての組織培養材料は、ライフテクノロジーズ社（英国）から入手した。ＲＮＡ溶液キットはストラタジーン社（米国）から入手し、第１鎖ｃＤＮＡ合成キットはファルマシア社（英国）から購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを含むＲＣＲ反応のための全ての構成成分および機器は、パーキンエルマー社（米国）から購入した。ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットは、インビトロジェン社（米国）から入手した。アガロース（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標））は、ライフテクノロジーズ社（英国）から入手した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｂｉｇ Ｄｙｅ（商標）ターミネーターサイクルシーケンシング準備反応キットのプレミックスサイクルシーケンシングキットおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０シーケンシングマシンは、共にＰＥアプライド・バイオシステムズ社（米国）から購入した。他の全ての分子生物学的製品は、ニュー・イングランド・バイオラボ社（米国）およびプロメガ社（米国）から入手した。

［方法］
マウスモノクローナル抗体１１－１Ｆ４を産生するハイブリドーマ細胞株からマウスＶ_ＨおよびＶ_Ｋ遺伝子をＰＣＲクローニングするために使用される戦略を図１に概説する。

α－ヒト軽鎖モノクローナル抗体１１－１Ｆ４を産生するＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞株の２つのクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢ２Ｄ６）は、親切にもアラン・ソロモン医学博士（米国テネシー州ノックスビル市のテネシー大学医療科学センター）によって提供された。ハイブリドーマ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ－１０５）から入手可能である。細胞株を、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地を使用して培養した。１０^８個の細胞の総生細胞数に達するまで細胞を培養した。

細胞を各クローンから別々に次の通り収穫した。マウスハイブリドーマ細胞株を、適切な培養培地で懸濁で、約１０^８個の細胞の総生細胞数を提供するのに十分な量増殖させた。培養上清を収穫し、ハイブリドーマ細胞をベンチトップ遠心分離機（２５０ｇ、５分）でペレット化した。細胞を２０ｍｌのＰＢＳに穏やかに再懸濁し、生細胞計数のために１００μｌのアリコートを採取した。アリコートの細胞をもう一度ペレット化し、２００μｌのＰＢＳおよび２００μｌのトリパンブルーを１００μｌの細胞に添加し、穏やかに混合した。１０μｌのこの混合物を使い捨て細胞計数スライドにピペットで入れ、９つの小さな正方形中の白血球の数を顕微鏡下で数えた。青色細胞（すなわち、死細胞）は数えなかった。計数工程を繰り返し、結果を平均し、平均結果に９×１０^５を掛けて、２０ｍｌのＰＢＳ中の細胞の生細胞数を得た。十分な細胞を収穫して、これらをＲＮＡ単離のために１０ｍｌの溶液Ｄに再懸濁した（ストラタジーン社のＲＮＡ単離キットを使用、下記参照）。

次いで、製造業者の指示書に従って、ストラタジーン社のＲＮＡ単離キットを使用して、各クローンの細胞から個別に総ＲＮＡを単離した。１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を試料に添加し、管を繰り返し反転させて、管の内容物を完全に混合した。管に１０．０ｍｌのフェノール（ｐＨ５．３～５．７）を添加し、反転させて内容物を再び完全に混合した。混合物に２．０ｍｌのクロロホルム－イソアミルアルコール混合物を添加し、管に蓋をして１０秒間激しく振盪し、管を氷中で１５分間インキュベートした。試料を、氷上で予冷した５０ｍｌの厚肉丸底遠心管に移し、管を１００００×ｇの遠心分離機で４℃で２０分間回転させた。遠心分離後に、管に２つの相が見えた。上部水相はＲＮＡを含有し、下部フェノール相および中間相はＤＮＡおよびタンパク質を含有していた。ＲＮＡ含有上部水相を新しい遠心管に移し、下部フェノール相を捨てた。等量のイソプロパノールを水相に添加し、内容物を反転させて混合し、次いで、管を－２０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを沈殿させた。管を１００００×ｇの遠心分離機で４℃で２０分間回転させた。遠心分離後に、ＲＮＡを含有する管の底のペレットを取り出し、上清を捨てた。ペレットを３．０ｍｌの溶液Ｄに溶解し、３．０ｍｌのイソプロパノールを管に添加し、内容物をよく混合した。管を－２０℃で１時間インキュベートした後に、１００００×ｇの遠心分離機で４℃で１０分間再度回転させ、上清を管から除去し、捨てた。（注：この時点まで、ＲＮＡはイソチオシアン酸グアニジンの存在によってリボヌクレアーゼから保護されていたが、ここでもはや保護されなくなった。）ペレットを７５％（ｖ／ｖ）エタノール（ＤＥＰＣ処理水（２５％））で洗浄し、ペレットを真空下で２～３分間乾燥させた。ＲＮＡペレットを０．５～２ｍｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁する。

アマシャム・ファルマシア・バイオテク社の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットに付属のＮｏｔ Ｉ－ｄ（Ｔ）^１８プライマーを使用して、製造業者の指示書に従って、１１－１Ｆ４ハイブリドーマｍＲＮＡの１本鎖ＤＮＡコピーを産生した。後述するように、単離された２つのＲＮＡ試料の各々に１つの反応を実施した。使用した成分は、バルク第１鎖ｃＤＮＡ反応ミックス、クローニングＦＰＬＣｐｕｒｅ（商標）マウス逆転写酵素、ＲＮＡｇｕａｒｄ（商標）、ＢＳＡ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２００ｍＭ ＤＩＴ水溶液、Ｎｏｔ Ｉ－ｄ（Ｔ）^１８プライマー：５’－ｄ［ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ_１８］－３’、およびＤＥＰＣ処理水であった。

２０μｌのＤＥＰＣ水中の全ＲＮＡのうちの約５μｇを６５℃で１０分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。バルク第１鎖ｃＤＮＡ反応ミックスを穏やかにピペッティングして均一な懸濁液を得て、０．５ｍｌのマイクロ遠心管に反応を次の通り設定した：総量３３μｌの２０μｌの変性ＲＮＡ溶液、１１μｌのバルク第１鎖ｃＤＮＡ反応ミックス、１μｌのＮｏｔ Ｉ－ｄ（Ｔ）^１８プライマーおよび１μｌのＤＴＴ溶液。反応物質をピペッティングして穏やかに混合し、３７℃で１時間インキュベートした。

次いで、マウス重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子（それぞれＶ_Ｈ遺伝子およびＶ_Ｋ遺伝子）を、ＪｏｎｅｓおよびＢｅｎｄｉｇによって記載された方法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８８）を使用して、ｓｓＤＮＡ鋳型からＰＣＲ増幅した。

適切な定常領域プライマー（Ｖ_ＨについてＭＨＣ１－ＭＨＣ３およびＶ_ＫについてＭＫＣの等モル混合物）を使用して、変性リーダー配列特異的プライマー（Ｖ_ＨについてＭＨＶ１－ＭＨＶ１２およびＶ_ＫについてＭＫＶ１－ＭＫＶ１１）の各々に対して別々のＰＣＲ反応を準備した。表１および表２は、それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｋ領域遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを詳述している。合計で、１２の重鎖反応および１１のκ軽鎖反応を実施した。後述するように全ての場合において、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型ｃＤＮＡを増幅した。

完成したｃＤＮＡの第１鎖合成反応物を９０℃で５分間加熱して、ＲＮＡ－ｃＤＮＡ二本鎖を変性させ且つ逆転写酵素を不活性化し、氷上で冷却した。１１本のＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＰＣＲ反応管をＭＫＶ１－１１で標識した。各管について、各反応混合物が６９．３μｌの滅菌水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、６μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、それぞれ２μｌのｄＮＴＰの１０ｍＭストック溶液、２．５μｌの１０ｍＭ ＭＫＣプライマー、２．５μｌの１０ｍＭ ＭＫＶプライマーのうちの１つ、および１μｌのＲＮＡ－ｃＤＮＡ鋳型ミックスを含有する１００μｌの反応混合物を調製した。次いで、管の各々に０．７μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、完成した反応ミックスに５０μｌの鉱油を重ねた。

同様の一連の反応混合物を上記のように調製して、マウス重鎖可変領域遺伝子をＰＣＲクローニングした。ただし、今回は１２本の反応管を標識し、１２のＭＨＶプライマーのうちの１つと適切なＭＨＣプライマーを各々に添加した。すなわち、例えば、マウスγ１重鎖の可変ドメイン遺伝子をＰＣＲ増幅するために、ＭＨＣ Ｇ１プライマーを使用した。

反応管をＤＮＡサーマルサイクラーに装填し、（９４℃で１．５分間の初期融解後）９４℃で１分間、５０℃で１分間および７２℃で１分間、２５サイクルにわたって処理した。最後のサイクルに続いて、７２℃で１０分間の最終伸長ステップを行った後に、４℃に冷却した。２．５分の延長したランプ時間を使用したアニーリング（５０℃）ステップと伸長（７２℃）ステップとの間を除いて、サイクルの各ステップの間で３０秒間のランプ時間を使用した。各ＰＣＲ反応からの１０μｌのアリコートを、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロース／１×ＴＢＥ緩衝液ゲルで泳動して、どのリーダープライマーがＰＣＲ産物を産生するかを決定した。陽性ＰＣＲクローンのサイズは約４２０～５００ｂｐであった。

上記ＰＣＲ増幅プロセスをさらに２回繰り返し、完全長可変ドメイン遺伝子を増幅すると思われるＰＣＲ反応を選択した。各潜在的ＰＣＲ産物の６μｌのアリコートを、製造業者の指示書に記載されるように、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ（商標）ＩＩベクターに直接クローニングした。形質転換大腸菌細胞の１０．０％（ｖ／ｖ）、１．０％（ｖ／ｖ）および０．１％（ｖ／ｖ）のアリコートを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する個々の直径９０ｍｍのＬＢ寒天プレートにピペットで移し、２５μｌのＸ－Ｇａｌストック溶液および４０μｌのＩＰＴＧストック溶液を重ね、３７℃で一晩インキュベートした。陽性コロニーをＰＣＲスクリーニングによって同定した。

各ＰＣＲ反応からの５μｌのアリコートを１％アガロース／ＴＢＥ（ｐＨ８．８）ゲルに泳動して、正しいサイズ（約４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生したものを決定した。このように同定されたこれらの推定陽性ＰＣＲ産物を、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ２．１ベクターに直接クローニングし、製造業者のプロトコルに記載されるようにＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。正しいサイズのインサートを有するプラスミドを含有するコロニーを、ＧｕｓｓｏｗおよびＣｌａｃｋｓｏｎの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：４０００）に従って、１２１２および１２３３オリゴヌクレオチドプライマー（表３）を使用してコロニーをＰＣＲスクリーニングすることによって同定した。このように同定されたこれらの推定陽性クローンを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターを使用し、二本鎖プラスミドＤＮＡ配列決定した。Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株クローンからのＶ_ＨおよびＶ_Ｋ遺伝子のそれぞれ３つの陽性クローンを配列決定し、Ｂ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株クローンからのＶ_Ｋ遺伝子の４つの陽性クローンおよびＶ_Ｈ遺伝子の６つも同様に配列決定した。

マウス１１－１Ｆ４抗体重鎖可変領域遺伝子を増幅するために各ハイブリドーマクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢＣＤ６）に対して実施した１２のＰＣＲ反応の結果を表４（ａ）に示す。

変性リーダー配列プライマーＭＨＶ７は、ＭＨＣＧＩ－３定常領域プライマーのミックス（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡから約６００ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。このバンドは、平均Ｖ_Ｈ遺伝子についての予想サイズ（４５０ｂｐ）よりも大きかったので、さらには調査しなかった。逆に、変性リーダー配列プライマーＭＨＶ６は、ＭＨＣＧＩ－３定常領域プライマーのミックス（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡからＶ_Ｈ遺伝子について予想サイズ（４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生した。

表４は、ＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞株Ｂ２Ｃ４およびＢ２Ｄ６からマウス１１－１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖可変領域遺伝子（ａ）および軽鎖可変領域遺伝子（ｂ）をクローニングするために実施したＰＣＲ増幅の結果を示す。３列目には、実際のＰＣＲ結果が記録されている。プライマーの特定の組み合わせでバンドが観察された場合、塩基対のサイズ（ｂｐ）が適切なスペースに記録された。

Ｂ２Ｃ４由来ＰＣＲ産物からの３つのクローンおよびＢ２Ｄ６由来ＰＣＲ産物からの５つのクローンの配列分析によって、単一重鎖可変領域配列が明らかになった（図２）。

使用したクローニング戦略（この領域に隣接するプライマー、すなわちリーダー配列および定常領域配列特異的プライマーを使用することによる可変領域遺伝子全体の増幅）によって、完全なＦＲ１配列を同定することができた。配列決定された８つのクローンは全て、この領域で同一の配列を有していた（図２）。

マウス１１－１Ｆ４抗体κ軽鎖可変領域遺伝子を増幅するために各ハイブリドーマクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢＣＤ６）に対して実施した１１のＰＣＲ反応の結果を表４（ｂ）に示す。

変性リーダー配列プライマーＭＫＶ６は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表２）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株のみに由来する鋳型ｃＤＮＡから約２００ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。このバンドは、Ｖ_Ｋ遺伝子についての予想サイズ（４５０ｂｐ）よりもずっと小さかったので、さらには調査しなかった。

変性リーダー配列プライマーＭＫＶ２は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表２）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡからバンドの予想サイズ４５０ｂｐよりも小さいＰＣＲ産物を産生した（アガロースゲル上で見た場合）。さらに、以前のＶ_Ｋクローニングでは、ＭＫＶ２プライマーが周知のκ軽鎖偽遺伝子を増幅することが分かった。したがって、この産物がマウス１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｋ遺伝子ではなく偽遺伝子であることを確認するために、各ＰＣＲ産物の１つのクローンの配列分析を実施した。この配列分析によって、当該ＰＣＲクローンが実際に偽遺伝子であることが明らかになった。

最後に、変性リーダー配列プライマーＭＫＶ１は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡから、Ｖ_Ｋ遺伝子についてほぼ予想サイズ（４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生した。

Ｂ２Ｃ４由来ＰＣＲ産物の３つのクローンおよびＢ２Ｄ６由来ＰＣＲ産物の４つのクローンの配列分析によって、偽遺伝子として同定できなかった単一κ軽鎖可変領域配列が明らかになった。

したがって、１１－１Ｆ４抗体重鎖可変領域遺伝子を、ハイブリドーマｍＲＮＡから（定常領域特異的およびリーダー配列特異的プライマーを使用して）クローニングし、配列決定した。

翻訳されると、配列はＴＶＳＳペプチド配列を示した。Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に記録された１２２個の再配列されたヒトＶ_Ｈ遺伝子の分析によって、これらの配列の８４％がＴＶＳＳペプチド配列を有することが明らかになった。したがって、単離されたＶ_Ｈ遺伝子が正しい１１－１Ｆ４抗体遺伝子配列であると結論付けられた。

マウス１１－１Ｆ４抗体可変領域κ軽鎖遺伝子も、非機能的Ｖ_Ｋ偽遺伝子と同様に、クローニングおよび配列決定に成功した。この偽遺伝子は、Ｃａｒｒｏｌｌら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８８）２５：９９１）によって最初に同定された。この配列は、元のＭＯＰＣ－２１腫瘍（ＳＰ２／０を含む）に由来する全ての標準的な融合パートナーに存在する異常なｍＲＮＡ転写産物から生じる。異常なｍＲＮＡの結果として、２３位の不変システインがチロシン残基によって置き換えられ、ＶＪジョイントがフレーム外になり、１０５位に停止コドンが生じる。

リンパ系細胞またはハイブリドーマ細胞が、２つ以上の再配列された軽免疫グロブリンｍＲＮＡを合成することが一般的である。これらのｍＲＮＡは通常、機能的Ｖ_Ｋ遺伝子では通常見られない終止コドンまたはフレームシフトの存在のために非生産的である。これらの偽メッセンジャーは、機能的ポリペプチドをコードしていないという事実にもかかわらず、Ｖ領域ＰＣＲの非常に優れた基質であるため、ハイブリドーマから免疫グロブリン遺伝子をクローニングする際にしばしば大きな問題を引き起こす。

１１－１Ｆ４抗体Ｖ_Ｋ遺伝子配列は、２つの異なるＰＣＲ産物から単離された７つ別個のＰＣＲクローンの詳細な配列分析後に同定され、配列番号３６が得られた。全ての配列が同一であったので、これが正しい１１－１Ｆ４抗体κ軽鎖可変領域配列として受け入れられた。

クローニングＶ_ＨおよびＶ_Ｋ領域遺伝子を使用して、キメラマウス－ヒト１１－１Ｆ４モノクローナル抗体を作製し、次いで、これを分析してＡＬ原線維への特異的結合を確認した。

［キメラマウス－ヒト１１－１Ｆ４（ｃ１１－１Ｆ４）抗体の構築］
キメラマウス－ヒト抗体の一部として哺乳動物細胞で上記の１１－１Ｆ４のＶ_ＨおよびＶ_Ｋ可変領域遺伝子の一過的発現を可能にするためには、特異的に設計されたＰＣＲプライマーを使用して５’末端および３’末端を改変することが必要であった（表５）。オリゴヌクレオチドプライマーＦ３９８３６およびＦ３９８３７を使用して１１－１Ｆ４のＶ_Ｋ遺伝子をＰＣＲ改変し、プライマーＦ３９８３５およびＦ５８９３３を使用して１１－１Ｆ４のＶ_Ｈ遺伝子をＰＣＲ改変した。逆方向（ＢＡＫ）プライマーＦ３９８３６およびＦ３９８３５は、Ｖ_ＫおよびＶ_Ｈ遺伝子のそれぞれの５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、コザック翻訳開始部位および免疫グロブリンリーダー配列を導入した。順方向（ＦＯＲ）オリゴヌクレオチドプライマーＦ３９８３７は、Ｖ_Ｋ遺伝子の３’末端に、スプライスドナー部位およびＢａｍＨＩ制限部位を導入した。順方向（ＦＯＲ）オリゴヌクレオチドプライマーＦ５８９３３は、Ｖ_Ｈ遺伝子の３’末端に、ＡｐａＩ制限部位を含むγ－１ＣＨ_１遺伝子の最初の２２塩基対を付加した。

コザックコンセンサス配列は、可変領域配列の効率的な翻訳に不可欠である（Ｋｏｚａｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ、１９６：９４７）。これは、リボソームが翻訳を開始する正しいＡＵＧコドンを定義し、単一の最も重要な塩基は、ＡＵＧ開始の上流－３位のアデニン（またはわずかに好ましくはグアニン）である。

免疫グロブリンリーダー配列は、発現された抗体が培地に分泌され、したがって容易に収穫および精製されることを保証する。この例に使用されるリーダー配列は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｋクローニングプロセス中にハイブリドーマｃＤＮＡからクローニングされたマウス１１－１Ｆ４のＶ_ＫおよびＶ_Ｈリーダー配列であった。

スプライスドナー配列は、適切な定常領域への軽鎖可変領域の正しいインフレーム付着、したがって１３０ｂｐのＶ_Ｋ：Ｃ_Ｋイントロンをスプライシングで切り出すのに重要である。重鎖可変領域を、Ａｐａｌ部位を介してその適切な定常領域遺伝子に直接付着させたので、スプライスドナー部位の必要性が排除された。

サブクローニング制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ、ならびにＨｉｎｄＩｌｌおよびＡｐａｌは、それぞれ改変Ｖ_ＫおよびＶ_Ｈ可変領域遺伝子を挟む。様々なユニークな制限部位の使用によって、適切な哺乳動物発現ベクターへの方向性サブクローニングが保証された。

１１－１Ｆ４軽鎖可変領域遺伝子を最初に慎重に分析して、望ましくないスプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位およびコザック配列を同定した（表６参照）。重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変領域遺伝子の両方を、機能的全抗体のサブクローニングおよび／または発現を後で妨害する余分なサブクローニング制限部位の存在について分析した。何も見つからなかった。

可変領域遺伝子ごとに、別個のＰＣＲ反応を次の通り準備した。上述したプラスミド１１－１Ｆ４のＶ_Ｈ．ｐＣＲ２．１および１１－１Ｆ４のＶ_Ｋ．ｐＣＲ２．１を鋳型として使用した。１００μｌの反応混合物を各ＰＣＲ管で調製した。各混合物は、最大４１μｌの滅菌水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液Ｉ、８μｌのｄＮＴＰの１０ｍＭストック溶液、１μｌの１０ｍＭ ５’順方向プライマー、１μｌの１０ｍＭ ３’逆方向プライマーおよび１μｌの１／１０希釈の鋳型ＤＮＡを含有した。最後に、０．５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（２．５ユニット）を添加した後に、完成した反応混合物に５０μｌの鉱油を重ねた。反応管をＤＮＡサーマルサイクラーに装填し、（９４℃で１分間の初期融解後）９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間および７２℃で５０秒間、２５サイクルにわたって処理した。最後のサイクルに続いて、７２℃で７分間の最終伸長ステップを行って、４℃に冷却した。各ＰＣＲ反応管からの１０μｌのアリコートを、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１．２％（ｗ／ｖ）アガロース／１×ＴＢＥ緩衝液ゲルで泳動して、ＰＣＲ産物のサイズおよび存在を決定した。陽性ＰＣＲクローンのサイズは約４２０ｂｐであった。このように同定されたこれらの推定陽性ＰＣＲ産物を、Ｔｏｐｏ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ２．１ベクターに直接クローニングし、製造業者のプロトコルに記載されるようにＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。ＧｕｓｓｏｗおよびＣｌａｃｋｓｏｎの方法に従って、１２１２および１２３３オリゴヌクレオチドプライマー（表３）を使用してコロニーをＰＣＲスクリーニングして、正しいサイズのインサートを有するプラスミドを含有するコロニーを同定した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターを使用して、上記推定陽性クローンを二本鎖プラスミドＤＮＡ配列決定した。それぞれＴｏｐｏ ＴＡクローニングＶ_ＨおよびＶ_Ｋ遺伝子の２つの陽性クローンを配列決定した。

正しく改変された１１－１Ｆ４のＶ_Ｈおよび１１－１Ｆ４のＶ_Ｋ遺伝子を含むクローンを同定し、これらのクローンからの改変Ｖ遺伝子をそれぞれの発現ベクターにサブクローニングして、哺乳動物細胞におけるキメラ重鎖およびκ軽鎖の発現を促進した。改変された１１－１Ｆ４のＶ_Ｋ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩ断片として発現ベクターｐＫＮ１００（図４）にサブクローニングした。このベクターは、ヒトκ定常領域遺伝子（アロタイプ：Ｋｍ（３ Ａｌａ１５３、Ｓｅｒ１９１））を含んでいる。改変された１１－１Ｆ４のＶ_Ｈ遺伝子も、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＡｐａＩ断片として発現ベクターｐＧ１Ｄ２００（図５）にサブクローニングした。このベクターは、ヒトγ１定常領域遺伝子（アロタイプ：Ｇ１ｍ（－１ Ｇｌｕ３７７、Ｍｅｔ３８Ｉ、－２ Ａｌａ４６２、３ Ａｒｇ２２２、Ｓｅｒ２２９））を含んでいる。使用されるκ定常領域アロタイプとγ１定常領域アロタイプの両方は、白人集団で一般的に見られる。次いで、ライゲーションした発現構築物、１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００を使用してＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、元のＰＣＲ改変プライマー（表４）を使用して上述したＰＣＲスクリーニング法を使用して陽性クローンを同定した。発現ベクターは容易に入手可能である。

［ＣＯＳ細胞におけるキメラ１１－１Ｆ４の一過的発現のための単一スーパーベクターの構築］
キメラ１１－１Ｆ４抗体の両方の免疫グロブリン鎖を発現する単一スーパーベクターを次の通り構築した。１１－１Ｆ４κ軽鎖発現カセット（ＨＣＭＶｉプロモーター、１１－１Ｆ４κ軽鎖可変領域遺伝子およびκ軽鎖定常領域遺伝子を含んでいた）を、１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００構築物（図４）から制限酵素消化（１位および２４９０位のＥｃｏＲＩ）し、次いで、ユニークなＥｃｏＲＩ（４２９７位、図５）を介して１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物にライゲートした。このライゲーションによって、１１－１Ｆ４キメラ抗体の重鎖とκ軽鎖の両方を含むスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４が構築された。

［ＣＯＳ細胞におけるキメラγ１／κ．１１－１Ｆ４全抗体の一過的発現］
キメラ１１－１Ｆ４抗体を、次の２つの方法で欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）のＣＯＳ細胞で一過的に発現させた：
（ｉ）それぞれ１０μｇのベクター構築物１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションによる。コトランスフェクションは２連で行った。
（ｉｉ）１３μｇの単一スーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４のトランスフェクションによる。スーパーベクターのトランスフェクションは５回行った。

次の通りトランスフェクション法を使用した。ＣＯＳ細胞株を、１５０ｃｍ^２フラスコ中１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、５８０μｇ／ｍｌのＬ－グルタミン、および５０ユニット／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（「培地」）でコンフルエントになるまで増殖した。細胞をトリプシン処理し、ベンチトップ遠心分離機で遠心沈殿させ（２５０ｇ、５分間）、次いで、６ｍｌの培地に再懸濁した後に、これを２５ｍｌの新鮮な予熱培地をそれぞれ含む３つの１５０ｃｍ^２フラスコに均等に分けた。細胞を５％ＣＯ_２中３７℃で一晩インキュベートし、翌日、指数関数的に増殖している間に収穫した。各フラスコは約１×１０^７個の細胞を含有していた。細胞を再度トリプシン処理し、前のようにペレット化し、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで、細胞濃度が１×１０^７細胞／ｍｌになるように十分なＰＢＳに再懸濁した。７００μｌのこれらの洗浄したＣＯＳ細胞をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）キュベットにピペットで入れ、次いで、そこに１μｌの重鎖発現ベクターＤＮＡとκ軽鎖発現ベクターＤＮＡ（それぞれ１０μｇ）の両方または１３μｇのスーパーベクター構築物を添加した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）装置を使用して、１９００Ｖ、２５μＦの静電容量パルスを混合物に供給した。各実験トランスフェクションおよび（ＣＯＳ細胞をＤＮＡの非存在下で電気穿孔した）「ＤＮＡなし」対照についてパルスを繰り返した。ＣＯＳ細胞の効率を試験するために、以前に発現した抗体の陽性対照も実施した。

ＣＯＳ細胞を室温で１０分間回復させ、次いで、１０％（ｖ／ｖ）γ－グロブリンを含まないＦＢＳ、５８０μｇ／ｍｌのＬグルタミンおよび５０ユニット／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した予熱ＤＭＥＭ８ｍｌを含む直径１０ｃｍの組織培養皿に穏やかにピペットで移し、５％ＣＯ_２中３７℃で７２時間インキュベートした後に、分析のためにＣＯＳ細胞上清を収穫した。７２時間のインキュベーション後に、培地を回収し、回転させて細胞片を除去し、キメラ抗体産生およびｃ１１－１Ｆ４抗体の抗原結合についてＥＬＩＳＡによって分析した。

［捕捉ＥＬＩＳＡを介したキメラγ１／κ１１－１Ｆ４抗体の定量化］
発現後に、ＣＯＳ細胞上清中に存在するＩｇＧ分子全体を、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量化した。ＩｇＧ分子を、固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体を介してＮｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｂ（商標）プレート上に捕捉し、抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を介して検出した。以下と同じ方法で、同じプレート上の既知の濃度の標準ＩｇＧ抗体を捕捉および検出して、標準曲線を作成した。９６ウェル（穴）イムノプレートの各ウェルを、ＰＢＳで希釈した０．４μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の１００μｌのアリコートでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。過剰なコーティング溶液を除去し、プレートを２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ）で３回洗浄した。第２列のＢ行～Ｇ行のウェルを除く全てのウェルに、１００μｌのＳＥＣ緩衝液を分注した。ヒトＩｇＧ１／κ抗体のＳＥＣ緩衝液中１μｇ／ｍｌ溶液を標準として調製し、２００μｌ／ウェルを第２列のＢ行およびＣ行のウェルにピペットで入れた。トランスフェクトしたｃｏｓ細胞の培地を遠心分離し（２５０ｇ、５分）、上清を保存した。（ＣＯＳ細胞をＤＮＡの非存在下でトランスフェクトした）「ＤＮＡなし」対照からの上清２００μｌのアリコートを、第２列のＤ行のウェルにピペットで入れ、実験上清の２００μｌ／ウェルのアリコートを第２列のＥ行、Ｆ行およびＧ行のウェルにピペットで入れた。第２列のＢ行～Ｇ行のウェルの２００μｌのアリコートを混合し、次いで、１００μｌを各ウェルから第３列の隣接ウェルに移した。このプロセスを、標準試料、対照試料および実験試料の一連の２倍希釈液で第１１列まで続け、次いで、全てを３７℃で１時間インキュベートし、全てのウェルを洗浄緩衝液の２００μｌのアリコートで６回すすいだ。ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲートをＳＥＣ緩衝液で５０００倍希釈し、１００μｌの希釈コンジュゲートを各ウェルに添加し、インキュベーションとすすぎステップを繰り返した。各ウェルに１５０μｌのＫ－ＢＬＵＥ基質を添加し、暗所中２５℃で１０分間インキュベートした。５０μｌのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液を各ウェルに添加して反応を停止し、６５５ｎｍで光学濃度を読み取った。

［キメラ１１－１Ｆ４抗体の結合分析］
キメラ１１－１Ｆ４抗体を、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、アミロイド原線維への結合について試験した。合成原線維を免疫グロブリン軽鎖タンパク質から形成し、「低結合」ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ、番号３４７４）を使用した固相ＥＬＩＳＡベースアッセイで抗体の反応性を監視するために使用した。プレートをコーティングする直前に、２５０μｇの原線維の塊をコーティング緩衝液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水中０．１％ウシ血清アルブミン）で１ｍｌに希釈した。次いで、最大値の４０％に設定した出力でＴｅｋｍａｒ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ超音波プローブを使用して、試料を２０秒間超音波処理して、それぞれ最大２～５個のプロトフィラメントで構成される短い原線維の溶液を得た。次いで、この溶液を５ｍｌに希釈し、ボルテックスで十分に混合し、プレートのウェルに等分した。このプロセスにより、各ウェルで５０μｇ／ｍｌの濃度の原線維溶液５０μｌが得られた。次いで、プレートを３７℃のインキュベーターに蓋をせずに入れて、一晩乾燥させた。

次いで、プレートを調製してから４８時間以内にＥＬＩＳＡアッセイを次の通り実施した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡ１００μｌの添加によってウェルをブロッキングし、シェーカー上で室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄した。プレートの各ウェルに、５０μｌのｃ１１－１Ｆ４の溶液（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌ抗体）を添加し、プレートをシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。プレートを再度（前回同様）３回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ番号Ｂ－８７７４、抗重鎖および軽鎖）を使用して、結合抗体の検出を達成した。

［結果］
改変に成功したＶ_ＨおよびＶ_Ｋ遺伝子の配列分析によって、正しい配列が存在することが明らかになった。改変された１１－１Ｆ４のＶ_ＫおよびＶ_Ｈ遺伝子の詳細なＤＮＡおよびアミノ酸配列を図３および図４に示す。改変されたＶ_ＫおよびＶ_Ｈ遺伝子の、哺乳動物発現ベクターｐＧ１Ｄ２００およびｐＫＮ１００へのクローニングにそれぞれ成功し、得られた１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物を、哺乳動物細胞のコトランスフェクションに使用した。

次いで、１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物を使用して、哺乳動物細胞でキメラ１１－１Ｆ４抗体を発現する単一スーパーベクター（ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４）も構築した。ＥＣＡＣＣのＣＯＳ細胞のコトランスフェクションとスーパーベクタートランスフェクションの両方からのキメラ１１－１Ｆ４抗体発現レベルを分析した。ｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４スーパーベクターのトランスフェクションから観察された発現レベル（１０３２６ｎｇ／ｍｌ）は、１１－１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１－１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物の対応するコトランスフェクションから観察されたレベル（２８２０ｎｇ／ｍｌ）よりも３．７倍高かった。

発現および定量化の後に、キメラ１１－１Ｆ４抗体を直接結合ＥＬＩＳＡによって標的抗原（親切にもＮＣＩによって提供されたアミロイド原線維）への結合について試験した。結合ＥＬＩＳＡの結果を図８に示す。２つの最良の個々のｐＧ１ＫＤ２００－１１－１Ｆ４スーパーベクタートランスフェクションからの上清を、対応するコトランスフェクションからの１つの上清と並行して分析した。

結果は、キメラ１１－１Ｆ４抗体がそのマウス同等物よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合することを示した。通常、キメラ抗体は元のマウス抗体に匹敵する結合親和性を有すると予想されるため、この結果は驚くべきものであり、予想外であった。特定の機構によって拘束されることを意図するものではないが、本発明者らは、１１－１Ｆ４マウスＶ領域と、キメラ１１－１Ｆ４抗体の作製に使用されるヒトγ１／κＣ領域とを組み合わせることで得られた正味の効果によって、より高い親和性を有する抗体が得られた可能性があると考えている。

本明細書で使用したキメラ１１－１Ｆ４モノクローナル抗体を分泌するＣＨＯ細胞（ＣＡＥＬ－１０１として特定）の試料は、ブダペスト条約に準拠して２０１８年６月２７日にアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ－１２５１４６）により寄託された。

［マウス１１－１Ｆ４によるマウスアミロイドーマの試験］
アミロイドをヒトから抽出し、特性評価した。すなわち、ＡＬアミロイドーシスを有する患者から死後に得られた３０ｇ～４０ｇの新鮮凍結（－８０℃）または１０ｇの凍結乾燥した脾臓または肝臓を、Ｖｉｒｔｉｓ－Ｔｅｍｐｅｓｔ装置（米国ニューヨーク州ガーディナー町のＶｉｒＴｉｓ社）を使用して、約３００ｍｌの冷生理食塩水中でホモジナイズした。ホモジネートを６℃で３０分間、１７０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上清のＯＤがＡ_２８０で０．１０未満になるまで、ホモジナイゼーションと洗浄を繰り返して残留生理食塩水可溶性物質を除去した。次いで、ペレットを繰り返しホモジナイズし、冷脱イオン水で洗浄し、遠心分離し、アミロイド含有上清を凍結乾燥した。回収されたタンパク質の量は、出発材料の重量のおよそ３分の１～５分の１となった。アミロイドの軽鎖組成およびＶＬサブグループを、６ｍｏｌ／ＬグアニジンＨＣｌで水溶性材料から抽出された還元され、ピリジルエチル化されたタンパク質のトリプシン消化によって得られた高速液体クロマトグラフィー分離ペプチドのアミノ酸配列決定（米国カリフォルニア州フォスター市のアプライド・バイオシステムズ社によるＰｒｏｃｉｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）およびイオン化質量分析（米国コネチカット州ノーウォーク市のパーキンエルマー社によるＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ １５０ ＥＸ）を用いて決定した。プロテオグリカンヘパラン硫酸の存在は、Ａｚｕｒｅアッセイを使用して確立した。

アミロイド抽出物の組成は、化学、イムノブロッティング、アミノ酸配列、およびイオン化質量分析によって確立し、主なタンパク質種は、ほとんどの場合、主に可変領域（ＶＬ）と最初の約５０残基の定常領域（ＣＬ）、および他では、ＶＬ断片またはインタクト分子からなるκまたはλ軽鎖関連分子であることが分かった。さらに、これらの抽出物は、予想されるアミロイド関連Ｐ成分、ならびにプロテオグリカンヘパリン硫酸を含有していた。

凍結乾燥した水溶性アミロイド抽出物を２５ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁し、ＰＣＵ－２ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ装置（スイス連邦ルツェルン州Ｂｒｉｎｋｍａｎ社）を使用してホモジナイズした。原線維を、６℃で３０分間、１７０００ｒｐｍでの遠心分離によって沈殿させ、得られたペレットを１ｍｌの滅菌生理食塩水に再懸濁し、再ホモジナイズした。この溶液を、６ｍｌシリンジに取り付けられた１８ゲージ針を使用して、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＤ－１８ヌル、およびＣ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤマウスの肩甲骨の間に皮下注射した。結果として生じるアミロイドーマのサイズを、毎日の触診によって測定し、剖検で確認した。ｍｉｃｒｏＣａｔ装置（米国テネシー州オークリッジ市のオークリッジ国立研究所）を使用して、高解像度Ｘ線コンピュータ断層撮影像を取得した。

注射された物質は、動物の背中に容易に見える、触知可能な塊を形成し、その大きさは、注射された物質の量に依存した（例えば、最大直径０．２～２．５ｃｍ）。アミロイドーマは、高解像度Ｘ線コンピュータ断層撮影によって証明されるように、約１０日～２４日間、局在したままで変化しなかった。その時点の後に、アミロイドーマは退行し始め、最終的には約４日間で消失した。この反応は、κもしくはλの性質、またはアミロイド抽出物のＶＬサブグループに関係なく発生した。しかしながら、５つの異なるκおよび７つのλアミロイドーマを含む試験では、ＡＬλ抽出物が典型的に、ＡＬｋよりもゆっくりと分解した（ＡＬλ、１８＋／－６日対ＡＬκ、１３＋／－３日）。アミロイドの組織源に関係なく、この効果が健康な若い動物で再現性があることが分かった１２例のうち８例で実験を少なくとも４回繰り返すのに十分な材料が利用可能であった。しかしながら、誘発されたアミロイドーマの溶解は、高齢マウス（１８月齢超）および免疫不全マウスで３ヶ月を超えて一貫して遅延した。

退行性アミロイドーマの運命を決定する組織学的試験は、コンゴレッド染色によって証明されるように、アミロイドが他のマウス組織に再分配されないことを実証した。さらに、アミロイドーマには、ナフトールＡＳ－Ｄクロロ酢酸陽性、α－ナフチル酢酸陰性、多形核細胞、すなわち好中球が浸潤してした。対照的に、この細胞反応はＣＤ－１８ヌルマウスでは発生せず、ヒトＡＬアミロイドーマの消散にはかなり長い期間（すなわち３ヶ月）を要した。さらに、アミロイドーマ誘発時および３日目に再び与えられた２５０ｍｇの抗好中球ｍＡｂ Ｇｒ－１の同時投与によって大いに好中球減少症になった動物ではアミロイド溶解（ａｍｙｌｏｉｄｏｌｙｓｉｓ）が遅延した。

アミロイド除去は、ヒト軽鎖含有物質に対する体液性マウス反応にも依存していた。アミロイドーマ誘発のおよそ１０日～２０日後に、本発明者らは、イムノブロッティング実験で、マウス血清が、注射されたアミロイドタンパク質の軽鎖成分だけでなく、異種ＡＬκまたはＡＬλ抽出物も認識する抗体を含有することを示した。対照的に、相同アミロイド前駆体タンパク質、すなわち、ベンス・ジョーンズタンパク質または試験された他のモノクローナル軽鎖との反応性はなかった。同じアミロイド製剤をこれらの免疫動物に再投与すると、その消失率はおよそ２倍に増加した。

マウス１１－１Ｆ４の治療有効性を試験するために、ヒトＡＬアミロイドーマを保有するマウスのペアに１００μｇ用量の抗体を投与する一連の実験を開始した。ＡＬｋの場合、２つの異なる抽出物を含む試験により、抗体を１回注入しただけでも、未処置動物と比較してアミロイド腫瘍が急速かつ完全に消失することが明らかになった（表７、図９）。ＡＬｋλアミロイドーマの質量は、対照動物と比較して、抗体注射後４日以内に９０％超減少した。しかしながら、一定のＡＬλ型アミロイドーマで同様の反応を達成するためには、試薬の複数回投与が必要であった。これらを、アミロイドーマが誘発された時点（０日目）から開始して、次いで、２日目、４日目、および６日目に、再び、一連の１００μｇ注射として投与した（図９Ｂ）。表７に示すように、マウスモデルで５つの異なるヒトＡＬλアミロイドーマを試験した実験では、１１－１Ｆ４による処置が、アミロイド腫瘍の排除時間を４倍も減少させることが分かった。特に、ＡＬ原線維を認識する他の２つの抗軽鎖ｍＡｂ（例えば、３１－８Ｃ７）の単回または反復投与は、アミロイド分解を促進し、１１－１Ｆ４試薬は、異なる速度であるが、ＡＬκとＡＬλの両方のアミロイドの除去を加速したという点で特有であった。対照的に、試験された他の３つの抗軽鎖ｍＡｂはそのような活性を欠いていた。

また、ＡＡ－、ＡＴＴＲ－、ＡＬｙＳ－、ＡＡｐｏＡ１－およびＡｂ含有組織の免疫組織化学分析で証明されるように、１１－１Ｆ４が他のタイプのアミロイドを認識することも決定された。各場合において、１１－１Ｆ４およびこれら５つの異なるタイプのアミロイドタンパク質に特異的な抗体で、同様の反応性パターンが得られた。

［キメラ１１－１Ｆ４抗体の第１ａ／ｂ相試験］
ＧＭＰグレードのアミロイド原線維反応性キメラＩｇＧ１ ｍＡｂ １１－１Ｆ４は、難治性のＡＬアミロイドーシスを有する患者を処置する第１ａ／ｂ相試験のためにＮＣＩの生物資源部門によって製造された。キメラＩｇＧ１ ｍＡｂ １１－１Ｆ４を産生するＣＨＯ細胞株は、ＣＡＥＬ－１０１として同定されている。

以前に抗形質細胞処置を受けた再発性または難治性ＡＬアミロイドーシス患者を登録した。患者は、キメラＩｇＧ１ ｍＡｂ １１－１Ｆ４を１回の静脈内注入（第１ａ相）または４週間の一連の毎週の注入（第１ｂ相）として受けた。０．５ｍｇ／ｍ^２、５ｍｇ／ｍ^２、１０ｍｇ／ｍ^２、５０ｍｇ／ｍ^２、１００ｍｇ／ｍ^２、２５０ｍｇ／ｍ^２、および５００ｍｇ／ｍ^２の連続用量を投与した第１ａ相と第１ｂ相の両方で、用量漸増「アップダウン」設計を使用した。

この試験の主要目的は、キメラ１１－１Ｆ４の最大耐用量を確立することであり、副次目的は、（１）発症した臓器肥大の減少および／または臓器機能改善によって証明されるアミロイド負荷の減少の実証、（２）単回ＩＶ注入（第１ａ相）または一連の毎週のＩＶ注入（第１ｂ相）として投与された場合の１１－１Ｆ４の薬物動態の決定、および（３）２５０ｍｇ／ｍ^２用量と５００ｍｇ／ｍ^２用量の差の決定を含んでいた。

主要な選択基準は、２１歳以上、以前に全身療法を受けていた患者、形質細胞標的療法を必要としなかった患者、および米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔａｔｕｓ）が３以下だった患者を含んでいた。

主要な除外基準は、２．５ｍｍ超の脳室内中隔、３０ｃｃ／分未満のクレアチンクリアランス、施設正常値上限の３倍超のアルカリホスファターゼ、および３．０ｍｇ／ｄＬ超のビリルビンを含んでいた。

第１ａ相試験では、用量漸増が「アップダウン設計」に従った。忍容性が得られた後に、患者がそれぞれ次第により高用量のキメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂを受け、２人の患者が５００ｍｇ／ｍ^２用量で登録された。５００ｍｇ／ｍ^２用量を受けた患者でさえ、用量を制限する毒性を報告しなかった。図９Ａに示すように、０週目に患者を評価し、１週目にキメラ１１－１Ｆ４を投与し、２週目、３週目、４週目、および８週目に再評価した。

第１ｂ相試験では、０．５ｍｇ／ｍ^２から開始して４週間にわたって１週間に１回注入を行った。忍容性が得られた後に、患者がそれぞれ次第により高用量のキメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂを受け、６人の患者が５００ｍｇ／ｍ^２用量で登録された。投与スキームを図９Ｂに示す。

［結果］
２７人の患者をキメラ１１－１Ｆ４Ａ抗体で処置した。２６人の患者が反応について評価可能であった。８人の患者が第１ａ相を完了し、１９人の患者が第１ｂ相で処置を完了した。第１ａ相および第１ｂ相の中央年齢は６８歳であった。全ての患者が、第１ａ相と第１ｂ相の両方で、与えられた用量のｍＡｂキメラ１１－１Ｆ４および最高用量レベル５００ｍｇ／ｍ^２まで忍容性を示した。薬物関連のグレード４または５の有害事象（ＡＥ）も用量を制限する毒性もなかった。２人の患者が、注入後３～４日でグレード２の発疹を発症した。１人の患者が、第１ａ相（用量レベル４）および第１ｂ相で撤退した際に皮膚発疹を発症した。免疫組織化学染色による皮膚生検は、付随する好中球浸潤を伴うアミロイド原線維へのキメラ１１－１Ｆ４の結合を示した。この患者と別の患者とが、第１ｂ相で同様の発疹を発症した。これは、キメラ１１－１Ｆ４が軽鎖アミロイド原線維に直接結合するという臨床的相関データをさらに提供している。全体として、評価可能な患者の６３％（８人中５人）が、第１ａ相でｍＡｂ ｃ１１－１Ｆ４の１回注入後に臓器反応を実証した。第１ａ相での反応までの平均時間は、治療完了後４．５週間であった。第１ｂ相では、評価可能な患者の６１％（１８人中１１人）が、顕著な臓器反応を示し、反応までの平均時間が治療開始後１週間であり、高投与量でより速い反応の傾向があった。

評価可能な患者のサブセットの患者特徴を以下の表８に示す。

第１ａ／ｂ相試験の終了時に、１８人の患者が評価可能な反応を示した（Ｎ＝１に測定可能な疾患はなく、Ｎ＝２は処置を完了しなかった）。１８人中１２人（６７％）が、臓器反応改善を示した。具体的には、第１ａ相では、測定可能な疾患負荷の患者の６３％（８人中５人）が、ｍＡｂ １１－１Ｆ４の１回の注入後に臓器反応を実証した（腎臓２人、心臓２人およびＧＩ １人）。第１ｂ相試験では、測定可能な疾患負荷を有する患者の７０％（１０人中７人）が、臓器反応を示した。心臓関与を含む反応について評価した４人中３人の患者が、心臓反応を示した。腎臓関与を含む反応について評価した４人中４人の患者が、腎臓反応を示した。ＧＩ反応を有する１人の患者を評価した。軟部組織反応を有する１人の患者が、３→１の関節炎の改善を示した。

［心臓反応］
８人の患者を心臓反応について評価した。評価された測定基準の中には、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰおよびＮＹＨＡクラス基準があった。これらの患者全てのベースラインレベルが、６５０ｐｇ／ｍｌ以上であった。患者のうちの５人（６３％）は応答の大幅な改善を示し（すなわち、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの３０％以上の減少および／またはＮＹＨＡクラスＩＩＩからクラスＩへの移行）、２人の患者は安定したままであり、１人のみが疾患進行の何らかの徴候を示した。患者群の心臓の結果を図１１に示す。１人の例示的な患者のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの減少を図１２に示す。

［腎臓反応］
８人の患者を腎臓反応について評価した。ここでは、タンパク尿が反応性を決定するための主要な測定基準であった。６人の患者（７５％）が応答の大幅な改善（すなわち、タンパク尿の３０％以上の減少、または腎臓進行のない状態で０．５ｇ／２４時間未満への減少）を示し、２人の患者は安定したままであった。腎臓疾患進行の徴候（ｅＧＦＲで２５％超の悪化）を示した患者はいなかった。患者群の腎臓の結果を図１３に示す。１人の例示的な患者のタンパク尿の減少を図１４に示す。

［試験結果概要］
キメラ１１－１Ｆ４による処置は、忍容性が良好で安全であった。５００ｍｇ／ｍ^２のＭＴＤまで薬物関連のグレード４または５の有害事象（ＡＥ）も用量を制限する毒性もなかった。さらに、キメラ１１－１Ｆ４は、臨床的に有効である。ほとんどの患者が、１回の注入としてまたは４週間にわたる週１回の注入として、早期の持続的な臓器反応を経験した。心臓、腎臓、ＧＩ、皮膚および軟部組織の反応を含む組織／臓器にわたって反応改善が観察された。実際、キメラ１１－１Ｆ４は、患者の６７％でアミロイド消散を安全に促進し、ＡＬλ沈着を有する患者でさえ、単回投与後に臓器機能の改善をもたらした。キメラ１１－１Ｆ４に対する患者の反応は、迅速で持続的であった。実際、キメラ１１－１Ｆ４は、第１ａ相試験で４．５週間、第１ｂ相試験でわずか１週間の中央反応時間でアミロイド原線維を標的とする他の既知の治療薬よりも速く陽性反応を提供する。キメラ１１－１Ｆ４によるアミロイド原線維の急速な破壊は、臓器機能を改善し、ひいては、この一様に致命的な疾患を有する患者の死亡率を大幅に改善する。

［長軸方向のグローバルストレインを使用したＡＬアミロイドーシスを有する患者におけるキメラ原線維反応性モノクローナル抗体１１－１Ｆ４に対する心臓反応：第１ｂ相試験の結果］
キメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂの非盲検第１ｂ相臨床試験を完了し、以下に示す有望な結果が得られた。この試験は、長軸方向のグローバルストレイン（ＧＬＳ）を使用してｍＡｂ投与に対する心筋機能の反応を評価するために実施した。

再発性または難治性ＡＬアミロイドーシスを有する患者１９人を試験に登録した（年齢±ＳＤ、６３±１２、男性６８％）。５３％が軽鎖κアミロイドを有し、５２％が６５０ｐｇ／ｍｌ超のＮＴｐｒｏ－ＢＮＰレベルによって定義される心臓関与を含んでいた。１９人の患者のＮＴｐｒｏ－ＢＮＰスクリーニングおよびベースラインレベルを以下の表９に示す。これらの心臓病患者は、スクリーニングとベースラインＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ値の違いにより、心臓で評価可能な一次臨床分析に参加していない２人の患者を含んでいた。

ｍＡｂを、用量漸増設計で０．５ｍｇ／ｍ^２、５ｍｇ／ｍ^２、１０ｍｇ／ｍ^２、５０ｍｇ／ｍ^２、１００ｍｇ／ｍ^２、２５０ｍｇ／ｍ^２、および５００ｍｇ／ｍ^２の連続用量で４週間にわたって毎週投与した。ベースラインと治療１２週間後の臨床心エコー（ＥＣＨＯ）検査を比較した。左室駆出率（ＬＶＥＦ）（シンプソンの二方向法を使用して計算）および長軸方向のグローバルストレイン（ＧＬＳ）を含むいくつかの心エコー変数を得た。ＧＬＳは、スペックルトラッキング（ドイツ国のＴｏｍＴｅｃ社のＴｏｍＴｅｃ－Ａｒｅｎａ１．２）を使用して測定し、４、２、および３チャンバーベースの測定値の平均として計算した。対応のあるスチューデントのｔ検定を使用して、ベースライン時とｍＡｂによる治療の１２週間後の心エコー変数を比較した。心エコー図パラメータの分析を以下の表１０に示す。

全体的なコホートについて、ベースラインから１２週間の試験まででＬＶＥＦ（５６．２±８．６％対５６．２±９．５％、ｐ＝０．９８５）でもＧＬＳ（－１９．０４±－５．１１％対－１９．７３±－４．１％、ｐ＝０．１１９）でも大幅な変化はなかったが、心臓関与を含む患者は、図１５に図示するように、ＧＬＳの改善を示した（前－１５．５８±－４．１４％と後－１７．３７±－３．５３％、ｐ＝０．００４）。キメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂによる治療前および治療後１２週目での心臓関与を含む患者の例示的な心エコー図を図１７に示す。図１７に示す患者は、治療前のベースラインレベルのＮＴ－ｐｒｏＢＮＰが２５４９ｐｇ／ｍＬで、ＧＬＳ値が－９．５８であった。１２週間のキメラ１１－１Ｆ４ ｍＡｂによる治療後に、患者は－１３．３９へのＧＬＳ減少および、１４８５ｐｇ／ｍＬへのＮＴｐｒｏＢＮＰ減少を示した。サブグループ分析は、λアミロイド心臓関与を含む患者のＧＬＳの改善（前－１４．３±－４．３８％と後－１６．１７±－３．７４％、ｐ＝０．０２）およびκアミロイド心臓関与での改善傾向（前－１６．６０±－４．１０％と後－１８．１６±－３．４８％、ｐ＝０．０７）を示した。さらに、試験の臨床分析で定義される心臓病評価可能集団（スクリーニング値ではなくベースラインＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ値を使用）も、ＧＬＳ％の統計学的に大幅な減少（ｐ値０．０１６３）をもたらし、ＥＣＨＯ群（－１．６９）によって提供される分析と数値的に類似の減少（－１．７１）であった。以下の表１１は、心臓病患者対心臓病評価可能な患者および非心臓病患者のＧＬＳの減少の分析を示している。

結論として、この試験は、ＡＬアミロイド心臓関与を含む対象において抗原線維特異的ｍＡｂへの曝露後のＧＬＳの大幅な改善を示す。図１５に示すように、心臓関与を含む１０人中９人の患者が、ＧＬＳ％で改善した。薬物効果がないという帰無仮説の下で９人以上の患者が改善する確率は約０．０１０７であり、１０人中９人の患者が改善することを観察することは、薬物が本当に有効でない限り、非常に起こりにくい結果であることを示唆している。この予備データは、大規模な臨床試験の設計に役立つ。さらに、ＧＬＳを利用して心筋機能を評価する大規模な試験が正当化される。

［血液学的に制御されていない患者におけるキメラ原線維反応性モノクローナル抗体１１－１Ｆ４に対する臓器反応］
６回の化学療法処置を受け、臓器反応のない処置で血液学的部分反応を達成した患者に、キメラアミロイド原線維反応性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１１－１Ｆ４を投与した。投与後の３連続期間にわたって、１１－１Ｆ４を受けた後にＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの一貫した減少があり、患者は、図１６に記載されるように臓器反応を達成した。ただし、抗体をやめると、遊離軽鎖が増加し、患者の状態が悪化した。また、試験の完了後に、臓器進行が見られた。この患者の反応パターンにより、研究者らは、臓器反応はキメラ１１－１Ｆ４抗体処置によるものであり、化学療法による血液学的反応とは無関係であると結論付けた。

本明細書の説明および特許請求の範囲において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などを含む当該単語の変形は、特に明示されていない限り、他の特徴、添加剤、成分、整数またはステップを排除することを意図していない。これらの単語の範囲は、排他的な意味ではなく包括的な意味を有するように広く解釈されるものである。

以上、本明細書において本発明の組成物および方法を、実施例を参照して説明した。しかしながら、本発明はこれらに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の教示から逸脱することなく、当業者に知られているように種々の変形が可能であることが理解されるであろう。

Claims (23)

1. 原発性アミロイドーシスの治療を必要とするヒト患者の当該原発性アミロイドーシスを治療するために使用されるキメラ抗体であって、配列番号４７を含むＶＫ領域と配列番号４８を含むＶＨ領域とを有し且つ前記原発性アミロイドーシスを治療するのに有効な複数回治療上有効量のキメラマウス－ヒト抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を、患者に投与する、キメラ抗体。
2. 前記キメラ抗体は、約５００ｍｇ／ｍ^２以下の用量で投与される、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
3. 前記キメラ抗体の治療上の有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
4. 前記原発性アミロイドーシスは、心臓、腎臓、肝臓、肺、消化管、神経系、筋肉骨格系、軟部組織および皮膚からなる群から選択される少なくとも１つの臓器または組織の関与を含む、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
5. 前記患者は、約１週間以内に治療反応の徴候を示す、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
6. 前記原発性アミロイドーシスは、心臓の関与を含む、請求項４に記載のキメラ抗体の使用。
7. 前記キメラ抗体の有効用量は、約２２００ｍｇである、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
8. 前記患者は、前記キメラ抗体の投与前にニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類クラスＩＩまたはＩＩＩに分類され、前記キメラ抗体の投与後にクラスＩに分類される、請求項４に記載のキメラ抗体の使用。
9. 前記原発性アミロイドーシスは、腎臓の関与を含む、請求項４に記載のキメラ抗体の使用。
10. 前記キメラ１１－１Ｆ４抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する定常領域を含む、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
11. 前記アミロイド沈着疾患は、原発性軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスである、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
12. 前記ＡＬアミロイドーシスは、λ軽鎖原線維の凝集体を含む、請求項１１に記載のキメラ抗体の使用。
13. 前記治療上有効量の前記キメラ１１－１Ｆ４抗体は、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、または６ヶ月に１回投与される、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
14. 前記治療上有効量の前記キメラ１１－１Ｆ４抗体は、半年ごとに投与される、請求項１に記載のキメラ抗体の使用。
15. 前記ＡＬアミロイドーシスは、難治性である、請求項１１に記載の方法。
16. κまたはλ軽鎖原線維凝集体沈着物を含む原発性アミロイドーシスを有するヒト患者のκおよび／またはλ軽鎖原線維凝集体沈着物の量を減少させるキメラ抗体の使用であって、原線維凝集体沈着物を減少させる複数回治療上有効な用量の抗体を、前記患者に投与するステップを含み、
    前記抗体は、
    （ａ）配列番号４７を含むＶＫ領域、
    （ｂ）配列番号４８を含むＶＨ領域、および
    （ｃ）ヒトＩｇＧ１定常領域、
    を有し、
    前記抗体の投与は、前記患者のκおよび／またはλ軽鎖原線維凝集体沈着物の量を減少させる、キメラ抗体の使用。
17. 前記原発性アミロイドーシスは、λ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる、請求項１６に記載のキメラ抗体の使用。
18. 前記原発性アミロイドーシスは、κ軽鎖原線維凝集体沈着物からなる、請求項１６に記載のキメラ抗体の使用。
19. 前記抗体は、配列番号５３を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１と、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２と、配列番号５４を含むＣＤＲＨ３と、を有する可変重鎖（ＶＨ）、および配列番号４９を含むＣＤＲＬ１と、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２と、配列番号５１を含むＣＤＲＬ３と、を有する可変軽鎖（ＶＫ）、を含む、請求項１６に記載のキメラ抗体の使用。
20. 任意選択で、心臓関与を含む軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）と診断された患者の心筋機能の改善を監視するステップをさらに含み、前記ステップは、治療上有効量のキメラ抗体またはその抗原結合断片の前記患者への投与から約３週間以内に、前記心臓関与を含むＡＬＡと診断された前記患者の心筋機能の改善を観察するステップを含む、請求項１１に
    記載のキメラ抗体の使用。
21. 患者の心臓関与を含むアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬＡ）を治療するキメラ抗体の使用であって、前記ＡＬＡは、血液学的に制御されておらず、前記キメラ抗体の使用は、複数回治療上有効量のヒト化またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を、心臓関与および血液学的制御の欠如を特徴とするＡＬＡを有する前記患者に投与するステップを含み、
    前記抗体または前記抗原結合断片は、
    配列番号５２を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１と、配列番号５３を含むＣＤＲＨ２と、配列番号５４を含むＣＤＲＨ３と、を有する可変重鎖（ＶＨ）、および
    配列番号４９を含むＣＤＲＬ１と、配列番号５０を含むＣＤＲＬ２と、配列番号５１を含むＣＤＲＬ３と、を有する可変軽鎖（ＶＫ）、
    を含む、キメラ抗体の使用。
22. 前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化、ヒトまたはキメラ抗体である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＶＫ領域は、配列番号４７を含み、前記ＶＨ領域は、配列番号４８を含む、請求項２１に記載の方法。

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