CN111867626A - 治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用嵌合(例如小鼠‑人)抗体治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法和医药物组成物，包含通过施用包含嵌合的抗淀粉样蛋白原纤维抗体的医药物组成物来治疗心脏受累的淀粉样蛋白沉积疾病的方法。本发明的方法可以仅在治疗后三周内，改善被诊断为患有心脏受累的轻链淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(Amyloid light chain amyloidosis，ALA)的患者的心肌功能。
Description
引用EFS-WEB提交的序列表
序列表“8441-0009-1-_ST25”的ASCII文本文件的内容，大小为17.4kb，创建于2018年6月15日，并通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，在此全部引用作为参考。
政府权利
本发明是在美国政府的支持下，由食品和药物管理局(Food and DrugAdministration，FDA)授予的FD-U-005110资助完成。因此，美国政府对此处描述和要求保护的发明享有某些权利。
要求优先权
本申请要求2017年8月1日提交的美国临时专利申请62/539,821、和2018年3月2日提交的美国临时专利申请62/637,609的优先权，其全部内容通过引用并入在此。
技术领域
本发明是关于用于治疗淀粉样蛋白沉积疾病的人源性和嵌合(例如，小鼠-人)抗体及其抗原结合片段、包含此类抗体的医药组成物、以及以所述抗体和所述医药组成物治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法，特别是原发性(AL)淀粉样变性病。本发明另外是关于以淀粉样蛋白原纤维反应性抗体治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法。特别地，本发明关于改善被诊断为患有发生在心脏的淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(ALA)的患者的心肌功能的方法(即，淀粉样蛋白沉积在心脏中或其周围)。此种的患者可能具有包含轻链λ淀粉样蛋白或轻链κ淀粉样蛋白的ALA沉积物。此外，所述患者可能患有血液可控制或不受控制的疾病。
背景技术
以下揭示仅是为了提供帮助读者理解本发明，并且不被认为是为了描述或构成其现有技术。
天然的抗体通常是由约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其是由两条相同的轻链和两条相同的重链所组成，其中每条轻链透过一个二硫键与重链相连，而两条重链之间额外的二硫键的数量随着不同的抗体的同种型而有不同。最简单的同种型抗体是IgG，其仅包含两条轻链及两条重链，且其中两条重链仅透过两个二硫键连接。每条重链的一端具有一个可变区域(VH)，其带有多个相邻的恒定区域：而每条轻链的一端也具有可变区域(VL)，且其另一端具有恒定区域。抗体中轻链及重链的每个可变区域都包含三个区段，称为互补决定区(Complementarity-determining regions，CDR)或高度变异区。轻链中的每个互补决定区与相邻重链中所相应的互补决定区共同形成抗体的抗原结合位点。轻链主要有κ与λ两种类型，属于哪种类型是取决于其恒定区域，κ与λ轻链均可与任何不同的重链互相结合。
淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(AL淀粉样变性、AL或ALA)，或者也可称为原发性淀粉样变性，是在美国最常见的全身性淀粉样变性的形式；其中，术语“淀粉样变性”是指一组具有共同特征的疾病，即病理性不可溶解的纤维蛋白在器官及组织中的细胞外沉积(Rodney，et al.-NEJM，25：898)。淀粉样变性是由于人体内产生抗体的细胞的功能异常而引起的，这种异常会导致蛋白纤维异常地产生，且所述蛋白纤维会在器官和组织中聚集形成不可溶的淀粉状沉积物。淀粉样变性的类型是由形成原纤维沉积物的前驱蛋白的性质所决定的。在原发性淀粉样变性中，原纤维包含免疫球蛋白轻链的片段，而在继发性淀粉样变性中，原纤维则包含淀粉样蛋白A蛋白。淀粉样变性较现代的分类是基于形成原纤维沉积物的前驱血浆蛋白的性质而决定的。
前驱血浆蛋白是多种且彼此之间互不相关的，尽管如此，所有前驱沉积物都会产生淀粉样蛋白沉积物，且其具有共同的典型β-折叠构型的特征，而此特征是纤维状沉积物典型的染色特性所致。淀粉样变性发展的最后阶段是淀粉样原纤维沈积在患者的器官中，且淀粉样变性地死亡率很高，目前的五年生存率约为28％。
迄今为止，原发性淀粉样变性的治疗方法，一直是致力于透过常规或高剂量细胞毒性的化学疗法，以攻击发生功能异常的细胞来减少淀粉样前驱轻链的合成。然而，此种治疗有两个缺点：第一个是因为直到发生大量沉积为止，原纤维沉积通常是无症状的，因此在已经发生大量沉积之前不太可能进行所述种治疗方法；另一个则是因为此种治疗方法最多只能停止前驱异常蛋白的产生而不能去除现有的沉积物，因此由于病理性沉积物的残存率(或进展状态)，原发性淀粉样变性患者的预后仍然非常差(Solomon，et al.-Int.J.Exp.Clin.Invest.2：269)。
综合以上结果，淀粉样蛋白沉积物的治疗靶向和清除是医学热门的兴趣领域。但是，食品和药物管理局迄今为止尚未批准任何此类疾病的治疗产品，因此，所述疾病仍然存在大量未满足的医疗需求。本文揭示的组成物和方法满足了这一类需求。
发明内容
本文描述用于治疗淀粉样蛋白沉积疾病，特别是原发性(AL)淀粉样变性病的组成物和方法。所揭示的组成物和方法是使用会特异性结合淀粉样蛋白原纤维(例如淀粉样蛋白轻链原纤维)的人源性或嵌合抗体或其片段，以靶向原纤维而得以被免疫系统进行清除。
一方面，本发明的组成物和方法包含可用于治疗淀粉样蛋白沉积疾病，特别是原发性(ALA)淀粉样变性病的人源性或嵌合抗体(例如小鼠-人嵌合抗体)。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体包含SEQ ID NO：47的VK区和包含SEQ ID NO：48的VH区。在本发明一些实施方案中，抗体包含衍生自人类IgG1的恒定区。在本发明一些实施方案中，抗体以比其鼠类等效物更高的亲和力与淀粉样蛋白原纤维进行结合。在本发明一些实施方案中，所述抗体以比包含SEQ ID NO：36的VK区和SEQ ID NO：35的VH区的小鼠抗体具有与由淀粉样蛋白原纤维的β-折叠构型所表达的抗原表位更高的结合亲和力。在本发明一些实施方案中，所述抗体是在体内结合κ和λ淀粉样蛋白原纤维。
另一方面，本发明还提供一医药组成物，其包含所揭示的人源性或嵌合抗体和一医药学上可接受的载体。
可以通过在载体细胞中共转染载体构建体11-1F4VK.pKN100和11-F4VH.pG1D200或在哺乳动物细胞中转染超载体构建体pG1KD200，以生产本发明所揭示的方法和医药物组成物中的嵌合抗体11-1F4。在本发明一些实施方案中，载体构建体11-1F4VK.pKN100和11-F4VH.pG1D200的共转染或超载体构建体pG1KD200-11-1F4的转染是在COS(Chinesehamster ovary，中国仓鼠卵巢)细胞中进行的，而所产生的抗体称为“嵌合11-1F4抗体”。
另一方面，本发明还提供通过在需要被治疗淀粉样蛋白沉积疾病的人类患者中治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法，包含对所述患者施用能够有效治疗或改善淀粉样蛋白沉积疾病和/或疾病症状的治疗有效剂量的所揭示的抗体或片段中的至少一种，以治疗或改善需要这种治疗的患者的淀粉样蛋白沉积疾病，例如原发性(AL)淀粉样变性。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体可以与医药学上可接受的载体一起施用。
在本发明一些实施方案中，淀粉样蛋白沉积病是原发性淀粉样变性。在本发明一些实施方案中，是以约500mg/m2或更少的剂量施用所述抗体，而在本发明一些实施方案中，嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约2,200mg，并且在本发明一些实施方案中，有效剂量为约1-50mg/kg。
在本发明一些实施方案中，原发性淀粉样变性包含选自心脏、肾脏、肝脏、肺、胃肠道、神经系统、肌肉骨骼系统、软组织、和皮肤的至少一种器官或组织的受累。
在本发明一些实施方案中，当淀粉样变性影响心脏时，在施用所述抗体后，患者的N端pro b-型利钠肽(N-terminal pro b-type natriuretic peptide，NT-proBNP)的水平相较于治疗前的水平会降低至少约30％或至少约40％。在本发明一些实施方案中，在施用所述抗体后，患者的N端pro b-型利钠尿肽(NT-proBNP)的水平会降低至小于约9100ng/L、约8000ng/L、约7000ng/L、约6000ng/L、或约5000ng/L。在本发明一些实施方案中，在施用抗体之前患者会依纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)功能分类为II或III，并在施用所揭示抗体后将患者分类为I类。
在本发明一些实施方案中，当淀粉样变性正在影响肾脏时，与施用所述抗体后的基线水平相比，患者的尿蛋白水平可以降低至少约30％或约40％。在本发明一些实施方案中，患者的尿蛋白可在施用所述抗体后减少至小于约7000mg/24小时、约6000mg/24小时、约5000mg/24小时、或约4000mg/24小时。
在本发明一些实施方案中，抗体的施用不会引起任何严重的不良事件。
本发明还提供治疗心脏受累的ALA的方法。所揭示的方法独特地能够在治疗开始后约3周内提供有益的临床结果，并且是在先前被认为是预期寿命极短而无法治疗的患者群体中。
一方面，本发明还提供改善被诊断为患有心脏受累的淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(ALA)的患者的心肌功能的方法，所述方法包含：向所述被诊断为患有心脏受累的ALA的患者施用治疗有效剂量的人源性或嵌合抗体或其抗原结合片段，且所述抗体或抗原结合片段包含：一可变重链(VH)，其包含：一含有SEQ ID NO：52的互补决定区(CDR)H1；一含有SEQ IDNO：53的CDRH2，其；和一含有SEQ ID NO：54的CDRH3；和一可变轻链(VK)，其包含：一含有SEQID NO：49的CDRL1；一含有SEQ ID NO：50的CDRL2；和一含有SEQ ID NO：51的CDRL3；从而在施用所述剂量的所述抗体或其抗原结合片段可在约三周内有效改善所述患者的心肌功能。
另一方面，本发明还提供监测被诊断为患有轻链淀粉样变性(ALA)而使心脏受累患者的心肌功能改善的方法，包含对所述患者施用一治疗有效剂量的人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段后约三周内，观察到所述被诊断为患有ALA而使心脏受累患者心肌功能的改善。
另一方面，本发明还提供治疗患有淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(ALA)而使心脏受累患者的方法，其特征在于，所述ALA不受血液所控制，所述方法包含向所述患者施用治疗有效量的人源性或嵌合抗体或其抗原结合片段，所述患者的特征是心脏受累且缺乏血液控制的ALA，其包含：一可变重链(VH)，其包含：一含有SEQ ID NO：52的互补决定区(CDR)H1；一含有SEQ ID NO：53的CDRH2，其；和一含有SEQ ID NO：54的CDRH3；和一可变轻链(VK)，其包含：一含有SEQ ID NO：49的CDRL1；一含有SEQ ID NO：50的CDRL2；和一含有SEQ ID NO：51的CDRL3。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以是人源性抗体，而在本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以是嵌合抗体。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VK区可以包含SEQ ID NO：47，而VH区则可以包含SEQ ID NO：48。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含衍生自人类IgG1的恒定区。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述方法可以提供心肌功能的改善，所述心肌功能的改善会在施用所述抗体或其抗原结合片段后持续至少三个月。而在本发明一些实施例中，此种改善可以持续四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、或十二个月、或更多个月。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够以在三个月的时间内不超过一次、两次、三次、或四次的频率施用。在本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段的施用频率甚至可以更少地，例如每隔一个月一次或每三个月一次。
在前述方面的本发明一些实施方案中，与施用前的GLS水平相比，所述方法提供心肌功能的改善，其可以包含整体纵向应变(GLS)的改善。
在前述方面的本发明一些实施方案中，患者在治疗前表现出大于650pg/mL的NT-proBNP水平。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述剂量有效地导致所述患者与治疗前的NT-proBNP水平相比，在治疗后表现出约300pg/mL或更多的NT-proBNP水平降低。在本发明一些实施方案中，NT-proBNP水平的减少可以是约400pg/mL、约500pg/mL、约600pg/mL、约700pg/mL、约800pg/mL、或约1000pg/mL、或更多。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述方法提供心肌功能的改善，其可以包含与治疗前的NT-proBNP水平相比，在治疗后降低约30％或更多的NT-proBNP水平。
在前述方面的本发明一些实施方案中，患者可能患有复发性或难治性ALA。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述ALA可能进一步具有心脏受累的轻链λ淀粉样蛋白沉积疾病的特征，而在本发明一些实施方案中，所述ALA可能进一步具有心脏受累的轻链κ淀粉样蛋白沉积疾病的特征。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述ALA可能不是血液所控制的。例如，受试者血清中参与的和未参与的游离轻链之间的差异可能＞40mg/L，或者受试者的血液或血清中具有可检测水平的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白。
在前述方面的本发明一些实施方案中，所述方法可能进一步包含向所述患者施用一化学治疗化合物。
另一方面，本发明还提供在疑似具有此类沉积物的患者中检测淀粉样蛋白沉积物的存在的方法，所述方法包含向所述患者施用句野标记的所述抗体或其抗原结合片段。在本发明一些实施例中，所述标记可以是放射性标记，例如124I，但是本领域普通技术人员可以轻易地想到其他种类的标记。
另一方面，本发明还提供治疗患有淀粉样蛋白沉积疾病的患者的方法，所述方法包含每月少于一次地频率向所述患者施用一治疗有效剂量的嵌合11-1F4抗体。例如，在本发明一些实施方案中，治疗可能是以每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次、或每年一次的频率向所述患者施用治疗有效剂量的人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体包含衍生自人类IgG1的恒定区。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述淀粉样蛋白沉积疾病是原发性轻链(AL)淀粉样变性，并且所述疾病可以包含λ轻链原纤维的聚集体。在本发明一些实施方案中，在施用所述抗体后，λ轻链原纤维聚集体的存在会显着减少。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量为500mg/m2或更少，而在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合抗体片段的治疗有效剂量为约2,200mg，并且在本发明一些实施方案中，治疗有效剂量为约1-50mg/kg。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合抗体片段的治疗有效剂量是每两个月、三个月、四个月、五个月、或六个月施用一次。在本发明一些实施方案中，治所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合抗体片段的治疗有效剂量是每半年一次或仅一年一次的进行施用。
另一方面，本发明还提供治疗患有心脏受累的原发性轻链(AL)淀粉样变性的患者的方法，所述发访包含向所述患者施用一定剂量的所述人源性或嵌合11-1F4抗体，所述剂量足以有效地导致所述患者的N端pro b-型利钠肽(N-terminal pro b-type natriureticpeptide，NT-proBNP)水平在施用所述嵌合11-1F4抗体后，相较于治疗前的水平降低至少约30％。在本发明一些实施方案中，AL淀粉样变性是难治性的。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体包含衍生自人类IgG1的恒定区。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体是每个月施用一次，而在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体是每周施用一次。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量为500mg/m2或更少，而在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合抗体片段的治疗有效剂量为约2,200mg，并且在本发明一些实施方案中，治疗有效剂量为约1-50mg/kg。
在所述方面的本发明一些实施方案中，在施用所述嵌合11-1F4抗体后，患者中NT-proBNP会持续降低至少约六个月。
另一方面，本发明还提供治疗肾脏受累的原发性轻链(AL)淀粉样变性的患者的方法，包含向所述患者施用一定剂量的所述人源性或嵌合11-1F4抗体，所述剂量足以有效地导致所述患者的蛋白尿水平在施用所述嵌合11-1F4抗体后，相较于治疗前的水平降低至少约40％。在本发明一些实施方案中，AL淀粉样变性是难治性的。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体包含衍生自人类IgG1的恒定区。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体是每个月施用一次，而在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体是每周施用一次。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量为500mg/m2或更少，而在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合抗体片段的治疗有效剂量为约2,200mg，并且在本发明一些实施方案中，治疗有效剂量为约1-50mg/kg。
在所述方面的本发明一些实施方案中，在施用所述嵌合11-1F4抗体后，患者中蛋白尿会持续降低至少约六个月。
另一方面，本发明还提供减少患有包含κ或λ轻链原纤维聚集体沉积物的原发性淀粉样变性的有需要的人类患者中κ或λ轻链原纤维聚集体沉积物的含量的方法，所述方法包含向所述患者施用一定剂量的抗体，所述抗体包含：(a)一包含SEQ ID NO：47的VK区；(b)一包含SEQ ID NO：48的VH区；及(c)一人类IgG1的恒定区；其中，施用所述抗体会减少所述患者中κ和/或λ轻链原纤维聚集体的沉积量。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述原发性淀粉样变性是由λ轻链原纤维聚集体沉积物所组成，而在本发明一些实施方案中，所述原发性淀粉样变性是由κ轻链原纤维聚集体沉积物所组成，并且在本发明其他实施方案中，所述原发性淀粉样变性是由κ和λ轻链原纤维聚集体沉积物所组成。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体是每个月施用一次，而在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体是每周施用一次。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量为500mg/m2或更少，而在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合抗体片段的治疗有效剂量为约2,200mg，并且在本发明一些实施方案中，治疗有效剂量为约1-50mg/kg。
另一方面，本发明还提供治疗AL淀粉样变性的方法，其包含向患有AL淀粉样变性的患者施用包含11-1F4抗体的互补决定区(CDR)的单克隆抗体，其中所述抗体不是鼠的11-1F4。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述抗体可以是鼠-人嵌合抗体。
在所述方面的本发明一些实施方案中，所述抗体包含人类IgG1的恒定区。
在任何前述方面的本发明一些实施方案中，患者的器官功能障碍在施用所述抗体后会减少。在任何前述方面的本发明一些实施方案中，患者在治疗后少于5周内会显示出治疗反应的迹象，有时则是在治疗后少于4周内、有时是在治疗后少于3周内、有时则是在少于2周内。在本发明一些其他实施方案中，患者在治疗后约一周或更短时间内显示出治疗反应的迹象。
前面的大致描述和下面的详细描述皆是示例性和说明性的，并且旨在提供对本发明的进一步说明。
附图说明
图1是为用于从杂交瘤细胞株选殖鼠VH和VK基因的策略概述图。
图2是为鼠11-1F4抗体VH区域基因的DNA序列和氨基酸序列的列表，分别为SEQ IDNO：39和SEQ ID NO：35。
图3是为鼠11-1F4抗体VK区域基因的DNA序列和氨基酸序列的列表，分别为SEQ IDNO：40和SEQ ID NO：36。
图4是为免疫球蛋白κ轻链表达载体pKN100的基因地图，所述载体是由一个pSV2载体片段所组成，而该片段具有SV40起始和残缺的SV40晚期启动子，即SV40起源和Co1E1起源；所述载体还具有氨苄青霉素抗性以和neo基因；其中，残缺的SV40晚期启动子会驱动neo基因；所述载体还具有HCMVi启动子、用于插入免疫球蛋白可变区域基因的多个选殖位点(包含BamHI和HindIII限制酶切位点)、以及由spaC2终止讯号序列(Arnie)终止的人类kappa恒定区域基因的cDNA，其中所述cDNA的方向与kappa轻链表达匣相同。
图5是为免疫球蛋白γ1重链表达载体pG1D200的基因地图，所述载体是由一个pSV2dhfr载体片段所组成，而所述片段具有SV40早期和残缺的SV40晚期启动子，即SV40起源和Co1E1起源；所述载体还具有氨苄青霉素抗性和dhfr基因；其中，残缺的SV40晚期启动子会驱动dhfr基因；因此，所述载体的表达能力较差，但其也因此允许使用相对较低表达水平的氨甲喋呤以选择多基因/高表达水平的选殖产物；所述载体还具有HCMVi启动子片段、多选殖位点、人γ1恒定区基因(内含子缺乏)的cDNA，所述cDNA的后面是spaC2终止讯号序列(Arnie)。
图6是为经修饰的鼠11-1F4抗体VK区基因的DNA序列和氨基酸序列(分别为SEQ IDNO：42和47)的列表，以及用于修饰所述VK区基因的寡核苷酸引物的序列(分别为SEQ IDNO：41和NO：43)。
图7是为经修饰的鼠11-1F4抗体VH区基因的DNA序列和氨基酸序列(分别为SEQ IDNO：45及NO：48)的列表，以及用于修饰所述VH区基因的寡核苷酸引物的序列(分别为SEQ IDNO：44及NO：46)。
图8是为淀粉样蛋白原纤维结合ELISA测定的结果；含有嵌合11-1F4抗体的COS细胞的细胞培养液上清液与纯化的鼠11-1F4抗体一起在同一个ELISA培养盘上进行测试；其中是测量在OD405的吸光值：新SV＝pG1KD200-11-1F4；新的共转染＝11-1F4VHpG1D200加上11-1F4VK.pKN100。
图9显示在用鼠11-1F4治疗的小鼠中，人ALκ和人ALλ淀粉样瘤的清除率，其中是使用单剂量(图9A)或多剂量(图9B)的鼠11-1F4治疗小鼠。结果显示，鼠11-1F4可以快速清除ALκ淀粉样瘤，但在大多数情况下，需要多剂量才能够清除小鼠体内的ALλ淀粉样瘤。
图10显示嵌合11-1F4的1a/b期临床试验的剂量/评估方案。图10A显示出阶段1a的方案，图10B则显示示出阶段1b的方案，图10C显示这些研究中使用的剂量。
图11显示，在大多数患者中，施用嵌合11-1F4能够改善心脏功能，图A以直方图显示1a/b期试验的结果，图B则以箱形图显示结果。
图12显示c11-1F4抗体的1a/b期临床试验期间示例性患者的心脏反应(NT-proBNP)。
图13显示，在大多数患者中，施用嵌合11-1F4能够改善肾功能，图A以直方图显示1a/b期试验的结果，图B则以箱形图显示结果。
图14显示在嵌合11-1F4抗体的1a/b期临床试验期间示例性患者的肾脏反应(蛋白尿)。
图15显示嵌合11-1F4单克隆抗体的整体纵向应变变化的图示。
图16显示在嵌合抗体治疗之前对化学疗法有部分血液反应而无器官反应的患者中，在嵌合11-1F4抗体治疗后器官反应(NT-proBNP)的图示。
图17显示在嵌合11-1F4 mAb治疗后第零周和第十二周有心脏受累的淀粉样变性疾病患者的超声心动图。
具体实施方式
根据本发明，本案提供包含人源性抗体、嵌合抗体(例如小鼠-人抗体)或其抗原结合片段的方法和组成物，其可用于施用于患有淀粉样蛋白沉积疾病的患者以治疗或减轻所述疾病和疾病症状。本发明的抗体和抗体片段能够与淀粉样蛋白结合，并激活所述患者的免疫系统以清除所结合的物质，且几乎不产生或完全不产生人类抗小鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)的反应。本发明还提供包含至少一种所述或抗体片段与药学上可接受的载体的医药组成物，以及一通过向一患者施用一有效剂量的所述抗体或抗体片段来治疗或改善淀粉样变性和淀粉样变性疾病的症状的方法，其至少有一些淀粉样蛋白沉积从患者的器官中移出来，从而治疗或改善疾病及其症状。
进一步根据本发明所揭露，提供用于治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法。特别地，本发明所揭露针对改善被诊断为患有心脏受累的淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(ALA)的患者的心肌功能。所述方法包含向一患者施用会与淀粉样蛋白原纤维沉积物、循环的淀粉样蛋白、及具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白结合的一人源性或嵌合抗体(例如小鼠-人抗体)或一其抗原结合片段。特别地，本发明所揭露显示，向被诊断为患有心脏受累的ALA的患者施用所揭露的淀粉样蛋白原纤维结合抗体，相较于治疗前的整体纵向应变(GLS)水平会有改善的情况，和/或与治疗前的NT-proBNP水平相比会有降低的情况。此外，即使疾病不受血液控制，患者也能够得到有效的治疗(即所数患者的血液中含有可被检测的水平的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白，或者参与和未参与的游离轻链之间的差异＞40mg/L)，无论所述疾病是否涉及κ或λ蛋白的原纤维。
定义
应当理解，所述方法不限于所描述的特定实施方案，并且因此可以有不同的变化。另外还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于进行限定。本发明的技术范围将仅由所附权利要求书所限制。
如本文中所使用的，某些术语可能具有以下所定义的含义。如本发明说明书和权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包含单数和复数的引用，除非上下文中额外明确地指出。例如，术语“一个细胞”包括单个细胞以及包含其混合物的多个细胞。
如本文中所使用的，术语“包含”是在表示所述组成物和方法包含所列举的要素，但不排除包含其他要素。当用于定义组成物和方法时，“基本上由...组成”应表示排除对组成物或方法具有任何重要意义的其他要素；而“由......组成”应表示对于要求保护的组成物和实质性的方法步骤，排除其他成分中的微量元素。由这些过渡术语中的每一个所限定的实施方案是在本发明所揭露的范围内。因此，所述方法和组成物意为可以包含另外的步骤和组分(包含)，或者可替代地包含不重要的步骤和组成物(基本上由其组成)，或者仅意为所述的方法步骤或组合物(由其组成)。
如本文中所使用的，“约”是指正负10％。
如本文中所使用的，“可选的”或“可选地”是指随后所描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且所述描述包含所述事件或情况发生的情况和未发生的情况。
如本文中所使用的，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是一个生物、一脊椎动物、一哺乳动物(例如牛，犬，猫或马)、或一个人。在一个优选的实施方案中，个体、患者或受试者是人。
如本文中所使用的，术语“经分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合淀粉样蛋白原纤维的经分离的抗体中，基本上不含具有不与淀粉样蛋白原纤维结合的抗体)。然而，与淀粉样蛋白轻链原纤维(例如κ和/或λ原纤维)的抗原表位特异性结合的经分离的抗体，可能与其他蛋白质如淀粉样蛋白A原纤维具有交叉反应性。然而，抗体优选为总是结合人类淀粉样蛋白轻链原纤维。另外，经分离的抗体通常基本上不含有其他细胞物质和/或化学物质。
如本文中所使用的，词组“治疗有效剂量”和“治疗水平”分别是指受试者中的抗体剂量或血浆浓度，在需要接受施用这种施用所述抗体治疗的受试者中，提供特异性医药作用，即减少、改善或消除淀粉样蛋白沉积疾病，如AL淀粉样变性病，的作用或症状。要强调的是，即使本技术领域中普通技术人员认为这种剂量是治疗有效剂量，药物的治疗有效剂量或治疗水平也不总是有效地治疗本文所述的病症/疾病。治疗有效剂量可能会根据给药的途径和剂型、受试者的年龄和体重、和/或受试者的病情(包含开始治疗时，淀粉样变性的类型和阶段)以及其他因素而有所不同。
如本文中所使用的，关于淀粉样蛋白疾病，例如AL淀粉样变性，的术语“治疗(Treatment)”或“治疗(Treating)”是指减轻、改善或消除淀粉样变性的一种或多种症状或作用，包含但不限于清除或降解淀粉样蛋白斑块或沉积物、改善受所述疾病影响的器官的功能(例如心脏、肾脏、肝脏等)，并延长患者的寿命或五年存活率。
“治疗反应”是指淀粉样蛋白疾病的至少一种量度的改善，例如通过标准技术测得的现有淀粉样蛋白沉积物或斑块尺寸的减少、淀粉样蛋白沉积速率的降低、或器官功能的改善。例如，在心脏中存在淀粉样蛋白沉积物的患者中，器官功能的改善(即一治疗反应)可能由患者N端pro b-型利尿钠肽(N-terminal pro b-type natriuretic peptide，NT-proBNP)的水平降低、或患者于纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)功能分类级别的降低作为指标。在肾脏中具有淀粉样蛋白沉积物的患者中，器官功能的改善(即一治疗反应)可以通过蛋白尿的减少、或尿液中蛋白质输出的速度作为指针。
如本文中所使用的，术语“人源性抗体”是指包含衍生自人类以外的哺乳动物的抗体的CDR，以及人类抗体的框架区(Framework region，FR)和恒定区的抗体。由于人源性抗体在人体中的抗原性会降低，因此人源性抗体能够作为本发明治疗剂中的治疗有效成分。
如本文中所使用的，“心脏受累”是指患有淀粉样蛋白疾病的患者在心脏中具有淀粉样蛋白沉积物。心脏中的淀粉样蛋白沉积物会导致患者NT-proBNP的释放和血液中NT-proBNP的水平升高。在本文中，如果NT-proBNP大于650pg/mL，则患者即具有心脏受累。
如本文中所使用的，关于AL淀粉样变性的“不受血液控制”的描述意味着所述疾病既不是完全缓解也不是非常良好的部分缓解。例如，当患者血液中有可被检测水平的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白(即血液或血清)，或者患者血液中涉及的和未涉及的游离轻链之间的差异大于40mg/L时，就无法在血液上控制该疾病或血清。
如本文中所使用的，术语“严重不良事件”是指导致死亡、危及生命、需要住院、或延长现有住院时间、或导致持续或显着毁形或致残的不良医疗事件，如在21CFR 312.32(a)中所定义的。
如本文中所使用的，术语“医药学上可接受的载体”是指用于与药物化合物(例如嵌合抗体)混合以向患者施用的材料，例如在“Ansel’s Pharmaceutical Dosage Formsand Delivery Systems”，Tenth Edition(2014)中所述的。
抗AL抗体
鼠抗原纤维抗体
最近的动物研究显示，施用鼠11-1F4抗体和其他针对存在于AL原纤维上的β-折叠构型的共同抗原表位的其他鼠抗人轻链特异性抗体时，会导致人类ALκ和ALλ淀粉样蛋白沉积物完全降解。这些鼠抗体中有一些在美国专利申请号8,105,594案(“第594号专利”)中有所描述，所述专利通过引用形式整体并入本文。
鼠抗体通常不适合施用于其他动物物种(例如人类)中，因为接收的物种会将鼠抗体识别为具抗原性的，并将产生针对其的抗体。当将一种物种的抗体注射到另一物种中时，其抗原性通常是由恒定结构域的一部分所引起的。此种的抗原反应将阻碍或阻止鼠抗体的鼠抗体的理想治疗效果。在人类中，这种抗原性的反应称为人类抗小鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)。在第594号专利中所描述的抗体通过人类抗小鼠抗体(HAMA)反应而在人类中具有高度免疫原性的潜力。由于HAMA反应通常导致小鼠抗体从人受体中快速地被清除，因此HAMA将严重限制鼠抗体可能具有的任何潜在的人类治疗益处。因此，这些鼠抗体不适合施用于患者，以阻止或逆转淀粉样原纤维在患者体内的沉积。因此，本发明揭示用于治疗淀粉样蛋白沉积疾病的组成物和方法，且在施用后不太可能在患者中产生免疫原性HAMA反应。
人源性和嵌合抗原纤维抗体
本发明所揭露提供用于治疗淀粉样变性的人源性和嵌合抗体或其抗原结合片段。通常，抗体由四个多肽所组成：两个相同副本的重链(H)和两个相同副本的轻链(L)。通常，每条重链包含一个N端可变(VH)区和三个C端恒定(CH1、CH2和CH3)区，每条轻链包含一个N端可变(VL或VK)区和一个C-端恒定(CL)区域。抗体中轻炼和重链的每个可变结构域(Domain)还包含三个区段，其称为互补决定区(Complementarity-determining regions，CDR)或高度变异区。轻链中的每个CDR与相邻的重链中的相应CDR会共同形成抗体的抗原结合位点。每对轻炼和重链的可变区会形成抗体的抗原结合位点，而恒定区提供结构支持并调节由抗原结合引发的免疫反应。
嵌合抗体将非人类抗体的可变区掺入人类抗体的恒定区。例如嵌合11-1F4可以通过使用人类抗体诸如人类IgG1的Fc区表现鼠的可变区来产生。
可获得非人类(例如鼠)抗体的人源性形式，其包含衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列。通常，人源性抗体可能包含一个或两个或多个可变结构域，其中可变区是衍生自非人免疫球蛋白，而框架区(Framework regions，FR)则是对应于人免疫球蛋白的序列。因此，在一些实施方案中，人源性抗AL抗体包含人类抗体的框架区。此种抗体可以通过已知的技术来制备。
鼠11-1F4单克隆抗体是由SP2/0杂交瘤细胞所产生的抗AL抗体，所述SP2/0杂交瘤细胞是保藏在Alan Solomon，MD(University of Tennessee Medical Center atKnoxville，TN)。杂交瘤细胞是可以取得自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC access PTA-105)。下列表1中显示11-1F4抗体的VK区(SEQ IDNO：36)和VH区(SEQ ID NO：35)；表2中则提供重链和轻链的CDR序列。
表1-11-1F4单克隆抗体的可变序列
表2-11-1F4单克隆抗体的CDR序列
可以使用已知的人类抗体序列进行上面列出的VH和VK区基因的克隆，以产生嵌合的11-1F4抗体。嵌合11-1F4抗体与淀粉样蛋白的小鼠的β-折叠构型所表达的表位结合，就像他的鼠类的对应物一样，但是令人惊讶的是，如下面的实施方案6所示，所述嵌合抗体以相较于11-1F4鼠抗体更高的亲和力与AL淀粉样蛋白原纤维结合。
还可以使用已知的人类抗体序列进行CDR区基因的克隆，以产生人源性形式的抗体。如同11-1F4抗体的嵌合形式一样，人源性形式对淀粉样蛋白原纤维的结合亲和力也可能高于鼠类的对应物。
本技术领域中普通技术人员将理解，本发明所揭示的人源性和嵌合抗体可以利用所有不同类型的人类恒定区和/或框架区。例如，所揭示的人源性和嵌合抗体可以包含人类IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgE、IgH或IgM的恒定区和/或框架区。在优选的实施方案中，所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体包含人类IgG1的恒定区。
在一些实施方案中，所揭示的抗体可以包含一个或多个取代、插入或缺失，只要所述抗体保持与淀粉样蛋白原纤维(例如κ和/或λ轻链原纤维)的的结合能力即可。例如，在一些实施方案中，与相应于此处揭示的重链和轻链序列相比，本发明的嵌合11-1F4抗体可以包含约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的重链和轻链，只要所述抗体保持与淀粉样蛋白原纤维的结合能力即可。在一些实施方案中，与相应于此处揭示的CDR序列相比，本发明的人源性11-1F4抗体可以包含约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的重链和轻链，只要所述抗体保持与淀粉样蛋白原纤维的结合能力即可。
在一些实施方案中，所揭示的人源性或嵌合抗体在体外(In vitro)和/或体内(Invivo)，以比其等量的鼠类对应物，具有与淀粉样蛋白原纤维更高的结合亲和力，例如通过例如实施方案6中所述的直接结合ELISA测定法进行的测定。在不受理论所束缚的前提下，所揭示的人源性和嵌合11-1F4抗体应被认为可以结合并中和尚未形成沉积物或原纤维的毒性循环淀粉样蛋白，并且所揭示的人源性和嵌合的抗体可以溶解淀粉样蛋白沉积物。实际上，已证明嵌合11-1F4抗体能够与原纤维结合并能够在小鼠中溶解人类淀粉样瘤。值得注意的是，由于前体轻链蛋白被认为是对心肌细胞具有毒性的，因此可以靶向循环中具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白以及沉积在器官内聚集的淀粉样蛋白原纤维的治疗方法，可以改善具心肌受累的AL淀粉样变性的患者的心血管结果，即使其不受血液所控制(即，所述患者的血液或血清中，具有可检测的水平的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白水平，或者参与和未参与的游离轻链之间的差异＞40mg/L)。
简称
Dulbecco′s改良的Eagles培养基(Dulbecco′s Modified Eagles Medium，DMEM)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)；传讯RNA(messenger RNA，mRNA)；脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)；互补DNA(CopyDNA，cDNA)；聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)；分钟(Minute，min)；秒(Second，sec)；三硼酸盐缓冲液(Tris-borate buffer，TBE)。
氨基酸由IUPAC缩写表示，如下所示：丙氨酸(Alanine，Ala)，精氨酸(Arginine，Arg)，天冬酰氨(Asparagine，Asn)，天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)，半胱氨酸(Cysteine，Cys)，谷氨酰氨(Glutamine，Gln)，谷氨酸(Glutamic acid，Glu)，甘氨酸(Glycine，Gly)，组氨酸(Histidine，His)，异亮氨酸(Isoleucine，Ile)，亮氨酸(Leucine，Leu)，赖氨酸(Lysine，Lys)，蛋氨酸(Methionine，Met)，苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)，脯氨酸(Proline，Pro)，丝氨酸(Serine，Ser)，苏氨酸(Threonine，Thr)，色氨酸(Tryptophan，Trp)，酪氨酸(Tyrosine，Tyr)，缬氨酸(Valine，Val)。核苷酸类似物：腺嘌呤(Adenine，A)，胞嘧啶(Cytosine，C)，鸟嘌呤(Guanine，G)，胸腺嘧啶(Thymine，T)，尿嘧啶(Uracil，U)，腺嘌呤或鸟嘌呤(Adenine or Guanine，R)，胞嘧啶或胸腺嘧啶(Cytosine or Thymine，Y)，鸟嘌呤或胞嘧啶(Guanine or Cytosine，S)，腺嘌呤或胸腺嘧啶(Adenine or Thymine，W)，鸟嘌呤或胸腺嘧啶(Guanine or Thymine，K)，腺嘌呤或胞嘧啶(Adenine or Cytosine，M)，胞嘧啶或鸟嘌呤或胸腺嘧啶(Cytosine or Guanine or Thymine，B)，腺嘌呤或鸟嘌呤或胸腺嘧啶(Adenine or Guanine or Thymine，D)，腺嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶(Adenine orCytosine or Thymine，H)，腺嘌呤或胞嘧啶或鸟嘌呤(Adenine or Cytosine or Guanine，V)，以及任何碱基(Base，N)。
人源性或嵌合抗体
为了生产本发明的嵌合抗体，将美国专利第8,105,594号中所述的老鼠11-1F4单克隆抗体的重链和κ轻链的可变区基因进行PCR修饰，以促进嵌合11-1F4抗体在哺乳动物细胞中的表达。本发明中对修饰的可变区基因进行详细的序列分析。将修饰的可变区基因克隆到合适的哺乳动物表达载体中，以产生构建体11-1F4VHpG1D200和11-1F4VK.pKN100，并透过EcoRI的限制酶消化与连接，将11-1F4VHpG1D200与11-IF4VK.pKN100构建成单个超载体构建体pG1KD200-11-1F4；最后，透过在COS(Chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢)细胞内共转染及单一超载体转染以瞬时表达嵌合11-1F4抗体；其中，尽管本发明为方便起见而选择COS细胞进行共转染或转染，但本领域技术人员皆知能够使用其他哺乳动物细胞株进行。透过直接结合ELISA的方法以确定嵌合11-1F4抗体对淀粉样蛋白原纤维的结合能力的特征。出乎意料且有利的是，嵌合11-1F4抗体相较于比鼠11-1F4抗体具有与淀粉样蛋白原纤维更高的亲和力与结合力。
通常，抗体由四个多肽所组成：两个相同副本的重链(H)和两个相同副本的轻链(L)。通常，每条重链包含一个N端可变(VH)区和三个C端恒定(CH1、CH2和CH3)区，每条轻链包含一个N端可变(VL或VK)区和一个C-端恒定(CL)区域。每对轻炼和重链的可变区会形成抗体的抗原结合位点。
用于本发明的组合物和方法中的抗体可以是一包含SEQ ID NO：47的VK区和SEQID NO：48的VH区的嵌合小鼠-人单克隆抗体、或一包含SEQ ID NO：49-54的CDR序列的人源性单克隆抗体。这些抗体会与由淀粉样蛋白原纤维的β-折叠构型所表达的抗原表位进行结合。此外，令人惊讶地，所述抗体比其衍生来源的11-1F4小鼠抗体具有与所述抗原表位更高的亲和力；其中，所述11-1F4小鼠抗体包含SEQ ID NO：36的VK区及SEQ ID NO：35的VH区。本发明包含在需要此种治疗的患者中治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法，所述方法包含对所述患者施用包含医药学上可接受的载体的前述抗体；其中，所施用的抗体的剂量应能够有效地减少沉积在所述患者组织中的淀粉样蛋白原纤维的含量。所述抗体组成物能够通过任何常规的给药途径的方式施用，其中给药途径较佳为肠胃外给药(例如静脉内)，而医药学上可接受的载体是本技术领域中的通常知识，并且医学领域中技术人员能够选择最合适的一种方式。淀粉样沉积疾病较佳为原发性(AL)淀粉样变性。
在共同拥有的专利合作条约申请案__________(主张于2017年6月29日提交的美国专利申请62/526,835的优先权)中，揭示可用于本文所述和所请的组成物和方法的嵌合抗体(以及制备所述嵌合抗体的方法)，所述申请案在同一日期提交，并在此全文并入。可用于制备本发明所请抗体的材料包含分别选自图5和图6的载体构建体11-1F4VK.pKN100和11-F4VH.pG1D200，以及由上述两种载体构建体所制备的超构建体pG.1KD20011-1F4。其他可用的材料包含经修饰的鼠11-1F4抗体的VK区基因(SEQ ID NO：42)和经修饰的11-1F4抗体的VH区基因(SEQ ID NO：45)，以及相应的引物SEQ ID NO：41、43、44和46。本发明所请的抗体可以通过将载体构建体11-1F4VK.pKN100和11-F4VH.pG1D200或超构建体pG.1KD20011-1F4共转染在合适的哺乳动物宿主细胞中制成，例如COS细胞。
制备、测试和使用人源性或嵌合11-1F4抗体的方法将在以下各个实施方案中进一步详细的讨论。
医药组成物的配方
适用于本发明所述方法的医药组成物可以包含所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体、人源性抗体、或抗原结合抗体片段以及医药学上可接受的载体或稀释剂。
所述医药组成物可以被配制成用于静脉内、皮下、腹膜内、肌内、口服、经鼻、经肺、经眼、经阴道或经直肠的方式施用。在本发明一些实施方案中，所述抗体被配制成用于静脉内、皮下、腹膜内或肌内的方式施用，例如在溶液、悬浮液、乳剂、脂质体制剂等中。所述医药组成物可以被配制成速释(Immediate-release)组合物、持续释放(Sustained-release)组合物、延迟释放(Delayed-release)组合物等本领域所用的技术。
用于各种剂型的医药学上可接受的载体是本领域已知的。例如，用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂是已知的；用于液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂，等渗剂、缓冲剂、和舒缓剂是已知的。在本发明一些实施方案中，所述医药组成物包含一种或多种额外的组成分，例如一种或多种防腐剂、抗氧化剂、稳定剂等。
另外，所揭示的医药组成物可以被配制成适合于高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其他有序结构。所述载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在使用分散体的情况下，例如使用诸如卵磷脂的包覆层，通过维持所需的粒径，并通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在本发明一些实施方案中，将优选在组成物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组成物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，则可以达到可注射组成物的延长吸收。
无菌注射溶液可以通过将所需剂量的活性化合物与所需的一种或以上所列举的组成分的组合并入适当的溶剂中，然后进行灭菌微过滤来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中来制备所述分散体，所述无菌载体包含基本分散介质和上述所需的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
本发明所揭示的医药组成物可以组合作为淀粉样变性和淀粉样蛋白疾病的当前治疗标准的一部分的其他治疗剂进行以进行施用。或者，可以将本发明所揭示的医药组成物施用于先前已经接受过淀粉样变性和淀粉样蛋白变性疾病常规治疗但对所述常规治疗无反应的患者(即所述疾病是顽固性的或持续发展的)。
治疗的方法
在本发明中，将至少一种嵌合抗体、人源性抗体或其抗原结合抗体片段施用于患有淀粉样变性病的患者(例如人类患者)，以促进至少一些沉积在患者器官中和/或在患者血流中循环的淀粉样蛋白原纤维的降解和去除。在本发明一些实施方案中，治疗有效剂量的抗体是与医药学上可接受的载体一起施用。合适的医药学上可接受的载体是本领域众所周知的，并且如下文所述。如医学领域的普通技术人员所熟知的，典型的给药途径是肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)；当然，其他给药途径也是可行的。而给药可以是单次给或多次给。医师可以针对特定患者优化抗体的给药剂量和给药频率。
淀粉样变性可以影响不同人的不同器官，并且淀粉样蛋白有不同的类型。淀粉样变性病经常影响心脏、肾脏、肝脏、脾脏、神经系统和消化道。严重的淀粉样变性可能导致危及生命的器官衰竭。
淀粉样变性的体征和症状可包含但不限于：踝和腿肿胀、严重的疲劳和无力、呼吸急促、手或脚麻木、刺痛或疼痛，特别是手腕疼痛(Carpal tunnel syndrome，腕管综合症)、腹泻，可能是血液或便秘、无意且显着的体重减轻、舌头的扩大、皮肤变化，例如增厚或容易瘀伤，以及眼睛周围的紫色斑块、心律不齐、或吞咽困难。
通常，淀粉样变性是由称为淀粉样蛋白的异常蛋白的积累所引起的。淀粉样蛋白是在骨髓中产生的，可以沉积在任何组织或器官中。所述病的具体原因取决于淀粉样变性的类型。
存在几种类型的淀粉样变性或淀粉样蛋白疾病，包含AL淀粉样变性、AA淀粉样变性、和遗传性淀粉样变性。
AL淀粉样变性(免疫球蛋白轻链淀粉样变性)是最常见的类型，并且可以影响心脏、肾脏、皮肤、神经和肝脏。AL淀粉样变性先前称为原发性淀粉样变性(Primaryamyloidosis)，当骨髓产生无法被分解的异常抗体时，就可能会发生AL淀粉样变性。所述抗体以淀粉样蛋白斑块的形式沉积在各种组织中，从而干扰组织或器官的正常功能。
AA淀粉样变性通常影响肾脏，但偶尔也会影响消化道、肝脏或心脏，期先前被称为继发性淀粉样变性(Secondary amyloidosis)，且其通常与慢性感染或炎性疾病(例如类风湿性关节炎或炎性肠病)同时发生。
遗传性淀粉样变性(家族性淀粉样变性)是一种遗传性疾病，其通常会影响肝脏、神经、心脏和/或肾脏。出生时出现的许多不同类型的基因异常，与淀粉样蛋白疾病或遗传性淀粉样变性的风险增加有关。淀粉样蛋白基因异常的类型和位置会影响某些并发症的风险、症状首次出现的年龄、以及疾病随时间发展的方式。
当淀粉样蛋白疾病影响心脏时，其会引起多种类型的并发症。淀粉样蛋白沉积或斑块会降低心脏在两次心脏搏动之间的充血的能力，使得每次搏动都会泵出更少的血液，而可能导致呼吸急促。心脏内或周围的淀粉样蛋白沉积或斑块也可能导致不规则的心跳和充血性心力衰竭，以及其他器官功能障碍。
当淀粉样蛋白疾病影响肾脏时，其通常会损害肾脏的过滤能力，从而使蛋白质从血液中泄漏到尿液中(即蛋白尿)。此外，肾脏将废物于体内清除的能力降低，最终可能导致肾脏衰竭。
本文提供在需要此种治疗的患者(例如人类患者)中治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法，例如原发性(AL)淀粉样变性，其包含向所述患者施用一人源性或嵌合11-1F4抗体和一医药学上可接受的载体，其用量可有效治疗淀粉样蛋白沉积疾病。
在本发明一些实施方案中，淀粉样蛋白沉积疾病(例如原发性淀粉样变性)包含选自心脏、肾脏、肝脏、肺、胃肠道、神经系统、肌肉骨骼系统、软组织和皮肤所组成的族群。
在所述疾病涉及在患者心脏中具有淀粉样蛋白沉积或斑块的实施方案中，用所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体治疗，相比于施用所述抗体之前的基线水平，能够降低所述患者中约30％的N端pro b-型利尿钠肽(NT-proBNP)的水平。在本发明一些实施方案中，与施用所述抗体之前的基线水平相比，NT-proBNP的减少可以为至少约40％、至少约50％、至少约60％或更多。在本发明一些实施方案中，用所揭示的人类或嵌合11-1F4抗体进行治疗，可以使致所述患者的NT-proBNP水平在抗体施用后，降低至小于约9100ng/L。在本发明一些实施方案中，在施用所述抗体后，所述患者的NT-proBNP水平可以降低至小于约8000ng/L、7000ng/L、6000ng/L、5000ng/L或4000ng/L。在本发明一些实施方案中，在施用所述抗体之前，所述患者可能一开始依纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)功能分类为II或III，但是在用所揭示的嵌合11-1F4抗体进行治疗后，所述患者可能在NYHA分类量表上被分类为I类。
本文提供在患有心脏受累的淀粉样变性病的患者中改善心肌功能的方法，以及用于治疗所述患者的特定亚群的方法，例如具有心脏受累且不受血液控制的ALA的那些患者(即NT-proBNP超过650pg/mL)。
当淀粉样蛋白疾病影响心脏时，其可能引起多种类型的并发症，并且此种心脏受累预示不良的预后。当淀粉样蛋白疾病影响心脏时，其会引起多种类型的并发症。淀粉样蛋白沉积或斑块会降低心脏在两次心脏搏动之间的充血的能力，使得每次搏动都会泵出更少的血液，而可能导致呼吸急促，以及其他严重的复杂因子。心脏内或周围的淀粉样蛋白沉积或斑块也可能导致不规则的心跳和充血性心力衰竭，以及其他器官功能障碍。
本文提供在被诊断为患有心脏受累的淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(ALA)的患者中改善心肌功能的方法，所述方法包含向所述被诊断为患有心脏受累的ALA的患者施用治疗有效剂量的一人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段。通过直接结合ELISA的确定，所述抗体或其抗原结合片段相较于鼠11-1F4抗体具有与淀粉样蛋白原纤维更高的结合亲和力。此外，在施用所述抗体或其抗原结合片段后约三周内，心肌功能的改善可能是明显的，例如，可以在开始治疗后约1周内、2周内、3周内、4周内、5周内、6周内、7周内、8周内、9周内、10周内、11周内、12周内、13周内、14周内、15周内，可以观察到各种心肌功能指针的改善。
具有心脏受累的患者的心肌功能可以通过测量N端pro b-型利钠肽(NT-proBNP)的水平来确定。由ALA患者心脏中的淀粉样蛋白沉积所引起的组织损伤，会增加患者中NT-proBNP的水平。在本发明一些实施方案中，被诊断患有心脏受累的ALA的患者，其治疗前NT-proBNP的水平会大于650pg/mL。
如Smiseth等人于Eur Heart J，37：1196中所述，可通过使用超声心动图(Echocardiography)来测量整体纵向应变(Global longitudinal strain，GLS)以测量心肌的功能及其改善结果。超声心动图是使用超声来测量心肌各节段内的平均变形，而GLS是这些节段的平均值，以作为整体左心室功能的量度。淀粉样蛋白沉积可能导致左心室壁和右心室壁变厚，以及导致僵硬且顺应性较差的非扩张型心室，从而导致心脏和脉管系统“劳损(Strain)”。在超声心动图的用语中，术语“劳损”是用于描述心肌的变形，其可以包含但不限于心肌的局部缩短、增厚和/或延长。劳损可以用作心室功能的量度。本领域普通技术人员知道如何使用超声心动图来确定GLS，并且理解能够以各种方式来计算得到。例如，拉格朗日(Lagrangian)公式(εL＝(L-L0)/L0＝ΔL/L0，其中L0是基的线长度、L是结果的长度)，将相对于原始长度的劳损定义为无因次度量，其中缩短将为负值，而延长将为正值，并通常以百分比表示；另一种定义方法是欧拉劳损(Eulerian strain)，其定义与瞬时长度有关的劳损：εE＝ΔL/L。对于随时间的变化，拉格朗日劳损是为：εL＝∑ΔL/L0，而欧拉劳损是为：εE＝∑(ΔL/L)。Mirsky和Parmley首次使用该术语来描述正常心肌和缺血心肌之间的变形区域差异。
因此，在本发明一些实施方式中，与治疗前的整体纵向应变(GLS)的水平相比，以本发明方法治疗的患者表现出整体纵向应变(GLS)的改善。例如，在一项针对19名接受本发明所揭示的嵌合抗体治疗的患者的研究中，这些患者中有10名每次筛查NT-proBNP水平时都有心脏受累，而这些患者中有8名是进行每个基线NT-proBNP的心脏评估，其中心脏受累是定义为NT-proBNP水平大于650pg/mL。在本发明一些实施方案中，患有心脏受累的ALA的患者可以具有至少650pg/mL的基线NT-proBNP，而在本发明一些实施方案中，患有心脏受累的ALA的患者可以具有至少700pg/mL、750pg/mL、800pg/mL、850pg/mL、900pg/mL、950pg/mL、1000pg/mL、1050pg/mL、1100pg/mL、1150pg/mL、1200pg/mL、1250pg/mL、1300pg/mL、1350pg/mL、1400pg/mL、1450pg/mL、1500pg/mL、1550pg/mL、1600pg/mL、1650pg/mL、1700pg/mL、1750pg/mL、1800pg/mL、1850pg/mL、1900pg/mL、1950pg/mL、2000pg/mL、2050pg/mL、2100pg/mL、2150pg/mL、2200pg/mL、2250pg/mL、或2300pg/mL或更高的基线NT-proBNP。
如以下实施方案9中所揭示的，如图15所示，在暴露于所揭示的嵌合抗体中的10名患有心脏受累的患者中，有9名表现出心肌功能的改善。因此，在本发明一些实施方案中，与治疗前的整体纵向应变(GLS)水平相比，经治疗有效剂量的嵌合抗体治疗的患者的整体纵向应变(GLS)水平有所改善，且于降低的GLS同时，用所揭是的抗体治疗的患者也可能表现出NT-proBNP水平的降低。
在一些实施方案中，GLS的改善可以在治疗开始后约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周内发生。在本发明一些实施方案中，GLS的改善可以表示为与通过拉格朗日公式计算的基线相比，GLS减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、或更多。与基线相比，GLS的水平降低约2％或更多即被认为具有临床意义。
在本发明一些实施方案中，所揭示的用人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段的治疗，相比于施用所述抗体之前的基线水平，能够降低所述患者中约30％的N端pro b-型利尿钠肽(NT-proBNP)的水平。在本发明一些实施方案中，与施用所述抗体之前的基线水平相比，NT-proBNP的减少可以为至少约40％、至少约50％、至少约60％或更多。在本发明一些实施方案中，用所揭示的人类或嵌合11-1F4抗体进行治疗，可以使致所述患者的NT-proBNP水平在抗体施用后，降低至小于约9100ng/L。在本发明一些实施方案中，在施用所述抗体后，所述患者的NT-proBNP水平可以降低至小于约8000ng/L、7000ng/L、6000ng/L、5000ng/L或4000ng/L。在本发明一些实施方案中，在施用所述抗体之前，所述患者可能一开始依纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)功能分类为II或III，但是在用所揭示的嵌合11-1F4抗体进行治疗后，所述患者可能在NYHA分类量表上被分类为I类。
在本发明一些实施方案中，所揭示的方法包含治疗患有复发性或难治性ALA的患者。在本发明一些实施方案中，所述患者可为患有κALA。在本发明一些实施方案中，所述患者则可为患有λALA。
免疫球蛋白是由四个蛋白质链所组成：两条轻链，为κ或λ轻链、以及两条重链，其中有几种不同类型。在AL淀粉样变性中，κ轻链或λ轻链可能被错误折迭并形成淀粉样原纤维或斑块。因此，在某些患者中，κ和λ片段都可能被错误折迭。亚组的分析表示，如实施方案8中所示，与治疗前的水平相比，既患有λ心脏受累又有κ心脏受累的患者通过降低GLS表现出病症的改善。因此，在本发明一些实施方案中，所述患者进一步被定性于具有轻链λ淀粉样蛋白心脏受累。在本发明一些实施方案中，所述患者则进一步被定性为具有轻链κ淀粉样蛋白心脏受累。
在本发明一些实施方案中，所揭示的治疗方法可以进一步包含施用化学治疗药物，所述化学治疗药物可以是用于杀死正在产生具毒性前体蛋白的功能异常的细胞。在某些情况下，这种治疗法法可能是会成功的，从而导致功能失调的细胞减少，并随之减少患者血液中循环的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白的含量。但是，在某些情况下，化学疗法在减少功能障碍细胞的数量和/或这些细胞所产生的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白的能力可能是为无效的。那些在血液中仍持续具有可被检测水平的循环的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白水平的患者即为所述患有血液上不受控制的ALA。
所揭示的治疗方法对于不受血液控制(即既没有完全缓解也没有非常好的局部缓解)的疾病的患者可能特别有益，因为根据本发明所揭示的人源性和嵌合11-1F4抗体甚至能够在蛋白质聚集形成淀粉样沉积之前，就可以与循环中的具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白结合并中和。完全缓解的定义是为在自由轻链(Free-light-chain，FLC)的分析中，血清和尿液的免疫固定和正常比率为阴性，而非常好的局部缓解则定义为参与的和未参与的游离轻链之间的差异小于40mg/L。
监测的改进
超声心动图是非侵入性的，并且可以用于监测被诊断为患有心脏受累的轻链淀粉样变性(ALA)的患者的心肌功能的改善，包含在向所述患者施用治疗有效剂量的人源性或嵌合11-1F4抗体(c11-1F4Ab)或其抗原结合片段后约三周内，观察被诊断为患有心脏受累的ALA的患者的心肌功能的改善其中所述人源性或嵌合11-1F4Ab或抗原结合是通过直接结合ELISA进行测定的，其与淀粉样蛋白原纤维具有结合亲和力的片段高于鼠11-1F4抗体。因此，如实施方案8所示，可以在施用所述人源性或嵌合11-1F4抗体后约三周内观察到心肌功能的改善。在本发明一些实施方案中，在施用所述人源性或嵌合11-1F4Ab或其抗原结合片段后，心肌功能的改善会持续至少三个月。
在疾病涉及患者肾脏中的淀粉样蛋白沉积或斑块的实施方案中，以所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体治疗后，与在施用抗体之前所测定的基线水平相比，可以使所述患者尿液中的蛋白质(即蛋白尿)水平降低至少约30％。在本发明一些实施方案中，与在施用抗体之前所测定的基线水平相比，所述患者尿液中蛋白质的减少可以为至少约40％、至少约50％、至少约60％或更多。在本发明一些实施方案中，在施用抗体后，患者的尿蛋白输出量可减少至小于约7000mg/24小时、小于约6000mg/24小时、小于约5000mg/24小时、小于约4000mg/24小时、或小于约3000mg/24小时。
治疗的有效剂量和给药的方案
在本发明一些实施方案中，所述抗体的治疗有效剂量可以在三个月的时间内施用不超过一次、两次、三次、或四次。在本发明一些实施方案中，在施用人源性或嵌合11-1F4抗体后，所述患者中NT-proBNP的减少或GLS的改善会持续至少约三个月。
如本领域普通技术人员所容易理解的，前述方法的治疗有效剂量和给药方案是可以变化的，其可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如淀粉样蛋白斑的治疗可导致清除或减少沉积的淀粉样蛋白原纤维的含量)。举例来说，在本发明一些实施方案中，可以施用单一个剂量的所述抗体，而在本发明某些实施方案中，则可以随时间推移施用数个分开的剂量，或者可以根据情况指示在后续给药中按比例减少或增加剂量；例如，在本发明一些实施方案中，可以通过皮下、静脉内、或肌内注射的方式，每周一次或两次施用所揭示的抗体。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体或其抗原结合片段可以通过皮下、静脉内、或肌内注射的方式，每月一次或两次进行施用。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体或其抗原结合片段可以通过皮下、静脉内、或肌内注射的方式，每年施用一次或两次。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体或其抗原结合片段可以视所述患者的情况或状况显示，而每周一次、每隔一周一次、每三周一次、每四周一次、每个月一次，每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次、每年两次、或每年一次的频率施用。
此外，本文所揭示的数据表示，所述患者对使用所述人源性或嵌合11-1F4抗体治疗的反应不仅持续而且快速。在本发明一些实施方案中，所述患者可在一周或更短的时间内、两周或更短的时间内、三周或更短的时间内、四周或更短的时间内、五周或更短的时间内、六周或更短的时间内、七周或更短的时间内、八周或更短的时间内、九周或更短的时间内、十周或更短的时间内、十一周或更短的时间内、十二周或更短的时间内、或两者之间的任何时间范围内，经历治疗反应(即淀粉样蛋白沉积物或斑块的大小减少、斑块形成速度的减慢、或器官功能的改善)。例如，取决于剂量和给药方案，所述患者可在约一周或约4.5周内经历治疗反应。
向所述患者施用的抗体的治疗有效剂量(无论是以单一个剂量还是多个分开的剂量施用)应足以减少所述患者体内沉积的淀粉样蛋白原纤维的含量。可以通过评估所述患者的症状变化、或评估淀粉样蛋白原纤维的沉积含量的变化来决定这种治疗的有效剂量(例如使用具有124I标记的所述抗体通过放射免疫法来检测沉积的淀粉样蛋白沉积物)。因此，本发明所揭示内容的标记抗体可用于检测疑似患有所述疾病的患者中，淀粉样蛋白沉积疾病的存在以及确定治疗的有效性。
示例性的剂量可以根据待被治疗个体的大小和健康状况、以及待被治疗病症的状况而有所变化。在本发明一些实施方案中，所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体的治疗有效剂量可以为约500mg/m2或更低；优选地为约500mg/m2或更低；然而，在某些情况下，所述剂量可能会更高。在本发明一些实施方案中，治疗的有效剂量可以是10-1000mg/m2、25-900mg/m2、50-800mg/m2、75-700mg/m2、100-600mg/m2、或两者之间的任何数值；例如，在本发明一些实施方案中，治疗的有效量可以为约1000mg/m2、约975mg/m2、约950mg/m2、约925mg/m2、约900mg/m2、约875mg/m2、约850mg/m2、约825mg/m2、约800mg/m2、约775mg/m2、约750mg/m2、约725mg/m2、约700mg/m2、约675mg/m2、约650mg/m2、约625mg/m2、约600mg/m2、约575mg/m2、约550mg/m2、约525mg/m2、约500mg/m2、约475mg/m2、约450mg/m2、约425mg/m2、约400mg/m2、约375mg/m2、约350mg/m2、约325mg/m2、约300mg/m2、约275mg/m2、约250mg/m2、约225mg/m2、约200mg/m2、约175mg/m2、约150mg/m2、约125mg/m2、约100mg/m2、或更低。
类似地，在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约2,200mg。然而，在某些情况下，所述剂量可以为更高或更低。在本发明一些实施方案中，治疗的有效剂量可以是50至5000mg、60至约4500mg、70至4000mg、80至3500mg、90至3000mg、100至2500mg、150至2000mg、介于200至1500mg之间、介于250至1000mg之间、或介于两者之间的任何剂量；例如，在本发明一些实施方案中，治疗的有效剂量可以是约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg、约3000mg、约3100mg、约3200mg、约3300mg、约3400mg、约3500mg、约3600mg、约3700mg、约3800mg、约3900mg、约4000mg、约4100mg、约4200mg、约4300mg、约4400mg、约4500mg、约4600mg、约4700mg、约4800mg、约4900mg、约5000mg或更多。
类似地，在本发明一些实施方案中，所述人源性或嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约25mg/kg；然而，在本发明一些实施方案中，所述浓度可以为更高或更低。在本发明一些实施方案中，有效剂量可以为约1-50mg/kg、约5-40mg/kg、约10-30mg/kg、或约15-25mg/kg、或两者之间的任何数值；例如，在本发明一些实施方案中，有效剂量可以是1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、26mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45、mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg或50mg/kg或更多。
所揭示的治疗方法还可以根据情况的需要与其他已知的治疗方法结合；例如，AL淀粉样变性的当前照护标准通常涉及自体血干细胞移植(Autologous blood stem celltransplantation，ASCT)或自体骨髓移植。许多用于治疗多发性骨髓瘤的化学疗法的药物都被用于治疗AL淀粉样变性，以阻止产生淀粉样蛋白/具毒性的淀粉样蛋白前体蛋白的异常或功能异常的细胞生长。因此，在本发明一些实施方案中，所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体可以在其他已知的治疗之前、之后、或同时施用。在本发明一些实施方案中，仅在其他治疗选择失败或疾病继续发展后，才可以施用所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体。换句话说，在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体是用于治疗难治性淀粉样蛋白疾病，例如难治性AL淀粉样变性。
在本发明实施方案中，当所述疾病涉及患者肾脏中的淀粉样蛋白沉积或斑块时，与所测定的基线水平相比，以所揭示的嵌合11-1F4抗体治疗后，可以使所述患者尿液中的蛋白质水平(即蛋白尿)相较于在施用抗体之前降低至少约30％。在本发明一些实施方案中，与在施用抗体之前所测定的基线水平相比，所述患者尿液中蛋白质可以减少至少约40％、至少约50％、至少约60％或更多。在本发明一些实施方案中，在施用所述抗体后，所述患者的尿蛋白输出量可减少至小于约7000mg/24小时、小于约6000mg/24小时、小于约5000mg/24小时、小于约4000mg/24小时、或小于约3000mg/24小时。
本文还提供治疗患有淀粉样蛋白沉积疾病(例如AL淀粉样变性)的患者的方法，所述方法包含每个月少于一次地向需要所述治疗的患者施用治疗有效剂量的人源性或嵌合11-1F4抗体。在本发明一些实施方案中，AL淀粉样变性可能包含λ轻链原纤维的聚集体，在这种状况下，于施用所述抗体后，λ轻链原纤维的聚集体的存在会显着地减少。
在本发明一些实施方案中，抗体的治疗有效剂量可以是每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、或每半年一次，且更具体的给药方案的施用将在下文中进行讨论。
本发明还提供治疗患有涉及心脏的原发性轻链(AL)淀粉样变性的患者的方法，所述方法包含向所述患者施用一定剂量的人源性嵌合11-1F4抗体，且所述剂量可以有效导致于施用所述人源性或嵌合11-1F4抗体后，与治疗前的水平相比，降低至少30％的N端pro b-型利钠尿肽(NT-proBNP)的水平。本发明还包含治疗涉及肾脏的原发性轻链(AL)淀粉样变性的方法，包含向所述患者施用一定剂量的人源性或嵌合11-1F4抗体，且所述剂量可以有效导致于施用所述人源性或嵌合11-1F4抗体后，与治疗前的水平相比，降低至少40％的尿蛋白的水平。
在本发明一些实施方案中，在施用所述人源性或嵌合11-1F4抗体后，所述患者中NT-proBNP和/或蛋白尿的减少会持续至少约六个月。
如前所述，免疫球蛋白是由四个蛋白质链所组成：两条轻链，κ(Kappa)或λ(Lambda)轻链，以及两条重链，其中有几种不同类型。在AL淀粉样变性中，κ轻链或λ轻链可能被错误折迭并形成淀粉样蛋白原纤维或斑块。在某些患者中，κ和λ片段均可能被错误折迭。因此，本文提供减少有需要所述治疗的患者中κ和/或λ轻链原纤维聚集体沉积物的含量的方法，包含向所述患有包含κ或λ轻链原纤维聚集体沉积物的原发性淀粉样变性的患者施用一定剂量的抗体，其包含：(i)包含SEQ ID NO：47的VK区、及包含SEQ ID NO：48的VH区或(ii)包含SEQ ID NOs：49-54的CDR序列和人类IgG1的恒定区；其中，所述剂量能够有效减少所述患者中κ或λ轻链原纤维聚集体的沉积量。
在本发明一些实施方案中，原发性淀粉样变性是由λ轻链原纤维的沉积物或斑块所组成，而在本发明一些实施方案中，原发性淀粉样变性则是由κ轻链原纤维地聚集体沉积物所组成，并且在本发明一些实施方案中，原发性淀粉样变性是由κ和λ所组成的轻链原纤维的聚集体沉积物。
在本文中令人惊奇地发现，所述嵌合11-1F4在清除λ轻链原纤维方面出乎意料地有效。实际上，诸如实施方案7中所提供的小鼠研究之类的临床前实验表示，λ原纤维对清除具有抵抗性，并且需要多次重复的治疗才得以清除所述沉积物；然而，如实施方案8所示，当将所述嵌合11-1F4抗体施用于人类患者时，所述处理会导致仅在一次剂量的施用后，λ链淀粉样蛋白沉积的减少。在执行所揭示的方法之前，所述结果是完全出乎意料的，因此相信人源性11-1F4抗体将显示出相似的清除λ轻链原纤维的能力。
在任何前述的方法中，预期施用所揭示的人源性或嵌合11-1F4抗体能够减轻器官的功能障碍。另外，在任何前述方法中，所述抗体的恒定区可以是人类IgG的恒定区。更具体地说，在本发明一些实施方案中，所述抗体的恒定区可以是人类IgG1的恒定区。
如本领域普通技术人员所容易理解的，前述方法的治疗有效剂量和给药方案是可以变化的，其可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如淀粉样蛋白斑的治疗可导致清除或减少沉积的淀粉样蛋白原纤维的含量)。举例来说，在本发明一些实施方案中，可以施用单一个剂量的所述抗体，而在本发明某些实施方案中，则可以随时间推移施用数个分开的剂量，或者可以根据情况指示在后续给药中按比例减少或增加剂量；例如，在本发明一些实施方案中，可以通过皮下、静脉内、或肌内注射的方式，每周一次或两次施用所揭示的抗体。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体或其抗原结合片段可以通过皮下、静脉内、或肌内注射的方式，每月一次或两次进行施用。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体或其抗原结合片段可以通过皮下、静脉内、或肌内注射的方式，每年施用一次或两次。在本发明一些实施方案中，所揭示的抗体或其抗原结合片段可以视所述患者的情况或状况显示，而每周一次、每隔一周一次、每三周一次、每四周一次、每个月一次，每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次、每年两次、或每年一次的频率施用。
此外，本文所揭示的数据表示，所述患者对使用所述人源性或嵌合11-1F4抗体治疗的反应不仅持续而且快速。在本发明一些实施方案中，所述患者可在一周或更短的时间内、两周或更短的时间内、三周或更短的时间内、四周或更短的时间内、五周或更短的时间内、六周或更短的时间内、七周或更短的时间内、八周或更短的时间内、九周或更短的时间内、十周或更短的时间内、十一周或更短的时间内、十二周或更短的时间内、或两者之间的任何时间范围内，经历治疗反应(即淀粉样蛋白沉积物或斑块的大小减少、斑块形成速度的减慢、或器官功能的改善)。例如，取决于剂量和给药方案，所述患者可在约一周或约4.5周内经历治疗反应。
提供以下实施方案以说明本发明；然而，应当理解为，本发明不限于这些实施方案中所描述的特定条件或细节，且本文引用的所有印刷出版物均通过引用而明确地并入。
实施方案1
小鼠11-1F4抗体的PCR克隆及DNA测序
以PCR克隆鼠11-1F4单克隆抗体的重链与轻链的可变区基因，并对所分离出的所有可变区基因(包含假性与功能性的)进行详细的序列分析，以获得鼠11-1F4的重链与轻链可变区基因的详细DNA及氨基酸序列。
材料
培养基的成分及所有其他组织培养材料皆是购自Life Technologies(英国)。RNA溶液试剂套组是购自Stratagene(美国)，而第一链cDNA合成试剂套组则是购自Pharmacia(英国)。用于RCR反应的所有成分与设备，其中包含
聚合酶，皆是购自Perkin Elmer(美国)。TOPO TA
试剂套组是购自Invitrogen(美国)。琼脂(UltraPureTM)是购自Life Technologies(英国)。ABI
DyeTM终止剂循环定序准备反应试剂套组、预混合循环定序试剂套组、及ABI
定序仪皆是购自PEApplied Biosystems(美国)。其他所有分子生物学产品均是购自New England Biolabs(美国)及Promega(美国)。
方法
图1中概述在杂交瘤细胞株中，以PCR克隆鼠VH与VK基因进而制造鼠单克隆抗体11-1F4的策略。
产生α-人类轻链单克隆抗体11-1F4的SP2/0杂交瘤细胞株的两个克隆株(B2C4及B2D6)是由医学博士Alan Solomon所提供(田纳西大学医学中心，田纳西州诺克斯维尔)。杂交瘤细胞是自美国典型培养物保藏中心获得(ATCC，编号PTA-105)。细胞是使用含有20％(v/v)胎牛血清、青霉素/链霉素、及L-谷氨酰氨的DMEM培养基进行培养。以前述方法培养细胞直到总活细胞总数达到108个细胞。
不同细胞是分别由下列各个克隆株所获得的。小鼠杂交瘤细胞株悬浮生长在合适及质量足够的培养基中，使得其能够生长到总活细胞数达约108个细胞后，收取细胞培养上清液，并以台式离心机(250g，5分钟)沉淀所述杂交瘤细胞，接着将细胞轻轻的重新悬浮于20mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline buffer，PBS)中，并取出100μL等分试样进行活细胞计数。将所述等分试样中的细胞再次离心沉淀后，将200μL的磷酸盐缓冲溶液与200μL的台盼蓝(Trypan blue)添加到100μL的细胞溶液中并轻轻地混合均匀，接着取出10μL的所述混合物至一次性细胞计数载玻片中，并在显微镜下计数9个小方块中白色细胞的数量，其中不计算蓝色细胞(即死细胞)的数量。重复计数细胞的过程，将计数结果平均后乘以9x105，以获得20mL的磷酸盐缓冲溶液中总活细胞的数量。收取足够量的细胞后，将其重新悬浮于10mL的溶液D中以进行RNA的分离纯化(参见下文，Stratagene RNA分离试剂套组)。
接着根据制造商的指示，使用Stratagene RNA分离试剂套组将每个克隆的细胞中分别分离纯化出总RNA。将1mL的2M乙酸钠(pH 4.0)添加到样品中，并透过反复倒置试管的方式将其内容物充分的混合均匀，接着于各试管中加入10.0mL的苯酚(pH 5.3-5.7)，并同样以反复倒置的方次再次充分混合内容物后，于所述混合物中加入2.0mL的氯仿-异戊醇混合物，将试管加盖后剧烈的摇晃10秒钟，并将试管在冰中作用15分钟。接着，将样品转移到已在冰上预冷的50mL厚壁圆底离心管中，并将所述离心管于离心机中以10,000xg转速及4℃温度离心20分钟后，则可于所述离心管中见到两相，其中上层为包含RNA的水相，下层为苯酚相，而中间相则包含DNA及蛋白质，将含有RNA的上层水相转移到新的离心管中，并丢弃下层的苯酚相。将等体积的异丙醇加入到水相中，并透过反复倒置试管的方式将其内容物充分的混合均匀，接着将离心管在-20℃作用1小时以沉淀RNA，再将所述离心管于离心机中以10,000xg转速及4℃温度离心20分钟后，取出含有RNA的试管底部的沉淀物，并移除上清液。接着，将所述沉淀物溶解在3.0mL的溶液D中，再加入3.0mL的异丙醇于各离心管中，并将内容物充分混合均匀后，将各离心管在-20℃下反应1小时后，再次将所述离心管于离心机中以10,000xg转速及4℃温度离心10分钟，并将上清液从离心管中取出并丢弃。(注意：截至目前为止，已透过异硫氰酸胍保护RNA免受核糖核酸酶的作用，但现在不再受到保护。)将所述沉淀物以75％(v/v)的乙醇(DEPC处理过的水(25％))清洗后，将所述沉淀物在真空下干燥2-3分钟，最后将所述RNA沉淀物重新悬浮于0.5-2mL的DEPC处理过的水中。
根据制造商的指示，使用Amersham Pharmacia Biotech第一链cDNA合成试剂套组中随附的Not I-d(T)18引物，以产生11-1F4杂交瘤的mRNA的cDNA复制片段。以如下所示方法对所分离的每一对中的两个RNA样品，分别进行一个反应，其中使用的成分是为：大量的第一链cDNA反应混合物、克隆的FPLCpureTM鼠反转录酶、RNAguardTM、BSA、dATP、dCTP、dGTP、及dTTP、200mM的DIT水溶液、Not Id(T)18引物：5′-d[AACTGGAAGAATTCGCGGCCG CAGGAA18]-3′、及以DEPC处理过的水。
将20μL的DEPC水中约5μg的总RNA加热至65℃保持10分钟后，再置于冰上进行冷却。轻轻地混合大量的第一链cDNA反应混合物，以获得混合均匀的悬浮液，并在0.5mL的微量离心管中进行如下所示的反应：20μL的变性的RNA溶液，11μL的大量第一链cDNA反应混合物、1μL的Not I-d(T)18引物、及1μL的DTT溶液，总体积共为33μL。透过反复吸放溶液将反应物轻轻的混合均匀，并在37℃下反应1小时。
接着使用Jones及Bendig描述的方法(参见Bio/Technology 9：88)由单链DNA(Single strand DNA，ssDNA)模板以PCR反应扩增鼠重链及κ轻链的可变区基因(分别为VH基因及VK基因)。
为了制造每种变性的前导序列特异性引物(对于VH是为MHVI-MHV12，对于VK则是为MKVI-MKV11)，分别使用适当的恒定区引物(针对VH的MHCI-MHC3及针对VK的MKC的等摩尔混合物)个别进行PCR反应。表1与表2中详细的列出分别用于扩增VH及VK区基因的引物。总共进行12个重链反应及11个κ轻链反应。在所有PCR反应中，皆是使用
聚合酶以扩增cDNA模板，详细步骤如下所示。
将完成的cDNA第一链合成反应在90℃下加热5分钟，以使RNA-cDNA双链体变性并使反转录酶失去活性后，置于冰上进行冷却。取出十一个新的GeneAmpTMPCR反应试管并标记为MKV1-11，于每个反应试管中准备共100μL的反应混合物，其中每种反应混合物均包含69.3μL的无菌水、10μL的10X PCR缓冲液II、6μL的25mM的MgCl2、10μM的dNTPs储备液各2μL、2.5μL的10mM的MKC引物、2.5μL的10mM的十一个MKV引物的其中一种、及1μL的RNA-cDNA模板混合物。接着于每个试管中加入0.7μL的
聚合酶，并将所得的反应混合物以50μL的矿物油覆盖。
以类似于如上所述的试例的反应混合物制备方法，以PCR克隆小鼠重链可变区基因。不过，这次共需标记十二个反应试管，并于其中分别添加十二个MHV引物的其中一种、以及适当的MHC引物。即此PCR反应是为了扩增小鼠γ1重链的可变域基因，例如使用MHC G1引物。
将反应试管装载到DNA热循环仪中，并在94℃下初始解旋1.5分钟之后，在94℃下反应1分钟，在50℃下反应1分钟，在72℃下反应1分钟共进行25个循环，其中最后一个循环完成后，进行最后的延伸步骤，即在72℃下反应10分钟，接着将反应产物冷却至4℃。除了在黏合(50℃)以及延伸(72℃)的步骤之间使用2.5分钟的延长斜坡时间之外，在每个循环步骤之间皆使用30秒的斜坡时间。将每个所获得的PCR产物，在每个含有0.5μg/mL的溴化乙锭的1％(w/v)琼脂/1X TBE缓冲凝胶上进行10μL的等分试样，以确定哪组引物产生PCR产物。阳性PCR克隆的大小约为420-500bp。
将以上的PCR扩增反应再重复进行两次，并选择那些似乎完整扩增可变域基因全长的PCR反应，接着将每个候选的PCR产物以6μL的等分试样，按照制造商的说明指示，直接克隆到
试剂套组所提供的pCRTMII载体中，并转型于大肠杆菌细胞中，接着分别取出10.0％(v/v)、1.0％(v/v)、及0.1％(v/v)等分试样的已转形的大肠杆菌细胞，放置到含有50μg/mL的氨苄青霉素的直径为90毫米的LB琼脂培养盘上，并以用25μL的X-Gal储备溶液及40μL的IPTG储备溶液覆盖，再于37℃下反应一夜，以透过PCR筛选鉴定阳性的菌落。
表1.克隆小鼠κ轻链可变区基因的PCR引物
表2.克隆小鼠重链可变区基因的PCR引物
每个PCR反应产物皆取出5μL的等分试样在1％的琼脂/TBE(pH 8.8)凝胶上进行电泳，以确定哪个反应产物具有正确的PCR产物大小(约450bp)。将以此方法鉴定出为阳性的PCR产物直接克隆到
试剂套组所提供的pCR2.1载体中，并按照制造商的说明指示，将所述载体转形至TOP10胜任细胞中，并按照Güssowand Clackson(Nucleic AcidsRes.17：4000)的方法，利用如表3所示的1212与1233寡核苷酸引物进行PCR筛选，以对插入正确片段大小的质粒的菌落进行PCR的鉴定。接着，使用ABI PRISM 310基因分析仪及ABIPRISM BigDyeTM终止子对以前述方法鉴定出为阳性的克隆株进行双链质粒的DNA定序；其中，本发明实施方案中对来自B2C4杂交瘤细胞株克隆的每个VH及VK基因的三个阳性选植株进行定测序，以及对来自B2D6杂交瘤细胞株克隆的VK基因的四个阳性克隆株与六个VH基因进行定序。
表3.克隆小鼠重链可变区基因的PCR引物
| 引物名称 | 序列(5′-＞3′) | SEQ ID NO |
| 1212(17mer) | GTTTTCCCAGTCACGAC | 29 |
| 1233(21mer) | AGCGGATAATTTCACACAGGA | 30 |
表4(a)中显示对每个杂交瘤克克隆株(B2C4及BCD6)，所进行的十二个PCR反应以扩增鼠11-1F4重链可变区基因的结果。
将变性的前导序列引物MHV7与MHCG1-3恒定区引物的混合物(如表1所示)进行组合，以从衍生自B2C4及B2D6杂交瘤细胞株的模板cDNA产生大小约为600bp的PCR产物。由于所述产物的大小大于平均VH基因的预期大小(450bp)，因此不作进一步的研究。相反的，变性的前导序列引物MHV6与MHCG1-3恒定区引物的混合物(如表1所示)进行组合后，可由来自B2C4与B2D6杂交瘤细胞株中的模板cDNA，获得符合VH基因预期大小(450bp)的PCR产物。
表4.中显示从SP2/0杂交瘤细胞株B2C4与B2D6克隆鼠11-1F4单克隆抗体可变区重链(a)及轻链(b)基因的PCR扩增结果；其中，第三列包含实际PCR结果的记录。在观察到特定引物组合的大小时，在适当的空间记录其碱基对的大小(bp)。
表4(a).
表4(b).
衍生自杂交瘤克隆株B2C4的PCR产物的三个克隆产物的序列分析、以及衍生自杂交瘤克隆株B2D6的PCR产物的五个克隆产物的序列分析，公开示单个重链可变区序列(如图2所示)。
所使用的克隆策略(透过使用位于前导序列与恒定区序列特异性引物区域的侧翼的引物，以扩增整个可变区基因)能够鉴定出完整的FR1序列。定序的所有八个克隆在所述区域均具有相同的序列(如图2所示)。
表4(b)中显示对每个杂交瘤克克隆株(B2C4及BCD6)，所进行的十一个PCR反应以扩增鼠11-1F4κ轻链可变区基因的结果。
变性的前导序列引物MKV6与MKC恒定区引物的组合(如表2所示)，仅从源自杂交瘤细胞株B2C4的模板cDNA产生大小约为200bp的PCR产物。由于所述大小比VK基因的预期大小(450bp)小得多，因此不作进一步的研究。
变性的前导序列引物MKV2与MKC恒定区引物的组合(如表2所示)，会产生一个大小小于预期450bp的PCR产物(当在琼脂上观察时)；其中，所述PCR产物是衍生自杂交瘤细胞株B2C4与杂交瘤细胞株B2D6二者的模板cDNA。此外，先前的VK克隆发现MKV2引物会扩增一个众所周知的kappa轻链假性基因；因此，需要针对每个PCR产物的一个克隆结果皆进行序列的分析，以确认所述产物是假性基因而不是鼠11-1F4 VK基因，而所述序列分析结果显示所述PCR克隆结果确实是为假性基因。
最后，变性的前导序列引物MKV1与MKC恒定区引物的组合(如表1所示)，从衍生自杂交瘤细胞株B2C4及杂交瘤细胞株B2D6二者的模板cDNA，能够产生符合VK基因预期大小(450bp)的PCR产物。
对衍生自杂交瘤细胞株B2C4的PCR产物的三个克隆产物的序列分析、及衍生自杂交瘤细胞株B2D6的PCR产物的四个克隆产物的序列分析，公开单个κ轻链可变区序列，其不能被鉴定为假基因。
因此，从杂交瘤mRNA克隆出11-1F4重链可变区基因(使用恒定区特异性及前导序列特异性引物)并进行定序。
当所述mRNA进行转译后，所述序列会产生TVSS的胜肽序列。分析在Kabat数据库中所记录的122个重排的人类VH基因(Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，发现其中84％的序列具有TVSS2的胜肽序列。因此，可以得出所分离出的VH基因是正确的11-1F4基因序列的结论。
鼠11-1F4可变区κ轻链基因，即不具功能的VK假性基因，也被成功的被克隆出来且定序。所述假性基因是由Carroll等人(Molecular Immunology(1988)25：991)首次鉴定出来的。所述序列是来自异常的mRNA转录产物，其存在于源自起始MOPC-21肿瘤(包含SP2/0)的所有标准融合族群中。由于异常的mRNA，于第23位点的不变异性的半胱氨酸被酪氨酸残基所取代，而VJ的接位点不符合原本的读取框架，进而导致于第105位产生终止信号的密码子。
在淋巴样或杂交瘤细胞中，合成一种以上重新排列的轻型免疫球蛋白mRNA是很常见的，由于具功能性的VK基因中，通常不存在终止信号的密码子或读取框架位移，所述些mRNA通常是无效的。但是当从杂交瘤中克隆免疫球蛋白基因时，所述些假性信号则经常出现而成为主要的问题，因为尽管他们无法编码功能性多肽，但他们是V区是PCR反应中良好的底物。
在对七个独立的PCR克隆产物进行详细的序列分析之后，鉴定出11-1F4VK基因序列，自所述些克隆产物中分离出两个不同的PCR产物以得到SEQ.ID NO：36。由于所有的序列皆相同，因此其被认为是正确的11-1F4κ轻链可变区序列。
使用所述克隆出来的VH及VK区基因，用于制备小鼠-人的嵌合11-1F4单克隆抗体，并且对其进行分析以证实其与AL原纤维的特异性结合。
实施方案2
构建小鼠-人嵌合11-1F4(c11-1F4)的抗体
为了使前述11-1F4 VH及VK可变区基因作为小鼠-人嵌合抗体的一部分，并在哺乳动物细胞中实时的表达，实有必要使用专门设计的PCR引物(如表5所示)进行5′-与3′-端的修饰。本发明实施方案中，寡核苷酸引物F39836及F39837被用于进行11-1F4 VK基因的PCR修饰，而引物F39835及F58933则用于11-1F4 VH基因的PCR修饰。反向(Back，BAK)引物F39836及F39835分别在VK及VH基因的5′端引入HindIII限制酶的切位点、Kozak转译起始位点、及免疫球蛋白前导序列。正向(Froward，FOR)寡核苷酸引物F39837在VK基因的3′端引入一个剪接位供应位点及一个BamHI限制酶的切位点，而正向(FOR)寡核苷酸引物F58933还附加γ-1CH1基因之前的22个碱基对，其中还包含位于VH基因的3′端的ApaI限制酶的切位点。
表5.用于11-1F4重链及κ轻链可变区基因的PCR修饰的寡核苷酸引物
Kozak共通序列对于可变区序列的有效翻译至关重要(Kozak-J Mol Bio 196：947)。其会定义正确的AUG密码子，使核醣体从所述密码子开始转译，并且最关键的一个碱基是AUG起始位置-3处的腺嘌呤(或较不佳的鸟嘌呤)。
免疫球蛋白前导序列用以确保表达的抗体分泌到培养基中，因此使得收取与纯化更加地容易。在所述情况下，所使用的前导序列是在VH及VK克隆的过程中，从杂交瘤cDNA克隆的鼠11-1F4 VK及VH前导序列。
剪接位供应体序列对于轻链可变区与其适当的恒定区的正确读取框内连接是至关重要的，因此剪接出130bp的VK：CK内含子。重链可变区是透过Apal切位点直接与其适当的恒定区基因相连，从而消除对剪接位供应体的需求。
亚克隆限制酶切位点HindIII与BamHI，以及HindIII与Apal分别将经修饰的VK及VH可变区基因涵盖起来，而使用不同的独特限制酶切位点以确保定向亚克隆到合适的哺乳动物表达载体中。
首先仔细地分析11-1F4轻链可变区基因，以鉴定任何不需要的剪接位供应体位点、剪接位受体位点、及Kozak序列(如表6所示)。接着分析重链及轻链可变区基因是否存在任何额外的亚克隆限制酶切位点，所述些切位点随后可能会干扰功能性完整的抗体的亚克隆及/或表达，而结果显示并未发现。
表6.在哺乳动物细胞中有效表达免疫球蛋白基因的重要序列
| 名称 | 共通DNA序列 |
| Kozak转译起始位点 | CCGCCRCCAUGG |
| Kappa轻链剪接位供应体位点 | AC：：GTRAGT |
| 重链剪接位供应体位点 | AG：：GTRAGT |
| 免疫球蛋白剪接位受体位点 | YYYYYYYYYYNCAG：：G |
注：以粗体显示的碱基被认为在每个共通序列内是不变的。
以下列的方法分别准备每个可变区基因的PCR反应，其中是将前述质粒11-1F4VH.pCR2.1及11-1F4 VK.pCR2.1作为模板。在每个PCR试管中准备总体积为100μL的反应混合物，每个反应混合物最多包含41μL的无菌水、10μL的10xPCR缓冲液I、8μL的10mM的dNTPs储备溶液、1μL的10mM的5′正向引物、1μL的10mM的3′反向引物、及1μL的1/10稀释的模板DNA。最后，在用50μL的矿物油覆盖完成的反应混合物之前，添加0.5μL的
聚合酶(2.5个单位)。将反应试管置入DNA热循环仪中，并在94℃下初始解璇1分钟后，在94℃下反应30秒，在68℃下反应30秒，在72℃下反应50秒共进行25个循环，其中最后一个循环完成后，在72℃下进行最后的延伸步骤，共持续7分钟，接着将反应产物冷却至4℃。每个PCR反应产物皆取出10μL的等分试样在1.2％(w/v)的琼脂/含有0.5μg/mL的溴化乙锭的1X TBE缓冲液凝胶上进行电泳，以确定PCR反应产物的大小及存在；其中，阳性PCR克隆产物的大小约为420bp。接着将所述些经鉴定为阳性PCR的反应产物，直接克隆到由Topo TA
试剂套组所提供的pCR2.1载体中，并按照制造商的说明指示，将所述含有PCR反应产物的载体转形到TOP10胜任细胞中；再按照Güssowand Clackson(Nucleic Acids Res.17：4000)的方法，利用如表3所示的1212与1233寡核苷酸引物进行PCR筛选，以针对插入正确片段大小的质粒的菌落进行PCR的鉴定。接着，使用ABI PRISM 310基因分析仪及ABI PRISM BigDyeTM终止子对以前述方法鉴定出为阳性的克隆株进行双链质粒的DNA定序；其中，对每个Topo TA克隆株的VH及VK基因进行两个阳性克隆株的定序。
鉴定含有正确修饰的11-1F4VH及11-1F4VK基因的克隆株，并将来自所述些选植株中具有V基因修饰的克隆株亚克隆到其各自的表达载体中，以促进嵌合重链及κ轻链在哺乳动物细胞中进行表达。经修饰的11-1F4 VK基因以HindIII-BamHI片段亚克隆到表达载体pKN100(如图4所示)中，其中所述载体包含人κ恒定区基因(基因型：Km(3Ala153及Ser191)；经修饰的11-1F4 VH基因同样以HindIII-ApaI片段亚克隆到表达载体pG1D200中(如图5所示)，其中所述载体含有人γ1恒定区基因(基因型：G1m(-1Glu377、Met38I、-2Ala462、3Arg222、及Ser229)，且κ及γ1恒定区的异型株通常存在于白种人中。接着将连结的表达构建体11-1F4VK.pKN100及11-1F4VH.pG1D200转形于DH5α胜任细胞中，并使用原始PCR修饰引物(如表4所示)以前述PCR筛选方法进行阳性克隆结果的鉴定；其中，所述些表达载体皆是普通技术人员可轻易获得的。
实施方案3
建构于COS细胞中瞬时表达的嵌合11-1F4的单一超载体
构建会同时表达嵌合的11-1F4抗体的两条免疫球蛋白链的单一超级载体的方法如下所述。将11-1F4κ轻链表达匣(包含HCMVi启动子、11-1F4κ轻链可变区基因、及κ轻链恒定区基因)从建构体11-1F4VK.pKN100上以限制酶切下来，其中限制酶EcoRI的切位点在位置1及位置2490(如图4所示)；接着，将所述切下来的片段透过独特的EcoRI(切位点在位置4297，如图5所示)连接到建构体11-1F4VHpG1D200中。所述连接反应会使超级载体构建体pG1KD200-11-1F4产生，且其会同时包含11-1F4嵌合抗体的重链及κ轻链。
实施方案4
嵌合γ1/κ.11-IF4全抗体在COS细胞中的瞬时表达
嵌合11-IF4抗体在COS细胞中能以两种方式进行瞬时表达，其中所述COS细胞是来自欧洲细胞培养物保存中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)：
(i)透过共转染10μg的载体构建体11-1F4VK.pKN100及10μg的载体构建体11-1F4VH.pG1D200，且共重复进行两次的共转染；
(ii)透过转染13μg的单一超载体构建体pG1KD200-11-1F4，且共进行五次超载体的转染。
以下将详细描述转染的方法。COS细胞是培养在含有10％(v/v)胎牛血清(Fetalcalf serum，FCS)、580μg/mL的左旋麸酰氨酸(L-glutamone)、及50Units/mL的青霉素/50μg/mL链霉素(培养基)的DMEM中；其中，所述细胞培养液是在150cm2的烧瓶中进行配制，直到所有成分皆混合均匀。将COS细胞培养到一定数量后，使用胰蛋白酶将贴附在细胞培养盘底部的COS细胞悬浮在细胞培养液中，并将所述细胞培养液平均分装在三个150cm2的烧瓶中，其中每个烧瓶中分别装有25mL新鲜的且已预热的培养培养液，接着再以桌上型离心机以250g离心五分钟后，将上清液移除后将COS细胞重新悬浮于6mL的细胞培养液中。接着，将COS细胞在5％的CO2中于37℃培养一夜，并在培养细胞的第二天，在细胞仍保持指数成长的状态时收取细胞，并使最后每个烧瓶中含有约1×107个细胞；其中收取细胞的方式如下：使用如前所述方法，以胰蛋白酶将贴附在细胞培养盘底部的COS细胞悬浮在细胞培养液中，并以桌上型离心机以250g离心五分钟后，将上清液移除后以20mL的磷酸盐缓冲溶液清洗细胞后，以同样条件进行离心，并移除上清液后将COS细胞重新悬浮于足够量的磷酸盐缓冲溶液中，且最终溶液中的细胞浓度为1x107细胞/mL。接着，将700μL的所述经清洗过的COS细胞溶液转移至
光析管中，并分别加入1μL的重链及1μL的kappa轻链表达载体DNA(其中每个皆为10μg)、或加入13μg的超级载体构建体。接着，使用Bio-Rad
设备将1900伏特、25μF的电容脉冲传送到所述混合物中；对于每个转染的实验组以及不含DNA的对照组(即其中的COS细胞在不存在任何DNA的情况下进行电穿孔)重复进行所述脉冲；并同时建立一个先前表达的抗体作为阳性对照，以测试COS细胞的表达效率。
在进行完电穿孔后，使COS细胞在室温下进行恢复10分，接着将其轻轻吸取后移到直径为10cm的组织培养盘中，所述组织培养盘中含有8mL的已预热的细胞培养液中，并在5％的CO2中于37℃培养72小时；其中，所述细胞培养液是含有10％(v/v)不含γ-球蛋白的胎牛血清、580μg/mL的左旋麸酰氨酸、及50Units/mL的青霉素/50μg/mL链霉素(培养基)的DMEM。接着，在培养72小时后，收集各组COS细胞的细胞培养液的上清液，其中以离心方式除去细胞碎片，接着透过酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析嵌合抗体的产生、以及c11-1F4抗体的抗原结合力。
实施方案5
透过捕获ELISA以定量嵌合γ1/κ11-1F4抗体
以下将详细描述透过捕获ELISA测定法，以定量存在于COS细胞上清液中的全部IgG分子：透过山羊抗人类IgG的Fcγ片段-特异性抗体，以捕获IgG分子并将其固定在Nunc-Immuno MaxiSorbTM培养盘上，并通过抗人kappa轻链的过氧化物酶偶联的抗体进行IgG抗体的检测。透过以下相同的方式在同一板上捕获及检测已知浓度的标准IgG抗体，以产生用于计算IgG浓度的标准曲线：在96孔免疫培养盘的每个孔中，均匀的涂覆100μL的等分试样的0.4μg/mL的山羊抗人类IgG抗体(所述抗体是以磷酸盐缓冲溶液进行稀释)，并在4℃下反应一夜，接着除去过量的涂覆溶液，并以200μL/孔的清洗缓冲溶液(含有0.1％聚山梨醇酯(TWEEN)的1x磷酸盐缓冲溶液)将培养盘清洗三次。除了第B至G行的第2列以外，于所有培养孔中分配100μL的粒径筛析层析法(Size exclusion chromatograpby，SEC)缓冲液；其中，以溶于SEC缓冲液中的人类IgG1/kappa抗体的1μg/mL溶液作为标准溶液，并将所述标准溶液以200μL/孔的量，加入于第B及C行的第2列的培养孔中。将经转染的COS细胞的细胞培养液以250g离心5分钟，并保存所述上清液。接着，将取自不含DNA的对照组(在不含DNA的情况下进行COS细胞的转染)的200μL细胞培养液上清液的等分试样移入第D行的第2列的培养孔中；并取200μL/孔的实验组细胞培养液上清液的等分试样移入第E、F、及G行的第2列的培养孔中。将第B至G行第2列的200μL的等分试样混合均匀后，从每个孔中取出100μL的溶液转移到第3列的相邻培养孔中，而所述对照组及实验组样品的2倍稀释溶液则继续进行相同的稀释过程至第11列，以完成一系列的标准品，接着将所有的样品在37℃下反应1小时后，将所有培养孔用200μL的等分试样的水溶性洗涤缓冲液清洗六次。接着，将山羊抗人κ轻链的过氧化物酶偶联物以粒径筛析层析法缓冲溶液中稀释5000倍，并于每个培养孔中加入100μL的所述稀释的偶联物，接着重复反应及清洗的步骤。接着，于每个培养孔中加入150μL的K-BLUE底物，并在25℃下于黑暗中反应10分钟后，于每个培养孔中加入50μL的RED STOP溶液以终止反应，并于655nm处读取光密度。
实施方案6
嵌合11-1F4抗体的结合分析
使用直接结合ELISA测定法测试嵌合的11-1F4抗体与淀粉样蛋白原纤维的结合能力。合成的原纤维是由免疫球蛋白的轻链蛋白所形成的，并将其应用于使用“低结合性”聚苯乙烯培养盘(购自Costar，编号#3474)的固态ELISA的分析中，以监测抗体的反应能力。在将合成的原纤维披覆于培养盘之前，将质量为250μg的原纤维以披覆缓冲溶液(0.1％的牛血清白蛋白溶于pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液中)稀释至1mL；接着，使用Tekmar SonicDisruptor超声探头对个样品以超声波处理20秒，其中功率设置为最大功率的40％，以获得最多由2-5个原型纤丝所组成的短纤维溶液。接着，将所述溶液稀释至5mL，并透过涡旋震荡仪将溶液充分的混合均匀，并等分到培养盘板的每孔中；其中，所述制备过程会在每个培养孔中产生浓度为50μg/mL的50μL的原纤维溶液。接着，透过将培养盘暴露在37℃的恒温培养箱中一夜进行干燥。
接着，在制备培养盘的48小时内以如下方法进行ELISA测定。透过在磷酸盐缓冲溶液中添加100μL的1％的牛血清白蛋白，并在室温下于振荡器上反应1小时，以进行培养孔的阻断。接着，将培养盘以含有0.05％聚山梨醇酯二十(Tween 20)(v/v)的磷酸盐缓冲溶液清洗共三次后，于培养盘的每个培养孔中加入50μL的c11-1F4溶液(溶于0.1％牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲溶液溶液的3μg/mK抗体)，并将培养盘在室温下于振荡器上作用1小时后，再次以前述方法清洗培养盘共安次，并使用生物素化的山羊抗小鼠IgG抗体(购自Sigma，编号#B-8774，抗重链及轻链)以完成结合的抗体的检测。
结果
对经成功修饰的VH及VK基因的序列分析结果显示正确的序列存在。经修饰的11-1F4 VK及VH基因的详细地DNA序列及氨基酸序列如图3及图4中所示。经修饰的VK及VH基因分别成功地被克隆到哺乳动物的表达载体pG1D200及pKN100中，以获得用于共转染于哺乳动物细胞中的建构体11-1F4VK、建构体pKN100、及建构体11-1F4VHpG1D200。
构建体11-1F4VK.pKN100及构建体11-1F4VHpG1D200接着也被用于构建单个超级载体，即pG1KD200-11-1F4，其会在哺乳动物细胞中表达嵌合的11-1F4抗体。接着，测定来自ECACC的COS细胞中，共转染及超载体转染的嵌合11-1F4抗体的表达水平。结果显示，相较于共转染建构体11-1F4VK.pKN100及建构体11-1F4VHpG1D200的COS细胞(2820ng/ml)，转染超级载体pG1KD200-11-1F4(10326ng/mL)的COS细胞中所观察到的11-1F4抗体的表达水平较高3.7倍。
于表达及定量后，透过直接结合ELISA测试嵌合的11-1F4抗体与标靶抗原(由NCI所提供的淀粉样原纤维)的结合能力；其中，结合ELISA的结果如图8所示。进行两个最佳的来自不同转染超载体pG1KD200-11-1F4的COS细胞的培养液上清液、及一个来自共转染的COS细胞的培养液上清液的ELISA测试。
此结果显示，嵌合的11-1F4抗体会以比鼠类等效抗体更高的亲和力与淀粉样蛋白原纤维进行结合，而所述结果是令人惊讶且出乎意料的，因为通常情况下，嵌合抗体具有与原始鼠抗体相当的结合亲和力。不受特定机制所限制，发明人相信，将11-1F4鼠V区与人类γ1/κC区进行结合以产生的嵌合11-1F4抗体的最终效果可能会产生更高的亲和力。
分泌用于本文的嵌合11-1F4单克隆抗体的CHO细胞样品(被鉴定为CAEL-101)于2018年6月27日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，编号为：PTA-125146)中，已遵守《布达佩斯条约》。
实施方案7
以小鼠11-1F4研究小鼠淀粉样瘤
从人体中提取出淀粉样蛋白并进行定性。简单地来说，使用Virtis-Tempest装置(Virtis，Gardiner，纽约，美国)将约30至40g的新鲜冷冻(-80℃)或10g的冻干肾脏或肝脏在约300mL的冷食盐水中均质化，其中所述肾脏或肝脏是取自患有AL淀粉样变性的患者死后的器官。将所述的均质物在6℃下以17,000rpm离心30分钟，并通过重复均质化和洗涤的方式除去残留的盐溶性物质，直到所得的上清液在A280的OD值小于0.10。接着将所得的沉淀物重复进行均质化、用冷的去离子水洗涤、离心、并将含有淀粉样蛋白的上清液冻干。回收到的蛋白质量约占原料总重量的三分之一至五分之一。淀粉样蛋白的轻链组成和VL亚组通过氨基酸定序(Procise Protein Sequencing System；Applied Biosystems，FosterCity，CA，美国)和高效液相色谱分离肽的电离质谱(PE SCIEX API 150EX；Perkin Elmer，Norwalk，CT)进行测定，其是通过胰蛋白酶消化还原和吡啶基乙基化(Pyridylethylated)的蛋白所得，其中所述蛋白质是用6mol/L的盐酸胍从水溶性物质中提取所得。并使用天蓝色测定法(Azure Aassay)测定蛋白聚醣硫酸乙酰肝素(Proteoglycan heparan sulfate)的存在。
通过化学、免疫墨点、氨基酸序列、和电离质谱分析以确定所得的淀粉样蛋白提取物的组成，其中发现主要的蛋白质种类是与κ或λ轻链相关的分子，在大多数情况下，他们主要由可变区(VL)加上约前50个残基的恒定区(CL)、以及其他VL片段或完整分子。此外，这些提取物还包含预期的淀粉样蛋白相关的P成分以及蛋白聚醣硫酸乙酰肝素。
将冻干的水溶性淀粉样蛋白提取物悬浮在25mL的无菌食盐水中，并以PCU-2Polytron装置(Brinkman，Luzerne，瑞士)进行均质化。其中是通过在6℃下以17,000rpm离心30分钟使原纤维沉淀，并将得到的沉淀物重新悬浮于1mL无菌食盐水中并重新均质化。使用连接到6mL注射器的18号针头，将所述溶液以皮下注射方式注射到BALB/c、CD-18null、和C.B-17SCID小鼠的肩骨之间。通过每日触诊测量方式得到淀粉样瘤的大小，并在肾镜检查下进行确认，并使用microCat装置(Oak Ridge National Laboratory，Oak Ridge，TN)获取高分辨率的X射线计算器断层扫描图像。
所注射的材料在动物的背上形成显而易见、可触知的团块，其大小取决于所注射的材料的含量(例如最大直径为0.2到2.5cm)。高分辨率X射线计算器断层扫描显示，淀粉样瘤在约10到24天之内保持局部性且不变的，而在此之后，淀粉样瘤会开始消退，并最终在约4天的时间内消失。不论是淀粉样蛋白提取物的κ或λ天然物、或VL亚组都会发生这种现象；然而，在涉及五个不同的κ和七个不同λ淀粉样瘤的研究中，ALλ提取物的溶解量通常比ALκ慢(ALλ为18+/-6天，而ALκ则为13+/-3天)。具有足够的材料可供在12个病例中的8例中进行至少四次重复，其中发现这种功效在健康的幼小动物中为可再现的，而与淀粉样蛋白的组织来源无关。然而，在年龄较大(＞18个月)和免疫缺陷小鼠中，诱导的淀粉样瘤的溶解会持续地延迟超过3个月。
决定退行性淀粉样瘤命运的组织学研究表示，如以刚果红(Congo red)染色结果所示，淀粉样蛋白没有重新分布到小鼠其他组织中。另外，淀粉样瘤被萘酚AS-D氯乙酸盐阳性、α-萘乙酸乙酸酯阴性、多形核细胞，即嗜中性白细胞所浸润；相反地，这种细胞反应在CD-18的小鼠中并未发生，其中要解决人类AL淀粉样瘤需要相当长的时间(即3个月)。进一步地，通过在淀粉样瘤诱导时和第3天时，共同施予250mg的抗中性粒细胞mAb Gr-1，能够使在表现出中性粒细胞减少的动物中，淀粉样蛋白水解在被延迟。
淀粉样蛋白的去除还取决于对人类含轻链物质的鼠体液免疫反应。淀粉样瘤诱导后约10至20天，在免疫墨点实验中显示，小鼠血清中含有的抗体不仅可以识别注射的淀粉样蛋白的轻链成分，还可以识别异源的ALκ或ALλ提取物的淀粉样蛋白；相反地，其与同源淀粉样前体蛋白，即Bence Jones蛋白或任何其他测试的单克隆轻链间则没有反应。当将相同的淀粉样蛋白制剂再次施用于这些免疫化的动物时，其消失率会增加约两倍。
为了测试鼠11-1F4的治疗功效，开始一系列的实验，其中针对成对携带人类AL淀粉样瘤的小鼠施用100-μg剂量的抗体。在ALk的案例中，涉及两种不同提取物的研究显示，与未经治疗的动物相比，即使单次注射抗体也会导致淀粉样蛋白肿瘤迅速而完全地消失(参见表7及图9)。而与对照动物相比，抗体注射后的4天内，ALkλ淀粉样瘤的质量减少了＞90％；然而，为了在某些ALλ型淀粉样瘤中获得相似的现象，则需要多次剂量的试剂，这些剂量是在开始诱发淀粉样瘤的时间(第0天)，然后在第2天、第4天、和第6天再次给药(参见图9B)，以一系列100μg的注射剂量施用的。如表7中所汇整的，在小鼠模型中测试五种不同的人ALλ淀粉样瘤的实验中，发现以11-1F4进行的治疗会减少消除淀粉样瘤时间达四倍之多。值得注意的是，尽管单次或重复剂量的识别AL原纤维(例如31-8C7)的其他两种抗轻链mAb可以加速淀粉样蛋白的水解，但是11-1F4试剂的独特之处在于，尽管速度不同，但其可以加速ALκ和ALλ淀粉样蛋白的去除。相反地，进行测试的其他三种抗轻链单克隆抗体则缺乏这种活性。
表7.用鼠11-1F4治疗含有人淀粉样瘤的小鼠
*100g第0天；
100g第0、2、4、6天；
mAb指定；§时间(天)；
未处理
另外还确定11-1F4可以识别其他形式的淀粉样蛋白，如同对含AA-、ATTR-、ALyS-、AApoA1-、和含Ab-组织的免疫组织化学分析所证明的。在每种情况下，使用11-1F4和对这五种不同类型的淀粉样蛋白具有特异性的抗体都可获得相似的反应模式。
实施方案8
嵌合11-1F4抗体的1a/b期研究
由NCI的Biological Resource Branch生产GMP级淀粉样蛋白原纤维反应性的嵌合IgG1 mAb 11-1F4，并将其用于1a/b期的试验治疗难治性AL淀粉样变性的患者。产生嵌合IgG1 mAb 11-1F4的CHO细胞是被鉴定为CAEL-101。
招募接受先前抗浆细胞治疗的复发性或难治性AL淀粉样变性的患者，并使所述患者接受嵌合IgG1 mAb 11-1F4为单次静脉输注(1a期)或一系列每周输注4周(1b期)。阶段1a和阶段1b均采用剂量递增“上和下”设计，其中连续剂量分别为0.5mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、250mg/m2、和500mg/m2。
所述研究的主要目的是为了确定嵌合11-1F4的最大耐受剂量，其次要的目的包含：(1)证明淀粉样蛋白的负荷降低，这是由受影响的器官肿大和/或器官功能改善所证明的；(2)确定以单次IV输注(1a期)或一系列每周一次IV输注(1b期)施用时11-1F4的药代动力学；(3)确定250mg/m2和500mg/m2剂量之间的差异。
关键纳入标准包含21岁或更大年龄、患者先前曾接受过全身性治疗、患者不需要浆细胞靶向治疗、以及患者的东部合作肿瘤小组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)表现状态低于或等于3。
主要的排除标准包含室间隔大于2.5mm、肌酸清除率小于30cc/min、碱性磷酸酶大于正常机能上限的3倍、胆红素大于3.0mg/dL。
关于对1a期的研究，剂量递增遵循“上和下设计”。一但经耐受后，连续的患者每人将逐渐接受更高剂量的嵌合11-1F4 mAb，其中两名患者以剂量为500mg/m2入组。即使接受500mg/m2剂量的患者，也都没有回报任何限制毒性的剂量。如图9A所示，在第0周评估患者，在第1周施用嵌合11-1F4，然后在第2周、第3周、第4周、和第8周重新评估患者。
关于对1b期的研究，以0.5mg/m2开始每周输注一次，并持续四周。一旦经耐受后，连续的患者每人逐渐接受更高剂量的嵌合11-1F4mAb，其中六名患者以500mg/m2剂量入组。剂量的施用方案如图9B所示。
结果
使用嵌合11-1F4A抗体治疗27名患者后，其中26名患者的反应为可评估的，8名患者完成1a期，19名患者完成1b期治疗，其中1a和1b期的中位年龄为68岁。所有患者均耐受于所给定的mAb嵌合11-1F4的剂量，并且1a和1b期的最高剂量水平均为500mg/m2。其中没有药物相关的4或5级不良事件(Adverse events，AE)或剂量限制性毒性。两名患者在输液后3-4天出现2级皮疹，一名患者在1a期(剂量水平为4)以及在1b期接受治疗时出现皮疹。免疫组织化学染色的皮肤活检结果显示，嵌合11-1F4与淀粉样原纤维进行结合，并且伴随有嗜中性粒细胞的浸润。同一患者和另一患者在1b期出现类似的皮疹，所述皮疹进一步提供临床和相关数据，其显示嵌合11-1F4直接与轻链淀粉样蛋白原纤维进行结合。总体而言，可评估患者中有63％(8个中的5个)在1a期中一次注入mAb c11-1F4后表现出器官反应，1a期反应的中位时间为完成治疗后4.5周；而在1b阶段，可评估患者中有61％(18名患者中的11名)在开始治疗后表现出明显的器官反应，中位反应时间为1周，且施用高剂量时有更快反应的趋势。
下列表8中显示可评估患者的子集的患者特征。
表8.1a/b期患者的特征
在1a/b期研究结束时，有18位患者的反应为可评估的(N＝1为无可测量的疾病、N＝2为未完成治疗)，且18人中有12人(67％)的器官反应有所改善。具体而言，在1a期研究中，有63％的可测量疾病负担的患者(8个中的5个)在单次注入mAb 11-1F4(2个肾脏、2个心脏、和1个GI)后，表现出器官反应。而在1b期研究中，可测量疾病负担的患者中有70％(10人中有7人)表现出器官反应：在4名接受心脏受累评估的患者中，有3人表现出心脏反应；在4名接受肾脏受累评估的患者中，有4位表现出肾脏反应；评估1位患者的肠胃道反应；且1位具有软组织反应的患者的关节炎自3好转为1。
心脏反应
共针对八名患者进行心脏反应的评估，所述评估的指标包含NT-proBNP和NYHA分类标准。这些所有患者的基线水平均为≥650pg/mL。其中共五位患者(63％)表现出明显改善的反应(即NT-proBNP降低至≥30％和/或从NYHA III类转移到I类)、2位者则保持稳定，只有1名患者显示出疾病进展的迹象。图11则显示各组患者的心脏结果；图12则显示1位示例性患者的NT-proBNP下降。
肾反应
共针对八名患者进行肾脏反应的评估，其中蛋白尿是确定反应性的主要指标。其中共6位患者(75％)表现出明显改善的反应(即蛋白尿减少为≥30％或在没有肾脏进展的情况下降至＜0.5g/24小时)、2位患者则保持稳定，且未有患者显示出肾脏疾病进展的迹象(eGFR恶化为＞25％)。图13显示各组患者的肾脏结果；图14则显示1位示例性患者的蛋白尿减少。
研究结果的概述
嵌合11-1F4治疗的耐受性好且安全，且没有药物相关的4级或5级不良事件(AEs)、或最高MTD为500mg/m2的剂量限制性毒性。在者，嵌合11-1F4在临床上是有效的，大多数患者即使是单次输注或每周输注一次并持续4周也皆能观察到早期且持续的器官反应。在整个组织/器官中所观察到改善的反应，包含心脏、肾脏、胃肠道、皮肤、和软组织的反应。且确实的，嵌合11-1F4可以安全地提高67％的患者的淀粉样蛋白溶解度，甚至在有ALλ沉积物的患者中，单次给药也可以改善器官的功能。患者对嵌合11-1F4的反应迅速且为持续的。实际上，在1a期的试验中，中位反应时间为4.5周；而在1b期试验中，中位反应时间仅为1周；嵌合11-1F4的阳性反应比任何其他已知的靶向淀粉样蛋白原纤维的治疗速度都要来得快。嵌合11-1F4对淀粉样蛋白原纤维的快速破坏可以改善器官功能，进而可以显着改善患有这种致命疾病的患者的死亡率。
实施方案9
在AL淀粉样变性患者的治疗中以整体纵向应变观察嵌合原纤维反应性单克隆抗体11-1F4的心脏反应：1b期试验的结果
嵌合11-1F4 mAb的开放标签1b期临床试验已完成，结果显示如下。这项研究旨在评估使用整体纵向应变(Global longitudinal strain，GLS)以进行心肌功能对施用mAb的反应。
将19名患有复发性或难治性AL淀粉样变性的患者纳入本试验中(年龄±SD，63±12；68％男性)。根据NTpro-BNP水平＞650pg/mL的定义，有53％的人患有轻链κ淀粉样蛋白，且有52％的人有心脏受累。下列表9显示所述19位患者的NTpro-BNP筛查和基线水平。这些心脏病患者包含2例因筛查与基线NT-proBNP水平值的差异而无法进行心脏可评估的主要临床分析的患者。
表9.超声心动图分析的NTpro-BNP筛查和基线水平
在剂量递增的设计中，以0.5mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、250mg/m2、和500mg/m2的连续剂量，以每周一次的频率施用mAb共持续4周。比较基线和治疗后12周的临床超声心动图(Clinical echocardiographic，ECHO)检查后，获得几个超声心动图的变量，包含左心室挤出血液分数(Left ventricular ejection fraction，LVEF)(使用Simpson’s biplane method进行计算)和整体纵向应变(Global longitudinal strain，GLS)；其中，是使用斑点跟踪(TomTec-Arena 1.2，德国)测量GLS，并将其计算为基于4室、2室、和3室的平均值。Paired student’s t-test用于比较mAb治疗前后和基线时的超声心动图变量。超声心动图参数的分析在下列表10中示出。
表10.超声心动图的参数分析
| 筛选 | 第12周 | P-value | |
| 患者数 | 10 | 10 | |
| lvidd_cm(mean(SD)) | 4.38(0.93) | 4.32(0.91) | 0.319 |
| ivs_cm(mean(SD)) | 1.29(0.22) | 1.21(0.18) | 0.119 |
| pwt_cm(mean(SD)) | 1.12(0.27) | 1.14(0.25) | 0.217 |
| lved_mass_g(mean(SD)) | 187.86(43.37) | 179.70(42.87) | 0.197 |
| ef_percent(mean(SD)) | 51.95(9.92) | 52.28(11.59) | 0.856 |
| mcf(mean(SD)) | 0.37(0.11) | 0.38(0.13) | 0.626 |
| mv_e_m_s(mean(SD)) | 8.53(24.18) | 0.94(0.37) | 0.347 |
| mv_a_m_s(mean(SD)) | 13.45(34.05) | 0.72(0.23) | NA |
| gls_percent(mean(SD)) | -15.68(4.14) | -17.37(3.53) | 0.004 |
虽然LVEF(56.2±8.6％对56.2±9.5％，p＝0.985)和GLS(-19.04±-5.11％对-19.73±-4.1％，p＝0.119)在12周检查中整体所列的基线，均未有显着的变化，患有心脏受累的患者表现出GLS的改善(术前-15.58±-4.14％，术后-17.37±-3.53％，p＝0.004，如图15所示。)图17显示有心脏受累的患者在接受治疗前和接受嵌合11-1F4 mAb治疗后第12周的示例性超声心动图。如图17中所示，所述患者在治疗前的NT-proBNP基线水平为2549pg/mL、GLS值为-9.58；而在以嵌合11-1F4 mAb治疗12周后，所述患者的GLS降至-13.39、NTproBNP则降至1485pg/mL。亚组分析结果显示，患有λ淀粉样蛋白心脏受累的患者的GLS有所改善(治疗前为-14.3±-4.38％、治疗后为-16.17±-3.74％，p＝0.02)，并且患有κ淀粉样蛋白心脏受累的患者亦有改善的趋势(治疗前为-16.60±-4.10％，治疗后为-18.16±-3.48％，p＝0.07)。此外，研究临床分析中所定义的心脏可评估人群(Cardiac EvaluablePopulation)(使用NT-proBNP的基线值而不是筛查值)还导致GLS％呈显统计上地显着下降(p值0.0163)，其是与ECHO组(-1.69)所提供的分析结果相比，在数值上显示相似的下降幅度(-1.71)。下列表11显示心脏患者与心脏可评估患者和非心脏患者中GLS降低的分析。
表11.每次筛查的心脏疾病患者与基线可评估定义和非心脏疾病患者的比较
总结来说，所述试验结果显示，在患有AL淀粉样蛋白心脏受累的受试者中，暴露于抗原纤维特异性的mAb后，GLS会显着的改善。如图15所示，每10位心脏受累患者中就有9位的GLS％有所改善。在没有药物作用的无效假设下，有9位或更多患者改善的可能性约为0.0107，这表明所观察的10位患者中有9位改善的可能性极小，除非药物真正有效。这些初步数据将有助于设计更大的临床试验。此外，还需要进行更大范围的利用GLS进行评估心肌功能的试验。
实施方案10
不受血液控制的患者对嵌合纤维反应性单克隆抗体11-1F4的器官反应
对已经接受6种化学疗法进行治疗，并且在这些治疗中实现血液局部反应却没有器官反应的患者中，施用所述嵌合淀粉样蛋白原纤维反应性单克隆抗体(mAb)11-1F4。如图16所示，施用11-1F4后，在施用后连续三个时期，NT-proBNP会持续地降低，并且患者会产生器官反应。但是当抗体从中被取出时，游离地轻链会增加并且患者状况会恶化。试验完成后，会观察到器官的进展，所述患者的反应方式使研究者得出结论，器官反应是由于嵌合11-1F4抗体的治疗所导致的，并且与化疗引起的血液反应无关。
在本专利说明书及权利要求的描述中，单词“包含”(comprise)及所述单词的变异体，例如“包含”(comprises)及“包含”(comprising)并不会排除其他的特征、添加物、组成分、整数、或步骤，而是相反的，除非另有说明以明确指出，这些单词的范围应广义地解释为具有包容性的含义，而不是排他性的含义。
尽管本发明的组合物及方法已经透过本案说明性实施方案的方式中进行描述，但是应当理解为，本发明不限于此，并且如本领域技术人员所公知的，在不脱离由所附申请专利范围要求限定的本发明的教导的情况下，可以做出各种变化。
Claims (111)
1.一种在需要被治疗淀粉样蛋白沉积疾病的人类患者中治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法，其特征在于，包含对所述患者施用一有效剂量的医药组成物以治疗所述淀粉样蛋白沉积疾病，所述医药组成物包含一小鼠-人嵌合抗体和一医药上可接受的载体，所述小鼠-人嵌合抗体包含SEQ ID NO：47的VK区、和含有SEQ ID NO：48的VH区。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的淀粉样蛋白沉积疾病是原发性淀粉样变性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗体的施用剂量是约500mg/m2或更少。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗体的有效剂量是约2,200mg。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗体的有效剂量是约1-50mg/kg。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的原发性淀粉样变性发生在包含至少一种选自以下的器官或组织：心脏、肾脏、肝脏、肺、肠胃道、神经系统、骨骼肌系统、软组织、和皮肤。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在五周的时间内有效导致治疗反应的迹象。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的患者在约一周或更短的时间内显示出治疗反应的迹象。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的原发性淀粉样变性包含发生在心脏。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的剂量是有效地使所述患者的N端pro b-型利钠肽(N-terminal pro b-type natriuretic peptide，NT-proBNP)水平在施用所述嵌合抗体后，相较于基线水平降低至少约30％。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的剂量是有效地使所述患者的N端pro b-型利钠肽(NT-proBNP)水平在施用所述嵌合抗体后，相较于基线水平降低至少约40％。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的抗体后，有效导致所述患者的N端pro b-型利钠肽(NT-proBNP)水平小于约9100ng/L。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的N端pro b-型利钠肽(NT-proBNP)水平小于约8000ng/L。
14.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的N端pro b-型利钠肽(NT-proBNP)水平小于约7000ng/L。
15.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的N端pro b-型利钠肽(NT-proBNP)水平小于约6000ng/L。
16.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的N端pro b-型利钠肽(NT-proBNP)水平小于约5000ng/L。
17.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的患者在施用所述嵌合抗体之前依纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)功能分类为II或III类，并且在施用所述嵌合抗体之后被分类为I类。
18.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的原发性淀粉样变性包含发生在肾脏。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的剂量是有效地使所述患者的尿蛋白(Urine protein)水平在施用所述嵌合抗体后，相较于基线水平降低至少约30％。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的剂量是有效地使所述患者的尿蛋白(Urine protein)水平在施用所述嵌合抗体后，相较于基线水平降低至少约40％。
21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的尿蛋白水平小于约7000mg/24小时。
22.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的尿蛋白水平小于约6000mg/24小时。
23.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的尿蛋白水平小于约5000mg/24小时。
24.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的剂量是在施用所述病患所述的嵌合抗体后，有效导致所述患者的尿蛋白水平小于约4000mg/24小时。
25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体的施用不会引起任何严重的不良反应。
26.一种在疑似具有淀粉样蛋白沉积物的患者中检测此类沉积物的存在的方法，其特征在于，包含对所述患者施用一定量的小鼠-人嵌合抗体，所述小鼠-人嵌合抗体包含SEQID NO：47的VK区、和含有SEQ ID NO：48的VH区，并且具有附着于其上的一可检测标记；且如果淀粉样蛋白沉积物存在，则施用所述定量的所述小鼠-人嵌合抗体足以允许检测出所述的淀粉样蛋白沉积物。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记是124I。
28.一种治疗患有淀粉样蛋白沉积疾病的人类患者的方法，其特征在于，包含对所述患者每月少于一次地施用一治疗有效剂量的嵌合11-1F4抗体。
29.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体包含源自人类IgG1的一恒定区。
30.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述淀粉样蛋白沉积疾病是原发性轻链(AL)淀粉样变性。
31.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述AL淀粉样变性是包含λ轻链原纤维的聚集体。
32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，λ轻链原纤维的聚集体的存在于施用所述嵌合11-1F4抗体之后会显着地减少。
33.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的有效剂量为500mg/m2或更少。
34.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的有效量为约2,200mg。
35.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约1-50mg/kg。
36.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的剂量是导致所述病患在少于五周的时间内有效地显示出治疗反应的迹象。
37.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述量是导致所述病患在约一周或更短的时间内有效地显示出治疗反应的迹象。
38.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的治疗有效剂量是每两个月施用一次。
39.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的治疗有效剂量是每三个月施用一次。
40.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的治疗有效剂量是每四个月施用一次。
41.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的治疗有效剂量是每五个月施用一次。
42.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的治疗有效剂量是每六个月施用一次。
43.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体的治疗有效剂量是每半年施用一次。
44.一种治疗患有原发性轻链(AL)淀粉样变性而使心脏受累患者的方法，其特征在于，包含对所述患者施用一剂量的嵌合11-1F4抗体足以导致所述患者的N端pro b-型利钠肽(N-terminal pro b-type natriuretic peptide，NT-proBNP)水平在施用所述嵌合11-1F4抗体后，相较于治疗前的水平降低至少约30％。
45.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述AL淀粉样变性是难治性的。
46.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体包含源自人类IgG1的一恒定区。
47.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体是每月施用一次。
48.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体是每周施用一次。
49.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致所述患者在少于5周内显示出治疗反应的迹象。
50.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致所述患者在约一周或更短的时间内显示出治疗反应的迹象。
51.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述的嵌合11-1F4抗体的有效剂量为500mg/m2或更少。
52.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述的嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约2,200mg。
53.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述的嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约1-50mg/kg。
54.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致在施用所述嵌合11-1F4抗体后，在所述患者中NT-proBNP持续降低至少约六个月。
55.一种治疗患有原发性轻链(AL)淀粉样变性而使肾脏受累患者的方法，其特征在于，包含对所述患者施用一剂量的嵌合11-1F4抗体足以导致所述患者的蛋白尿水平在施用所述嵌合11-1F4抗体后，相较于治疗前的水平降低至少约40％。
56.根据权利要求54所述的方法，其特征在于，所述AL淀粉样变性是难治性的。
57.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述嵌合的11-1F4抗体包含源自人类IgG1的一恒定区。
58.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述嵌合的11-1F4抗体是每月施用一次。
59.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述嵌合11-1F4抗体是每周施用一次。
60.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致所述患者在少于5周内显示出治疗反应的迹象。
61.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致所述患者在约一周或更短的时间内显示出治疗反应的迹象。
62.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述的嵌合11-1F4抗体的有效剂量为500mg/m2或更少。
63.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述的嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约2,200mg。
64.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述的嵌合11-1F4抗体的有效剂量为约1-50mg/kg。
65.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致在施用所述嵌合11-1F4抗体后，在所述患者中蛋白尿持续降低至少约六个月。
66.一种减少人类患者中κ和/或λ轻链原纤维聚集体沉积物含量的方法，所述患者患有包含κ或λ轻链原纤维聚集体沉积物的原发性淀粉样变性，其特征在于，包含对所述患者施用一治疗原纤维聚集体沉积物有效剂量的抗体，所述抗体包含：
a.一包含SEQ ID NO：47的VK区；
b.一包含SEQ ID NO：48的VH区；
c.一人类IgG1的恒定区；
其特征在于，施用所述抗体会减少所述患者中κ和/或λ轻链原纤维聚集体的沉积量。
67.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述原发性淀粉样变性是由λ轻链原纤维聚集体沉积物所组成。
68.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述原发性淀粉样变性是由κ轻链原纤维聚集体沉积物所组成。
69.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述原发性淀粉样变性是由κ和λ轻链原纤维聚集体沉积物所组成。
70.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述嵌合抗体是每月施用一次。
71.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述嵌合抗体是每周施用一次。
72.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致所述患者在少于5周内显示出治疗反应的迹象。
73.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致所述患者在约一周或更短的时间内显示出治疗反应的迹象。
74.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗体的有效剂量为500mg/m2或更少。
75.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗体的有效剂量为约2,200mg。
76.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗体的有效剂量为约1-50mg/kg。
77.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述剂量是有效地导致所述患者的器官功能障碍的减轻。
78.一种治疗AL淀粉样变性的患者AL淀粉样变性的方法，其特征在于，包含对所述患者施用一治疗有效剂量的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含11-1F4抗体的可变区，其特征在于，所述抗体不是鼠的11-1F4。
79.根据权利要求77所述的方法，其特征在于，所述抗体是小鼠-人嵌合抗体。
80.根据权利要求77所述的方法，其特征在于，所述抗体包含一人类IgG1的恒定区。
81.一种改善心肌功能于被诊断为患有淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(ALA)而使心脏受累患者的方法，其特征在于，包含对所述患者施用一定量的人源性或嵌合抗体或其抗原结合片段，且所述抗体或抗原结合片段包含：
一可变重链(VH)，包含：一含有SEQ ID NO：53的互补决定区(CDR)H1；一含有SEQ ID NO：53的CDRH2，其；和一含有SEQ ID NO：54的CDRH3；和
一可变轻链(VK)，包含：一含有SEQ ID NO：49的CDRL1；一含有SEQ ID NO：50的CDRL2；和一含有SEQ ID NO：51的CDRL3；
所述定量的抗体或其抗原结合片段可在施用约三周内有效改善所述患者的心肌功能。
82.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是人源性抗体。
83.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
84.根据权利要求83所述的方法，其特征在于，所述VK区包含SEQ ID NO：47，且VH区包含SEQ ID NO：48。
85.根据权利要求83所述的方法，其特征在于，所述抗体包含源自人类IgG1的一恒定区。
86.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，在施用所述抗体或其抗原结合片段后，心肌功能的改善是持续至少三个月。
87.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段在三个月的时间内不超过施用一次、两次、三次、或四次。
88.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述心肌功能的改善包含与治疗前相比，整体纵向应变(Global longitudinal strain，GLS)水平的改善。
89.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述患者在治疗前表现出大于650pg/mL的NT-proBNP水平。
90.根据权利要求89所述的方法，其特征在于，所述剂量有效地导致使所述患者与治疗前的NT-proBNP水平相比，在治疗后表现出约300pg/mL或更多的NT-proBNP水平降低。
91.根据权利要求89所述的方法，其特征在于，心肌功能的改善包含与治疗前的NT-proBNP水平相比，在治疗后降低约30％或更多的NT-proBNP水平。
92.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述患者患有复发性或难治性ALA。
93.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述ALA进一步具有心脏受累的轻链λ淀粉样蛋白沉积疾病的特征。
94.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述ALA进一步具有心脏受累的轻链κ淀粉样蛋白沉积疾病的特征。
95.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述ALA不是血液所控制的。
96.一种监测被诊断为患有轻链淀粉样变性(ALA)而使心脏受累患者的心肌功能改善的方法，其特征在于，包含对所述患者施用一治疗有效剂量的人源性或嵌合11-1F4抗体或其抗原结合片段后约三周内，观察到所述被诊断为患有ALA而使心脏受累患者心肌功能的改善。
97.根据权利要求96所述的方法，其特征在于，所述患者患有复发性或难治性ALA。
98.根据权利要求96所述的方法，其特征在于，所述ALA进一步具有心脏受累的轻链λ淀粉样蛋白沉积疾病的特征。
99.根据权利要求96所述的方法，其特征在于，所述ALA进一步具有心脏受累的轻链κ淀粉样蛋白沉积疾病的特征。
100.一种治疗患有淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(ALA)而使心脏受累患者的方法，其特征在于，所述ALA不受血液所控制，所述方法包含对所述患者施用一治疗有效量的人源性或嵌合抗体或其抗原结合片段，所述患者的特征是心脏受累且缺乏血液控制的ALA，包含：
一可变重链(VH)，其包含：一含有SEQ ID NO：52的互补决定区(CDR)H1；一含有SEQ IDNO：53的CDRH2，其；和一含有SEQ ID NO：54的CDRH3；和
一可变轻链(VK)，其包含：一含有SEQ ID NO：49的CDRL1；一含有SEQ ID NO：50的CDRL2；和一含有SEQ ID NO：51的CDRL3。
101.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是人源性抗体。
102.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
103.根据权利要求102所述的方法，其特征在于，所述VK区包含SEQ ID NO：47，且VH区包含SEQ ID NO：48。
104.根据权利要求102所述的方法，其特征在于，所述抗体包含源自人类IgG1的一恒定区。
105.根据权利要求100所述的方法，其进一步包含向所述患者施用一化学治疗化合物。
106.权利要求100的方法，其特征在于，所述缺乏血液控制至少包含循环淀粉样蛋白前体蛋白的水平，其特征在于，所述患者血清中参与的和未参与的游离轻链之间的差异＞40mg/L。
107.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述患者显示出与治疗前相比，整体纵向应变(Global longitudinal strain，GLS)水平的改善。
108.权利要求107的方法，其特征在于，GLS的改善是在施用所述抗体或其抗原结合片段的三周内所发生。
109.权利要求107的方法，其特征在于，在施用所述抗体或其抗原结合片段后，GLS的改善持续至少三个月。
110.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述ALA进一步具有心脏受累的轻链λ淀粉样蛋白沉积疾病的特征。
111.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述ALA进一步具有心脏受累的轻链κ淀粉样蛋白沉积疾病的特征。
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